tema "extracción de adn"

TEMA
"EXTRACCIÓN DE ADN"
Laboratorio de bilogía molecular
COORDINACIÓN DE BIOSEGURIDAD, UNIDAD IZTAPALAPA
Elaboró:
Q. A. José Miguel Angel Castillo Minjarez
Técnico en control de calidad y trazabilidad de muestras de OGMs
EXTRACCIÓN DE ADN
EL ADN
El ácido desoxirribonucleico o ADN, es el ácido nucleico que contiene las
instrucciones genéticas usadas
en
el
desarrollo y
funcionamiento
de
todos
los organismos vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su transmisión
hereditaria. El papel principal de la molécula de ADN es el almacenamiento a largo plazo
de la información. Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos
(polinucleótido).
Cada nucleótido está formado por la desoxirribosa, una base nitrogenada que puede
ser adenina (A), timina(T), citosina (C) o guanina (G) y un grupo fosfato. La disposición
secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la información
genética. El ADN se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos
hebras están unidas. La union de los nucleotidos ocurre entre el grupo fosfato y el azucar,
mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molecula. Las bases de
cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrogeno y mantienen estable la
estructura helicoidal.
Bases nitrogenadas (purinas y pirimidinas)
Watson y Crick postulan que el ADN nativo consiste en dos cadenas antiparalelas en una
disposición de doble hélice. Hay apareamiento complementario de pares de bases (AT y
GC), se forman por enlaces de hidrógeno dentro de la hélice.
La historia del ADN puede pensarse que comenzó en 1865, cuando Gregor Mendel
descubre a través de experimentos de reproducción con chicharos, que los rasgos se
heredan. En 1866, Ernst Haeckel propone que el núcleo contiene los factores responsables
de la transmisión de los caracteres hereditarios. Entre 1884 y 1885, Oscar Hertwig ,
Albrecht von Kflliker, Eduard Strasburger y August Weismann proporcionan evidencia de
que el núcleo de la célula contiene la base de la herencia. En 1889, Richard Altmann
introduce por primera vez el nombre de ácido nucleico para una sustancia que hasta ese
momento era conocida como nucleina. En 1929, Phoebus Levene identifica los
componentes básicos del ADN, incluyendo las cuatro bases: adenina (A), citosina (C),
guanina (G) y timina (T). En 1953, James Watson y Francis Crick descubren que la
estructura molecular del ADN es una doble hélice en la que A siempre se aparea con T y C
siempre con G.
James Watson
Francis Crick
Pero es en el año de 1869 cuando Friedrich Miescher aísla ADN por primera vez. Los
experimentos que realizó con vendas quirúrgicas lo llevaron a obtener un precipitado
floculento que llamó “nucleína” y que finalmente se llamaría ácido desoxirribonucleico.
Friedrich Miescher
Métodos de extracción
La extracción de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios
de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En el caso del
ADN, la extracción consiste en su aislamiento y purificación basándose en las
características fisicoquímicas de la molécula. Los grupos fosfato están cargados
negativamente y son polares, lo que le confiere una carga neta negativa al ADN,
haciéndolo altamente polar y permite disolverlo en soluciones acuosas y formar una capa
hidratante alrededor de la molécula. Cuando se pone en presencia de etanol, se rompe la
capa hidratante, quedando expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se
favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las
cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite. Por otro lado, la carga neta
negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas
positivamente.
A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos de extracción con la finalidad de
obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de
inhibidores potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Para elegir el
método más adecuado, se pueden emplear los criterios siguientes:
 ácido nucleico diana;
 organismo fuente;
 material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
 resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación);
 uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de
ADNc, etc.).
Métodos tradicionales
Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50’s, utilizan solventes orgánicos
para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por
precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción
puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben
realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales:
homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y
redisolución del ADN.
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es necesario lisar la celular,
inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos celulares. El
procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser
suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero
suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos
usuales de lisis figuran los siguientes:
 rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);
 tratamiento químico (uso de detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles,
etc.);
 digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo
tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que solubilicen las
membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares.
Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan
fácilmente por filtración o precipitación.
Separación de proteínas y lípidos
En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y
ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para
