Dafne Laura Garcia Ortega

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
ZONA: CÓRDOBA – ORIZABA
Carrera de Licenciado en Biología
“Establecimiento de un protocolo de
PCR como técnica de diagnóstico preventivo
para la Clorosis Variegada de los Cítricos”.
T E S I S
Que para obtener el titulo de:
Licenciado en Biología
P r e s e n t a:
Dafne Laura Garcia Ortega
DIRECTORES:
Dra. Araceli Montiel Flores
Dra. Moramay Naranjo Moreira
CÓRDOBA, VER,
2012
1
Dedicatorias
A Dios y la Virgen de Guadalupe:
Porque de no ser por su intervención, mi vida no sería tan
maravillosa, con todos los retos, que con sabiduría me han impuesto y
que con sus enseñanzas he logrado superar y aprender, porque en cada
momento de mi vida han sido mi apoyo, mi refugio y fortaleza.
A mis Padres:
María y Baltazar Porque gracias a ellos existo y he aprendido a ser el
ser humano que hoy lucha fielmente por sus convicciones, el ser
humano con valores fundamentados en amor comprensión y paciencia;
porque ellos me han enseñado que las carencias no son sinónimo de
conformismo, sino de lucha y de trabajo honrado, que aunque las cosas
parecen difíciles, jamás serán imposibles, por eso y mucho más, mil
gracias, LOS AMO.
A mis hermanas:
Ana, Evelyn y Alejandra porque al pasar el tiempo siempre he
obtenido muestras de cariño y apoyo; a su lado he pasado momentos
sencillamente increíbles, mágicos y trascendentales, ustedes son parte
muy importante en mi vida y sé que en todo momento o situación
siempre estarán ahí como yo para ustedes LAS AMO.
A mis amigos y compañeros de generación
Que de alguna manera han estado presentes en mi vida, en los días
gratos, chuscos, tristes, cansados, estresados, en las locuras, en eventos
e infinidad de momentos que recordaré siempre en que han estado a mi
lado y espero haberles correspondido de la misma manera, han hecho
mi felicidad más grande, GRACIAS A TODOS.
2
AGRADECIMIENTOS
Al personal del laboratorio “PROCIGO” (Promotora Citrícola del Golfo) por su hospitalidad y
apoyo durante mi estancia en esa institución en especial a la Dra. Moramay Naranjo Moreira,
ya que sin su apoyo y paciencia, la realización de este trabajo no hubiese tenido éxito.
A la Universidad Veracruzana y en especial a la Facultad de Ciencias Biológicas y
Agropecuarias, Campus Peñuela, por ser mi alma mater y permitir mí desarrollo profesional.
A la Dra. Araceli Montiel Flores y MC. Mario Felipe Herrera Tenorio, por ser mis mentores
en esta tesis la cual representa para mí un paso significativo en mi formación académica.
Siempre les estaré agradecida.
Al H. Comité Revisor de mi trabajo recepcional.
A todos los profesores de la carrera de Licenciado en Biología, que durante mi formación
académica compartieron sus conocimientos y experiencias profesionales para alimentar mi
gusto por la investigación, fomentándome el respeto y dedicación a la carrera. Por su
dedicación, paciencia, cariño y trabajo, Gracias.
Dafne García
3
ÍNDICE GENERAL
Págs.
ÍNDICE DE CUADROS ................................................................................... 6
ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................... 6
RESUMEN ........................................................................................................ 7
I.-INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 8
2. FUNDAMENTOS........................................................................................ 10
2.1. Los cítricos ............................................................................................. 10
2.1.1. Importancia mundial ........................................................................ 11
2.1.2. Importancia nacional ....................................................................... 13
2.1.3. Importancia estatal ........................................................................... 15
2.1.4. Especies y variedades cultivadas en México .................................... 16
2.2. Problemática del cultivo ......................................................................... 16
2.3. CLOROSIS VARIEGADA DE LOS CÍTRICOS, CVC ......................... 18
2.3.1. Importancia económica de la CVC .................................................. 19
2.3.2. Distribución ..................................................................................... 20
2.3.3. Espectro/distribución de hospederos. ........................................... 20
2.3.4. Descripción/ sintomatología de CVC ............................................... 21
2.3.5. Hospederos de CVC ........................................................................ 22
2.4. Etiología de CVC ................................................................................... 22
2.4.1. Xylella fastidiosa ............................................................................. 23
2.4.2. Origen del agente causal .................................................................. 23
2.4.3. Nomenclatura/ taxonomía de Xyllela fastidiosa ............................... 24
2.4.4. Transmisión ..................................................................................... 25
2.5. Vectores de Xyllela fastidiosa ................................................................. 25
2.5.1. Eficiencia de transmisión ................................................................. 26
2.5.2. Cicadelidae ...................................................................................... 26
2.5.2.1. Clasificación taxonómica del vector Homalodisca coagulata .... 27
2.5.2.2. Daños causados ......................................................................... 27
2.5.3. Ciclo Biológico ................................................................................ 28
2.5.4. Control de la familia Cicadelidae .................................................... 29
2.5.5. Distribución de la familia Cicadelidae ............................................. 30
2.5.6. Otros vectores .................................................................................. 30
4
2.6. Epifitiología de CVC .............................................................................. 30
2.6.1. Factores que favorecen CVC ........................................................... 31
2.6.1.1. Relación con deficiencias nutricionales ..................................... 31
2.6.1.2. Relación con daños por plagas u otras enfermedades ................ 31
2.6.1.3. Relación con factores ambientales ............................................ 32
2.7. Control de CVC ...................................................................................... 32
2.7.1. Métodos de control .......................................................................... 32
2.7.2. Impacto estimado para ..................................................................... 33
2.8. Pruebas de detección y diagnóstico......................................................... 33
2.9. Detección por PCR ................................................................................. 34
2.9.1. Fundamentos de la técnica de PCR .................................................. 35
2.9.2. Técnicas de PCR utilizadas en la detección de Xylella fastidiosa ..... 36
3. OBJETIVOS ................................................................................................ 38
3.1. Objetivo General .................................................................................... 38
3.2. Objetivo Específicos ............................................................................... 38
4. HIPÓTESIS ................................................................................................. 38
5. MÉTODO .................................................................................................... 39
5.1. Análisis de protocolos relacionados ........................................................ 39
5.2. Materiales ............................................................................................... 39
5.2.1. Material de análisis .......................................................................... 39
5.3.-Procedimiento ........................................................................................ 39
5.3.1. Recepción, observación y preparación de muestras vegetales .......... 39
5.3.2. Extracción de ADN.......................................................................... 40
5.2.5. Comprobación mediante análisis electroforético .............................. 40
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 44
7. CONCLUSIONES ....................................................................................... 53
5
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 54
ANEXOS .......................................................................................................... 59
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro
Pág.
1.Principales países productores de limones y limas (ton) ................................ 11
2.Principales países exportadores de limones y limas (ton) .............................. 12
3.Valor de las exportaciones de limones y limas .............................................. 12
4.Datos de limón para el estado de Veracruz a Diciembre de 2010. .................. 15
5.Cultivos afectados por X. fastidiosa (Fuente: Hopkins, 1989) ....................... 21
6.Eficiencia de transmisión de .......................................................................... 26
7.Referencias relacionadas al uso de primers para detección de CVC .............. 41
8.Protocolos probados en la amplificación de Xylella fastidiosa ...................... 45
9.Protocolos probados en la amplificaciónde Xylella fastidiosa ....................... 46
10.Protocolos probados en la amplificación de Xylella fastidiosa ..................... 48
11.Protocolos probados en la amplificación de Xylella fastidiosa ..................... 49
12.Protocolos probados en la amplificación de Xylella fastidiosa ..................... 50
13.Resumen de los ensayos que fueron probados y la respuesta obtenida .......... 52
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Pág.
1. Evolución de las exportaciones. .................................................................... 12
2. Superficie (ha) sembrada de cítricos (2000- 2009)........................................ 13
3. Superficie cosechada (ha) de naranja, limón y toronja en 2009..................... 14
4. Valor de la producción de cítricos en 2009. .................................................. 14
5. Problemática de los cítricos causada por plagas ............................................ 17
6. Problemática de los cítricos causada por enfermedades ................................ 17
7. Preparación de muestras para PCR en campana de flujo laminar. ................. 42
8. Amplificación de las muestras. ..................................................................... 43
9. Electroforesis de las muestras ....................................................................... 43
10. Determinación de calidad de DNA por electroforesis ................................. 44
11. Comprobación del ADN utilizado .............................................................. 47
12. Resultado positivo de ensayo con los primers 272-1 int/272-2 int .............. 49
6
RESUMEN
En México la citricultura representa una de las actividades más importantes para la economía
del país, ya que ocupa el primer lugar internacional en producción de naranja y es el segundo
país más importante en producción de limón siendo así el primer lugar en realizar
exportaciones de este producto; además, de producir toronja, mandarina y la tangerina tanto a
niveles industriales como en fresco. Pero este cultivo como muchos otros es susceptible a ser
invadido por plagas y enfermedades, representando graves pérdidas económicas, como en su
momento fue el caso del Virus de la tristeza de los cítricos (VTC) o el caso más reciente del
Huanglongbing (HLB). Los fenómenos naturales aumentan la distribución de plagas y
enfermedades aun no presentes en nuestro país, pero que están ya ocurriendo en otros, como
es el caso de la Clorosis Variegada de los Cítricos (CVC), causante de pérdidas económicas
considerables en la parte sur del continente Americano. Esto representa un riesgo latente para
la citricultura Mexicana por la cercanía o colindancia con otros países, considerando los
vectores y el amplio espectro de la bacteria. Por ello, es necesario implementar técnicas que
ayuden a detectar y en su caso, prevenir la propagación masiva de la enfermedad en materiales
vegetativos y/o los vectores, introducidos en el país. Considerando esta situación, este trabajo
tuvo por propósito el establecimiento de un protocolo de Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) como técnica de diagnóstico preventivo para la enfermedad de Clorosis Variegada de
los Cítricos. Se utilizaron muestras de ADN de la variedad naranja Pera, con síntomas de la
enfermedad (CVC) provenientes de FUNDECITRUS Brasil como controles positivos. Para
determinar las condiciones de PCR más adecuadas, se diseñaron/ adecuaron protocolos con
base otros trabajos relacionados tanto en cítricos como en otras especies. Se probaron 9
ensayos de los cuales 5 arrojaron respuesta negativa y únicamente 4 fueron positivos para la
amplificación de las muestras afectadas con CVC.
7
I.-INTRODUCCIÓN
La producción mundial de todos los cítricos se encuentra entre las 85 millones de toneladas.
En México, los cítricos más cultivados son la naranja, seguida por el limón, la toronja, la
mandarina y la tangerina, cuya producción se desarrolla en 28 estados con climas tropicales y
subtropicales. El país figura como segundo productor mundial de limón, con casi dos millones
de toneladas. Al 2009, Veracruz se posiciona como primer productor nacional de naranja para
los mercados nacional e internacional, con más de dos millones de toneladas, equivalentes al
49.1% de la producción nacional. Casi una quinta parte de la producción nacional se
comercializa principalmente en Estados Unidos (SIAP, s/f).
Aun con la inversión en infraestructura y activos que se generan, la producción no se
encuentra garantizada y a pesar de los esfuerzos, sigue siendo vulnerable a factores que
reducen el rendimiento y calidad de los frutos que se refleja en pérdidas económicas. Como en
todos los cultivos, los cítricos enfrentan problemas asociados a factores abióticos, como
salinidad y alcalinidad de los suelos, heladas, sequías, altas temperaturas, etc. Además, son
susceptibles al ataque de numerosas plagas y enfermedades provocadas por hongos, bacterias,
spiroplasmas, fitoplasmas, virus, viroides, y otros agentes patógenos de etiología desconocida.
Una enfermedad aún no detectada en el país pero de riesgo potencial para la industria citrícola
es la Clorosis Variegada de los Cítricos (CVC), originada por la bacteria Xylella fastidiosa.
