instrucciones para aislamiento de leucocitos a partir de sangre total

INSTRUCCIONES PARA
AISLAMIENTO DE LEUCOCITOS
A PARTIR DE SANGRE TOTAL
EL PRIMER PASO, ES LEER PRIMERO Y
LUEGO SEGUIR TODAS LAS INSTRUCCIONES
!!!!!
ALFREDO URIBE ARDILA M.SC.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES - DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
BOGOTA-COLOMBIA
REACTIVOS
SOLUCION DEXTRAN-HEPARINA
En un balón volumétrico aforado de 25 ml medir:
•
•
•
•
•
15 ml de agua destilada-desionizada.
1,25 g de Dextran * (Sigma No. D-5251).
0.175 g de Cloruro de Sodio.
Adicionar el volumen correspondiente a 6000 UI de Heparina (Roche
Liquemine *).
Llevar a volumen final con agua destilada-desionizada. Almacenar a
4ºC. **
– * Puede utilizarse otra marca, pero se deben respetar las cantidades.
– ** El reactivo es estable seis meses a esta temperatura.
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1
PROCEDIMIENTO
•
A un tubo que contenga 2 ml de
Dextran-Heparina, se le agregan 10 ml
de sangre total recién extraída por
punción venosa.
•
Se
mezcla
suavemente
hasta
homogenizar la sangre con el reactivo
y se deja en una gradilla, para que se
produzca la sedimentación gradual de
los glóbulos rojos.
•
Si la temperatura del lugar supera los
12 grados centígrados se sugiere que
la sedimentación se haga bajo
refrigeración con un gel refrigerante
bajo la gradilla o dentro de una nevera
en el área de refrigeración.
•
Retirar la tapa del tubo durante el
proceso.
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2
PROCEDIMIENTO
•
Por efecto del Dextran-Heparina se genera
una sedimentación diferencial de los
glóbulos rojos, con respecto a los
Leucocitos.
•
Los Glóbulos Rojos sedimentan a mayor
velocidad dejando en el sobrenadante los
Leucocitos.
•
Este proceso se lleva a cabo en los
primeros 45 minutos.
•
Observaciones:
–
–
–
15 minutos
30 minutos
NO dejar pasar mas del tiempo indicado.
No acelerar el proceso con Centrifugación.
Evitar al máximo contaminar la muestra
con Glóbulos rojos
45 minutos
Muestra en proceso de sedimentación
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3
PROCEDIMIENTO
•
Una vez se cumplen los
45
minutos
de
sedimentación
se
extrae con la ayuda de
una pipeta plástica o
pipeta automática el
sobrenadante.
•
La pipeta no debe tocar
el fondo, que contiene
los glóbulos rojos, esto
debe evitarse en los
posible; sin embargo
debe
extraerse
la
mayor cantidad posible
del sobrenadante.
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4
PROCEDIMIENTO
•
El sobrenadante que se extrae
debe repartirse los mas
equitativo posible, en dos
tubos que deben ser nuevos y
totalmente limpios.
•
El
sobrenadante
debe
extraerse al máximo posible
dado
que
los
glóbulos
blancos
se
encuentran
suspendidos en esta parte de
la muestra.
•
Al final se tiene por cada
paciente dos muestras, que
constituyen el especímen y un
duplicado para confirmación
de resultados.
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5
PROCEDIMIENTO
•
Una vez se extrae totalmente
el sobrenadante, se deben
sellar los tubos con tapas de
caucho, que entren forzadas,
para evitar fugas.
•
Estas
muestras
bajo
refrigeración son estables
alrededor de 24 horas.
•
•
NO CONGELAR BAJO NINGUNA
CIRCUNSTANCIA.
•
Esta muestra tiene la ventaja de ser
mas estable que la sangre total,
dado que el aislamiento de
leucocitos de sangre completa, no
pueden hacerse en forma optima
después de tres horas de haberse
tomado la muestra.
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5
PROCEDIMIENTO
•
Es muy conveniente impregnar
una tarjeta, con la muestra, para
tener células y papel filtro de cada
paciente, sin embargo se debe
impregnar la tarjeta con sangre
tomada directamente de la jeringa
después de la punción.
•
NO IMPREGNE CON LOS ERITROCITOS
SOBRANTES DE LA SEDIMENTACION,
ESTA MUESTRA ESTA PRACTICAMENTE
SIN CELULAS BLANCAS Y NO ES DE
UTILIDAD PARA EL ANALISIS DE
ENZIMAS LISOSOMALES.
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Algunos comentarios…..
• Si tiene la muestra aislada y va a viajar inmediatamente, colóquela
en una caja de Icopor con un Gel refrigerante. La estabilidad es de
24 horas.
• Si va a enviar la muestra colóquela en la caja de Icopor, teniendo
la precaución de fijarla con cinta de enmascarar a la pared de la
caja, limite el movimiento del Gel de la misma manera y selle muy
bien la caja.
• Si son varias muestras rotúlelas con nombres y apellidos
completos del paciente, edad y sexo.
• Asegúrese con el servicio de Aeromensajería, que la muestra sea
traída en un termino no superior a 20 horas al Laboratorio.
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GRACIAS POR SEGUIR LAS
INSTRUCCIONES !!!!!
BIBLIOGRAFIA.
KAMPINE JP, BRADY R. JKAUFER JN. FELD M. SHAPIRA D.
Diagnosis of Gaucher's disease and Nieman-Pick's disease with small
samples of venous blood. Science 1966.155 .86.
SHAPIRA E, Blitzer MG Miller JB, Africk DK.
Biochemical Genetics. A laboratory manual. Oxford University Press. New
York, 1989.
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