Estudio inicial de Pseudomonas fitopatógenas aisladas de

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOLOGÍA
ESTUDIO INICIAL DE Pseudomonas FITOPATÓGENAS
AISLADAS DE DAÑOS EN PLANTAS DE ESTROPAJO,
PINO Y TOMATE DE CULTIVOS VERACRZANOS
TESIS
TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL
QUE PRESENTA:
GABRIEL CASTRO MASEGOSA
DIRECTOR: MAURICIO LUNA RODRÍGUEZ
XALAPA, VER.
AÑO 2012
DEDICATORIA
A mi madre, BEATRIZ MASEGOSA CONTRERAS. A esa mujer hermosa que ha llenado mi
vida de amor y que inculcó valores a manos llenas, que siempre ha sabido escuchar y
comprenderme y que nunca limitó sus esfuerzos para darme todo lo que necesité. Hoy te prometo
que responderé a la altura de todos los retos que se me presenten en la vida, porque no me menos.
Sólo puedo desear que, cuando llegue el momento, yo logre ser un gran padre para mis hijos tal
como fuiste conmigo.
Te amo.
A mi primo FERNANDO HERNÁNDEZ MASEGOSA, por el apoyo y el cariño que me ha
brindado. Gracias por enseñarme la unión familiar. En el tiempo que hemos estado juntos te has
convertido en una figura paterna en mi vida.
Te estaré agradecido siempre.
A mi tía GISELA MASEGOSA CONTRERAS, una persona excepcional que siempre tuvo
cariño incondicional para todos. Te nos adelantaste en el camino y jamás podremos asimilar tu
partida inesperada. Sabemos que estás en la gloria de Dios, porque te ganaste el cielo estando en
la tierra.
“Tus palabras, ahora son como un lastre de caricias que nos hacen falta”.
A mi FAMILIA, que han sido el motor que me mueve para alcanzar mis logros. No sé qué sería
de mí sin los momentos tan alegres que hemos pasado juntos.
ii
AGRADECIMIENTOS
A Crys Ortega, por el apoyo incondicional que me ha brindado. Gracias por permitirme
disfrutar de tu compañía, por darme palabras de aliento en todo momento y por confiar siempre
en mí. Por decirme las cosas como son en lugar de decirme lo que quería escuchar, y por haber
estado conmigo en los peores momentos que he vivido. Siempre estarás en mi corazón.
Al Ph. D. Mauricio Luna Rodríguez, un ejemplo a seguir. Gracias por creer en mí y por lo
que me ha enseñado desde el día en que llegué al laboratorio y hasta la presentación de este
trabajo. Pero, sobre todo, muchas gracias por la amistad brindada, por los buenos consejos que
me ha dado, por animarme a seguir adelante y por el apoyo en los momentos difíciles.
A la Ph. D. Beatriz Palmeros Sánchez, por su buena disposición para mejorar este trabajo
y por sus comentarios tan acertados. Sus sólidas enseñanzas en clase impactaron fuertemente en
mi formación profesional.
A mi gran amigo, el Biólogo Marco Tulio Solano, otra persona que siempre me dio
ánimos y apoyo, que creyó en mí hasta cuando yo dudé de lo que podía lograr. Gracias por los
grandes consejos que me has dado, por las pláticas amenas y las discusiones en las que siempre
terminamos. Sin lugar a duda, mi estancia en el laboratorio hubiera sido más tediosa sin tus
bromas de mal gusto.
A Diana Barceló, Alejandro Guzmán, Carlos Lobato, Liliana Aguilar y Doña Olga. No
me imagino una estancia tan larga sin buenos amigos con quienes platicar alegremente y en quien
apoyarse cuando se necesita ayuda. Los voy a extrañar mucho.
¡A mi súper equipo! Desiree De La Cruz y Rayenari Torres, gracias por enseñarme la
funcionalidad grupal en el laboratorio y en campo, por aquellos buenos momentos y por otros, no
tan buenos, de regaños quizá merecidos.
iii
A mis amigos de la carrera: Saraí Farías, Luis Herbert, Alfredo Rosas, Octavio Córdova,
Alfonso Aceves, Pablo Palma, Paco Magaña, Luis Carrillo, Eduardo León, Bruno Cruz, Beu
Hernández, Verónica Morales, Alejandra Alamillo, Omar Oltehua, José Colmenares, Anahí
Ceibo, Julieta Álvarez y Omar Olivares. Gracias por aquellos buenos momentos de sonrisas, de
bromas, de baile y hasta de tonterías. Me hicieron muy amena la trayectoria en la facultad.
A Mary Tinoco Cruz, muchas gracias por haberme sacado de tantos apuros y por
facilitarme material para continuar con mis experimentos. Créeme, fue de gran ayuda.
A los doctores Clementina Barrera y Armando Lozada, por guiarme en este camino y
hacer que mi trabajo mejorara considerablemente.
Al Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa por haberme proporcionado el espacio,
equipo y reactivos para la realización de este trabajo.
iv
ÍNDICE
Página
RESUMEN
I.
INTRODUCCIÓN
1
II.
ANTECEDENTES
4
2.1
Generalidades e importancia de las especies vegetales con
4
problemas fitosanitarios en estudio
2.2
2.3
2.1.1 El cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill.)
4
2.1.2 El cultivo de estropajo (Luffa cylindrica)
7
2.1.3 El cultivo de pino (Pinus patula)
9
Bacterias fitopatógenas
10
2.2.1 El género Pseudomonas
11
Problemática taxonómica de Pseudomonas
11
Impacto del gen 16S rRNA en el estudio del género
13
Pseudomonas
2.4
Estudio de Pseudomonas en México
16
III.
OBJETIVOS
18
3.1
Objetivo general
18
3.2
Objetivos específicos
18
IV.
MATERIAL Y MÉTODOS
19
4.1
Material biológico
19
4.2
Resguardo de cepas
19
4.3
Caracterización fenotípica
20
4.4
Análisis del gen 16S rRNA
22
4.4.1 Extracción de DNA genómico
22
v
4.4.2 Evaluación de la integridad del DNA genómico
23
4.4.3 Amplificación parcial del gen 16S rRNA
23
4.4.4 Purificación de los productos de amplificación
24
4.4.5 Secuenciación de productos amplificados
25
4.4.6 Análisis de las secuencias parciales del gen 16S rRNA
26
V.
RESULTADOS
27
5.1
Caracterización fenotípica
27
5.2
Extracciones de DNA genómico
27
5.3
Amplificación parcial del gen 16S rRNA
28
5.4
Análisis de las secuencias parciales del gel 16S rRNA
29
VI.
DISCUSIÓN
36
VII
CONCLUSIONES
42
VIII BIBLIOGRAFÍA
43
IX.
ANEXO I
50
X.
ANEXO II
53
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1.
Daños vegetales en pino y estropajo a partir de los cuales
19
se obtuvieron las cepas de Pseudomonas. A) tumor en
tallos de pino, B) Pudrición del fruto de estropajo.
Figura 2.
DNA genómico de Pseudomonas spp. obtenido mediante
28
el protocolo de Cheng y Jiang (2006).
Figura 3.
Productos de amplificación parcial del gen 16S rRNA de
28
Pseudomonas spp.
Figura 4.
Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la
30
cepa B3 EST-07 (aislada de pudriciones en frutos de
estropajo) utilizando Neighbor-Joining.
Figura 5.
Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la
31
cepa B5 EST-07´(aislada de pudriciones en frutos de
estropajo) utilizando Neighbor-Joining.
Figura 6.
Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la
32
cepa B6 PIN-03 (aislada a partir de tumores en plántulas
de pino) utilizando Neighbor-Joining.
Figura 7.
Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la
34
cepa B7 PIN-02 (aislada a partir de tumores en plántulas
de pino) utilizando Neighbor-Joining.
vii
Figura 8.
Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la
35
cepa B8 TOM-03 (aislada a partir de tumores en plántulas
de pino) utilizando Neighbor-Joining.
Figura 9.
Resultados para la formación de levana. a) cepa B6 PIN-
50
03 y b) B5 EST-07´.
Figura 10. Resultados para la prueba de Citocromo Oxidasa.
51
Resultados positivos para todas las cepas en estudio.
Figura 11. Resultados para la prueba de pudrición en tubérculos de
51
papa. Las cepas B7 PIN-02 y B3 EST-07´fueron
positivas, con daños notorios.
Figura 12. Resultados para la prueba de Arginina Dihidrolasa en
52
medio Thornley 2A. Resultados positivos en todas las
cepas.
Figura 13. Resultados para la prueba de hipersensibilidad en plantas
52
de tabaco. a) y b) tratamientos testigo en la que se inoculó
agua destilada estéril. c) y d) planta con necrosis,
inoculada con la cepa B5 EST-07´.
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1.
Principales países productores de tomate de 2004 a 2008.
5
Se muestran datos de producción en toneladas.
Tabla 2.
Principales países exportadores de tomate. Se muestran
5
datos de producción en toneladas.
Tabla 3.
Principales estados productores de tomate en México. Se
6
muestran datos de producción en toneladas.
Tabla 4.
Producción de tomate en el estado de Veracruz. Se
6
muestran datos de producción en toneladas.
Tabla 5.
Preparación de la reacción de PCR.
23
Tabla 6.
Iniciadores universales utilizados para la amplificación
24
parcial del gen 16S rRNA
Tabla 7.
Programa térmico empleado para la amplificación parcial
24
del gen 16S rRNA, de acuerdo con Tambong et al. (2007).
Tabla 8.
Resultados de las pruebas LOPAT recomendadas para la
27
identificación de Pseudomonas fitopatógenas.
ix
Tabla 9.
Concentrado de los resultados del esquema LOPAT para la
41
mayoría de las especies de Pseudomonas fitopatógenas
reportadas hasta 2010 por Bull et al. las cepas en estudio se
encuentran al final de la tabla con su clave correspondiente.
Tabla 10.
Resultados del análisis BLAST para la cepa B3 EST-07.
53
Tabla 11.
Resultados del análisis BLAST para la cepa B5 EST-07´.
55
Tabla 12.
Resultados del análisis BLAST para la cepa B6 PIN-03.
57
Tabla 13.
Resultados del análisis BLAST para la cepa B7 PIN-02.
59
Tabla 14.
Resultados del análisis BLAST para la cepa B8 TOM-03.
62
x
RESUMEN
El género Pseudomonas comprende bacterias con papeles muy diversificados en los ecosistemas.
Algunas de ellas tienen la capacidad de provocar enfermedades en las plantas ocasionando
diversos síntomas en los hospederos. En nuestro país es aún limitado el estudio de las bacterias
fitopatógenas pertenecientes a este género, así como también, el uso de herramientas moleculares
para su identificación. El presente trabajo es un estudio pionero en cepas regionales de
Pseudomonas fitopatógenas aisladas a partir de enfermedades en tomate, estropajo y pino,
pertenecientes a la colección del Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa (LATEX). Con el fin
de identificar a los microorganismos, las cepas fueron caracterizadas fenotípicamente mediante el
esquema LOPAT (Brawn-Kiewnick y Sands, 2001), así como también, genotípicamente
mediante el análisis de secuencias parciales del gen 16S rRNA. El análisis genotípico reveló que
las cepas no tuvieron una correspondencia completa con especies reconocidas de Pseudomonas,
además de que no se encontró un consenso entre los resultados fenotípicos y genotípicos.
xi
I.
INTRODUCCIÓN
El género Pseudomonas fue descrito por Migula en 1894 como un grupo de bacterias gramnegativas en forma de bacilos curvos, con un tamaño de alrededor de 0.5-1.0 x 1.5-4.0 µm. Las
células son móviles con uno o varios flagelos polares. El contenido de G+C en su DNA es de 5871 %. De manera general son catalasa positiva y aerobios estrictos, a excepción de unas pocas
bacterias desnitrificantes. Una característica sobresaliente, en la mayoría de estas bacterias, es la
producción de pigmentos fluorescentes al crecer en medios deficientes de hierro como B de King
(KB). Las Pseudomonas no crecen a temperaturas de 41oC y acumulan, como material de reserva,
poli-β-hidroxibutirato (PHB) (Brawn-Kiewnick y Sands, 2001).
El grupo comprende bacterias ubicuas en la naturaleza, encontrándose en agua, suelos
sanos, suelos contaminados con aceites o combustibles y residuos de fábricas, poseen habilidades
metabólicas versátiles que les permiten utilizar una gama amplia de compuestos simples o
complejos como fuente de carbono; y tienen importancia dentro de la medicina, tecnología de
alimentos, medio ambiente y fitopatología (Fendri et al., 2010). Pueden ser descomponedores
activos del petróleo y sus productos (Tekorienė, 2008) y también se sabe que están involucradas
en la biodegradación de productos tóxicos, tanto naturales como humanos, lo que las hace, en
muchos casos, candidatos atractivos para utilizarlas en procesos de biorremediación, y en otras
potencialidades biotecnológicas, como por ejemplo Pseudomonas fluorescens que promueve el
crecimiento vegetal o suprime las funciones de patógenos de las plantas, y por tal motivo puede
ser explotada con fines de control biológico. Por otro lado, también son importantes como
patógenos de plantas y animales, incluido el ser humano (Widmer et al., 1998; Yumamoto et al.,
2000; Fendri et al., 2010; Tekorienė, 2008; Moore et al., 1996). Las Pseudomonas fitopatógenas
tienen la capacidad de causar numerosas enfermedades a las plantas provocando síntomas muy
diversos entre los que se incluyen chancros, pudriciones blandas, manchas foliares, clorosis,
tumores, agallas y pudriciones de hongos, entre otras (Brawn-Kiewnick y Sands, 2001).
