Resumen La enfermedad de Parkinson se caracteriza

Resumen
La enfermedad de Parkinson se caracteriza por la degeneración y muerte
selectiva de las neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra (Aguila et
al., 2012). La pérdida de esta población celular trae como consecuencia un
déficit de dopamina en el estriado generando los trastornos motores
característicos de la enfermedad tales como temblor, rigidez, bradicinesia,
entre otros (Aguila et al., 2012). La terapia celular basada en trasplantes de
tejido mesencefálico ha sido empleada en la enfermedad de Parkinson
(Mendez et al., 2008, Lindvall and Bjorklund, 2011). Algunos de los
pacientes trasplantados han mostrado una mejoría considerable de los
síntomas motores (Kefalopoulou et al., 2013), sin embargo la poca
disponibilidad de esta fuente celular y los aspectos éticos asociados a su
uso constituyen una limitación importante. Adicionalmente, pacientes
trasplantados con esta fuente celular han manifestado complicaciones
motoras conocidas como discinesias inducidas por el trasplante (GID, de
sus siglas en ingles); frecuentemente relacionado con la presencia de
neuronas serotonérgicas (Brundin et al., 2010, Aguila et al., 2012). Esto
evidencia la escasa estandarización del tejido mesencefálico a trasplantar y
una composición celular heterogénea donde solo alrededor de un 5 %
representa neuronas dopaminérgicas (Silani et al., 1994, Brundin et al.,
2010, Aguila et al., 2012).
Las células pluripotentes, por su capacidad de autorenovación y
potencialidad para dar lugar a cualquier tipo celular son una fuente
atractiva e ilimitada, al menos en teoría. Sin embargo, estas propiedades
también complican la posibilidad de generar in vitro una población celular
homogénea.
El
establecimiento
de
protocolos
de
diferenciación
dopaminérgica a partir de fuentes pluripotentes y su capacidad para
1
integrarse y revertir síntomas motores en distintos modelos de Parkinson ha
generado gran expectativa con vistas a su posible aplicación clínica (Lee et
al., 2000, Hedlund et al., 2008, Sanchez-Pernaute et al., 2008, Kriks et al.,
2011, Ganat et al., 2012, Xi et al., 2012). Sin embargo, su empleo en la
medicina regenerativa está condicionada a la capacidad para desarrollar
protocolos de diferenciación más eficientes en combinación con métodos
de selección (Pruszak et al., 2007, Hedlund et al., 2008, Aguila et al., 2012,
Ganat et al., 2012).
En este sentido, el trabajo realizado en esta tesis se ha dirigido a desarrollar
una estrategia de selección de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas
derivadas de fuentes pluripotentes basada en la expresión de Foxa2. Este
marcador es un factor de transcripción expresado por las neuronas
dopaminérgicas mesencefálicas de forma temprana durante el desarrollo
embrionario y juega un papel esencial en su especificación y diferenciación
(Ferri et al., 2007, Kittappa et al., 2007). Su expresión, restringida a este
grupo de neuronas dopaminérgicas, se mantiene durante el desarrollo en el
adulto regulando su identidad y supervivencia (Kittappa et al., 2007, Stott
et al., 2013).
Para la selección de neuronas de neuronas dopaminérgicas mesencefálicas
derivadas de fuentes pluripotentes, hemos desarrollado vectores lentivirales
que expresan diferentes reporteros controlados por dos secuencias
promotoras del gen de Foxa2. Una de las secuencias reguladoras incluye el
promotor de 400pb del gen Foxa2 y la otra secuencia contiene
adicionalmente 1200pb del primer intrón y exón (no codificantes). Para
comprobar la especificidad de estos vectores utilizamos líneas celulares
humanas y murinas con expresión diferencial de Foxa2 y como genes
reporteros la proteína fluorescente verde (GFP) o el gen de resistencia a
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puromicina (PAC). En estos experimentos de selectividad, solamente el
vector lentiviral que incluye la secuencia promotora de 400pb resultó
funcional, específico y sensible a la expresión endógena de Foxa2 para
regular la expresión del gen reportero; demostrando ser una herramienta
útil y flexible para la selección de células Foxa2pos.
Como requisito indispensable para la validación y selección de neuronas
Foxa2pos, primero confirmamos la expresión endógena de este factor de
transcripción en progenitores mesencefálicos ventrales y neuronas
dopaminérgicas derivadas de células pluripotentes murinas, recapitulando
in vitro el desarrollo embrionario de las neuronas dopaminérgicas
mesencefálicas. Luego verificamos la especificidad de este vector en dicho
contexto neuronal, ratificando su versatilidad para seleccionar poblaciones
Foxa2pos derivadas de cualquier fuente celular.