separarlos en medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en
solventes orgánicos. La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que
permite aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el
cloroformo y el alcohol isoamílico. Estos reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo
que se debe evitar acarrearlos en el proceso de purificación.
Precipitación del ADN
Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN. Para ello,
se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que
se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas
y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble. Un paso de
centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol
es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el
remanente se elimina por evaporación.
Redisolución del ADN
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para
mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para permitir la
redisolución completa del ADN y evitar una hidrolisis ácida. Cuando se utiliza una solución
amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un
pH de 8.0 (low TE) para almacenar el material. Cuando se está disolviendo el ADN es
importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden fragmentar moléculas
de alto peso molecular. Una opción que evita la fragmentación consiste en incubar a 55°C
el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave.
Método de extracción con CTAB
El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por
Murray y Thompson en 1980 y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus
colaboradores. El método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y
alimentos derivados de vegetales y está especialmente indicado para eliminar los
polisacáridos y los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza del
ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en genética
molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validación para detectar
OGM. Se han elaborado algunas variantes adicionales para adaptar el método a una
amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin transformar.
Principios del método del CTAB: lisis, extracción y precipitación
Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetil
amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucléicos en medio
hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás
contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El
complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentración salina y se precipita con
etanol o isopropanol. En esta sección se describirán los principios de las tres etapas
principales: la lisis de la membrana celular, la extracción del ADN genómico y su
precipitación.
Lisis de la membrana celular: La primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la
membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con
el tampón de extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas
biológicas presentan la misma estructura general, integrada por moléculas de lípidos y de
proteínas, unidas por interacciones no covalentes.
Representación simplificada de las membranas celulares
Las moléculas lipídicas están ordenadas en una doble capa continua, en la que las
moléculas proteínicas están «disueltas». Las moléculas lipídicas están formadas por
extremos hidrófilos, denominados “cabezas”, y extremos hidrófobos, denominados “colas”.
En este método, el detergente (CTAB) contenido en el tampón de extracción provoca la
lisis de la membrana. Dado que la composición de los lípidos y del detergente es similar, el
componente de CTAB del tampón de extracción captura los lípidos que integran la
membrana celular y nuclear. A continuación se muestra el mecanismo de solubilización de
los lípidos con un detergente.
Solubilización de los lípidos.
En la imagen siguiente se muestra cómo se libera el ADN genómico cuando el detergente
captura los lípidos y las proteínas al entrar en contacto la membrana celular y el tampón de
extracción con CTAB. Con una concentración salina (NaCl) determinada, el detergente
forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. El EDTA es un componente
quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la
desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa
presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solución la capacidad de amortiguar el pH.
Los ácidos nucleicos se degradan fácilmente en esta fase de la purificación, debe reducirse
al mínimo el tiempo transcurrido entre la homogeneización de la muestra y la adición de la
solución tampón con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la célula y de los
orgánulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos),
se purifica el ADN.
Rotura de la membrana celular y extracción del ADN genómico.
Extracción - En esta etapa, se separan los complejos formados por los ácidos nucleicos y
el CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y los demás lisados
celulares disueltos en la solución acuosa. Es especialmente importante eliminar los
polisacáridos y los compuestos fenólicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones
enzimáticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los
complejos de ácidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solución
acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de
las fases acuosa y orgánica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante,
si dicha fase es densa debido a la concentración salina (> 0,5 M), formará la fase inferior.
Además, si el pH de la solución acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 – 8,0),
