índice i.- introducción ii.- objetivos iii. estrategía

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ÍNDICE
1
I.- INTRODUCCIÓN
I.1. Generalidades
I.1.1. La regulación por el pH
I.1.2. Funciones transcripcionales de PacC/Rim101
I.1.3. Comportamiento de las mutantes en los genes Pal/Rim en Aspergillus
nidulans
I.1.4. El sistema Pal/Rim en Saccharomyces cerevisiae
I.1.5. El sistema Pal/Rim en Candida albicans
I.2. El modelo de este estudio: Ustilago maydis
I.2.1. Ciclo de vida
I.3. Antecedentes
I.3.1. Sistema Pal/Rim en U. maydis
II.- OBJETIVOS
II.1. Objetivo general
II.2. Objetivos específicos
1
1
3
4
4
6
6
7
8
8
13
13
13
14
III. ESTRATEGÍA EXPERIMENTAL
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
IV.1. Organismos utilizados
IV.2. Medios y condiciones de cultivo
IV.2.1. Medios para el cultivo
IV.2.2. Crecimiento en condiciones de estrés
IV.3. Purificación del polisacárido
IV.4. Determinación de proteína
IV.5. Determinación de azúcares neutros
IV.6. Digestión del polisacárido con β-1,3-glucanasa
IV.7. Hidrólisis ácida del polisacárido o las paredes celulares
IV.8. Cromatografía en capa fina (TLC)
IV.9. Inmunodetección del polisacárido
IV.10. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear con Transformada de
Fourier (FT-NMR)
IV.11. Espectroscopía de Infrarrojo Medio con Transformada de Fourier (FT-IR)
IV.12. Cromatografía de intercambio aniónico (HPAEC)
IV.13. Purificación de paredes celulares
IV.14. Determinación secuencial de los componentes de la pared celular
IV.15. Determinación de quitina
IV.16. Microscopía electrónica
IV.17. Purificación de RNA
IV.18. Transcripción reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
IV.19. Determinación de actividad de lipasa
V
15
15
15
15
15
15
16
16
16
17
17
17
17
18
18
18
19
19
20
20
20
21
IV.20. Determinación de pH intracelular
IV.20.1. Calibración in vivo
IV.20.2. Medición de pH intracelular
IV.21. Determinación de la reproducibilidad de los métodos usados
V.- RESULTADOS
V.1. Identificación del polisacárido secretado por la mutante ∆palB
V.1.1. Evaluación de la secreción del posible polisacárido secretado por las
cepas pal/rim en función del pH
V.1.2. Identificación de azúcares presentes en el polisacárido
V.1.3. Inmunodetección del polisacárido
V.1.4. Identificación del polisacárido por medio de hidrólisis enzimática
V.1.5. Identificación del polisacárido por FT-IR y FT-NMR
V.2. Análisis de la estructura y composición química comparativas de la pared de
las cepas silvestre y mutante ∆palB de U. maydis
V.2.1. Estructura de la pared celular
V.2.2. Análisis de la composición química de la pared celular
V.2.3. Análisis de la expresión de los genes que codifican quitina sintasa
(CHS) y glucana sintasa (GLS)
V.2.4. Determinación de la proteína presente en el medio de cultivo
V.3. Sensibilidad de la mutante pal/rim a diferentes tipos de estrés
V.3.1. Sensibilidad a estrés osmótico y salino
V.3.2. Estabilidad de la pared celular
V.3.3. Sensibilidad a estrés oxidativo
V.3.4. Análisis de una posible relación de la vía Pal/Rim con las vías PKA y
MAPK involucradas en el crecimiento levaduriforme y micelial de U.
