CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS
AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL.
UNIDAD IRAPUATO.
Desarrollo de un nuevo método de transformación genética en el reino
fungi.
Tesis que presenta
IBQ. Denis Israel Magaña Ortíz.
Para Obtener el Grado de
Maestro en Ciencias.
En la Especialidad de
Biotecnología de plantas.
Director de la Tesis: Dr. Miguel Ángel Gómez Lim.
Irapuato, Guanajuato.
Agosto, 2010.
ii
AGRADECIMIENTOS.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el soporte institucional y monetario
con la beca número 22655 para la realización de los estudios de Maestría presentados en este
trabajo.
A los integrantes del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico
Nacional, Unidad Irapuato, por permitirme cursar mis estudios de posgrado en una institución de
alta calidad y que proporciona una excelente formación humana.
A la Universidad Nacional Autónoma de México por los recursos económicos para la realización de
los experimentos desarrollados en esta tesis.
Al Dr. Miguel Ángel Gómez Lim, por la oportunidad de unirme a su grupo de trabajo, por su deseo
de escuchar y comprender las ideas de sus alumnos, por su disposición a resolver cualquier duda
con paciencia y serenidad, por su confianza en el desarrollo del proyecto, en fin, por todo el apoyo
brindado a lo largo de mis estudios cursados.
Al Dr. Achim Loske Mehling cuya asesoría, confianza, conocimientos y excelente disposición
permitieron el desarrollo de los experimentos cruciales que se detallan en este trabajo.
A los integrantes del Laboratorio de Ondas de Choque del Centro de Física Aplicada y Tecnología
Avanzada de la Universidad Nacional Autónoma de México, en especial a la QFI. Concepción
Arredondo, al M. en C. Francisco Fernández y a Erick Ramos Espinoza sin cuyo apoyo y deseo
sincero de colaborar esta tesis no hubiera sido posible.
A mi cotutora Dra. Elizabeth de la Luz Ortíz Vazquéz, por su completa disposición a compartir sus
conocimientos, sugerencias, críticas de una manera amable y diáfana durante toda mi formación
profesional. Le estoy infinitamente agradecido por su amistad y confianza demostrada sobre todo
en los momentos más difíciles de mi vida.
A la Dra. Dora Linda Guzmán por dedicarme tiempo para el análisis de mis resultados, para
corregir mis errores, y cuyas propuestas permitieron mejorar sustancialmente este trabajo de tesis.
Todo lo anterior con amabilidad, confianza y apoyo sincero.
A mis compañeros de laboratorio de Laboratorio de Plantas Tropicales y Salud Humana del
Departamento de Ingeniería Genética, que siempre estuvieron dispuestos a colaborar, a opinar,
resolver dudas, y fomentar un buen ambiente de trabajo. Agradezco en especial a Margarita y a
Lina su amistad y apoyo.
Al Biól. Luis Jorge Saucedo por la confianza y disposición plena en el desarrollo de mis
experimentos.
Al Dr. Francisco Luna cuya oportuna asesoría me permitió resolver numerosas dudas en la fase
experimental de mi trabajo.
iii
DEDICATORIA.
Quiero dedicar esta tesis en primer lugar a mi familia, por todo lo que ha hecho por mí.
A Nancy, quien ha llenado mi vida de felicidad sin condiciones.
A mi mejor amigo Héctor, quien me ha ayudado a superarme en múltiples aspectos de mi vida a lo
largo de estos años.
A la familia Cordourier Maruri por su apoyo en los días más complicados.
Al Mtro. José Luis Domínguez quien siempre estuvo dispuesto a compartir su sabiduría y tiempo
conmigo.
A Carmen Silverio, Marianne Luna, Andrea Rojas, William Pereira, Claudia Torres, Mario Mex,
David Chan y Christian Ávila que a pesar del tiempo y la distancia me demuestran lo valioso de la
amistad.
A Hypatia Arano por su valioso apoyo y tierna amistad otorgados a lo largo de mi estancia en la
maestría.
A mis compañeros y amigos de la maestría, en especial a Hernán López, Juliana Medina, Alondra
Ortega, Diana Ascencio, Omar Córdova e Ithaí Ángeles.
iv
ÍNDICE GENERAL.
Página
ÍNDICE DE FIGURAS.
ix
ÍNDICE DE TABLAS
xi
ABSTRACT.
xii
RESUMEN
xiii
ANTECEDENTES.
1
1.1. Impacto biotecnológico de los hongos.
1
2.1. La transformación genética de hongos.
3
2.1.1. Transformación por electroporación.
3
2.1.2. Transformación por biobalística.
6
2.1.3. Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens.
9
2.1.4. Transformación por medio de protoplastos.
13
2.2. Transformación de células por medio de ondas de choque.
15
2.2.1. Conceptos básicos de la física de ondas de choque.
15
2.2.2. Conceptos básicos del equipo de litotripsia extracorporal
17
utilizado en este trabajo.
2.2.3. Evidencias de la transformación de células por cavitación
19
acústica.
2.3. Especies de hongos utilizados en este trabajo.
20
2.3.1. El hongo ascomiceto Aspergillus niger.
2.3.1.1.
Importancia
biotecnológica
20
de
la
actividad
22
proteolítica de Aspergillus niger.
2.3.2. El hongo Colletotrichum gloeosporioides.
24
2.3.3. El hongo Fusarium solani.
25
2.3.4. La levadura Saccharomyces cerevisiae.
26
JUSTIFICACIÓN.
29
v
HIPÓTESIS.
30
OBJETIVO GENERAL.
31
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
31
METODOLOGÍA.
32
1. Cepas utilizadas en este trabajo.
32
2. Plásmidos utilizados en este trabajo y extracción de ADN
32
plasmídico.
3. Establecimiento de las concentraciones inhibitorias de
33
higromicina.
4. Estandarización de la cantidad y calidad del inóculo.
34
5. Descripción del equipo experimental.
35
6. Preparación y procesamiento de las muestras.
37
6.1. Protocolo de transformación genética de las especies
37
Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides.
6.2. Protocolo de transformación genética del hongo
38
Aspergillus niger.
6.3.
Protocolo
de
transformación
de
la
levadura
39
Saccharomyces cerevisiae.
7. Extracción de ADN de hongos filamentosos.
39
8. Extracción de ADN de la levadura Saccharomyces
40
cerevisiae.
9. Escrutinio de probables cepas transformadas.
RESULTADOS.
41
44
1. Transformación genética del hongo Fusarium solani.
44
2. Transformación genética del hongo Colletotrichum
47
gloeosporioides.
3. Transformación genética de la levadura Saccharomyces
49
vi
cerevisiae.
4. Transformación genética del hongo Aspergillus niger.
54
4. 1. Protocolos de selección con higromicina.
54
4. 2. Protocolos de transformación con la construcción
58
-
pepA y gen de selección a fleomicina.
DISCUSIÓN.
63
1. Transformación genética del hongo Fusarium solani.
63
2. Transformación genética del hongo Colletotrichum
64
gloeosporioides.
3. Transformación genética de la levadura Saccharomyces
65
cerevisiae.
4. Transformación genética del hongo Aspergillus niger.
67
CONCLUSIONES.
69
BIBLIOGRAFÍA.
70
APÉNDICE. Medios de cultivo.
78
vii
ÍNDICE DE FIGURAS.
Pág.
Figura 1. Mecanismo postulado de captación de ADN en los equipos de
electroporación por incremento de tensión en la superficie celular.
Figura 2. Mecanismo postulado de la captación de ADN en un campo eléctrico
mediante la desestabilización de la membrana y posterior formación de vesículas.
Figura 3. Resultados obtenidos en la transformación de Trichoderma harzanium por
electroporación
Figura 4. Efecto de la presión de helio en el número de transformantes de
Aspergillus nidulans durante los protocolos de biobalística
4
5
6
9
Figura 5. Espectro típico de cambios de presión generados por ondas de choque.
17
Figura 6. Esquema básico del equipo piezoeléctrico utilizado en este trabajo.
19
Figura 7. Clasificación funcional de los marcos de lectura (ORFs) de Aspergillus
niger de acuerdo a las categorías Funcat.
22
Figura 8. Unidad de ultrasonido y control principal del equipo Piezolith 2300
36
Figura 9. Sistema piezoeléctrico y unidad de disparo del equipo Piezolith 2300.
36
Figura 10. Morfología microscópica de micelio de las cepas silvestre y resistente a
higromicina de Fusarium solani.
Figura 11. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
correspondiente a los protocolos de transformación de Fusarium solani.
45
46
Figura 12. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
correspondiente
a
los
protocolos
de
transformación
de
Colletotrichum
48
gloeosporioides.
Figura 13. Cepas protótrofas a triptófano de Saccharomyces cerevisiae obtenidas
por medio de ondas de choque.
Figura 14. Propagación en medio líquido de cepas protótrofas a triptófano de
Saccharomyces cerevisiae obtenidas por medio de ondas de choque.
Figura 15. Gel de electroforesis de muestras de extracción de ADN y PCR
correspondientes a los protocolos de transformación de Saccharomyces cerevisiae.
Figura 16. Curva de calibración de número de colonias viables versus absorbancia
a 420 nm de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.
Figura 17. Curva de calibración de número de conidios versus absorbancia a 420
nm de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.
51
52
53
54
55
viii
Figura 18. Cepas de Aspergillus niger propagadas en medio selectivo con
higromicina (100 µg/ml).
Figura 19. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
correspondiente a los protocolos de transformación de Aspergillus niger.
Figura 20. Expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en una de las cepas
resistentes a higromicina.
Figura 21. Esquema de la construcción pepA- ensamblada en este trabajo para el
aislamiento de cepas de Aspergillus niger deficientes en proteasas.
Figura 22. Gel de electroforesis que muestra el análisis de restricción de la
construcción pepA- clonada en el vector SK+.
57
57
58
60
60
Figura 23. Cepas generadas durante los protocolos de transformación de
Aspergillus niger por medio de ondas de choque con el gen de resistencia a
61
fleomicina
Figura 24. Cepas deficientes en proteasas generadas durante los protocolos de
transformación de Aspergillus niger por medio de ondas de choque.
62
ix
ÍNDICE DE TABLAS.
Pág.
Tabla 1. Ejemplos seleccionados de compuestos comercialmente importantes
producidos por hongos.
Tabla 2. Especies (Fungi y oomicetos) transformadas en núcleo celular por
biobalística.
Tabla 3. Condiciones óptimas para la transformación de Aspergillus nidulans y
Trichoderma harzanium por medio de biobalística.
Tabla 4. Ejemplos de organismos no vegetales que han sido transformados por
Agrobacterium tumefaciens en condiciones de laboratorio.
2
8
8
12
Tabla 5. Características genómicas del hongo Aspergillus niger cepa CBS 513.88.
21
Tabla 6. Características generales del genoma de Nectria heamatoccoca.
25
Tabla 7. Concentraciones de selección establecidas con higromicina de las
especies utilizadas en este trabajo.
Tabla 8. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del
protocolo de transformación de Fusarium solani por medio de ondas de choque.
Tabla 9. Parámetros relevantes del protocolo de transformación de Fusarium solani
por medio de ondas de choque.
34
44
45
Tabla 10. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del
protocolo de transformación de Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas
47
de choque.
Tabla 11. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de
Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas de choque.
49
Tabla 12. Número de probables transformantes obtenidos tres repeticiones del
protocolo de transformación de Saccharomyces cerevisiae por medio de ondas de
50
choque con 150 pulsos.
Tabla 13. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de
Saccharomyces cerevisiae por medio de ondas de choque.
Tabla 14. Valores obtenidos para las curvas de calibración de absorbancia a 420
nm de los conidios de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015.
51
54
Tabla 15. Número de probables transformantes obtenidos tres repeticiones del
protocolo de transformación de Aspergillus niger por medio de ondas de choque
56
con 100 pulsos.
Tabla 16. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de
Aspergillus niger por medio de ondas de choque.
56
x
Tabla 17. Número de probables transformantes obtenidos con la construcción
pepA- con conidios de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.
Tabla 18. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de
-
Aspergillus niger por medio de ondas de choque con el gen pepA .
60
61
xi
ABSTRACT.
The kingdom Fungi includes a diverse group of organisms, all of them are characterized by
morphological and metabolic diversity. Fungi are eukaryotic organisms, heterotrophic, nonphotosynthetic, thereby their nutrition is by absorption from their surroundings. All of these features
made fungi valuable tool as model systems. The development of molecular biology and massive
genomes sequencing allow a better comprehension and description of metabolism and evolution of
Fungi. However, to exploit all the potential of genetic manipulation of these organisms is difficult
and there are several problems to insert genes of importance in science and industry. Most of the
current methodologies to achieve genetic manipulation (protoplast transformation, electroporation,
biolistic, Agrobacterium-mediated transformation) have deficiencies of success and reproducibility.
In this work a new methodology for genetic transformation with high efficiency in Fungi was
developed and the stability of transformants was demonstrated. The application of shockwaves
produced by a piezoelectric generator, as used in urinary stone fragmentationi (extracorporeal
shockwave lithotripsy), allowed the insertion of reporter genes in diverse groups of Fungi as
Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger.
The genetic transformation was validated by polymerase chain reaction (PCR). In Aspergillus niger
the genetic transformation was evaluated by the expression of green fluorescent protein (GFP). The
results show that the efficiency with this new method was higher than efficiency of the usage of
protoplast. In Colletotrichum gloeosporioides the efficiency was 7.3% (compared with 0.0018%), in
Fusarium solani, the efficiency was 0.6% (compared with 0.0001%) and finally, in Aspergillus niger
the calculated efficiency was 0.53% (compared with 0.005%). In the case of the yeast
Saccharomyces cerevisiae the efficiency was higher than the chemical procedures (0.0086%
compared with 0.00084%). In another group of experiments, a genetic construction of argillopepsin
A disrupted by the gene of resistance to fleomicin was assembly. The transformation of Aspergillus
niger ATCC 1015 with this construction permits the isolation of protease deficient strains. The
efficiency in this last protocol was 0.74%.
xii
RESUMEN.
El reino fungi está integrado por grupos de microorganismos que se caracterizan por su gran
diversidad metabólica y morfológica, así como variabilidad intrínseca. Son organismos eucarióticos,
heterótrofos, carecen de sistema fotosintético, son unicelulares o pluricelulares y adquieren los
nutrientes por absorción. Todas estas características han hecho a los hongos valiosas
herramientas como modelos de estudio. Con el advenimiento de la biología molecular y la
secuenciación de genomas existe la posibilidad de una mejor comprensión del metabolismo y
evolución de los hongos. Sin embargo, ante la posibilidad de manipular genéticamente estos
microorganismos se presentan numerosas problemáticas para la inserción de los genes de interés.
La mayoría de los métodos actuales de transformación (protoplastos, electroporación, biobalística,
transformación mediada por Agrobacterium) presentan desventajas de reproducibilidad y eficiencia.
En este trabajo se desarrolló de un nuevo método de transformación genética para el reino fungi y
se demostró la eficacia del mismo. La aplicación de ondas de choque producidas por un generador
piezoeléctrico del tipo utilizado en la desintegración no invasiva de cálculos renales (litotricia
extracorpórea) permitió la inserción de genes reporteros en diversos grupos de hongos como
Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae. La
presencia de los genes reporteros fue validada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En Aspergillus niger la transformación también fue evaluada por la expresión de la proteína verde
fluorescente. Los resultados demuestran que la eficiencia fue mayor a la reportada con el uso de
protoplastos. En Colletotrichum gloeosporioides la eficiencia de transformación fue de
7.3 %
(contra 0.0018%), en Fusarium solani fue de 0.6% (contra 0.0001%) y con Aspergillus niger se
estableció una eficiencia de 0.53% (contra 0.005%). En el caso de la levadura Saccharomyces
cerevisiae la eficiencia también fue mayor a la reportada con métodos químicos: 0.0086% (contra
0.00084%). En otra serie de experimentos, se logró ensamblar una construcción del gen que
codifica para la la argilopepsina A interrumpida por la secuencia del antibiótico de resistencia a
fleomicina. La transformación con esta secuencia ensamblada permitió el aislamiento de cepas
deficientes en proteasas de Aspergillus niger. La eficiencia de este protocolo fue de 0.74%.
xiii
ANTECEDENTES.
1.1. Impacto biotecnológico de los hongos.
Desde hace varias décadas, los hongos (de ahora en adelante al utilizar la palabra hongos, nos
referimos a los miembros del reino Fungi) han sido objeto de estudios genéticos y biotecnológicos
para la comprensión de la regulación genética, actividad metabólica, y para la producción de
enzimas y otros compuestos recombinantes.
