universidad central del ecuador facultad de ingeniería química
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA DE CAMARÓN TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO AUTORA: BARRIGA GAIBOR KARLA MASSIEL TUTOR: DOCTOR ULLRICH RAINER STAHL, Ph.D QUITO 2016 ©DERECHOS DE AUTOR Yo, Barriga Gaibor Karla Massiel en calidad de autor del trabajo de titulación, modalidad de proyecto de investigación: “OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA DE CAMARÓN”, autorizo a la Universidad Central del Ecuador hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación. Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento. Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior. En la ciudad de Quito, a los 21 días del mes junio de 2016 Firma: Karla Massiel Barriga Gaibor C.C.: 172057873-9 [email protected] ii APROBACIÓN DEL TUTOR Yo, Ullrich Rainer Stahl, en calidad de tutor del trabajo de titulación, modalidad de trabajo de investigación, titulado “OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA DE CAMARÓN”, elaborado por la estudiante KARLA MASSIEL BARRIGA GAIBOR de la Carrera de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte del jurado examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO, a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad Central del Ecuador En la ciudad de Quito, a los 21 días del mes de junio de 2016 ----------------------------------------Ullrich Rainer Stahl C.C.: 1723190508 iii DEDICATORIA A José Barriga y Mercedes Gaibor mis padres que con su dedicación, esfuerzo y apoyo me han ayudado a culminar una etapa importante de mi vida. A mi hermano Alexander que con sus enojos, bromas y sobre todo cariño da alegría y sentido cada día de mi vida. A cada uno de mis tíos que con sus sabios consejos siempre estuvieron presentes. iv AGRADECIMIENTOS A la Facultad de Ingeniería Química, por ayudarme a crecer como persona y profesional, gracias a los conocimientos impartidos durante todos estos años de carrera universitaria. A mis padres, José y Mercedes que han estado en cada uno de mis triunfos y derrotas, y que con su amor, paciencia, y ternura han logrado formar la persona que soy. Al Doctor Ullrich Stahl por el apoyo y aporte para la mejor realización de este trabajo. Al Ingeniero Carlos Guepud por su apoyo y consejos brindados en la ejecución de este trabajo, y al Ingeniero don Lennin por ayudarme, apoyarme y hacerme reír siempre. A Eliceo por el amor, paciencia, y apoyo que me ha dado durante todos estos años. A cada uno de mis amigos por estar siempre cuando más los necesitaba, con su cariño y apoyo, en especial a Erika Suarez por ser más que amiga es una verdadera hermana. v CONTENIDO Pág. LISTA DE TABLAS ix LISTA DE FIGURAS x LISTA DE ANEXOS xi RESUMEN xii ABSTRACT xiii INTRODUCCIÓN 1 1. MARCO TÓRICO 3 1.1. Problemática Ambiental 3 1.2. Camarón 3 1.2.1. Producción de camarón en el Ecuador 3 1.2.2. Características de los desechos de camarón 4 1.3. 5 Quitina 1.3.1. Fuentes de obtención de la quitina 6 1.3.2. Propiedades físico químicas y características de la quitina 6 1.3.3. Obtención de quitina 6 1.4. 7 Quitosano 1.4.1. Obtención de quitosano 8 1.4.2. Propiedades físico químicas y características del quitosano 8 1.5. Aplicaciones de la quitina y del quitosano 9 1.6. Glucosamina ( C6 H13NO5) 9 1.6.1. Obtención de glucosamina 10 1.6.2. Formas de glucosamina 11 1.6.3. Aplicaciones de glucosamina 12 vi 2. MARCO EXPERIMENTAL 13 2.1. Proceso experimental 13 2.1.1. Pre tratamiento de la materia prima 13 2.1.2. Obtención de quitina 13 2.1.3. Obtención de glucosamina 14 2.1.4. Determinación de glucosamina 14 2.2. Diseño experimental 14 2.3. Descripción del pre tratamiento de la materia prima 16 2.4. Descripción de la obtención de quitina 17 2.5. Descripción de obtención de glucosamina 17 2.6. Materiales y equipos 17 2.7. Sustancias y reactivos 18 2.8. Procedimiento 19 2.8.1. Procedimiento para el pre tratamiento de la materia prima 19 2.8.2. Procedimiento para la obtención de quitina 19 2.8.3. Procedimiento para la obtención de glucosamina 20 2.8.4. Procedimiento para la identificación química de azúcar reductor 20 con el reactivo de Fehling 2.8.5. Cuantificación de glucosamina por HPLC 21 3. DATOS EXPERIMENTALES 22 3.1. Obtención de quitina 22 3.2. Obtención de glucosamina 22 3.3. Cuantificación de glucosamina por HPLC 23 4. CÁLCULOS 25 4.1. Rendimiento de quitina 25 4.2. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida 25 4.3. Análisis estadístico 26 4.3.1. Cálculo de ANOVA para dos factores 26 4.3.2. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina 28 5. RESULTADOS 30 5.1. Rendimiento de la quitina 30 vii 5.2. Identificación de la quitina mediante solubilidad en diferentes 30 soluciones 5.3. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida 31 5.4. Identificación química de la glucosamina ( azucares reductores ) 32 5.5. Cuantificación de glucosamina por HPLC 32 5.6. Análisis estadístico 34 5.6.1. Análisis estadístico para la determinación de glucosamina 35 5.7. 37 Condiciones óptimas 5.7.1. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina 37 6. DISCUSIÓN 38 7. CONCLUSIONES 41 8. RECOMENDACIONES 43 CITAS BIBLIOGRÁGICAS 44 BIBLIOGRAFÍA 48 ANEXOS 49 viii LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Especies de camarones comerciales del Ecuador 4 Tabla 2. Propiedades físico químicas y características de la quitina 6 Tabla 3. Propiedades físico químicas y características del quitosano 8 Tabla 4. Aplicaciones de la quitina y quitosano 9 Tabla 5. Pesos de quitina obtenida 22 Tabla 6. Pesos de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida 22 Tabla 7. Datos del estándar utilizado 23 Tabla 8. Datos del peso de la muestra de sólidos obtenidos mediante la 24 hidrólisis ácida de la quitina utilizado para el análisis en HPLC Tabla 9. Codificación de los factores para el diseño estadístico 26 Tabla 10. ANOVA para el diseño factorial 3k 28 Tabla 11. Rendimiento de la quitina 30 Tabla 12. Solubilidad de la quitina en diferentes soluciones 30 Tabla 13. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida 31 Tabla 14.Cuantificación de glucosamina por HPLC 32 Tabla 15. ANOVA para la obtención de glucosamina 35 Tabla 16. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina 37 ix LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Composición química de las cáscaras de camarón 5 Figura 2. Polímero no ramificado de N-acetil-D-glucosamina 5 Figura 3. Relación de estructuras entre la quitina, el quitosano y quitano 7 Figura 4. Estructura química de la glucosamina 10 Figura 5. Reacción química de la obtención de glucosamina 10 Figura 6. Obtención de glucosamina a partir de quitina 11 Figura 7. Diseño experimental 16 Figura 8. Diagrama de flujo de pre tratamiento de materia prima 16 Figura 9. Diagrama de flujo para la obtención de quitina 17 Figura 10. Diagrama de flujo para la obtención de glucosamina 17 Figura 11. Cálculos en Statgraphics 29 Figura 12. Reacción general del reactivo de Fehling con la glucosamina 32 Figura 13. Cantidad de glucosamina en función de la concentración de 33 ácido clorhídrico (réplica 1) Figura 14. Cantidad de glucosamina en función de la concentración de 33 ácido clorhídrico (réplica 2) Figura 15. Cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción 34 (réplica 1) Figura 16. Cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción 34 (réplica 2) Figura 17. Efectos principales para glucosamina 36 Figura 18. Interacción AB para la obtención de glucosamina 37 Figura 19. