PRACTICA 03 - Biología General

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Práctica #3
PROPIEDADES DE LAS MACROMOLÉCULAS
I. Objetivos
Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de:
* Estudiar la estructura, clasificación y función de las distintas macromoléculas de importancia biológica.
* Conocer distintas pruebas colorimétricas que permitan la detección de macromoléculas.
* Discutir los efectos de condiciones ambientales como el pH y la temperatura sobre la actividad
enzimática.
* Observar la presencia de azúcares y almidón en alimentos.
* Conocer las reacciones de importancia biológica para la identificación de las características de los
lípidos.
II.
Introducción
Todos los organismos vivos poseen carbohidratos, proteínas, lípidos, y ácidos nucleicos. Estas moléculas
son frecuentemente llamadas macromoléculas. Todas las macromoléculas son polímeros sintetizados a partir
de la unión de bloques estructurales (compuestos orgánicos) más sencillos, denominados monómeros. Los
polímeros pueden ser degradados en sus monómeros constituyentes mediante reacciones de hidrólisis.
Las macromoléculas tienen diferentes estructuras y propiedades químicas. Por ejemplo, los lípidos
(compuestos de ácidos grasos) poseen muchos enlaces C-H y relativamente poco oxígeno, mientras que las
proteínas (compuestas de aminoácidos) poseen grupos amino(NH3+) y carboxilo(-COOH)s. Estas
subunidades características y grupos químicos, le confieren diferentes propiedades químicas a las
macromoléculas. Por ejemplo, los monosacáridos tales como la glucosa son polares y solubles en agua,
mientras que los lípidos son compuestos no polares e insolubles en agua..En este laboratorio estudiaremos
solamente los carbohidratos, lípidos y proteínas.
Entre los distintos componentes de los alimentos,
después del agua, los carbohidratos son las
sustancias más abundantes y más ampliamente
distribuidas en la naturaleza; siendo la celulosa la
biomolécula que se encuentra en mayor cantidad en
la biosfera, y el almidón, la fuente energética
alimentaria más empleada en el mundo.
Los
carbohidratosson
moléculas
compuesta
fundamentalmente de carbono, hidrógeno y oxígeno
en una relación 1:2:1 (por ejemplo la fórmula
química de la glucosa es C6H12O6). Todos los
carbohidratos están formados por cadenas de
carbono de tamaño variable, saturadas con grupos
hidroxilo (-OH), que pueden tener una función
aldehídica (-CHO) o cetónica (-C=0). Los
carbohidratos pueden ser clasificados en:
Monosacáridos: Ejemplos son la glucosa, fructuosa y galactosa. Son sólidos, cristalinos, incoloros o blancos,
dulces y solubles en agua. Su solubilidad, se debe a que tanto los radicales hidroxilo, como el grupo
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carbonilo son polares y establecen por ello enlaces de hidrogeno con las moléculas de agua también polares.
Dentro de sus propiedades químicas destaca que poseen poder reductor frente a determinadas sustancias (por
ejemplo el licor de Fehling), debido a la presencia del grupo carbonilo que puede oxidarse a ácido con
facilidad por disoluciones alcalinas de plata o cobre. Esta propiedad es utilizada para detectar su presencia en
medios biológicos.
Disacáridos: son dulces, solubles en agua, cristalizables y por hidrólisis se descomponen en sus
monosacáridos constituyentes. Entre los disacáridos de mayor interés biológico, se pueden citar como
ejemplo maltosa formada por dos moléculas de -glucosa, lactosa formada por una molécula de -galactosa
y otra de -glucosa y sacarosa formada por una molécula de -glucosa y otra de -fructosa.
Polisacáridos: son los azúcares más abundantes en la naturaleza y los de mayor peso molecular, formados
por más de diez monosacáridos, unidos entre sí. Son insípidos, amorfos e insolubles en agua. Algunos
pueden formar dispersiones coloidales. Los polisacáridos realizan funciones biológicas de dos tipos: de
reserva energética y estructural. Los primeros (almidón y el glucógeno) presentan enlaces de tipo ,
mientras los segundos (celulosa y la quitina), poseen enlaces de tipo .