Debido a que los hongos poseen una extraordinaria capacidad de secreción, existe un
creciente interés en la optimización de métodos convencionales y en el desarrollo de nuevos
métodos para introducir genes de interés cuyos productos puedan ser secretados al medio
externo y fácilmente recuperados.
Los métodos actuales de transformación genética desarrollados son poco eficientes, poco
reproducibles y complejos; pero a pesar de estas limitaciones ha sido posible la producción de
diversas proteínas recombinantes por la manipulación genética de hongos.
Son muchas las especies utilizadas a nivel comercial para la producción de enzimas
endógenas o heterólogas, aunque las más utilizadas en el ámbito de la producción de enzimas
recombinantes son Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y Trichoderma reesei.
Para dar una idea de la importancia de la industria enzimática, basta decir que el mercado
mundial de enzimas alcanzó los 4 mil millones de dólares en 2004 y su tasa de crecimiento anual
se ha estimado en 6%. Por tanto, se calcula que para el 2011, alcance la cifra de los 6 mil
millones de dólares a nivel mundial (Popper, 2009).
Asimismo, una gran cantidad de antibióticos se han obtenido de hongos a partir del trabajo
pionero de Alexander Fleming con la penicilina. Este metabolito secundario producido
comercialmente por el hongo Penicillium chrysogenum ha permitido salvar millones de vidas y ha
generado un campo fructífero en el desarrollo de compuestos activos para la medicina.
1
Hay muchos compuestos comerciales producidos por hongos (Tabla 1), sin embargo, el
compuesto producido por estos organismos con mayor demanda a nivel mundial es el ácido
cítrico. Se producen anualmente 1.75 millones de toneladas de ácido cítrico con un valor de 1,600
millones de dólares. El hongo utilizado para este proceso es Aspergillus niger debido a su
capacidad de secretar grandes cantidades de este metabolito (Soccol et al. 2006).
Tabla 1. Algunos compuestos comercialmente importantes producidos por hongos (Meyer, 2008).
Compuesto comercial
Organismo
Área de aplicación principal
Ácido cítrico
Aspergillus niger
Alimentos y bebidas
Ácido itacónico
Aspergillus terreus
Industria de polímeros
Alfa-amilasa
Aspergillus niger, Aspergillus
Procesamiento de almidón e
oryzae
industria de los alimentos
Quimosina
Aspergillus niger
Industria alimentaria
Celulasa
Trichoderma viride,
Industrias textil y papelera
Trichoderma reesei.
Glucoamilasa
Aspergillus phoenices,
Procesamiento de almidón
Rhizopus delemar
Glucosa oxidasa
Aspergillus niger, Aspergillus
Industria textil
oryzae
Lacasa
Trametes vesicolor
Industrias textil y papelera
Cefalosporina
Acremonium chrysogenum
Industria farmacéutica
Ciclosporina
Tolycladium nivenum
Industria farmacéutica
Griseofulvina
Penicillium griseofulvum
Industria farmacéutica
Lovastatina
Monascus rubber,
Industria farmacéutica
Aspergillus terreus
Vacunas
(Hepatitis
B
y
Saccharomyces cerevisiae
papiloma humano)
Taxol
Industria biotecnológica y de
salud humana
Taxomyces andrenae
Industria farmacéutica
Una desventaja en la producción de los compuestos referidos en la tabla 1 es la
variabilidad que presentan los hongos en su capacidad metabólica, de tal manera que la
2
transformación genética representa una alternativa para el mejoramiento de los rendimientos en la
producción de metabolitos de interés.
2.1. La transformación genética de hongos.
Se han utilizado numerosas técnicas para la introducción de material genético en muchas
especies de hongos. A continuación se describirán las herramientas más utilizadas.
2.1.1. Transformación por electroporación.
Esta técnica se basa en la permeabilización relativa de las biomembranas inducida por
campos eléctricos de alta intensidad y corta duración. Los primeros ensayos de
electroporación se realizaron en células de ratón deficientes en timidina cinasa (Neumann
et al. 1982). Posteriormente se realizaron ensayos en la cepa de E. coli K12 con la
inserción del plásmido pUC18. La optimización de este protocolo permitió la obtención de
5x10
9
transformantes por µg de ADN. Esta elevada eficiencia ha convertido la
electroporación en el método de rutina para la transformación de cepas de E. coli en la
gran mayoría de laboratorios del mundo. (Calvin y Hanawalt. 1988).
En forma general el funcionamiento de un equipo de electroporación se basa en la
descarga de un capacitor que produce el campo eléctrico requerido. Este campo eléctrico
de duración de apenas unos 10 µs genera poros instantáneos en la célula y permite el
paso del ADN. Un capacitor es, en breves palabras, un dispositivo de dos placas paralelas
que permite el almacenamiento de corriente eléctrica. El capacitor utilizado en las
diferentes marcas comerciales tiene una capacidad de almacenamiento entre 2 y 1000 µF
y utiliza voltajes entre 200 y 2000 voltios. La carga eléctrica almacenada es liberada de
manera casi inmediata a través de un interruptor electrónico.
El mecanismo de transferencia no está plenamente comprendido. Una de las
hipótesis en torno al proceso de captación en células de mamífero se muestra en la figura
1. La acción del campo eléctrico sobre la superficie celular genera una conductividad y una
tensión eléctrica que terminan por romper de manera reversible la membrana (Imai e Isaka.
3
2002). Al mismo tiempo las cargas electrostáticas ocasionan que las hebras de ADN se
adhieran a la superficie, de tal modo que al ocurrir los rompimientos de dicha superficie, el
ADN puede pasar al interior de la célula.
Por otra parte, la figura 2 muestra un mecanismo donde la corriente eléctrica
inducida por el equipo de electroporación permite la adhesión de partículas de ADN,
desestabiliza la estructura de las membranas y forma vesículas que encierran el ADN y lo
conducen al interior. Se ha postulado también que existe algún mecanismo que transfiere
el ADN al interior de la célula por medio de poros.
A pesar del éxito de la electroporación en bacterias y el uso relativamente común
en células de mamíferos, este método no es práctico en plantas, levaduras y hongos
filamentosos. En el caso de las levaduras el método de electroporación no puede competir
con los altos rendimientos logrados por métodos químicos, además de que requiere la
estandarización de las variables de voltaje y capacitancia para los diferentes tipos de
cepas.
Incremento de la tensión generada por el campo eléctrico.
Captación del ADN por rompimientos reversibles de la membrana.
Figura 1. Mecanismo postulado de captación de ADN por incremento de tensión en la
superficie celular (Adaptado de Imai e Isaka. 2002).
4
Figura 2. Mecanismo postulado de la captación de ADN en un campo eléctrico mediante la
desestabilización de la membrana y posterior formación de vesículas (endocitosis). (Imai e
Isaka. 2002).
Este método es poco eficiente en hongos. En los hongos filamentosos la pared
celular está formada por quitinas, glucanos y glicoproteínas enlazadas de manera
compleja, las interacciones con el campo eléctrico no son lo suficientemente intensas como
para permitir el paso del ADN al interior de las células (Bowman y Free. 2006). Estudios
pioneros en el campo de electroporación en hongos filamentosos mostraron que es
necesario un tratamiento previo de la pared celular para lograr la transformación con genes
reporteros (Goldman et al. 1990). Además se requiere la adición de enzimas hidrolíticas
que degraden compuestos de la pared celular. Asimismo, es necesario añadir
polietilenglicol a la muestra, con el consecuente riesgo de formar complejos multicelulares.
En la figura 3 se muestran los resultados de un ensayo de electroporación con la
especie Trichoderma harzanium utilizando células sensibles a la ósmosis (OSC, por sus
siglas en inglés), este trabajo fue realizado por Goldman y colaboradores en 1990. En la
5
figura puede observarse que el proceso tiene un punto óptimo en el parámetro de 2.8
kV/cm para el campo eléctrico generando 52 transformantes por microgramo de ADN. La
9
mayor eficiencia en este protocolo utilizando 1.8x10 células sensibles a la ósmosis fue de
-6
apenas 7.5x10 %.
Campo eléctrico (kV/cm).
Figura 3. Resultados obtenidos en la transformación de Trichoderma harzanium por
electroporación (Datos de Goldman et al. 1990).
2.1.2. Transformación por biobalística.
Este método fue diseñado para realizar la transformación de especies vegetales en las
cuales no existía la posibilidad de transformación por Agrobacterium.
La inserción de
partículas por bombardeo ofrece un método rápido de insertar ADN tanto para expresión
transitoria como para lograr una transformación estable. El principal beneficio de este
método es que puede utilizarse tejido intacto, sin someterlo a procesos de degradación de
la pared celular y sus consecuencias.
La mayoría de los protocolos de biobalística utilizan el mismo principio para la
aceleración de partículas y su inserción en el tejido blanco, es decir una fuerza generada
6
por explosión o expansión de un gas impulsa un transportador, que contiene las partículas
a liberar a través de un canal. De tal manera que el transportador al finalizar su
deslizamiento queda sujeto al equipo que lo impulsa mientras las partículas son dirigidas
hacia el tejido. Esta fuerza puede ser generada por una pistola calibre 22 adaptada, una
descarga de alto voltaje, expansión acelerada de aire comprimido o helio. La muestra suele
colocarse entre 6 a 10 cm del punto de liberación de las partículas.
En la actualidad los equipos de biobalística comerciales utilizan helio para generar
la fuerza necesaria para impulsar las partículas (Sunagawa et al. 2007. Herzog et al. 1996.
Lorito et al. 1993. Finer et al. 1992). Entre los parámetros a estandarizar en estos modelos
se encuentran la cantidad de inóculo, la presión de helio, la distancia entre la liberación de
la partículas y el objetivo, el tipo de transportadores a utilizar y el diámetro de los
microproyectiles.
No es fácil establecer un mecanismo de transformación eficaz para todos los
hongos, por ello el método de biobalística constituye una opción para especies
recalcitrantes o para patógenos obligados. En el caso de los hongos filamentosos los
conidios o micelio pueden ser colocados en medio de agar semisólido. Debido a su baja
eficiencia este método se utiliza en casos donde los protocolos con protoplastos o
Agrobacterium tumefaciens no ofrecen resultados.
Existen
varias
especies
con
protocolos
establecidos,
entre
ascomicetos,
basidiomicetos y oomicetos, como se muestra en la tabla 2. En la tabla 3 se detallan las
variables utilizadas en dos de los protocolos reportados. Finalmente, en la figura 4 se
muestra una gráfica del número de transformantes obtenidos (por µg ADN y 1x108
conidios) usando diferentes presiones de helio en psi (libras por pulgada cuadrada). Para
presiones mayores a 1200 psi la eficiencia del método comienza a disminuir de manera
drástica, seguramente por el daño causado al tejido.
La mayor eficiencia calculada en este protocolo, es por tanto, 5x10
-6
% con
respecto al número de conidios utilizados.
7
Tabla 2. Especies (Fungi y oomicetos) transformadas en núcleo celular por biobalística.
(Adaptada de Herzog, RW. 1996).
Especie
Tejido utilizado
Modo de selección
Referencia
Aspergillus nidulans
Conidios
Prototrofía
Herzog et al. 1996.
Trichoderma
Conidios
Resistencia a
Lorito et al. 1993.
harzanium
Gliocladium virens
higromicina
Conidios
Resistencia a
Lorito et al. 1993.
higromicina
Phytophtora spp.
Micelio
Higromicina y
Bailey et al. 1993.
actividad con GUS
Uromyces
Esporas
GUS
Li et al. 1993.
Hifas
Resistencia a
Smith et al. 1992.
appendiculatus
Uncinula necátor
benomil
Neurospora crassa
Conidios
Prototrofía
Armaleo
et
al.
1990.
Suillus grivelei
Micelio
Higromicina
Sunagawa
et
al.
2007
Tabla 3. Condiciones óptimas para la transformación de Aspergillus nidulans y Trichoderma
harzanium por medio de biobalística. (Basada en Herzog, RW. 1996).
Variables
Aspergillus nidulans
8
Trichoderma harzanium
1x10
7
Concentración de conidios
1x10
Presión de helio
1200 psi
1200 psi
Distancia al objetivo
6 cm
6 cm
Diámetro medio de los
0.4-1.1 µm
1.1 µm
Tungsteno
Tungsteno
Herzog et al. 1996.
Lorito et al. 1993.
microproyectiles
Material de los
microproyectiles
Referencia
8
Figura 4. Efecto de la presión de helio en el número de transformantes de Aspergillus
nidulans durante los protocolos de biobalística (Adaptada de Herzog, RW. 1996).
2.1.3. Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens.
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena, gram-negativa, que puede
transferir e integrar parte de su ADN plasmídico en el genoma del organismo susceptible a
infección. Las secuencias de inserción (T-ADN) se encuentran localizadas en un plásmido
“inductor de tumores” (Ti, por su abreviatura en inglés). De manera natural, la región TADN que es transferida a las células de la planta contiene genes que codifican hormonas
vegetales que son las causantes de la formación de tumores.
También contiene secuencias para la producción de moléculas llamadas octopinas
o nopalinas, que sólo pueden ser utilizadas por las bacterias. El plásmido Ti contiene otro
segmento llamado región de virulencia, el cual está conformado por un gran número de
genes denominados vir (Zhu et al. 2000). Las proteínas codificadas por la región de
virulencia están involucradas en la formación, transporte y la integración del T-ADN. La
9
región T-ADN del plásmido está delimitada por bordes repetidos de 24 pb, lo cuales son la
señal de activación para el sistema de transferencia a las células de la planta (Lacroix et al.
2008). La capacidad que tiene esta bacteria para insertar genes en los genomas vegetales
abrió la posibilidad de obtener las primeras plantas transgénicas. La región T-ADN fue
modificada para que en lugar de inducir la síntesis de compuestos benéficos para la
bacteria se transfirieran secuencias con genes reporteros.
Estudios posteriores mostraron que bajo condiciones de laboratorio, la capacidad
de dicha bacteria para transferir parte de su ADN no está limitada al reino vegetal. Los
organismos susceptibles a infección por Agrobacterium tumefaciens incluyen levaduras,
hongos filamentosos y células humanas.
El primer reporte de la transformación mediada por Agrobacterium en organismos
-
no vegetales se refirió a la levadura Saccharomyces cerevisiae donde células ura fueron
complementadas con el gen ura3 por la transferencia e integración de secuencias T-DNA.
Este estudio pionero ofreció aspectos relevantes de la transformación mediada por
Agrobacterium en eucariontes. En primera instancia, resultó necesaria la adición de
compuestos inductores (derivados fenólicos, en específico acetosiringona) de los genes de
virulencia para que se llevara a cabo el proceso de infección.
Además, se observó un proceso de protección por parte de la maquinaria de
Agrobacterium tumefaciens sobre el T-ADN a transferir, cosa que no ocurre durante los
procesos físicos de transformación. Mutaciones específicas en los genes de virulencia
mostraron las diversas funciones que estas secuencias desempeñan en el proceso de
quimiotaxis, transferencia e integración del ADN exógeno (Bundock et al. 1995).
Posteriormente estudios en Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Neurospora crassa,
Fusarium venetatum, entre otros, ofrecieron una notable alternativa a los métodos
disponibles de transformación de hongos filamentosos.
Como en el caso anterior, la inducción de los genes de virulencia se logró mediante
la adición de acetosiringona y se demostró la posibilidad de utilizar tanto conidios como
10
micelio para el proceso de transformación (de Groot et al. 1998). También se observó que
de acuerdo al grado de homología de las secuencias y los mecanismos de integración
propios de cada organismo infectado la inserción puede llevarse a cabo por procesos de
recombinación ilegítima o recombinación homóloga (Michielse et al. 2005).
En este sentido el impacto de la transformación mediada por Agrobacterium quizá
ha sido mayor en hongos filamentosos. Especies cuya transformación no había sido
lograda o que presentaban tasas muy bajas de inserción de genes, ahora podían ser
modificadas con protocolos reproducibles. La tabla 4 proporciona una visión general de los
organismos no vegetales que han sido transformados por Agrobacterium tumefaciens,
puede observarse el impacto de esta técnica en organismos del reino fungi y hongos
filamentosos en específico.
De igual modo, estandarizando numerosas variables podían lograrse una elevada
tasa de eficiencia en el proceso de transformación de hongos filamentosos. Puesto que en
algunas especies la inserción de genes era de una sola copia por genoma y se observaban
procesos de recombinación homóloga, la transformación con este método abría la
posibilidad de interrumpir la función génica de manera específica.