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina 37 x LISTA DE ANEXOS Pág. ANEXO A. Equipo de reacción para la obtención de quitina 50 ANEXO B. Equipo de reacción para la obtención de glucosamina 51 ANEXO C. Reacción de los sólidos obtenidos con el reactivo de Fehling 52 ANEXO D. Solubilidad de quitina en diferentes solventes 53 ANEXO E. Especificaciones de estándar de glucosamina 55 ANEXO F. Valores obtenidos de la cantidad de glucosamina 56 ANEXO G. Cromatogramas de glucosamina obtenida 66 xi OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA DE CAMARÓN RESUMEN En esta propuesta de investigación se realizó la obtención de glucosamina por hidrólisis ácida de la quitina derivada de la cáscara de camarón a nivel de laboratorio. Se inició la experimentación con el pre tratamiento de la materia prima mediante el lavado, secado y triturado, luego se procedió a la purificación de la quitina siguiendo el protocolo de desproteinización, desmineralización y blanqueo. Seguidamente se realizó la hidrólisis ácida de la misma en un equipo de reacción a una temperatura constate de 85°C, velocidad de agitación de 150 rpm y una relación de materia prima: solvente de 1:20. Se evaluó la obtención de glucosamina en función de las variables de concentración de ácido clorhídrico: 4, 5 y 6 molar y tiempo de reacción: 60, 90 y 120 minutos. Se realizó un estudio estadístico mediante el cual se determinaron las condiciones óptimas del proceso, cuyos resultados fueron: el tiempo de reacción de 120 minutos y la concentración de ácido clorhídrico 6 molar. PALABRAS CLAVE: / CÁSCARA DE CAMARÓN / QUITINA/ HIDRÓLISIS ÁCIDA / GLUCOSAMINA/ xii OBTAINING GLUCOSAMINA BY ACID HYDROLYSIS FROM CHITIN DERIVED FROM PEEL SHRIMP ABSTRACT Obtaining at laboratory glucosamine by acid hydrolysis, from chitin derived from peel shrimp. It began experimenting with pretreatment of peel shrimp, by washing, drying and grinding, and then proceed to the separation of chitin, following the deproteinization, demineralization, and bleaching protocol. Following, it was made the acid hydrolysis with hydrochloric acid at concentrations of 4, 5, and 6 molar, at different reaction times of 60, 90 and 120 minutes and constant temperature 85 ° C, stirring speed of 150 rpm, and the ratio was performed raw material: solvent 1:20. Optimal conditions were determinate by Statgraphics software, whose results were: reaction time of 120 minutes and hydrochloric acid concentration of 6 Molar. KEYWORDS: / PEEL SHRIMP / CHITIN / ACID HYDROLYSIS/ GLUCOSAMINA/ xiii INTRODUCCIÓN La conservación del ecosistema en un mundo globalizado ha sido uno de los objetivos a nivel industrial. Por este motivo se han contemplado la reutilización de diversas materias, que han sido consideradas como un factor alto de contaminación ambiental. El Ecuador es unos de los más grandes exportadores de camarón en el mundo con alrededor de 30,000 toneladas con un ingreso económico de 170.000 dólares según el reporte de la Cámara Nacional de Acuacultura para 2015. Esta actividad tiene el inconveniente de presentar un elevado porcentaje de desechos, producto de una industrialización. Por lo que es importante diseñar mecanismos para aprovechar estos subproductos que están constituidos principalmente por el exoesqueleto, patas y cola del camarón y los cuales son ricos en compuestos químicos que son aplicables para la elaboración de diversos productos. Este es uno de los retos que se han planteado muchos países a nivel mundial. El exoesqueleto es el principal producto sólido del camarón, el cualesta constituido de proteinas, minerales, carotenos y quitina, siendo esta ultima uno de los principales componentes, que representa alrededor del 27 % en peso del caparazón, tomando en consideración este porcentaje de quitina y que en su estructura principal esta compuesto por unidades de N-acetilglucosamina, se propone determinar si es eficiente la obtención de glucosamina apartir de una hidólisis ácida de la quitina derivada de los desechos del camarón. Según el Sistema de Información Nacional de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca (SINAGAP), el Ecuador ha realizado importaciones de alrededor de 1800productos de uso veterinario que contienen glucosamina, por lo cual mediante este trabajo se busca determinar si los residuos de camarón nacional se pueden usar como una fuente para la obtención de glucosamina, permitiendo de esta manera reducir el 1 costo de importación de las materias primas que son utilizadas en la industria farmacéutica y además reducir el impacto ambiental que genera este tipo de desechos. Al considerar a los desechos del camarón como una fuente de obtención de diversos productos como la quitina, quitosano y alimento para animales, y tomando en cuenta que este mercado se encuentra saturado, se ha generado la necesidad de buscar otras alternativas de aprovechamiento de estos desechos. Por este motivo el presente trabajo tiene como finalidad desarrollar diferentes experimentos a escala de laboratorio para la obtención de glucosamina a partir de la quitina derivada de la cáscara de camarón mediante una hidrólisis ácida. Con estos antecedentes se fundamenta el uso de desechos del camarón en la obtención de glucosamina, además de ayudar a disminuir los problemas medioambientales que causa la inadecuada eliminación de estos desechos. 2 1. MARCO TEÓRICO 1.1. Problemática Ambiental El Ecuador, al ser una plataforma rica en recursos pesqueros, puede incrementar la economía de los pueblos dedicados a dichas actividades, así como también la de todo un país, si estos recursos son explotados correctamente. [1] La evolución de las industrias dedicadas a la extracción de especies acuáticas ha generado un gran problema medio ambiental, sobre todo la industria camaronera, ya que tras la extracción de la parte comestible de los crustáceos, se genera un residuo sólido formado en su mayoría por los exoesqueletos. [2] En la actualidad, esos desechos son descartados en basureros municipales y en otros casos directamente en los mares y ríos, lo que origina un serio problema a nivel ambiental. [3] 1.2. Camarón El Ecuador se ha convertido en uno de los exportadores y sobre todo productores más importantes a nivel mundial de camarón, ya que cerca del 90% de esta producción se deriva del cultivo en piscinas, y el restante es obtenido de manera artesanal en las aguas del Océano Pacífico. Generando así esta industria camaronera uno de los rubros más significativos para el país en la exportación de productos tradicionales que no sean de origen petrolero. [4] 1.2.1. Producción de camarón en el Ecuador Según la Cámara Nacional de Acuacultura las exportaciones de camarón ecuatoriano hasta diciembre del año 2015 fue de 65.455,247 libras, las cuales generaron un ingreso económico para el país de alrededor de 170.000 dólares; Originando en el Ecuador fuentes de empleo y de estabilidad económica, ya que esta industria 3 requiere de mano de obra, personal de apoyo, técnicos e investigadores que participan en cada una de las etapas del proceso productivo del camarón.[5] En el Ecuador existen cuatro especies predominantes para la producción y exportación de camarón a nivel mundial, como se indica en la siguiente tabla 1: Tabla 1. Especies de camarones comerciales del Ecuador [6] Especies de Camarones Comerciales Género Especie Nombre Común Vannamei Litopenaeus Farfantepenaeus Solenocera Blanco Occidentales Stylirostris Azul Californiensis Café Brevirostris Rojo Agazzissi / Mutador % de Producción 95 5 Carapachudo 1.2.2. Características de los desechos de camarón Las cáscaras de camarón son consideradas por muchos como un desecho orgánico y para otros como simple basura. Pero estas presentan diferentes características tanto físicas como químicas.[7]Lo que les da un aporte importante a nivel industrial, ya que son consideradas como fuentes de materia prima renovable, debido a que en su estructura predomina un polímero formado por unidades de N-acetil-D-glucosamina, que es un excelente principio activo para el uso en farmacología y agroindustria. [8] Morfológicamente el camarón consta de un 37,84% en peso de cefalotórax o cabeza y de un 27,30% en peso de abdomen o cola. Cabe notar que el residuo generado por el camarón depende del tipo de producto que se desee comercializar. [9] a) Composición química de los residuos del camarón Por su composición química los residuos de camarón son considerados como materia prima con un amplio potencial industrial, principalmente por la quitina. 