maydis respectivamente
V.4. Determinación de la secreción de proteínas alcalinas
V.4.1. Secreción de lipasa
V.5. Homeostasis del pH intracelular
V.5.1. Determinación de pH intracelular
V.5.2. Análisis de la expresión de los genes que codifican los genes de
ATPasa de H+ de la membrana citoplasmática
VI. DISCUSIÓN
VII. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
VI
21
21
22
23
23
23
23
23
24
24
25
26
26
26
27
28
28
28
29
29
29
29
29
30
30
31
33
37
40
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Tabla 1.Tabla 2.Tabla 3.Tabla 4.-
Organismos empleados
Oligos empleados
Azúcares neutros presentes en el posible polisacárido
Composición química de purificados de paredes celulares de la cepa
silvestre y mutante de U. maydis
Tabla 5.- Azúcares neutros presentes en la pared celular de la cepa silvestre y
mutante ∆palB de U. maydis
Tabla 6.- Determinación de proteína presente en el medio de cultivo de la cepa
silvestre y mutante ∆palB de U. maydis
Tabla 7.- Efecto de la vía Pal/Rim en la homeostasis del pHi de U. maydis
Figura 1.Figura 2.Figura 3.Figura 4.-
Modelo genético de regulación por pH en A. nidulans
Modelo propuesto de regulación por pH en A. nidulans
Ciclo de vida de U. maydis
Esquema representativo de la determinación secuencial de los
componentes de la pared celular
Figura 5.- Curva de calibración de pH in vivo de U. maydis
Figura 6.- Secreción del posible polisacárido al medio de cultivo de la cepa ∆palB de
U. maydis
Figura 7.- Cromatografía de capa fina del polisacárido
Figura 8.- Inmunodetección del polisacárido
Figura 9.- Cromatograma de HPAEC del producto de 10 h de digestión del
polisacárido con β-1,3-glucanasa
Figura 10.- Espectro de infrarrojo medio (FT-IR) de la muestra del polisacárido
Figura 11.- Espectro de 1H-NMR en estado líquido de la muestra del polisacárido
Figura 12.- Espectro de 13C-NMR en estado sólido de la muestra del polisacárido
Figura 13.- Microscopía electrónica de secciones de células de U. maydis
Figura 14.- Análisis de niveles de expresión de transcritos de los genes de CHS y GLS
Figura 15.- Efecto del estrés osmótico en el crecimiento de la cepa silvestre y
mutante en ∆palB de U. maydis
Figura 16.- Efecto del estrés a iones divalentes con Mg++ en el crecimiento de la cepa
silvestre y mutante en ∆palB de U. maydis
Figura 17.- Efecto del estrés a iones divalentes en el crecimiento con Ca++ de la cepa
silvestre y mutante en ∆palB de U. maydis
Figura 18.- Efecto en la estabilidad de la pared celular en el crecimiento de la cepa
silvestre y mutante en ∆palB de U. maydis
Figura 19.- Efecto del estrés oxidativo en el crecimiento de la cepa silvestre y
mutante en ∆palB de U. maydis
Figura 20.- Efecto del estrés a cafeína en el crecimiento de la cepa silvestre y
mutante en ∆palB, PKA-, MAPK- de U. maydis
Figura 21.- Morfología celular de la cepa silvestre y mutante ∆palB de U. maydis
VII
15A
20A
23B
26C
27A
28A
31A
1A
3A
7A
19A
22A
23A
24A
24B
25A
25B
25C
26A
26B
27B
28B
28C
28D
29A
29B
29C
30A
Figura 22.- Cinética de crecimiento con aceite de oliva de la cepa silvestre y mutante
en ∆palB de U. maydis
Figura 23.- Determinación de lipasa en cultivos las cepas silvestre y mutante en
∆palB de U. maydis
Figura 24.- Análisis de niveles de expresión de transcritos de la ATPasa H+ PMA1 de la
cepa silvestre y mutante en ∆palB de U. maydis
Figura 25.- Análisis de niveles de expresión de transcritos de la ATPasa Na+/H+ de la
cepa silvestre y mutante en ∆palB de U. maydis
Figura 26.- Esquema propuesto de la regulación de la vía Pal/Rim con otras rutas
metabólicas
VIII
30B
30C
31B
32A
38A
ABSTRACT
One of the most important physicochemical factors of the environmental that affect cell
growth and development is pH. In the particular case of fungi, depending on external pH
they secrete different low molecular weight compounds and proteins that perform
important functions in their adaptation to the prevalent environmental conditions. The
most important mechanism controlling these functions in fungi is the signal transduction
pathway that we have denominated as Pal/Rim. This is a signaling cascade that leads to
the proteolytic activation of a zinc finger transcription factor called PacC/Rim101 that
activates or represses transcription of a selected number of genes. This signaling pathway
is mediated in Ascomycota by six proteins: PalH/Rim21, PalF/Rim8, PalI/Rim9,
PalA/Rim20, PalB/Rim13 and Snf7/Vps32 (ESCRT-III).