1
Por lo antes mencionado, las bacterias del género Pseudomonas son objeto de estudios
multifacéticos intensos y profundos en todo el mundo (Tekorienė, 2008), varios de estos han
arrojado resultados que desencadenaron cambios en la nomenclatura del grupo durante la última
década. Por ejemplo, en sus comienzos el género fue establecido basándose en características
morfológicas y metabólicas, y en la 8ª edición de Bergey´s Manual of Determinative
Bacteriology se listaron alrededor de 29 especies bien caracterizadas junto con otras 235 especies
menos estudiadas. En los diez años que siguieron, este número fue dramáticamente reducido a
sólo 112 especies formalmente reconocidas en el Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology.
Muchos de los organismos originalmente descritos como especies del género Pseudomonas han
sido reclasificados (Moore et al., 1996).
El reconocimiento de la heterogeneidad considerable entre los organismos que han sido
reclasificados como especies del género en cuestión y las subsecuentes reorganizaciones
taxonómicas se deben a la aplicación, varios años atrás, de métodos para analizar
microorganismos a nivel molecular. De manera general la diferenciación y clasificación de los
taxa bacterianos existentes se ha acelerado desde hace ya 20 años con el incremento del uso de la
filogenia molecular. Hace algunos años se propuso, y de hecho ahora se ha reconocido, que el
género Pseudomonas (sensu stricto) puede ser limitado a aquellas bacterias agrupadas junto con
P. aeruginosa y P. fluorescens dentro del grupo I de homologías DNA-rRNA (Moore et al.,
1996).
Tradicionalmente, y con fines prácticos, las especies fitopatógenas pertenecientes al
género Pseudomonas se identificaban mediante el esquema LOPAT (Brawn-Kiewnick y Sands,
2001). Sin embargo, en la actualidad las secuencias del gen rRNA 16S han sido muy usadas para
determinar relaciones procarióticas en todos los niveles taxonómicos (Naum, 2008), y dentro del
género Pseudomonas es el rRNA la molécula que más impacto ha causado en la identificación y
clasificación de estas especies (Palleroni, 2003). Dicha molécula está bien estudiada desde
diferentes enfoques y se ha establecido la distancia promedio de los genes estructurales del
ribosoma entre especies bacterianas, el número de copias, el tamaño del operón ribosomal, la
secuencia del mismo y las estructuras secundarias de los genes del rRNA (Bouchet et al., 2008).
Los genes que se encuentran en dicho operón están arreglados de la siguiente manera: 16S rRNA2
23S rRNA-5S rRNA y debido a que el gen que codifica para el rRNA 16S es el más conservado
de los tres tipos, se ha convertido en el “patrón de oro” para la clasificación e identificación de
especies bacterianas (Bouchet et al., 2008).
3
II.
ANTECEDENTES
2.1 Generalidades e importancia de las especies vegetales con problemas fitosanitarios en
estudio.
2.1.1. El cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.)
Pertenece a la familia de las Solanáceas. Actualmente se cultiva en más de cien países con una
producción de dos millones de toneladas anuales, destinado para consumo fresco como para la
industria (Ascencio et al., 2008b).
Por el gran número de productos que se obtienen con su industrialización, es considerado
como una de las hortalizas de mayor importancia en muchos países del mundo. Mundialmente
ocupa el segundo lugar de importancia debido a su nivel de producción, la cual es superada
solamente por el cultivo de la papa. Los principales países productores son: China, Turquía,
Estados Unidos, India, Italia, Egipto, España, Irán, Brasil y México (Tabla 1). La producción
anual mundial de tomate creció 9.5% en los últimos 40 años, siendo la hortaliza más cultivada.
En cuanto a la exportación del producto, México ocupa el primer lugar a nivel mundial (Tabla 2)
(Ascencio et al., 2008a).
En México, el cultivo del tomate genera divisas elevadas e impulsa la economía de las
regiones que lo producen (Alvarado et al., 2011) ya que, como ocurre a nivel mundial, está
considerada como la segunda especia hortícola más importante debido a la superficie sembrada, y
como la hortaliza de mayor importancia por sus niveles de producción. Para 2008, se sembraron
alrededor de 81,000 ha y se obtuvieron cerca de 2 millones de toneladas, siendo los principales
estados productores: Sinaloa, Baja California, San Luis Potosí, Jalisco y Michoacán (Tabla 3)
(Ascencio et al., 2008a).
4
Tabla 1. Principales países productores de tomate de 2004 a 2008. Se muestran datos de producción en
toneladas.
PAÍS
2004
2005
2006
2007
2008
China
30,143,929
31,618,462
32,519,315
33,596,881
33,811,702
Estados Unidos
12,854,480
10,982,790
12,257,172
14,185,180
12,575,900
Turquía
9,440,000
10,050,000
9,854,877
9,945,043
10,260,600
India
8,125,600
8,825,400
9,820,400
10,054,600
10,260,600
Italia
7,683,071
7,187,014
6,351,202
6,530,162
5,976,912
Irán
4,022,878
4,781,018
5,064,571
5,000,000
5,000,000
Egipto
7,640,818
7,600,000
8,576,070
8,639,024
4,204,039
Brasil
3,515,567
3,452,973
3,362,655
3,431,230
3,934,275
España
4,383,202
4,810,301
3,800,552
3,664,100
3,847,800
México
3,037,265
2,800,115
2,899,153
3,150,353
2,936,773
Fuente: Monografía del tomate. Comisión Veracruzana de Comercialización Agropecuaria (2010).
Tabla 2. Principales países exportadores de tomate. Se muestran datos de producción en toneladas.
PAÍS
2003
2004
2005
2006
2007
México
903,384
895,126
900,767
1,031,503
1,072,646
España
946,511
1,023,028
923,907
987,260
880,630
Países Bajos
690,949
771,848
770,750
776,496
834,589
Jordania
186,517
237,859
285,169
304,529
386,968
Estados Unidos
180,712
212,279
188,173
144,184
245,315
Bélgica
202,041
204,503
200,209
200,002
203,328
Marruecos
179,804
107,365
166,570
192,353
297,593
Francia
94,972
96,706
113,314
120,647
166,978
India
11,328
7,427
11,743
33,593
134,845
Canadá
131,450
137,163
146,277
141,957
125,209
Fuente: Monografía del tomate. Comisión Veracruzana de Comercialización Agropecuaria (2010).
5
Tabla 3. Principales estados productores de tomate en México. Se muestran datos de producción en toneladas.
Estado
2004
2005
2006
2007
2008
Sinaloa
991,113.1
845,477.18
783,314.03
827,010.94
782,909.5
Baja California
294,076.06
262,457.52
216,000.04
196,388.03
206,257.11
Michoacán
162,476.07
150,730.08
134,177.84
224,897.88
175,702.64
San Luis Potosí
125,122.75
162,052.7
120,120
120,289.4
139,653
Jalisco
109,929.87
117,500.45
87,533.64
141,796.28
122,420.73
TOTAL
2,314,629.9
2,246,246.3
2,093,431.5
2,425,402.77
2,263,201.6
Fuente: Monografía del tomate. Comisión Veracruzana de Comercialización Agropecuaria (2010).
Aunque Veracruz no figura entre los principales productores de tomate a nivel nacional,
en los últimos años ha venido aumentando sus niveles de producción. Se destacan los municipios
de Emiliano Zapata, Actopan y Alto Lucero como los de mayor producción en 2007 y 2008
(Tabla 4).
Tabla 4. Producción del tomate en el estado de Veracruz. Se muestran datos de producción en toneladas.
Municipio
2004
2005
2006
2007
2008
Emiliano Zapata
6,250
2,556
17,280
32,890
35,900
Actopan
2,983
4,244.50
4,932.75
16,630.50
16,196
Alto Lucero
2,940.75
4,474.25
5,445
4,550
9,253.50
Juan Rodríguez
Clara
San Andrés Tuxtla
2,250
2,355
2,250
3,020
3,750
2,000
1,680
3,000
3,900
2,100
TOTAL
22,910
24,488.34
43,133.75
75,892.50
76,759.50
Fuente: Monografía del tomate. Comisión Veracruzana de Comercialización Agropecuaria (2010).
Debido al potencial económico que tiene el cultivo de tomate, en los últimos años en
México se ha expandido la producción de esta hortaliza en invernaderos, esto con el fin de evitar
los riesgos a enfermedades que tienen los cultivos a cielo abierto. Sin embargo, incluso en los
invernaderos, se tienen registros de enfermedades que afectan a los cultivos de tomate; en
6
muchos casos se desconocen los agentes etiológicos de las mismas y, por consecuencia, no se
alcanzan los niveles óptimos de producción. Éstas enfermedades son causadas por hongos,
bacterias y virus, de las cuales, la enfermedad fúngica producida por Fusarium oxysporum es la
que más devasta los campos destinados a producción de tomate (Alvarado et al., 2011).
Los cultivos también son afectados por bacterias, principalmente P. syringae, P.
corrugata y P. cichorii (Rao et al., 2008; Sutra et al., 1997). La primera causa la enfermedad de
la mancha bacteriana del tomate, enfermedad económicamente muy importante, ya que puede
afectar cualquier estructura de la planta (Rao et al., 2008); por su parte, P. corrugata y P. cichorii
son el agente causal de la necrosis del tomate, aunque P. corrugata también puede enfermar
plantas de chile, alfalfa y crisantemo (Sutra et al., 1997).
En los últimos años, en Grecia, Nueva Zelanda, Canadá e Italia se han aislado
Pseudomonas “desconocidas” que provocan enfermedades en los cultivos de L. esculentum Mill.
y con daños similares a los ocasionados por P. cichorii y P. corrugata (Sutra et al., 1997). Estas
especies bacterianas podrían jugar un papel muy importante en el impacto perjudicial en los
campos de cultivo, así como también en la producción de los mismos. Debido al papel que juega
la producción de tomate para nuestro país, es importante conocer a los microorganismos que lo
afectan mediante una correcta identificación de estos, lo que permitirá establecer mejores
estrategias de control integral a largo plazo (Alvarado et al., 2011).
2.1.2 El cultivo de estropajo
El estropajo (Luffa cilindrica) es una especie vegetal de la familia de las Cucurbitáceas. Recibe
diferentes nombres, como: estropajo (México), estropajo o pepinillo de esponja (Colombia), paste
(Costa Rica), quimgombo (Venezuela), buchados paulistas (Brasil), loofah (Estados Unidos). El
género cuenta con 7 especies pero solo L. cylindrica y L. acutangula son las más conocidas y
comúnmente cultivadas.
7
Es una planta preferentemente tropical, necesita grandes cantidades de agua en forma de
humedad y condiciones climáticas templadas para poder desarrollarse al máximo, lo cual definirá
su calidad. Algunos aspectos relacionados con la calidad y adaptación de la planta son: el tipo de
suelo, la altura con respecto al nivel del mar, humedad y calor, etc. El origen de esta planta es
desconocido o incierto, ya que se especula que pudo ser introducida a China alrededor del año
600 a.C. o en Egipto, aunque algunos expertos aseguran que su origen se encuentra en Asia
occidental, en áreas tropicales como el caso específico de la India, en donde aún es posible
encontrar formas silvestres.
Desde épocas anteriores ha sido utilizado en zonas tropicales como aditamento de higiene,
entre otros usos, y actualmente ha retomado importancia económica al establecerse cultivos
extensivos con fines de comercialización a nivel nacional e internacional, Según el Banco de
Datos de la Unión Europea, después de 1993, países como el Reino Unido, Países Bajos, España,
Francia, Alemania e Italia, además de Estados Unidos han sido los principales importadores de
fibras naturales, como el estropajo, generando una derrama económica de 840,785.00 dls en el
2001 (Ventura, 2009). En tanto que del 2000 al 2002, México se colocó como el principal
exportador latinoamericano, según la Asociación Latinoamericana de Integración, generando
ganancias anuales de alrededor de 700,000.00 dls en exportación (Díaz y Ávila, 2002). Razón
por la cual, en la zona centro-sur de Veracruz actualmente se está cultivando como producto
alternativo.
La invasión del cultivo por microorganismos se ve favorecida por las condiciones en la
que se desarrolla la planta, además, debido a la facilidad que tienen estos microorganismos de
propagarse en el medioambiente de este cultivo y la facilidad relativa de llegar y pasar a través de
las vellosidades que sirven como medio de absorción de humedad en hojas y tallo, o bien, durante
la absorción de nutrientes y minerales a nivel de raíces (Ventura, 2009).
Dentro de los principales problemas del cultivo se han identificado alrededor de 14
especies de hongos y hasta 5 especies de bacterias causantes de enfermedades. Entre las especies
bacterianas reportadas se encuentran: P. syringae pv lachrymans, P. syringae pv mellea, P.
cichorii, P. carotovorum subsp. carotovorum y E. tracheiphila (Díaz y Ávila, 2002). Cabe
resaltar que para México se tienen como patógenos regulados (cuarentenados en productos
8
agrícolas de importación) a P. syringae pv. lachrymans, P. cichorii y E. tracheiphila (Ventura,
2009).