4 A continuación se indica en la figura 1 la composición química promedio de los caparazones del camarón: 3% 27% 30% Quitina Proteínas Carbonato de Calcio 40% Carotenos Figura 1. Composición química de las cáscaras de camarón [10] 1.3. Quitina La quitina es el segundo polisacárido más abundante después de la celulosa. Este biopolímero está compuesto por unidades de N-acetil glucosamina que están unidas por enlaces glicosídicos de la misma forma como las unidades de glucosa que componen a la celulosa. Figura 2. Polímero no ramificado de N-acetil-D-glucosamina [11] Se argumenta que el grado de desacetilación (DA) promedio de la quitina es de 66 %, esto indica que una de cada tres unidades se encuentran desacetiladas [12] 5 1.3.1. Fuentes de obtención de la quitina La quitina se encuentra considerablemente distribuida en la naturaleza, principalmente en el exoesqueleto de los artrópodos como arácnidos, insectos, entre otros, y en los caparazones de los crustáceos como cangrejos y camarones; siendo esta última la fuente más accesible ya que se encuentra disponible en desperdicios de la industria marisquera. Aparte de los artrópodos y de los crustáceos existen otras fuentes poco comunes de los cuales también se puede extraer la quitina pero en menor proporción, como los hongos, las algas, las levaduras, entre otros. [13] 1.3.2. Propiedades físico químicas y características de la quitina Tabla 2. Propiedades físico químicas y características de la quitina [14] QUITINA PROPIEDADES CARACTERÍSTICAS Producto Blanca Dura Inelástica Peso Molecular No presenta solubilidad Natural 106g/mol Producto 3-5 x 105 Comercial g/mol en el agua y en Grado de Desacetilación 66 % disolventes orgánicos. Contenido de Humedad 2-10 % Contenido de cenizas <2% Contenido de Nitrógeno 6-7 % Biodegradable (lentamente) 1.3.3. Obtención de quitina Aunque existen varios métodos de obtención de la quitina, varios investigadores coinciden que es necesario la utilización de ácidos y bases. En el caso de la obtención de la quitina a partir de los desechos de los crustáceos se utiliza hidrólisis ácida para la desmineralización, y el uso de hidrólisis básica permite que se rompa el enlace entra la proteína y la quitina. 6 La quitina obtenida se clasifica en función de su pureza y color, ya que si existen trazas de proteínas o de pigmentos pueden causar problemas en sus aplicaciones principalmente en productos biomédicos y farmacéuticos. Razón por la cual se debe considerar que para la obtención de la quitina se debe adaptar diferentes procedimientos según de la fuente de donde se extraiga y el uso que se le desee dar. [15] 1.4. Quitosano La desacetilación completa de la quitina produce un compuesto llamado quitano el cual es totalmente soluble en medio ácido, pero al tener una desacetilación incompleta de la quitina, es decir que elimine al menos un 50 % de sus grupos acetilo, se genera un material con distintas propiedades denominado quitosano. El quitosano es un polisacárido llamado también chitosán, está compuesto por cadenas distribuidas aleatoriamente de D-glucosamina, unidades de N-acetil-D- glucosamina (unidad acetilada). [16] El quitosano es un sólido amorfo que se obtiene de diferentes pesos moleculares y grado de desacetilación, esto depende de las condiciones de reacción, que puede ser vía química o enzimática. [17] Figura 3. Relación de estructuras entre la quitina, el quitosano y quitano [18] 7 1.4.1. Obtención de quitosano El quitosano es obtenido comercialmente de los residuos quitinosos, como por ejemplo de los desechos del camarón, cangrejo, langostino entre otros cretáceos. Para la obtención del quitosano existen dos alternativas que son: el proceso químico y el proceso enzimático. El proceso químico consta de dos partes, la primera es la extracción de la quitina, mediante una desmineralización y desproteinización de los desperdicios de los crustáceos, y la segunda etapa es la desacetilación, mediante una hidrólisis de los grupos acetoamidos para así obtener la conversión a quitosano, que presenta al menos 25 a 30 unidades menos de glucosamina que la quitina. En el proceso enzimático la desacetilación de la quitina, se lo realiza mediante el uso de enzimas desacetilasas. Estas enzimas catalizan la conversión de la quitina a quitosano mediante una hidrólisis de los residuos de N-acetil glucosamina.[19]. A pesar de que este proceso enzimático no es el más óptimo, presenta una ventaja importante, que es la uniformidad en cuanto al grado de desacetilación y polimerización; a diferencia del proceso químico se dan de manera aleatoria. [20] 1.4.2. Propiedades físico químicas y características del quitosano Tabla 3. Propiedades físico químicas y características del quitosano[21] QUITOSANO PROPIEDADES CARACTERÍSTICAS Blanco Estructura cristalina Inelástica Peso Molecular Poliamina lineal de alto peso molecular. Biocompatibilidad : polímero natural no toxico Bioactividad Producto 1,5x106 - Natural 2,5x106 g/mol Producto Comercial 1-3 x 105 g/mol Grado de Desacetilación 65 - 90% Contenido de Humedad 2-10% Contenido de cenizas < 2% Contenido de Nitrógeno 7 - 8,5% 8 1.5. Aplicaciones de la quitina y del quitosano Tabla 4. Aplicaciones de la quitina y quitosano [22] Biopolimero Quitosano Quitina Propiedades Uso Aprovechadas Películas para recubrimiento de Antimicrobiana y frutas, hojas, semillas y vegetales fungicida Clarificación de jugos de frutas Coagulante Floculante Protección de Plantas Fungicida Liberación controlada de Formación de agroquímicos hidrogeles Formación de fibras aglutinantes en el proceso de fabricación del papel. Eliminación de metales disueltos en medios acuosos Biodegrabilidad Tratamiento de agua 1.6. Glucosamina (C6H13NO5) La glucosamina es un amino azúcar de origen natural que se encuentra presente en el cartílago articular de los mamíferos, en una glucoproteína de la saliva que es la mucina, paredes celulares de hongos, en el exoesqueleto de crustáceos y varios artrópodos. La estructura química de la glucosamina o el 2-amino-2-desoxi-D-glucosa o 2-amino-2desoxi-D-glucopiranosa, se indica en la figura 4 9 Figura 4. Estructura química de la glucosamina [23] 1.6.1. Obtención de glucosamina a) Proceso químico La glucosamina al ser un monómero de la quitina se la puede obtener mediante una hidrolisis ácida de la misma, en donde ocurre el rompimiento del enlace glucosídico generando cantidades equimolares de ácido acético y de glucosamina. En la figura siguiente se indica la hidrólisis de la quitina con ácido clorhídrico para la obtención del monómero. Figura 5. Reacción química de la obtención de glucosamina [24] El ácido estándar más utilizado para hidrolizar la quitina es el ácido clorhídrico, aunque existen otros tipos de experimentaciones en las cuales se ha trabajado con otros ácidos como el ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido fluorhídrico. Pero hay que considerar que la solución acuosa del último ácido conduce a una hidrólisis parcial de la quitina a una temperatura de 20 °C después de varias horas de reacción. Además se está considerando la obtención del monómero de glucosamina con ácido sulfúrico al 20 -80%, ya que al trabajar con este ácido se evita la utilización de reactores revestidos de vidrio. [25] 10 Glucosamina acetilada Quitosano Despolimerización Desacetilación Hidrólisis ácida Quitina Desacetilación Glucosamina Figura 6. Obtención de glucosamina a partir de quitina b) Proceso enzimático La glucosamina también puede ser producida mediante una hidrólisis enzimática de crustáceos,como ejemplo de ello se realizó en la Universidad de British Columbia en el año 1996 un estudio en el cual indica que la hidrólisis enzimática de la quitina con un conjunto de enzimas como las quitinolíticas, quitinasa y chitobiase, se puede producir N-acetil-D-glucosamina, siendo este un procedimiento eficaz y económico.[26] Además en el año 2012 se publicó una patente sobre la producción de glucosamina a partir de especies vegetales, en la cual se describe la utilización de un fertilizante a base de nitrógeno, el cual actúa como precursor de glucosamina en plantas que contiene un alto nivel de este monómero, en un porcentaje del 0,5 %, es decir 5 gramos por cada kilogramo de materia seca. [27] Algunas compañías han planteado métodos para producir glucosamina a partir de una fermentación con microorganismos que son modificados genéticamente. [28] 1.6.2. Formas de glucosamina La glucosamina puede transformarse en distintas formas ya que es una base orgánica débil, como se detalla a continuación: a) Sulfato de glucosamina El sulfato de glucosamina presenta una hidratación, debido a que en estado puro es altamente higroscópico, por lo cual existe una disminución de pH. Por estas propiedades que presenta la obtención del mismo exige que las condiciones de extracción sean extremadamente controladas, y debe ser preservada en un desecante. 