Las proteínas son las macromoléculas más versátiles de las células. Cumplen funciones estructurales, de
catalizadores (enzimas), de transporte, de regulación, de protección y de almacenamiento Una de las
funciones más importantes de las proteínas es la de participar como catalizadores biológicos de reacciones
químicas importantes, es decir, compuestos que incrementan la velocidad de la reacción química sin alterarla.
El material en el cual el catalizador reacciona se llama sustrato, y es modificado durante la reacción para
formar un nuevo producto. El sitio activo de una enzima puede unirse con el sustrato, formando el complejo
enzima-sustrato. Es aquí donde ocurre la catálisis. Cuando ésta se completa, el complejo se disocia en
enzimas y productos.
Los lípidos son un grupo muy heterogéneo de macromoléculas que se definen por el hecho de que son
solubles en solventes en disolventes orgánicos como la gasolina, benceno, xilol, cloroformo, pero
prácticamente insolubles en agua. Los lípidos tienen una gran importancia biológica al ser un componente
estructural de las membrana biológicas; son una fuente importante de reserva energética, predominantemente
en la forma de triglicéridos; tanto vitaminas y hormonas son ejemplos ejemplos de lípidos y sus derivados.
El componente principal de las grasas o lípidos son los ácidos grasos, que son almacenados y transportados
en forma de triglicéridos (3 ácidos grasos unidos a una molécula de glicerol). Cuando en su molécula
contienen ácidos grasos insaturados, las grasas se presentan como aceites, tal es el caso de los vegetales. Si
contienen ácidos grasos saturados dan lugar a grasas sólidas o semisólidas, como ocurre en los animales
(sebos y mantecas). Desde el punto de vista nutritivo son la mayor fuente de calorías, siendo utilizadas como
reserva energética de uso no inmediato. Además, son portadoras de vitaminas liposolubles (A, D, E, K) y
contienen los llamados ácidos grasos esenciales, de gran importancia para el buen funcionamiento del
organismo. Algunos lípidos como el colesterol, forman parte importante de las membranas celulares.
Los lípidos se clasifican de varias formas, una de ellas es atendiendo a la presencia ácidos grasos
(saponificables) o no (no saponificables) en su composición, dividiéndose así en dos grupos:
LÍPIDOS SAPONIFICABLES
A. Simples
1. Acilglicéridos (grasas o aceites)
esteres de glycerol y triglicéridos
2. Céridos (ceras)
B. Complejos
1. Fosfolípidos
2. Glucolípidos
LÍPIDOS NO SAPONIFICABLES
A. Terpenos
B. Esteroides
C. Prostaglandinas
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Entre las grasas biológicamente importantes encontramos a los fosfolípidos, los carotenoides y esteroides.
Los fosfolípidos son un componente importante de la membrana celular, otros lípidos actúan como hormonas
y algunos funcionan como almacén de energía a largo plazo (1 gr de grasa almacena más del doble de energía
que 1 gr de carbohidratos).
En el laboratorio, es posible extraer conclusiones acerca de la identidad, composición (pureza, autenticidad) y
calidad (frescura, vida útil) de una grasa/aceite empleando diferentes métodos químicos o físico-químicos y
sensoriales. Entre los métodos químicos (índices) destacan el de saponificación (cantidad de hidróxido
potásico necesaria para la saponificación de 1 g de grasa), yodo (cantidad en gramos de yodo que resulta
ligada por cada 100 g de grasa), acidez (cantidad en miligramos de hidróxido potásico necesaria para la
neutralización de los ácidos grasos libres presentes en1 g de grasa) y de peróxidos (cantidad en miligramos
de oxígeno activo en 1 Kg de grasa).
III. Procedimiento
Durante la sesión de laboratorio se realizarán cuatro experimentos que le permitirán conocer los métodos
colorimétricos de detección y algunas propiedades químicas de las macromoléculas. . Para lograr éste
objetivo, los miembros pares o impares de cada uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera
sesión de laboratorio, realizarán y analizarán un experimento, de acuerdo a las indicaciones del instructor.
Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se reúnen para hacer una discusión de
los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir
sus resultados.
Experimento1
Reconocimiento y propiedades de proteínas
(A) Reconocimiento colorimétrico de proteínas
Los componentes más importantes del reactivo de Biuret son NaOH y CuSO4, siendo el ión Cu2+el que
reacciona con el grupo amino del enlace peptídico produciendo una coloración violeta. La intensidad de
la coloración está relacionada con el número de enlaces peptídicos (cantidad de proteínas) presentes y la
reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. Sin embargo, la sensibilidad
del método es muy baja y no se recomienda para cuantificación de proteínas excepto en preparados muy
concentrados (por ejemplo en suero).
1. Prepare 5 tubos de ensayos limpios y secos.
Si hay disponibilidad, los tubos de ensayo pueden sustituirse por placas de reacción
2. Rotule cada tubo y dispense las siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
4
5
Contenido
2 ml de albúmina
2 ml de leche
2 ml de solución de gelatina
2 ml solución de aminoácidos
2 ml de agua destilada
3. Agregue a cada tubo, 5 gotas del reactivo de Biuret y agite.
4. Observe cuidadosamente el cambio en la coloración en cada tubo. Describa sus observaciones en el
reporte.
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(B) Propiedades de las enzimas: Velocidad de reacción de la catalasa y el efecto del pH en la reacción
enzimática
La enzima catalasa es muy activa en todas las células. Cataliza la reacción que disocia el peróxido de
hidrogeno (agente oxidante fuerte) producto del metabolismo celular. En este experimento se usara una
suspensión de la enzima catalasa (cultivo de Saccharomyces cereviciae al 1.5 % , extracto de papa o
macerado de hígado) y el H2O2 como sustrato.
1. Formule una hipótesis de trabajo que relacione la presencia o no de la enzima catalasa en el cultivo
de levadura y el uso del H2O2 como sustrato. Prediga los resultados
2. Prepare 5 tubos de ensayos con la siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
4
Contenido
H2O
H2O2 (3%)
H2O2 (6%)
H2O2+ HCI
H2O
H2O2
5.0 ml
4.5 ml
4.0 ml
3.5 ml
0.0 ml
0.5 ml
1.0 ml
0,5 ml
H2O2/HCl H2O2/NaOH
(0,1 M)
(0.1 M)
0.0 ml
0.0 ml
0.0 ml
0.0 ml
0.0 ml
0.0 ml
1,0 ml
0,0 ml
H2O2+NaOH
3.5 ml 0,5 ml
0,0 ml
5
Nota: utilice la probeta graduada para H2O2, HCl y NaOH.
Complete con dH2O hasta obtener el volumen final (5 ml)
1,0 ml
3. Mida el pH en cada uno de los tubos de ensayo y anótelo en el reporte en el cuadro respectivo.
4. Tome con una pinza 1 disco de papel de filtro y sumérjalo por 5s en la
suspensión de catalasa
Verifique que extrae sólo un disco y que éste se encuentre libre
de residuos. Evite tocarlo con las manos.
5. Déjelo secar al aire ligeramente por unos 10 segundos.
6. Con otra pinza tome el disco y déjelo caer en uno de los tubos de ensayo
que preparó anteriormente con la concentración de sustrato y pH conocido
(no toque la solución con la pinza).
7. Tan pronto el disco detenga la caída en el tubo, marque ése punto e inicie el
cronómetro.
8. Al iniciarse la reacción observe cuidadosamente el movimiento del disco.
Cuando el disco alcance la superficie de la solución detenga el cronómetro.
Anote el tiempo transcurrido.
9. Mida la distancia (mm) que recorrió el disco. Con ese valor y el tiempo
transcurrido en el movimiento del disco, calcule la velocidad de reacción
como:
Velocidad de reacción
= (mm/s)
Distancia recorrida por el disco (mm) / tiempo
(seg).
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10. Repita este experimento (pasos 3 - 8) con otros 2 discos, utilizando el mismo sustrato. Si sus
resultados no son consistentes, repita el procedimiento hasta obtener valores similares.