2.1.3 El cultivo de pino
Pinus patula es uno de los géneros de coníferas más estudiado y del que existe mayor
información en el mundo (González y Mendoza, 2008). Tiene una distribución natural restringida
en México y crece en bandas relativamente angostas a lo largo de la Sierra Madre Oriental
(Córdova y Rosas, 2008). El área principal de distribución está restringida a una franja que pasa
por los estados de Hidalgo, Veracruz y Puebla, donde esta especie puede ser considerada como
una de las más importantes por su abundancia (González y Mendoza, 2008). Es una especie muy
agresiva, por lo que puede ser empleada para la recuperación de zonas verdes, la conservación de
suelos, el control de la erosión, etc. (Córdova y Rosas, 2008). En 1990, se sembraron más de un
millón de hectáreas en el sur y oeste de África y en el oeste de América del Sur.
Es una de las especies de pino más importantes para las plantaciones comerciales
intensivas en el mundo debido a su tasa de crecimiento excepcionalmente rápido, buena forma
del tronco, amplio grado de adaptación, bajo contenido en resinas, características favorables
(físicas y mecánicas) de la madera y buena longitud de las fibras para productos de celulosa
(Córdova y Rosas, 2008; Luna et al., 2005; Sáenz et al., 2010).
En México, de donde es endémica, tiene un potencial silvícola elevado (González y
Mendoza, 2008) con un potencial productivo enorme, siendo una de las especies de mayor
demanda en el extranjero para la realización de plantaciones. Sin embargo, no ha sido cultivada
ampliamente, hasta 2010 había aproximadamente 4239 ha plantadas con P. patula en territorio
mexicano (Sáenz et al., 2010).
9
2.2 Bacterias fitopatógenas
Desde 1882 se tiene conocimiento de bacterias que causan enfermedades a las plantas. A nivel
mundial las pérdidas en la producción de los cultivos, provocadas por enfermedades, están entre
el 25 a 65 %, y a nivel nacional de 12 a 38 %, repercutiendo en gran medida en el aspecto
económico, ya que se tiene que gastar tanto en el control de las enfermedades como en resolver la
demanda del producto; por lo que es importante no escatimar en estudios integrales de estos
patógenos para evitar y/o prevenir grandes pérdidas en la producción de cultivos básicos o de
importancia económica para determinada región geográfica (Ventura, 2009).
Por otro lado, en muchas partes del mundo los microorganismos han devastado zonas
productoras completas al infectar los cultivos, esas epidemias han provocado que la mayoría de
los productores opten por sembrar variedades resistentes a las enfermedades, hecho que ha
repercutido severamente en la variabilidad de las plantas cultivadas. Ahora genéticamente son tan
homogéneas que pueden ser infectadas por muchos más organismos patógenos que los que
originariamente las afectaban (Agrios, 1995).
Hasta la década de los 80´s, se tenían registradas alrededor de 50 especies bacterianas
fitopatógenas, cada una de las cuales puede tener de uno a varios patovares, y a su vez estas
bacterias se agruparon dentro de los géneros Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas, Xyllela,
Agrobacterium, Streptomyces y Clavibacter, de los cuales los dos primeros tenían el mayor
número de especies con 17 y 21 respectivamente. Para el 2010, se publicó la lista actualizada de
especies fitopatógenas bacterianas agrupadas en los géneros: Acetobacter, Acidovorax,
Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Brenneria, Burkholderia, Clavibacter, Clostridium,
Corynebacterium, Curtobacterium, Dickeya, Enterobacter, Erwinia, Ewingella, Gluconobacter,
Herbaspirillum,
Janthinobacterium,
Leifsonia,
Nocardia,
Pantoea,
Pectobacterium,
Pseudomonas, Ralstonia, Rathayibacter, Rhizobacter, Rhizobium, Rhodococcus, Samsonia,
Serratia, Sphingomonas, Spiroplasma, Streptomyces, Xanthomonas, Xyllela, Xilophilus y
Candidatus (Bull et al., 2010). Siendo los géneros Xanthomonas y Pseudomonas los
económicamente más importantes por el número de especies y patovares que comprenden.
Claramente el ingreso de nuevos géneros de bacterias fitopatógenas, se debe a una investigación
10
exhaustiva de dichas bacterias y de sus relaciones evolutivas, generando cambios en el
conocimiento y clasificación de las mismas.
La mayoría de las bacterias fitopatógenas representan pérdidas económicas en muchos
países. México es un productor importante de recursos agrícolas, tiene una geografía universal en
cuanto a clima y condiciones de reproducción para este tipo de microorganismos, por lo que las
pérdidas se cuantifican en miles de hectáreas y en decenas de millones de dólares desde que los
niveles de producción aumentaron; mas por los niveles de producción que por los niveles de
incidencia, ya que a mayor producción mayor incidencia de contaminación (Ventura, 2009).
2.2.1 El género Pseudomonas
El género Pseudomonas fue establecido y caracterizado principalmente por morfología y
metabolismo (Moore et al., 1996). Comprende alrededor de 200 especies, siendo uno de los
grupos mayores de especies bacterianas con importancia fitosanitaria (alrededor de 25 especies).
La fitopatogenia de las Pseudomonas causa numerosas enfermedades en plantas afectando varios
tipos de estructuras vegetales, entre las que destacan hojas, ramas y flores, con diversos síntomas
como: pudriciones cafés suaves, tumores, marchitamiento, etc. Muchas Pseudomonas se
encuentran asociadas a las plantas como epífitas foliares o como habitantes de la rizósfera
(Ventura, 2009).
Problemática taxonómica de Pseudomonas
La multitud de características importantes de las especies de Pseudomonas ha inspirado
numerosos estudios taxonómicos, los cuales en conjunto han llevado al desarrollo de un mejor
conocimiento del género. Los enfoques incluyen cultivo selectivo, amplificación del gene de
rRNA por PCR en conjunción con la secuenciación, técnicas de hibridación RNA-DNA, análisis
de proteínas y composición de ácidos grasos, utilización de fuentes de carbono y anticuerpos
específicos (Widmer et al., 1998).
11
Palleroni y su grupo de trabajo han realizado estudios sobre taxonomía del género
Pseudomonas desde la década de los 60´s, en un principio dichos trabajos involucraban
caracterizaciones fenotípicas usando principalmente caracteres nutricionales, los cuales al parecer
eran muy efectivos, ya que podían diferenciar especies y hasta patovares. Sus resultados
arrojaban una gran diversidad de especies dentro del género, mismos que en algunos casos se
encontraban de acuerdo con las técnicas moleculares de hibridación DNA-DNA; sin embargo, a
nivel molecular había ciertas especies que eran ligeramente más heterogéneas que otras. Así, en
1973 utilizaron técnicas de hibridación rRNA-DNA concluyen que las cepas bajo estudio (37
bacterias en total, de las cuales 3 eran Xanthomonas y el resto especies consideradas como
pertenecientes a Pseudomonas) pueden caer en uno de 5 grupos de homología de RNA, cada uno
de los cuales compartía cierta similitud entre sus integrantes. La heterogeneidad encontrada en
este género viejo reflejó cierta lejanía de parentesco, lo cual provocó un acomodo de las especies
dentro de nuevos géneros o ya existentes debido a que cada grupo de similitud merecía al menos
el atributo de género (Palleroni et al., 1973).
Estos análisis y los reacomodos taxonómicos identifican a las especies del grupo RNA I,
que incluye a la especie tipo P. aeruginosa y a otras especies como P. fluorescens, P. putida y P.
syringae, como miembros del grupo filogenéticamente homogéneo de las referidas Pseudomonas
(Brawn-Kiewnick y Sands, 2001). Otras bacterias que provocan enfermedades en las plantas y
que tuvieron mayor identidad con los grupos de RNA del II al IV fueron asignadas dentro de los
géneros Brevundimonas, Sphingomonas, Burkholderia, Ralstonia, Aminobacter, Comamonas,
Acidovorax, Hygrogenophaga, Telluria y Stenotrophomonas. Esta clasificación concuerda con la
información filogenética obtenida de las secuencias de 16S rRNA que se presenta en el Proyecto
de Base de Datos Ribosomal (Widmer et al., 1998).
Los estudios moleculares que siguieron han sugerido una definición molecular del género,
misma que se menciona a continuación: “Especies referidas al grupo I o grupo fluorescente de
pseudomónadas, en el grupo llamado Pseudomonas, a lo largo con los subgrupos de
Acinetobacter
y Teredinibacter. Las ramas filogenéticas directamente adyancentes están
formadas por el grupo de Oceanospirillum y el complejo de Colwellia (Widmer et al., 1998).
12
Numerosas investigaciones de Pseudomonas fitopatógenas, resultado de sus importantes
características y de su amplia distribución, desde diferentes enfoques han colaborado a un mejor
entendimiento del grupo. Sin embargo, hay una marcada diferencia en los estudios que se
encuentran en México con los de otros países. Las caracterizaciones de bacterias fitopatógenas en
general son escasas y basadas, principalmente, en caracteres fisiológicos y bioquímicos, mismas
que empobrecen la descripción y por consiguiente el conocimiento de los taxa, ya que para una
identificación correcta de un patógeno o la diagnosis de una enfermedad en plantas, depender
sólo de la evidencia de pruebas fisiológicas tiende a ser insatisfactoria. Las técnicas moleculares
incrementan la robustez de una descripción, así como también facilitan la identificación hasta
niveles de especie o patovares (Brawn-Kiewnick y Sands, 2001).
2.3 Impacto del gen 16S rRNA en el estudio del género Pseudomonas
El gen 16S rRNA posee atributos que le otorgan el papel de cronómetro molecular por su función
esencial, ubicuidad en los organismos, presencia de regiones variables y conservadas, tamaño
adecuado para contener información útil (suficientes polimorfismos intraespecíficos para proveer
mediciones estadísticamente válidas) y actualmente es la parte del genoma que más se utiliza
para fines taxonómicos (Clarridge III, 2004; Case et al., 2007). Su uso ha marcado el comienzo
de otras disciplinas como por ejemplo de la Ecología Microbiana Molecular, comenzando ésta
con la amplificación y secuenciación de gen, lo que ha cambiado el entendimiento y el estudio de
los procariontes en el ambiente. El hecho de que el gen rRNA puede identificar un organismo y
reconstruir su filogenia, junto con el hecho de que permite almacenar secuencias en una base de
datos, resultó en una adopción rápida del gen por los microbiólogos para el estudio de procariotas
(Case et al., 2007).
En 1998, Widmer et al. diseñaron un protocolo de PCR altamente específico para la
identificación de Pseudomonas en muestras ambientales. La identificación de las especies del
género en cuestión, dice Widmer, es indispensable para poder entender las relaciones ecológicas
y la importancia que el género tiene. Del mismo modo un protocolo libre de cultivo que permita
13
identificar las bacterias del género es una herramienta de mucho valor para estudios en ecología
y de diagnóstico.
En el año 2000, Yamamoto y colaboradores realizaron un estudio filogenético de este
género con el objetivo de establecer un sistema de clasificación más fiable; para ello usaron
secuencias nucleotídicas combinadas de los genes que codifican para la subunidad B DNA girasa
(gyrB) y el gen del factor δ70 (rpoD). La DNA girasa es la enzima responsable de introducir
superenrrollamiento negativo dentro de los cromosomas bacterianos y juega un papel crucial en
la replicación de los mismos. El factor δ70, por el otro lado, es unos de los factores que actúan
como promotores específicos para la RNA polimerasa en el proceso de la transcripción. Ambas
proteínas son ubicuas en las bacterias y juegan un papel esencial en el crecimiento celular. El
experimento fue validado con la identificación de 31 especies descritas de Pseudomonas (un total
de 125 aislamientos). Los resultados arrojan que las especies dentro del género tienden a
agruparse dentro de dos grandes clúster intragenéricos (IGC1 Y IGC2). El IGC1 se subdividió en
dos subclusters mientras que el IGC2, se separó en 3 subclusters.
En 2004, Rodríguez et al. aplicaron un estudio polifásico que incluía caracterizaciones
fenotípicas, inmunofluorescencia indirecta y PCR para la identificación de Burkholderia cepacia
y P. fluorescens previamente aisladas de mazorcas de maíz. También se emplearon métodos
convencionales como galerías API 20 NE. Además, para la amplificación del gen, se utilizaron
oligonucleótidos
específicos
5´CGTGTGTGAAGAAGTCTCGG3´
para
(forward)
los
y
organismos
de
interés:
5´AGGGCCATGAGGACTTGACG3´
(reverse), pudiendo limitar mucho las especies que se podían encontrar en las plantas de maíz.
Tambong et al. (2009) realizaron una investigación interesante sobre la heterogeneidad de
la región espaciadora 16S-23S (ITS1) del gen rRNA entre bacterias aisladas de semillas de
cacahuate (Amphicarpa bracteata). La hipótesis es que el hábitat puede estar predispuesto a
albergar genotipos bacterianos únicos que pueden tener potencial benéfico en la producción de
ciertas plantas. La amplificación por PCR de las cepas en estudio genera de uno a dos productos
de amplificación, y es importante mencionar que es el primer reporte del estudio molecular de
14
Pseudomonas en el que se utiliza la heterogeneidad intragenómica del ITS en conjunto con el
análisis de curva de fusión.
El análisis de las secuencias del ITS1 reveló que hay dos tipos de esa región espaciadora,
el primero es de cerca de 517 pb y se encontró en todos los aislamientos (un total de 29) y el
segundo de 279 pb detectado en sólo 15 aislamientos. La diferencia de longitud puede deberse a
las deleciones de varios bloques de nucleótidos que se encuentran entre las 70 pb y 359 pb del
alineamiento. Se encontraron cepas de Pseudomonas genéticamente únicas validando la hipótesis
inicial del trabajo y mencionando, de nuevo, que hay un amplio mosaico genético en el género.