11 b) Clorhidrato de glucosamina El clorhidrato de glucosamina es una variante de glucosamina que se elabora generalmente de los desechos de crustáceos. Este tipo de glucosamina se utiliza habitualmente para el dolor de las rodillas, glaucoma, dolor de espalda y sobre todo para la osteoartritis. (Therapeutic Research Center) Además a diferencia del sulfato de glucosamina, el clorhidrato de glucosamina es mucho más estable y está disponible en forma altamente pura (>99%).[29] c) Cocristales o coprecipitados de sulfato de glucosamina con cloruro de potasio o sodio d) Mezclas físicas de clorhidrato de glucosamina y disulfato de potasio y sodio 1.6.3. Aplicaciones de glucosamina Esta amino glucosa es un suplemento dietético que se utiliza principalmente para: El tratamiento de la inflamación o degradación de las articulaciones como por ejemplo la artritis. En la prevención de la degradación del cartílago mediante la inhibición de las metaloproteasas. En el mejoramiento de la sequedad de la piel ayudando en el aumento en el contenido de humedad. Además ayuda a la suavidad o exención de arrugas de la piel. [30] El alivio del dolor y picazón que se produce por la inflamación de las venas varicosas presentes en las piernas El dolor que generan las lesiones en codos, rodillas, manos y caderas que es originado por el ejercicio o por alguna actividad física realizada. La glucosamina también presenta otros efectos terapéuticos, tales como antivirales, anti-cáncerigeno, la reducción del 12 colesterol entre otros.[31] 2. MARCO EXPERIMENTAL 2.1. Proceso experimental Para la obtención de la quitina a partir de los residuos del camarón se siguieron las siguientes etapas: 2.1.1. Pre tratamiento de la materia prima: a) Lavado: Se realiza con la finalidad de eliminar todo tipo de impureza existente en los desechos de camarón y así garantizar un alto rendimiento en el proceso. b) Secado y Molienda: Se seca las cáscaras de camarón con ayuda de una estufa. Una vez que las cáscaras estén libre de humedad; se realiza la molienda de cada una de estas, con la finalidad de disminuir el tamaño de partícula, para así mejorar el contacto de la materia prima con los reactivos que se van a utilizar en cada una de las etapas. 2.1.2. Obtención de quitina a) Desproteinización: se realiza con el propósito de retirar toda la proteína existente, mediante la utilización de hidróxido de sodio a una determinada concentración, tiempo de reacción y a un calentamiento constante. b) Lavado 1: se ejecuta con la intención de eliminar todo el hidróxido de sodio restante que contiene proteínas disueltas y llegar a un pH neutro. c) Desmineralización: se realiza con la finalidad de eliminar todos los minerales que contienen los desechos, entre ellos el predominante carbonato de calcio. Esto se efectúa usando ácido clorhídrico a una determinada concentración y tiempo de reacción. 13 d) Lavado 2: se ejecuta con la intención de eliminar todo el ácido clorhídrico restante que contienen disueltos los minerales como el carbonato de calcio y llegar a un pH neutro. 2.1.3. Obtención de glucosamina: a) Mediante la utilización de ácido clorhídrico se realiza la despolimerización de la quitina para obtener el monómero de glucosamina, para lo cual se varían diferentes parámetros como el de concentración y tiempo de reacción, para determinar las condiciones óptimas del proceso. 2.1.4. Determinación de glucosamina: permite cuantificar la cantidad de glucosamina obtenida al final del proceso. 2.2. Diseño experimental Para el diseño experimental se determinaron dos variables independientes (tiempo y concentración de ácido clorhídrico) y una variable dependiente (cantidad de glucosamina). Por lo cual, se escoge un diseño factorial 3k=32 obteniéndose nueve tratamientos diferentes, para lo cual se ha considerado la realización de tres réplicas, obteniendo un total de 27 tratamientos para la obtención de glucosamina. Materia prima: se toma como base una cantidad de 7 g de materia prima. Este valor es constante para todos los ensayos. Relación materia prima – ácido clorhídrico: en el proceso de obtención de glucosamina por hidrólisis ácida se empleó una relación 1:20. Velocidad de agitación: la velocidad de agitación corresponde a 150 rpm, debido a que esta velocidad no genera turbulencia ni puntos muertos en el recipiente de reacción. Temperatura: corresponde a la temperatura de 85 °C y así generar la ruptura de las cadenas del polímero de la quitina. 14 Concentración: Se determinó mediante una serie de pruebas preliminares, comprobando mediante pruebas con el reactivo de Fehling la fragmentación de las macromoléculas, obteniendo 3 niveles de concentración de ácido clorhídrico, que corresponden a un nivel bajo, medio y alto. Concentración 1: 4 molar. Concentración 2: 5 molar. Concentración 3: 6 molar. Tiempo: Para el tiempo de la reacción de hidrólisis se ha tomado como referencia el valor descrito en la patente US 6486307 “Preparación de clorhidrato de glucosamina” t1: 60 minutos. t2: 90 minutos. t3: 120 minutos Glucosamina: el contenido se determina para cada muestra mediante cromatografía líquida de alta eficacia HPLC G1, G2, G3: contenidos de glucosamina determinados para cada muestra. 15 C1 Trabajo de Titulación t11 G11 t12 G12 t13 G13 t21 G11 t22 G11 t23 G11 t31 G31 t32 G32 t33 G33 Recolección de materia prima ( Cascara de Camarón) Obtención de Quitina Muestra de Quitina con ácido clorhídrico C2 C3 Figura 7. Diseño experimental Donde: C = concentración t = tiempo de reacción G= Cantidad de glucosamina obtenida 2.3. Descripción del pre tratamiento de la materia prima H2O Recolección de materia prima ( cáscara de camarón) H2O Lavado Secado Impurezas Cáscara de camarón pretratada T= 90 °C t = 10 h Molienda Figura 8. Diagrama de flujo de pre tratamiento de materia prima 16 2.4. Descripción de la obtención de quitina Cáscara de camarón pretratadas HCl H2O H2O NaOH Desproteinización Lavado y Filtrado T = 65°C t = 60 min Desmineralización T = ambiente t = 30 min Residuos de proteínas y NaOH Lavado y Filtrado Minerales disueltos en HCl CO2 NaClO H2O H2O QUITINA Secado Lavado y filtrado Blanqueo Pigmentos destruidos, NaOH T = 65°C t=5h Figura 9. Diagrama de flujo para la obtención de quitina 2.5. Descripción de obtención de glucosamina Quitina CH3CH2OH HCl Reactor de reflujo Filtrado Cristalizado T = 85°C Macromoléculas disueltas en HCl Filtrado CH3COOH HCl CH3CH2OH t = 30 min T= 5°C GLUCOSAMINA Secado T= 60 °C t = 30 min Figura 10. Diagrama de flujo para la obtención de glucosamina 2.6. Materiales y equipos Vasos de precipitación V: 250 mL Ap. ± 50 mL V: 200 mL Ap. ± 50 mL 17 Probetas graduadas V:100 mL Ap.± 10 mL Balones de destilación de dos bocas V: 500 mL Balones aforados V: 1000 mL V: 250 mL Balón de destilación con 3 bocas V: 2000 mL Rango: 250 – 2200 RPM Agitador mecánico Marca: Heidolph Balanza analítica Rango: 0-220 g Ap.: ± 0,0001 g Campana de extracción Marca: Sematech Engineering Plancha de calentamiento con agitación Rango: 0 – 370 °C Rango: 0 – 1500 RPM magnética Marca: Velp scientifica AM4 Molino SM 300 Marca: Retsch Termómetro Rango: -20 – 110°C Ap ± 0,5 °C Condensador tipo serpentín Tamaño: 29/32 Tapones de caucho Varios Estufa Marca: Memmert Rango: 20°C -200°C Mangueras de caucho Reverbero Marca: Teckno 110 V-60 Hz- 1200 W 2.7. Sustancias y reactivos Hidróxido de sodio NaOH(s) Ácido clorhídrico 36,5 p/v HCl(l) Hipoclorito de sodio NaClO(l) Agua destilada H2O(l) Ácido Acético CH3COOH(l) 18 2.8.Procedimiento 2.8.1. Procedimiento para el pre tratamiento de la materia prima Lavar las cáscaras de camarón con abundante agua potable y retirar cualquier tipo de residuo carnoso que contenga. Secar las cáscaras de camarón durante un tiempo aproximado de diez horas (10 h) a una temperatura de 90 °C, con ayuda de una estufa. Triturar las cáscaras de camarón en un molino SM 300 a un tamaño de partícula de máximo 2 mm. 2.8.2. Procedimiento para la obtención de quitina a) Desproteinización Pesar 100 g de las cáscaras de camarón pre tratadas Preparar una solución de hidróxido de sodio al 3,5% p/p Colocar las cáscaras de camarón anteriormente pesadas en un balón de 2000 mL y en una relación 1:10 con la solución de hidróxido de sodio y armar el equipo como se indica en el ANEXO A Controlar la temperatura de reacción a 65 °C; esta debe permanecer constante durante todo el tiempo de reacción. Ajustar la velocidad del agitador mecánico a 280 rpm y dejar reaccionar la mezcla por un tiempo de 60 minutos. Filtrar y lavar las cáscaras de camarón desproteinizadas con abundante agua potable hasta obtener un pH aproximadamente de 7. b) Desmineralización Preparar una solución de ácido clorhídrico 1 M. Colocar las cáscaras de camarón desproteinizadas en un balón de 2000 mL y en una relación 1:15 con la solución de ácido clorhídrico. Ajustar la velocidad del agitador mecánico en 280 rpm y dejar reaccionar la mezcla por un tiempo de 30 minutos a temperatura ambiente. Lavar las cáscaras de camarón desmineralizadas con abundante agua potable hasta obtener un pH de aproximadamente de 7. 