aislamiento e, identificación de microorganismos a partir de
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PONTIFICIA UNIVERISAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION INDUSTRIAL JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar al título de Microbiólogo Industrial Directora ANDREA CAROLINA AGUIRRE Codirectora SANDRA JANETH SANTOS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. 2011 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION INDUSTRIAL JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI APROBADO Dra. INGRID SCHULER GARCÍA Ph.D Decana académica Dra. JANETH ARIAS PALACIOS M.ScM.Ed Directora de carrera PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. 2011 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION INDUSTRIAL JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI ANDREA CAROLINA AGUIRRE M.Sc Directora SANDRA JANETH SANTOS Codirectora LUIS DAVID GÓMEZ M.Sc Jurado PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. 2011 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946. AGRADECIMIENTOS A Andrea Aguirre, Carval de Colombia, Sandra Janeth Santos, al laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana y en su nombre, Balkys Quevedo, por su ayuda, sin la cual este proyecto no hubiera sido posible. TABLA DE CONTENIDO Página 1. RESUMEN 7 2. INTRODUCCIÓN 8 3. MARCO TEÓRICO 9 4. JUSTIFICACIÓN Y PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 11 5. OBJETIVOS 12 5.1 OBJETIVO GENERAL 12 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12 6. METODOLOGÍA 12 6.1 RECOLECCIÓN DE MUESTRAS 12 6.2 MUESTREO INICIAL 12 6.3 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 13 6.4 CONSERVACIÓN INICAL DE CEPAS 13 6.5 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA 14 6.6 CONSERVACIÓN FINAL DE CEPAS 14 7. RESULTADOS 15 7.1 MUESTREO INICIAL 15 7.2 MUESTREOS 16 7.2.1 RECUENTO DE MUESTREOS 16 7.2.2 COLORACIONES DE GRAM 20 7.3 IDENTIFICACIONES BIOQUÍMICAS 22 8. DISCUSIÓN 26 9. CONCLUSIONES 33 10. RECOMENDACIONES 34 11. BIBLIOGRAFÍA 35 12. ANEXOS 40 1. RESUMEN Los probióticos han entrado en auge en los últimos años por su aplicación como medicina preventiva y en el campo agrícola se ha buscado reducir el uso de antibióticos promotores de crecimiento (APCs), mejorar la alimentación de los animales y también, evitar las enfermedades causadas por patógenos entéricos. En este estudio se aplicaron metodologías para el aislamiento de microorganismos con presuntiva capacidad probiótica a partir de heces de vertebrados como aves (gallinas de engorde), ganado porcícola (cerdos de engorde), ganado vacuno (rumiantes de engorde) y caninos (como mascotas domésticas). Se identificaron un total de 60 microorganismos mediante pruebas bioquímicas usando baterías API (Biomerieux®) obteniendo bacterias Ácido Lácticas como Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus rhamnosus, L. pentosus, L. paracasei ssp. paracasei y L. brevis. Bacilos esporulados como Bacillus subtilis/amyloliquefaciens, B. megaterium y B. licheniformis. Se identificaron levaduras sin reportes bibliográficos encontrados en cuanto a probiosis Geotrichum sp., Kloeckera sp., Cryptococcus terreus y varias especies de Candida. Los resultados obtenidos son preliminares para la futuros estudios que permitan la evaluación de la capacidad probiótica de estas cepas tanto in vitro como In vivo. 2. INDTRODUCCIÓN Los probióticos son microorganismos vivos que, cuando son suministrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio sobre el huésped (1). Dentro de las aplicaciones que se les ha dado a estos productos están medicinales como antialérgicas (2), contra la diarrea, contra infecciones urinarias, contra el cáncer de colon, entre otras (3). Quizá la aplicación más estudiada y comercial es la de colonización intestinal para la defensa contra patógenos entéricos como Shigella, Salmonella y Escherichia coli. Existen productos derivados de la leche, como el yogurt, que contienen Bacterias Ácido Lácticas como las Bifidobacterias y Lactobacilos que al colonizar el tracto digestivo humano, previenen enfermedades causadas por ciertos patógenos (4). Se ha sugerido que le eficiencia en la nutrición animal se debe principalmente a los microorganismos nativos del tracto digestivo (5). Se han descrito dos mecanismos de acción principales que emplean los probióticos responsables del beneficio para el huésped animal y humano: 1) El efecto nutricional caracterizado por la reducción de reacciones metabólicas que producen sustancias tóxicas, estimulación de enzimas propias del huésped, producción de vitaminas y minerales y secreción de antimicrobianos. 2) El efecto de salud distinguido por el incremento en la resistencia de colonización contra patógenos mediante la competencia de adhesión a la superficie intestinal, competencia por sustrato, secreción de bacteriocinas y estimulación de la respuesta inmune (5, 6). Los probióticos son común denominador en dietas recomendadas por nutricionistas y ahora se conoce que consumir productos a base de microorganismos estudiados con fines probióticos optimizan las funciones que ejerce el aparato digestivo, bien sea de humanos o de animales. El futuro de los probióticos está direccionado hacia el mercado del cuidado personal y de la salud animal. Se busca que éstos puedan ser usados en la prevención o alivio de síntomas o enfermedades específicas, especialmente para la población de recién nacidos, la tercera edad o personas inmunosuprimidas (2). En el presente estudio se tuvo como objetivo aislar e identificar bioquímicamente microorganismos con potencial de capacidad probiótica presuntiva (Bacterias Ácido Lácticas, Levaduras y Bacilos esporulados) a partir de muestras fecales de animales de interés agroindustrial y doméstico. 