Sin embargo, existen desventajas en este método. Se ha encontrado una notable
variabilidad de virulencia en las cepas, especies de gran importancia (como Aspergillus
niger) no son susceptibles de altas tasas de transformación con este método, otras
especies se han mostrado recalcitrantes (por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum) y se
requiere un control óptimo de numerosas variables para lograr un protocolo exitoso.
(Michielse et al. 2005).
Aunado a esto estudios realizados en plantas han demostrado que Agrobacterium
tumefaciens no sólo transfiere regiones del T-ADN del plásmido de virulencia, sino que es
capaz de integrar secuencias de hasta 18 kb de su ADN cromosómico en el genoma de las
plantas infectadas, lo cual no es deseable (Ülker et al. 2008).
11
Tabla 4. Ejemplos de organismos no vegetales que han sido transformados por
Agrobacterium tumefaciens en condiciones de laboratorio (Adaptado de Lacroix et al.
2006).
Reino
Phylum
Familia
Especie
Leptosphaeria maculans
Pleosporales
Venturia inaequalis
Helminthosporium turcicum
Incerta sedis
Mycosphaerella graminicola
Aspergillus awamori
Aspergillus fumigatus
Eurotiales
Aspergillus niger
Monascus purpureus
Blastomyces dermatitidis
Onygenales
Coccidioides immitis
Histoplasma capsulatum
Helotiales
Botrytis cinerea
Pezizales
Tuber borchii
Ascomycota
Fungi
Fusarium oxysporum
Fusarium venetatum
Hypocreales
Trichoderma atroviridae
Trichoderma reesei
Verticilium fungicola
Sordariales
Neurospora crassa
Colletotrichum gloeosporioide.
Phycorales
Verticillium dahliae
Incerta sedis
Magnaporthe grisea
Kluyveromyces lactis
Saccharomycetales
Saccharomyces cerevisiae
Animalia
Basydiomicota
Agaricales
Agaricus bisporus
Zygomycota
Mucorales
Rhyzopus oryzae
Chordata
Hominidae
Homo sapiens
12
2.1.4. Transformación genética utilizando protoplastos.
Los protoplastos son células sin pared celular y fueron inicialmente utilizados para estudios
bioquímicos en levaduras. Sin embargo, en la actualidad tienen importancia en los estudios
sobre la estructura y síntesis de la pared celular así como en la secreción de proteínas en
numerosos organismos incluyendo plantas, levaduras y hongos filamentosos.
Además, la ingeniería genética de hongos tuvo un considerable avance con la
estandarización de numerosos protocolos de transformación utilizando protoplastos. El
inicio del análisis para la obtención de protoplastos en levaduras y hongos filamentosos
comenzó durante la década de 1970. Durante este período se determinó que el aislamiento
óptimo de protoplastos depende de numerosos factores como el uso de estabilizadores
osmóticos, el pH de la suspensión y la edad del micelio. Otra conclusión de estos estudios
es que el problema crítico consistía en encontrar la mezcla de enzimas correcta para
degradar la compleja estructura de polímeros de quitina y glucanos de la pared celular.
En un inicio, el uso de enzimas proteolíticas provenientes del caracol Helix pomatia
fue bastante útil para la formación de protoplastos. Sin embargo, la técnica de extracción
de estas enzimas resultaba tediosa y deficiente. Se realizaron numerosos ensayos para la
obtención de enzimas proteolíticas con
Cytophaga sp., Streptomyces venezulae y
Trichoderma harzianum (Peberdy 1979) y se comprobó que Trichoderma harzianum
resultaba una excelente fuente de enzimas líticas para la obtención de protoplastos sobre
todo si el hongo se incubaba en presencia de quitina.
Finalmente se obtuvo una preparación de enzimas de Trichoderma harzanium,
llamada comercialmente Novozyme 234, que constituyó un gran avance en la obtención de
protoplastos de numerosas especies. Esta mezcla fue capaz de producir millones de
protoplastos de Aspergillus nidulans en menos de una hora de incubación y demostró sus
capacidad de degradación de la pared celular en un amplio rango de especies.
13
La transformación de protoplastos de levadura y protoplastos de Neurospora
crassa se publicó en 1978 (Ruiz-Díez, B. 2002). La utilización de marcadores de selección
en hongos filamentosos empezó con protoplastos de Aspergillus nidulans obtenidos con
Novozyme 234. La utilización del gen de resistencia a higromicina obtenido de E. coli
permitió la transformación de un amplio número de cepas silvestres de hongos. A pesar de
los inconvenientes que se detallan a continuación, hasta hoy, el uso de protoplastos
constituye una rutina en la manipulación genética de hongos filamentosos y es el método
más utilizado para su transformación.
Desde el inicio de la manipulación de protoplastos varios grupos de investigación
observaron la formación de agregados celulares multinucleados. Esto implica la creación
de organismos modificados con una ploidía indeseada. Posteriormente, la adición de
polietilenglicol durante los protocolos de transformación indujo la fusión de los protoplastos
(Bradshaw, RE. 2006). Durante mucho tiempo se señaló este fenómeno como un artefacto
de los protocolos de manipulación.
Otros experimentos de coloración micelial y marcadores nutricionales fueron
utilizados para demostrar sin lugar a dudas que había una fusión de protoplastos y un
intercambio de información genética entre especies vegetativamente incompatibles durante
los protocolos de transformación. Ejemplos de estos experimentos son los que se llevaron
a cabo mezclando protoplastos de Aspergillus nidulans y Aspergillus rugulosos, en los
cuales las cepas obtenidas mostraban fenotipos intermedios entre ambas especies.
También se realizaron experimentos con Penicillium chrysogenum y Penicillium cyaneofulvum (Bradshaw, RE. 2006).
Finalmente, se han llevado a cabo experimentos de fusión de protoplastos con
especies relativamente distantes como Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae
para observar el intercambio de material genético durante la manipulación de protoplastos
(Kumari and Panda, 1994).
14
2.2. Transformación de células por medio de ondas de choque.
En este apartado se darán a conocer algunas generalidades sobre la física de las ondas de
choque describiendo los conceptos de onda mecánica, presión, cavitación, frecuencia, etc.
También se describirán las ideas básicas de la aplicación de ondas de choque en el equipo
utilizado (litotriptor extracorporal) durante la fase experimental de este trabajo.
Finalmente, se discutirán algunas ideas actuales sobre el proceso hipotético por el
cual el ADN del medio circundante es captado por células sometidas a ondas de choque.
2.2.1. Conceptos básicos de la física de las ondas de choque.
Las ondas físicas se encuentran en cualquier lugar a nuestro alrededor. Una onda física se
puede describir como la propagación de una perturbación a través de un espacio definido.
Durante el proceso hay una liberación de energía. Las ondas físicas provienen de una
fuente y se desplazan de un punto a otro propagando la perturbación referida. De modo
general, las ondas físicas se dividen en mecánicas y electromagnéticas. Las ondas de
choque son ondas mecánicas, esto es, requieren un medio para propagarse. Otros
ejemplos de ondas mecánicas son el sonido ambiental, las ondas que se propagan a
través de sismos, las ondas en las cuerdas de los instrumentos musicales y el ultrasonido.
Las ondas electromagnéticas en cambio no requieren de un medio para propagarse; la luz,
los rayos X, las microondas pueden propagarse plenamente en el vacío.
Durante su desplazamiento las ondas mecánicas ocasionan un movimiento de
oscilación en el medio donde se propagan. Si las vibraciones que ocurren en la fuente de la
onda mecánica provocan cierta periodicidad en las oscilaciones del medio, la onda
mecánica puede ser caracterizada por su frecuencia. La frecuencia, es entonces, el
número de ciclos de estas oscilaciones que ocurren en un segundo. La unidad de
frecuencia en el sistema internacional de unidades es el Hertz. El concepto básico anterior
permite clasificar las ondas mecánicas en infrasonido, sonido audible, ultrasonido e
15
hipersonido de acuerdo a la capacidad del oído humano. El sonido audible va de los 20 Hz
hasta los 20 kHz. El ultrasonido se encuentra arriba de los 20kHz. Las ondas de choque
utilizadas en este trabajo poseen un espectro de frecuencias que va desde menos de los
20 kHz hasta varios megahertz.
Otro aspecto importante de la transmisión de ondas mecánicas es la impedancia
acústica del medio en el cual se propagan. Esta es una medida de la dificultad con que la
onda se desplaza en un medio específico. La dificultad está referida por definición a la
velocidad del sonido y la densidad del material. Por ejemplo, el sonido se propaga más
rápidamente en el agua que en el aire y el agua es más densa que el aire. Por tanto, la
impedancia acústica es mayor en el agua que en el aire.
Para generar una onda de choque se requiere una liberación súbita de energía en
un espacio limitado. Esta energía puede ser de tipo mecánico, eléctrico, químico o nuclear.
La liberación inmediata de energía ocasiona una discontinuidad muy marcada y cambios
drásticos en la presión, densidad, temperatura, entropía y velocidad de las partículas
situadas en la vecindad de la onda de choque (Loske, 2007).
Entre las características de las ondas de choque estudiadas en este trabajo se
+
encuentra la amplitud del pico de presión positivo (p ) y la amplitud del pulso de presión
-
“negativo” o de rarefacción (p ). En la figura 5 puede observarse el perfil de presión típico
de una onda de choque en agua.
16
Figura 5. Variación de presión típica generada en el equipo utilizado en este trabajo (Loske
et al. 2002).
2.2.2. Conceptos básicos del equipo de litotricia extracórporea utilizado en este trabajo.
El estudio de las ondas de choque para la desintegración de cálculos renales se originó a
mediados del siglo XX. Entre las ventajas del uso de ondas de choque para la
desintegración de cálculos renales (litotricia extracórporea) destacan la baja morbilidad y
su carácter no invasivo. Esta técnica logra erradicar los cálculos renales, sin que haya
recurrencia, en el 80% de los pacientes tratados. Se han desarrollado tres tipos de
generadores de ondas de choque (litotriptores) de uso médico. En estos tres sistemas la
energía eléctrica es almacenada en una serie de capacitores. La liberación de esta energía
y la consecuente formación de ondas de choque se logra a través transductores de tipo
electrohidraúlico, electromagnético y piezoeléctrico.
17
En la mayoría de los litotriptores de uso médico las ondas de choque son
generadas en agua y transmitidas al paciente a través de una membrana flexible. Esto se
debe a que la impedancia acústica del agua y de los tejidos son semejantes, evitando
reflexiones y la liberación nociva e innecesaria de energía en esta zona. El establecimiento
de la dirección de las ondas de choque y la ubicación de los cálculos se logra por medio de
equipos de ultrasonido ó rayos X. Un esquema de un litotriptor como el utilizado en este
trabajo puede observarse en la figura 6. El generador de ondas de choque piezoeléctrico
se encuentra en la parte inferior del litotriptor y está formado por 3000 pequeños cristales
piezoeléctricos montados sobre el sector de un cascarón esférico de aluminio. Cada
elemento piezoeléctrico es capaz de convertir la energía eléctrica en mecánica y viceversa.
Ejemplos de materiales piezoeléctricos son la cerámica y ciertos compuestos como el
titanato de bario.
La energía eléctrica de los capacitores de este equipo (con un voltaje de 5 a 10 kV)
se descarga a través de los cristales piezoeléctricos provocando una expansión en cada
uno de ellos. La perturbación originada por cada cristal se transmite al agua y se
superpone con la de los demás cristales, formando una onda de choque en la vecindad del
centro del arreglo (ver figura 6). La geometría del sistema de cristales es semiesférica de
tal manera que la energía converge en el centro.
Los equipos de litotricia pueden generar picos como los de la figura 5 con valores
máximos de presión positiva de 30 a 150 MPa y duración de 0.5 a 3 µs seguido de un
descenso brusco hasta valores negativos de 20 MPa de duración de 2 a 20 µs. Para darse
una idea de estos valores las zonas más profundas del océano (10 km debajo del nivel del
mar) alcanzan una presión de unos 100 MPa. El cambio brusco de presión genera
interesantes fenómenos en las superficies de los cálculos renales. Entre los mecanismos
de desintegración de los cálculos renales se encuentran el desprendimiento ocasionado
por fracturas, la compresión y la cavitación acústica (Loske et al. 2002. Loske, AM. 2007).
18
Figura 6. Esquema básico de un generador de ondas de choque piezoeléctrico como el
utilizado en este trabajo. (Adaptado de Loske et al. 2002).
2.2.3. Evidencias de la transformación de células por cavitación acústica.
Los líquidos generalmente contienen gases disueltos y burbujas con diámetros
menores a 0.1 mm. Durante una primera etapa del paso de la onda de choque, estas
burbujas se ven sometidas a compresión por el pico de presión positivo de la onda de
choque. La caída súbita de presión (figura 5) en la etapa subsiguiente ocasiona que el gas
de las burbujas expanda su volumen cientos de veces. Este crecimiento dura alrededor de
unos 50 µs y las burbujas permanecen estables durante 200 a 450 µs, para finalmente
sufrir un colapso violento. Producto de este colapso, es la formación de ondas de choque
secundarias y pequeños chorros de líquido (microjets) con velocidades de hasta 400 m/s
(Ohl, CD. 2002. Klaseboer et al. 2007).
19
El fenómeno anterior se conoce como cavitación acústica. Se ha demostrado que
estas la cavitación acústica puede ocasionar la captura de una variedad de moléculas en
diversos tipos celulares. En la actualidad, este fenómeno ha estimulado el interés en la
posibilidad de introducir de manera no lesiva ADN, medicamentos y proteínas de interés en
experimentos clínicos (Newman, CMH. Bettinger, T. 2007).
Se cree que la cavitación acústica ocasiona una serie de lesiones en las células
debido a la liberación de estos chorros de velocidades considerables. La distancia de
acción del colapso de las burbujas ha sido estimada de 10 a 100 µm. Hasta ahora los
modelos de captura se han elaborado a partir de experimentos utilizando ultrasonido para
producir los fenómenos de cavitación acústica (Zarnitsyn et al. 2008).
El objetivo de esta tesis fue demostrar la amplia aplicabilidad de este método de
transformación para diferentes hongos filamentosos y levaduras. Por esa razón se describe
a continuación una breve semblanza de cada hongo utilizado en este trabajo y su
importancia.
2.3. Especies de hongos utilizados en este trabajo.
2.3.1. El hongo ascomiceto Aspergillus niger.
Aspergillus niger es el hongo filamentoso más utilizado en la industria debido a sus
notables capacidades metabólicas. Sus usos a nivel comercial van desde la producción de
grandes cantidades de ácido cítrico, ácido glucónico y enzimas como las amilasas, hasta la
producción de proteínas heterólogas como la quimosina y el interferón humano (Andersen
et al. 2008). Además el género Aspergillus tiene una larga participación en la elaboración
de alimentos y en la actualidad se le considera un microorganismo “generalmente
reconocido como seguro” (GRAS por sus siglas en inglés). Esto último constituye una gran
ventaja para la aceptación de los compuestos producidos para alimentación tanto de
animales como de seres humanos.
20
Existe evidencia que las proteínas heterólogas son correctamente glicosiladas en
el género Aspergillus, a diferencia de otros organismos del reino fungi que presentan
diferentes tasas de hiperglicosilación (Maras et al.1999; Deshpande et al. 2008).Con esta
versatilidad en la producción de compuestos de interés y en sus altos rendimientos,
Aspergillus niger tiene el potencial de convertirse en el biorreactor de multitud de
compuestos benéficos en el futuro.
La secuenciación del genoma de Aspergillus niger cepa CBS 513.8 ha
proporcionado valiosa información sobre las redes metabólicas de este microorganismo.
Sin duda alguna, los próximos avances en la ingeniería metabólica incrementarán los
rendimientos en la elaboración de metabolitos de interés en este hongo (Pel et al. 2007).
El genoma de Aspergillus niger se ha estimado en 33.9 megabases que contienen
un total de 14,165 marcos de lectura (ORF, Open Reading Frames, por sus siglas en
inglés). Los datos generales del genoma de Aspergillus niger se resumen en la tabla 5 y en
la figura 7 se muestra la clasificación funcional de los marcos de lectura de acuerdo a la
jerarquía FunCat (Ruepp et al. 2004).
Tabla 5. Características genómicas del hongo Aspergillus niger cepa CBS 513.88. (Datos
tomados de Pel et al. 2007).
Tamaño del genoma ensamblado (Mb)
Genes que codifican proteínas
33.9
14,165
Contenido de GC en el genoma ensamblado (%)
50.4
Tamaño promedio de los genes (pb)
1,572
Densidad génica (genes/kb)
0.42
Promedio de intrones por gen
2.57
Tamaño promedio de los intrones (pb)
97
Tamaño promedio de los exones (pb)
370
21
Figura 7. Clasificación funcional de los marcos de lectura (ORFs) de Aspergillus niger de
acuerdo a las categorías Funcat. (Imagen tomada de Pel et al. 2007).