Esta enfermedad ha causado grandes pérdidas económicas al norte y sur de América, e incluso
se empieza a manifestar en el continente europeo, en la región de Kosovo, Serbia. Su
importancia se debe a la variedad de hospederos sintomáticos y asintomáticos que se pueden
infectar y, a la rapidez con la que se distribuye. El peligro de la diseminación de la enfermedad
se debe en gran parte, al diagnóstico tardío con que se evalúan sus síntomas, ya que es común
confundirla con deficiencias nutricionales como la de zinc o con enfermedades muy parecidas
sintomatológicamente como el Huanglongbing (HLB), también causada por una bacteria.
8
Aunque algunas alternativas para mitigar esta enfermedad se refieren al uso de planta
certificada producida en vivero, ésta propuesta no asegura totalmente la sanidad del material
una vez transplantado y desarrollado en campo, donde puede llegar a adquirir la enfermedad.
De manera que el riesgo futuro es potencial, pudiendo afectar la industria citrícola mexicana,
por lo que es conveniente con anticipación a la introducción y establecimiento de esta
enfermedad en México, desarrollar o bien adaptar tecnologías que permitan detectar a tiempo
el mínimo brote de esta enfermedad. De manera que las contribuciones en este aspecto pueden
ser de invaluable ayuda. Por lo que, este trabajo de investigación tuvo como finalidad
establecer y/ o adaptar un protocolo para el diagnóstico de la clorosis variegada de los cítricos
mediante la utilización de herramientas moleculares (PCR).
9
2. FUNDAMENTOS
2.1. Los cítricos
Botánicamente, las especies de interés comercial de los cítricos pertenecen a la familia
división Embriophyta Siphonogama, subdivisión Angiospermae, clase Dicotyledonea,
subclase Rosidae, superorden Rutanae, orden Rutales (Swingle, 1967), familia Rutaceae,
subfamilia Aurantoideae, género Citrus. Los seis géneros que constituyen los cítricos
verdaderos (Citrus, Clymenia, Eremocitrus, Fortunella, Microcitrus y Poncirus) se encuentran
dentro de la subtribu Citrinae y sólo tres de ellos tiene importancia comercial: Poncirus
(naranjo trifoliado), Fortunella (Kumquat) y Citrus (Moore, 2001). Las especies del género
Citrus son las más importantes desde un punto de vista agronómico (Agustí, 2003), cuenta con
más de 145 especies, entre las que destacan: naranja, Citrus sinensis; mandarina, Citrus
reticulata; limón, Citrus limon; lima, Citrus aurantifolia; toronja, Citrus paradisi, entre otras
(Plan Rector Sistema Nacional Citricos, 2005). Prácticamente todas las especies de Citrus son
diploides, con 2n = 18 cromosomas, y con un genoma relativamente pequeño, 382 Mpb
(Arumuganathan y Earle, 1991).
El nombre de cítricos deriva del latín acrimen, agrio, debido a las notables cantidades de
vitamina C y minerales (calcio y fósforo) que contienen. Los cítricos tienen su origen en Asia
oriental, concretamente en la zona que abarca desde la vertiente meridional del Himalaya hasta
China meridional, Indochina, Tailandia, Malasia e Indonesia (Davies y Albrigo, 1994). En la
actualidad se extienden por la mayor parte de las regiones tropicales y subtropicales
comprendidas entre los paralelos/ latitudes 44oN y 41oS (Agustí, 2003).
Los cítricos son árboles de tamaño y forma variable, según las especies. En las axilas de las
hojas presentan espinas de mayor o menor dureza. Las hojas son unifoliadas, las flores
(azahar) son muy blancas y los frutos son hesperidios de forma variable. Las semillas, sin
endospermo, presentan, en muchas de las especies, dos o más embriones nucelares.
10
2.1.1. Importancia mundial
Los cítricos constituyen el cultivo frutal de mayor importancia económica en el mundo. La
producción mundial de 2007 fue de aproximadamente 103 millones de toneladas, lo que
representa la cuarta parte de toda la producción frutícola (FAO, 2007).
Los principales productores de cítricos, en orden de importancia son Brasil, China, Estados
Unidos, Méjico, India y España (FAO, 2007). Otros productores son Argentina, Australia,
Cuba, Egipto, Israel, Italia, Japón, Marruecos, Turquía y Sudáfrica. En muchos de esos países
la cosecha se consume en fresco, aunque algunos como Brasil y Estados Unidos, la mayor
parte se vende transformada en jugo concentrado (Timmer, 2001). En cuanto a la producción
solo de limones y limas, el Cuadro 1 muestra a México como segundo productor mundial de
estos (realmente se refiere a las limas ácidas como el limón „Persa‟), con casi 2 millones de
toneladas, seguido por Argentina y Brasil (COVECA, 2011).
Cuadro 1. Principales países productores de limones y limas (ton)
(Fuente: http://faostat.fao.org/)
De manera similar se aprecia en el Cuadro 2, la posición de México como el principal
exportador de limones y limas.
11
Cuadro 2. Principales países exportadores de limones y limas (ton)
Las exportaciones de cítricos representan casi una quinta parte de la producción nacional (329
mil toneladas), las cuales se comercializan principalmente en Estados Unidos (Cuadro 3) y en
la Figura 1 se muestra la evolución de las mismas del 2000 al 2009.
Cuadro 3. Valor de las exportaciones de limones y limas
Mientras en 2000 ingresaron 47 millones 480 mil dólares por exportaciones de cítricos, en
2009 se recibieron 163 millones 375 mil. A septiembre de 2010 hubo un saldo positivo
superior a los 129 millones de dólares, de los cuales, el limón aportó 94.6%.
Figura 1. Evolución de las exportaciones.
12
En la década, el saldo de la balanza comercial de estos productos fue superavitario para el
país, en más de 94 millones de dólares en promedio (SIAP, 2009). De manera que México está
posicionado en los primeros lugares de producción y ventas internacionales de limón y naranja
entre otros señalan estadísticas del Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera
(SIAP, 2009). Y, durante 2010, estos cultivos representaron el 63% de la producción nacional,
detalló el organismo de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación (SAGARPA 2011).
2.1.2. Importancia nacional
En México para el cultivo de cítricos la superficie destinada para siembra entre 2000 y 2009
fue de 532 mil 850 hectáreas, extensión equivalente a la superficie de estados como Colima o
Aguascalientes (0.3% del territorio nacional) (SIAP, 2009)
El producto más cultivado fue la naranja, seguido por el limón, la toronja, la mandarina y la
tangerina. En 2009 se registró la mejor producción de la década, con seis millones 670 mil
toneladas, de las cuales más de 60% correspondieron a la naranja. Los datos presentados en la
Figura 2 muestran el periodo 2000-2009 para los cultivos de limón, naranja, toronja, tangerina,
nectarina, mandarina, lima y tangelo (SIAP, 2009).
Figura 2. Superficie (ha) sembrada de cítricos (2000- 2009)
(Fuente SIAP, 2009)
La tasa de crecimiento media anual de la superficie cosechada de cítricos (Figura 3) en el
periodo de referencia fue de 0.9%. Tres cultivos mostraron las mayores tasas: mandarina con
3.6%, toronja con 3.5% y tangerina con 3.3%. Para septiembre de 2010 se registró una
13
superficie cosechada de 418 mil 648 hectáreas, considerando los principales cítricos, naranja,
limón y toronja (SIAP, 2009).
Figura 3. Superficie cosechada (ha) de naranja, limón y toronja en 2009
(Fuente SIAP 2009)
La riqueza generada por los cítricos en 2009 (Figura 4) fue la mayor de la década en cuestión:
el valor de la producción ascendió a diez mil 178 millones 726 mil 630 pesos, muy por arriba
del promedio para ese periodo (siete mil 679 millones 311 mil 790 pesos).
Figura 4. Valor de la producción de cítricos en 2009.
(Fuente: SIAP, 2009)
El cultivo con mayor valor en 2009 fue el limón con cuatro mil 919 millones 563 mil 682
pesos, con un crecimiento promedio de 4.5 por ciento. La naranja registró cuatro mil 160
millones 716 mil 174 pesos y mantuvo el promedio anual más alto con un crecimiento
promedio de 3.6 puntos porcentuales. La tangerina es el cítrico que más crece: promedió 8.9%
por año y su valor en 2009 fue de 313 millones 997 mil 400 pesos (SIAP, 2009).
14
2.1.3. Importancia estatal
El estado de Veracruz cuenta con 72 empacadoras, 64 enceradoras, 3 industrias gajeras, 9
jugueras, 7 viveros certificados, 3 huertas productoras de semillas, 6 lotes productores de
yemas, 1 lote fundación, 1 Banco de germoplasma y 45 viveros no certificados
proporcionando 400 mil empleos directos y 6 millones indirectos en toda la cadena productiva
de cítricos, (producción, empaque, comercialización e industrialización). Beneficiando
aproximadamente un promedio de 70,000 productores que dependen de este cultivo.
(CESVVER 2008).
Veracruz se posiciona como primer productor nacional de naranja en 2009, abasteció al
mercado nacional e internacional con más de dos millones de toneladas que equivalieron a
49.1% de la producción nacional. En 2009 la superficie sembrada por naranjos era 11% del
total estatal, con presencia en 89 municipios. Más de la mitad de la producción se debió a las
demarcaciones de Álamo Temapache, Papantla, Martínez de la Torre y Tihuatlán, que en
conjunto aportaron 56.2%. El amplio diferencial entre el precio local y el ofrecido
internacionalmente ha convertido a Veracruz en uno de los grandes exportadores de naranja,
tanto en jugo como en fresco. La producción se mantuvo relativamente estable entre 2000 y
2009, con un ritmo anual promedio de crecimiento de 0.8%. En el último año se obtuvo la
segunda cosecha más alta de la década, superior en 2.1% a la de 2008 (Panorama
agroalimentario y pesquero, 2011). Los datos de limón para el Estado de Veracruz a diciembre
de 2010, fueron de 35,982.36 hectáreas como superficie cosechada y 437,243.50 toneladas
como producción para todos los ciclos. Los principales municipios productores se enlistan en
el Cuadro 4.
Cuadro 4. Datos de limón para el estado de Veracruz a Diciembre de 2010.
15
2.1.4. Especies y variedades cultivadas en México
NARANJA
Variedad de naranjas: Mandarinas: Naranjas muy fáciles de pelar y cómodas de comer debido
a su facilidad para separarla en gajos. Ideales para los niños. (Entra en producción en
noviembre) (SIAP 2004). Naranja ombligona o navel de esta variedad, identificada en
términos comerciales con la palabra inglesa navel (ombligo), destacan las variedades:
Navelate, Navelina, Newhall, Washington Navel, Lane late y Thompson (Consejo Citrícola
mexicano A.C. 2009). Naranjas Navelinas: Naranjas que sirven tanto para la mesa como para
preparar zumos. Es una variedad muy valorada ya que es la primera en ser cosechada su
producción entra en diciembre. Existen varias variedades de naranja temprana, aunque la que
domina en México es de la variedad “Mars” (Consejo Citrícola mexicano, 2009). Naranjas
Navel-lane-late: son naranjas de mesa muy jugosas y dulces y con el grado justo de acidez.
Tienen mucho zumo, una piel muy fina y no tienen semillas. Es una de las variedades de
mayor calidad. (Entra en producción en febrero). Naranjas Valencias: son naranjas muy
jugosas y dulces, de tamaño un poco menor que las navel-lane-late, y están más orientadas al
zumo. (Entra en producción en mayo)(SIAP 2004).
LIMON
En México se producen en forma preponderante dos variedades de limón: Persa (sin semilla) y
Mexicano (con semilla), las cuales están bien diferenciadas por zonas productoras, modalidad
(riego o temporal y esquemas de comercialización); sin embargo, en realidad no es limón sino
lima ácida o amarga en sus dos variedades, de igual manera se reportan el Italiano y el Real.
(SIAP 2004).