En cada prueba debe utilizar una solución sustrato nueva
11. Repita el experimento en los otros tubos de ensayo utilizando otros discos (3 discos para cada tubo)
12. Reporte los datos obtenidos en el experiemnto, en un cuadro que diseñó previamente su grupo de
trabajo. Complete el cuadro en el reporte. Responda las preguntas del reporte.
Al finalizar el experimento, dispense el contenido de los tubos de ensayo en las
botellas debidamente rotuladas.
Experimento 2
Reconocimiento de carbohidratos
Algunos azúcares (mono y disacáridos con un grupo libre aldehído y cetónico) son agentes reductores en
soluciones alcalinas. El reactivo de Benedict es una solución alcalina que contiene iones cobre, los cuales
pueden oxidar grupos aldehídos. A su vez lo iones Cu se reducen a óxido cuproso que forma un precipitado
rojo. Cuando el reactivo de Benedict está en presencia de un azúcar reductor, éste produce cambios en la
coloración de la solución que varía de amarillo a verde o rojo dependiendo de la cantidad y el tipo del azúcar
presente, siguiendo la siguiente escala:
azul
verde
naranja
(-)
(+)
(++)
rojo
rojo-marrón
(+++)
(++++)
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El reactivo de Barfoed también reconoce azucares reductores. Sin embargo, no es tan reactivo como el
Benedict por lo que la velocidad con la que se forma el precipitado puede ser un indicativo entre mono o
disacáridos: un precipitado rojo que se forma en 5-7 min es indicativo de la presencia de monosacáridos
mientras, los disacáridos generalmente causan un precipitado entre 10-15 min. de calentamiento
Por otra parte, el reactivo de Seliwanoff es frecuentemente usado para discriminar entre cetosas y aldosas. En
ésta prueba el HCl concentrado actúa como agente dehidratante mientras el resorcinol actúa con el grupo
cetona para producir un precipitado color rojo. En presencia de aldosas , frecuentemente no se produce
ningúa cambio de coloración, aunque en ocasiones reaccionan produciendo un leve color rosa.
Otro reactivo frecuentemente utilizado para discriminar entre pentosas y hexosas es el reactivo de Bial.
Nuevamente, el agente dehidratante es el HCl concentrado, que en del compuesto orcinol y hierro, produce
un precipitado azul si una pentosa está presente en la solución.
Finalmente, compuestos a base de iodo reaccionan con polisacáridos que producen soluciones de diferentes
colores. Específicamente, la amilosa rinde un color azul–negro oscuro, mientras la celulosa forma un
precipitado rojo-marrón y el glicógeno produce rojizo. Monosacáridos y disacáridos son demasiado pequeños
para reaccionar con el I2/KI. Es así que esta prueba permite distinguir entre mono/disacáridos y polisacáridos.
También permite evaluar el curso temporal de la hidrólisis de algún polisacárido.
Consideraciones de seguridad
Reactivo de BENEDICT
Irritante de ojos, piel y tracto respiratorio,si es ingerido produce problemas estomacales
serios
Reactivo de BARFOED, BIAL y SELIWANOFF
Son corrosivos de ojos y piel; si son ingeridos producen graves problemas estomacales
DETECCIÓN DE POLISACÁRIDOS
1.
Prepare 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
4
Contenido
dH2O
Almidón (1%)
Glucosa (1%)
Sustancia desconocida (1%)
2.
A cada uno de los tubos de ensayo, añada 3 gotas de reactivo de Lugol y mezcle ligeramente.
3.
Anote en el reporte la coloración final obtenida a los 20 minutos.
DETECCIÓN DE AZUCARES REDUCTORES
1. Prepare otros 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
Contenido
dH2O
Lactosa (1%)
Sacarosa (1%)
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4
Sustancia desconocida (1%)
2. A cada uno de los tubos, añada 3 gotas del reactivo de Benedict y mezcle ligeramente.
3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 5-10 min y observe regularmente los cambios en la
coloración de la solución. Anote en el reporte sus observaciones.