La heterogeneidad en la región espaciadora puede estar relacionada con una diversidad en los
operones ribosomales de las bacterias, dando una ventaja para las adaptaciones a cambios
ambientales, debido a que en sus regiones espaciadoras se encuentran diferentes genes para RNA
de transferencia.
Varias revisiones de la historia del género y de los momentos claves que han conducido a
la construcción de una mejor taxonomía del mismo han sido publicadas. Algunos investigadores
sugieren que el estudio del género Pseudomonas marcó la entrada a una nueva manera de percibir
y trabajar la taxonomía bacteriana y un ejemplo de ello fue el establecimiento de las bases para
utilizarla la molécula de rRNA como marcador molecular, ya que se mantenían patrones de
similitud entre especies relacionadas; así, las técnicas de hibridación DNA-DNA se modificaron a
hibridaciones rRNA-DNA para dirigirlas a estudios sobre el género, marcando un hito con una
aplicación nueva de las moléculas hereditarias. El trabajo en Pseudomonas ha tenido dos
marcadas consecuencias en el estudio de los microorganismos: la propuesta de una metodología
para la extensa caracterización fenotípica, recomendada principalmente para organismos
quimioheterótrofos, y la demostración del poder de estudios de similitud de rRNA y su
introducción como herramienta taxonómica.
En conclusión, y debido a la amplia variedad de especies dentro del género y a la
conjunción de estudios multifacéticos del mismo, se llegó a la extensión de las estrategias
adoptadas para la caracterización de procariotas más allá de los límites de un solo grupo. Cabe
mencionar que aunque en sus inicios las investigaciones también se abordaban en temas de
15
quimiotaxonomía o por métodos inmunológicos, estas estrategias no tuvieron la aplicabilidad de
los estudios de ácidos nucleicos, y las implicaciones filogenéticas que arrojaron no fueron
suficientemente claras. Actualmente, la secuenciación del gen 16S rRNA ha confirmado los
grupos básicos definidos por Palleroni en 1973 (Palleroni, 2003).
Escalante et al. (2009) han descrito una nueva especie para México, P.
cuatrocienegasensis que, como su nombre lo indica fue aislada de aguas en Cuatro Ciénegas.
Para la descripción se recurrió a un estudio fisiológico y bioquímico intenso, caracterización de
ácidos grasos, técnicas de hibridación DNA-DNA, PCR y secuenciación del gen 16S rRNA. En
conjunto los datos obtenidos permiten clasificar la cepa dentro de una nueva especie y un dato
interesante es que descripciones de especies nuevas se están llevando a cabo en varias partes del
mundo, y encontrarlas en base de datos es común, sin embargo para México este es el primer
registro que encontramos.
2.4 Estudio de Pseudomonas en México
Las técnicas moleculares han sido muy trabajadas y como se podrá notar el grupo ha sido
sometido a varios estudios desde diferentes enfoques; sin embargo, en nuestro país las
caracterizaciones moleculares para Pseudomonas fitopatógenas no se han publicado y no se han
encontrado investigaciones acerca de la historia de vida de este grupo, aunque se considera que
este género tiene un fuerte impacto en la economía mexicana. Por ejemplo, para el campo, las
pérdidas de plantas o semillas pueden incrementar los gastos en fertilizantes y/o pesticidas y en el
mejoramiento de infraestructura cada vez más compleja para un mejor cuidado de la producción,
así como también, puede haber pérdidas en la competitividad de los productos tanto en el
mercado interno como en el externo. Estas pérdidas al parecer aún no se han estimado en México,
y por su puesto en nuestro Estado.
En la revista de la Sociedad Mexicana de Fitopatología (SMF), no existen descripciones
robustas de las especies y de hecho son pocos los estudios enfocados al grupo, en la mayoría de
los casos se desvía la atención a la identificación de “posibles” agentes de biocontrol. Hay
16
estudios multifásicos publicados en la SMF y cabe mencionar que son investigaciones de otros
países como Cuba o Bélgica. No debe limitarse el interés por un grupo de microorganismos tan
amplio que alberga versatilidades metabólicas y biogeográficas tales, que les permiten una
distribución en todo el mundo, y que representan potencialidades beneficiosos y/o perjudiciales.
De acuerdo a Widmer et al. (1998), sin un método correcto para identificar las especies que
afectan los cultivos es lejana la solución al problema, dado que no se sabe con precisión qué
atacar ni cómo hacerlo. Además la efectiva identificación de los microorganismos puede
canalizar esfuerzos para entender su fisiología, ecología, biología y los mecanismos patológicos
que llevan a cabo.
Un prerrequisito esencial para la investigación detallada del papel y la evolución de las
Pseudomonas es el conocimiento exacto de un sistema de clasificación e identificación, que
según Yamamoto et al. (2000) no está totalmente establecido debido a la falta de un preciso
sistema taxonómico.
Por lo antes mencionado, se considera que es de suma importancia generar información de
un grupo tan amplio y diverso que ha sido sometido a sesgos de conocimiento, al menos en
nuestro país. Planteamos implementar un protocolo de PCR utilizando oligonucleótidos
universales para el gen 16S rRNA que amplifican fragmentos de 750 pb, considerando dichos
fragmentos como apropiados para la identificación y el análisis de las secuencias (Clarridge III,
2004). En conjunto, se realizarán las pruebas del esquema LOPAT (Brawn-Kiewnick y Sands,
2001) para una identificación más robusta de las cepas de Pseudomonas fitopatógenas que se han
aislado de tres cultivos veracruzanos. Hasta el momento, no se han encontrado trabajos
publicados que acoplen estudios moleculares y fenotípicos para Pseudomonas fitopatógenas, así
se llega a suponer que se trata de un trabajo pionero para nuestro estado.
17
III.
3.1
OBJETIVOS
Objetivo general
•
Determinar a qué especie pertenecen las Pseudomonas fitopatógenas que causan
enfermedades en estropajo, tomate y pino presentes en campos de cultivo
veracruzanos.
3.2
Objetivos específicos
•
Caracterizar fenotípicamente las cepas de Pseudomonas fitopatógenas causantes de
enfermedades en estropajo, tomate y pino, mediante el esquema LOPAT.
•
Caracterizar parcialmente el gen 16S rRNA de las cepas en estudio.
•
Inferir la similitud de las secuencias parciales del gen 16S rRNA de las cepas de
Pseudomonas en estudio con especies del género registradas en bases de datos de
información genética.
18
IV.
MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 Material biológico
Se estudiaron Pseudomonas fluorescentes fitopatógenas almacenadas en el cepario
del
Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa S.C. de la Universidad Veracruzana (LATEX). Las
cepas fueron aisladas a partir de daños en plantas de estropajo (B3 EST-07
07 y B5 EST-07´),
EST
pino
(B6 PIN-03 y B7 PIN-02) y tomate (B8 TOM
TOM-03) (Figuras 1A y 1B).
). Cada cepa fue resembrada
mediante la técnica de agotamiento por estría en medio B de King (Polipeptona 20 g, K2HPO4 1.5
g, MgSO4 1.5 g, Glicerol 15 mL, agar bacteriológico 15 g, agua destilada 1 L) e incubadas a 28
o
C ± 1 durante un período de 24 a 48 horas. Se repitió la resiemb
resiembra
ra hasta obtener cultivos puros
comprobados mediante la morfología colonial y la prueba de fluorescencia a la luz ultravioleta.
ultrav
A
B
Figura 1. Daños vegetales en pino y estropajo a partir de los cuales se obtuvieron las cepas de Pseudomonas. A)
Tumor en tallos de pino, b) pudrición del fruto de estropajo.
4.2 Resguardo de cepas
Después de obtener cultivos puros de las cepas de Pseudomonas se procedió a realizar resiembras
de resguardos para su uso posterior. El métod
método
o usado fue propuesto por Braun (Kiewnick y
Sands, 2001) y se describe a continuación:
19
i.
Transferir una colonia de bacterias a tubos que contengan 3 mL de caldo NBY (Caldo
nutritivo 8.0 g, Extracto de levadura 2.0 g, K2HPO4 2.0 g, KH2PO4 0.5 g, Glucosa 2.5g,
Agar 15.0 g y Agua destilada 1 L)
ii.
Incubar durante dos días a 28oC.
iii.
Transferir 700 µL del cultivo a un tubo estéril y adicionar 300 µL de glicerol al 30%
estéril.
Mezclar con vórtex durante 10 s y finalmente los cultivos se almacenan a -20 oC.
iv.
Para comprobar el crecimiento bacteriano en el caldo NBY se observó turbidez, así como
también se recurrió de nuevo a la prueba de fluorescencia en lámpara de rayos UV. Para descartar
contaminación se realizó el mismo procedimiento en un testigo conteniendo sólo NBY y glicerol.
Después de una semana, las bacterias que se mantuvieron en congelación se resembraron por
agotamiento por estría para verificar la pureza y viabilidad de la cepa.
4.3 Caracterización fenotípica
Se realizó la caracterización fenotípica de las cepas para la incrementar la robustez de la
descripción. Para esta caracterización se aplicaron pruebas fisiológicas basadas en el esquema
LOPAT para Pseudomonas fitopatógenas sugerido por Brawn-Kiewnick y Sands (2001).
Los experimentos se realizaron con cultivos de 24 a 48 horas de crecimiento y el método
empleado para las cinco pruebas se describe a continuación.
•
L = Producción de Levana. Una colonia bacteriana se sembró por punción en medio de
producción de levana (agar nutritivo adicionado con 5% de sucrosa). Las bacterias se
incubaron con la tapa hacia arriba durante 24 a 48 horas. Si las colonias fueron pulvinadas
o mucoides blancas la prueba se consideró positiva.
20
•
O= Citocromo Oxidasa. En una tira de papel filtro se agregó una o dos gotas de solución
acuosa de N,N- Dimetil o tetrametil-para-fenil-diamina al 1% de reciente preparación.
Con la ayuda de puntas para micropipeta se colocó un poco de crecimiento bacteriano
sobre el papel humedecido. La prueba fue positiva si al cabo de 10 segundos se observó
una coloración rosa o roja.
•
P = Pudrición de papa, para determinar la presencia de enzimas pectolíticas. Las papas se
lavaron con agua destilada estéril y se flamearon con alcohol, se cortaron en rebanadas
con ayuda de un rebabador o bisturí estéril. Se estriaron las rebanadas de papa con el
cultivo bacteriano de interés, se colocaron e incubaron en cámara húmeda por un periodo
de 24 a 72 horas a 28°C. Si el tejido presentó una consistencia blanda desde las primeras
24 horas la prueba se consideró positiva.
•
A = Dihidrolasa Arginina, prueba para determinar la presencia de enzimas hidrolasas que
permiten a las Pseudomonas crecer en condiciones anaeróbicas. Las enzimas generan
ATP por la degradación de la arginina a ornitina con la generación de dióxido de carbono
(CO2) y amonio (NH3). La primer enzima es arginina desaminasa que degrada la arginina
a citrulina+NH3, la siguiente enzima es la citrulina-ureidasa que convierte la citrulina a
ornitina+CO2 +NH3. Para la realización de la prueba cultivo bacteriano se inoculó por
punción en tubos con medio de arginina, y se adicionó 1mL de aceite mineral estéril. Los
tubos se incubaron a 28oC hasta por 4 días. Se consideró positivo cuando el indicador viró
del rosa al violeta, dado que es una reacción alcalina debido al producto +NH3.
•
T = Hipersensibilidad en Tabaco: inocular hojas sanas de tabaco con 0.5 mL de
suspensión bacteriana. Se utilizó una planta por cada cepa a evaluar. La inoculación se
realizó inyectando la solución en las venas secundarias de las hojas. Las plantas se
mantuvieron en condiciones ambientales normales, se validó la prueba a las 24 horas
después de la inoculación. Se consideró positiva si se apreció necrosis en las hojas de
tabaco.
21
4.4 Análisis del gen 16S rRNA
4.4.1
Extracción de DNA genómico
La extracción de DNA genómico se llevó a cabo a partir de cultivos bacterianos puros por el
método de lisis con fenol (Cheng y Jiang, 2006), mismo que se explica a continuación:
i.
Desarrollar cultivos bacterianos en medio KB a 28 ±1°C durante 48 h.
ii.
Suspender las células bacterianas en 1 mL de solución STE (100 mM NaCl, 10 mM
Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8).
iii.
Centrifugar a 8,000 g por 2 minutos.
iv.
Remover el sobrenadante y resuspender las células en 400 µL de solución STE.
v.
Centrifugar la suspensión a 8,000 g por 2 minutos.
vi.
Desechar el sobrenadante y resuspender la pastilla en 200 µL de solución TE (10 mM
Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Agregar 100 µL de solución Tris saturada con fenol (pH
8).
vii.
Centrifugar a 13,000 g por 5 minutos.
viii.
Transferir 160 µL de la solución acuosa a un tubo limpio de 1.5 mL. Agregar 40 µL de
solución TE y mezclar con 100 µL de cloroformo.
ix.
Centrifugar a 13,000 g por 5 minutos.
x.
Repetir el paso viii y ix hasta que no se observe una película blanca en la interfase.
xi.
Transferir 160 µL de la fase acuosa a un tubo limpio de 1.5 mL.
xii.
Agregar 40 µL de solución TE y 5 µL de RNasa (10mg/mL) e incubar a 37 oC por 10
minutos para digerir el RNA.
xiii.