Ustilago maydis is a Basidiomycota biotrophic pathogen fungus responsible for
common smut in maize (Zea mays L.) and teozintle (Z. mays ssp. Parviglumis). In common
with all Basidiomycota whose genomes have been sequenced, U. maydis contains only
PalA/Rim20, PalB/Rim13, PalC/Rim23 PalI/Rim9 and PacC/Rim101 genes. Studies in our
laboratory showed that mutation of genes PacC/Rim101, PalB/Rim13, PalC/Rim23
PalA/Rim20 and PalI/Rim9 in U. maydis, gave rise to a pleiotropic phenotype, that
included growth inhibition at alkaline pH, secretion of a viscous polysaccharide,
hypersensitivity to alkaline ions (Li+, Na+ and K+), increased susceptibility to acid or
oxidative stress, and deficiencies in the construction of cell wall. These alterations may
indicate a cross-talk between Pal/Rim and different pathways including the one involved
in cell wall integrity.
In this study I analyzed the mechanisms through which the Pal/Rim pathway is
involved in providing tolerance to divalent ions, alkaline pH, and the organization and
assembly of the cell wall. The results described in this thesis are evidence that the
pathway is related to signaling pathways responsible for the maintenance of cell wall
integrity, stress response, and regulation of intracellular pH homeostasis.
XI
Tabla 1. Organismos empleados.
Cepa
Genotipo
relevante
Ustilago maydis
silvestre
FB2
a2b2
Ustilago maydis
AC401
Ustilago maydis
pka-
Ustilago maydis
mapk-
Organismo
a2b2
∆palB
a2b2
∆uac1
a2b2
∆ubc4
15A
Origen
F.
Banuett,
California
State
University, Long Beach.
A.
Cervantes Chávez, Laboratorio
13 de CINVESTAV-Irapuato.
E. Gold, University of Georgia, Athens
Georgia.
E. Gold, University of Georgia, Athens
Georgia.
Tabla 2. Lista de oligonucleótidos empleados.
Nombre
5’3’ Secuencia
F- CTTTCAGACGTTGGCGCCAGC
Chs1
Tm oC
Fragmento (pb)
# de ciclos
62
267
30
60
340
30
60
650
30
60
659
30
60
498
30
60
378
30
60
539
30
62
417
30
60
390
30
60
836
30
50
279
36
48
298
36
R- CGAGTGAGCTGGATCTTTTTG
F- CGAAGCACAGCAACCAACCAC
Chs2
R- GATTTGCTGATACTGCTGGCC
F- GCCTATTATTCGAGACCGGCTT
Chs3
R- GCGATACCAGCTGCTCTTCCAA
F- GCCACCTCGCTACCCATTT
Chs4
R- CCCTCTTGAGCGTCTTGTAT
F- CACGTTGATTCCTGTCTCGAC
Chs5
R- CTGTCCAACGTTCCGGTCCTTC
F- CGCAGGCGGCATCGATGA
Chs6
R- CGGATTCGTTGCGTTGAGC
F- GCGACCAGGAAGTGATTATCGATA
Chs7
R- CGATGGCTGTGGTGGATGCTGAT
F- GGACCGACTATGAAAACGAGC
Chs8
R- GAAGGCTGAGGCATGAACCC
F- GCCGAGGTCATCTTCCCCATCTGC
Gls
G- AAGCGCGGTTTGTCTCGTCGTG
F- GGGTAAAGAAAAGGCTCACG
Feα
R- GGGCGAAGGTGACAACCATAC
CGTCTTTATCGCTCTGTTCG
PMA1
CGACACTTCGAGGAAAAGGA
ATPasa
CTCGGCGTTATTCTTGACGA
Na/H
AAGATCGCACACTCCCACTC
20A
Tabla 3. Azúcares neutros presentes en el polisacárido. Crecimiento celular de la mutante
∆palB de U. maydis a diferentes pH.