2.3.1.1. Importancia biotecnológica de la actividad proteolítica de Aspergillus niger.
Desde el comienzo de la aplicación de la biotecnología en hongos se reconoció la
importancia de la actividad proteolítica como un posible obstáculo para la producción de
compuestos de interés. A pesar de que se han logrado avances en el control de la
actividad proteolítica y se han aislado mutantes con deficiencia en la secreción de estas
enzimas, este aspecto de la biotecnología de los hongos todavía sigue siendo un
problema.
Un uso racional de la ingeniería genética en el género Aspergillus para el control
de la actividad proteolítica requiere el bloqueo específico de proteasas que interfieren con
la producción de la proteína de interés. El bloqueo indiscriminado de las proteasas en las
22
cepas de Aspergillus podría disminuir su tasa de crecimiento normal e inclusive podría
resultar letal.
Por otra parte, la actividad de proteasas específicas, como KEX2 (Broekhuijsen et
al., 1993), resultan importantes para la liberación del compuesto de interés sin que se
requiera un tratamiento enzimático posterior. Los primeros estudios determinaron que la
argilopepsina A es la proteasa con mayor actividad en las cepas de Aspergillus niger. Por
los tanto, el uso biotecnológico de esta especie se ha basado en cepas mutantes que no
producen dicha proteasa (Nevalainen et al. 2005; Mattern et al. 1992).
No obstante, el conocimiento emanado de la secuenciación del genoma de
Aspergillus niger podría ofrecer una perspectiva más acorde de la regulación de la
actividad proteolítica. Por ejemplo, se ha determinado que existen alrededor de 100 a 200
secuencias que codifican posibles proteasas en el genoma de Aspergillus niger (Pel et al.
2007) y el trabajo reciente de Punt et al. (2008) ha logrado caracterizar un factor de
transcripción (codificado por el gen prtT) que regula la mayor parte de la actividad
proteolítica en este hongo filamentoso.
Sin embargo, existen numerosas variables a considerar durante el uso
biotecnológico de Aspergillus niger y los problemas relacionados con la actividad
proteolítica. La secreción de proteasas es más baja, por ejemplo, en medios con valores
neutros de pH que en medios ácidos (Lubertozzi and Keasling, 2009). Asimismo se ha
demostrado que altas cantidades de glucosa reprimen la expresión de proteasas. Otros
parámetros como la fuente de nitrógeno y la morfología del pellet en el biorreactor pueden
disminuir también la actividad de estas enzimas (Lubertozzi and Keasling, 2009).
La comprensión y uso racional de la información contenida en el genoma de
Aspergillus niger, el establecimiento de métodos de transformación eficientes, la ingeniería
metabólica y la exploración de variables de la tecnología de fermentaciones permitirán, de
manera combinada, convertir a este hongo filamentoso en una excelente plataforma de
producción de metabolitos de interés.
23
2.3.2. El hongo Colletotrichum gloeosporioides.
Las especies agrupadas bajo el nombre de Colletotrichum (Glomerella en su
estado sexual) infectan una gran variedad de plantas de importancia comercial provocando
una enfermedad conocida como antracnosis. Entre las especies afectadas se encuentran
el mango, papaya, manzana, tomate, pepino, melón y maíz. Para el establecimiento de la
interacción compatible y posterior infección, el hongo desarrolla una célula especializada
conocida como apresorio, que se caracteriza por la presencia de melaninas. Esta célula
genera una gran cantidad de presión sobre la cutícula de la planta que es colonizada.
Después del proceso de penetración, una vesícula infecciosa y la hifa primaria
comienzan a desarrollarse. Este primer estadío de infección se identifica como biotrófico,
esto es, el hongo coloniza la planta sin causar muerte celular. Posteriormente se inicia una
etapa necrotrófica, donde las hifas secundarias se diseminan en el tejido y causan la
muerte celular. El ciclo vital de las especies identificadas como Colletotrichum se conoce
como hemibiotrófica, puesto que las etapas biotrófica y necrotrófica de desarrollo son
establecidas como una secuencia temporal e involucran procesos de diferenciación muy
específicos (Wei et al. 2003, Münch et al. 2008)
El genoma de algunas especies de Colletotrichum está siendo secuenciada en dos
proyectos paralelos, uno involucra la cepa Glomerella graminicola M1.001 y el otro la cepa
Colletotrichum higginsianum IMI 349063. El primer proyecto de secuenciación está a cargo
del Broad Institute de Harvard y el Instituto Tecnológico de Massachusetts, el segundo se
lleva a cabo en Instituto Max Planck. Los dos genomas no han sido ensamblados por
completo y los marcos de lectura (ORFs) no han sido anotados en alguna categoría. El
tamaño estimado del genoma es de 51.6 Mb en el caso de Glommerella graminicola y 50
Mb en la primera estimación elaborada por el Instituto Max Planck.
24
2.3.3. El hongo Fusarium solani.
El hongo ascomiceto Nectria haematococca, comúnmente identificado como
Fusarium solani en su estado asexual, es un miembro de un clado que agrupa alrededor de
50 especies bajo el nombre genérico de “complejo de especies Fusarium solani”. Los
miembros de este grupo monofilético son capaces de colonizar una gran variedad de
ambientes que van desde zonas cultivables hasta desiertos. Como patógenos, los
miembros de este complejo son responsables de enfermedades en alrededor de 100
géneros de plantas. También representan el grupo más importante de patógenos
relacionado con infecciones oportunistas y queratitis en humanos.
La habilidad de estos hongos filamentosos para adaptarse a gran variedad de
ecosistemas e infectar especies de plantas y animales nos ofrece una idea de su
plasticidad genética y su amplia capacidad metabólica. Los miembros de este complejo de
especies pueden degradar, por ejemplo, hidrocarburos, compuestos organofluorados,
ligninas, cianuros de metales y pesticidas (Coleman et al, 2009).En la tabla 6 se detallan
las características del genoma secuenciado de Nectria heamatoccoca.
Tabla 6. Características generales del genoma de Nectria heamatoccoca (Basada en
Coleman et al. 2009).
Tamaño del genoma (Mb)
Número de genes
Densidad génica (genes/Mb)
54.5
15,707
307
Tamaño promedio de genes (bases)
1,674
Tamaño promedio del transcrito (bases)
1,503
Tamaño promedio de proteínas (aminoácidos)
480
Número de exones por gen
3.1
Tamaño promedio de los exones (bases)
488
Tamaño promedio de los intrones (bases)
84
25
2.3.4. La levadura Saccharomyces cerevisiae.
El genoma de la levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae) fue el primer
genoma eucariótico secuenciado y por tanto, el inicio del estudio sistemático de la
organización, regulación y mantenimiento de la estructura génica en organismos con
cromosomas compactados en núcleos definidos. En la actualidad existen numerosas
herramientas que permiten el conocimiento de los genes, los marcos de lectura (ORFs) y
los productos que estos genes codifican. Entre las bases de datos disponibles se
encuentran
Saccharomyces
Genome
Database
(http://www.yeastgenome.org),
y
Comprehensive Yeast Genome Database (http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast). Asimismo,
otras bases de datos proporcionan la información generada a partir de microarreglos
(http://transcriptome.ens.fr /ymgv/index.php) y la información de redes de interacción de
proteínas (General Repository of Interaction Datasets [http://www.thebiogrid.org/]).
Otros centros conservan las cepas utilizadas en laboratorios de todo el mundo y los
plásmidos creados para la modificación genética de Saccharomyces cerevisiae en multitud
de proyectos (European Saccharomyces cerevisiae Archive for Functional Analysis
[http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/]
y Japanese Yeast Genetic Resource
Center [http://yeast.lab.nig.ac.jp/nig/index_en.html]).
Un estudio más detallado de la genómica funcional de esta levadura ha generado
una colección de mutantes con 6000 genes interrumpidos (knockouts) que cubren un 96%
del genoma esta especie del reino fungi (Saccharomyces Genome Deletion Project).
Incluso esta colección de cepas está disponible para su venta a los grupos de
investigación. Debido a todo lo anterior esta especie se ha convertido en uno de los
modelos eucarióticos mejor establecidos.
La manipulación genética de Saccharomyces cerevisiae ha permitido el estudio de
procesos biológicos fundamentales como el envejecimiento, el transporte de ARN
mensajero, el ciclo celular y el procesamiento de proteínas. Asimismo esta levadura
funciona como modelo de estudio de enfermedades humanas como el cáncer, el diseño de
26
medicamentos, la identificación del plegamiento de priones, el estudio de virus y la
ecotoxicología.
Saccharomyces cerevisiae también desempeña un papel relevante en la
investigación aplicada debido a su capacidad sobresaliente para producir etanol y dióxido
de carbono a partir de azúcares con alta productividad y rendimientos. La industria
biotecnológica aprovecha estas cualidades metabólicas en los procesos de panadería,
elaboración de vino y cerveza, y producción de bioetanol, además de ser el sistema
utilizado para la producción de algunas vacunas humanas como las de la hepatitis B y el
virus del papiloma. Como Saccharomyces cerevisiae es relativamente tolerante a niveles
bajos de pH, y a las altas concentraciones de azúcar y etanol, los riesgos de contaminación
durante los procesos son menores. Además, esta levadura es altamente resistente a los
compuestos generados durante la hidrólisis de la biomasa y es capaz de crecer
anaeróbicamente (Nevoigt, 2008).
La remoción de la pared celular en Saccharomyces cerevisiae y posterior
formación de protoplastos fue reportada desde el año de 1957. La adición de enzimas
provenientes del caracol Helix pomatia disolvió por entero la pared celular de este
microorganismo. La primera transformación con este tipo de células se logró hasta el año
de 1978 con la inserción de un plásmido que confería prototrofía a triptófano (Gietz, RD.
Woods, RA. 2001).
El método de transformación de la levadura por medio de protoplastos se convirtió
en uso común en laboratorios de todo el mundo. Sin embargo, se sugirió que la
transformación genética o la captura del ADN por las células era ocasionada por la fusión
de los protoplastos y en consecuencia, ocurría una poliploidía indeseada en los procesos
de transformación. El primer protocolo de transformación exitoso y reproducible se logró a
partir del estudio sistemático de Ito y colaboradores en 1981. Este grupo mostró que
+
+
+
+
+
cationes monovalentes como Na , K , Rb , Cs y Li pueden ser usados en combinación
con polietilenglicol (PEG) para estimular la captura de ADN plasmídico en levaduras con
27
pared celular intactas. Los mejores resultados involucraron el uso de acetato de litio y la
0
incubación de las células durante 5 minutos a 42 C. Los rendimientos de transformación
con este nuevo método fueron inferiores al uso de protoplastos; pero el uso de cationes y
PEG resultó mucho más rápido, simple y fácil de estandarizar (Ito et al. 1983).
Posteriores modificaciones han logrado mejorar los rendimientos de transformación
6
hasta lograr valores de 1x10 cepas recombinantes por microgramo de ADN y 1x10
8
células. Estas modificaciones involucran la desnaturalización del ADN para convertirlo en
una estructura de una sola hebra, la adición de transportadores de ADN de una sola hebra
(single stranded DNA carrier) y la incubación de las células durante el proceso de captura a
0
42 C durante 40 minutos (Gietz et al. 1992). Hasta ahora estos elevados rendimientos
convierten el protocolo por cationes y choque térmico en el más utilizado en todo el mundo
para la transformación de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
28
JUSTIFICACIÓN.
Los métodos actuales de transformación genética en hongos presentan numerosos
problemas respecto a su eficiencia, reproducibilidad y fenómenos indeseados de
modificación de la carga genética. Es por lo anterior que en este trabajo se propone un
nuevo método de transformación que solucione los problemas anteriores, permita generar
mutantes con fenotipos de interés científico e incursione en la exploración de parámetros
físicos involucrados en la transformación genética por medio de ondas de choque.
29
HIPÓTESIS.
Es posible introducir genes de interés en hongos mediante un proceso de cavitación
acústica generado por ondas de choque y además, estos genes pueden establecerse de
manera funcional en el genoma del hospedero.
30
OBJETIVO GENERAL.
Determinar los parámetros generales que permitan la transformación genética de hongos mediante
ondas de choque.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
•
Establecer las variables (número de ondas de choque, concentración de material biológico,
concentración de ADN, concentración de antibiótico de selección) que permitan la
obtención de transformantes en las especies: Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger,
Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas de choque.
•
Propagar las cepas que presenten el fenotipo de interés y analizar la expresión de los
genes reporteros insertados.
•
Realizar pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para validar la presencia
de los genes insertados.
•
Determinar la eficiencia del proceso en relación a sistemas tradicionales.
31
METODOLOGÍA.
1. Cepas utilizadas.
•
Las cepas de Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides fueron donadas por
el Dr. José Tun del Instituto Tecnológico de Conkal, Yucatán.
•
La cepa de Saccharomyces cerevisiae w303a fue donada por el Dr. Plinio Guzmán
Villate del CINVESTAV, Unidad Irapuato.
•
Las cepas de Aspergillus niger ATCC 1015 y Aspergillus niger ATCC 16888 fueron
donadas por la Dra. Dora Linda Guzmán del CINVESTAV, Unidad Irapuato.
•
Las cepas de E. coli para la multiplicación de vectores fueron DH10B y GM48. Esta
última está modificada genéticamente en la maquinaria de metilación de
secuencias de ADN.
2. Plásmidos utilizados en este trabajo y extracción de ADN plasmídico.
•
Se utilizó el plásmido pCambia 1302 (CAMBIA, Canberra, Australia) para la
transformación de los hongos Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides.
Este plásmido confiere resistencia a higromicina a partir del gen hptII (higromicina
fosfotransferasa II) acoplado al promotor CaMV35S (Virus del mosaico de la coliflor
35S).
•
Para los protocolos de transformación de las cepas de Aspergillus niger 16888 y
Aspergillus niger ATCC 1015 se utilizó el plásmido pBINGFPHPH (O´Connell et al.
2004) proporcionado por la Dra. June Kilpatrick Simpson Williamson del
CINVESTAV, Unidad Irapuato. Este plásmido también confiere a higromicina con
el gen hph (higromicina B fosfotransferasa). El gen de la proteína verde
fluorescente (gfp) y el gen de resistencia están bajo control del promotor gpdA de
Aspergillus nidulans y el terminador trpC (antranilato sintasa) de la misma especie.
32
•
El plásmido PGBKT7 (Clontech, California, EU) fue proporcionado por el Dr. Plinio
Guzmán Villate. Este plásmido permite la selección de transformantes en
Saccharomyces cerevisiae por prototrofía a triptófano. Contiene la secuencia
completa del gen TRP1 que codifica para la enzima N-(5'-fosforibosil)-antranilato
isomerasa.
•
La extracción de ADN plasmídico de las cepas de E. coli DH10B y E. coli GM48 se
llevó a cabo de acuerdo al protocolo Maxiprep modificado de Sambrook et al.
2001.
3. Establecimiento de las concentraciones inhibitorias de higromicina.
De manera natural las diferentes cepas de la misma especie de hongos filamentosos
presentan variabilidad en la tolerancia a la actividad de antibióticos de selección. Para
evitar la presencia de falsos transformantes se realizaron pruebas, previas a los protocolos
de transformación, para establecer los límites de resistencia al antibiótico higromicina.
La higromicina es un compuesto ampliamente utilizado como agente de selección
en hongos filamentosos, su acción impide el proceso de traducción del ARN mensajero al
unirse al sitio activo de los ribosomas. Se realizaron pruebas con 100 µg/ml, 200 µg/ml,
300 µg/ml y 400 µg/ml de higromicina para cada una de las especies utilizadas en este
trabajo. Los resultados se resumen en la tabla 7. Además de la higromicina se añadieron
los antibióticos carbenicilina y estreptomicina en los protocolos para prevenir la
contaminación por bacterias.
33
Tabla 7. Concentraciones de selección establecidas con higromicina de las especies
utilizadas en este trabajo.
Especie
Concentración establecida de selección
con higromicina
Colletotrichum gloeosporioides
200 µg/ml
Fusarium solani
400 µg/ml
Aspergillus niger
400 µg/ml
4. Estandarización de la cantidad y calidad del inóculo.
En numerosos protocolos el uso de micelio representa una alternativa para la
transformación genética de hongos filamentosos. Sobre todo en especies con baja
capacidad de esporulación. El inconveniente principal del uso de micelio radica en la
presencia de múltiples núcleos (heterocariosis) en las hifas de diferentes especies.