4. Al finalizar los 10 min, remueva todos los tubos y los coloca en la gradilla.
DETECCIÓN DE AZUCARES SIMPLES
1. Prepare otros 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
4
Contenido
dH2O
Glucosa (1%)
Sacarosa (1%)
Sustancia desconocida (1%)
2. A cada uno de los tubos, añada 4 gotas del reactivo de Barfoed. Mezcle ligeramente
3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 5-10 min y observe cuidadosamente el tiempo y
los cambios en la coloración del precipitado. Anote las observaciones
4. Luego de 10 min remueva todos los tubos y los coloca en la gradilla.
DETECCIÓN DE PENTOSAS
1. Prepare otros 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
4
Contenido
dH2O
Ribosa (1%)
Fructosa (1%)
Sustancia desconocida (1%)
2. A cada uno de los tubos, añada 4 gotas del reactivo de Bial. Mezcle ligeramente
3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 1-3 min y observe cuidadosamente la coloración
del precipitado. Anote las observaciones
4. Al finalizar la prueba, remueva todos los tubos y los coloca en la gradilla.
DETECCIÓN DE CETOSAS
1. Prepare otros 4 tubos de ensayos, y dispense 1 ml de las siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
4
Contenido
dH2O
Fructosa (1%)
Glucosa (1%)
Sustancia desconocida (1%)
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2. A cada uno de los tubos, añada 4 gotas del reactivo de Seliwanoff. Mezcle ligeramente
3. Coloque los tubos de ensayo en baño de maría por 1-3 min y observe cuidadosamente la coloración
del precipitado. Anote las observaciones
4. Al finalizar la prueba, remueva todos los tubos y los coloca en la gradilla.
Al finalizar el experimento, complete el cuadro en el reporte y describa los resultados obtenidos.
Dispense el contenido de los tubos de ensayo en las botellas debidamente rotuladas y lave
completamente todo el material utilizado.
Experimento 3
Reconocimiento y propiedades de lípidos
Este experimento está organizado para que lo realicen dos subgrupos de trabajo y consta de tres
partes: detección colorimétrica de lípidos en solución, descripcíon de dos propiedades generales
(saponificación y emulsificación) y, descripción de una propiedad específica de los lípidos.
(A) Reconocimiento de lípidos
El reconocimiento de los lípidos se realiza con el colorante Sudán III, un colorante liposoluble que tiñe las
grasas selectivamente de color rojo-anaranjado. En presencia de una mezcla de lípidos y agua, Sudán III se
mueve hacia la capa de lípidos, formando una banda roja.
1. Prepare 5 tubos de ensayo con las siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
4
Contenido
1 ml dH2O
1 ml aceite vegetal
1 ml leche regular
1 ml de solución desconocida
2. A cada uno de los tubos de ensayo, añada 5 gotas de Sudan III.
3. Mezcle el contenido de cada tubo y anote en el reporte el color del contenido del tubo.
4. Para comprobarla solubilidad de los lípidos en disolventes orgánicos, coloque en un tubo de ensayo: 1 ml
de aceite+ 1 gota de Sudán III + 10 ml de acetona.
5. Tape y agite enérgicamente. Espere unos segundos. Describa sus resultados.
(B) Propiedades generales de lípidos
Los lípidos más abundantes son los que posen ácidos grasos, es decir, los lípidos saponificables. De ellos
los triglicéridos (grasas y aceites) son los más característicos
En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicas
(lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina. En este caso, la enzima lipasa es
hidrosoluble pero su sustrato (triacilgliceroles) no lo es, por lo que se hace importante la participación de
agentes emulsificantes (sales biliares) que reducen la tensión superficial de las grasas, separando las
grasas en gotas mas pequeñas, aumentando así el área superficial de exposición a la acción enzimática.
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Los ésteres de ácidos grasos reaccionan en caliente con el hidróxido de sodio o potasio
descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan
con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones (saponificación).