Añadir 100 µL de cloroformo a cada tubo y mezclar por inversión.
xiv.
Centrifugar a 13,000 g por 5 minutos.
xv.
Transferir 150 µL de la fase acuosa a un tubo limpio. Esta solución contiene el DNA
genómico de la bacteria.
xvi.
Almacenar las muestras a -20oC.
22
El método ha demostrado efectividad, no depende del uso de kit´s comerciales y se
emplean compuestos y materiales de uso común y frecuente en las técnicas de biología
molecular, por lo que se tiene establecido como un método de trabajo en el laboratorio.
4.4.2
Evaluación de la integridad del DNA genómico
La integridad del DNA se evaluó por electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0.8% y TBE
1X como solución amortiguadora de corrida. En cada pozo se depositaron 4 µL de la suspensión
de DNA previamente mezclado con 2 µL de solución de carga. La tinción del gel se realizó en
100 mL de Buffer TBE 0.5X adicionado con 2 µL de Bromuro de Etidio (10 mg/mL). Los geles
se revelaron y fotografiaron en un transiluminador Microbis con el software GelQuant.
4.4.3
Amplificación parcial del gen del rRNA 16S
La solución para la amplificación del DNA se preparó de acuerdo a lo indicado en la Tabla 5.
Para la amplificación del gen 16S rRNA se utilizaron los iniciadores universales descritos por
Tambong et al. (2007) (Tabla 6). El programa térmico empleado se indica en la Tabla 7.
Tabla 5. Preparación de la reacción de PCR
Componentes de reacción
Requerimiento/ reacción
DNA genómico
40 ng
Primer Universal Bact Forward (10 pM/µL)
15 pM
Primer Universal Bact Reverse (10 pM/µL)
15 pM
dNTP´s 25mM (Promega)
0.2 mM
Tampón Taq 5 X (Promega)
MgCl2, 25mM (Promega)
Taq DNA polimerasa 5 U/µL (Promega)
Volumen final
1X
2 mM
1U
25 µL
23
Tabla 6. Iniciadores universales utilizados para la amplificación del gen 16S rRNA
Iniciador
Secuencia
5’
Universal Primer Bact Forward
GATCCTGGCTCAGGATGAAC 3’
5’
Universal Primer Bact Reverse
GGACTACCAGGGTATCTAATC 3’
Tabla 7. Programa térmico empleado para la amplificación parcial del gen 16S rRNA, de acuerdo a Tambong
et al. (2007).
Fase
Desnaturalización
Inicial
Desnaturalización
Alineación
Extensión
Extensión final
Temperatura
Tiempo
Ciclos
95oC
92 oC
62 oC
72 oC
72 oC
5 minutos
15 segundos
1 minuto
1 minuto
10 minutos
1
30
1
Los productos amplificados se evaluaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.8% en
TBE 1X a 90 V en un sistema horizontal BIORAD SUBCELL. Los geles fueron teñidos en 100
mL de solución TBE 0.5 X adicionado con 2 µL de bromuro de etidio (10 mg/mL) e incubados
durante 20 min. En cada evento de electroforesis se colocó un marcador de peso molecular de
100 pb (AMRESCO´S). Los productos de amplificación fueron fotografiados con un equipo
trans-iluminador marca MICROBIS con ayuda del software GELQUANT.
4.4.4
Purificación de los productos de amplificación
Para la limpieza de los productos de amplificación se utilizó el kit Wizard SV Gel and PCR
Clean-Up System (PROMEGA), según las indicaciones del fabricante, mismo que se describe a
continuación:
i.
Colocar una minicolumna SV dentro de un tubo colector por cada muestra.
ii.
Agregar el mismo volumen de solución de unión a la membrana al producto de PCR, la
mezcla se transfiere a la minicolumna previamente montada.
24
iii.
Centrifugar la minicolumna SV a 16,000 g por 1 minuto. Remover la minicolumna para
desechar la solución del tubo colector.
iv.
Lavar la columna adicionando 700 µL de solución de lavado de membrana.
Posteriormente se centrifugar por un minuto a 16,000 g. De nuevo, desechar la solución
del tubo colector y repetir el lavado de la columna, esta vez con 500 µL de solución de
lavado de membrana, la muestra se centrifuga a 16,000 g por 5 minutos.
v.
Remover la minicolumna SV del tubo colector. Desechar el precipitado y centrifugar la
minicolumna a 16,000 g por un minuto.
vi.
Transferir la minicolumna SV a un tubo limpio de 1.5 mL, adicionar a la membrana 50
µL de agua libre de nucleasas. La muestra se incuba a temperatura ambiente por un
minuto para posteriormente centrifugarla a 16,000 g por un minuto.
vii.
Desechar la minicolumna, la solución en el tubo de 1.5 mL contiene el producto de PCR
ya purificado. La solución se almacena a -20oC para su posterior uso.
El kit de purificación utilizado está diseñado para la limpieza de fragmentos desde los 100
pb hasta las 10 Kb a partir de productos de PCR, o bien, de cortes de bandas en gel de agarosa de
buffer TBE o TAE.
Una vez purificados los productos de amplificación se corrieron en electroforesis en gel
de agarosa al 1.8% para comprobar su integridad.
4.4.5
Secuenciación de productos amplificados
Para la secuenciación, los productos de purificación se enviaron al Instituto de Biotecnología de
la UNAM, Cuernavaca, Morelos, según las recomendaciones del laboratorio que presta el
servixio. De manera anticipada se empleó un equipo NanoDrop para establecer la concentración
de los productos.
25
4.4.6
Análisis de las secuencias parciales del gen 16S rRNA
La información arrojada por los cromatogramas se editó con ayuda de los programas FinchTV y
BioEdit para seleccionar un fragmento de secuencia de DNA confiable que permitió utilizarlo
para análisis posteriores. Las secuencias de DNA se analizaron primeramente mediante el
algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) en la página del National Center for
Biotechnology Information (NCBI) para establecer las identidades de las bacterias en estudio con
secuencias registradas en dicha base de datos.
A continuación, se realizaron los alineamientos múltiples de secuencias con el algoritmo
ClustalW, mediante el software MEGA v. 5.05 (Molecular Evolutionary and Genetics Analysis).
Para ello, se seleccionaron las secuencias que mostraron afinidad del 98 y hasta el 100% (según
en análisis BLAST). A su vez, dichas secuencias pertenecieron a cepas de Pseudomonas
registradas en colecciones bacterianas internacionales o, en su defecto, que se encontraron
publicadas en revistas científicas de reconocido prestigio, principalmente en la International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. En caso de que alguna de las secuencias
careciera de las características antes mencionadas, se excluyó del trabajo para evitar el manejo de
datos no precisos.
Posterior a la fase de alineamiento y con propósitos exploratorios, las secuencias
alineadas se analizaron con el método Neighbor-joining para la construcción de árboles.
Finalmente, del dendrograma resultante se seleccionaron las secuencias que mostraron mayor
afinidad hacia las cepas en estudio y se reanalizaron con el mismo método, esto con la finalidad
de agilizar el análisis de las secuencias y evitar el manejo de datos innecesarios. En todos los
casos, para la construcción de dendrogramas se utilizó un análisis Bootstrap de 1000 repeticiones
y como elemento fuera de grupo, una secuencia de Acinetobacter rudis, especie de la misma
familia.
26
V.
RESULTADOS
5.1 Caracterización fenotípica de las cepas
Los resultados de las pruebas LOPAT se resumen en la Tabla 8. De manera general las bacterias
comparten resultados positivos para las pruebas Citocromo oxidasa y Arginina dihidrolasa.
Tabla 8. Resultados de las pruebas LOPAT recomendadas para la identificación de Pseudomonas
fitopatógenas.
Levana
B3
EST-07
-
B5
EST-07´
+
B6
PIN-03
+
B7
PIN-02
-
B8
TOM-03
-
Oxidasa
+
+
+
+
+
Papa
-
+
-
+
-
Arginina
+
+
+
+
+
Tabaco
-
+
-
-
-
(-) Negativo, (+) positivo.
B3 EST-07 y B5 EST-07´: Pseudomonas aisladas a partir de estropajo
B6 PIN-03 y B7 PIN-02: Pseudomonas aisladas a partir de pino
B8 TOM-03: Pseudomonas aisladas a partir de tomate
5.2 Extracciones de DNA genómico
El método usado para la extracción de DNA fue efectivo en todas las cepas bacterianas (Figura
9). Se obtuvieron productos limpios y con concentración adecuada para su uso en el trabajo
molecular.
27
Ci-07 Ci-07´ Pi-02
Pi-03
T-03
DNA
Figura 2. DNA genómico de las cepas de Pseudomonas spp. obtenido mediante el protocolo de Cheng y Jiang
(2006). Ci-07 y Ci07´: Pseudomonas aisladas a partir de estropajo. Pi-03 y Pi-02: Pseudomonas aisladas a partir
de pino. T-03: Pseudomonas aisladas a partir de tomate.
5.3 Amplificación del gen 16S rRNA
Se obtuvieron productos de amplificación de ≈ 750 pb para las cinco cepas de Pseudomonas en
estudio (Figura 10).
EST-07 EST-07´ PIN-03 PIN-02 Tom-03 mpm
2000 pb
Fragmentos amplificados del
gen 16S rRNA
750 pb
Figura 3. Productos de la amplificación parcial del gen 16S rRNA de Pseudomonas spp. B3 EST-07 y B5 EST07´: Pseudomonas aisladas a partir de estropajo. B6 PIN-03 y B7 PIN-02: Pseudomonas aisladas a partir de
pino. B8TOM-03: Pseudomonas aisladas a partir de tomate. Mpm: Marcador de tamaño molecular
(AMRESCOS).
28
5.4 Análisis del gen 16S rRNA
Las secuencias parciales del gen 16S rRNA de las cepas de Pseudomonas en estudio, arrojaron la
siguiente información.
a) Para la Cepa B3 EST-07 se obtuvo una secuencia de 400 nucleótidos, misma que se muestra
a continuación:
GAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAG
CTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGAT
GATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGG
GGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAG
GTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCCGTTACCTAATACGTGA
TGGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGG
TAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGT
GGTTT
El análisis BLAST indicó que esta cepa bacteriana tuvo una similitud del 99 % con 30
secuencias que correspondieron al mismo número de especies, estas fueron: P. rhodesiae, P.
marginalis, P. trivialis, P. poae, P. mediterránea, P. grimontii, P. congelans, P. tremae, P.
simiae, P. extremorientalis, P. savastanoi, P. ficuserectae, P. veronii, P. syringae pv. syringae, P.
meridiana, P. antárctica, P. orientalis, P. lurida, P. cannabina, P. viridiflava, P. mandelii, P.
caricapapayae, P. lini, P. cichorii, P. palleroniana, P. costanini, P. kilonensis, P. tolaasii, P.
amygdali y P. frederiksbergensis, así como también tiene un porcentaje de identidad del 98% con
otras 29 secuencias, de la misma manera, todas ellas pertenecieron a diferentes especies (Ver
Anexo 2 ).
En este caso, el dendrograma resultante del análisis de la secuencia utilizando NeighborJoining mostró que la cepa se agrupó con las especies P. grimontii, P. rhodesiae, P. mediterranea
y P. marginalis (Figura 4).
29
57
Pseudomonas rhodesiae CIP104664
Pseudomonas marginalis ATCC10844T
41
Pseudomonas mediterranea CFBP5447
47
43
Pseudomonas grimontii CFML97-514
80
Pseudomonas trivialis
B3 EST-07
14
Pseudomonas poae P527/13
Pseudomonas caricapapayae ENA-378
25
Pseudomonas palleroniana CFBP4389
53
86
Pseudomonas tolaasii LMG2342
Pseudomonas cichorii CFBP2101
Pseudomonas chlororaphis subsp aureofaciens DSM6698
56
Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca NCIB
98
33
Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis DSM50083T
Acinetobacter rudis CIP
Figura 4. Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la cepa B3 EST-07 (aislada de pudriciones en
frutos de estropajo) utilizando Neighbor-Joining, donde se muestra la agrupación con especies de Pseudomonas de
mayor afinidad.
b)
Para la cepa B5 EST-07´ se obtuvo la siguiente secuencia de 603 nucleótidos:
ACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAG
ATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACG
ATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCC
AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA
TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTT
GGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATA
AGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTT
AATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGA
AATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGT
AGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAA
CACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGC
GTGGGG
El análisis BLAST reportó que dos especies de Pseudomonas muestran el 100 % de
similitud con la cepa en estudio: P. simiae y P. extremorientalis. Adicionalmente se encontraron
30
25 secuencias con el 99% de identidad: P. trivialis, P. poae, P. meridiana, P. antarctica, P.
veronii, P. costantinii, P. tolaasii, P. lurida, P. palleroniana, P. orientalis, P. grimontii, P.
rhodesiae, P. tremae, P. lini, P. salomonii, P. mandelii, P. savastanoi, P. congelans, P.
fluorescens, P. ficuserectae, P. marginalis, P. syringae pv. syringae, P. frederiksbergensis, P.
caricapapayae y P. cannabina. Además, 26 secuencias mostraron el 98 % de afinidad (Ver
Anexo 2).
De ellas, las especies más cercanamente emparentadas con la cepa en estudio, de acuerdo
con el dendrograma resultante del algoritmo Neighbor-Joining, fueron: P. meridiana, P.
antarctica, P. extremorientalis, P. simiae y P. orientalis, P. veronii, P. trivialis y P. poae (Figura
5).