3. MARCO TEÓRICO 3.1 Probióticos Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), los probióticos son microorganismos vivos que cuando son suministrados en cantidades adecuadas, confieren un efecto benéfico sobre el huésped (1). El concepto de probiosis también abarca la exclusión competitiva para mejorar una ecología microbiana específica. Existen diferentes tipos de microorganismos que son considerados probióticos; entre ellos están las bacterias Ácido Lácticas, los bacilos formadores de espora (Bacilos Esporulados) y las levaduras (7, 8). Estos microorganismos se le han atribuido también efectos de estimulación en la digestión y mantenimiento en la flora intestinal tanto de humanos como animales. De esta manera ayudan a contrarrestar el estrés causado por cambios en la dieta y proveen una línea de defensa contra patógenos. Ciertos microorganismos probióticos secretan enzimas, vitaminas y otras sustancias consideradas como factores de crecimiento que llevan a aumentas la eficiencia en la producción animal (9). Se ha estudiado la capacidad de estos microorganismos de producir sustancias antimicrobianas conocidas como bacteriocinas, que inhiben el crecimiento y reproducción de patógenos entéricos (10). 3.2 Bacterias Ácido Lácticas Son denominadas de ésta manera por su capacidad de producir ácido láctico a partir de carbohidratos como la glucosa, fructosa, manosa, etc. Tienen morfología microscópica cocoíde o bacilar y reaccionan positivamente ante los colorantes de Gram (8). Entre las bacterias de este tipo, las más reportadas y comúnmente empleadas están: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. crispatus, L. gasseri, L. paracasei, L. reuteri y L. rhamnosus (3). 3.3 Bacilos esporulados Existen bacterias capaces de formar una estructura denominada espora que le permite asegurar su supervivencia en condiciones adversas o extremas como insuficiencia de agua o nutrientes, temperaturas elevadas, niveles de pH ácidos o alcalinos, etc. Presentan morfología bacilar al microscopio y reacción positiva a los colorantes de Gram (3). Estos microorganismos, aunque existen especies consideradas patógenas, también existen otros con reportes y usos por sus capacidades probióticas. El más ampliamente conocido en este campo es Bacillus subtilis (5). 3.4 Levaduras Ciertos hongos presentan una morfología llamada levaduriforme. Esta se caracteriza por ser de mayor tamaño que las bacterias y presenta una reacción positiva ante los colorantes de Gram, aunque a diferencia de las bacterias, esta se debe por la afinidad al colorante Cristal Violeta y no por la presencia de peptidoglicano en la pared como ocurre en las bacterias Gram positivas (8). Saccharomyces cerevisiae y S. boulardii se han usado durante muchos años como suplemento alimenticio por su alto contenido proteico, además ser utilizado como agente anti diarreico en humanos. Las características atribuidas a estos microorganismos para ser utilizados en animales son: su producción de minerales, vitaminas hidrosolubles y enzimas; mejora en la eficiencia alimentaria dada por la mejora en la absorción de nutrientes en el huésped (por el control de la diferenciación y proliferación de células epiteliales en el intestino), control la flora intestinal y reducción de olores en las excretas (9). 3.5 Mecanismos de acción implicados en la probiosis Principalmente, los probióticos son conocidos como una línea de defensa contra patógenos causantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) (10) por varias razones: su adhesión a las células del intestino causa una competencia por espacio y nutrientes contra los patógenos, producción de bacteriocinas que afectan el crecimiento de éstos, modulación de la respuesta inmune causada como respuesta a la pared de las bacterias Ácido Lácticas (ácido lipoteícoico) que ayuda a los antígenos de membranas celulares de las células epiteliales causando una interacción que desencadena una producción de citoquinas, proliferación de células mononucleares, macrófagos y células NK (natural killers) (3). Bajo estas razones es que se hace interesante el uso de estos microorganismos como sustitución a la terapia antibiótica en animales por terapias probióticas, puesto que tienen efectos similares en cuanto a la defensa del animal y su crecimiento saludable, sin embargo, los probióticos ofrecen una mejor alternativa por menores costos de producción y salubridad tanto humana como del animal. 4. JUSTIFICACIÓN Y PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 4.1 JUSTIFICACIÓN Los probióticos han entrado en auge en los últimos años con ventas de preparados a base de leche con adición de una carga de Bifidobacterias, Lactobacilos y Lactococos con los cuales se busca la colonización del tracto digestivo, eviten la enfermedad de patógenos entéricos y ayuden a regular el metabolismo (7-10). Esto ha sido aplicado, en gran parte para humanos, sin embargo, en Colombia no ha habido grandes estudios respecto a la producción de biopreparados para la industria agropecuaria. Se ha encontrado que en la producción industrial de animales, como la avicultura y la porcicultura, ocurren condiciones en donde los mayores costos y pérdidas económicas son causados por infecciones con virus, bacterias, hongos y protozoos y por la inversión de antibióticos profilácticos y como factor de crecimiento empleados (7). Los antibióticos promotores del crecimiento (APC) se usan para aumentar la eficiencia en la absorción de nutrientes en las aves y para el aumento en peso corporal. Bajo reglamentación, se establece que los APC no deben causar daño al consumidor y no deben dejar residuos de compuestos relacionados bien sea en la carne o en los huevos. Sin embargo, no se conoce un estudio fiable que cuantifique con exactitud dichos compuestos (8, 9). El uso de los APC ha llevado a una pérdida del balance de la flora intestinal y desarrollo de resistencias a antibióticos por parte de los microorganismos que pueden ser patógenos para animales o humanos (5). Con la tendencia global a evitar consumir lo que se ha inundado con químicos, en este caso siendo los APC, los productos a base de probióticos como Bactocell® (7, 11) son una alternativa que puede proveer nuevas tendencias en la agricultura. En la industria de ganado vacuno, se ha encontrado que los antibióticos suministrados a estos animales reducen de manera drástica la población microbiana en el intestino inferior lo que causa dificultades en asimilación de nutrientes para el animal y establecimiento de patógenos (12). Se conoce que para la digestión de nutrientes en estos animales se necesitan de microorganismos, en especial para la degradación de celulosa (13) Es por esto que es adecuado aplicar métodos para el aislamiento de microorganismos con capacidad probiótica presuntiva para su posterior caracterización e implementación en el mercado agropecuario. 