19 c) Blanqueamiento Preparar una solución de hipoclorito de sodio 0,3% p/p Colocar la quitina obtenida en un recipiente y adicionar la solución de hipoclorito de sodio en una relación 1:20, por un tiempo de 20 minutos. Lavar la quitina blanqueada con abundante agua, posteriormente filtrar y secar con ayuda de una estufa a una temperatura de 60°C por 5 horas. 2.8.3. Procedimiento para la obtención de glucosamina Pesar 7 g de la quitina obtenida. Preparar una solución de ácido clorhídrico 4 M. Colocar la quitina y la solución de ácido clorhídrico en un balón de 500 mL en una relación 1:20 y armar el equipo como se indica en el ANEXO B, y con ayuda de una plancha de calentamiento ajustar la temperatura a 85 °C. Ajustar la agitación a 150 rpm y dejar reaccionar por un tiempo de 60 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de reacción proceder apagar la plancha de calentamiento y filtrar, evitando eliminar la solución obtenida por el drenaje ya que esta es un líquido corrosivo. Cristalizar a 5 °C con etanol al 95% por 30 minutos y filtrar. Dejar secar el sólido obtenido en una estufa a 60°C por 3 horas. Realizar el procedimiento anterior para los tiempos de 90 y 120 minutos. Repetir el procedimiento anteriormente descrito para las concentraciones de ácido clorhídrico de 5 M y 6 M. 2.8.4. Procedimiento para la identificación química de azúcar reductor con el Reactivo de Fehling. Pesar 0,5 g de los sólidos obtenidos y colocar en un tubo de ensayo Agregar 5 mL de la solución A y 5 mL de la solución B del reactivo de Fehling Introducir el tubo de ensayo en el baño maría que esta aproximadamente a 70 °C para dar comienzo a la reacción. 20 2.8.5. Cuantificación de glucosamina mediante HPLC La cuantificación de la glucosamina se llevó a cabo en el laboratorio de Multianalityca Cía. Ltda para lo cual utilizaron lo siguiente: Tipo de columna: Luna 3 m C 18 con un tamaño de poro 100 °A Tipo de elución: Isocrática Elución A: Acetonitrilo Elución B: H3PO4 0,1% Elución isocrática es cuando se lleva a cabo con un disolvente o con una mezcla de disolventes, en concentraciones constantes durante el tiempo de análisis. Fase Móvil: A: 10 B: 90 Detección: UV- VIS 254 nm Flujo: 0,5 mL/min Tiempo de corrida: 10 min 21 3. DATOS EXPERIMENTALES 3.1. Obtención de quitina Tabla 5. Pesos de quitina obtenida Muestra 1 Peso Inicial Cáscaras de Camarón, g 1 2 3 4 5 100 Peso Final Quitina Obtenida, g 23,57 21,75 24,32 20,65 27,32 3.2. Obtención de glucosamina por el proceso de hidrólisis ácida Para obtener el rendimiento de la hidrólisis de la quitina se toma como base 7 g de la misma y utilizando el equipo de reflujo se consiguieron los siguientes resultados: Tabla 6. Pesos de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida Concentración, M Tiempo, min 60 4 90 120 22 Peso Final, g 5,91 4,18 4,46 5,84 4,33 4,86 5,51 4,19 4,01 CONTINUACIÓN Tabla 6 Concentración, M Tiempo, min 60 5 90 120 60 6 90 120 Peso Final, g 3,88 3,66 3,81 3,74 3,87 3,8 3,34 2,96 3,1 3,59 3,19 3,97 3,88 3,71 3,6 3,5 2,44 2,38 3.3. Cuantificación de glucosamina por HPLC Las especificaciones del estándar de glucosamina sulfato de potasio ver ANEXOE Datos proporcionados por Multianalityca Cía. Ltda. Tabla 7. Datos del estándar utilizado Estándar Masa, g Pureza,% 0,1986 99 23 Tabla 8. Datos del peso de la muestra de sólidos obtenidos mediante la hidrólisis ácida de la quitina utilizado para el análisis en HPLC Concentración, M 4 5 6 Tiempo, min Masa, g Réplica 1 Réplica 2 60 0,11 0,08 90 0,15 0,08 120 0,13 0,12 60 0,18 0,10 90 0,17 0,25 120 0,18 0,26 60 0,28 0,08 90 0,19 0,45 120 0,13 0,043 24 4. CÁLCULOS 4.1. Rendimiento de quitina Con base a los datos de la tabla 5, se calculó el rendimiento como un porcentaje de la obtención de quitina, tomando como base de cálculo 100 g de cáscara de camarón. (1) Donde: PQ = peso en gramos de la quitina obtenida PC = peso en gramos de la cáscara de camarón %R = porcentaje de rendimiento de la quitina 4.2. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida En este punto se realiza el cálculo modelo del rendimiento de los sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida de la quitina. (2) 25 Donde: PG = peso en gramos de los sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida. PQ = peso en gramos de la quitina. %RG = porcentaje de rendimiento de la glucosamina. 4.3. Análisis estadístico Para el análisis estadístico se utilizó el programa STATGRAPHICS, a través del cual se probó si las variables independientes tiempo y concentración de ácido clorhídrico tienen influencia en la cantidad de glucosamina obtenida. Tabla 9. Codificación de los factores para el diseño estadístico Factor Notación Concentración de ácido clorhídrico A Tiempo de reacción B Interacción concentración – tiempo AB 4.3.1. Cálculo de ANOVA para dos factores En el modelo estadístico 32 estudiaron y analizaronlos efectos individuales de cada uno de los factores y de la interacción entre la concentración – tiempo sobre la variable de respuesta. Por lo tanto la hipótesis que se desea probar es: HIPÓTESIS NULA Ho = La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al efecto de la concentración de ácido clorhídrico existe (A). Ho = La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al efecto del tiempo existe (B). Ho = La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al efecto de la interacción de los dos factores existe (AB). 26 HIPÓTESIS ALTERNATIVA Ha= La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al efecto de la concentración de ácido clorhídrico no existe (A). Ha= La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al efecto del tiempo no existe (B). Ha= La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al efecto de la interacción de los dos factores no existe (AB). (3) (4) (5) (6) N = abn (7) (8) (9) Donde: = suma de todas las observaciones. = suma de las observaciones del tratamiento i del factor A. = suma de las observaciones del tratamiento i del factor B. = suma global de todas las observaciones. = suma de cuadrados totales. = suma de cuadrados del efecto A. 27 = suma de cuadrados del efecto B. = suma de cuadrados del error. = total de observaciones del experimento. = número réplicas. = grados de libertad. = cuadrados medios. = estadístico de Fisher Tabla 10. ANOVA para el diseño factorial 3k FV SC GL CM Fo Valor - p Efecto A Efecto B Efecto AB Error Total 4.3.2. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina Para extraer información sobre el punto óptimo del proceso se utiliza una técnica matemática que es la optimización. Se empleó el programa estadístico STATGRAPHICS para determinar las condiciones óptimas, utilizando la técnica de superficie de respuesta. 28 Figura 11. Cálculos en Statgraphics 29 5. RESULTADOS 5.1. Rendimiento de la quitina En la siguiente tabla se muestran los valores del rendimiento de la quitina obtenida a partir de las cáscaras de camarón. Tabla 11. Rendimiento de la quitina. Muestra 1 Peso Inicial Peso Final Cáscaras de Quitina Camarón, g Obtenida, g Rendimiento Rendimiento De Quitina, % reportado, % 1 23,57 23,57 2 21,75 21,75 24,32 24,32 4 20,65 20,65 5 27,32 27,32 3 100 22,22 5.2. Identificación de la quitina mediante su solubilidad en diferentes soluciones En la tabla 12 indica una prueba característica de la quitina que es la solubilidad en diferentes solventes. . Tabla 12. Solubilidad de la quitina en diferentes soluciones Muestra H2 O QUITINA Insoluble CH3COOH HCl HCl (10% p/v) (3 M) (Concentrado) Insoluble Insoluble Soluble Ver ANEXO D 30 5.3. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida En la tabla siguiente se indica el rendimiento de los sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida de la quitina. Tabla 13. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida Concentración, M Tiempo, min 60 4 90 120 60 5 90 120 60 6 90 120 31 Rendimiento, % 84,46 59,78 63,76 83,49 61,98 69,54 78,81 59,88 57,31 55,48 52,38 54,51 53,43 55,33 54,35 47,75 42,32 44,31 51,33 45,68 56,84 55,54 53,11 51,46 50,00 34,97 34,07 5.4. Identificación química de la glucosamina (azúcares reductores) Se comprobó la presencia de glucosamina en las diferentes muestras obtenidas por hidrólisis ácida de la quitina, ya que al reaccionar con el reactivo de Fehling durante unos minutos y en un baño maría a una temperatura de 65 ° C, se tornó de un color rojo indicando que existe una oxidación en medio alcalino, en el cual, el grupo carbonilo es oxidado a grupo carboxilo. Dando una prueba positiva a la presencia del monosacárido de forma lenta, esto dependió de las concentraciones de ácido clorhídrico del compuesto de glucosamina que se encontraban en cada una de las muestras analizadas. Ver ANEXO C + 2 Cu2+ OH- + Cu2O 2 Figura 12. Reacción general del reactivo de Fehling con la glucosamina 5.5. Cuantificación de glucosamina por HPLC La cuantificación de glucosamina se realizó en un HPLC UV-VIS en Multianalityca Cía. Ltda. Los valores obtenidos se detallan en la tabla 14 Tabla 14. Cuantificación de glucosamina por HPLC Concentración, M 4 5 6 Tiempo, min 60 90 120 60 90 120 60 90 120 Glucosamina mg/100g Glucosamina g/100g Réplica 1 14291,38 14080,98 15793,47 18955,94 19132,02 23597,94 24724,95 28442,48 35334,03 Réplica 1 14,29 14,08 15,79 18,96 19,13 23,60 24,72 28,44 35,33 Réplica 2 14577,39 14334,89 15881,65 18694,01 19815,17 23281,69 24927,90 28703,49 35581,01 32 Réplica 2 14,58 14,33 15,88 18,69 19,82 23,28 24,93 28,70 35,58 En las figuras 13, 14 se representa la variación de la cantidad de glucosamina en función de la concentración de ácido clorhídrico de cada muestra obtenida. Figura 13. Cantidad de glucosamina en función de la concentración de ácido clorhídrico (réplica 1) Figura 14. Cantidad de glucosamina en función de la concentración de ácido clorhídrico (réplica 2) En las figuras 15,16 representa la variación de la cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción de cada muestra obtenida. 33 Figura15. Cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción (réplica 1) Figura16. Cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción (réplica 2) 5.6. Análisis estadístico El análisis de la varianza (ANOVA) es una potente herramienta estadística, que evalúa la importancia de uno o más factores al comparar las medias de varias respuestas en los diferentes niveles de los factores. Además es de gran importancia en la industria para el control de diversos procesos, como por ejemplo en el laboratorio. 34 5.6.1. Análisis estadístico para la determinación de glucosamina El análisis de varianza ANOVA es una técnica esencial en el estudio de datos experimentales. La idea general de esta técnica es separar la variación total en las partes con las que contribuye cada factor de variación en el experimento. Para estudiar si las variables tiempo y concentración presentan una influencia específica en la variable de respuesta, se efectúo el análisis de varianza ANOVA utilizando el programa estadístico STATGRAPICS, por lo cual se tiene la siguiente tabla 15 Tabla 15. ANOVA para la obtención de glucosamina Fuente Suma de G Cuadrado Cuadrados L Medio Valor Razón-F Valor-P Crítico de F Efectos Principales A: Concentración 667243023,7 2 333621511,8 6257,54 7,1E-15 4,256 B: Tiempo 100073546,4 2 50036773,18 938,51 3,6E-11 4,256 7,4E-09 3,633 Interacciones AB 44311742,37 4 11077935,59 207,782 Residuos 479836,1283 9 53315,12536 Total ( Corregido) 812108148,6 17 La tabla 15 descompone la variabilidad del porcentaje de glucosamina en contribuciones debidas a varios factores. La contribución de cada factor se mide eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. El factor A correspondiente a la concentración de ácido clorhídrico, y el factor B que corresponde al tiempo de reacción, así como los factores AB que corresponden a la interacción de ambos, tienen un valor-P menor a 0,05, por lo tanto, se puede establecer que son significativamente influyentes en la cantidad de glucosamina obtenida. El estadístico de F obtenido del factor A y B y la interacción AB son mayores al F crítico calculado a un nivel de confianza del 95%, por lo que se rechaza la hipótesis 35 nula y por lo tanto se acepta la hipótesis alternativa, por lo que el factor A tiene influencia en la cantidad de glucosamina eliminando el efecto del factor B. El factor B tiene influencia en la cantidad de glucosamina eliminando el efecto del factor A y la interacción de los factores AB tiene una influencia significativa en la cantidad de glucosamina obtenida. Figura 17. Efectos principales para glucosamina La figura 17 muestra los efectos de manera individual de los factores de tiempo de reacción y concentración para la obtención de glucosamina, donde el factor concentración tiene mayor influencia que el tiempo de reacción en el contenido de glucosamina obtenida. En la figura 18 se aprecia que para los dos factores A y B, la variable de respuesta varia en forma diferente. 36 Figura 18. Interacción AB para la obtención de glucosamina 5.7.Condiciones óptimas Las condiciones óptimas estimadas para la obtención de glucosamina se obtuvieron mediante el programa estadístico STATGRAPHICS. 5.7.1. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina Figura 19. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina Tabla 16. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina Concentración Tiempo, Glucosamina, Glucosamina, HCl, M min mg/100g g/100g 6 120 35581,01 35,58 37 6. DISCUSIÓN En el aislamiento de la quitina se logró obtener un rendimiento de 20,65 a 27,32% como se indica la tabla 11 con respecto al peso de las cáscaras de camarón, comparando con los resultados obtenidos en la tesis titulada “Obtención de quitosano a partir de quitina para su empleo en conservación de frutillas y moras” (Luna, 2012), donde se establece que el rendimiento de quitina corresponde al 22,22 %, determinándose así que los valores obtenidos en el presente trabajo son aceptables, ya que presenta un porcentaje de error del 7,9 % con respecto al rendimiento reportado en bibliografía. Además, la quitina obtenida cumple con las siguientes características: soluble en HCL concentrado e insoluble en agua, ácido acético y HCl 3 M, como se indica en el ANEXO D. Este análisis cualitativo realizado al polímero obtenido se contrasta con los resultados presentados en la bibliografía citada anteriormente, comprobando que la quitina cumple con la característica de solubilidad. El rendimiento de los sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida de la quitina varía entre 34,07 %, a 84,46% como se indica en la tabla 13, obteniendo valores altos de rendimientos para concentraciones de ácido clorhídrico y tiempos de reacción bajos, debido a que, a estas condiciones no hay una hidrólisis completa, ya que es posible tener una mezcla de productos como: N-acetil glucosamina, glucosamina y ácido acético; por lo tanto, para lograr la ruptura de los enlaces -1,4 glicosídicos es necesario trabajar a condiciones altas de concentración, tiempo y temperatura de reacción para lograr la completa despolimerización de la quitina. Mediante un análisis cualitativo con el reactivo de Fehling se determinó los 3 niveles de concentración de ácido clorhídrico que se utilizaron para la hidrólisis de la quitina, considerando el siguiente criterio: el cambio de color a rojo que experimenta con cada una de las muestras al reaccionar con dicho reactivo. Esto se 38 evidencio con las muestras obtenidas con concentraciones de ácido de 4, 5 y 6 molar, indicando el poder reductor de este tipo de azúcar que proviene del grupo carbonilo que es oxidado a grupo carboxilo; lo que no sucedió con las muestras obtenidas con concentraciones de ácido clorhídrico de 1, 2 y 3 