2.2. Problemática del cultivo
Los cítricos enfrentan problemas asociados a alteraciones bióticas y abióticas. Las alteraciones
abióticas o no infecciosas se deben a condiciones ambientales adversas, defectos genéticos o
nutricionales o prácticas de cultivo defectuosas, tales como aplicaciones químicas inadecuadas
o algunos daños por pesticidas. Las alteraciones bióticas como las plagas (Figura 5) y las
enfermedades (Figura 6), en este caso, infecciosas, causadas por bacterias, fitoplasmas,
hongos, nematodos, virus y viroides (Timmer, 2001).
16
Figura 5. Problemática de los cítricos causada por plagas
Figura 6. Problemática de los cítricos causada por enfermedades
17
2.3. CLOROSIS VARIEGADA DE LOS CÍTRICOS, CVC
Es una enfermedad que se reportó primero en Brasil, en los Estados de San Pablo y Minas
Gerais causando en toda esa área cuantiosos daños. También se ha descrito en Argentina con
el nombre de “pecosita” y en Uruguay. Es causada por la bacteria Gram negativa, Xylella
fastidiosa, localizada en los vasos del xilema.
Produce pérdidas económicas muy importantes. Entre los síntomas más notables se observan
zonas amarillentas en la cara superior de las hojas, en el envés presenta manchas de color
marrón claro, las ramas de la parte superior del árbol pierden sus hojas, y muestran síntomas
de necrosis de ramillas, por otra parte los frutos son muy pequeños y maduran
prematuramente. La enfermedad es difícil de controlar; sin embargo, cuando los árboles
presentan solo síntomas foliares, es posible eliminar la bacteria cortando las ramas afectadas.
(Soc. Española de Fitop., 2000).
En 1984, en algunas quintas cítricas de naranja Valencia (Citrus sinensis (L.) Osb.) ubicadas
en la región del Alto Paraná, de Misiones, Argentina se detectó una nueva enfermedad
conocida localmente como “pecosita” que se caracterizaba por la disminución del tamaño de
los frutos, anticipación de la madurez de la fruta y la cáscara de consistencia dura. En las
hojas, los puntos de goma observados en el envés se correspondían con áreas cloróticas del
haz. La sintomatología se detectaba tanto en plantas jóvenes como adultas y se observaba en
las brotaciones maduras de primavera. Las hojas de las ramas afectadas tomaban un aspecto
marchito por la pérdida de turgencia (Contreras, 1990).
En 1987 se descubre por primera vez en Brasil como una enfermedad que no era la ya
conocida como Amarelinho pero que tenia síntomas muy similares a esta; por lo cual se
realizan estudios. Su aparición comenzó en la parte norte del estado de São Paulo y al sur de
Minas Gerais (De Negri, 1990). En 1989, después de trabajos realizados en conjunto por el
Instituto Biológico de San Paulo y el INRA de Francia se determina que la enfermedad
observada 1987, en San Paulo, Brasil, con síntomas de amarillamiento (Amarelinho) es
realmente causada por una bacteria semejante a la Xylella fastidiosa, que se aloja en el xilema
de las plantas y se nombra a esta enfermedad “Clorosis Variegada de los cítricos” (Naranjo et
al., 2005).
18
Los síntomas de “pecosita” (denominada así en Argentina) son similares a la “clorosis
variegada de los cítricos” descrita en Brasil en 1987 y se ha comprobado serológicamente que
es el mismo agente causal el que afecta los tejidos de plantas cítricas con síntomas de
“pecosita” y el que provoca la CVC (Brlansky 1991).
En 1990 se logra el aislamiento de la bacteria en medio de cultivo y en 1993 se comprueban
los Postulados de Koch´s (Anexo 1) para confirmar así que el agente causal era dicha bacteria.
En trabajos experimentales se ha visto variación en la morfología de la cepa de Xylella
fastidiosa que provoca CVC. Se manifiestan dos tipos de colonias, una que mantiene la
morfología característica: blanco cremosa, granulada, con un punto oscuro en el centro,
semejando una pila de arena cuando se observa al estereoscopio el revés de la placa de cultivo.
La otra colonia es de coloración más oscura (pardo brillante) y de forma más aplanada sin
presentar el punto oscuro en el centro. Estudios detallados con métodos moleculares (Reacción
en cadena de la polimerasa –PCR-, con cebadores específicos) demostraron que ambas
colonias pertenecen al mismo patógeno y al hacer cultivos puros en medio sólido de cada tipo,
el crecimiento resultante es una mezcla de las dos morfologías (Naranjo et al., 2005).
A pesar de que la bacteria, Xylella fastidiosa, ha sido aislada de plantas con síntomas de CVC,
la totalidad de los síntomas no se han podido reproducir en condiciones de campo por
inoculación, debido probablemente a que, además de la presencia de la bacteria, concurran
otros aspectos como desordenes nutricionales (Malavolta et al., 1994).
Xylella fastidiosa fue la primera bacteria fitopatógena en ser secuenciada. Su genoma tiene
2,679,305 pb. y posee dos plásmidos de 51,158pb y 1,285pb (Simpson et al., 2000).
2.3.1. Importancia económica de la CVC
Esta enfermedad se ha difundido en forma epidémica en la región citrícola de San Pablo,
Brasil, así, Prates (1993) cita que los árboles más afectados tenían 2 a 5 años y la incidencia en
las plantaciones de la región era del 1 al 5% . Y Beretta (1992) menciona que en
aproximadamente 5 años se encontraban infestados 1.8 millones de árboles afectando 84%. En
19
Colina, localizada al noreste del Estado de San Pablo, la severidad de CVC se registró en una
curva ascendente con graves pérdidas en la producción citrícola estimada en un 19,7% en
1991 y del 71,5% en 1992 (Palazzo; 1993).
Para el año 2000, se calculó que los daños causados por la CVC en el estado de São Paulo,
alcanzaron los 110 millones de dólares aproximadamente (teniendo en cuenta la pérdida de las
plantas en estado productivo, la reducción de la producción y los costos del control de la
enfermedad). La epidemiología de la enfermedad ha recibido poca atención, contrastando con
el rápido progreso en la caracterización molecular del agente causal (Simpson et al., 2000).
2.3.2. Distribución
Desde su observación por primera vez en 1984 en la región del alto Paraná, Argentina,
denominada con el nombre local de “pecosita”, (Contreras; 1990) y después confirmado el
mismo agente causal con la enfermedad encontrada en 1987 en Brasil y declarada como
Clorosis variegada de los cítricos se ha hecho presente en las provincias de Misiones y
Corrientes, Argentina, y, en Brasil, en los estados de San Paulo, Paraná, Minas Gerais, Santa
Catarina, Rio Grande del sur, Goiás, Distrito Federal, Sergipe, Pará y Bahía de Brasil.
También se ha reportado su presencia en Paraguay, Costa Rica (Naranjo et al., s/f) y Uruguay”
(Anón., 2000).
2.3.3. Espectro/distribución de hospederos.
El agente causal (Xylella fastidiosa) de esta enfermedad cuenta con grupos o razas que atacan
no solo a los cítricos sino también a otras plantas de interés agroalimentario y ornamental. Ésta
característica compleja le ha servido para ampliar su distribución y ser causante de
importantes pérdidas económicas.
Como ejemplo, en vid produce la enfermedad de Pierce, problema que se ha observado desde
1892 en el Sur de California, USA (EPPO, 2004), limitando la producción comercial de las
uvas de racimo en el sureste de Estados Unidos (Minsavage et al,. 1994). Esta misma
enfermedad se reportó como probable en Europa, en la región de Kosovo, Serbia (EPPO
2004). Otros cultivos afectados por X. fastidiosa son:
20
Cuadro 5. Cultivos afectados por X. fastidiosa (Fuente: Hopkins, 1989)
Cultivo nombre científico
Citrus sinensis L. Osbeck
Coffea arabica L.
Vitis vinifera L.
Morus rubra L.
Prunus persica L. Batsch
Prunus salicina Lindl.
Prunus amygdalus Batsch
Pyrus pyrifolia Bum Nakai
Medicago sativa L.
Ulmus Americana L.
Platanus occidentalis L.
Quercus rubra L.
Catharantus roseus L. G. Don
Cultivo nombre común
Naranja Valencia
Café arabigo
La vid
Mora roja
Duraznero
Ciruelo japonés
Almendro
Pera japonesa
Alfalfa
Olmo americano o blanco
Plátano occidental
Roble rojo
Vicaria
Enfermedad
Citrus variegated chlorosis
Coffea leaf scald
Pierce's disease
Mulberry leaf scorch
Phony peach
Plum leaf scald
Almond leaf scorch
Pear leaf scorch
Alfalfa dwarf
Elm leaf scorch
Sycamore leaf scorch
Oak leaf scorch
Periwinkle wilt
Maple leaf scald
Oleander leaf scorch
Hay cultivos que actúan como hospederos asintomáticos o con asociaciones de otros agentes
de enfermedades como es el caso que demuestra el estudio en México de la asociación
molecular de Xylella fastidiosa en el cultivo de papa Solanum tuberosum L. con síntomas de
punta morada (Gutiérrez et al., 2009). O el caso donde se encontró a la bacteria Xylella
fastidiosa infectando aguacates (Persea americana) en Costa Rica, y cuyo muestreo para
dicho estudio se realizó entre los años 2000 y 2004 lo cual representa un nuevo registro de
hospedante para este patógeno (Organización Norteamericana de Protección a las plantas
Sistema de Alerta Fitosanitaria 2008).
2.3.4. Descripción/ sintomatología de CVC
En las plantas afectadas, las hojas de los brotes jóvenes muestran una clorosis similar a la de
una deficiencia de zinc, mientras que en las hojas de más edad aparecen jaspeados. El envés de
las hojas presenta manchas de color marrón claro y ligeramente prominentes, que se
corresponden con las zonas cloróticas del haz. Estas manchas son puntiformes o alargadas en
grupos o en líneas y finalmente se convierten en lesiones necróticas. Las ramas de la parte
superior del árbol pierden sus hojas y muestran síntomas de necrosis de ramillas («die-back»).
Los frutos son muy pequeños y maduran prematuramente. La producción es muy reducida.
(Garnier; 2000). Los valores de Brix y acidez se incrementan en frutas de plantas enfermas,
21
bajando el porcentaje de jugo. El problema parece agudizarse en los meses de mayo hasta
agosto (Palacios, 2005).
Clasificación de los síntomas:
Nivel I: Pocas hojas con síntomas que todavía no se manifiestan en los frutos.
Nivel II: Síntomas en hojas y frutos pero restringidos a una parte de la copa.
Nivel III: Síntomas avanzados en toda la copa, frutos pequeños, la bacteria está distribuida por
toda la planta (Naranjo et al., 2005).
2.3.5. Hospederos de CVC
En sentido general, son susceptibles todas las variedades de naranjo dulce, independiente del
patrón utilizado, las más afectadas son: Pera (más susceptible), Hamlin, Natal, Selecta,
Valencia, Valencia de hoja mustia, Baianinha y Barao. El naranjo Westin es el menos
susceptible. Entre los mandarinos las variedades más susceptibles son: Nova, Fortune,
Clementino, Ellendale y Wilking.
Las plantas injertadas sobre los patrones más vigorosos son más afectadas por CVC. Los
portainjertos donde se manifiesta mayor incidencia de la enfermedad son: limero Rangpur,
mandarino Cleopatra, C. volkameriana o citrange Troyer, mandarino Sunki, naranjo Caipira y
los trifoliados. El pie de Poncirus trifoliata pareciera agravar el problema (Garnier, 2000).
Los cultivares tolerantes son los mandarinos Murcott, Sunburst, (13a reunión del Comité de
problemas de productos básicos, 2003) Ponkan, Dancy y Satsuma; el cidro y los pomelos
Redblush Star Ruby y Marsh Seedless, Fortunella sp., los tangelos, el limonero Siciliano, los
limeros mexicano y Tahití, el naranjo agrio y los híbridos de Satsuma x Natal (Naranjo et al.,
2005). Los kumcuats, las naranjas trifoliadas y las toronjas no suelen mostrar síntomas de esta
enfermedad, pero permiten en cierta medida la multiplicación de las bacterias.