4.2 Pregunta de investigación ¿Es posible aislar géneros de microorganismos de presuntiva capacidad probiótica a partir de heces de ganado bovino, porcícola, avícola y de caninos? 5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general: Aislar e identificar microorganismos con capacidad probiótica presuntiva a partir de muestras fecales de animales de producción industrial y de comercio agrícola. 5.2 Objetivos específicos: - Aislar microorganismos a partir de heces bovinas, avícolas, porcícolas y caninas. - Identificar bioquímicamente los microorganismos previamente aislados 6. METODOLOGÍA 6.1 Recolección de muestras Se recolectaron muestras de: - Heces caninas - Heces bovinas - Heces porcícolas - Heces avícolas Las muestras provinieron de granjas ubicadas en el Valle del Cauca, Colombia. Se enviaron para su procesamiento en refrigeración bajo correo certificado. 6.2 Muestreo inicial Previo al muestreo se realizó un estudio para tener una aproximación a la población microbiana capaz de crecer en los medios MRS, YGC y Plate Count. Es este último se dio un tratamiento térmico para así limitar el crecimiento a microorganismos esporulados (80°C durante 10 minutos y choque en frío a 20°C durante 10 minutos) (14). Se procesaron muestras de cada animal al momento de la recepción de cada una. Se realizaron diluciones seriadas en base 10, hasta obtener una dilución correspondiente a 10 -15. Se sembraron todas las diluciones por superficie (0.1mL) y se incubó a 37°C para bacterias (medios MRS y Plate Count) y 30°C para levaduras (medio YGC), durante 48 horas. También se realizó un estudio para evaluar si las condiciones aeróbicas afectaban el crecimiento de los microorganismos crecidos en el medio de cultivo MRS. A partir de los resultados del muestreo inicial, se tomaron las muestras que arrojaron el recuento mayor contable y se sembraron las diluciones 10-5 y 10-6 por duplicado, incubando un duplicado en condiciones de microaerofilia, generado por el sistema GENEBOX de Biomerieux® y el otro en condiciones aeróbicas. 6.3 Procesamiento de muestras De cada muestra se pesaron 10 gramos que fueron diluidos en 90mL de agua peptonada. Se realizaron diluciones seriadas en base 10 hasta 10-8 tomando como referencia los resultados del muestreo inicial realizado previamente. Se sembró 0,1 mL por en agar MRS, YGC y Plate Count. En este último se le dio un tratamiento térmico para así limitar el crecimiento a microorganismos esporulados (80°C durante 10 minutos y choque en frío a 20°C durante 10 minutos) (13). Se incubó a 37°C para bacterias (medios MRS y Plate Count) y 30°C para levaduras (medio YGC), durante 48 horas. A cada morfotipo de colonia crecida se le realizó coloración de Gram y se purificaron según los siguientes criterios (anexo 2, tabla VII): Colonias crecidas en MRS: cocos o bacilos Gram positivos Colonias crecidas en YGC: levaduras ligeramente ovoides de gemación única Colonias crecidas en Plate Count: bacilos Gram positivos esporulados 6.4 Conservación inicial de las cepas Las colonias aisladas se conservaron realizando repiques cada 30 días en los medios originales para posteriores trabajos y conservación de las mismas (8). Se realizó un banco de transporte correspondiente a 3 viales por microorganismo purificado, creciendo las colonias en tubos de 13x100 con 5mL del medio de cultivo correspondiente, 100rpm, 37°C para bacterias y 30°C para levaduras por 16 horas. Posterior al crecimiento se agregaron con un volumen final de 1mL a un tubo eppendorf con glicerol para obtener una concentración final de glicerol al 10% (v/v). Los viales se conservaron a -70°C y se reactivaron una semana después de preparado el banco, en el mismo medio en donde originalmente ser aisló cada microorganismo. 6.5 Identificación bioquímica Los microorganismos se identificaron mediante las pruebas de API 50 CHL (para colonias crecidas en agar MRS), API 20C AUX (para colonias crecidas en agar YGC) y API 50 CHB (para colonias crecidas en Plate Count), siguiendo las instrucciones y protocolos de la casa comercial Biomerieux® y se ingresaron al software APIWEB de la misma casa comercial para su identificación. 6.6 Conservación final de las cepas Aquellos microorganismos cuyo perfil bioquímico resultado de API arrojó la identificación de género referenciado en literatura como posible microorganismo probiótico fue conservado en glicerol al 10% (v/v) siguiendo la siguiente metodología: A partir de una colonia pura, se sembró en caldos MRS, YPG o Plate Count (para bacterias aisladas de MRS, YGC o Plate Count respectivamente). Se incubó a 37 o 30°C para bacterias y levaduras respectivamente, por 16 horas a 100 rpm (15). Posterior al periodo de incubación, se realizaron dos lavados celulares usando agua destilada estéril. Finalizado los lavados celulares, se resuspendió el pellet en glicerol al 10% y se congeló a -20°C. 7. RESULTADOS 7.1 Muestreo inicial A partir de las muestras recibidas, se obtuvieron diferentes recuentos que principalmente variaron por el medio de cultivo utilizado para la siembra. A excepción de la muestra de heces porcícolas, en MRS se obtuvieron recuentos del mismo orden logarítmico de 107 (Tabla 1). La mayoría de otros crecimientos se encontraron en concentraciones suficientes para continuar con el estudio. Tabla I: Recuento en placa de muestreo inicial de heces de diferentes animales. Procedencia de la Muestra Heces bovinas Heces porcícolas Heces avícolas Heces caninas Medio de cultivo MRS Plate Count Recuento (UFC/g) 6,50E+07 1,50E+05 YGC MRS Plate Count 2,30E+04 3,10E+09 3,60E+05 YGC MRS Plate Count 4,00E+07 3,60E+07 4,60E+05 YGC MRS Plate Count 3,40E+06 1,80E+08 3,60E+05 YGC 1,10E+04 Fuente: elaboración propia Recuento de muestreo inicial 25 LN UFC/g 20 15 MRS 10 Plate Count 5 YGC 0 Heces bovinas Heces porcícolas Heces avícolas Heces caninas Muestra Figura I: Gráfico de barras del logaritmo natural de los recuentos iniciales en LN UFC/g. Fuente: elaboración propia Los resultados de los crecimientos de microaerofilia y aerobiosis fueron en ambos casos, mayor a 2,60E+8 lo que indicó que no había interferencias en cuanto a densidad microbiana en los resultados por condiciones de oxígeno en la incubación. 