66
Pseudomonas meridiana CMS38
Pseudomonas antarctica CMS35
Pseudomonas extremorientalis KMM3447
B5 EST-07´
58
Pseudomonas simiae OLi
Pseudomonas orientalis CFML
Pseudomonas veronii CIP
72
Pseudomonas trivialis
61
Pseudomonas poae P527/13
Pseudomonas lurida DSM
51
Pseudomonas palleroniana CFBP4389
60
Pseudomonas costantinii CFBP5705
50
56
Pseudomonas tolaasii LMG2342
Pseudomonas salomonii CFBP2022
Pseudomonas fluorescens IAM
Acinetobacter rudis CIP
Figura 5. Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la cepa B5 EST-07´ (aislada de pudriciones en
frutos de estropajo) utilizando Neighbor-Joining, donde se muestra la agrupación con especies de Pseudomonas de
mayor afinidad.
c) Para la cepa B6 PIN-03. Se obtuvo una secuencia de 532 nucleótidos, misma que se
muestra a continuación.
31
CGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGAT
GAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGAT
CCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG
ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATC
CAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGG
GAGGAAGGGCAGTTGCCTAATACGTAGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAG
CACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAA
TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAA
TCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAG
AGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATAT
El análisis BLAST mostró que 19 secuencias se identificaron al 99 % con la cepa en
estudio, estas fueron: P. palleroniana, P. costantinii, P. tolaasii, P. lurida, P. simiae, P.
extremorientalis, P. trivialis, P. poae, P. lini, P. mandelii, P. meridiana, P. antarctica, P. veronii,
P. orientalis, P. grimontii, P. salomonii, P. rhodesiae, P. frederiksbergensis y P. fluorescens. Así
como también se encontraron 32 secuencias que mostraron afinidad hacia la cepa con un
porcentaje de 98 %.
El dendrograma resultante para la cepa en estudio la agruparon cerca de las especies P.
palleroniana, P. tolaasii, P. costantinii, y P. lurida, P. lini y P. mandelii (Figura 6).
Pseudomonas palleroniana CFBP4389
Pseudomonas tolaasii LMG2342
Pseudomonas costantinii CFBP5705
57
Pseudomonas lurida DSM15835
B6 PIN-03
Pseudomonas lini CFBP5737
99
Pseudomonas mandelii CIP105273
Pseudomonas salomonii CFBP2022
83
Pseudomonas fluorescens IAM12022
Acinetobacter rudis CIP
Figura 6. Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la cepa B6 PIN-03 (aislada a partir de tumores en
plántulas de pino) utilizando Neighbor-Joining, donde se muestra la agrupación con especies de Pseudomonas de
mayor afinidad.
32
d) En el caso de la cepa B7 PIN-02 se obtuvo como resultado una secuencia de 569 bases:
TATTAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCG
ACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCC
AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATC
CAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGA
GGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCG
GCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATT
ACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCT
CAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGA
ATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGG
CGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA
TTA
El análisis BLAST para la cepa en estudio mostró el 99 % de similitud con 16 especies
del género Pseudomonas, estas fueron: P. tremae, P. savastanoi, P. congelans, P. ficuserectae, P.
syringae pv. syringae, P. caricapapayae, P. cannabina, P. mandelii, P. lini, P. simiae, P.
chlororaphis subsp. aurantiaca, P. chlororaphis subsp. chlororaphis, P. extremorientalis, P.
kilonensis, P. veronii y P. amygdali. También se reportó similitud del 98 % con otras 50
secuencias pertenecientes a especies diferentes.
Como resultado del análisis múltiple de secuencias se encontró que la cepa en estudio está
más relacionada con las especies P. ficuserectae, P. syringae pv. syringae, P. congelans, P.
tremae, P. savastanoi y P. caricapapayae (Figura 7).
33
Pseudomonas ficuserectae JCM2400
67
Pseudomonas syringae pv. syringae NCPPB281
Pseudomonas congelans P538/23
59
Pseudomonas tremae TO1
60
Pseudomonas savastanoi ATCC13522
65
Pseudomonas caricapapayae ENA-378
B7 PIN-02
71
Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca NCIB10068
98
Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis DSM50083T
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens DSM6698
Pseudomonas cremoricolorata IAM1541
Acinetobacter rudis CIP
Figura 7. Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la cepa B7 PIN-02 (aislada a partir de tumores en
plántulas de pino) utilizando Neighbor-Joining, donde se muestra la agrupación con especies de Pseudomonas de
mayor afinidad.
e) Para la cepa B8 TOM-03 se obtuvo la siguiente secuencia conformada por 551
nucleótidos.
TATTAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCG
ACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCC
AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATC
CAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGA
GGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCG
GCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATT
ACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCT
CAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGA
ATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGG
CGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGT
Se encontraron 16 secuencias con el 99 % de identidad: P. tremae, P. savastanoi, P.
congelans, P. ficuserectae, P. syringae pv. syringae, P. caricapapayae, P. cannabina, P.
mandelii, P. lini, P. simiae, P. chlororaphis subsp. aurantiaca, P. chlororaphis subsp.
34
chlororaphis , P. extremorientalis, P. kilonensis, P. veronii y P. amygdaly. Por otra parte, 42
secuencias mostraron afinidad del 98 % hacia la cepa en estudio.
Al someter la secuencia al análisis de Neighbor-Joining, la cepa se acercó a las mimas
especies fitopatógenas que la cepa anterior, estas fueron: P. congelans, P. syringae pv. syringae,
P. ficuserectae, P. tremae, P. savastanoi y P. caricapapayae (Figura 8).
Pseudomonas congelans P538/23
66
Pseudomonas syringae pv. syringae NCPPB281
Pseudomonas ficuserectae JCM2400
60
Pseudomonas tremae TO1
58
Pseudomonas savastanoi ATCC13522
64
Pseudomonas caricapapayae ENA-378
B8 TOM-03
70
Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca NCIB10068
98
Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis DSM50083T
Pseudomonas chlororaphis subsp aureofaciens DSM6698
Pseudomonas cremoricolorata IAM1541
Acinetobacter rudis CIP
Figura 8. Dendrograma resultante del análisis de la secuencia de la cepa B8 TOM-03 (aislada de manchas foliares
necróticas en plantas de tomate) utilizando Neighbor-Joining, donde se muestra la agrupación con especies de
Pseudomonas de mayor afinidad.
35
VI.
DISCUSIÓN
De acuerdo al esquema LOPAT la cepa B3 EST-07 no tuvo el 100 % de coincidencia con alguna
especie de Pseudomonas fitopatógenas en particular. Con solo un resultado distinto se
encontraron seis especies posibles con las cuales la cepa pudiera corresponder, estas fueron: P.
agarici, P. cichorii, P. fuscovaginae, P. corrugata y P. costantinii y P. palleroniana.
De estas especies P. agarici y P. costantinii están reportadas como patógenas de hongos
cultivados donde provocan pudriciones blandas de color café (Munsch et al., 2002) y no han sido
reportadas como patógenas para vegetales. Por su parte, P. palleroniana está reportada
únicamente como patógeno del arroz (Gardan et al., 2002; Bull et al., 2010) provocando necrosis
en la semilla y en la vaina de las hojas, sin embargo, esta especie produce levana (Tabla 9),
característica diferencial con respecto a la cepa en estudio. P. fuscovaginae causa la pudrición de
la cascarilla del arroz (Miyajima et al., 1983) y difirió con la cepa EST-07 en la pudrición de la
papa (Tabla 9). Para el caso de P. corrugata, esta especie es descartada como posible identidad
de la cepa en cuestión por ser una especie que no produce pigmentos fluorescentes. En tanto que
la especie con mayor afinidad correspondió a P. cichorii la cual tiene un amplio rango de
hospederos, entre los que se encuentra el estropajo (Díaz y Ávila, 2002), y de manera general
causa manchas foliares y del tallo; para lechuga se ha reportado que causa podredumbres de las
nervaduras centrales (Pauwelyn et al., 2011).
Al relacionar los datos del análisis anterior con el análisis molecular, los resultados
indicaron que la cepa en estudio tuvo mayor afinidad con P. palleroniana y P. cichorii (Figura
4), sin embargo, se considera que esta última, por las características anteriormente mencionadas,
podría ser la especie de mayor similitud. Aunque no se puede llegar a una conclusión categórica
debido a los valores de confianza arrojado por el análisis (Figura 4).
Para el caso de la cepa B5 EST-07´, la caracterización del esquema LOPAT la identificó
al 100 % con P. marginalis, aunque se indica que esta especie es variable para la prueba de
hipersensibilidad en tabaco. La especie tiene un amplio rango de hospederos, así como también
es capaz de ocasionar diferentes síntomas entre los que se mencionan necrosis marginal de las
36
hojas, pudriciones blandas y de color café y pudrición de las raíces (Höfte y De Vos, 2006). Los
síntomas de pudriciones blandas encajan en los encontrados en los frutos de estropajo, sin
embargo no se ha reportado como agente patógeno para dicho cultivo.
Por su parte, en el análisis molecular se encontró una relación estrecha de la cepa con P.
meridiana, P. antarctica, P. extremorientalis, P. simiae, P. orientalis, P. veronii, P trivialis y P.
poae (Figura 5) con un aceptable índice de confianza, cabe resaltar que todas estas especies son
de reciente descripción (Elomari et al., 1996; Ivanova et al., 2002; Vela et al., 2006; Behrendt et
al., 2003; Gundlapalli et al., 2004). Ninguna de ellas está reportada como especie fitopatógena y
en este estudio no se encontró a P. marginalis estrechamente relacionada con la cepa B5 EST07´, de esta manera no hay un consenso entre los experimentos moleculares y la caracterización
del esquema LOPAT.
La caracterización de la cepa B6 PIN-03 bajo el esquema LOPAT, la identificó al 100%
con las especies P. palleroniana y P. salomonii. Como se mencionó anteriormente P.
palleroniana es patógena de cultivos de arroz mientras que P. salomonii lo es para el ajo
ocasionando la enfermedad del tizón bacteriano, iniciando con necrosis en las hojas y puede
conducir a pudriciones blandas y muerte de la planta (Gardan et al., 2002; Jacques et al., 2009).
Los síntomas ocasionados por estas dos especies no son similares a los encontrados en las
plántulas de pino (tumoraciones), además de que no se encontraron reportes de pino como
hospedero para estas especies.
Bajo los análisis de Neighbor-Joining P. palleroniana y P. costantinii se encontraron
cercanamente relacionadas con la cepa en estudio en una agrupación sustentada con un aceptable
índice de confianza (57 %) (Figura 6). Ambas especies son consideradas dentro del Biovar A de
Pseudomonas fluorescens y, por tal motivo, es de esperarse resultados similares para las pruebas
fenotípicas y los análisis genotípicos. Aunque hay un consenso entre el esquema LOPAT y el
análisis de las secuencias, ambos datos son insuficientes para diferenciar entre una de las dos
especies.
37
En lo que respecta a las pruebas de LOPAT para la caracterización de la cepa B7 PIN-02,
ésta concordó totalmente con la especie Pseudomonas fuscovaginae. Esta especie está reportada
como patógena para nueve especies de gramíneas en las que ocasiona pudriciones de color café
(Miyajima, 1983), pero no se tienen registros de afectaciones a otras familias de vegetales como
las Pináceas. Otro punto a considerar es que la cepa estudio fue aislada a partir de tumoraciones
en plantas de pino, mientras que P. fuscovaginae no tiene la capacidad de ocasionar dicha
sintomatología.
En cuanto al análisis molecular, B7 PIN-02 se agrupó con P. caricapapayae, P.
ficuserectae, P. syringae pv. syringae, P. tremae y P. savastanoi. Todas ellas, especies de
importancia fitopatógena (Bull et al., 2010; Gardan et al., 1999), así como también con P.
congelans (Figura 7), esta última se ha mencionado como potencial agente patogénico debido a
su cercanía filogenética con Pseudomonas causantes de enfermedades en plantas (Behrendt,
2003). De las especies relacionadas a la cepa, solo P. savastanoi es capaz de producir
tumoraciones en los tejidos que infecta, sin embargo, la cepa difiere considerablemente en la
caracterización LOPAT.
Por otro lado, las especies que causan enfermedades y que se agruparon cerca de la cepa
en estudio alguna vez fueron consideradas como patovares de Pseudomonas syringae (Bull et al.,
2010), de nueva cuenta se muestra la heterogeneidad de algunas cepas catalogadas dentro de un
mismo taxón, pero que después y con el uso de técnicas integrales de identificación fueron
catalogadas como especies diferentes.
Con una secuencia casi idéntica y con los resultados del análisis BLAST similares a la
cepa B7 PIN-02, la bacteria B8 TOM-03 se relacionó con las mismas especies del análisis de
secuencias: P. caricapapayae, P. ficuserectae, P. syringae pv. syringae, P. tremae, P. congelans
y P. savastanoi (Figura 8). Sin embargo, la cepa resultó en un esquema LOPAT completamente
diferente a la cepa B7 PIN-02, e idéntico a los resultados para la cepa B3 EST-07, el cual la
identificó con varias especies de Pseudomonas fitopatógenas (Tabla 9).
38
Se pueden descartar las especies P. tolaasii, P. costantinii y P. agarici por ser patógenos
de hongos cultivados (Grewal et al., 1995; Cutri et al., 1984). A su vez P. corrugata es patógeno
para cultivos de tomate (Catara et al., 2002) y difiere solo en la prueba de hipersensibilidad en
tabaco, al respecto se ha mencionado que las cepas pueden perder esta característica después de
múltiples resiembras en medios de cultivo.