En este trabajo debido a la baja esporulación o a la poca viabilidad de las esporas
se decidió utilizar micelio de dos especies de hongos: Fusarium solani y Colletotrichum
gloeosporioides. Para evitar el uso de dos tejidos diferentes (micelio y esporas) el micelio
de estas dos especies fue filtrado con una membrana Millipore de 0.45 µm. En el caso de
Aspergillus niger debido a su alta tasa de esporulación se utilizaron conidios para los
protocolos de transformación.
•
Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides. Las cepas se crecieron en medio
mínimo para Aspergillus agar (ver apéndice para la composición y preparación de
medio) durante tres días. Con un asa de siembra se tomó una muestra de micelio del
hongo, este tejido se filtró a través de una membrana Millipore de 0.45 µm para evitar la
presencia de esporas. El micelio se resuspendió mediante un vórtex en 9 ml de medio
mínimo para Aspergillus en forma líquida. Se efectuó el conteo al microscopio de hifas
de la suspensión y se plaquearon dos muestras de 100 µl de la solución micelial en
medio mínimo para Aspergillus agar para el conteo de colonias viables.
34
•
Aspergillus niger. Para estandarizar la cantidad de inóculo se realizó una curva de
calibración a 420 nm de conidios de Aspergillus niger. Las cepas ATCC 16888 y ATCC
0
1015 se crecieron en medio mínimo para Aspergillus durante seis días a 28 C. Las
esporas se lavaron con medio líquido para Aspergillus para obtener cuatro lecturas de
absorbancia a 420 nm. Las muestras se colocaron en un hematocitómetro para contar
el número de conidios por mililitro. Las muestras también se plaquearon en medio
mínimo para Aspergillus agar con tres repeticiones.
•
Saccharomyces cerevisiae. Se creció un preinóculo de la levadura en 5 ml de medio
mínimo para levadura (YMM, ver apéndice para la composición de este medio) durante
0
12 horas a 30 C en agitación. Los 5 ml se trasladaron a un matraz conteniendo 100 ml
0
de medio YMM, se incubó el cultivo de levadura a 30 C hasta alcanzar una densidad
óptica de 0.5 a 600 nm (aproximadamente 3 horas). La medición de la absorbancia
6
referida equivale a 1x10 /ml células registradas con el hematocitómetro.
5. Descripción del equipo experimental.
Para los protocolos de transformación desarrollados en este trabajo se empleó un litotriptor
modelo Piezolith 2300 modificado (marca Richard Wolf GMbH, Knittlingen, Alemania). Este
equipo tiene acoplado un sistema de ultrasonido que se usó para centrar la muestra (figura
8). El sistema posee un capacitor que puede cargarse con voltajes entre 5 y 10 kV.
La energía eléctrica se encuentra almacenada en una fuente de alto voltaje. La
descarga del capacitor está controlada por un interruptor de chispa situado en la base del
generador (figura 9). El circuito de descarga está conectado a un sistema electrónico que
permite ajustar la frecuencia de emisión de ondas de choque y el voltaje de descarga.
Finalmente, el sistema piezoeléctrico generador de las ondas de choque está constituido
por 3000 cristales que al recibir la descarga de los capacitores se expanden súbitamente
para generar las ondas mecánicas en el agua circundante.
35
Figura 8. Monitor de ultrasonido y consola de mando del equipo Piezolith 2300.
Figura 9. Generador piezoeléctrico y circuito de descarga del equipo Piezolith 2300. El
interior de la base se encuentra relleno con agua y dentro se coloca la muestra para ser
sometida a los diferentes pulsos de ondas mecánicas.
36
6. Preparación y procesamiento de las muestras.
6.1. Protocolo de transformación genética de las especies Fusarium solani y Colletotrichum
gloeosporioides.
Se prepararon con un sellador comercial bolsitas de propileno de 1 cm por 1.5 cm para
colocar la solución micelial y el ADN plasmídico con el gen de interés. Se utilizaron 6 µl de
ADN plasmídico (pCambia 1302) a una concentración de 1 µg/µl en el caso de Fusarium
solani. En el caso de Colletotrichum gloeosporioides se utilizaron 10 µl del mismo plásmido
a una concentración de 1 µg/µl. Estos 10 µl se disolvieron en 190 µl de suspensión de
micelio del hongo por lo que la concentración total de ADN en la muestra fue de 30 µg/ml
en el caso de Fusarium solani y 50 µg/ml en el caso de Colletotrichum gloeosporioides.
En total se prepararon cinco muestras para cada especie dentro de las bolsitas de
propileno, cuatro conteniendo la concentración referida de ADN y una muestra de 200 µl
de solución micelial sin ADN como control. La muestra 1 se sometió a 100 ondas de
choque, la muestra 2 se sometió a 200 ondas de choque, la muestra tres a 300 ondas de
choque, la cuatro a 400 ondas de choque. La muestra control se sometió a 250 ondas de
choque.
El voltaje utilizado fue de 7.6±0.15 kV con una frecuencia de generación de ondas
de choque de 0.5 Hertz. Después de la aplicación de las ondas de choque las muestras se
depositaron en filtros de celulosa sobre cajas petri con medio mínimo para Aspergillus agar
sin antibiótico de selección. Después de 24 horas de recuperación del tejido micelial, los
filtros se transfirieron a medio mínimo para Aspergillus con una concentración de 200 µg/ml
de higromicina como antibiótico de selección en el caso de Colletotrichum gloeosporioides
y 400 µg/ml en el caso de Fusarium solani. Las cepas resistentes a higromicina se
observaron a las 48 horas de realizar la transferencia al medio selectivo. Se realizaron tres
repeticiones del protocolo de cada especie.
37
6.2. Protocolo de transformación genética del hongo Aspergillus niger.
Para el proceso de transformación las cepas se crecieron en medio mínimo para
0
Aspergillus agar durante seis días a 28 C hasta que se observó una buena producción de
conidios. Los conidios se lavaron con medio mínimo para Aspergillus líquido y se diluyeron
4
hasta lograr una concentración de 1x10 UFC tomando como punto de partida las lecturas
iniciales analizadas en una curva de calibración. Por otra parte se prepararon con un
sellador comercial bolsitas de propileno de 1 cm por 1.5 cm para colocar la solución de
conidios y el ADN plasmídico a transfectar.
Se utilizaron 10 µl de ADN plasmídico (pBINGFPHPH) a una concentración de 1
µg/µl. Estos 10 µl se disolvieron en 190 µl de suspensión de conidios del hongo por lo que
la concentración total de ADN en la muestra fue de 50 µg/ml. En total se prepararon cinco
muestras dentro de las bolsitas de propileno: cuatro conteniendo la concentración referida
de ADN y una muestra de 200 µl de solución de conidios sin ADN como control. La
muestra 1 se sometió a 100 ondas de choque, la muestra 2 se sometió a 200 ondas de
choque, la muestra tres a 300 ondas de choque, la cuatro a 400 ondas de choque. La
muestra control se sometió a 250 ondas de choque.
Después de la aplicación de las ondas de choque las muestras se depositaron en
filtros de celulosa sobre cajas petri con medio mínimo para Aspergillus agar sin antibiótico
de selección. Después de 24 horas de recuperación del tejido del hongo, los filtros se
transfirieron a medio mínimo para Aspergillus con una concentración de 400 µg/ml de
higromicina como antibiótico de selección. Las cepas resistentes a higromicina se
observaron a las 48 horas de realizar la transferencia al medio selectivo. Se realizaron tres
repeticiones de este protocolo.
38
6.3. Protocolo de transformación de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Para realizar este protocolo se prepararon pequeñas bolsas de propileno de 1 cm x
1.5 cm con un sellador de plástico comercial. En cada bolsa se colocaron 194 µl del cultivo
de levadura y 6 µl de ADN del plásmido pGBKT7 a una concentración de 1 µg/ml. En total
se prepararon cinco muestras dentro de las bolsitas de propileno: cuatro conteniendo la
concentración referida de ADN y una muestra de 200 µl de solución de células sin ADN
como control. La muestra 1 se sometió a 100 ondas de choque, la muestra 2 se sometió a
200 ondas de choque, la muestra tres a 300 ondas de choque, la cuatro a 400 ondas de
choque. La muestra control se sometió a 250 ondas de choque.
Las muestras se trasladaron a tubos eppendorf con 900 µl de medio YMM, se
0
incubaron durante media hora a 30 C en agitación para permitir la recuperación celular. En
forma posterior, las muestras se plaquearon en medio mínimo para levadura agar sin
triptófano para permitir la selección de transformantes. Estas cajas de cultivo se incubaron
0
de manera inmediata a 30 C. Las colonias con el gen de interés se observaron a las 24
horas de la siembra en medio selectivo. Se llevaron a cabo tres repeticiones de este
protocolo.
7. Extracción de ADN de hongos filamentosos.
La metodología básica está reportada por Punekar et al. (2003), este protocolo fue
modificado para mejorar la calidad de ADN y su concentración. El micelio del hongo se
creció en 200 ml de medio mínimo para Aspergillus líquido durante una semana a quince
días, dependiendo de la especie. El micelio del hongo se filtró para retirar el exceso de
líquido. Se tomaron de 4 a 5 gramos de micelio húmedo del hongo y se trituraron con un
mortero y nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. En forma simultánea se
precalentaron 10 ml de buffer de lisis (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 M de NaCl y 1% de
0
SDS) a 65 C en un tubo corex de 40 ml. Se tomaron 2.5 gramos del micelio perfectamente
triturado (la relación de buffer y tejido macerado es 1:4 peso/volumen) y se depositaron en
el buffer de lisis precalentado. Esta mezcla se calentó durante 20 minutos a 650C.
39
Al término de este tiempo la muestra se dejó enfriar y se le añaden 6 ml de
solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v). La muestra se centrifugó a
4500 g durante 20 minutos. Al término de tiempo la epifase se transfirió a un tubo corex
limpio y se le añadieron 6 ml más de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v). La
muestra se centrifugó nuevamente a 4500 g durante 20 minutos. El sobrenadante se lavó
de igual manera con fenol:cloroformo (4:5 v/v). Al sobrenadante se le añadieron 0.54 del
0
volumen recuperado de isopropanol y se dejó incubando a -20 C durante una hora.
Transcurrido el período de tiempo anterior la muestra se centrifugó a 4500 g para precipitar
el ADN. La pastilla obtenida se lavó en dos ocasiones con etanol absoluto (4500 g durante
10 minutos). La muestra se dejó secar y prepararon alícuotas de 200 ml de agua
desionizada estéril. Para mejorar la calidad del ADN extraído, las muestras se trataron con
el kit DNA Clean and Concentrator (Zymo Research, EU).
8. Extracción de ADN de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Se utilizaron dos protocolos de extracción de ADN, uno basado en el choque térmico de la
pared celular de levadura (Harju et al. 2004) y otro basado en el uso de perlas de vidrio
(Sobanski y Dickinson. 1995). En ambos casos se evita el uso de enzimas hidrolíticas. El
protocolo basado en Sobansky y Dickinson (1995) consta de las siguientes etapas:
Se inoculó una colonia de levadura en 5 ml del medio YPD y se dejó crecer hasta
la saturación del medio (1 ó 2 días). Para recuperar las células el cultivo se transfirieron a
un tubo falcon limpio y estéril. La muestra se centrifugó a 2500 g durante 5 minutos. Se
retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 500 µl de agua estéril. Las
células se transfirieron a tubos eppendorf estériles y se precipitaron centrifugando la
muestra a máxima velocidad durante 10 segundos. Se retiró el exceso de agua, las
muestras se resuspendieron en el agua restante y se añadieron 200 µl de la solución de
Winston (2% Tritón X-100, 1% SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl pH 8.0 y 1 mM
de EDTA).
40
La muestra se disolvió completamente en el buffer, se le añadieron 2 perlas de
vidrio estériles de 2 mm de diámetro y 200 µl de fenol:cloroformo (4:5 v/v). La muestra se
colocó en un vórtex a máxima velocidad durante 5 minutos, se le añadieron 200 µl más
de agua estéril y se centrifugó a 10,000 g durante 5 minutos. El sobrenadante se transfirió
0
a un tubo limpio, se le añadieron 2 µg de RNAsa A y se incubó durante 5 minutos a 37 C.
Posteriormente se le añadieron 200 µl de fenol:cloroformo (4:5 v/v), se colocó esta
mezcla en un vórtex a máxima velocidad durante 1 minuto. Se tomó nuevamente el
sobrenadante y los lavados de fenol:cloroformo se repitieron dos veces más. Al
sobrenadante obtenido de la última centrifugación se le añadió 500 µl de etanol absoluto,
se incubó a -200C durante 15 minutos y se centrifugó a 10,000 g durante 5 minutos. La
pastilla se lavó una vez más con etanol absoluto y se dejó secar completamente. La
muestra de ADN obtenida se disolvió en 50 µl de agua estéril.
9. Escrutinio de probables cepas transformadas.
Para detectar la inserción de los genes de interés se realizaron pruebas con la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Para el gen hpt contenido en el plásmido pCambia 1302
utilizado en las especies de Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides se emplearon
los siguientes oligonúcleotidos:
Iniciador directo: 5`-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-´3
Iniciador reverso: 5´-TACTTCTACACAGCCATC-´3
0
Las condiciones de la reacción fueron: 95 C de desnaturalización por 30 segundos,
0
0
42 C de alineamiento durante 30 segundos y 72 C de extensión durante 90 segundos. Se
corrieron 25 ciclos de amplificación. El tamaño esperado del fragmento amplificado con
estos oligonucleótidos es de 1000 pb. Los productos de amplificación se analizaron en un
gel de agarosa al 8%.
Para el gen hph contenido en el plásmido pBINGFPHPH utilizado para la
transformación de Aspergillus niger se emplearon dos pares de oligonúcleotidos:
41
•
Par proporcionado por el laboratorio Laboratorio de Marcadores Moleculares y
Genética Molecular (CINVESTAV, Unidad Irapuato):
Iniciador directo: 5`-GCACGAGGTGCCGGA-´3
Iniciador reverso: 5´-GCTCTCGGAGGGCGA-´3
•
Par diseñado con el software Geneious 4.6.4 (2009):
Iniciador directo: 5`-AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-´3
Iniciador reverso: 5´-ATCGCCTCGCTCCAGTCAATG-´3
Con el fin de optimizar el alineamiento de los oligonucleótidos se llevó a cabo un
protocolo de PCR tipo touch-down. Se utilizó una temperatura superior de alineamiento a la
recomendada para evitar la amplificación de zonas inespecíficas. Esta temperatura
disminuyó hasta alcanzar el valor óptimo de alineamiento, es en esta última temperatura
donde ocurrieron la mayor parte de las amplificaciones requeridas.
0
Las condiciones iniciales de reacción fueron: 94 C de desnaturalización por 30
0
0
segundos, 56 C de alineamiento durante 30 segundos (disminuyendo 1 C en cada ciclo
0
0
hasta alcanzar los 51 C) y 72 C de extensión durante 50 segundos. Las condiciones finales
0
0
de reacción fueron: 94 C de desnaturalización por 30 segundos, 51 C de alineamiento
0
durante 30 segundos y 72 C de extensión durante 50 segundos. Se corrieron 24 de estos
ciclos. El tamaño esperado con estos oligonucleótidos es de 500 pb. Se utilizaron de 200
ng de ADN en cada reacción. Los productos de amplificación se analizaron en un gel de
agarosa al 0.8%.
Finalmente, para la detección del gen trp1 contenido en el plásmido pGBKT7 para
la transformación de Saccharomyces cerevisiae se diseñó el siguiente par de oligos con el
software Geneious 4.6.4 (2009):
Iniciador directo: 5`- TGGTCCATTGGTGAAAGTTTGCGG-´3
42
Iniciador reverso: 5´- TTTGTCTCCACACCTCCGCTTACA-´3
0
Las condiciones de la reacción fueron: 95 C de desnaturalización por 30 segundos,
0
0
46 C de alineamiento durante 30 segundos y 72 C de extensión durante 90 segundos. Las
reacciones se analizaron en un gel de agarosa al 8%.
43
RESULTADOS.
1. Transformación genética del hongo Fusarium solani.
Se obtuvieron cepas resistentes a higromicina con el plásmido pCambia 1302 en un
ensayo inicial con 200 y 300 ondas de choque. Utilizando 100 y 400 ondas de choque no
se obtuvieron colonias resistentes; con 200 ondas de choque se detectaron siete probables
transformantes y con 300 una probable cepa transgénica. Se realizaron tres repeticiones
del protocolo con 200 ondas de choque de ondas de choque. Los resultados se muestran
en la tabla 8. La eficiencia calculada en este protocolo fue de 0.6% con 200 ondas de
choque.