En primer lugar empleamos los lentivirus para la selección de neuronas
dopaminérgicas derivadas de células embrionarias murinas. En este
contexto, utilizamos el vector FOXA2.PAC para seleccionar con
puromicina progenitores neurales murinos que expresan Foxa2. Sin
embargo, el uso de puromicina como paradigma de selección mostró un
alto grado de toxicidad por lo cual el resto de los experimentos los
realizamos con el vector FOXA2.GFP en combinación con separación
celular por FACS (fluorescence-activated cell sorting).
Durante la infección y selección por FACS, en algunos experimentos
empleamos como control otro vector lentiviral que expresa de forma
constitutiva la GFP (CMV.GFP). Con este vector, optimizamos la
transducción y pudimos evaluar la capacidad de la fracción celular GFPpos
seleccionada para integrarse y sobrevivir en el cerebro de ratas
hemiparkinsonianas, previamente lesionadas con 6-hydroxidopamina. En
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este experimento de trasplante celular, resultó evidente la necesidad de
eliminar durante la selección las células indiferenciadas que permanecen
proliferando en el cultivo. Para conseguirlo optimizamos un marcaje
extracelular para SSEA1, una proteína de membrana de las células
embrionarias murinas, que durante el proceso de FACS descartamos en las
fracciones GFP. Dichas fracciones post-FACS mostraron un alto grado de
pureza y se caracterizaron de forma inmediata por PCR cuantitativa e
immunofluorescencia. La flexibilidad de este vector y su capacidad para
enriquecer una población Foxa2posGFPpos derivada de células pluripotentes
murinas nos motivó a investigar su utilidad para seleccionar progenitores
dopaminérgicos derivados de células pluripotentes humanas, una fuente
celular con aplicaciones más relevantes.
Para la diferenciación dopaminérgica derivada de células embrionarias
humanas, empleamos factores que favorecen de forma eficiente la
inducción neural con una identidad regional típica del mesencéfalo ventral,
donde se originan las neuronas dopaminérgicas (Perrier et al., 2004,
Sanchez-Pernaute et al., 2008, Kriks et al., 2011). De forma similar a los
progenitores neurales murinos, la transducción lentiviral de progenitores
neurales humanos con el vector FOXA2.GFP se realizó alrededor de la
cuarta semana in vitro (estadio de expansión).
La especificidad de este vector en un contexto neuronal humano y su
utilidad para seleccionar poblaciones Foxa2pos se comprobó en diferentes
líneas
pluripotentes
que
dan
lugar
a
neuronas
dopaminérgicas
mesencefálicas en los estadios más avanzados de diferenciación. La
caracterización de las fracciones GFP a partir de la selección por FACS se
realizó de forma inmediata por PCR cuantitativa en la mayoría de los
experimentos.
En
otros
casos,
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pudimos
caracterizar
por
immunofluorescencia las fracciones GFP mantenidas in vitro a partir de cocultivos con astrocitos estriatales irradiados, los cuales mejoran la
viabilidad post-FACS (Hedlund et al., 2008).
Como resultado de la selección por FACS, la fracción GFPpos de
progenitores murinos y humanos transducidos con el vector FOXA2.GFP,
mostró un enriquecimiento para marcadores mesencefálicos ventrales. Sin
embargo, con esta estrategia no purificamos ninguna población neuronal
sino que enriquecemos en una población Foxa2pos con un fenotipo de placa
basal mesencefálica, con expresión de marcadores típicos de esta región
que además de Foxa1/2, incluyen moléculas como netrina y F-espondina.
Finalmente, empleamos un vector retroviral para sobre expresar Foxa2 en
progenitores neurales humanos como una estrategia alternativa para validar
nuestro paradigma de selección basado en la expresión endógena de Foxa2.
En estos experimentos comprobamos que la selección de células humanas
sobre-expresando Foxa2 genera una población enriquecida en marcadores
mesencefálicos ventrales similar a la obtenida con el vector basado en la
expresión endógena. Estos resultados descartan que la incapacidad del
promotor Foxa2 (400pb) para enriquecer en neuronas dopaminérgicas
durante la selección endógena sea debida a causa técnicas. Adicionalmente,
el cultivo prolongado de células transducidas para sobre-expresar Foxa2 y
mantenidas en condiciones de diferenciación terminal, también dio lugar a
una población mayoritaria de progenitores mesencefálicos ventrales con
características de radial-glia.
De forma conjunta, nuestros resultados sugieren que el factor de
transcripción
Foxa2
no
es
suficiente para
seleccionar neuronas
dopaminérgicas derivadas de células pluripotentes. Sin embargo, este
vector lentiviral es una herramienta útil para seleccionar poblaciones
5
Foxa2pos derivadas de cualquier fuente pluripotente, incluidas las IPSCs
(induced pluripotent stem cells); enriqueciendo un fenotipo de placa basal
que permitiría el estudio in vitro de importantes funciones biológicas del
desarrollo
como
la
ventralización
tisular
posicionamiento y diferenciación neuronal
del
tubo
neural,
el
e incluso la generación de
organoides neurales de forma más homogénea y estructurada.
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