7.2 Muestreos 7.2.1 Recuento de muestreos Los resultados obtenidos para recuento en placa de las muestras analizadas fueron coherentes con el muestreo inicial en tanto que dieron cerca del mismo valor logarítmico (Anexo 2, Tabla XI) (Figuras II, III, IV, V, VI, VII y VIII). Sugiero mostrar la grafica y poner en anexos las tablas. Se procesaron 10 muestras de cada vertebrado seleccionado separado en dos grupos de 5 exceptuando canes, para lo que se procesaron solamente 5 en total. Población microbiana crecida en Heces Avícolas 1 20 LN UFC/g 15 MRS 10 Plate Count 5 YGC 0 M1 M2 M3 M4 M5 Número de muestra Figura II: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia Población microbiana crecida en Heces Avícolas 2 25 LN UFC/g 20 15 MRS 10 Plate Count 5 YGC 0 M1 M2 M3 M4 M5 Número de muestra Figura III: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia Población microbiana crecida en Heces Porcícolas 1 25 LN UFC/g 20 15 MRS 10 Plate Count 5 YGC 0 M1 M2 M3 M4 M5 Número de muestra Figura IV: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia Población microbiana crecida en Heces Porcícolas 2 25 LN UFC/g 20 15 MRS 10 Plate Count 5 YGC 0 M1 M2 M3 M4 M5 Número de muestra Figura V: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia LN UFC/g Población microbiana crecida en Heces Caninas 16 14 12 10 8 6 4 2 0 MRS Plate Count YGC M1 M2 M3 M4 M5 Número de muestra Figura VI: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales caninas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia Población microbiana crecida en Heces Bovinas 1 25 LN UFC/g 20 15 MRS 10 Plate Count 5 YGC 0 M1 M2 M3 M4 M5 Número de muestra Figura VII: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales bovinas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia Población microbiana crecida en Heces Bovinas 2 20 LN UFC/g 15 MRS 10 Plate Count 5 YGC 0 M1 M2 M3 M4 M5 Número de muestra Figura VIII: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia 7.2.2 Coloraciones de Gram Las morfologías y reacciones ante los colorantes de Gram se observan en la tabla II. Aunque el medio YGC contiene un antimicrobiano de amplio espectro, se observaron morfologías de bacterias como bacilos y cocos Gram negativos Tabla II: Coloraciones de Gram de la diferentes morfologías macroscópicas observadas en las siembras en placa. M(#): Muestra, BGP: Bacilo Gram Positivo, BGPE: Bacilo Gram Positivo Esporulado, BGN: Bacilo Gram Negativo, CGP: Coco Gram Positivo, CGN: Coco Gram Negativo, LS: Levadura Silvestre, LGM: Levadura ovoide con Gemación Múltiple, LGU: Levadura ovoide con Gemación Única, C(#): Colonia *Repicada. Muestra Heces avícolas 1 MRS Plate Count M1 M2 M3 M4 M5 C1: BGP * C1: BGP* C1: CGN C1: BGN C1: CGN C1: BGN C2: BGP* * C2: BGN C2: BGN C2: CGN C2: BGP C2: CGP M1 YGC M2 M3 M4 M5 C1: BGPE * C1: BGPE * C1: BGPE * C2: C2: BGP C2: BGN BGN C3: BGP * C3: BGN C3: CGP M1 M2 M3 M4 M5 C1: BGPE* C1: LS C1: LS C1: LS C1: LS C1: BGN C2: CGP C2: LS C2: BGN C2: LGU * C2: C2: LS LS C3: LS C3: LS C3: CGP C3: LS C4: C4: BGP Heces avícolas 2 C1: BGP * C1: BGP* * C2: BGN C2: CGN C1: BGN BGN C1: CGN C1: CGN C1: BGP C1: BGN C1: BGP C2: BGN C2: BGN C2: C2: BGN C2: BGPE * BGN C3: BGP * C1: BGPE * C2: BGP C3: BGPE * C3: BGN C1: BGPE* C1: BGN C2: BGPE* * C2: LS C1: LS C1: LGM C1: BGP C1: LGM C2: LS C2: LGM C2: LS C1: LS C1: LS C2: BGN C2: LS C3: LS C3: BGPE* C4: BGN C5: BGN Heces porcícola s1 C1: BGN C1: CGP* C1: CGN C2: C2: BGN C2: BGN C1: BGP * BGN C2: BGN C3: CGN C3: BGN C1: BGN C2: BGN C1: BGPE * C1: BGPE * C2: BGP C2: BGP C3: BGPE * C3: BGPE * C4: BGN C4: BGP C3: BGN C1: BGN C1: BGP C1: BGPE* C1: LS C2: BGN C2: BGPE * C2: BGPE* C2: LS C3: BGP C3: LGU * C3: BGPE * C3: BGP C1: LG M C1: LGM C2: LG M C3: LGU * C4: BGP C4: LS C5: LGM C5: BGP C6: BGN Heces porcícola s2 C1: BGN C1: BGP* C1: BGN C1: BGN C1: BGN C2: BGN C2: BGN C2: BGN C2: BGP * C2: BGN C3: BGP * C3: BGN C3: CGN C1: BGPE * C1: BGPE * C2: BGN C2: BGPE * C3: CGP C4: BGP * C4: BGN C2: BGN C3: BGP C4: BGP C4: BGP C5: BGP * C1: BGPE * C2: BGN C3: BGP C4: BGPE * C1: BGPE* C1: LS C2: BGP C2: BGN C3: BGN C3: LS C4: BGN C4: LS C1: LG M C1: LS C2: LS C3: LS C1: LS C1: LS C2: LS C2: LS C3: LS C3: LS C4: BGN C4: BGN C5: LGU * C5: LGU * C5: BGN C6: CGN Heces caninas C3: BGPE * C1: BGN C6: BGP C1: BGN C1: BGN C1: CGN C1: CGN C2: C2: C2: C2: C1: BGP * - - - - - - - - - - CGP * BGN BGN BGN C1: BGN C1: BGM C1: BGN C1: BGN C2: BGN C2: BGN C2: CGN C2: BGN C3: CGP * C3: BGN C3: CGN C3: BGN C4: BGN C4: BGN C3: BGP * Heces bovinas 1 C4: BGN C1: BGP * C2: BGN C3: BGN C4: BGN C2: CGP * C1: BGP C1: BGP C2: CGP C2: BGN C3: BGN C3: BGP C4: BGN C1: BGPE * C2: BGP C3: BGP C1: BGP C1: BGP C2: BGN C2: BGP C3: BGPE * C3: BGP - - - C1: BGP* C1: BGN C2: BGN C2: CGN C3: CGN C3: BGN C1: BGP * C1: BGP * C2: BGN C2: CGN C3: BGN C4: BGN C1: BGP C2: BGP C3: BGN C2: BGP C3: BGP C1: BGP C2: BGP C3: BGP C4: BGP C1: LGM C3: LGU * C4: BGN C1: BGPE * C1: LGU * C2: LGM C4: LGM C5: BGN C5: BGN Heces bovinas 2 C1: CGP * C1: BGPE * C2: BGP C3: BGN C4: BGN C1: BGP C1: LS C2: BGP C2: LS C1: 1 - C1: LS - C2: LS C3: BGP C4: BGP C5: CGP Fuente: elaboración propia 7.3 Identificación bioquímica La identificación de los microorganismos purificados se llevo a cabo mediante las baterías de API (Biomerieux®). Se organizaron según el tipo de microorganismo (Bacterias Ácido Lácticas, Bacilos Esporulados y Levaduras) su procedencia para tener claridad del ambiente en donde se encontraban los microorganismos. Tabla III: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 50CHL (para microorganismos obtenidos en MRS). Bacterias Ácido Lácticas Microorganismo Procedencia Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas Lactobacillus pentosus Heces bovinas Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces avícolas Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces bovinas Lactobacillus brevis Heces bovinas Lactobacillus pentosus Heces avícolas Lactobacillus pentosus Heces avícolas Lactococcus lactis ssp. lactis Heces caninas Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces porcícolas