2.4. Etiología de CVC
En trabajos realizados en los centros de investigación de Brasil, se consideraron tres hipótesis
como agentes causales de “CVC”: 1) algo muy asociado a la Xylella fastidiosa, 2) a un viroide
o mycoplasma, o simplemente 3) un problema nutricional (Rossetti et al., 1965).
22
En posteriores trabajos de investigación se menciona que además del accionar de la bacteria,
parecería que están influenciando otros factores como desordenes nutricionales, provocados
muy posiblemente por nematodos como Tylenchulus semipenetrans y otros (Rodriguez et al.,
1999), ya que una vez controlados estos nematodos las plantas mejoraban sustancialmente. En
parte coincide con los trabajos de Rossetti (1965).
En 1984 apareció en Monte Carlo (en Misiones, Argentina), se observó sensibilidad en plantas
de pomelo Duncan (Agostini y Haberle, 2000). Por microscopía electrónica se pudo detectar
abundante bacteria en el xilema de las ramas. Estudios realizados por Garnier (2000)
coinciden con otros investigadores en que la bacteria Xylella fastidiosa Hopkins, Gram
negativa, es el agente causal, ya que es común encontrarla ubicada en el xilema de ramas y
troncos en plantas afectadas por el mal, observándose un bloqueo de vasos (Palacios, 2005).
2.4.1. Xylella fastidiosa
Es una bacteria pequeña, Gram negativa, aerobia, con forma de bastoncillo de 0.1-0.5 micras
de diámetro x 1-5micras de longitud, no flagelada y no produce esporas (CABI/EPPO s/f) que
tiene una pared rugosa característica; crece lentamente en medios especiales (Hopkins 2001).
Las cepas y patotipos de la especie han sido identificados y caracterizados mediante el uso de
varios métodos moleculares que incluyen: rep-PCR, RAPD-PCR, RFLP e hibridación ADNADN. Y, la bacteria causante de la clorosis variegada de los cítricos está serológicamente
relacionada con las cepas de X. fastidiosa responsables de la enfermedad de Pierce de la vid,
de la hoja seca del almendro y del achaparrado de Ambrosia sp. (Anón., 2000).
2.4.2. Origen del agente causal
Xylella fastidiosa, la más estudiada de las Bacterias Fastidiosas Limitadas al Xilema (XLB),
presenta un amplio rango de hospederos además de los cítricos es por ello que se complica
especificar un centro de origen. Causa una afección severa en la mayoría de sus hospedantes.
En 1892, en la región vinícola del sur de California, USA, se observaron por primera vez los
síntomas causados por Xylella Fastidiosa en la vid, y se le denominó al síndrome "la
enfermedad de Pierce”, y recientemente ha sido identificada en Europa. Posteriormente,
enfermedades similares fueron reportadas en muchas frutas y árboles ornamentales (EPPO,
2004): la quemazón foliar de la adelfa o laurel rosa (Nerium oleander), almendros y varios
23
árboles forestales, “Phony peach” del duraznero, y el escaldado de la hoja en ciruelas son
ejemplos de enfermedades causadas por esta bacteria en California, Georgia y otros estados de
Estados Unidos. En Taiwán, la quemazón de la hoja del peral se le atribuye a X. Fastidiosa.
En cítricos, se encuentran los primeros indicios de CVC en América del Sur, en 1984 en
Argentina y en 1987 en Brasil, como se mencionó anteriormente, la cual se ha tornado en una
limitante de la producción de cítricos y el mismo patógeno fue identificado como el agente
causal de un escaldado de la hoja en cafeto.
En cada una de estas enfermedades la bacteria es transmitida de planta a planta por insectos
vectores, particularmente miembros del suborden Auchenorrhyncha, de la familia Cicadellidae
(“sharpshooters”). La enfermedad de Pierce de la vid se consideró al inicio como una
enfermedad de menor importancia en California, debido a que su vector era relativamente
sedentario. Sin embargo, esta enfermedad ha tomado un papel más devastador recientemente,
amenazando a las industrias de las uvas y del vino en dicho estado. El cambio en la
importancia de esta enfermedad proviene de la invasión del área dedicada al cultivo de uvas de
Homolodisca coagulata, un miembro de la familia Cicadellidae. Dicha importancia ocurrió
solamente por este factor sin que ocurriera una mutación en los genes de virulencia de este
patógeno bacteriano ni de la ampliación en la siembra de cultivares de uva susceptibles. El
insecto adquiere a X. fastidiosa a medida que se alimenta en los viñedos del sur y centro de
California, movilizándose rápidamente de allí a grandes distancias, alimentándose a medida
que pasa por ellas y diseminando eficientemente a la bacteria de una planta a otra y de viñedo
en viñedo.
2.4.3. Nomenclatura/ taxonomía de Xyllela fastidiosa
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Xanthomonadales
Familia: Xanthomodaceae
Género: Xylella
Especie: fastidiosa
Código EPPO: XYLEFA (CABI, 2010).
24
2.4.4. Transmisión
Xylella fastidiosa es una bacteria cuyos mecanismos de dispersión aún se evalúan. Sin
embargo, se considera que su transmisión es ocasionada por porta yemas contaminadas ya que
tarda de 9-12 meses para que aparezcan los síntomas. Por lo tanto, los árboles y las yemas de
propagación son portadores asintomáticos de la bacteria ( EPPO/CABI, s/f). Xylella fastidiosa
infecta los tejidos de los frutos del naranjo y las semillas, estableciendo colonias en ellos;
transmitiéndose así de semillas a plántulas (NAPPO, 2003).
X. fastidiosa es transmitida por homópteros que se alimentan del xilema. Este grupo de
insectos incluye a chicharritas “sharpshooters” (Hemiptero, subfamilia Cicadellinae), y a los
saliveros (Hemiptero, Familia Cercopidae). Es posible que las cicadas (Hemiptero, familia
Cicadidae), que también se alimentan del xilema, puedan transmitir a X. fastidiosa, pero ésto
todavía no ha sido demostrado
Prácticamente todos los insectos chupadores que se alimentan principalmente del líquido del
xilema son vectores potenciales (Purcell, 1989). En Brasil se han identificado al menos 11
especies de cicadélidos que transmiten la clorosis variegada de los cítricos (Anón., 2003). La
transmisión sin embargo también se puede ver influida por otros cultivos susceptibles a
adquirir la bacteria y cuya relación o compatibilidad de hospedero y vector la hagan una
amenaza al encontrarse cercano a las huertas citrícolas; como es el caso de Marucci (2003).
Éste confirmó la transmisión de Xilella fastidiosa de las especies de café por los vectores
Homalodisca ignorata Melichar, Oncometapia facialis (Signoret), Young y Dilobopterus
costalimai Bucephalogonia xanthophis (Berg), y que también son los vectores en cítricos, con
eficiencias variables de 2,2% de H. ignorata a 20% D. costalimai (Bragantia, 2006).
2.5. Vectores de Xyllela fastidiosa
La bacteria se adquiere de manera eficiente por insectos vectores, sin periodo de latencia, y
persiste en insectos adultos infecciosos de forma indefinida (Severin, 1949), Estos vectores
tienen bien desarrollada una cámara de succión que les permite consumir bajo fuerte presión
negativa los nutrientes del xilema (Purcell, 1989), principalmente aminoácidos y ácidos
orgánicos (Andersen et al., 1989) excretando el exceso de líquido a través del ano. Como los
aminoácidos se encuentran en baja concentración en el xilema, estos insectos deben ingerir
25
grandes cantidades de líquidos (Purcell, 1989; Raven, 1993). Varias especies de cicadélidos
que son comunes en las zonas citrícolas son sin duda vectores potenciales cuya eficacia
(Cuadro 7) varía según la especie (Anón., 2003). Los vectores más importantes al sur del
continente Americano son: Acrogonia terminalis, Dilobopterus costalimai y Oncometopia
fascialis; otros vectores presentes son Sonesimia grossa, Hortensia similis, Ferrariana sp. y
Molomea sp. Se ha demostrado que el cicadélido de alas vidriosas Homoladisca coagulate,
presente en el sudeste de los Estados Unidos y ahora también en California, es capaz de
transmitir la clorosis (Anón., 2003). A esta lista se suman Acrogonia virescens, Macugonalia
leucomelas, Bucephalogonia xanthophis, Plesiommata corniculata y Parathona gratiosa.
2.5.1. Eficiencia de transmisión
Las épocas del año de mayor ocurrencia de cigarritas en cítricos son la primavera y el verano.
La eficiencia de transmisión de estas especies es relativamente baja, según estudios realizados
en FUNDECITRUS (Cuadro 6).
Cuadro 6. Eficiencia de transmisión de
Xylella fastidiosa por cigarritas
Chicharritas (Cigarritas)
Macugonalia
Bucephalogonia
Dilobopterus
Plesiommata
Parathona
Acrogonia
Ferrariana
Oncometopia
Sonesimia
Homalodisca
A. virescens
Transmisión (%)
17.3
12.8
5.5
2.9
2.8
2.3
1.9
1.3
1.2
0.5
0.3
2.5.2. Cicadelidae
Los cicadélidos (Cicadellidae) son una familia de insectos hemípteros de la superfamilia
Membracoidea, suborden Auchenorrhyncha, conocidos vulgarmente como cigarritas,
chicharritas (término más usado) o saltahojas. Son pequeños insectos comedores de plantas
distribuidos en todo el mundo. Constituyen una de las familias más grandes de Hemiptera; hay
al menos 20,000 especies descritas. Se alimentan de la savia de una amplia y variada gama de
26
plantas a las que pueden transmitir virus y bacterias. Algunas especies son importantes plagas
agrícolas de la patata, remolacha, manzana, etc. Principalmente consumen la vegetación, pero
se sabe que también se dedican a pequeños insectos como pulgones.
2.5.2.1. Clasificación taxonómica del vector Homalodisca coagulata
La clasificación taxonómica general de los insectos vectores de Xylella fastidiosa es la
siguiente (hasta antes del género) y, en particular se muestra la especie H. coagulata:
Clase Insecta
Orden Hemiptera
Suborden Homoptera
Familia Cicadellidae
Subfamilia Cicadellinae
(http://www.cnr.berkeley.edu/xylella/overview/diseaseOverview.html)
Género Homalodisca
Especie coagulata
2.5.2.2. Daños causados
Los síntomas asociados con la infección de X. fastidiosa sugieren que la conducción de agua y
nutrientes del xilema es interrumpida por la presencia de la bacteria. Los agregados
bacterianos, los depósitos de goma o las tilosis que bloquean los elementos conductores, todos
ellos contribuyen a los estreses de agua que presentan las plantas infectadas. Como dato
interesante, microfotografías electrónicas de plantas afectadas han mostrado variaciones en
cuanto al número y tipo de oclusión de los elementos del xilema, lo que hace que se presenten
discrepancias en cuanto a los mecanismos del desarrollo de la enfermedad. Una teoría indica
que una fitotoxina liberada por el patógeno es responsable por la quemazón foliar. Otra
posibilidad es que la infección causada por X. fastidiosa afecte el balance de los reguladores
de crecimiento. En el caso de durazno, se ha aplicado ácido giberélico a los árboles afectados
por “Phony peach” mostrando algún tipo de remoción de los síntomas.
Las pérdidas a causa de la CVC ocurren en los estados más avanzados de la enfermedad, y se
reflejan en la reducción del crecimiento de la planta, particularmente de la fruta. Por lo general
los tallos de las plantas enfermas exhiben protuberancias en la parte alta de la corona, la cual
27
tiene hojitas y frutillos, y muestra defoliación en las ramillas finales. Cuando se llega a este
estado el árbol muere económicamente en la mayoría de los casos.