Tabla 8. Número de probables transformantes obtenidos en tres repeticiones del protocolo
de transformación de Fusarium solani por medio de ondas de choque.
Repetición
Colonias viables
Colonias resistentes
1
1220
7
2
1330
5
3
1090
6
Se determinó una concentración de higromicina para la propagación de las cepas
en medio líquido de 70 µg/ml. Tres de las cepas se propagaron en medio mínimo para
Aspergillus con la concentración de higromicina referida. En una de las cepas se realizó
una caracterización morfológica (figura 10); así como la extracción y purificación de ADN
genómico.
44
1
2
Figura 10. Morfología microscópica del micelio de las cepas silvestre (número 1) y
resistente a higromicina (número 2) de Fusarium solani. Puede observarse el
engrosamiento de las hifas y el cambio de tamaño de los núcleos.
Para el análisis por PCR se utilizaron 500 µg de ADN en cada reacción. Se obtuvo
un fragmento del tamaño esperado (1 Kb) con el plásmido pCambia 1302 como control
positivo y en la cepa resistente a higromicina. Por el contrario, en la cepa silvestre de
Fusarium solani no se observó ningún fragmento producto de la reacción (ver figura 11). La
tabla 9 resume las variables importantes en el protocolo de transformación de este hongo
por medio de ondas de choque.
Tabla 9. Parámetros relevantes del protocolo de transformación de Fusarium solani por
medio de ondas de choque.
Nombre de la variable
Valores estandarizados
Voltaje
7.6 ± 0.15 kV
Frecuencia de emisión de
ondas de choque
Número de ondas de choque
0.5 Hertz
200
Tipo de inóculo
Micelio
Colonias viables (UFC)
1x10
Cantidad de ADN
50 µg/ml
Volumen de muestra
200 µl
Concentración de
con higromicina
selección
3
400 µg/ml
45
1
2
3
4
1 kb.
0.5 kb.
Figura 11. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
correspondiente a los protocolos de transformación de Fusarium solani. Carril 1. Marcador
de peso molecular. Carril 2. Control positivo, plásmido pCambia 1302. Carril 3. ADN
genómico de cepa resistente de Fusarium solani. Carril 4. ADN genómico de la cepa
silvestre de Fusarium solani. Las flechas en la figura muestran el peso molecular
(kilobases) de la banda señalada en el marcador de referencia.
46
2. Transformación genética del hongo Colletotrichum gloeosporioides.
Ensayos iniciales generaron cepas resistentes a higromicina con 100 y 200 ondas de
choque con el plásmido pCambia 1302. Utilizando 300 y 400 ondas de choque no se
obtuvieron colonias resistentes; con 100 ondas de choque se detectaron cinco probables
transformantes y con 200 ondas de choque 89 probables cepas transgénicas. Se realizaron
tres repeticiones del protocolo con 200 ondas de choque de ondas de choque.
Los resultados se muestran en la tabla 10. La eficiencia calculada en este
protocolo fue de 7.3% con 200 ondas de choque.
Tabla 10. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del
protocolo de transformación de Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas de
choque. (NC*. No cuantificable. Las cepas crecieron una muy cerca de otra y fue imposible
contarlas).
Repetición
Colonias viables
Colonias resistentes
1
1530
89
2
1220
92
3
1430
NC*
Se determinó una concentración de higromicina para la propagación de las cepas
de 35 µg/ml en medio líquido para Aspergillus. Se llevó a cabo la extracción y purificación
de ADN genómico. A partir del ADN extraído se realizó un protocolo de reacción en cadena
de la polimerasa con los oligonucleótidos correspondientes al gen hpt. Se utilizaron 200 ng
de ADN en cada reacción de amplificación. El ADN genómico de la cepa resistente y el
control positivo mostraron la amplificación del fragmento esperado. La cepa silvestre no
47
mostró ningún fragmento producto de la reacción (figura 12). Los parámetros relevantes del
protocolo de transformación se resumen en la tabla 11.
1
2
3
4
1.375 kb.
0.947 kb.
Figura 12. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
correspondiente a los protocolos de transformación de Colletotrichum gloeosporioides.
Carril 1. Marcador de peso molecular. Carril 2. Control positivo, plásmido pCambia 1302.
Carril 3. ADN genómico de correspondiente a la cepa silvestre. Carril 4. ADN genómico de
la cepa resistente de Colletotrichum gloeosporioides. Las flechas en la figura muestran el
peso molecular (kilobases) de la banda señalada en el marcador de referencia.
48
Tabla
11.
Parámetros
estandarizados
para
el
protocolo
de
transformación
de
Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas de choque.
Nombre de la variable
Valores estandarizados.
Voltaje
7.6±0.15 kV
Frecuencia de emisión
ondas de choque
de
0.5 Hertz.
Número de ondas de choque
200
Tipo de inóculo
Micelio
Colonias viables (UFC)
1x10
Cantidad de ADN
30 µg/ml
Volumen de muestra
200 µl
Concentración de
con higromicina
selección
3
200 µg/ml
3. Transformación genética de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Se realizó un ensayo inicial con el plásmido pBINGFPHPH que confiere resistencia
a higromicina en fase con el promotor gpdA (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) de
Aspergillus nidulans. A pesar de la poca homología con el promotor respectivo gpd1 de
Saccharomyces cerevisiae, se decidieron realizar estos ensayos preliminares.
La levadura se creció en medio YPD (ver apéndice para la composición de los
medios) hasta alcanzar una absorbancia de 0.5 a 600 nm. Se contaron las levaduras a esta
6
absorbancia en un hematocitómetro siendo de 1x10 levaduras por mililitro. Asimismo se
determinó una concentración inhibitoria de higromicina de 200 µg/ml. Para la realización de
estas pruebas se colocaron 190 µl del medio de cultivo y 10 µl de ADN a una
concentración de 1µg/µl del plásmido pBINGFPHPH. Es importante mencionar que durante
el proceso de aplicación de las ondas de choque se formaron numerosas burbujas en el
49
medio de cultivo. Después de este proceso, las células se incubaron durante 30 minutos a
0
30 C para permitir su recuperación. Finalmente se plaquearon en medio selectivo con la
concentración antes referida de higromicina. Se realizaron tres repeticiones con este
protocolo; sin embargo no se produjeron transformantes.
Por otra parte, el uso del vector comercial pGBKT7 requirió el uso de medio
mínimo para levadura (YMM). Este medio sintético permite la adición y sustracción de
aminoácidos para la selección de levaduras por prototrofía. Para analizar la viabilidad de
este protocolo se realizaron ensayos para comprobar que la cepa utilizada (w303a) era
auxótrofa a triptófano (figuras 14 y 15). La utilización de un medio sintético disminuyó la
presencia de burbujas. Se obtuvieron cinco y doce cepas protótrofas a triptófano con 100 y
200 ondas de choque respectivamente. Un segundo ensayo para acotar estas variables
permitió observar que a 150 ondas de choque se obtenía un mayor número de
transformantes. Los resultados de la repetición del protocolo con 150 ondas de choque se
resumen en la tabla 12.
Tabla 12. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del
protocolo de transformación de Saccharomyces cerevisiae por medio de ondas de choque
con 150 ondas de choque.
Repetición.
Colonias viables.
Colonias protótrofas.
1
2x10
5
18
2
2x10
5
12
3
2x10
5
22
La eficiencia calculada de este protocolo fue de 0.0086% con respecto a las células
totales de la levadura sometidas a las ondas de choque. Los parámetros relevantes del
50
protocolo se resumen en la tabla 13. En las figuras 13 y 14 pueden observarse las pruebas
de selección por prototrofía de las cepas obtenidas.
Tabla
13.
Parámetros
estandarizados
para
el
protocolo
de
transformación
de
Saccharomyces cerevisiae por medio de ondas de choque.
Nombre de la variable.
Valores estandarizados.
Voltaje.
7.6±0.15 kV
Frecuencia de emisión de
ondas de choque.
Número de ondas de choque.
0.5 Hertz.
150.
Tipo de inóculo.
Células.
Colonias viables. (UFC)
2x10
Cantidad de ADN.
30 µg/ml.
Volumen de muestra.
200 µl.
Selección.
Prototrofía a triptófano.
5
Figura 13. Cepas protótrofas a triptófano de Saccharomyces cerevisiae obtenidas por
medio de ondas de choque. Las cepas fueron crecidas en medio sintético YMM sin
triptófano durante cinco días. Cepas marcadas con la letra C (control): cepas silvestres.
51
Cepas marcadas con los números 1,2,3,4,5 y 6: Cepas aisladas de los protocolos de
transformación.
Figura 14. Propagación en medio líquido de cepas protótrofas a triptófano de
Saccharomyces cerevisiae obtenidas por medio de ondas de choque. Tubo de ensayo con
el número 1. Cepa silvestre crecida en medio YPD (contiene todos los aminoácidos).
Número 2. Cepa silvestre en medio YMM sin triptófano. Números 3 y 4. Cepas obtenidas
por medio de ondas de choque en medio YMM sin triptófano. Número 5. Cepa silvestre en
medio YMM con triptófano añadido.
Para evitar el uso de enzimas hibrolíticas se utilizaron dos protocolos alternativos
de extracción de ADN, uno basado en el choque térmico de la pared celular de levadura
(Harju et al. 2004) y otro basado en el uso de perlas de vidrio (Sobanski y Dickinson. 1995).
El protocolo de choque térmico no ofreció buenos resultados. El ADN presentaba
impurezas a pesar de la adición de lavados con fenol y cloroformo. La cantidad de ADN
extraída era además, muy poca, en promedio 50 ng/µl.
El uso de perlas de vidrio por otra parte permitió la extracción de ADN en buena
cantidad y libre de impurezas. Los rendimientos por extracción de 5 mililitros de levadura
fueron en promedio de 3 µg/µl en un volumen de 50 µl (ver figura 15). El tamaño esperado
con estos oligonucleótidos es de 650 pb. Se utilizaron de 200 ng de ADN en cada reacción.
Los productos de amplificación se analizaron en un gel de agarosa. Se obtuvo una
amplificación del tamaño esperado en cuatro cepas protótrofas analizadas y en el plásmido
52
pGBKT7 utilizado como control positivo. El ADN extraído de la cepa silvestre no mostró
ninguna amplificación en la reacción de PCR (figura 15).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.831 kb.
0.564 kb.
Figura 15. Gel de electroforesis de muestras de extracción de ADN y PCR
correspondientes a los protocolos de transformación de Saccharomyces cerevisiae. Carril
1. Marcador de peso molecular. Carriles 2, 3 y 4. Extracciones de ADN genómico. Carril 5.
Reacción de amplificación cepa silvestre. Carriles 6, 7, 8 y 9. Reacción de amplificación de
cepas protótrofas generadas por el protocolo. Carril 10. Reacción de amplificación del
plásmido pGBKT7 utilizado como control positivo. Las flechas en la figura muestran el peso
molecular (kilobases) de la banda señalada.
53
4. Transformación genética del hongo Aspergillus niger.
4. 1. Protocolos de selección con higromicina.
Para estandarizar la cantidad de inóculo en los protocolos de transformación se realizó una
curva de calibración de las esporas (conidios) y de colonias viables versus absorbancia de
la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger a 420 nm. Los valores obtenidos se registran en la
tabla 14. El coeficiente de regresión lineal fue mayor en el caso de las colonias viables
(UFC) R=0.992 con respecto al número de conidios R=0.942 (figuras 16 y 17).
Este
resultado indica una mayor confiabilidad en los datos de la calibración con respecto al
número de colonias viables.
Tabla 14. Valores obtenidos para las curvas de calibración de absorbancia a 420 nm de los
conidios de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015.
log(No. conidios)
UFC (colonias/ml)
log (UFC)
Absorbancia. No. conidios.
0,373
3,00E+06
6,477121255
450000 5,65321251
0,21
8,00E+05
5,903089987
200000
5,30103
0,312
2,00E+06
6,301029996
380000
5,5797836
0,289
1,50E+06
6,176091259
310000 5,49136169
Absorbancia (420 nm).
log10(UFC).
Figura 16. Curva de calibración de número de colonias viables versus absorbancia a 420
nm de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.
54
log10(Conidios).
Figura 17. Curva de calibración de número de conidios versus absorbancia a 420 nm de la
cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.
Un ensayo inicial del protocolo de transformación generó cepas resistentes a
higromicina con el plásmido pBINGFPHPH con 100 ondas de choque. La aplicación de
200, 300 y 400 ondas de choque no generó cepas resistentes. Se realizaron tres
repeticiones con 100 ondas de choque. Los resultados se resumen en la tabla 15. Después
de su aislamiento, las cepas fueron propagadas en medio mínimo para Aspergillus líquido
con una concentración de selección de 100 µg/ml (figura 18). Los parámetros relevantes de
este protocolo se resumen en la tabla 16. La eficiencia calculada con respecto al número
total de colonias viables fue de 0.53%. Posteriormente, se efectúo la extracción de ADN y
el análisis por PCR. El tamaño del fragmento esperado con los oligonucleótidos utilizados
es de 500 pb.
55
Tabla 15. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del
protocolo de transformación de Aspergillus niger por medio de ondas de choque con 100
ondas de choque.
Repetición.
Colonias viables.
Colonias resistentes.
1
1x10
4
16
2
1x10
4
50
3
1x10
4
27
Tabla 16. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de Aspergillus
niger por medio de ondas de choque.
Nombre de la variable
Valores estandarizados
Voltaje
7.6 ± 0.15 kV
Frecuencia de emisión de
ondas de choque
Número de ondas de choque
0.5 Hertz
100
Tipo de inóculo
Conidios
Colonias viables (UFC)
1x10
Cantidad de ADN
50 µg/ml
Volumen de muestra
200 µl
Concentración de
con higromicina
selección
4
400 µg/ml
En dos de cinco cepas analizadas por PCR se obtuvo una amplificación positiva.
Por el contrario, el ADN extraído de la cepa silvestre no mostró ninguna amplificación en la
reacción de PCR (figura 19). Además en estas dos cepas pudo observarse la expresión de
la proteína verde fluorescente (figura 20). Se realizaron microcultivos y se documentó la
actividad del gen reportero al tercer día de crecimiento con un microscopio de fluorescencia
56
MDR Leica a 480-520 nm. Por el contrario, la cepa silvestre de Aspergillus niger ATCC
1015 no mostró fluorescencia en este mismo espectro de longitud de onda y en la misma
tiempo de crecimiento.
1
2
3
4
5
6
Figura 18. Cepas de Aspergillus niger propagadas en medio selectivo con higromicina (100
µg/ml). Cultivo marcado con el número 1: Cepa silvestre (control). Cultivos marcados con
los números 2, 3, 4, 5 y 6: Cepas aisladas de los protocolos de transformación con 100
ondas de choque.
1.
2.
3.
4.
5.
0.564 kb.
Figura 19. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
correspondiente a los protocolos de transformación de Aspergillus niger. Carril 1. Marcador
de peso molecular. Carril 2. Control positivo, plásmido pBINGFPHPH. Carriles 3 y 4.
57
Extracciones ADN genómico de correspondiente a dos de las cepas resistentes. Carril 5.
ADN genómico de la cepa silvestre de Aspergillus niger. Las flechas en la figura muestran
el peso molecular (kilobases) de la banda señalada en el marcador de referencia.
A.
B.
Figura 20. Expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en una de las cepas
resistentes a higromicina. Panel A. Cepa crecida durante tres días en medio mínimo para
Aspergillus vista en campo claro con el objetivo 20X. Panel B. Misma cepa observada con
lámpara de fluorescencia a 480-520 nm.
-
4.2. Transformación de Aspergillus niger con la construcción pepA y el gen de selección a
fleomicina.
Para la obtención de cepas deficientes de proteasas se decidió ensayar protocolos
de transformación con el gen de la peptidasa A de Aspergillus niger interrumpida por la
secuencia del gen ble que confiere resistencia a fleomicina (Drocourt et al. 1990). Se
prefirió el uso del gen de resistencia a fleomicina porque tiene este antibiótico tiene una
mejor capacidad de inhibición del crecimiento de la cepa silvestre de Aspergillus niger que
la actividad de la higromicina.
58
Esta construcción se sintetizó comercialmente en tres fragmentos de 1955, 1881 y
1634 pares de bases (figura 21), los cuales fueron ensamblados y clonados en el vector
SK+ (figura 22). Para el uso de la secuencia en los protocolos de transformación, el
plásmido fue digerido con la enzima HindIII, la banda liberada se cortó en el gel de agarosa
y se purificó con el kit Illustra Gen Band Purification (GE Healthcare).