Lactobacillus rhamnosus Heces porcícolas Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas Lactobacillus pentosus Heces bovinas Lactobacillus rhamnosus Heces avícolas Lactobacillus rhamnosus Heces caninas Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces porcícolas Lactococcus lactis ssp. lactis Heces porcícolas Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas Lactobacillus pentosus Heces bovinas Lactobacillus pentosus Heces avícolas Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus Heces avícolas Heces caninas Lactobacillus pentosus Heces porcícolas Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces avícolas Tabla IV: Resultados obtenidos de identificaciones mediante la técnica API 50CHB® (para microorganismos obtenidos en Plate Count). Bacilos esporulados Microorganismo Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus pumilus Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Procedencia Heces bovinas Heces avícolas Heces avícolas Heces avícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus pumilus Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus pumilus Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus megaterium Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus pumilus Bacillus licheniformis Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus licheniformis Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas Heces porcícolas Heces avícolas Heces avícolas Heces bovinas Heces bovinas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces bovinas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Heces porcícolas Bacillus pumilus Heces porcícolas Tabla V: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC). Fuente: Elaboración propia Levaduras Microorganismo Candida zeylanoides Candida dubliniensis Kloeckera sp. Candida rugosa Cryptococcus terreus Candida parapsilosis Geotrichum sp. Procedencia Heces porcícolas Heces porcícolas Heces bovinas Heces bovinas Heces porcícolas Heces Avícola Heces porcícolas Fuente: Elaboración propia En las figuras IX, X y XI se resume las identificaciones obtenidas por las diferentes pruebas API®, diferenciando entre tipo de microorganismo obtenido (según el medio de cultivo utilizado para su aislamiento). Bácterias Ácido Lácticas identificadas 9 Lactobacillus rhamnosus 8 Número de cepas 7 Lactobacillus pentosus 6 Lactococcus lactis ssp. lactis 5 4 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei 3 Lactobacillus brevis 2 1 0 Microorganismos Figura IX: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHL® (para bacterias obtenidas en MRS). Fuente: Elaboración propia. Bacterias esporuladas identificadas 20 18 Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Número de cepas 16 14 Bacillus pumilus 12 Bacillus licheniformis 10 8 Bacillus megaterium 6 4 2 0 Microorganismos Figura X: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 50CHB® (para bacterias esporuladas obtenidas en Plate Count). Fuente: Elaboración propia Levaduras identificadas 1.2 1 Candida parapsilosis Número de cepas C. rugosa 0.8 C. dubliniensis C. zeylanoides 0.6 Kloeckera sp. Geotrichum sp. 0.4 Cryptococcus terreus 0.2 0 Microorganismos Figura XI: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC). Fuente: Elaboración propia. 8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS En cuanto a la prueba de crecimiento de microorganismos obtenidos en el medio de cultivo MRS bajo las diferentes condiciones de oxígeno (aerobiosis y microaerofilia), se encontró que los recuentos fueron muy parejos y las características microscópicas y macroscópicas fueron muy similares (resultados no escritos). Las bacterias Ácido Lácticas son generalmente anaeróbicas facultativas o microaerofílicas, lo que les permite crecer tanto en condiciones de anoxia o en la presencia de oxígeno (8, 14, 15). Por esta razón se decidió continuar el estudio en condiciones aeróbicas para todos los muestreos. Diversos autores han trabajado en condiciones de anaerobiosis estrictas para el aislamiento de este tipo de microorganismos; esto puede ser una de las razones que expliquen que la diversidad microbiana encontrada fue diferente de la que se halló en este estudio, además de la diversidad microbiana atribuida a geografía y/o alimentación del animal huésped (4, 5, 12, 16). Los recuentos encontrados para las muestras sembradas en MRS de este estudio (7 – 9 unidades logarítmicas) son similares a las reportadas en bibliografía (12, 14, 16, 17), lo cual indica una metodología de siembras apropiadas (Tabla 1 y 2). Ningún medio de cultivo utilizado en este estudio fue selectivo para microorganismos probióticos; se usaron medios de cultivo referenciados en bibliografía (8, 14, 15) para el aislamiento de microorganismos con capacidades de probiosis presuntivas a partir de las muestras procesadas. Por esta razón es que se encontraron una gran variedad de morfologías tanto microscópicas como macroscópicas (morfologías macroscópicas no tabuladas). El medio MRS es un medio enriquecido que favorece el crecimiento de bacterias Ácido Lácticas, pero no tiene inhibidores de flora acompañante, el medio Plate Count es un medio enriquecido, sin embargo, el tratamiento térmico dado a las muestras sembradas en este medio, limita (hasta cierto punto) el crecimiento de microorganismos no termoresistentes; B. subtilis (microorganismo de interés) es un microorganismo capaz de tolerar temperaturas elevadas (como a la cual fue expuesto) gracias a su característica de ser una bacteria esporulada. El medio YGC tiene 0.1 g/L de cloranfenicol, que ayuda a eliminar la flora acompañante de bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas, pues este se une a la subunidad 50s del ribosoma bacteriano impidiendo así la síntesis proteica (18). De esta manera se logran obtener principalmente hongos levaduriformes en el medio. Como fue mencionado anteriormente, el criterio de selección inicial para la purificación de microorganismos fue su morfología microscópica y la reacción en su pared celular ante los colorantes de Gram. Bajo el contexto explicado de los medios de cultivo utilizados para el procesamiento de las muestras, se entiende la razón por la cual las morfologías microscópicas que presentaron los