En este experimento demostraremos dos propiedades generales de las grasas: saponificación y
emulsificación por detergentes
(a) Saponificación
1. Prepare 2 tubos de ensayo. Dispense las siguientes soluciones:
Tubo
1
2
3
4
Contenido
1 ml dH2O
1 ml aceite vegetal
1 ml aceite de coco
1 ml de solución desconocida
2. En un tubo añada 1ml de aceite (sin pipetearlo). En al otro, añada 1 ml de una solución
desconocida.
3. Añada 5 ml de NaOH 0.5 M a cada y agite enérgicamente. Observe la apariencia y coloción de la
solución. Anote sus observaciones
4. Caliente al baño María por unos 20-30 minutos. Al finalizar este tiempo, retire los tubos de
ensayo y colóquelos en la gradilla.
5. Describa en el reporte, la apariencia y coloración de la preparación resultante.
(b) Emulsificación
1. Dispense 3ml de aceite a dos tubos de ensayo. A uno de ellos añada 3 ml de dH2O (puede teñir el
agua con cualquier colorante vegetal para facilitar la observación). Describa que pasa en la mezcla
agua: aceite.
2. Al segundo tubo de ensayo con aceite, añada 3 ml de agua y 2 gotas de solución de detergente
liquido.
3. Tape ambos tubos y agite enérgicamente. Observe qué pasa en cada tubo inmediatamente después
de agitar. Luego haga observaciones al transcurrir 1 min, 5 min y 30 min. Haga un registro de sus
observaciones.
(c) Prueba de Acetato de cobre
La presencia en partes iguales de acetato de cubre y éter, permite diferenciar entre lípidos saturados
(origen animal) , insaturados (origen vegetal) y neutros. En el caso de acidos grasos saturados, una sal
cúprica del acido graso no se disuelve en el éter de petróleo y precipita en el fondo del tubo de ensayo,
mientras la sal cúprica del ácido graso insaturado, se disuelve en el éter de petróleo, formando una
banda superior de coloración azul-verdosa
1.
En un tubo de ensayo, dispense las siguientes soluciones:
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10
Tubo
1
2
3
4
Contenido
1 ml dH2O
1 ml aceite de oliva
1 ml aceite de coco
1 ml de solución desconocida
2.
Añada a cada tubo, 3 ml de éter de petróleo e igual volumen de acetato de cobre (1%).
3.
Tape la boca del tubo de ensayo y mezcle, inviertiendo el tubo de ensayo una sóla vez.
4.
Coloque cada tubo de ensayo en la gradilla y observe la separación de bandas.
5.
Describa el número y características de las bandas que se forman. Anote sus observaciones en el
reporte
Experimento 4
Reconocimiento de macromoléculas en alimentos
En la semilla, proteínas, carbohidratos y lípidos, se encuentran en diferente proporción y son importantes
para el desarrollo del embrión que dará pie a la germinación de la planta.
Este experimento utiliza semillas de maní, frijol, maíz y arroz para aplicar las pruebas colorimétricas de
reconocimiento de macromoléculas.
Se utilizarán las mismas pruebas descritas en los experimentos previos para identificar la presencia y la
abundancia relativa de las macromoléculas en las semillas.
1. Seleccione 6 semillas de las que se encuentren disponible (girasol, maní, frijol, maíz, arroz, almendra).
2. Realice un corte longitudinal cerca de la mitad del grano, y coloque la parte con el mejor corte de cada
semilla en una fila de la placa de reacción o en tubos de ensayo separados y rotulados para cada
semilla.
3. Por filas, en la placa de reacción, agregue 2-5 gotas de los siguientes reactivos en cada espacio:
reactivo de Biuret, lugol, Sudán III y reactivo de Benedict previamente calentado. En el caso de
trabajar con tubos de ensayo, coloque las gotas de reactivo de manera que todas las semillas sean
probadas con cada reactivo.
4. Espere unos segundos. Elabore un cuadro, anote sus resultados y responda las preguntas especificadas
en el reporte.
Al finalizar los experimentos de esta práctica, debe prestar especial atención en dejar
limpios todos los materiales utilizados y el área de trabajo.
Los tubos de ensayo deben quedar limpios, sin residuos y colocados boca-abajo en sus
respectivas gradillas para permitir el secado rápido.
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