En los últimos años la producción de árboles ha estado sujeta a cambios radicales con el
objetivo de restringir el riesgo de contaminación por la CVC o el cancro cítrico. De un total de
20 millones de árboles jóvenes en el estado de São Paulo, aproximadamente 4 millones se
están produciendo en viveros. Los datos obtenidos en las investigaciones sobre la CVC
realizadas por FUNDECITRUS demuestran que la incidencia de la enfermedad aumentó del
22,09 % al 34,03 % entre 1996 y el 2000. El incremento en la gravedad de la enfermedad está
relacionado con la sequía inusual de esos últimos dos años (FUNDECITRUS, 2001).
2.5.3. Ciclo Biológico
Estudios de ultraestructura han revelado que la bacteria puede adherirse a la parte interna de la
trompa, el órgano de bombeo (cibario) y el precibario del cicadélido (CCP- FAO 2003). Se
multiplica en el vector, pero no circula en su hemolinfa, ni requiere un período de latencia
antes de la transmisión (a diferencia de un fitoplasma) (EPPO/CABI s/f). Y se libera
directamente cuando el insecto se alimenta de nuevo (Purcell et al., 1979). El insecto pierde la
capacidad de transmitir X. fastidiosa cuando se produce la muda. Una vez que el adulto
contrae X. fastidiosa, conserva la capacidad de transmitirla durante toda su vida (CCP- FAO,
2003).
En el caso particular de H. coagulata (una chicharrita o “leafhopper”) para las condiciones de
Parras, Coahuila donde es vector de la „Enfermedad de Pierce‟ en vid (pero también se ha
reportado que puede transmitir CVC), estas chicharritas miden aproximadamente 12 mm de
longitud, en su mayoría de color marrón en la parte dorsal, con marfil y negro en el abdomen,
tienen grandes alas marrón humo con una mancha blanca en cada ala. El rostro y las piernas
son de color amarillo-anaranjado. Las ninfas son grises y no tienen alas, con una forma del
cuerpo similares a los adultos.
En el mes de marzo (2a o 3a semana) aparecen las ninfas de la primera generación las cuales
por no presentar alas se alimentan de los brotes tiernos pegados a las hojas donde nacieron, y
ahí se desarrolla prácticamente las primera generación. En el mes de mayo (1a o 2a semana)
28
aparecen los adultos de los cuales se migrarán al viñedo e inician el apareamiento y consigo la
segunda y posteriormente la tercera generación tanto en viñedo como en áreas de la periferia.
Por ser una chicharra más grande se ha observado que las distancias de su desplazamiento son
mayores infectando más sarmientos.
Se les localiza principalmente en árboles y arbustos, tanto de la viña como de la periferia de la
misma. Homalodisca segrega una sustancia líquida que al secar presenta coloración
blanquecina, en épocas de mucha incidencia del insecto asemeja una lluvia. Los adultos
invernantes pasan por una diopausia reproductiva, apareciendo en el mes de febrero (2a y 3a
semana) en brotes tiernos de árboles y arbustos perenes como pirules, eucaliptos, laureles,
truenos y aguacates; así como en árboles que inician su brotación como fresnos, higueras,
morales, bugambilias, parras silvestres y nogal.
Las hembras, que son más grandes que el macho, ovipositan en las hojas jóvenes de dichas
especies depositando grupos de 3 a 28 huevecillos. A medida que la hembra pone sus huevos
los va cubriendo con un material blanco raspado de los depósitos de sus alas.
En la región de Parras, Coahuila se presentan 3 generaciones al año y cada generación tiene 5
estadios ninfales:
Estadio
Ninfa 1
Ninfa 2
Ninfa 3
Ninfa 4
Ninfa 5
Adulto
Unidades calor
1170
2300
3430
455
570
900
Días
11-14
10-11
10-11
09-10
09-10
13-15
2.5.4. Control de la familia Cicadelidae
En la Isla de Pascua, Región de Valparaíso, único lugar en Chile donde ha sido detectada.la
chicharrita de alas cristalinas Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae) las
actividades de control se realizan en el lugar de detección del insecto, utilizando un insecticida
de baja toxicidad para las personas, con el propósito de disminuir las poblaciones de la plaga
en un corto plazo. También se está implementando un sistema de control biológico de la plaga
con el insecto Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) presente en Isla de Pascua y
29
que actúa sobre los huevos de H. vitripennis (ootecas). Debido a las bajas poblaciones de la
plaga existentes en la actualidad, los intentos de crianza de este controlador biológico bajo
condiciones de laboratorio han sido infructuosos, sin embargo, en la actualidad, la colecta en
terreno de masas de huevos parasitados de H. vitripennis y su posterior traslado al laboratorio
permiten la obtención de adultos de G. Ashmeadi, los cuales posteriormente son liberados en
los lugares con mayor presencia de la plaga para su control natural (SAG, s/f).
2.5.5. Distribución de la familia Cicadelidae
Las chicharritas (Cicadellidae) en la subfamilia Cicadellinae en América del Norte. En
California (EE.UU.), todos los miembros probados de la subfamilia Cicadellinae (incluyendo
Carneocephala fulgida, Minerva y Draeculacephala atropunctata Graphocephala) eran
portadores de la cepa de la vid. Homalodisca coagulata, H. insolita, Oncometopia, Versuta
Graphocephala y Costalis cuerna se presentan como los vectores de la cepa bacteriana en
durazno (Turner y Pollard, 1959; Yonce, 1983). Al sur del continente Americano son:
Acrogonia terminalis, Dilobopterus costalimai y Oncometopia fascialis; Sonesimia grossa,
Hortensia similis, Ferrariana sp. y Molomea sp. Se ha demostrado que el cicadélido de alas
vidriosas Homoladisca coagulate, presente en el sudeste de los Estados Unidos y ahora
también en California, es capaz de transmitir el CVC (Anóm., 2003). A esta lista se suman
Acrogonia virescens, Macugonalia leucomelas, Bucephalogonia xanthophis, Plesiommata
corniculata y Parathona gratiosa. Cicadella viridis (Cicadellinae), comunes y generalizadas
en el centro y el sur de Europa.
2.5.6. Otros vectores
Prácticamente todos los insectos chupadores que se alimentan principalmente del líquido del
xilema son vectores potenciales (Purcell, 1989). Además de las chicharritas (Cicadellidae), los
salivazos (Cercopidae) son en gran medida las especies más comunes de vectores conocidos
en el medio natural de X. fastidiosa.
2.6. Epifitiología de CVC
La temperatura es uno de los factores ambientales de mayor influencia sobre la biología de los
insectos, pudiendo alterar el metabolismo, la reproducción, la longevidad y el comportamiento
30
alimentario de las chicharritas. También la temperatura influye sobre la velocidad de
desarrollo y sobrevivencia de los insectos, dentro de ciertos límites. Cuanto mayor es la
temperatura, mayor será la tasa de desarrollo (Haddad et al., 1984; Milanez et al., 2002). Otro
factor importante son las precipitaciones, cuando éstas son abundantes puede aumentar el
número de insectos atrapados (Roberto et al., 1998).
2.6.1. Factores que favorecen CVC
Los árboles más jóvenes son más susceptibles a esta enfermedad que los que tienen diez o más
años de edad. Los síntomas parecen manifestarse con mayor intensidad e incidencia en los
climas más cálidos (CCP- FAO 2003).
2.6.1.1. Relación con deficiencias nutricionales
La CVC ésta siempre relacionada con bajos niveles de K en hoja, asociados con los síntomas
característicos de deficiencias de Zn (Lima et al., 1996, Malavolta, 1994 y Rodríguez, et al.,
1997). Su estudio desde el punto de vista nutricional ha determinado que la aplicación de Zn y
K en forma conjunta incrementa significativamente el tamaño de los frutos en plantas con
síntomas de C.V.C. (Rodríguez et al., 1994). Adicional a esto la confusión de los síntomas de
CVC con otras deficiencias nutricionales como magnesio, hierro, y toxicidad con boro
(Naranjo et al., 2005) aumentan aun más la probabilidad de identificar erróneamente la
enfermedad. En el Anexo 2 se muestran los síntomas de estas deficiencias en comparación con
la sintomatología de CVC.
2.6.1.2. Relación con daños por plagas u otras enfermedades
Dentro de los síntomas semejante a CVC por otras enfermedades están: los producidos por el
Blinght o Declinamiento, síntomas de huanglongbing, y síntomas de sarampo (cuyo agente
causal aun es desconocido). El ataque de las raíces de los citrus por parte de nematodos
ocasiona síntomas similares a los presentados por plantas con CVC: disminución del
desarrollo de los árboles, incremento de la caída de las hojas en períodos de stress, reducción
en el tamaño de las frutas y rendimiento; los síntomas típicos incluyen amarillamiento de las
hojas y aspecto general de deficiencias nutricionales (FAIRS s/f); características por las que
31
los síntomas presentados por plantas con CVC podrían también ser asociados con los de
plantas atacadas por nematodos como Tylenchulus semipenetrans y otros (Petit,1991).
En el Anexo 3 se muestran los síntomas de algunas enfermedades en comparación con la
sintomatología de CVC.
2.6.1.3. Relación con factores ambientales
El clima de invierno es probablemente el factor clave en la delimitación de las áreas en las que
X. fastidiosa pueden persistir de una temporada a la siguiente. La enfermedad de Pierce y la
enfermedad falsa sólo se producen en zonas con un invierno suave, probablemente en relación
con la supervivencia de la bacteria en plantas inactivas (Purcell, 1989). La terapia
experimental en frío de vides enfermas sugiere que las temperaturas de congelación pueden
eliminar la bacteria directamente de las plantas (Purcell, 1980). Los inviernos húmedos
promueven la supervivencia de las poblaciones de vectores y la alta propagación de
enfermedades a favor de las regiones con veranos secos (EPPO/CABI s/f).
2.7. Control de CVC
La enfermedad es difícil de controlar, sin embargo, cuando los árboles presentan sólo síntomas
foliares, es posible eliminar la bacteria cortando las ramas afectadas. Esta poda debe
efectuarse lo antes posible y las ramas deben cortarse 50-100 cm por debajo de la hoja más
baja que muestre síntomas. Cuando aparecen los síntomas en frutos es casi imposible eliminar
la bacteria y es preferible arrancar los árboles. Si la planta es joven (hasta 2 años) es preferible
eliminarla. Se recomienda aplicar medidas estrictas de cuarentena para evitar la introducción
de la enfermedad en zonas no afectadas y evitar la propagación de la enfermedad en el vivero
mediante un programa de certificación de yemas y plantas. Así mismo, en zonas afectadas es
recomendable propagar las plantas de vivero bajo malla y mantener bajas las poblaciones de
vectores en el campo, al menos los primeros años de la plantación (Soc. Española de
Fitopatología, 2000).
2.7.1. Métodos de control
La implementación de normas que regularicen la sanidad del material vegetal que ingresa al
país, programas de certificación de material propagativo, el uso de árboles nuevos producidos
32
en vivero, aplicación de insecticidas pulverizados para reducir las poblaciones de vectores, la
poda periódica de los árboles cuando muestran indicios o primeros síntomas, o la erradicación
de plantas con síntomas ya avanzados son algunos de los métodos de control.
2.7.2. Impacto estimado para
México es altamente propenso a adquirir la bacteria de Xylella fastidiosa no solo en el cultivo
de cítricos, ya que por el espectro de la bacteria abarca un sinnúmero de especies agrícolas,
muchas de las cuales son cultivadas en nuestro país (Anexo 4), como es el caso del café, uva,
cítricos, entre otros cultivos. Las condiciones climáticas son otro factor que favorece a los
huéspedes del vector y a la bacteria, ya que a temperaturas de entre 25°C – 35°C propician su
reproducción (a mayor temperatura, mayor tasa de reproducción), aunado a esto las
precipitaciones en los meses de verano incrementan la reproducción vectorial. La colindancia
de los países que enfrentan esta enfermedad, y los fenómenos naturales como huracanes y
tormentas tropicales, ciclones etc. hace aun más probable el riesgo, si se considera que en su
trayecto arrastran todo tipo de polizones naturales, que arriban a territorio mexicano.