molar, ya que estas al reaccionar con el reactivo de Fehling no experimentaron ningún cambio de color, indicando que no existe un fraccionamiento de las macromoléculas de la quitina. Los valores que se encuentra entre 14,29 a 35,33 g / 100 g de muestra corresponde a la cantidad de glucosamina, los que varían en función de la concentración del ácido clorhídrico y del tiempo de reacción, según las figuras 13, 14, 15 y 16 se puede analizar que el contenido de glucosamina incrementa conforme aumenta la concentración de ácido clorhídrico y el tiempo de reacción. Esto se debió a que existe una mayor despolimerización de las macromoléculas de la quitina al permanecer el ácido clorhídrico a alta concentración en contacto con el polímero por tiempos de reacción prolongados, lo que permite obtener una glucosamina de mayor pureza. La determinación de la glucosamina obtenida se realizó en un HPLC con un detector UV- VIS a 254 nm, confirmando la identificación a través de los picos observados en los cromatogramas de las muestras hidrolizadas de la quitina, se comparó el área del pico del estándar con el área de una de las muestras analizadas, dando una área para el estándar de 858307,563 mv/ min y para la muestra de 329562,438 mv/ min, al realizar la cuantificación de los picos se determinó el número de moléculas de glucosamina contenido en la muestra, por lo tanto, la concentración de la misma. Este análisis cuantitativo está basado en el área del pico del analito con la del estándar inyectado bajo las mismas condiciones cromatográfícas, este análisis se realizó a cada una de las muestras, VER ANEXO G. Mediante el programa estadístico STATGRAPHICS, se determinaron las condiciones óptimas del proceso para la obtención de glucosamina, obteniéndose que las condiciones óptimas corresponden a 6 M de ácido clorhídrico y 120 minutos de reacción; siendo la concentración la variable que tiene mayor influencia en el contenido de glucosamina como se observa en la figura 19 que cual se 39 determina la interacción tanto del tiempo de reacción como el de la concentración de ácido clorhídrico sobre la variable de respuesta; por lo tanto, la concentración presenta una mayor influencia sobre la cantidad de glucosamina obtenida, debido a que en concentraciones altas existe una mayor hidrólisis y así la ruptura de los enlaces -1,4 glicosídicos de las macromoléculas de la quitina. Comparando las ventajas y desventajas del proceso químico con el enzimático, se determinó que el primero tiene una considerable desventaja, debido a que se ocupa mayor cantidad de insumos como: productos químicos considerados agresivos para el medio ambiente y agua; mientras que, el proceso enzimático usa 50% menos de agua, ya que aprovecha la humedad de los desechos de los crustáceos, y al no utilizar químicos, permite obtener productos finales con menos impurezas; por otro lado, la desventaja del proceso enzimático es que se debe controlar más variables de operación como: pH, temperatura, porcentaje de encima, tiempo de incubación, entre otros, las cuales no se controlan en el proceso químico; además, el tiempo de hidrolisis de la quitina en mayor en el proceso enzimático. 40 7. CONCLUSIONES Se logró la obtención de glucosamina por hidrólisis ácida a partir de la quitina derivada de las cáscaras de camarón, obteniendo se entre 2,38 y 3,88 g de sólidos obtenidos después de la hidrólisis, los que contienen entre 14,29 y 35,58 g de glucosamina por cada 100 g de muestra analizada, estos últimos resultados se obtuvieron mediante el análisis cuantitativo en un HPLC con detector UV-VIS. En el proceso de laboratorio para la obtención de quitina se obtuvo rendimientos de 20,65 a 27,32%, lo que comparados con el contenido de quitina en las cáscaras de camarón que corresponde al 27 %, nos permite determinar que el proceso empleado es viable, ya que se está recuperando casi en su totalidad la quitina contenidas en los desechos. En el análisis cualitativo, al reaccionar cada muestra con el reactivo de Fehling, se obtuvo un resultado positivo, el que se evidenció con el cambio de color a rojo ladrillo, indicando el fraccionamiento de las macromoléculas, es decir la ruptura de enlaces 1,4 glicosidicos de la quitina, al hacer reaccionar con las concentraciones de 4, 5 y 6 molar de ácido clorhídrico. Al llevar a cabo el análisis del contenido de glucosamina por HPLC, se pudo confirmar que se establece una diferencia significativa en la cantidad obtenida de glucosamina en cada una de las muestras. Esto debido a que a bajas concentraciones de ácido clorhídrico y tiempos de reacción cortos existe una hidrólisis incompleta, lo que no sucede a condiciones altas de concentración de ácido clorhídrico y tiempo de reacción, en las que se presentan fraccionamiento de las macromoléculas de la quitina. 41 Se determinó que para la ruptura de los enlaces 1,4 glicosidicos, es necesario trabajar con concentraciones de ácido clorhídrico y tiempos de reacción altos, para así obtener el monómero de la quitina, y además evitar que se presenten productos no deseados. La mayor cantidad de glucosamina fue obtenida a concentraciones de ácido clorhídrico alto y tiempos elevados de reacción, debido a que, existe una interacción entre estas dos variables, siendo la concentración de ácido clorhídrico la que gobierna el proceso, ya que, presenta mayor influencia en la hidrólisis de las macromoléculas de la quitina, como se indica en la figura 17. Las condiciones óptimas para el proceso estimadas mediante el análisis estadístico usando la técnica de superficie de respuesta correspondieron a 6 M de concentración de ácido clorhídrico y un tiempo de reacción de 120 minutos, obteniéndose 35,33 g de glucosamina por cada 100 g de muestra analizada en el HPLC con detector UV-VIS. 42 8. RECOMENDACIONES Antes de realizar la extracción de quitina, realizar la verificación de cada uno de los exoesqueletos del camarón, ya que estos debes estar en buenas condiciones, es decir, libres de cualquier olor que no sea el característico a mariscos, evitar la descomposición de los mismos y tomar en cuenta que la textura debe ser consistente, para así evitar algún tipo de interferencia en la calidad de la quitina. Se sugiere que se realice un estudio para la extracción de colorante de las cascaras de camarón ya que en su estructura presenta el colorante carotenoide que es la astaxantina, el cual es usado como aditivo en los alimentos por su color característico que es el naranja. Se recomienda a las personas interesadas en el proceso de obtención de glucosamina a partir de desechos de camarón, que se realice un estudio para la extracción por vía enzimática, para así eliminar la producción de soluciones que son contaminantes para el medio ambiente. Se sugiere hacer un estudio sobre el proceso de obtención de glucosamina de otras fuentes que no sean de mariscos, ya que existe un gran porcentaje de personas que presentan algún tipo de alergia a este tipo de producto. 43 CITAS BIBLIOGRÁFICAS [1] MINISTERIO DEL AMBIENTE. La pesquería de arrastre camaronero en Ecuador. Subsecretaria de Gestión Marina y Costera,] Ministerio del Ambiente. 2012. p. 2 [2] CHÁVEZ, Roberto y LÓPEZ, María. Factibilidad técnica para el aprovechamiento integral del camarón especie penaeus vannamei. [En línea] Editorial Escuela Superior Politécnica del Litoral Ecuador. 2010. pp. 1-3 [Fecha de Recuperación: 13 Mayo 2016] Disponible en: https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/8840/1/ Factibilidad%20t%C3%A9cnica%20para%20el%20aprovechamiento%20integral% 20del%20Camar%C3%B3n.pdf [3] AMBIENTUM. Desechos pesqueros para disminuir la contaminación ambiental. [En línea] Editorial Argentina Investiga. 2015 [Fecha de Recuperación: 13 Mayo 2016] Disponible en: http://www.ambientum.com.ec/noticia/Desechos-pesquerospara-disminuir-la-contaminacion-ambiental/57586#.V4Z1WPnhDIV [4] FERNANDEZ, Ricardo, MACÍAS, Néstor y CONTERO, Rodrigo Creación de un nuevo modelo de negocios para la comercialización de camarón en el mercado de Guayaquil. [En línea] Editorial Escuela Superior Politécnica del Litoral Ecuador. 