Trabajo presentado

Implicaciones de la variabilidad genética del endemismo
de Gran Canaria Solanum vespertilio ssp. doramae
Leticia
1
Curbelo-Muñoz ,
1Fundación
Ruth
2
Jaén-Molina
& Juli
2*
Caujapé-Castells .
Canaria Amurga Maspalomas.
2Jardín Botánico Canario "Viera y Clavijo"-Unidad Asociada CSIC, Cabildo de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria.
(*[email protected]).
La motivación de este análisis es explorar en las dos subespecies de Solanum verspertilio la posible presencia de caracteres con
valor diagnóstico para la taxonomía en cinco secuencias cloroplásticas : las dos que actualmente se usan como “códigos de barras”
oficiales en Angiospermas (matK y rbcL) y tres más que están siendo rutinariamente utilizadas por el departamento de Biodiversidad
Molecular y Banco de ADN de la flora canaria del JBCVCSIC (http://www.bioclimac.com/mbdna/) y que han exhibido niveles
moderado-altos de polimorfismo en otros proyectos liderados por este departamento con otros taxones vegetales endémicos
canarios (trnT-L, trnF-L y trnK-rps16).
INTRODUCCIÓN
RESULTADOS
Evaluamos mediante técnicas de caracterización molecular la
posibilidad de certificar la identidad taxonómica de las
reintroducciones de Solanum vespertilio ssp. doramae en
referencia a sus congéneres canarios filogenéticamente más
cercanos mediante: la caracterización genética de 5 individuos
de cada uno de los taxones canarios: Solanum vespertilio ssp.
doramae, ssp. verpertilio y Solanum lidii además de un
congénere nativo mediante secuenciación de 5 regiones
informativas del ADN cloroplástico (trnT-L, trnK-rps16, trnF-L,
matK y rbcL), y la estimación de los niveles de variabilidad
genética poblacional de 121 individuos de S. vespertilio y S. lidii
mediante la técnica “ISSR”, utilizando las 5 regiones universales
descritas en Meimberg et al. (2006).
MATERIAL Y MÉTODOS
Nuestro diseño de muestreo incluyó 10 poblaciones. Solanum lidii (Amurga), Solanum vespertilio ssp. vespertilio
(Cabezo arbei y Chamorga) y Solanum vespertilio ssp. doramae (Finca Fran Sosa, Tilos de Moya, Osorio, Lito,
Azuaje reintroducido y Tilos de Moya reintroducido). Algunas muestras se encontraban en el Banco de ADN del
Jardín Botánico Canario “Viera y Clavijo” (JBCVC) y otras fueron recolectadas para dicho estudio.
Extracción de ADN y su amplificación
Extracciones de ADN se realizaron a partir de materiales de sílice tanto seca y fresca de gel utilizando el método
de CTAB 2X (Doyle y Doyle, 1987;. Palmer et al 1988). La calidad del ADN total, cuya concentración se midió en
un BioPhotometer Eppendorf, se verificó el 1% en geles de agarosa. Las alícuotas de los extractos de ADN
después de su uso quedaran depositadas en el Banco de ADN de la flora canaria en el Jardín Botánico Canario
"Viera y Clavijo" (JBCVC) hasta su uso posterior.
Para aquellas muestras con una concentración y pureza adecuadas se ajustó la concentración de trabajo para que
estuviera dentro del rango de 1 a 50 ng/µl y se montaron reacciones de amplificación (PCR) para un volumen
final de cóctel de 25µl. El Termociclador utilizado fue en todos los casos el “Mastercycler Gradient” de Eppendorf.
En todos los casos, se añadió BSA al 0.4% como componente adicional del cóctel de reacción. El ADN de aquellos
especímenes para los que se obtuvo una amplificación exitosa, fue purificado con las columnas “GENELUTE PCR
CLEAN-UP” (Sigma-Aldrich, C.O). Las muestras purificadas se enviaron a secuenciar a Macrogen (Corea).