Algunos de los vectores como la chicharrita de alas cristalinas Homalodisca coagulata (Say)
vector de la vid y también ocasionalmente vector en cítricos (en primavera), se encuentra
presente en Parras, Coahuila aunque su presencia es muy escasa; hay otras 3 especies de
chicharritas emparentadas: otra del mismo género y 2 del género Oncometopia (Coronado et
ál., 2000); ninguna de ellas es plaga.
H. coagulata vector de la enfermedad de “Pierce” en vid, es originario del noreste de México
y del sur de Estados Unidos; actualmente es plaga de los viñedos en California, EUA y ya está
atacando cítricos y algunas plantas ornamentales, por lo que es conveniente estar preparados
por si cambia su estatus de importancia en México. En Tamaulipas se han recolectado 3
especies de Gonatocerus (Mymaridae) y una de Ufens (Trichogrammatidae), que son
parasitoides de huevos de estas chicharritas (Ruiz et al., 2006).
2.8. Pruebas de detección y diagnóstico
El diagnóstico sobre el terreno de la clorosis variegada de los cítricos es difícil, porque esta
enfermedad puede confundirse con otras que producen marchitez. Los árboles infectados con
33
clorosis sometidos a la prueba de la inyección con jeringa absorben el agua, mientras que los
infectados con la quemazón de los cítricos no la absorben (CCP- FAO 2003).
Los síntomas para el diagnóstico sobre el terreno son el tamaño pequeño de los frutos con un
alto contenido de azúcar, la lesión gomosa en el envés de las hojas y las hojas pequeñas y
curvadas de la cima del árbol (CCP- FAO 2003).
Los métodos de detección de laboratorio comprenden: cultivo de la bacteria: las cepas de X.
fastidiosa responsables de CVC pueden ser cultivadas en medio PW, PD2 ó CS20, en los que
forman colonias en 5-10 días a 30°. La bacteria cultivada inoculada mediante inyección en el
xilema de plantas jóvenes de naranjo, induce los síntomas característicos de la enfermedad a
los 6-12 meses de la inoculación. Métodos serológicos: la bacteria puede detectarse mediante
ELISA utilizando anticuerpos policlonales preparados frente a una cepa de X. fastidiosa
aislada de cítricos infectados por CVC. Existe un estuche comercial para la detección de la
bacteria en cítricos, que puede servir para confirmar un diagnóstico basado en la observación
de síntomas o incluso para detectar la bacteria antes de la aparición de éstos (Soc. Española de
Fito. 2000).
El problema que plantean la mayoría de estos métodos de detección es que resulta difícil
diferenciar las cepas causantes de la clorosis variegada de los cítricos de otras cepas de X.
fastidiosa. Hay informes que indican que los métodos de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) permiten la detección específica de la cepa que causa esta enfermedad.
2.9. Detección por PCR
La detección de CVC por sintomatología visual, complica la evaluación diagnostica,
aportando falsos positivos, para ello utilizar herramientas moleculares para identificarla
aumenta totalmente la veracidad del resultado.
La prueba de la reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR; permite identificar
patógenos con casi un 100 % de confiabilidad. Esta técnica permite amplificar a gran escala,
regiones especificas del ADN y facilita la manipulación posterior de los fragmentos
amplificados (Hernández, 2004).
34
2.9.1. Fundamentos de la técnica de PCR
PCR son las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la
Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un segmento, sección o
fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy
elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas
(79ºC a 85ºC), de ahí su nombre comercial más conocido: taq polimerasa.
Cuando se efectúa una reacción de PCR se simula lo que sucede en una célula cuando se
sintetiza el ADN. Sólo que in vitro (tubo de PCR) se mezclan todos los ingredientes necesarios
para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que es de interés amplificar –donde se
encuentra el segmento que se va a sintetizar/ copiar– , los oligonucleótidos (denominados
también como primers, iniciadores, cebadores, “oligos”, etc.) necesarios para que se inicie la
transcripción, dinucleótidos (dNTPs) y, las condiciones para que la enzima trabaje
adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl 2, KCl, u
incluso pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa).
Esta técnica tan ingeniosa tiene muchísimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una
herramienta muy importante en la biología molecular; sus aplicaciones van desde la genética
de poblaciones, evolución molecular y genómica hasta la medicina forense.
El PCR tiene diferentes métodos o aplicaciones en función de lo que interese investigar (como
son los RAPDs, AFLPs, ISSRs, SSCP) y el primer paso es tener claro el tipo de información
que se requiere, para elegir o diseñar la estrategia más apropiada. Brevemente se puede dividir
la técnica en dos categorías:
1) PCRs para la amplificación de un solo sitio conocido del genoma (locus). Estos PCRs
requieren conocer la secuencia que se trabaja (por ejemplo cuando se amplifica un gen
específico como el 16S), en cuyo caso se utilizan oligonucleótidos diseñados a partir de la
secuencia de ese gen y se obtiene un solo fragmento de un tamaño ya conocido.
Con este tipo de PCRs es posible hacer filogenias, y para obtener los datos hay distintos
caminos: desde hacer geles especiales que detectan cambios hasta de una sola base entre las
secuencias (SSCP), hasta utilizar enzimas de restricción para generar patrones de cada
individuo. Aunque lo ideal es obtener la secuencia completa del gen que se amplifica, sobre
35
todo cuando se desea responder a preguntas relacionadas con las fuerzas evolutivas que han
actuado sobre él. El gen secuenciado puede ser analizado desde varias perspectivas.
2) PCRs en los que no es necesario conocer la región que se está amplificando (se amplifican
regiones no conocidas, como zonas hipervariables del genoma o aleatorias), por lo cual no se
sabe el tamaño del fragmento (o fragmentos) que se esperan. Éstos se utilizan para determinar
polimorfismo genómico y son los más comunes para fingerprint (huella genética), ya que es
sencillo obtener los datos (un gel de agarosa después del PCR es suficiente). Se observan
varios loci simultáneamente y la información de las zonas variables permite inferir los datos
necesarios para análisis de genética de poblaciones.
En general este tipo de PCRs utiliza un solo oligonucleótido con 2 características importantes:
que sea de pequeño a mediano (de 6 a 18 bases) y sobre todo que su secuencia esté presente
muchas veces en el ADN del organismo en estudio.
Existen zonas repetidas hipervariables del ADN que pueden amplificarse de esta manera, por
ejemplo los sitios que sirven para iniciar la síntesis de ADN en los cromosomas, conocidas
como microsatélites.
En el primer ciclo de reacción lo que sucederá es que el oligonucleótido utilizado hibridará en
distintas zonas del ADN, y primero comenzarán a sintetizarse fragmentos de tamaños
variables e indefinidos (hasta donde la polimerasa logre copiarlos). En el segundo ciclo las
cadenas sintetizadas a partir de las primeras copias formadas serán del tamaño que existe entre
dos oligonucleótidos que no estén muy alejados entre sí. Estos fragmentos se copiarán una y
otra vez, y de esta manera, finalmente se obtendrán muchos fragmentos de tamaños diferentes,
de los que se conocerá la secuencia con que inician y terminan, pero no la secuencia completa
de cada uno.
2.9.2. Técnicas de PCR utilizadas en la detección de Xylella fastidiosa
Minsavage et al., en 1994 desarrollaron un protocolo de PCR para la detección de Xylella
fastidiosa en tejido de plantas de vid, donde utilizaron los primers RST31- RST33 esperando
una banda de 733 pb y cuyo resultado se corroboró con electroforesis en gel de agarosa al 1%,
para así comparar la sensibilidad y utilidad de la detección con el sistema ELISA.
36
Pooler y Hartung en 1995 elaboraron un protocolo de PCR específico para detectar e
identificar la hebra de Xylella fastidiosa causante de la clorosis variegada de los cítricos,
utilizando los primers CVC-1, 272-1-int, 272-2 int y cuya banda esperada fue de 500 pb, el
material que utilizaron fue: 7 muestras de cítricos originarias de Brasil, 1 muestra de cítricos
de Florida, 2 muestras de uva de Florida, 2 de mora de Massachusetts, 1 de almendro de
California, 1 de ciruela de Georgia, 1 de olmo de Washington, DC., 1 de roble de Washington,
DC., 1 de ragweed de Florida, 1 de vid de California, 1 de vinca de Florida y 2 de vid de
florida.
Por su parte, el boletín #34 de la EPPO en 2004 publica el protocolo de diagnóstico para
regular plagas de Xylella fastidiosa en cítricos y vid utilizando los primers para el caso de
cítricos 272-1 int- 272-2 int cuya banda esperada fue de 600 pb y para el caso de vid los
primers RST31- RST33 esperando una banda de 733 pb.
37
3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
3.1. Objetivo General
Establecer un protocolo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como técnica de
diagnóstico preventivo para la enfermedad de Clorosis Variegada de los Cítricos.
3.2. Objetivo Específicos
3.2.1. Determinar la utilidad de la técnica de extracción de ADN para el diagnóstico de
Huanglongbing HLB en el proceso de purificación de ADN para el diagnóstico de CVC.
3.2.2. Evaluar la efectividad de diferentes protocolos PCR diseñados/ modificados ex profeso
en la detección de CVC.
4. Hipótesis
Un protocolo de PCR eficaz en la detección temprana de la Clorosis Variegada de los Cítricos
reduciría considerablemente el riesgo de propagar la enfermedad eliminando falsos positivos
por evaluación sintomática debido a confusiones con otras enfermedades o por deficiencias
nutricionales.
38
5. MÉTODO
Este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de la Promotora Citrícola del Golfo
(PROCIGO), de Martínez de la Torre, Veracruz, durante el periodo Julio-Agosto de 2011.
Para su realización se estableció la siguiente metodología:
5.1. Análisis de protocolos relacionados
5.1.1. Se efectuó una investigación documental y análisis de protocolos implementados
previamente en Brasil (FUNDECITRUS) y de la EPPO (Organization Européenne et
Méditerranéenne pour la Protection des Plantes), con el fin de adaptar y establecer la estrategia
particular para las condiciones de PROCIGO.
5.2. Materiales
5.2.1. Material de análisis
 Se utilizaron muestras (hojas jóvenes) de cítricos sanos, de los viveros de PROCIGO, para
extraer ADN.
 Como la enfermedad no existe en México los controles positivos necesarios para la
implementación de este método son provenientes de la empresa FUNDECITRUS
localizada en San Paulo Brasil; estos controles consisten en tubos con ADN de material
vegetal joven de la variedad Naranja pera con síntomas de CVC.
 Como control negativo se utiliza agua.
5.2.2. Materiales y equipo para implementación del PCR
En las nueve pruebas realizadas (a partir del diseño de protocolos a emplear) se utilizaron
buffer, dNTPs 20 mM, dNTPs 5mM, MgCl2, primers (indicados en el Cuadro 7), Taq DNA
Polimerasa, agua, según concentraciones indicadas en los Cuadros 8 al 12 . La amplificación
del ADN se hizo en PCR punto final con un termociclador Techne (TC-412) y con Taq DNA
polimerasa de Invitrogen.
5.3.-Procedimiento
5.3.1. Recepción, observación y preparación de muestras vegetales
1.- Registro en bitácora de características de las muestras a su llegada al laboratorio y foto
documentación de las mismas.
39
2.- Lavado de muestras (hojas), con agua y jabón líquido, para eliminar cualquier
contaminante. En este paso se pueden evaluar el uso de métodos de desinfección.
3.- Separación del pecíolo y nervadura del resto del limbo de la hoja; y corte en pequeños
fragmentos del peciolo y la nervadura a utilizar.
4.- Colocación de los cortes en un tubo eppendorf de 2 mililitros hasta la marca de 1 mililitro,
para aplicación del protocolo de extracción de ADN.
5.3.2. Extracción de ADN
Para la extracción de ADN se utilizó el protocolo desarrollado por Murray y Thomson (1980),
utilizando hojas jóvenes y sanas de cítricos de invernaderos:
1. Adicionar al tubo que contiene los fragmentos bien pequeños de material vegetal, la
cantidad de 1.4 ml de tampón de extracción conteniendo CTAB 2% +0,2 % de βmercaptoetanol. El β-mercaptoetanol se le agrega al CTAB minutos antes de usarlo.
