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Nuevo método rápido para la
determinación de histamina en
productos pesqueros
Elisa Jiménez
www.azti.es
11/24/2014
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Nuevo método rápido para la determinación de histamina en productos pesqueros
INTRODUCCIÓN
Histamina
Amina biógena formada postmortem en músculo de peces
•
•
•
•
Crecimiento bacterias generadoras de histidina decarboxilasa
Principalmente en escombridos (atunes…) (mayor contenido His)
Indicador nivel descomposición
Elevado nivel: causa de reacciones tóxicas (cefalea, hipertensión,
nausea, …)
Imagen: www.rcgroups.com
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INTRODUCCIÓN
Histamina
•
Medición: Cromatografía Líquida con detector de fluorescencia
(LC‐FLD), previa derivatización
•
Regulación:
Reglamento (CE) nº 2073/2005, de la Comisión de 15 de noviembre de 2005,
relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios
•
Limite máximo permitido
 Productos de la pesca procedentes de especies de pescado
asociados a un alto contenido de histidina: 100 mg/Kg
 Productos de la pesca sometidos a tratamiento de maduración
enzimática en salmuera, fabricados a partir de especies de
pescados asociados a un alto contenido de histidina: 200 mg/Kg
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INTRODUCCIÓN
Aptámeros
• Oligonucleótidos de pequeño tamaño capaces de
unirse específicamente a la molécula de interés frente
a la cual han sido previamente seleccionados
(Ellington y Szostak, 1990)
• ARN o ADN
• Kd= µM (moléculas pequeñas) (hasta nM en proteínas)
Imagen: www.amsbio.com
Método selección
• SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment
(Tuerk C y Gold L. 1990)
Ellington AD & Szostak JW (1990). In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346:818-822.
Tuerk C & Gold L (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249:505–510.
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OBJETIVOS
Objetivos
•
Desarrollar un sistema de detección rápido de histamina
•
Sistema de reconocimiento biológico basado en aptámeros
•
Testar los aptámeros seleccionados en sistema SPR (Surface
Plasmon Resonance)
•
Implementación de aptámero en un sensor rápido (tiras de
reacción, placas ELISA…)
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DESARROLLO
Selección de aptámeros
• Aplicación de protocolo FluMagSELEX para la selección de
aptámeros óptimos (Stoltenburg, 2005)
• Selección a partir de una biblioteca de oligonucleótidos (1015
moléculas)
• Aptámeros: parte variable central (60mer) flanqueados por dos
regiones comunes de anclaje de cebadores (18 mer)
• Histamina pegada a esferas magnéticas
Dynabeads ® M-270 Epoxy (Invitrogen)
• Detección mediante fluorescencia
Imagen: Invitrogen Dynal
Stoltenburg R.; et al. (2005), Flu-Mag-SELEX as an advantageous method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., 383, 83
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DESARROLLO
Protocolo de selección
Sucesivos ciclos: n=15
1. Enfrentamiento biblioteca de aptámeros-histamina
2. Lavado de aptámeros no unidos
3. Elución de aptámeros afines
4. Amplificación por PCR de aptámeros con mayor afinidad
5. Separación PAGE desnaturalizante
•
•
Cebadores longitud desigual
Marcaje fluorescente
6. Vuelta al paso 1
7. Selección negativa
•
Esferas no tapizadas con histamina
Imagen: Stoltenburg R.; et al. (2005), Flu-Mag-SELEX as an advantageous
method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., 383, 83
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RESULTADOS
Identificación de aptámeros
• Clonación de aptámeros
pMOS Blue Vector (Amersham)
• Secuenciación de clones positivos
pMOS Blue Blunt-Ended Cloning Kit.GE Healthcare
• Análisis de secuencias: búsqueda de motivos comunes
Software Clustal W
•
•
Selección de dos posibles aptámeros afines a histamina
Análisis de estructura secundaria
Software Mfold
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RESULTADOS
Análisis de afinidad
• Test afinidad aptámero-histamina en sistema de fluorescencia
ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)
• Aptámero marcado con FAM
Concentración (µg/mL)
UF Unidades
Fluorescencia
0.1000
3,965,115.00
0.0500
2,447,103.50
0.0200
1,070,333.50
0.0130
781,517.50
0.0100
462,513.00
0.0050
256,044.00
0.0020
44,121.00
Unidades de Fluorescencia (UF)
Incremento concentración histamina > incremento fluorescencia = AFINIDAD
Concentración de Histamina (μg/mlL)
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RESULTADOS
Aplicación a sensor SPR
• Sistema de Resonancia de Plasmones Superficiales SPR BIACORE X
• Determinación de constante de disociación de la interacción
• Chip CM5: superficie de oro, matriz dextrano-carboximetilada
Reconocimiento aptámero-histamina > señal detectable
Señal mínima: Histamina bajo peso molecular
Cooper MA (2002). Optical biosensors in drug discovery.
Nature Reviews Drug Discovery 1:515-528.
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RESULTADOS
Optimización
• Conjugación Histamina+BSA (Bovine Serum Albumin)
• Biofuncionalización del chip con BSA
Activación de grupos carboxílicos de BSA con EDC:NHS
• Optimización de variables cinéticas: flujo, volumen de
inyección...
Imagen Biacore X. www.biacore.com
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Imagen Estructura BSA. Autor: K.A.Majorek,P.J.Porebski,M.Chruszcz,S.C. Almo,W. Minor,
New York Structural Genomics Research Consortium (NYSGRC)
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ACTIVIDADES FUTURAS
Futuros pasos
• Incorporación de aptámeros a tiras de flujo laminar
• Detección mediante nanopartículas de oro: en tira o en solución
• Funcionalización de chip SPR cubierto con estreptavidina con
aptámero marcado con biotina
Imagen: Liu J (2006). A Simple and Sensitive “Dipstick” Test in Serum Based on Lateral Flow Separation of Aptamer-Linked Nanostructures. Angew. Chem. Int. Ed. 45:7955-7959.
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