Tanto para las reacciones de PCR como para las de secuenciación fue necesario realizar algunas modificaciones
(Newmaster, et al. 2007) respecto a los protocolos propuestos y recomendados por diferentes autores (Kress, et
al, 2005; Kress y Eriksson 2007; Chase et al, 2007) o por CBOL (para las secuencias “código de barras”, CBOL
Plant Working Group 2009). Algunas de estas modificaciones supusieron variaciones de la temperatura de
anillamiento (Ta), de la concentración final de magnesio, del número de ciclos en el termociclador o la adición de
DMSO en un 0.8%.
Alineación de secuencias y análisis filogenéticos
Las secuencias sentido y antisentido ("Forward" y "Reverse") enviadas por Macrogen fueron editadas con el
programa BIOEDIT v.5.0.6 (Hall 1999), depuradas mediante el algoritmo “contig” (que da como resultado un
consenso entre las dos direcciones de secuenciación) y alineadas con la opción CLUSTAL W (Thompson et al.
1994) de dicho programa, realizando los ajustes manuales que se consideraron necesarios, siguiendo las
indicaciones de Kelchner (2000).
Resolución obtenida con los cebadores C2 (imagen izquierda) y C1 (imagen derecha) en algunos de los individuos
analizados. La “DNA mass ladder” se muestra en el carril derecho e izquierdo de cada foto, respectivamente.
Análisis de parsimonia con las secuencias trnT-L,
rbcL y trnF-L
concatenadas en las 12 muestras con el código indicado. A) y B) son los
dos únicos árboles de parsimonia máxima encontrados, con el número de
cambios encima de las ramas (ver texto para métodos e indicadores de
calidad). C) muestra encima de las ramas los valores de apoyo bootstrap
obtenidos para las agrupaciones después de 1000 réplicas aleatorias
De arriba abajo, fragmentos de la secuencia de las regiones trnKrps16, rbcL-(F) , trnF-trnL , mk- KIM-(F) y trnT-trnL.
ALGUNAS CONCLUSIONES
El considerable polimorfismo detectado en S. lidii y dentro de las subespecies de S. vespertilio tanto en las cinco
secuencias utilizadas como en los dos ISSRs universales que dieron resultados interpretables sugiere que las poblaciones
naturales de estos taxones contienen niveles moderado-altos de diversidad genética. En línea con los resultados de
Prohens et al. (2007) con AFLPs (que no incluyen a la ssp. doramae), la convergencia de numerosas características
reproductivas inusuales en S. vespertilio (andromonoecia, zigomorfia, heteranteria y enantiostilia débil) pueden ayudar a
explicar la presencia de una diversidad genética más elevada de lo esperado para esta especie auto-compatible. Además,
muchas de las características de estos taxones y de los polinizadores en la naturaleza (Prohens et al. 2007) podrían
fomentar también la reproducción cruzada.
Por lo tanto, si bien las reintroducciones realizadas en Gran Canaria provienen probablemente de semillas
recolectadas en un solo individuo (o en individuos muy emparentados) de S. vespertilio ssp. doramae, parece que los
niveles de variabilidad genética detectados indican que dichas reintroducciones podrían provenir de reproducción
cruzada, y representar por tanto una parte indeterminada de la variabilidad genética natural de la especie.
TABLA. Indicadores básicos de polimorfismo en cada una de las accesiones en las que se
tomaron muestras. N: número de individuos analizado; P = porcentaje de loci
polimórficos; A = número de alelos observados; Ae = Número efectivo de alelos (Kimura
y Crow (1964); h = diversidad genética de Nei (1973); I = índice de información de
Shannon (Lewontin 1972).
Taxón/Población
N
P
A
Ae
H
I
Solanum
lidii
Amurga
3
6.38%
1.06
1.04
0.027
0.039
Solanum
vesper5lio
ssp.
vesper5lio
Cabezo
Arbei
7
25.53%
1.26
1.07
0.053
0.091
Como paso previo al análisis de datos, se realizaron búsquedas en GENBANK para todas las secuencias utilizando
el algoritmo BLAST para comprobar su mayor similitud se daba con otras Solanáceas disponibles en este
repositorio mundial de secuencias. Las secuencias de GENBANK se utilizaron también para delimitar el tamaño de
cada una de las tres regiones incluidas en este proyecto.