microorganismos crecidos en los nuestros fueron tan diversas. Con lo anterior mencionado, cabe resaltar de nuevo que los microorganismos de interés para este estudio tenían características específicas microscópicas (colonias crecidas en MRS: cocos o bacilos Gram positivos; Plate Count: bacilos Gram Positivos esporulados y YGC: levaduras ligeramente ovoides de gemación única). Estas características fueron el criterio de selección para la purificación de los mismos. Las identificaciones de los microorganismos aislados mediante las pruebas bioquímicas se muestran en la tabla 4. Se identificaron un total de 60 microorganismos: 26 a partir de bacterias aisladas del medio de cultivo MRS, 27 a partir de bacterias aisladas del medio de cultivo Plate Count (muestras con tratamiento térmico) y 7 levaduras a partir del medio de cultivo YGC. A partir de las colonias obtenidas en el procesamiento de todas las muestras en el medio de cultivo MRS, se obtuvieron un total de 26 microorganismos: 5 cepas de Lactococcus lactis ssp. Lactis: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas y 1 una de heces caninas; 8 cepas de Lactobacillus rhamnosus: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas, 2 de heces caninas y 2 de heces avícolas; 5 cepas de L. paracasei ssp. paracasei: 1 de heces bovinas, 3 de heces porcícolas y 1 de heces avícolas; 7 cepas de L. pentosus: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas y 3 de heces avícolas; y 1 cepa de L. brevis a partir de heces bovinas. En su mayoría, los perfiles bioquímicos de las aquellas cepas encontradas, fueron diferentes, incluyendo aquellas que arrojaron la misma identificación (resultados no mostrados). Diversos autores han realizado trabajos con estas cepas, tanto en el campo de probióticos, como en alimentos como quesos madurados, procesos de extracción, purificación, identificación y evaluación de bacteriocinas y extracción de proteinasas (15 - 17, 19 - 23). Para que un microorganismo se considere probiótico a escala in vitro debe cumplir ciertas características que se evalúan mediante pruebas de laboratorio entre las cuales están: tolerancia a sales biliares que son moléculas anfipáticas que emulsifican grasas y de esta manera alteran la tensión superficial, en especial la de las paredes celulares de bacterias (24), dada por la actividad bilis hidrolasa que detoxifica la acción de las sales biliares y aumenta la supervivencia y persistencia intestinal (16). Deben ser capaces de tolerar pHs bajos y concentraciones de jugos gástricos para también asegurar su transición del estomago al intestino y una vez se encuentre en el intestino, tenga la capacidad de adherirse a las células epiteliales (14, 15). De los microorganismos identificados, quizá el más estudiado para aplicaciones probióticas es L. rhamnosus (19), además de ser uno de los cuatro Lactobacilos autorizados en la legislación europea (Directive 70/524/EEC, JLO 297:15/11/2001) (25). Guo y colaboradores en su estudio del 2010 mostraron que de las cepas aisladas a partir de heces porcícolas, aquellas que obtuvieron mejores resultados en cuanto a características probióticas in vitro fueron las identificadas como L. rhamnosus (identificada mediante API 50CHL y corroboradas secuenciando la subunidad 16s ribosomal) obteniendo tolerancias a concentraciones de sales biliares de 0.3 y 1.0 % (m/v), supervivencia a pH de 2 durante 3 horas (sin disminución de unidad logarítmica poblacional) (16). Bernardeau y colaboradores en su estudio del 2002 también concluyeron que esta bacteria (L. rhamnosus) tenía un gran potencial probiótico, sin embargo, abordado desde otro ángulo: “Las cepas L. MA27/6B y MA27/6R (dos cepas de L. rhamnosus) son no patógenas y seguras para el consumo animal y tienen un efecto benéfico sobre el crecimiento en ratones (17, 26). Los autores mencionados concluyen que estos microorganismos tienen diversas aplicaciones como su uso en la industria porcícola como aditivos en la alimentación del animal, por sus tolerancias a factores adversos encontrados en el tracto gastrointestinal y actividad antimicrobiana (16). Otros sugieren profundización en estudios, en cuanto a consorcios y pruebas in vivo por los resultados in vitro obenidos (17) y no sólo se demostró la bioseguridad en cuanto al consumo de éstos microorganismos usando ratones, sino también la mejora en el crecimiento (26). Otro de los microorganismos identificados en este estudio que está actualmente siendo objeto de estudio para aplicaciones probióticas es Lactobacillus brevis. Entre las características probióticas demostradas para este microorganismo están la adherencia fuerte a células Henle o Caco-2 (lo que permite inferir que podrían adherirse al intestino del huésped), viabilidad estable a pH de 4, tolerancia a concentraciones de sales biliares de 1.0 % (m/v) en un periodo de 4 horas y actividad antimicrobiana efectiva contra patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans (27, 28). Además de estas características, existe una cepa de este microorganismo en la lista GRAS (generalmente reconocido como seguro): L. brevis KB290 (de la International Patent Organism Despositary Accession Number, FERM BP-4693) lo cual incrementa el interés por implementar este microorganismo en dietas (29). Lactobacillus paracasei ssp. paracasei ha sido estudiado por autores como Maragkoudakis y colaboradores en el 2006 encontrando que de 29 cepas de Lactobacilos aisladas en investigación, una sub especie de este microorganismo se destacó frente a los demás en cuanto a las pruebas probióticas in vitro, como tolerancia a pHs de 1 y 2 , teniendo una ligera disminución poblacional, no obstante dicha disminución fue menor con respecto a los demás microorganismos evaluados (entre los cuales estaban varias cepas de L. acidophilus y L. plantarum), tolerancia a pepsina (componente de sales biliares) a pH 2, inmunomodulación (estimulación de producción de interluquinas 10 y 12, TNFα e interferón γ) e inhibición destacada contra patógenos entéricos como E. coli y Salmonella sp. (17). Por otro lado, Lactococcus lactis ssp. lactis ha tenido un enfoque de estudio diferente al campo probiótico. Este microorganismo ha tenido aplicaciones en la industria de alimentos para