2009. p. 1 [Fecha de Recuperación: 13 Mayo 2016] Disponible en: https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/8002/1/D-39706.pdf [5] CÁMARA NACIONAL DE ACUACULTURA. Exportaciones por mercado y país comparativo acumulado a Abril 2016. [Fecha de Recuperación: 15 Mayo 2016] Disponible en: http://www.cna-ecuador.com/comercio-exterior/estadisticas/ camaron. [6] MINISTERIO DEL AMBIENTE, Op. Cit., .p. 6 [7] PRIMERA PLANA XXI Digital y Académico [En línea]. 2008. Salvador. La cáscara de camarón no es basura [Fecha de Recuperación: 18 Mayo 2016] Disponible en: http://primeraplanaxxi.blogspot.com/2009/09/la-cascara-decamaron-no-es-basura.html 44 [8] SORO, Luis. Estudio de la obtención de quitosano a partir de caparazones de camarón (Penaeus Vannamei) y su aplicación en la estabilidad de una emulsión aceite agua. Trabajo de Grado. Ingeniero de Alimentos. Escuela Superior Politécnica del Litoral. Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción. Guayaquil. 2007. p. 16. Disponible en: http://www.cib.espol.edu.ec/Digipath/D_Tesis_PDF/D-35464.pdf [9] RESTREPO, Ana y GUARÍN, Santiago. Valorización de los residuos generados en la industria de procesamiento del camarón [En línea] Editorial Escuela de Ingeniería de Antioquia. 2004. p. 3 [Fecha de Recuperación: 17 Mayo 2016] Disponible en: http://www.borsi.org/html/archivos/Bolsas/2/Publicacion/ Publicacion%20ID147.pdf [10] LUNA, Yadira. Obtención de quitosano a partir de quitina para su empleo en conservación de frutillas y moras. Trabajo de Grado. Ingeniera Química. Universidad Central del Ecuador. Escuela de Ingeniería química. p. 23 [11] NIETO, Christian y ORELLANA, Valeria. Aplicación del quitosano como promotor de floculación para disminuir la carga contaminante. [En línea] Editorial Universidad Politécnica Salesiana Sede Cuenca. 2011. p. 28 [Fecha de Recuperación: 22 Mayo 2016] Disponible en : http://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/1510/16/UPS-CT002068.pdf [12] SALAS, Gladys Diseño del área de producción para una fábrica procesadora de Quitina. [En línea] Editorial Universidad Tecnológica Equinoccial. 2009. p. 28 [Fecha de Recuperación: 22 Mayo 2016] Disponible en:http://repositorio.ute.edu.ec/handle/123456789/5330 [13] NIETO, Op. Cit., p. 30 [14] LUNA, Yadira. Obtención de quitosano a partir de quitina para su empleo en conservación de frutillas y moras. Trabajo de Grado. Ingeniera Química. Universidad Central del Ecuador. Escuela de Ingeniería química. pp. 24-25 [15] Ibid pp. 26-27 [16] Ibid pp. 27-28 [17] NIETO, Op. Cit., p. 37 [18] VELÁSQUEZ, Cristóbal, Quitina y quitosano: materiales del pasado para el presente y el futuro. [En línea] Editorial Avances de química. 2006. p. 37 [Fecha de Recuperación: 25 Mayo 2016] Disponible en: http://www.redalyc.org/ articulo.oa?id=93310204 45 [19] BUITRON, Diana. Biosorción de cromo y níquel en aguas contaminadas usando quitosano. Trabajo de Grado. Ingeniera Química. Universidad Central del Ecuador. Escuela de Ingeniería química. pp. 28 [20] MARTINEZ, A. Propiedades estructurales y fungistáticas de biopelículas de quitosano obtenido de ensilados de desecho de camarón. [En línea] Editorial Universidad de Sonara. 2009. p. 39 [Fecha de Recuperación: 01 Junio 2016] Disponible en:http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/19407/Capitulo2.pdf [21] LUNA, Op. Cit.,.. pp. 28-29 [22] COTA, Juan [en línea]. 2013. Obtención de quitosano a partir de exoesqueletos de camarón [Fecha de Recuperación: 18 Mayo 2016] Disponible en: https://prezi.com/eg4cku9mt6ss/obtencion-de-quitosano-a-partirdexoesqueletos -de -c amaron/ [23] ALVAREZ, Helsy y BRACHO, Orlando. Obtención de glucosamina a partir de los desechos del camarón. [En línea] Editorial Instituto Universitario Tecnológico Alosos Gamero. 2011. P. 29 [Fecha de Recuperación: 01 Junio 2016] Disponible en: https://www.yumpu.com/es/document/view/14846900 /obtencion-de-laglucosamina-a-partir-de-los-desechos-del-camaron. [24] Ibid pp. 31-32 [25] REVISTA CUBANA DE FARMACIA [en línea]. 2013. Diseño y validación de un nuevo método para estimar reductores hidrosolubles asociados con la quitina. Scielo [Fecha de Recuperación: 02 junio 2016] Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S003475152005000300007 [26] CHARLES, Haynes A., ALOISE, P& LOUISE, A F. Process for producing Nacetyl-D-glucosamine. US5998173. (CN1214737A, WO1997031121A1), 20 Feb 1996. Appl.08/603360, 17 Mar. 2016. 8.p. [27] PETIARD,V, MICHAUX, S. y COURTOIS, D. Producción de glucosamina a partir de especies vegetales. 2376114, 09 Mar 2012, 17 Mar. 2016. 3p [28] ALVAREZ, Helsy y BRACHO, Orlando. Obtención de glucosamina a partir de los desechos del camarón. [En línea] Editorial Instituto Universitario Tecnológico Alosos Gamero. 2011. P. 32 [Fecha de Recuperación: 01 Junio 2016] Disponible en: https://www.yumpu.com/es/document/view/14846900 /obtencion-de-laglucosamina-a-partir-de-los-desechos-del-camaron. [29] Ibid. pp. 32-33 46 [30] PETIARD, V, MICHAUX, S. y COURTOIS, D. Producción de glucosamina a partir de especies vegetales. 2376114, 09 Mar 2012, 17 Mar. 2016. 3p [31]THERAPEUTIC RESEARCH CENTER [en línea]. 2016. Clorhidrato de glucosamina [Fecha de Recuperación: 15 Junio 2016] Disponible en: https://medlineplus.gov/spanish/druginfo/natural/747.html 47 BIBLIOGRAFÍA SEYMOUR, R. y CARRAHER, C. Introducción a la química de los polímeros. BAYER, W Manual de química orgánica. Editorial Reverte Barcelona 1987 p 487 VALDERRAMA, J Información tecnológica. Editorial del norte Chile 1998 p 106 GARRIDO, A; TEIJON, J, VILLAVERDE, C y RAMIREZ J Fundamentos de bioquímica estructural Editorial Tebar Madrid 2006 p 315 ALVAREZ, Helsy y BRACHO, Orlando. Obtención de glucosamina a partir de los desechos del camarón. [En línea] Editorial Instituto Universitario Tecnológico Alosos Gamero. 2011. p. 29 LUNA, Yadira. Obtención de quitosano a partir de quitina para su empleo en conservación de frutillas y moras. Trabajo de Grado. Ingeniera Química. Universidad Central del Ecuador. Escuela de Ingeniería química. p. 23 48 ANEXOS 49 ANEXO A. Equipo para la obtención de la quitina Figura A. 1. Equipo de reacción para la obtención de la quitina 50 ANEXO B. Equipo para la hidrólisis ácida de la quitina Figura B.1. Equipo de reacción para hidrólisis ácida de la quitina 51 ANEXO C. Reacción de los sólidos obtenidos con el reactivo de Fehling Figura C. 1. Reacción del reactivo de Fehling para sólidos obtenidos con concentración de ácido 4 M Figura C. 2. Reacción del reactivo de Fehling para sólidos obtenidos con concentración de ácido 5 M Figura C. 3.Reacción del reactivo de Fehling para sólidos obtenidos con concentración de ácido 6 M 52 ANEXO D. Solubilidad de la quitina en diferentes solventes Figura D. 1. Solubilidad de quitina en ácido acético Figura D. 2. Solubilidad de la quitina en HCl concentrado 53 CONTINUACIÓN ANEXO D Figura D. 3. Solubilidad de la quitina en agua Figura D. 4. Solubilidad de la quitina en HCl 3 M 54 ANEXO E. Especificaciones de estándar de glucosamina 55 ANEXO F. Valores obtenidos de la cantidad de glucosamina 56 57 CONTINUACIÓN ANEXO F CONTINUACIÓN ANEXO F 58 CONTINUACIÓN ANEXO F 59 CONTINUACIÓN ANEXO F 60 61 CONTINUACIÓN ANEXO F CONTINUACIÓN ANEXO F 62 CONTINUACIÓN ANEXO F 63 64 CONTINUACIÓN ANEXO F 65 CONTINUACIÓN ANEXO F 66 ANEXO G Cromatogramas de glucosamina obtenida Figura. G 1. . Cromatograma 4M – 2 horas (réplica 1) Figura. G 2. Cromatograma 4M – 2 horas (réplica 2) 67 CONTINUACIÓN ANEXO G Figura. G 3.Cromatograma 4M – 1 hora (réplica 1) Figura. G 4.Cromatograma 4M – 1 hora (réplica 2) 68 CONTINUACIÓN ANEXO G Figura. G 5. Cromatograma 4M – 1 hora (réplica 1) Figura. G 6. Cromatograma 4M – 1 hora (réplica 2) CONTINUACIÓN ANEXO G 69 Figura. G 7. Cromatograma 6M – 2 horas (réplica 1) Figura. G 8. Cromatograma 6M – 2 horas (réplica 2) CONTINUACIÓN ANEXO G 70 Figura. G 9.Cromatograma 5M – 1 horas (réplica 1) Figura. G 10.Cromatograma 5M – 1 horas (réplica 2) CONTINUACIÓN ANEXO G 71 Figura. G 11. Cromatograma 5M – 2 horas (réplica 2) Figura. G 12. Cromatograma 5M – 2 horas (réplica 1) CONTINUACIÓN ANEXO G 72 Figura. G 13. Cromatograma 5M – 1:30horas (réplica 1) Figura. G 14. Cromatograma 5M – 1:30horas (réplica 2) CONTINUACIÓN ANEXO G 73 Figura. G 15. Cromatograma 6M – 1:30 horas (réplica 1) Figura. G 16. Cromatograma 6M – 1:30 horas (réplica 1) CONTINUACIÓN ANEXO G 74 Figura. G 17. Cromatograma 6M – 1:00 hora (réplica 1) Figura. G 18. Cromatograma 6M – 1:00 hora (réplica 2) 75