2. Dejar 2 horas y 30 minutos en baño seco a 65°C con una agitación por inversión
manual cada 30 minutos.
3. Centrifugar a 13 000 rpm x 5 minutos.
4. Recuperar 0.8 ml del sobrenadante transfiriendo a un tubo eppendorff nuevo.
5. Adicionar 0.8 ml de cloroformo- alcohol isoamílico 24:1 y homogenizar invirtiendo el
tubo.
6. Centrifugar a 13,000 rpm por 10 minutos.
7. Recuperar 0.7mL de la fase acuosa para un tubo nuevo y adicionar 0.6 volúmenes de
isopropanol.
8. Incubar 30 minutos a -20 °C. Se puede dejar en este paso durante toda la noche.
9. Centrifugar a 13,000 rpm por 20 minutos.
10. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de etanol al 70 %.
11. Centrifugar por 10 minutos a 13,000 rpm. Repetir este proceso de lavado.
12. Secar el ADN invirtiendo el tubo sobre el papel toalla por espacio de 30 minutos.
13. Resuspender el ADN en 50 µL de agua mili Q.
5.2.5. Comprobación mediante análisis electroforético
Para la comprobación de la presencia o ausencia y calidad del ADN se corren las muestras en
un gel de agarosa al 0.8 % y se utiliza marcador PM 100 pb. Preparación del gel de agarosa:
1. Pesar 1.6 gr de agarosa (ultrapure de invitrogen).
2. Medir en una probeta 20 ml de Buffer 10x y aforar a 200 ml con H2O.
3. Adicionar la agarosa e introducir al microondas por 2min y 30s.
40
4. Adicionar 8 µml de indicador de DNA (SYBR safe DNA gel stain 10 000x concentrate
in DMSO).
5. Verter en la cama de electroforesis y esperar a que gelatinice.
6. Colocar dentro de la cámara de electroforesis conteniendo tampón TBE al 1%.
7. Introducir en el canal inicial el marcador PM 100 pb.
8. En un pedazo de parafilm colocar 3 µml de Buffer de corrida o tampón de corrida
mezclar con la muestra de ADN e introducir en cada canal del gel.
El gel es sometido a una corriente de 110 V. Terminado el tiempo establecido para la corrida
de las bandas, se retira el gel de la cámara, y se coloca en un equipo foto-documentador
MiniBisPro para la observación con luz UV y la toma de una foto.
5.2.6. Diseño de las condiciones de estandarización u optimización de PCR
Verificada la presencia y calidad del ADN se diseñaron los diferentes protocolos de prueba, en
los que se calcularon y establecieron distintas concentraciones de primers, dNTPs, MgCl2, y
enzima Taq Polimerasa (mostradas en los resultados, Cuadros 8 a 12). También se evaluaron
las temperaturas y períodos de tiempos de ciclaje, mostradas en los mismos cuadros.
Para el diseño de los protocolos se tomaron en cuenta los trabajos desarrollados por los
investigadores citados en el Cuadro 7:
Cuadro 7. Referencias relacionadas al uso de primers para detección de CVC
Referencia de cuadro y Primers
autor
Secuencia de primer
Pooler y Hartung. 1995
CVC-1
AGATGAAAACAATCATGCAAA
272-2 int
GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT
RST31
GCGTTAATTTTCGAAGTGATTCGATTGC
RST33
CACCATTCGTATCCCGGTG
272-1 int
272-2 int
CTGCACTTACCCAATGCATCG
GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT
Minsavage et al., 1994
EPPO, 2004
Banda
esperada
(pb)
500
733
600
Bajo condiciones asépticas en una campana de flujo laminar horizontal con luz UV se
prepararon en frío las mezclas de reacción y se añadieron las alícuotas de ADN (Figura 7).
41
Figura 7. Preparación de muestras para PCR en campana de flujo laminar.
La amplificación del ADN mediante PCR fue realizada en un equipo termociclador Techne
(TC-412) (Figura 8). Se utilizó Taq DNA polimerasa comercializada por la firma Invitrogen.
42
Figura 8. Amplificación de las muestras.
Para visualizar los productos de amplificación por PCR que resultaron de las nueve pruebas de
protocolos, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% (Figura 9) y se
fotodocumentaron los patrones de bandeo respectivos.
Figura 9. Electroforesis de las muestras
43
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De acuerdo con los objetivos planteados en este trabajo se obtuvieron los siguientes
resultados.
Con relación al primer objetivo específico, relativo a la comprobación de la utilidad de la
técnica de extracción de ADN para el diagnóstico de Huanglongbing (HLB), en el proceso de
purificación de ADN para el diagnóstico de CVC, en la Figura 10 se muestra la buena calidad
del ADN vegetal obtenido por ese método (relativo al ADN del material vegetal sano). Sin
embargo, en la misma figura se observa la ausencia de ADN de los controles positivos. Aún
cuando se aumentó la alícuota, el resultado se observa igual.
Figura 10. Determinación de calidad de DNA por electroforesis
Sin embargo, por la técnica de HPLC (High Performance Liquid Chromatography) se
comprobó la presencia de DNA de los controles positivos, por lo que se decidió trabajar con
esas muestras. Ya comprobada la presencia de ADN las muestras fueron colocadas en
refrigeración a -20°C.
De las nueve pruebas de amplificación realizadas, cinco mostraron resultados negativos para
este trabajo, mismas que se realizaron con las primeras alícuotas de controles positivos
provenientes de Brasil FUNDECITRUS, aún cuando se hizo el diseño de modificaciones en
44
las concentraciones de ADN y en el ciclaje utilizado en el termociclador (Cuadros 8 y 9). Los
cuatro ensayos restantes fueron positivos, (Cuadros 10 al 12).
A continuación se muestran los diseños de los nueve protocolos diseñados y probados para
este trabajo.
En el Cuadro 8 se ilustran los tres primeros ensayos (protocolos 1, 2 y 3) realizados con la
primera muestra de controles positivos (ADN de plantas con síntomas de CVC proveniente de
Brasil) con los primers CVC 1/ 272-2 int . Para el diseño de las combinaciones de los mismos
se tomó como referencia el trabajo de Pooler y Hartung (1995), para probar tres volúmenes de
alícuotas y tres programas de ciclaje.
Cuadro 8. Protocolos probados en la amplificación de Xylella fastidiosa
(Toma como referencia el trabajo de Pooler y Hartung, 1995)
Uso de cebadores o primers CVC 1/ 272-2 int
Protocolo 1
Protocolo 2
Protocolo 3
Volumen final 25 μL
Volumen final 25 μL Volumen final 40 μL
Buffer 10x
1x
2.5 μL
1x
4 μL
1x
2.5 μL
dNTPs 20 mM
0.2 mM 0.25 μL
dNTPs 5 mM
0.2 mM
1.6 μL
0.2 mM
1 μL
MgCl2 50 mM 2 mM
1 μL
2 mM
1.6 μL
2.5 mM
1.25 μL
Primer 1 100μM 0.5 μM 0.125 μL 0.5 μM
0.2 μL
0.4 μM
0.1 μL
Primer 2 100μM
0.5 μM 0.125 μL 0.5 μM
0.2 μL
0.4 μM
0.1 μL
Taq Pol 5 u/μL
1.5 u/μL 0.3 μL
1.5 u/μL 0.3 μL
1 u/μL
0.2 μL
Agua
19.7 μL
31.1 μL
17.85 μL
DNA
1 μL
1 μL
2 μL
Programa
Programa
Programa
o
o
1) 94 C; 45 seg
1) 94 C; 45 seg
1) 94 oC; 4 min
2) 94 oC; 45 seg
2) 94 oC; 45 seg
2) 94 oC; 1 min
3) 62 oC; 45 seg
3) 62 oC; 45 seg
3) 62 oC; 1 min
4) 72 oC; 1 min
4) 72 oC; 1 min
4) 72 oC; 1 min
Del 2 al 4, 35 veces Del 2 al 4, 35 veces
Del 2 al 4, 30 veces
5- 72 oC; 4 min
5- 72 oC; 4 min
5- 72 oC; 10 min
6- 16 oC
6- 16 oC
6- 4 oC
En el Cuadro 9 se ilustran otros dos ensayos/ protocolos realizados también con la primera
muestra de controles positivos (ADN de planta con síntomas de CVC proveniente de Brasil).
Para éstos, se eligió el trabajo de Minsavage et al., 1994 para diseñar y calcular las
45
concentraciones de los Protocolos 4 y 5. Se utilizaron los primers (iniciadores) RST 31/ RST
33.
Cuadro 9. Protocolos probados en la amplificaciónde Xylella fastidiosa
(Se tomó como referencia el trabajo de Minsavage et al., 1994)
Uso de cebadores o primers RST 31/ RST 33
Protocolo 4
Protocolo 5
volumen final 25 μL volumen final 20.2 μL
Buffer 10x
1x
2.5 μL
1x
2 μL
dNTPs 20 mM
dNTPs 5 mM
0.2 mM
1 μL
0.2 mM
0.8 μL
MgCl2 50 mM 1.5 mM
0.75 μL 2.5 mM
1 μL
Primer 1 100μM 0.5 μM
0.125 μL 0.5 μM
0.1 μL
Primer 2 100μM 0.5 μM
0.125 μL 0.5 μM
0.1 μL
Taq Pol 5 u/μL
1.25 u/μL 0.25 μL 1 u/μL
0.2 μL
Agua
18.25 μL
6 μL
DNA
2 μL
10 μL
Programa
1) 95oC ; 1 min
2) 95 oC; 30 seg
3) 55 oC; 30 seg
4) 72 oC; 45 seg
Del 2 al 4, 40 veces
5) 95 oC; 30 seg,
6) 55 oC; 30 seg
7) 72 oC ;
8-4 oC; 5 min
Programa
1) 94 oC; 4 min
2) 94 oC; 1 min
3) 64 oC; 1 min
4) 72 oC; 1 min y 30 seg
Del 2 al 4, 35 veces
5) 72 oC; 10 min
6- 4 oC
Para los casos anteriores, la calidad de la muestra de ADN fue un factor importante. Para
comprobar la calidad de ésta y de los controles positivos , se determinó la calidad del ADN
después de realizar pruebas para corroborar tanto la presencia como la calidad de ADN.
Esto debió realizarse debido a que el control positivo era una muestra de ADN proveniente de
Brasil. Recuérdese que en México aún no se ha detectado la enfermedad, por lo que
afortunadamente no hay muestras disponibles de cítricos afectados en México.
La comprobación de la calidad del ADN es necesaria para los procesos de amplificación. Un
ADN de alta calidad implica que es de alto peso molecular y que no está fragmentado,
46
situación que se visualiza en un gel de agarosa al 1% normalmente, a través de una banda clara
y sin barrido. Así, la comprobación de calidad del ADN es un procedimiento rutinario, pero
necesario para preveer con certeza la confiabilidad de los resultados de amplificación. Más
aún en el caso de muestras de ADN puro, que al ser trasladadas a través de grandes distancias
(como en este caso, desde Brasil), podrían estar sujetas a contingencias imprevisibles y fuera
de control que las pudieran afectar. Es el caso de la elevación de temperatura de la muestra o
movimientos bruscos, causando la desnaturalización/ fragmentación de la misma, incidiendo
en un desempeño dudoso de la muestra en el proceso de amplificación por PCR. Esto se
evitaría si se manejara una muestra foliar, adecuadamente empacada/ refrigerada, pero se
correría el riesgo de introducir el inóculo bacteriano (transportado en la muestra foliar) a
terreno mexicano, situación sancionable ante Sanidad Vegetal/ SAGARPA.
Por otra parte, Ausubel et al. (1999) comentan que hay sustancias con potencial inhibidor de
PCR, mismas que pueden influir en la afectación en pureza de las muestras.