En este estudio se observó un aspecto importante en la identificación de las bacterias, el
cual se ha señalado de manera repetida, y que es la diversidad dentro del género Pseudomonas
donde se encuentran especies ligeramente heterogéneas de acuerdo con Palleroni et al. (1973) y,
por tal motivo, depender sólo de pruebas fenotípicas o genotípicas no basta (Palleroni, 1993;
Brawn-Kiewnick y Sands, 2001), en este caso un estudio más profundo basado en ambos tipos de
análisis sería lo ideal para identificarlas con precisión.
Es conveniente indicar que el trabajo con Pseudomonas fitopatógenas se inició en 1966 y
el esquema LOPAT fue establecido en 1967 (Palleroni, 1993). Durante sus inicios y hasta fechas
relativamente recientes fue muy utilizado para la identificación práctica de Pseudomonas
fitopatógenas. Sin embargo, ahora no es generalizado su uso y no se encuentra actualizado,
muestra de ello es el bajo número de especies descritas en la Guía de Laboratorio para la
Identificación de Bacterias Patógenas de Plantas (Brawn-Kiewnick y Sands, 2001) lo cual, en la
actualidad ha cambiado considerablemente debido al reporte de nuevas especies fitopatógenas y a
la reubicación de otras más, esto con el empleo de las técnicas de biología molecular
(Vandamme et al., 1996). Algunas de estas nuevas especies carecen de la caracterización LOPAT
completa y, en algunos casos, sus resultados se reportan como variables (Tabla 9).
Adicionalmente y como ya se indicó, en los últimos años se han tenido reportes de nuevas
especies del género en cuestión, sin embargo, hay que mencionar que la caracterización de
nuevos microorganismos ha tenido efervescencia en países de Europa y en Estados Unidos,
mientras que en nuestro país sólo se encontró el trabajo realizado por Escalante et al. (2009), esto
remarca el poco conocimiento que se tiene en cuanto a diversidad de Pseudomonas para México,
muy particularmente para especies de importancia fitopatógena.
39
En este estudio, las comparaciones de secuencias y del esquema LOPAT se realizaron en
base a resultados obtenidos para cepas registradas en otros países, por lo que es alta la
probabilidad de que los resultados difieran considerablemente, tomando en cuenta que son cepas
nativas, y particularmente para los casos de pino y estropajo, daños no reportados. Esto puede
explicar la falta de exactitud del análisis BLAST, donde en la mayoría de los casos, las cepas en
estudio eran 99% similares con un gran número de especies. Cabe mencionar que la longitud de
las secuencias no es un factor limitante para la identificación de microorganismos en general
(Clarridge III, 2004) y, por lo tanto podríamos hablar de cepas genéticamente únicas. Mismo
hecho que revela la importancia de generar conocimiento sobre estas especies para nuestro
territorio.
40
Tabla 9. Concentrado de los resultados del esquema LOPAT para la mayoría de las especies de Pseudomonas fitopatógenas reportadas hasta 2010 por Bull et al.
Las cepas en estudio se encuentran al final de la tabla con su clave correspondiente.
Levana
P.
marginalis
+
P.
tolaasii
-
P.
agarici
-
P.
cichorii
-
Oxidasa
+
+
+
+
Papa
+
-
-
-
Arginina
+
-
-
-
-
Tabaco
+/-
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
P.
costantinii
P.
palleroniana
P.
congenlans
P.
amygdali
P.
asplenii
P.
avellanae
P.
cissicola
P.
meliae
P.
salomonii
B3 EST07
B6 PIN-03
Levana
-
+
-
ND
-
+
-
-
+
-
B5
EST07´
+
Oxidasa
+
+
-
-
-
+
-
+
+
+
+
Papa
ND
-
-
-
-
-
-
-
+
-
Arginina
+
+
-
+/-
+
+/-
ND
+
+
+
+
Tabaco
-
-
+
+
+/-
+
-
-
+
-
B8 TOM-03
Levana
B7 PIN02
-
Oxidasa
+
+
Papa
+
-
Arginina
+
+
Tabaco
-
-
(+) positivo
(-) negativo
(ND) no determinado
(+/-) variable
-
P.
viridiflava
-
P.
savastanoi
-
P.
syringae
+
P.
fuscovaginae
-
P.
corrugata
-
P.
cannabina
+
P.
tremae
-
P.
ficuserectae
+
-
-
-
+
+
-
-
-
+
+/-
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
VII.
CONCLUSIONES
La caracterización LOPAT permitió relacionar a tres cepas (B5 EST-07´, B6 PIN-03 y B7 PIN02) con especies de Pseudomonas fitopatógenas, no obstante, no se encontró concordancia entre
la sintomatología observada y las especies hospederas reportadas. En el resto de las cepas (B3
EST-07 y B8 TOM-03) se obtuvo el mismo resultado del esquema y no se encontró coincidencia
con alguna especie fitopatógena reportada.
El análisis BLAST con las secuencias parciales del gen 16S rRNA no resolvió totalmente
la identidad de las cepas de Pseudomonas en estudio, en tanto que las agrupaciones generadas por
el método de Neighbor-Joining permitieron observar una tendencia de similitud hacia especies de
Pseudomonas fitopatógenas, que si bien no fueron contundentes hacia una especie particular,
permitió descartar un grupo amplio de especies con menor afinidad. En solo dos casos, cepas B3
EST-07 y B7 PIN-02, se estableció cierto grado de similitud con P. cichorii y P. savastanoi,
respectivamente, en concordancia con lo esperado, tomando en cuenta la relación hospedero
patógeno y su sintomatología.
Si bien el análisis de las secuencias de genes que codifican para la subunidad 16S rRNA
es una técnica útil, para México las caracterizaciones moleculares en cepas fitopatógenas son
escasas, por lo que se desconoce en gran medida la biodiversidad de este grupo microbiano. Los
resultados de este estudio ponen de manifiesto una serie de elementos a considerar con el
propósito de proponer estudios integrales (fenotípico, genotípico y ecológico) que permitan una
caracterización completa de los microorganismos, lo cual conllevará a su identificación precisa y
ésta, al conocimiento real de las condiciones fitosanitarias que prevalecen en el país.
42
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49
ANEXO 1
Producción de levana: los cultivos bacterianos B5 EST-07´ y B6 PIN-03 formaron colonias
elevadas en el medio, tomándose como resultados positivos (Figura 9).
a
b
Figura 9. Resultados para la formación de levana por las cepa PIN-03 (a) y EST-07´ (b), colonias elevadas.
Citocromo Oxidasa: las cepas bacterianas (B3 EST-7, B5 EST-7´, B6 PIN-03, B8 TOM-03
y B7 PIN-02) fueron examinadas para la presencia de la enzima, de las cuales todas las bacterias
presentaron Oxidasa Positivo (Figura 10). Como se mencionó anteriormente, un cambio de
coloración o la presencia de un color violeta indican resultados positivos.
50
Figura 10. Resultado para la prueba de Citocromo-oxidasa, positivo en todas las cepas.
NOTA: Ci-07= B3 EST-07, CI-07´= B5 EST-07´, T-03= B8 TOM-03, PI-03= B6 PIN-03 Y PI-02= B7 PIN-02; a su
vez se muestran resultados para cepas no incluidas en el presente estudio.
Pudrición en papa: Después de un período de incubación de 48 horas en cámara húmeda, se
revisaron los daños causados en tubérculos de papa. Las cepas que ocasionaron pudriciones
fueron EST-07´ y PIN-02 (Figura 11). Las pudriciones en rebanadas de papa son ocasionadas por
enzimas que hidrolizan almidón.
TOM-03
PIN-03
EST-07´
PIN-02
EST-07
TESTIGO
Figura 11. Prueba de pudrición en tubérculos de papa. Las cepas B7 PIN-02 y B3 EST-07 fueron positivas, con
daños notorios en los tubérculos de papa.
Arginina Dihidrolasa: Todas las cepas bacterianas fueron positivas para la prueba, se
corroboró con un tubo testigo (Figura 12).
51
Figura 12. Resultados para la prueba de Arginina dihidrolasa en medio Thornley 2A. Resultados positivos en todas
las cepas.
Prueba de hipersensibilidad en tabaco: Para esta prueba sólo B5 EST-07´ fue positiva,
presentado necrosis locales y colapso de las venas en las que se inoculó, así como también
adelgazamiento en el tejido laminar (Figura 13).
c
d
a
b
Figura 13. Reacción de hipersensibilidad en plantas de tabaco. a) y b) planta testigo en la que sólo se inoculó agua
destilada estéril, c) y d) planta con necrosis inoculada con la cepa B5 EST-07´.
52
ANEXO 2
Tabla 10. Resultados del análisis en BLAST para la cepa B3 EST-07.
Accession
gi|219857280|NR_024911.1
gi|224581448|NR_027230.1
gi|265678682|NR_028987.1
gi|265678681|NR_028986.1
gi|265678522|NR_028826.1
gi|219857514|NR_025102.1
gi|265678680|NR_028985.1
gi|219878410|NR_025549.1
gi|343201666|NR_042392.1
gi|219857586|NR_025174.1
gi|219856888|NR_024707.1
gi|343200111|NR_040798.1
gi|265678404|NR_028706.1
gi|343198806|NR_043716.1
gi|219878448|NR_025587.1
gi|219878447|NR_025586.1
gi|219857278|NR_024909.1
gi|343201473|NR_042199.1
gi|219878411|NR_025550.1
gi|343202464|NR_042764.1
gi|219857271|NR_024902.1
gi|310974966|NR_036830.1
Description
Pseudomonas rhodesiae strain CIP
104664 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas marginalis strain LMG
2210 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas trivialis strain P 513/19
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas poae strain P 527/13 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas mediterranea strain CFBP
5447 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas grimontii strain CFML 97514 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas congelans strain P 538/23
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas tremae strain TO1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas simiae strain : OLi 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas extremorientalis strain
KMM 3447 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas savastanoi strain ATCC
13522 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas ficuserectae strain JCM
2400 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas veronii strain CIP 104663
16S ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas syringae pv. syringae strain
NCPPB 281; 8511 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas meridiana strain CMS 38
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas antarctica strain CMS 35
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas orientalis strain CFML 96170 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas lurida strain : DSM 15835
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas cannabina strain CFBP
2341 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas viridiflava strain CECT
458 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas mandelii strain CIP 105273
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ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas cichorii strain PC1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas palleroniana strain CFBP
4389 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas costantinii strain CFBP
5705 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas kilonensis strain 520-20
16S ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas tolaasii strain LMG 2342
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas amygdali strain AL1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas frederiksbergensis strain
JAJ28 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
aurantiaca strain NCIB 10068 16S
ribosomal RNA, partial sequence
strain DSM 6698 16S ribosomal RNA,
complete sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
chlororaphis strain DSM 50083T 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas asplenii strain ATCC
23835 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas plecoglossicida strain
FPC951 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas brassicacearum strain
DBK11 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas salomonii strain CFBP
2022 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas panacis strain CG20106
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas psychrophila strain E-3
16S ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas brenneri strain CFML 97391 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas proteolytica strain CMS 64
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas monteilii strain CIP
104883 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas agarici strain 71A 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas vranovensis strain CCM
7279 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas thivervalensis strain
SBK26 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas lutea strain OK2 16S
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Pseudomonas fluorescens strain IAM
12022 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas migulae strain CIP 105470
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas graminis strain DSM
11363 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas japonica strain IAM 15071
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas corrugata strain Slade
939/1 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas lundensis strain ATCC
49968 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas rhizosphaerae strain IH5
16S ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas fulva strain IAM 1541 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas cremoricolorata strain IAM
1541 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas oryzihabitans strain L-1
16S ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas alcaligenes strain
IAM12411 16S ribosomal RNA,
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Tabla 11. Resultados del análisis BLAST para B5 EST-07´
Accession
Description
gi|265678745|NR_029050.1
Pseudomonas simiae strain : OLi 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas extremorientalis strain
KMM 3447 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas trivialis strain P 513/19
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas poae strain P 527/13 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas meridiana strain CMS 38
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas antarctica strain CMS 35
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas veronii strain CIP 104663
16S ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas costantinii strain CFBP
5705 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas tolaasii strain LMG 2342
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas lurida strain : DSM 15835
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas palleroniana strain CFBP
4389 16S ribosomal RNA, partial
sequence
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Pseudomonas grimontii strain CFML 97514 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas rhodesiae strain CIP
104664 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas tremae strain TO1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas lini strain DLE411J 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas salomonii strain CFBP
2022 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas mandelii strain CIP 105273
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas savastanoi strain ATCC
13522 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas congelans strain P 538/23
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas fluorescens strain IAM
12022 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas ficuserectae strain JCM
2400 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas marginalis strain LMG
2210 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas syringae pv. syringae strain
NCPPB 281; 8511 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas frederiksbergensis strain
JAJ28 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas caricapapayae strain Robbs
ENA-378 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas cannabina strain CFBP
2341 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
aurantiaca strain NCIB 10068 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas mediterranea strain CFBP
5447 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas brenneri strain CFML 97391 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas proteolytica strain CMS 64
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
chlororaphis strain DSM 50083T 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas kilonensis strain 520-20
16S ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas amygdali strain AL1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas panacis strain CG20106
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas umsongensis strain Ps 3-10
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas asplenii strain ATCC
23835 16S ribosomal RNA, complete
sequence
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Pseudomonas corrugata strain Slade
939/1 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas brassicacearum strain
DBK11 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas viridiflava strain CECT
458 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas agarici strain 71A 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
aureofaciens strain DSM 6698 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas fulva strain IAM 1541 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas cremoricolorata strain IAM
1541 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas psychrophila strain E-3
16S ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas libanensis strain CIP
105460 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas thivervalensis strain
SBK26 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas cedrina subsp. fulgida
strain : DSM 14938 = LMG 21467 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas cedrina strain CFML 96198 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas gessardii strain CIP
105469 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas plecoglossicida strain
FPC951 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas cichorii strain PC1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
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100%
0
99%
Tabla 12. Resultados del análisis BLAST para B6 PIN-03
Accession
gi|265678745|NR_029050.1
gi|219857576|NR_025164.1
gi|343198428|NR_041799.1
gi|343201473|NR_042199.1
gi|343201666|NR_042392.1
gi|219857586|NR_025174.1
gi|265678682|NR_028987.1
Description
Pseudomonas palleroniana strain CFBP
4389 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas costantinii strain CFBP
5705 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas tolaasii strain LMG 2342
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas lurida strain : DSM
15835 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas simiae strain : OLi 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas extremorientalis strain
KMM 3447 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas trivialis strain P 513/19
16S ribosomal RNA, partial sequence
57
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gi|219857278|NR_024909.1
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gi|219857515|NR_025103.1
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gi|265678601|NR_028906.1
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gi|343198652|NR_043195.1
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gi|310974966|NR_036830.1
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gi|224581448|NR_027230.1
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Pseudomonas poae strain P 527/13 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas lini strain DLE411J 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas mandelii strain CIP
105273 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas meridiana strain CMS 38
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas antarctica strain CMS 35
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas veronii strain CIP
104663 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas orientalis strain CFML
96-170 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas grimontii strain CFML
97-514 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas salomonii strain CFBP
2022 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas rhodesiae strain CIP
104664 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas cannabina strain CFBP
2341 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas brenneri strain CFML
97-391 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas proteolytica strain CMS
64 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas frederiksbergensis strain
JAJ28 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas fluorescens strain IAM
12022 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas tremae strain TO1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas panacis strain CG20106