la maduración de quesos y extracción de proteinasas específicas de cisteína para el mejoramiento de textura y sabor de quesos duros y semi-duros (22, 30). Sin embargo, una aplicación interesante en el campo de antimicrobianos, más específicamente, las bacteriocinas. Estos compuestos han sido definidos como proteínas o complejos proteicos antagónicos a bacterias estrechamente relacionadas genéticamente al organismo productor. Investigadores han reconocido a L. lactis ssp. lactis como productor de nisina Z (bacteriocina). Rilla y colaboradores (2003) evaluaron la capacidad de éste microorganismo para inhibir al patógeno Clostridium tyrobutyricum. Los autores señalan que la inhibición se debe gracias a la bacteriocina producida puesto que evaluaron tanto el extracto crudo de la bacteria sembrada en pozos en agar con C. tyrobutyricum como la bacterias enfrentadas en queso evaluando la viabilidad de cada microorganismo (23). Además de L. lactis ssp. lactis, la bacteria Lactobacillus pentosus también se le ha atribuido la producción de bacteriocinas. Liv en su estudio sobre bacteriocinas (2008) y Delgado en su estudio del aislamiento de L. pentosus a partir de aceitunas (2007) concluyeron que este microorganismo es el responsable de la producción de la bacteriocina capaz de inhibir un amplio espectro de bacterias como Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. inocua, E. coli, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus (6, 22). En el caso de las bacterias aisladas en el medio de cultivo Plate Count, se obtuvieron un total de 27 bacterias: 19 cepas de Bacillus subtilis/amyloliquefaciens (las pruebas bioquímicas no diferencian estas dos especies) provenientes de: 4 de heces bovinas, 9 de heces porcícolas y 4 de heces avícolas; 5 cepas de B. pumilus todas aisladas a partir de muestras de heces porcícolas; 2 cepas de B. licheniformis a partir de heces porcícolas y 1 de B. megaterium de heces porcícolas (tabla 4). Para diferenciar entre la identificación de B. subtilis/amyloliquefaciens con precisión, se sugieren pruebas moleculares como secuenciación de la subunidad 16S del mRNA. Las especies de Bacillus han sido usados como suplementos alimentarios hace más de 50 años con el producto italiano Enterogermina® (31). Entre las especies más estudiadas están B. subtilis, B. clausii, B. coagulans y B. licheniformis (32 - 34). Las esporas de estos bacilos le otorgan una ventaja sobre las bacterias Ácido Lácticas por su estructura de resistencia, pues ayuda la supervivencia en el tracto gastrointestinal confiriéndole tolerancias a pH bajos y tensores como las sales biliares. Esta estructura también otorga un interés comercial, pues una vez el preparado haya sido desecado no hay pérdidas de viabilidad aun si se almacena en temperatura ambiente, ahorrando costos de refrigeración que pueden tener los demás biopreparados (31). Algunos de los productos más comercializados que contienen esporas de B. subtilis son: Bio-Kult®, biopreparado comercializado en el Reino Unido, Biosporin® de Ucrania, Medilac-Vita® de China y Primal Defense de los Estados Unidos (31). En Japón se comercializa un producto de la fermentación de soja conocida como Natto. Este alimentos se ha caracterizado por tener esporas viables de una cepa de B. subtilis con la que se han realizado estudios revelando que tiene la capacidad de reducir la coagulación de la sangre por fibrilosis causada por la secreción de la enzima Natoquinasa (enzima reconocida como GRAS en los Estados Unidos) (35). Para la agricultura, este microorganismo está teniendo gran auge pues se ha demostrado que reduce la infección en cerdos y aves de Salmonella enterica, Clostridium perfringes y E. coli 078:K80 por competencia de espacio y nutrientes (36, 37), además de producir Amicoumacina, un antibiótico con actividad demostrada in vitro contra el patógeno tropical Helicobacter pylori (38). Por otro lado, se ha cuestionado mucho la capacidad de estos microorganismos de ser probióticos, puesto que se conoce que en ciertas bacterias, la espora es un factor de patogenicidad como en especias de Clostridium. Especies de Bacillus como las aisladas en este estudio (B. licheniformis y B. pumilus) han tenido recientes estudios en cuanto a su toxicidad en la veterinaria. Nieminen y colaboradores (2007) encontraron 4 bacterias que pertenecían a las especias de B. pumilus y B. licheniformis produjeron toxinas termo estables no proteicas en la leche bovina. Mencionaron que las cepas de B. licheniformis eran similares genéticamente (en genes codificando para la producción de toxinas) a B. cereus productor de toxina entérica termo estable causante de diarreas y vómitos (39, 40). Sin embargo, no todas las bacterias esporuladas aisladas en este estudio diferentes de B. subtilis son reportados como patógenos; B. megaterium tiene aplicaciones agrícolas de gran interés diferentes de probiosis. Padgham y Sikora en el 2007, Kildea y colaboradores en el 2008 y Kong y colaboradores en el 2010 han demostrado que este microorganismo puede ser usado como biocontrolador en diferentes cultivos contra fitopatógenos. Padgam y Sikora encontraron que B. megaterium tiene actividad antagónica contra Meloidogyme gramicola, nematodo que afecta cultivos de arroz aerobios (no inundados), reduciendo la atracción del nematodo a penetrar las raíces del cultivo previniendo así la infección (41). Kildea y colaboradores revelaron que B. megaterium también puede ser usado para reducir la enfermedad del trigo conocida como Septoriosis que evidenciada por manchas en el área foliar. En el estudio mostraron como la mancha foliar se reducía inoculando al bacilo Esporulado en plantas infectadas con el fitopatógeno Mycosphaerella graminícola (42). En China, Kong y colaboradores (2010) mostraron que otro fitopatógeno (Aspergillus flavus) se veía inhibido tanto in vitro como in vivo por B. megaterium reduciendo la incidencia de la enfermedad causada por A. flavus en los granos de maní (43). En cuanto a levaduras, el microorganismo objetivo eran especies de Saccharomyces, más específicamente S. boulardii o Saccharomyces cerevisiae. Por el contrario, sólo se identificaron levaduras de los géneros Candida, Geotrichum, Kloeckera y