Chamorga
3
14.89%
1.15
1.12
0.065
0.092
ssp.
doramae
Azuaje
PN
3
0.00%
1.00
1.00
0.000
0.000
Azuaje
R
18
44.68%
1.45
1.16
0.107
0.174
Para cada región y género, las secuencias alineadas se transformaron en matrices nexus desde el programa
BIOEDIT, y se cargaron en el programa PAUR 4.0* (Swofford 2010) para realizar los análisis filogenéticos
(parsimonia y máxima verosimilitud). Además, se analizaron todas las regiones para explorar la posible presencia
de caracteres diagnóstico, según Jaén Molina et al. (2010), esto es, un nucleótido o combinación de nucleótidos
en una posición de las secuencias alineadas que es exclusiva de todos los individuos disponibles de un taxón
determinado, y que contribuye a su discriminación respecto de otros taxones con-genéricos en nuestra muestra.
Finca
de
Fran
Sosa
3
27.66%
1.28
1.15
0.095
0.145
Finca
de
Lito
Almeida
2
0.00%
1.00
1.00
0.000
0.000
Osorio
7
17.02%
1.17
1.09
0.055
0.084
Tilos
de
Moya
38
78.72%
1.79
1.23
0.162
0.270
Tilos
Cab
39
61.70%
1.62
1.17
0.119
0.203
ssp.
vesper5lio
5.0
20.21%
1.21
1.10
0.059
0.092
ssp.
doramae
15.7
32.83%
1.33
1.11
0.077
0.125
Promedios
S.
vesper5lio
FIGURA. Análisis de Componentes Principales realizado con los datos de
polimorfismo genético obtenidos para los 47 loci que pudieron interpretarse con
la técnica ISSR utilizando los cebadores C1 y C2 de Powell et al. (1999) en los
121 individuos recolectados. Los dos primeros ejes del espacio multivariante
explican solamente el 28.51% de la variabilidad detectada. La representación
pequeña del ángulo superior derecho resume los datos por accesión. En la ssp.
doramae, es destacable la subdivisión en dos grupos de las muestras
recolectadas en Los Tilos Cabildo y de las reintroducciones del Barranco de
Azuaje, así como la separación entre las reintroducciones de Azuaje y los
individuos de la población natural (ver texto).
BIBLIOGRAFÍA
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population genetic data. Jardín Botánico Canario "Viera y Clavijo"-Unidad Asociada GBIF & EXEGEN
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Caujapé-Castells J, Castellano JJ, Sabbagh I, Ramos R, Quintana-Trujillo FM, Henríquez V, Rodríguez JF
(2011) Transformer-4: a genotype matrix format translator. Jardín Botánico Canario “Viera y Clavijo”-Unidad
Asociada CSIC, Instituto Tecnológico de Canarias, Jablesoft & Inventiaplus. Las Palmas de Gran Canaria,
Spain. <http://www.demiurge-project.org/download_t4>.
Caujapé-Castells J, Pérez de Paz J (2009) La diversidad aloenzimática de la flora Canaria (II): factores
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Chase MW, Cowan RS, Hollingsworth PM et al. (2007) A proposal for a standardised protocol to barcode
all land plants. Taxon, 56: 295–299.
Kimura M, Crow JF (1964) The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics
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Meimberg H, Abele T, Bräuchler C, Mckay JK, Pérez de Paz PL, Heubl G (2006). Molecular
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566-578.
Pérez de Paz J, Caujapé-Castells J (2010) The allozyme genetic diversity of the Canarian flora:
relationships with reproductive, biotic and abiotic factors. Floramac 2010, Ponta Delgada (Açores)
23-25 de Septiembre de 2010.
Prohens J, Anderson GJ, Herraiz FJ, Bernardello G, Santos-Guerra A, Crawford DJ Nuez N (2007)
Genetic diversity and conservation of two endangered eggplant relatives (Solanum vespertilio Aiton
and Solanum lidii Sunding) endemic to the Canary Islands. Genet. Resour. Crop Evol. 54:451-464.
NOTA
La matriz de datos de ISSRs presentada, se halla depositada en el
formato T4 en un compendio de diversidad genética del sistema
de información Demiurge (http://www.demiurge-project.org/), que
tendrá el código D-ISSRS-14 en caso de ser aceptada por el
revisor asignado.