los ácidos nucleicos tenderán a repartirse en la fase orgánica. Si es preciso, la extracción
con cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las
impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extracción de los ácidos nucléicos,
puede retroextraerse la fase orgánica con una solución acuosa, que se añade a
continuación al extracto anterior. Una vez purificados los complejos de ácidos nucleicos,
puede procederse a la precipitación, última etapa del procedimiento.
Precipitación - En esta última etapa se separan los ácidos nucleicos del detergente, para
lo cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación compuesta
por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta
concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado de ácidos nucleicos.
Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampón.
En estas condiciones, el detergente, que es más soluble en alcohol que en agua, puede
eliminarse por lavado, mientras que los ácidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento
con etanol al 70 % permite una mayor purificación o elución de los ácidos nucleicos de la
sal residual.
Métodos comerciales
A partir de los años 90 se introdujeron al mercado combos o kits de extracción que utilizan
matrices inorgánicas compactas cargadas positivamente capaces de retener varios
microgramos de ADN y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un
extracto libre de inhibidores. Los combos se venden en presentación de membranas de
sílice o perlas magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las segundas
consisten de un centro de hierro recubierto por resina. La membrana esta insertada dentro
de un microtubo de polipropileno y las microesferas se encuentran suspendidas en una
solución amortiguadora. Durante la extracción, el ADN cargado negativamente se adsorbe
o une a la matriz selectiva de manera reversible y se mantiene unido a esta durante la
remoción de lípidos, proteínas y metabolitos secundarios, posteriormente la molécula se
libera de la matriz. Los combos también incluyen soluciones de lisis, unión y lavado que no
contienen fenol ni cloroformo para extraer proteínas, tampoco requieren etanol para
precipitar al ADN. Los kits comerciales reducen la extracción a unas cuantas horas porque
reducen el número de pasos del procedimiento y, utilizados bajo las recomendaciones de
cada proveedor, pueden permitir una extracción de alta pureza.
Unión del ADN a la matriz inorgánica y lavado
En el caso del kit con membrana de sílice, en algunos casos a la mezcla de lisis se le
añade la solución de unión que tiene un pH específico. Antes de pasar la solución de lisis a
través de la columna, se adiciona etanol a la solución, eliminando la capa hidratante del
ADN y exponiendo sus grupos fosfato, facilitando con ello la adsorción de la molécula a la
membrana cargada positivamente. Los lípidos y proteínas no son afines a la membrana y
se eliminan con ayuda de la solución de lavado y un ciclo de centrifugación, mientras que
el material genético permanece unido a la matriz. El kit con perlas magnéticas además de
utilizar soluciones a pH específicos, utiliza un imán o magneto que atrae a las perlas para
separarlas de las soluciones en las que se encuentran suspendidas. En este caso, se
añade a la solución de lisis una solución amortiguadora a pH ácido que permite que las
perlas se carguen positivamente, favoreciendo la unión de ADN. Las proteínas y lípidos
tienen baja afinidad por las perlas y son eliminados con soluciones de lavado a pH
fisiológico. Las perlas son retenidas en la pared del microtubo con el magneto, mientras
que la solución con los contaminantes se eliminan por pipeteo.
Recuperación del ADN de la matriz
En los kits es necesario liberar al ADN de la matriz. La membrana y el ADN se deshidratan
con soluciones de lavado y ciclos de centrifugación, después se recomienda centrifugar
nuevamente la columna para evaporar el etanol y eliminar el exceso de las soluciones.
Posteriormente, se adiciona agua o solución amortiguadora al centro de la membrana, se
espera a que el ADN se hidrate, se centrifuga para recuperarlo de la matriz y
resuspenderlo. En el protocolo de perlas magnéticas se utiliza una solución básica de TrisHCl 10 mM a pH 8.5 para neutralizar la carga de las perlas. El ADN se separa de las perlas
y transfiere a otro tubo, mientras que las perlas continúan siendo retenidas por el magneto.
Es necesario saber que la mayoría de los kits tienden a ser generales a la hora de su
aplicación, pero se diseñan con un propósito específico. Por ejemplo, un kit para extraer
ADN de sangre total, considera la presencia de hemoglobina y eritrocitos durante el
proceso. Este método será más agresivo en comparación con un kit diseñado para extraer
ADN de células o tejidos animales. En los manuales proporcionados por el fabricante se
detallan, además de los pasos a seguir en cada caso, la cantidad de muestra
recomendada y el rendimiento esperado de acuerdo al tipo de tejido. Esta información
debe tomarse en cuenta al momento de elegir un kit.
Bibliografía

Dahm, R. (2005). Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Developmental
Biology, 278(2), 274-288.

Nelson, D. L. and Cox, M. M. (2005). Lehninger Principles of Biochemistry. Fourth
Edition. Publisher: W.H. Freeman ISBN: 0716743396.

Somma, M. Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en
Muestras de Alimentos. Extracción y Purificación de ADN. ORGANIZACIÓN
MUNDIAL DE LA SALUD, OFICINA REGIONAL PARA EUROPA. JRC. COMISIÓN
EUROPEA.

Watson, J. D., & Crick, F. H. (1953). Molecular structure of nucleic acids. Nature,
171 (4356), 737-738.