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas umsongensis strain Ps 310 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas caricapapayae strain
Robbs ENA-378 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas savastanoi strain ATCC
13522 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas migulae strain CIP
105470 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas marginalis strain LMG
2210 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas congelans strain P
538/23 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas kilonensis strain 520-20
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas ficuserectae strain JCM
2400 16S ribosomal RNA, complete
sequence
955
955
100%
0
99%
955
955
100%
0
99%
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955
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955
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99%
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955
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99%
955
955
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0
99%
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950
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99%
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946
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0
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944
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99%
944
944
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0
99%
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939
100%
0
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939
100%
0
98%
939
939
100%
0
98%
939
939
100%
0
99%
939
939
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0
99%
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933
100%
0
98%
933
933
100%
0
98%
933
933
100%
0
98%
933
933
100%
0
98%
933
933
100%
0
98%
933
933
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0
98%
933
933
100%
0
98%
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928
100%
0
98%
928
928
100%
0
98%
928
928
100%
0
98%
58
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gi|343198806|NR_043716.1
gi|219857281|NR_024912.1
gi|343206382|NR_044974.1
gi|343200115|NR_040802.1
gi|219857270|NR_024901.1
gi|310975271|NR_037135.1
gi|219857362|NR_024950.1
gi|219857287|NR_024918.1
gi|265678522|NR_028826.1
gi|219857340|NR_024928.1
gi|343202255|NR_042541.1
gi|343202464|NR_042764.1
gi|265678317|NR_028619.1
gi|219856843|NR_024662.1
gi|310975134|NR_036998.1
gi|219857363|NR_024951.1
Pseudomonas amygdali strain AL1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas cedrina subsp. fulgida
strain : DSM 14938 = LMG 21467 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
aurantiaca strain NCIB 10068 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas syringae pv. syringae
strain NCPPB 281; 8511 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas cedrina strain CFML 96198 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
chlororaphis strain DSM 50083T 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas asplenii strain ATCC
23835 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas libanensis strain CIP
105460 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas corrugata strain Slade
939/1 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas brassicacearum strain
DBK11 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas jessenii strain CIP
105274 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas mediterranea strain
CFBP 5447 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas gessardii strain CIP
105469 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas reinekei strain : MT1
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas viridiflava strain CECT
458 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas psychrophila strain E-3
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas plecoglossicida strain
FPC951 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas agarici strain 71A 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas thivervalensis strain
SBK26 16S ribosomal RNA, partial
sequence
928
928
100%
0
98%
922
922
100%
0
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922
922
100%
0
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922
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0
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922
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922
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922
100%
0
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922
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0
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920
100%
0
98%
920
920
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918
100%
0
98%
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917
100%
0
98%
917
917
100%
0
98%
911
911
100%
0
98%
911
911
100%
0
98%
911
911
100%
0
98%
911
911
100%
0
98%
911
911
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0
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909
909
100%
0
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Max
score
Total
score
Query
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E value
Max
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1040
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99%
1040
1040
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1035
1035
100%
0
99%
Tabla 13. Resultados del análisis BLAST para B7 PIN-02.
Accession
gi|219878410|NR_025549.1
gi|219856888|NR_024707.1
gi|265678680|NR_028985.1
Description
Pseudomonas tremae strain TO1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas savastanoi strain ATCC
13522 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas congelans strain P
538/23 16S ribosomal RNA, partial
59
sequence
gi|343200111|NR_040798.1
gi|343198806|NR_043716.1
gi|310974966|NR_036830.1
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gi|219857271|NR_024902.1
gi|265678737|NR_029042.1
gi|343201666|NR_042392.1
gi|343205610|NR_043935.1
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gi|219857586|NR_025174.1
gi|265678624|NR_028929.1
gi|265678404|NR_028706.1
gi|310975135|NR_036999.1
gi|265678682|NR_028987.1
gi|265678681|NR_028986.1
gi|265678522|NR_028826.1
gi|343202464|NR_042764.1
gi|219878448|NR_025587.1
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gi|265678601|NR_028906.1
gi|343199104|NR_044569.1
gi|310975271|NR_037135.1
gi|265678745|NR_029050.1
gi|343200173|NR_040860.1
gi|343200188|NR_040875.1
Pseudomonas ficuserectae strain JCM
2400 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas syringae pv. syringae
strain NCPPB 281; 8511 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas caricapapayae strain
Robbs ENA-378 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas cannabina strain CFBP
2341 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas mandelii strain CIP
105273 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas lini strain DLE411J 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas simiae strain : OLi 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
aurantiaca strain NCIB 10068 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
chlororaphis strain DSM 50083T 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas extremorientalis strain
KMM 3447 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas kilonensis strain 520-20
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas veronii strain CIP
104663 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas amygdali strain AL1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas trivialis strain P 513/19
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas poae strain P 527/13 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas mediterranea strain
CFBP 5447 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas viridiflava strain CECT
458 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas meridiana strain CMS 38
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas antarctica strain CMS 35
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas frederiksbergensis strain
JAJ28 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas cuatrocienegasensis
strain 1N 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas corrugata strain Slade
939/1 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas palleroniana strain CFBP
4389 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas fulva strain IAM 1541
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas cremoricolorata strain
IAM 1541 16S ribosomal RNA, partial
sequence
1035
1035
100%
0
99%
1029
1029
100%
0
99%
1029
1029
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0
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1024
1024
100%
0
99%
1018
1018
100%
0
99%
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1007
100%
0
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1007
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0
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100%
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100%
0
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100%
0
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100%
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0
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0
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1002
100%
0
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1002
100%
0
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1002
1002
100%
0
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1002
1002
100%
0
98%
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1002
100%
0
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1002
1002
100%
0
98%
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1002
100%
0
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1000
99%
0
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1000
100%
0
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996
100%
0
98%
996
996
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0
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gi|219857576|NR_025164.1
gi|343198428|NR_041799.1
gi|343201195|NR_041952.1
gi|219857339|NR_024927.1
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gi|219856843|NR_024662.1
gi|310975134|NR_036998.1
gi|343201473|NR_042199.1
gi|219857336|NR_024924.1
gi|343198697|NR_043313.1
gi|219857358|NR_024946.1
gi|219857278|NR_024909.1
gi|219856913|NR_024734.1
gi|310975045|NR_036909.1
gi|219857279|NR_024910.1
gi|219846356|NR_025947.1
gi|219857362|NR_024950.1
Pseudomonas psychrophila strain E-3
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas putida strain IAM 1236
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas asplenii strain ATCC
23835 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas grimontii strain CFML
97-514 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas lundensis strain ATCC
49968 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas marincola strain KMM
3042 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas segetis strain FR1439
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas umsongensis strain Ps 310 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas costantinii strain CFBP
5705 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas tolaasii strain LMG 2342
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas abietaniphila strain
:ATCC 700689 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas migulae strain CIP
105470 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas rhodesiae strain CIP
104664 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas plecoglossicida strain
FPC951 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas agarici strain 71A 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas lurida strain : DSM
15835 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas mosselii strain CIP
105259 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas vranovensis strain CCM
7279 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas fragi strain ATCC 4973
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas orientalis strain CFML
96-170 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas alcaliphila strain AL1521 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas taetrolens strain I11 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas monteilii strain CIP
104883 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas flavescens strain B62
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas brassicacearum strain
DBK11 16S ribosomal RNA, partial
996
996
100%
0
98%
996
996
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0
98%
996
996
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0
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992
100%
0
98%
992
992
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0
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990
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98%
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990
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0
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0
98%
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990
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0
98%
990
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0
98%
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0
98%
990
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0
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985
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0
98%
985
985
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0
98%
985
985
100%
0
98%
985
985
100%
0
98%
985
985
100%
0
98%
985
985
100%
0
98%
985
985
100%
0
98%
985
985
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0
98%
985
985
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0
98%
983
983
100%
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98%
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Pseudomonas jessenii strain CIP
105274 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas salomonii strain CFBP
2022 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
aureofaciens strain DSM 6698 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas moraviensis strain CCM
7280 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas marginalis strain LMG
2210 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas borbori strain : R-20821
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas thivervalensis strain
SBK26 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas lutea strain OK2 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas koreensis strain Ps 9-14
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas oryzihabitans strain L-1
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas pseudoalcaligenes strain
Stanier 63 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas cichorii strain PC1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas graminis strain DSM
11363 16S ribosomal RNA, complete
sequence
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985
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Tabla 14. Resultados del análisis BLAST para B8 TOM-03.
Accession
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Description
Pseudomonas tremae strain TO1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas savastanoi strain ATCC
13522 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas congelans strain P
538/23 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas ficuserectae strain JCM
2400 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas syringae pv. syringae
strain NCPPB 281; 8511 16S ribosomal
RNA, partial sequence
Pseudomonas caricapapayae strain
Robbs ENA-378 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas cannabina strain CFBP
2341 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas mandelii strain CIP
105273 16S ribosomal RNA, partial
62
sequence
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gi|219856885|NR_024704.1
Pseudomonas lini strain DLE411J 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas simiae strain : OLi 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
aurantiaca strain NCIB 10068 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
chlororaphis strain DSM 50083T 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas extremorientalis strain
KMM 3447 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas kilonensis strain 520-20
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas veronii strain CIP
104663 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas amygdali strain AL1 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas trivialis strain P 513/19
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas poae strain P 527/13 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas mediterranea strain
CFBP 5447 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas viridiflava strain CECT
458 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas meridiana strain CMS 38
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas antarctica strain CMS 35
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas frederiksbergensis strain
JAJ28 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas cuatrocienegasensis
strain 1N 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas corrugata strain Slade
939/1 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas palleroniana strain CFBP
4389 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas fulva strain IAM 1541
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas cremoricolorata strain
IAM 1541 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas psychrophila strain E-3
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas putida strain IAM 1236
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas asplenii strain ATCC
23835 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas grimontii strain CFML
97-514 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas lundensis strain ATCC
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sequence
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gi|343201724|NR_042450.1
Pseudomonas marincola strain KMM
3042 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas segetis strain FR1439
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas umsongensis strain Ps 310 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas costantinii strain CFBP
5705 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas tolaasii strain LMG 2342
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas abietaniphila strain
:ATCC 700689 16S ribosomal RNA,
partial sequence
Pseudomonas migulae strain CIP
105470 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas rhodesiae strain CIP
104664 16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas plecoglossicida strain
FPC951 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas agarici strain 71A 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas lurida strain : DSM
15835 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas mosselii strain CIP
105259 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas vranovensis strain CCM
7279 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas fragi strain ATCC 4973
16S ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas orientalis strain CFML
96-170 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas alcaliphila strain AL1521 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas taetrolens strain I11 16S
ribosomal RNA, partial sequence
Pseudomonas monteilii strain CIP
104883 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas flavescens strain B62
16S ribosomal RNA, complete
sequence
Pseudomonas brassicacearum strain
DBK11 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas salomonii strain CFBP
2022 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas chlororaphis subsp.
aureofaciens strain DSM 6698 16S
ribosomal RNA, complete sequence
Pseudomonas moraviensis strain CCM
7280 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas marginalis strain LMG
2210 16S ribosomal RNA, partial
sequence
Pseudomonas borbori strain : R-20821
16S ribosomal RNA, partial sequence
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