Para la elaboración de las muestras se utilizaron conidios y micelio de las cepas de
Aspergillus niger ATCC 16888 y ATCC 1015.La cantidad de ADN utilizado por muestra fue
de 10 µg. El volumen total de la muestra fue de 200 µl en bolsas de polipropileno. Por
tanto, la concentración final de ADN fue de 50 µg/ml. La utilización de micelio de la cepa
ATCC 16888 resultó ineficaz, el micelio de Aspergillus niger es cenocítico y es inviable al
disgregarse en la solución experimental.
Con respecto al inóculo de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015 se colocaron
4
3
en la muestra un total 1x10 esporas, lo cual resultó equivalente a 1x10 UFC. La
utilización de una solución de esporas de esta cepa generó los resultados que se resumen
en la tabla 17 y se muestran en la figura 23. Los parámetros relevantes de este protocolo
se resumen en la tabla 18. Por tanto, la eficiencia de este protocolo con respecto al número
de colonias viables fue de 0.74%.
-
Paralelamente al ensamblaje de los fragmentos de la construcción pepA y la
estandarización de los protocolos se realizaron ensayos para discriminar y aislar cepas
deficientes en actividad proteolítica. En un inicio se efectuaron ensayos con un medio
basado en leche descremada que ofreció pobres resultados (Mattern et al.1992). Sin
embargo, nuevas pruebas apoyadas en el trabajo de van den Homberg et al. (1995)
permitieron elaborar un medio que contiene gelatina y caseína para ensayos de proteólisis
(ver apéndice para la composición de medios).
Este medio permitió observar de manera clara y evidente la formación de un halo
turbio en las cepas silvestres producto de la proteólisis de la caseína, el cual no se observó
en las cepas transformadas con la construcción (figura 24).
59
-
Figura 21. Esquema de la construcción pepA ensamblada en este trabajo para el
aislamiento de cepas de Aspergillus niger deficientes en proteasas.
5.148 kb.
5.4 kb.
2.7 kb.
2.027 kb.
Figura 22. Gel de electroforesis que muestra el análisis de restricción de la construcción
-
pepA clonada en el vector SK+. Carril 1. Digestión con la enzima EcoRI, que libera la
-
construcción pepA (5.4 kb) y el vector SK+ (2.7kb). Carril 2. Marcador de peso molecular.
-
Carril 3. Digestión con la enzima HindIII, que libera la construcción pepA (5.4 kb) y el
vector SK+ (2.7kb). Las flechas en la figura muestran el peso molecular (kilobases) de la
banda señalada.
Tabla 17. Número de probables transformantes obtenidos con la construcción pepA- con
conidios de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.
Muestra
Control
M1
M2
M3
Número de ondas de
choque
200
100
200
300
Resistentes obtenidos
Cero
57
102
65
60
A.
B.
Figura 23. Cepas generadas durante los protocolos de transformación de Aspergillus niger
por medio de ondas de choque con el gen de resistencia a fleomicina interrumpiendo el
gen de la peptidasa A. Caja marcada con la letra A. Muestra control: colonias
bombardeadas sin ADN y sembradas en medio selectivo (fleomicina 5 µg/ml). Caja
marcada con la letra B. Colonias obtenidas con 200 ondas de choque y sembradas en
medio selectivo con la concentración antes mencionada.
Tabla 18. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de Aspergillus
-
niger por medio de ondas de choque con el gen pepA .
Nombre de la variable
Valores estandarizados
Voltaje
7.6 ± 0.15 kV
Frecuencia de emisión de
ondas de choque
Número de ondas de choque
0.5 Hertz
200
Tipo de inóculo
Conidios
Colonias viables (UFC)
1x103
Cantidad de ADN
50 µg/ml
Volumen de muestra
200 µl
Concentración
con fleomicina
de
selección
5 µg/ml
61
A.
B.
C.
Figura 24. Cepas deficientes en proteasas generadas durante los protocolos de
transformación de Aspergillus niger por medio de ondas de choque. Caja marcada con la
letra A. Muestra control con cepas silvestres de Aspergillus niger crecidas en medio
0
caseína-gelatina incubadas a 30 C. Cajas marcadas con las letras B y C. Colonias
obtenidas con 200 ondas de choque y sembradas en el medio antes mencionado con las
mismas condiciones y en presencia de fleomicina (5 µg/ml). Nótese la ausencia de halo en
B y C.
62
DISCUSIÓN.
1. Transformación genética del hongo Fusarium solani.
El hongo Fusarium solani (Nectria haematococca en su estado sexual) resulta de gran
interés científico, médico y fitopatológico (Coleman et al. 2009). Sin embargo; poco se ha
avanzado en métodos de transformación genética que permitan explotar parte de la
diversidad metabólica de este organismo. Hasta ahora el protocolo de transformación por
protoplastos ha permitido el estudio de la regulación de los genes de cutinasa y pectato
liasas, importantes en el proceso de fitopatogenicidad (Soliday et al. 1989; Yang et al.
2005).
Los rendimientos en estos protocolos de transformación han sido de diez mutantes
7
estables por microgramo de ADN y por 1x10 protoplastos. La eficiencia de este método
fue de 0.0001% con respecto al número de protoplastos. Además de considerar estos
bajos rendimientos, el uso de protoplastos representa un riesgo de formación de células
con poliploidía indeseada (Bradshaw, RE. 2006). Un segundo protocolo con modificaciones
como la adición de sorbitol para mantener la estado osmótico y el uso de una mayor
4
cantidad de polietilenglicol, permitió elevar los rendimientos hasta obtener 1x10 posibles
7
mutantes por microgramo de ADN y 1x10 protoplastos (Crowhurst et al. 1992). La
eficiencia de este protocolo fue de 0.1%.
En la metodología descrita anteriormente se observó que los resultados variaban
de lote a lote de protoplastos y se encontró también que existía una falta de correlación
entre la cantidad de ADN y la eficiencia de transformación. Como señalan los autores esta
variación puede deberse a factores biológicos no definidos que afectan de manera directa
la posibilidad de obtener altas frecuencias de transformación. Los autores no indagaron en
qué consistirían estos factores.
La metodología basada en la transformación mediada por Agrobacterium por otra
parte, ha permitido explorar la enzima quitosanasa como factor de patogenicidad en
63
cultivos de interés comercial como el chícharo. La transformación por medio de este
5
protocolo generó 12 transformantes por cada 1x10 conidios. La eficiencia para esta
metodología fue de 0.012%. (Liu, H. Bao, X. 2009). Como se muestra en el trabajo
mencionado de Crowhurst et al. 1992 no se observa una correlación directa en la cantidad
de ADN utilizado en el proceso de transformación y número de probables mutantes. Por
tanto, la cantidad de ADN no es un parámetro confiable para cuantificar la eficiencia de
estos protocolos.
Es por todo lo anterior, que se decidió comparar en este trabajo la cantidad de
cepas resistentes obtenidas con el número de posibles colonias del organismo contenidas
en el inóculo como medida de la eficiencia. De tal manera, que si bien no es una medida
exacta del éxito del método, si mejora la apreciación de los alcances de determinado tipo
de metodología con respecto a las diferentes opciones de transformación existentes. En
vista de lo anterior, el proceso de transformación propuesto en este trabajo incrementa en
grado sustancial la eficiencia lograda en la inserción de genes de interés. La eficiencia por
medio de ondas de choque, como se detalla en el apartado de resultados, es de 0.6% para
la especie Fusarium solani. Los resultados de este trabajo indican la posibilidad de un
nuevo método de transformación que incrementa la eficiencia y evitaría la aparición de
células poliploides.
2. Transformación genética del hongo Colletotrichum gloeosporioides.
Los protocolos de transformación de este hongo filamentoso con el uso de protoplastos
tienen una eficiencia reportada de 0.0018% (Wei et al. 2004). Esta metodología ha
permitido estudiar la importancia de la transferencia de glicerol como nutriente del
organismo infectado al fitopatógeno. Los estudios de transformación mediada por
Agrobacterium tumefaciens tuvieron una eficiencia de entre 0.005% y 0.013% (de Groot et
al. 1998). Sin embargo, estudios posteriores mostraron una variación en la eficiencia con
valores de 0.00039% para el uso de protoplastos y 0.00046% en la metodología con
64
Agrobacterium (Shamoun et al 2006). Estos valores resultan muy inferiores a los obtenidos
con los primeros protocolos citados.
El protocolo establecido en este trabajo incrementa en varios órdenes de magnitud
la eficiencia de la transformación (7.3% con respecto a las colonias viables), disminuye el
riesgo de la formación de organismos poliploides y nulifica la posibilidad de insertar ADN
bacteriano no deseado como puede ocurrir con Agrobacterium. El uso del promotor
CaMV35S
resultó
funcional
tanto
en
Fusarium
solani
como
en
Colletotrichum
gloeosporioides. La posibilidad de utilizar este promotor derivado del virus del mosaico de
la coliflor ya había sido demostrada por Mullins et al. 2001. No obstante, como se discute
en el trabajo referido, el fenotipo de las cepas mutantes puede variar con el promotor
utilizado. En este trabajo se observó un crecimiento excesivamente lento de las cepas
aisladas, aunque la resistencia a higromicina se mantuvo durante la propagación de las
colonias aisladas.
3. Transformación genética de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
A pesar de que el protocolo establecido en este trabajo presenta una eficiencia ligeramente
superior a los métodos químicos establecidos para la transformación de levadura (0.0086%
contra 0.0019%) y es muy superior al uso de protoplastos (0.00084%) no puede competir
con la eficiencia de protocolos modificados con la adición de ADN de una sola hebra y
choque térmico (eficiencias cercanas al 1%). (Ito et al. 1983; Gietz et al. 1992). Además, en
el protocolo actual de transformación de la levadura Saccharomyces cerevisiae por
métodos químicos y de temperatura se ha demostrado que no ocurre la formación de
células poliploides (Gietz, RD. Woods, RA. 2001).
Esta
combinación
de
alta
eficiencia,
tiempos
relativamente
breves
de
transformación, así como ausencia de problemas de carga génica se deben sin duda a las
propiedades de la pared celular de la levadura, cuya contenido de quitina es muy inferior al
contenido presente en la pared de los hongos filamentosos. La adición de cationes y
65
polietilenglicol son suficientes para inducir la permeabilidad en la pared celular y la captura
de ADN del medio externo.
No obstante que el método propuesto en este trabajo no compite con el método
estándar de transformación en la levadura Saccharomyces cerevisiae en los valores de
eficiencia, proporciona valiosa información respecto a los alcances del uso de ondas de
choque para la inserción de genes de interés. Es decir, la transformación por medio de
ondas de choque no está limitada en a hongos filamentosos, también es posible introducir
ADN de interés en células de levaduras como se demuestra.
El protocolo establecido señala que es posible transformar células con genes que
confieren prototrofía a un metabolito específico. Además el protocolo utilizado no está
optimizado porque muchos parámetros físicos no fueron modificados para observar si
existe variación en la eficiencia del método. Por ejemplo, pueden utilizarse diferentes
voltajes. También existe la posibilidad de utilizar ondas de choque en tándem. En esta
modalidad dos ondas de choque son generadas con un ligero retraso de una respecto a la
otra con el fin de incrementar los efectos de daño mecánico en los cálculos renales (Loske
et al. 2002. Loske, AM. 2007).
Es probable que la adición de una segunda onda de choque incremente el efecto
de la cavitación acústica en las vecindades de la célula y por tanto, permita la formación de
mayor número de microjets en el líquido de la suspensión celular. La exploración de las
modalidades antes mencionadas quizá permita un incremento de la eficiencia de la
transformación en Saccharomyces cerevisiae y sin duda, permitirá una mayor comprensión
de los mecanismos que permiten la captura de ADN en levaduras por medio de ondas de
choque.
66
4. Transformación genética del hongo Aspergillus niger.
Como se describió anteriormente, el hongo filamentoso Aspergillus niger presenta
actividades metabólicas y de secreción que lo convierten en un fuerte candidato para
convertirse en uno de los organismos más prometedores para ser utilizados como
biofábricas en un futuro cercano (Nevalainen et al. 2005; Karnaukhova et al. 2007;
Lubertozzi, D. Keasling, JD. 2009). No obstante, hasta ahora continúan utilizándose
mutaciones aleatorias inducidas por luz ultravioleta o agentes químicos para la obtención
de cepas con determinadas características (Lotfy et al. 2007).
La utilización de estos agentes mutagénicos puede interferir con rutas metabólicas
importantes en este microorganismo y disminuir su tasa de crecimiento o de secreción.
Además, la maquinaria de reparación celular puede revertir las mutaciones en las
secuencias de ADN modificadas, con la consecuente pérdida del fenotipo de interés
(Goldman et al. 2002).
Los métodos actuales de transformación incluyen la utilización de protoplastos y el
uso de Agrobacterium tumefaciens como vector de transformación (Meyer et al. 2007; de
Groot et al. 1998). El uso de protoplastos ha sido desde finales del siglo pasado el método
más utilizado en la transformación de Aspergillus niger. La obtención de cepas auxótrofas o
con sensibilidad toxigénica a cierto tipo de compuestos han permitido el aislamiento de
mutantes con fenotipos de interés. Los rendimientos de los protocolos de protoplastos son
cercanos al 0.005% y en casos extraordinarios al 0.01% (Meyer et al. 2007; Lubertozzi, D.
Keasling, JD. 2009). A pesar de ello la gran cantidad de protoplastos utilizados permite la
obtención de mutantes con la inserción genética deseada. La formación de poliploides y el
intercambio genético en cepas vegetativamente incompatibles fueron comprobados en
Aspergillus nidulans y hasta ahora es un problema no resuelto en el uso de protoplastos de
cualquier especie de hongos filamentosos.
Muchas especies del género Aspergillus son susceptibles de transformación
mediante Agrobacterium con rendimientos relativamente buenos (Michielse et al. 2004;
67
Michielse et al. 2005). En la especie Aspergillus awamori, por ejemplo, se obtuvo un
rendimiento del 0.04% en el protocolo desarrollado por de Groot et al. 1998. La eficiencia
reportada por de Groot et al. para Aspergillus niger fue de apenas 0.00005% y hasta ahora
no existe un protocolo reportado que mejore estos resultados.
Usando el protocolo de ondas de choque se plantea un mejor escenario para la
genómica funcional de este organismo. En los dos protocolos desarrollados en este trabajo
se observó una eficiencia bastante superior a los métodos convencionales (0.53% y
0.74%). Esta eficiencia fue validada por ensayos de reacción en cadena de la polimerasa y
la visualización de la proteína verde fluorescente. También este protocolo permitió el
aislamiento de cepas deficientes en proteasas sin realizar un mutagénesis aleatoria con
agentes químicos o luz ultravioleta. Este procedimiento, al utilizar una secuencia que
promovía la recombinación homóloga, redujo notablemente la cantidad de tiempo de
análisis en el aislamiento de cepas de interés.
En este trabajo se desarrollaron por vez primera protocolos reproducibles de
transformación genética de hongos mediante ondas de choque. Los protocolos se
caracterizaron por una mayor eficiencia, mayor facilidad y menor cantidad de trabajo para
obtener transformantes. A pesar de que no se conocen los mecanismos precisos de
transformación, los resultados de este trabajo sugieren la posibilidad de transformar
multitud de organismos de manera reproducible, eficiente y funcional. Como se mencionó
anteriormente, la transformación genética sigue siendo un obstáculo para el estudio y
utilización de varios hongos (por ejemplo, los basiodiomicetos). Con este protocolo, que se
presenta por primera vez, se abre la posibilidad de modificar especies que antes no se
podían manipular genéticamente.
68
CONCLUSIONES.
1. Es posible transferir secuencias de ADN en hongos mediante ondas de choque.
2. Las secuencias de ADN insertadas pueden expresarse de manera funcional en los organismos
modificados.
3. La eficiencia de los protocolos establecidos son mayores a los de los métodos
convencionalmente utilizados y no implican el uso de protoplastos.
4. La metodología de transformación genética por medio de ondas de choque permite el
aislamiento de cepas de interés con un gen específico, como se demostró con las cepas
deficientes en proteasas.
69
BIBLIOGRAFÍA.
Andersen, MR. Nielsen, ML. Nielsen, J. 2008. Metabolic model integration of the bibliome, genome,
metabolome and reactome of Aspergillus niger. Molecular Systems Biology. 4(178).