Como no se descartó la posibilidad de que los controles positivos (ADN) hubieran sido
afectados en el transporte, se solicito a FUNDECITRUS (Brasil) un nuevo envió de controles
positivos (con ADN bacteriano) para someterlos a pruebas para determinar su calidad (Figura
11).
En la Figura 11 se ilustra la electroforesis en gel de agarosa al 1%.del ADN utilizado como
control positivo, proveniente de Brasil (segundo envío), aún cuando no se alcanza a visualizar
(por haber sido muy diluida la muestra), pero igualmente comprobada por HPLC.
Figura 11. Comprobación del ADN utilizado
47
Con este nuevo material, se volvieron a efectuar los cinco protocolos mencionados en los
Cuadros 8 y 9. Igualmente se realizaron los siguientes protocolos (Cuadros 10 a 12):
El Cuadro 10 muestra las condiciones para la amplificación, que fueron diseñadas tomando
como base la referencia del boletín de la EPPO (2004), utilizando los primers 272-1 int y 2722 int y la enzima Taq Polimerasa de Invitrogen.
Cuadro 10. Protocolos probados en la amplificación de Xylella fastidiosa
(Tomando como referencia el trabajo de EPPO, 2004)
Reactivo
Concentración
Volumen
de reacción
Concentración final
10 X
2 μL
1X
Tampón*
50 mM
1.0 µL
2.5 mM
MgCl2 *
5 mM
0.8 μL
0.2 mM
dNTPs
100 μM
0.1 μL
0.5 μM= 500 nM
primer 272-1 int
100 μM
0.1 μL
0.5 μM= 500 nM
primer 272-2 int
5 u/μL
0.2 μL
1u
Taq DNA Polimerasa
14.8 μL
14.8 µL
Agua
1 μL
DNA
*) Incluidos en la presentación comercial de Invitrogen para la Taq polimerasa Platinum PCR
Supermix.
Paso
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Anillamiento
(anneling)
Extensión
Extensión final
Temperatura (°C)
Tiempo (min, seg)
No de ciclos
94
4 min.
94
1 min.
64
1 min.
35
72
72
1 min. y 30 seg.
10 min.
1
1
Los productos de la amplificación de las muestras fueron sometidos a electroforesis, y se
observó la banda esperada (resultado positivo/ de DNA planta enferma, procedente de Brasil)
de 500 pb en todos los carriles (tomando como referencia el carril 7, del Marcador de Peso
Molecular), a excepción del control negativo (CN) en el carril 6 (muestra de DNA de planta
sana).
48
Figura 12. Resultado positivo de ensayo con los primers 272-1 int/272-2 int
Después de este resultado, se implementó otro ensayo modificado para PROCIGO (Cuadro
11), con los mismos primers 272-1int -272-2 int que habían dado positivo el ensayo anterior
(Figura 12).
Cuadro 11. Protocolos probados en la amplificación de Xylella fastidiosa
(Tomando como referencia protocolo de PROCIGO)
Buffer 10x
dNTPs 20 mM
dNTPs 5 mM
MgCl2 50 mM
Primer 1 100μM
Primer 2 100μM
Taq Pol 5 u/μL
Agua
DNA
PROCIGO (272-1int -272-2 int)
Volumen final: 40 μL
1x
4 μL
0.2 mM
2 mM
0.5 μM
0.5 μM
1.5 u/μL
1.6 μL
1.6 μL
0.2 μL
0.2 μL
0.3 μL
31.1 μL
1 μL
Programa
1- 94; 45 seg
2- 94; 45 seg
3- 62; 45 seg
4- 72; 1 min
Del 2 al 4, 35 veces
5- 72; 4 min
6- 16 grados
Y, en el Cuadro 12 se muestra las condiciones del protocolo/ ensayo de PCR utilizado para
evaluar la respuesta de la enzima Platinum PCR Supermix de Invitrogen, que contiene las
49
sustancias en concentraciones probadas de amplificación para PCR de: dNTPs, MgCl2,
enzima Taq polimerasa, buffer. La formulación comercial de la Platinum PCR Supermix de
Invitrogen comprenden los componentes siguientes: 22 U/mL de Taq DNA polimerasa
recombinante en complejo con el anticuerpo Taq Platinum®, 22 mM Tris-HCl (pH 8.4), 55
mM KCl, 1.65 mM MgCl2, dNTPs 0.2 mM (equivalente a 220 μM dGTP, 220 μM dATP,
220 μM dTTP, 220 μM dCTP), y estabilizantes.
Se añadió a esta mezcla la muestra de DNA molde o templado (para amplificar), y los primers
272-1 int y 272-2 int.
Cuadro 12. Protocolos probados en la amplificación de Xylella fastidiosa
(Utilizando la enzima Platinum PCR Supermix de Invitrogen)
Reactivo
Platinum
Supermix
Cantidad
reacción
PCR 45 μL
Ensayo 1
por Concentración
final
Cantidad
reacción
30 μL
Ensayo 2
por Concentración
final
Primer 272-1 int
0.2 μL
0.4 μM= 400 nM
0.2 μL
0.6 μM= 600 nM
Primer 272-2 int
0.2 μL
0.4 μM= 400 nM
0.2 μL
0.6 μM= 600 nM
DNA
1, 2, 3 μL
Paso
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización
Anillamiento
(anneling)
Extensión
Extensión final
1, 2, 3 μL
Temperatura (°C)
Tiempo (min, seg)
94
4 min.
94
1 min.
64
1 min.
72
1 min. y 30 seg.
72
10 min.
No de ciclos
1
35
1
También en el Cuadro 12 se muestra la cantidad evaluada de enzima, misma que se logró
disminuir en el volumen de la alícuota de 45 µL a 30 µL sin disminuir la respuesta obtenida.
En la Figura 13 se muestra el gel de agarosa y el resultado obtenido del PCR usando los
cebadores 272-1 int/272-2 int y la enzima Platinum PCR Supermix de Invitrogen además de la
evaluación de la cantidad de alicuota utilizada.
50
Figura 13. Comprobación de la respuesta de la enzima Platinum PCR Supermix de Invitrogen
La guía de uso y recomendaciones de la enzima (Invitrogen) mencionan que: “una reacción
estándar de 50-μL utiliza 45 μL of Platinum® PCR SuperMix y 5 μL de primer y soluciones
del DNA molde (templado). Para los grupos de primers utilizados en el desarrollo de la
Platinum® PCR SuperMix, no fueron observados decrementos en el rendimiento del producto
si la cantidad del templado y de la solución del primer adicionados se encontraban entre una
fracción de 1 microlitro y 20 microlitros. Más bajos rendimientos ocurren si la concentración
de Mg++ disminuye un nivel subóptimo. Pero si la concentración final de Mg++ se ajusta a 1.5
mM, el volumen del primer y de la solución del templado que pueden adicionarse de los 45 μL
of Platinum® PCR SuperMix, puede excederse 50 microlitros”.
De tal manera que atendiendo estas recomendaciones para no afectar el desempeño
enzimático, al disminuir el volumen de reacción de 45 μL a 30 μL de la Platinum® PCR
SuperMix, realmente se abaten los costos por cada reacción, lo que permitiría en su momento,
tratar más muestras de DNA de plantas sospechosas de haber adquirido la CVC. Esto es
importante si se maneja un número grande de muestras/ árboles para certificar su sanidad.
Finalmente, en el cuadro 13 se ilustra una síntesis los protocolos probados, los primers
(iniciadores/ cebadores) utilizados, su secuencia, y la respuesta obtenida.
51
Cuadro 13. Resumen de los ensayos que fueron probados y la respuesta obtenida
Referencia
de
Autor y ensayos
diseñados
Pooler y Hartung
1995
3 Ensayos
Primers
Secuencia de primer
CVC-1
AGATGAAAACAATCATGCAA
A
GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT
Minsavage et al.
1994
2 Ensayos
RST31
EPPO 2004
1 Ensayo
PROCIGO
1 Ensayo
PROCIGO/ enzima
Super
Mix de
Invitrogen
2 Ensayos
272-2 int
Cultivo
antecede
nte
citricos
Banda
esperad
a (pb)
500
Resultad
o
en
cítricos
Negativo
733
Negativo
600
Positivo
600
Positivo
600
Positivo
citricos
vid
RST33
GCGTTAATTTTCGAAGTGATT
CGATTGC
CACCATTCGTATCCCGGTG
272-1 int
272-2 int
272-1 int
272-2 int
272-1 int
272-2 int
CTGCACTTACCCAATGCATCG
GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT
CTGCACTTACCCAATGCATCG
GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT
CTGCACTTACCCAATGCATCG
GCCGCTTCGGAGAGCATTCCT
Cítricos y
vid
vid
Esta información es de utilidad para la toma de decisiones en cuanto a los protocolos que
deberán emplearse en caso de brotes de la enfermedad en zonas productoras de cítricos de
México, o en el caso de programas de monitoreo para evaluar el estado sanitario de las plantas,
antes de la introducción de la bacteria a territorio nacional.
52
7. CONCLUSIONES
1. La técnica de extracción de ADN para el diagnóstico de HLB en el proceso de purificación
de ADN para el diagnóstico de CVC) fue efectiva y el ADN obtenido fue de buena calidad
(alto peso molecular e intacto) como se confirmó vía electroforesis.
2. Los protocolos diseñados para este trabajo, modificados de los utilizados por EPPO y
PROCIGO permiten la amplificación de muestras de DNA de plantas afectadas por CVC
(resultados positivos). Incluso algunos de ellos permiten el uso de un menor volumen de
alícuota y de Taq polimerasa, del complejo/ mezcla de reacción comercial utilizada. La
disminución de los costos por reacción de PCR es una situación positiva para cualquier
empresa citrícola que requiera el uso de este tipo de ensayos para evaluar la sanidad de las
plantas que comercializa.
53
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57
http://www.inegi.org.mx/prod_serv/contenidos/espanol/biblioteca/Default.asp?accion=2&upc
=702825000965
58
ANEXO 1
Postulados de Koch
1. El microorganismo siempre debe estar asociado con la enfermedad, y la enfermedad no
debe presentarse sin que el organismo o agente causal se encuentre presente o haya estado
presente.
2. El microorganismo en cuestión debe ser aislado en cultivo puro y sus características
determinadas.
3. La inoculación del microorganismo debe resultar en los mismos síntomas de la enfermedad.
4. El microorganismos debe ser re-aislado y sus características deben coincidir con las
determinadas en el segundo postulado (French y Hebert, 1982).
59
ANEXO 2
Comparación de síntomas por deficiencias nutricionales y por CVC
Síntomas de clorosis variegada de los cítricos
Síntoma planta
Síntoma hoja
Síntoma fruto
Deficiencia de zinc
Síntomas de deficiencia de nitrógeno
60
Deficiencia de fosforo
Deficiencia de de Potasio
Deficiencia de magnesio
Deficiencia de Hierro
Deficiencia de manganeso
61
ANEXO 3
Comparación de daños por CVC con daños por plagas u otras enfermedades
Síntoma planta
Síntomas de clorosis variegada de los cítricos
Síntoma hoja
Síntoma fruto
Cancrosis de los cítricos
Huanglongbing (Greening)
62
Stubborn
Psorosis
Leprosis
63
Anexo 4
Entidades de la republica mexicana con cultivos posiblemente
amenazados por enfermedades asociadas a Xylella fastidiosa
Estado
naranja
Aguas
calientes
Baja
california
Colima
Limón
Papa
Mandarina
café
uva
Mora
roja
durazno
ciruelo
almendro
pera
alfalfa
plátano
roble
Vinca
X
x
x
Chiapas
x
x
Chihuahua
x
Guanajuato
x
Hidalgo
x
Edo. De
México
Michoacán
X
X
Nuevo
León
Oaxaca
x
x
X
San Luis
Potosí
Sinaloa
X
X
Sonora
X
Tabasco
Tamaulipas
X
Veracruz
X
Zacatecas
olmo
X
X
X
X
X
X
X
X
Fuente: INEGI. Perspectiva Estadística. Serie por Entidad Federativa. México.
64
aguacate