Cryptococcus. Esto se debe principalmente a que las levaduras no son microorganismos propios del intestino animal, sino que generalmente su presencia es transitoria dependiendo de la dieta suministrada. Ninguna de las cepas identificadas en este estudio ha tenido reportes de capacidad o aplicabilidad probiótica. La gran mayoría son objeto de estudio clínico, pues se consideran patógenos, o patógenos oportunistas (44, 45). Candida dubliniensis ha sido asociada a estomatitis protésica (proceso inflamatorio de la mucosa oral asociada a especies de Candida) junto con C. albicans (44). C. parapsilosis es la segunda levadura más comúnmente aislada en muestras de sangre en hospitales de Estados Unidos, Canadá y América Latina. A pesar de su baja patogenicidad, este microorganismo tiene capacidad de destrucción de tejidos epidérmicos y orales (45). Otros géneros de levaduras también considerados patógenos aislados e identificados en este estudio son Geotrichum y Cryptococcus. El primero está asociado a infecciones sistémicas que resultan graves especialmente para la población inmunosuprimida con una tasa de mortalidad entre el 60 y el 80% de la población infectada en condiciones de baja inmunidad. Cryptococcus es una levadura encapsulada sin discriminación en huéspedes de infección (40). Kloeckera es junto con Saccharomyces cerevisiae la levadura que se encuentra más frecuentemente en los mostos para la producción del vino. Está relacionada con fermentaciones no deseables en la bebida alcohólica puesto que produce muchos ácidos volátiles (46). Por otro lado, ciertas levaduras aisladas en este estudio tienen aplicación industrial como es el caso de Candida rugosa. Domínguez de María y colaboradores (2006) publicaron un reporte en cuanto a las lipasas producidas por esta levadura. Estas lipasas han sido ampliamente usadas en tecnologías de fermentaciones, ensayos biocatalíticos, detergentes y solventes (47). Levaduras ampliamente reportadas en el campo probiótico son Saccharomyces cerevisiae y S. boulardii. Ortiz y Reuto en su estudio del 2007 mostraron mediante la evaluación in vitro de S. cerevisiae su capacidad de tolerancia a sales biliares desde 0.5% hasta 3.0%, estabilidad ante enfrentamiento a jugos gástricos, reducción de 54% de colesterol en 12 horas y adherencia celular con la línea celular Caco-2 (48). De manera similar, Le Bon y colaboradores en el 2010 investigaron la influencia de S. cerevisiae ssp. boulardii en la salud intestinal de cerdos de edad temprana enfocado a los valores de producción animal en cuanto al destete del cerdo. Encontraron que la adición de este microorganismo en la dieta del animal beneficia a la flora de las bacterias Ácido Lácticas y reduce la población de E. coli (49). 9. CONCLUSIONES Las muestras procesadas presentaron una alta carga microbiana, especialmente la evidenciada en el medio de cultivo MRS (entre 104 y 108 UFC/mL) mostrando un amplio potencial para el trabajo con estos microorganismos hacia el beneficio de la industria agropecuaria. Se aislaron bacterias Ácido Lácticas reportadas con capacidad probiótica (8 Lactobacillus rhamnosus, 7 Lactobacillus pentosus, 5 Lactococcus lactis ssp. lactis y 5 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei) Se aislaron bacterias Esporuladas reportadas con capacidad probiótica (19 Bacillus subtilis / amyloliquefaciens) No se hallaron géneros de levaduras reportadas como probióticas. 10. RECOMENDACIONES Para dar continuación al proyecto se sugieren pruebas de capacidad probiótica in vitro como adhesión celular, producción de bacteriocinas, tolerancia a pH, tolerancia a sales biliares, tolerancia a jugos gástricos, reducción de colesterol y antagonismo contra patógenos. Con el fin de tener una mayor precisión en cuanto a la identificación de los microorganismos, se sugiere la secuenciación de la subunidad 16s del RNA. Si se desea obtener una variedad mayor de bacterias Ácido Lácticas se sugiere el uso de cámaras de anaerobiosis para el aislamiento de microorganismos con el fin de obtener aquellos que sean anaerobios estrictos. 10. BIBLIOGRAFÍA 1. World Health Orgniazation. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food 2002. Disponible en http://www.who.int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_guidelines.pdf. Consultado el 12 de Febrero, 2011. 2. Lee J, Seto D, Bieolory L. Meta-analysis of clinical trials of probiotics for prevention and treatment of pediatric atopic dermatitis. Journal of Allergy and Clinical Inmunology. 2008; 151, 116-121 3. Mombelli B, Gismondo M. The use of probiotics in medical practice. International Journal of Antimicrobial Agents. 2000; 16, 531-536 4. Gibson G, Beatty E, Wang X, Cummings J. Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulim. Gastroenterology 1995; 108, 975-982 5. Guillot J.F. Probiotic feed additives. 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Fuente: Elaboración propia Muestr a MRS Plate Count YGC M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 Heces avícolas 1 5,2E 7 8,2E 7 9,8E 6 2,1E 7 4,8E 7 5,2E 3 1,8E 3 8,0E 3 7,9E 2 2,7E 3 4,7E 5 5,8E 5 2,7E 5 5,1E 6 8,6E 5 Heces avícolas 2 3,9E 7 4,9E 8 1,1E 8 2,5E 8 4,3E 7 4,5E 4 5,9E 4 6,2E 3 5,2E 4 8,2E 3 2,9E 5 9,6E 4 5,6E 4 4,9E 5 6,6E 5 Heces porcícol as 1 2,2E 9 5,8E 8 2,9E 8 6,9E 9 4,1E 9 5,9E 5 4,1E 3 8,6E 5 3,2E 4 4,8E 3 8,5E 6 6,0E 5 1,9E 6 9,2E 5 9,8E 6 Heces porcícol as 2 8,9E 8 4,6E 8 2,9E 9 5,5E 8 1,2E 9 2,5E 3 6,5E 4 2,4E 4 5,8E 3 3,0E 4 2,8E 7 4,5E 7 9,2E 7 5,0E 6 4,7E 7 Heces caninas 6,9E 5 1,6E 4 1,6E 6 4,1E 5 2,0E 6 <1,0 E1 <1,0 E1 <1,0 E1 <1,0 E1 <1,0 E1 <1,0 E1 <1,0 E1 <1,0 E1 <1,0 E1 <1,0 E1 Heces bovinas 1 9,0E 5 9,6E 6 1,1E 7 2,9E 6 6,3E 9 1,2E 6 7,0E 4 8,9E 4 3,8E 5 3,2E 5 4,0E 4 6,2E 3 7,4E 3 2,0E 4 7,7E 3 Heces bovinas 2 1,3E 8 5,5E 7 5,1E 7 1,3E 8 4,4E 7 1,2E 6 7,1E 4 4,9E 5 1,3E 5 3,2E 5 4,0E 3 1,2E 4 2,1E 4 5,6E 4 2,2E 3 Anexo 2 Tabla VII: Ejemplos de criterios de selección según morfologías y coloraciones de Gram para la purificacion de microorganismos obtenidos en los muetreos. Tipo de microorganismo Morfología Bacteria Ácido Láctica Bacilo Gram Positivo Coco Gram Positivo Bacteria Esporulada Bacilo Gram Positivo con espora central Levadura Levadura ligeramente ovoíde de gemación única