Armaleo, D. Ye, GN. Klein, TM., Shark, KB. Sanford, JC. Johnston, SA. 1990. Biolistic nuclear
transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Current Genetics. 17:97-103.
Bailey, AM. Mena, G L. Herrera-Estrella L. 1993. Transformation of four Phytophthora spp by
microprojectile bombardment of intact mycelia. Current Genetics. 23:42-46.
Bowman, SM. Free, SJ. 2006. The structure and synthesis of the fungal cell wall. Bioessays.
28:799-808.
Bradshaw, RE. 2006. From protoplasts to gene clusters. Mycologist. 20:133-139.
Broekhuijsen, M. Mattern, I. van den Hondel, C. 1993. Secretion of heterologous proteins by
Aspergillus niger: production of actives human interleukin-6 in a protease deficient mutant by KEX-2
like processing of a glucoamylase-hiL6 fusion protein. Journal of Biotechnology. 31(2):135-145.
Bundock, PA. Dulk-Ras, A. Beijersbergen. Hooykaas, PJ. 1995. Trans-kingdom T-DNA transfer
from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. Journal of Molecular Biotechnology
(Europe). 14:3206–3214.
Calvin, NM. Hanawalt, PC. 1988. High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation.
Journal of Bacteriology. 170(6):2796-2801.
Coleman, JJ. Rounsley, SD. Rodriguez-Carres, M. Kuo, A. Wasmann, CC. Grimwood, J. Schmutz,
J. Taga, M. White, GJ. Zhou, S. Schwartz, DC. Freitag, M. Ma, LJ. Danchin, EG. Henrissat, B.
Coutinho, PM. Nelson, DR. Straney, D. Napoli, CA. Barker, BM. Gribskov, M. Rep, M. Kroken, S.
Molnár, I. Rensing, C. Kennell, JC. Zamora, J. Farman, ML. Selker, EU. Salamov, A. Shapiro, H.
Pangilinan, J. Lindquist, E. Lamers, C. Grigoriev, IV. Geiser, DM. Covert, SF. Temporini, E.
70
Vanetten, HD.
2009. The genome of Nectria haematococca: contribution of supernumerary
chromosomes to gene expansion. PLos Genetics. 5(8).
Crowhurst, RN. Rees-George, J. Rikkerink, EH. Templeton, MD. 1992. High efficiency
transformation of Fusarium solani f. sp. cucurbitae race 2 (mating population V). Current Genetics.
21(6):463-469.
Crum, LA. 1979. Surface oscillations and jet development in pulsating bubbles. Journal of Physique
Colloques. 40:285-288.
Crum, LA. 1988. Cavitation microjets as a contributory mechanism for renal calculi disintegration in
ESWL. Journal of Urology. 140(6):1587-1590.
Deshpande, N. Wilkins, MR. Packer, N. Nevalainen, H. 2008. Protein glycosilation pathways in
filamentous fungi. Glycobiology. 18(8):626-637.
Drocourt, D. Calmels, T. Reynes, JP. Baron, M. Tirabyl, G. 1990. Cassettes of the
Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to
phleomycin resistance. Nucleic Acids Research. (18)13:4009
Finer, J. Vain, P. Jones, M. Michael D. McMullen, M. 1992. Development of the particle inflow gun
for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Reports. 11:323-328.
Gambihler, S. Delius, M. Ellwart, JW. 1994. Permeabilization of the plasma membrane of L1210
mouse leukemia cells using lithotripter shock waves. Journal of Membrane Biology. 141:267-275.
Gietz, RD. Jean, S. Woods, RA. Schiestl, RH. 1992. Improved method for high efficiency
transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Research. 20:1425.
Gietz, RD. Woods, RA. 2001. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30(4): 816-832.
de Groot, MJ. Bundock, P. Hooykaas, PJ. Beijersbergen, AG. 1998. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16:839–842.
71
Goldman, GH. McGuire, SL. Harris, SD. 2002. The DNA damage response in filamentous fungi.
Fungal Genetics Biology. 43:531-544.
Herzog, R W. Daniell, H. Singh, NK. Lemke, P A. 1996. A comparative study on transformation of
Aspergillus nidulans by microprojectile bombardment of conidia and a more conventional procedure
using protoplasts treated with polyethylene glycol (PEG). Applied Microbiology Biotechnology.
45:333-337.
Imai, E. Isaka, Y. 2002. Gene electrotransfer: Potential for gene therapy of renal diseases. 61:S37S41.
Ito, H. Fukuda, Y. Murata, K. Kimura, A. 1983. Transformation of intact yeast cells with alkali
cations. Journal of Bacteriology. 153(1):163-168.
Kaminsjkyj, SG. 2001. Fundamentals of growth, storage, genetics and microscopy of Aspergillus
nidulans. Fungal Genetics Newsletter. 48(1).
Karnaukhova, E. Ophir, Y. Trinh, L. Shiloach, J. 2007. Expression of human α1-proteinase inhibitor
in Aspergillus niger. Microbial Cell Factories. Vol. 6. No. 34.
Klaseboer, E. Fong, SW. Turangan, CK. Khoo, BC. Szeri, AJ. Calvisi, ML. Sankin, MN. Zhong, P.
2007. Interaction of lithotripter shockwaves with single inertial cavitation bubbles. Journal of Fluid
Mechanics. 593:37-56.
Kumari, JA. Panda, T. 1994. Intergeneric hybridisation of Trichoderma reesei and Saccharomyces
cerevisiae by protoplast fusion. Enzyme and Microbial Technology. 16: 870–882.
Li, A. Altosaar, I. Heath, MC. Horgen, P. 1993. Transient expression of the beta-glucuronidase gene
delivered into urediniospores of Uromyces appendiculatus by particle bombardment.
Canadian
Journal Plant Pathology. 15:1-6.
Lacroix, B. Tzvi, T. Vainstein, A. Citovsky, V. A case of promiscuity: Agrobacterium’s endless hunt
for new partners. Trends in Genetics. 22(1):29-37.
72
Lacroix, B. Loyter, A. Citovsky, V. 2008. Association of the Agrobacterium tumefaciens T-DNAprotein complex with plant nucleosomes. Proceedings of National Academy of Sciencies of the
USA. 105(40):15429-15434.
Lauer, U. Bürgelt, E. Squire, Z. Messmer, K. Hofschneider, PH. Gregor, M. Delius, M. 1997. Shock
wave permeabilization as a new gene transfer method. Gene Therapy. 4:710-715.
Liu, H. Zhang, B. Li, C. Bao, X. 2010. Knock down of chitosanase expression in phytopathogenic
fungus Fusarium solani and its effect on pathogenicity. Current Genetics. 56:275–281.
Liu, H. Bao, X. 2010. Overexpression of the chitosanase gene in Fusarium solani via Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation. Current Microbiology. 58:279–282.
Lotfy, WA. Ghanem, KM. El-Helow, ER. 2007. Citric acid production by a novel Aspergillus niger
isolate: I. Mutagenesis and cost reduction studies. Bioresource Technology. 98(18):3464-3469.
Lorito, M. Hayes, CK. Di Pietro, A. Harman, GE. 1993. Biolistic transformation of Trichoderma
harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Genetics. 24:349-356.
Loske, AM. Prieto, FE. Fernández, F. van Caywelaert. 2002. Tandem shock wave cavitation
enhancement for extracorporeal lithotripsy. Physics in Medicine and Biology. 47:3945-3957.
Loske, AM. 2007. Shock wave physics for urologists. Centro de Física Aplicada y Tecnología
Avanzada, UNAM, Querétaro, México. ISBN 978-970-32-4377-8.
Lubertozzi, D. Keasling, JD. 2009. Developing Aspergillus as a host for heterologous expression.
Biotechnology Advances. 27:53-75.
Maras, M. van Die, I. Contreras, R. van den Hondel, CA. 1999. Filamentous fungi as production
organism for glycoproteins of bio-medical interest. Glyconjugate Journal. 16:99-107.
Meyer, V. Arentshorst, M. El-Ghezal, A. Drews, AC. Kooistra, R. van den Hondel, CA, Ram, AF.
2007. Highly efficient gene targeting in the Aspergillus niger kusA mutant. Journal of Biotechnology.
128(4):770-775.
73
Meyer, V. 2008. Genetic engineering of filamentous fungi-progress, obstacles and future trends.
Biotechnology Advances. 26:177-185.
Mattern, I. van Noort, J. van den Berg, P. van den Hondel, C. 1992. Isolation and characterization
of mutants of Aspergillus niger deficient in extracelular proteases. Molecular Genome Genetics.
(2):232-236.
Michielse, CB. Ram, AF. Hooykaas, PJJ. van den Hondel, CAM. 2004. Role of bacterial virulence
proteins in Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus awamori. Fungal Genetics and
Biology. 41:571–578.
Michielse, CB. Hooykaas, PJ. van den Hondel, CAMJJ. Ram, AFJ. 2005. Agrobacterium-mediated
transformation as a tool for functional genomics in fungi. Current Genetics. 48:1–17.
Mullins, ED. Chen, X. Romaine, P. Raina, R. Geiser, DM. Kang, S. 2001. Agrobacterium-mediated
transformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene
transfer. Phytopathology. (91)2:173-180.
Neumann, E. Schaefer-Ridder,M. Wang, Y. Hofschneider, PH. 1982. Gene transfer into mouse
lyoma cells by electroporation in high electric fields. Journal of Molecular Biotechnology (Europe).
1(7):841-845.
Nevalainen, H. Te´o, V. Bergquist, P. 2005. Heterologous protein expression in filamentous fungi.
Trends in Biotechnology. 23(9): 468-474.
Nevoigt, E. 2008. Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology
and Molecular Biology Reviews. 72(3): 379-412.
Newman, CMH. Bettinger, T. 2007. Gene therapy progress and prospects: Ultrasound for gene
transfer. Gene Therapy. 14:465-475.
74
O'Connell, R. Herbert, C. Sreenivasaprasad, S. Khatib, M. Esquerré-Tugayé, MT. Dumas, B. 2004.
A novel Arabidopsis-Colletotrichum pathosystem for the molecular dissection of plant-fungal
interactions. Molecular Plant Microbe Interactions. 17(3):272-282.
Ohl, CD. 2002. Cavitation inception following shock wave passage. Physics of Fluids. 14(10):35123521.
Peberdy. 1979. Fungal protoplasts: Isolation, reversion and fusion. Annual Review of Microbiology.
33: 21–39.
Pel, HJ. de Winde, JH. Archer, DB. Dyer, PS. Hofmann, G. Schaap, PJ. Turner, G. de Vries, RP.
Albang, R. Albermann, K. Andersen, MR. Bendtsen, JD. Benen, JA. van den Berg, M. Breestraat,
S. Caddick, MX. Contreras, R. Cornell, M. Coutinho, PM. Danchin, EG et al. 2007.
Genome
sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88. Nature
Biotechnology 25: 221–231.
Popper, Lutz. 2009. Enzymes in breadmaking: Economic relevance, markets, and future
perspectives. Grain & Feed Milling Technology. July-August, 2009. 34-38.
Punekar N. S., Suresh Kumar S. V., Jayashri T. N. 2003. Isolation of genomic DNA from acetonedried Aspergillus mycelia. Fungal Genetics Newsletter 50.
Punt, PJ. Schuren, FH. Lehmbeck, J.
Christensen, T. Hjort, C. van den Hondel, C. 2008.
Characterization of the Aspergillus niger prtT, a unique regulator of extracellular protease encoding
genes. Fungal Genetics and Biology. 45:1591-1598.
Ruiz-Díez, B. 2002. Strategies for the transformation of filamentous fungi. Journal of Applied
Microbiology. 92:189-195.
Ruepp, A. Zollner, A. Maier. D. Albermann, K.
Mewes, HW. 2004. The FunCat, a functional
annotation scheme for systematic classification of proteins from whole genomes. Nucleic Acids
Research. 32:5539–5545.
75
Sambrook, DJ. Fritsch, EF. Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y.
Shamoun, SF. Williams, H. Tanguay, P. Breuil, C. 2006. PEG- and Agrobacterium - mediated
transformation of the hyperparasite Colletotrichum gloeosporioides with a green fluorescent protein
.Phytopathology. 96(6). Suppl.S107.
Smith, F D. Gadoury, DM. Harpending, PR. Sanford, JC. Transformation of a powdery mildew,
Uncinula necator, by microprojectile bombardment. Phytopathology. 82: 247-248.
Soccol, CR. Vandenberghe, LP. Rodrigues, C. Pandey, A. 2006. New perspectives for citric acid
production and application. Food Technology and Biotechnology. 44(2): 141–149.
Soliday, CL. Dickman, MB. Kolattukudy, PE. 1989. Structure of the cutinase gene and detection of
promoter activity in the 5'-flanking region by fungal transformation.
Journal of Bacteriology.
171(4):1942-1951.
Sunagawa, M. Murata, H. Miyazaki, Y. Nakamura, M. 2007. Transformation of the mycorrhizal
basidiomycetes,
Suillus grevillei and S. bovinus, by particle bombardment. Bioscience
Biotechnology and Biochemistry. 71(1):47-50.
Ülker, B. Li, Y. Rosso, MG. Logemann, E. Somssich, IE. Weisshaar, B. 2008. T-DNA–mediated
transfer of Agrobacterium tumefaciens chromosomal DNA into plants. Nature Biotechnology.
26(9):1015-1017.
van den Homberg, JP. van der Vondervoort, PJ. Van der Heijden, NC. Visser, J. 1995. New
protease mutants in Aspergillus niger result in strongly reduced in vitro degradation of target
proteins; genetical and biochemical characterization of seven complementation groups. Current
Genetics. 28:299-308.
Wei, Y. Shen, W. Dauk, M. Wang, F. Selvaraj, G. Zou, J. 2004.Targeted gene disruption of glycerol3-phosphate dehydrogenase in Colletotrichum gloeosporioides reveals evidence that glycerol is a
76
significant transferred nutrient from host plant to fungal pathogen. Journal Biological Chemistry.
279(1):429-435.
Yang, Z. Rogers, LM. Song, Y. Guo, W. Kolattukudy, P. 2005. Homoserine and asparagine are host
signals that trigger in planta expression of a pathogenesis gene in Nectria haematococca.
Proceedings of National Academy of Sciencies (USA). 102(11):4197–4202.
Zarnitsyn, V. Rostad, CA. Prausnitz, MR. 2008. Modeling transmembrane transport through cell
membrane wounds created by acoustic cavitation. Biophysical Journal. (95):4124–4138.
Zhu, J. Oger, PM. Schrammeijer, B. Hooykaas, PJ. Farrand, SK. Winans, SC. 2000. The bases of
crown gall tumorigenesis. Journal of Bacteriology. 182:3885–3895.
77
APÉNDICE.
Medios de cultivo utilizados en este trabajo.
1. Medio mínimo para Aspergillus.
Glucosa
10 g
20X Nitratos
50 ml
1000X Trazas
1 ml.
1% Tiamina
1 ml
Aforar a un litro, ajustar el pH de 6.0 a 6.5 con NaOH 0.1 N.
20X Nitratos
NaNO3
120 g.
KCl
50 ml.
MgSO4
10.4 g.
KH2PO4
30.4 g.
1000X Trazas
Agua destilada 60 ml
ZnSO4 7H2O
2.2 g
H3BO3
1.1 g
MnCl2.4 H2O
0.5 g
FeSO4.7 H2O
0.5 g
78
CoCl2 6 H2O
0.17 g
CuSO4.5 H2O
0.16 g
Na2MoO4.2 H2O
0.15 g
Na4EDTA
5g
2. Medio YPD.
Extracto de levadura.
10 g
Peptona.
20 g
Glucosa.
20 g
Aforar a un litro y autoclavar.
3. Medio YMM.
Base nitrogenada.
6.68 g
Glucosa.
20 g
Dropo out.
10 ml
Agar
20 g
Aminoácidos (Stocks al 1%).
Adenina.
1 ml.
Tirosina.
3 ml.
Uracilo.
4 ml.
Histidina.
1 ml.
Leucina.
6 ml.
Triptófano.
4 ml.
Aforar a un litro y autoclavar.
79
Drop out. 100x. (Componentes para un litro).
Arginina.
2g
Isoleucina.
6g
Lisina.
4g
Metionina.
1g
Fenilalanina.
6g
Treonina.
5g
4. Medio caseína y gelatina.
Glucosa
9g
20X Nitratos
50 ml
1000X Trazas
1 ml
1% Tiamina
1 ml
Gelatina
10 g
Caseína
10 g
Casaminoácidos
5g
Tritón
100 µl
Aforar a un litro, ajustar el pH de 6.0 a 6.5 con NaOH 0.1 N.
80