Mutante ∆palB de U. maydis
pH
μg proteína/ ml
cultivo
Peso seco del
polisacárido mg
7
86.17 ±1.6
10.9
8
76.6 ±0.8
10.4
9
95.74 ±2.3
12.2
10
95.74 ±1.4
11.7
11
20.64 ±0.5
7.5
23B
Azúcares neutros
mg
10.7 ±0.6
Tabla 4. Composición química de purificados de paredes celulares de cepa silvestre y
mutante ∆palB de U. maydis. Las diferencias de la cepa mutante son estadísticamente
significativas con 95% de confianza.
Porcentaje por mg de pared celular
Composición química
Cepa silvestre
FB2
Cepa mutante
∆palB
Azúcares neutros totales
63.3 ±2.4
51.8 ±1.2
Quitina
12.9 ±1.3
4.8 ±2.3
Proteína
15.7 ±0.8
10.1 ±1.1
26C
Tabla 5. Azucares neutros presentes en la pared celular de la cepa silvestre y mutante
∆palB de U. maydis. Se cuantificó secuencialmente cada uno de los azures enlistados en la
tabla por el método de antrona. Las diferencias en azucares neutros álcali solubles de la
cepa mutante son estadísticamente significativas con 95% de confianza.
μg CHO´s/mg pared celular
Azúcares neutros
Cepa silvestre
FB2
Cepa mutante
∆palB
44.11 ±5.6
12.52 ±3.6
Mananas
11.05 ±1.7
7.58 ± 2.1
β-1,3-glucanas
33.06 ±3.9
4.94 ±1.5
527.91 ±32.7
459.51 ±28.4
β-1,6-glucanas
69.63 ±8.2
45.28 ±7.6
β-1,3-glucanas
458.28 ±25.8
414.23 ±19.8
Azúcares neutros álcali solubles
Azucares neutros álcali insolubles
27A
Tabla 6. Determinación de proteína presente en el medio de cultivo de la cepa silvestre y
mutante ∆palB de U. maydis.
Cepa
mg proteína/100 ml de medio
FB2
0.125
AC401
1.41
28A
Tabla 7. Efecto de la vía Pal/Rim en la homeostasis del pH intracelular de U. maydis.
Determinación de pH intracelular de cepa silvestre y mutante ∆palB con el fluoróforo
BCECF-AM 1µM. Las diferencias de la cepa mutante son estadísticamente significativas
con 95% de confianza.
Cepa silvestre
Cepa mutante
pH externo
pH interno
∆
pH interno
∆
6
7.846 ±0.01
8.5
7.805 ±0.013
6 →9 (5 h)
7.896 ±0.015
0.050
8.294 ±0.08
0.249
6 →9.5 (3 h)
7.911 ±0.018
0.065
8.467 ±0.07
0.522
6 →10 (3 h)
7.928 ±0.02
0.082
8.674 ±0.091
0.729
7.945 ±0.034
-0.040
-0.040
7.905 ±0.031
31A
I. INTRODUCCIÓN
I.1. Generalidades
Uno de los factores fisicoquímicos medio ambientales más importante que afectan el
crecimiento y desarrollo celular es el pH (Cervantes-Chávez y Ruiz-Herrera, 2010). Los
organismos pluricelulares tienen normalmente sistemas homeostáticos que mantienen el
pH extracelular relativamente constante. Pero aquellos organismos unicelulares que viven
en medios de la más diversa composición y a valores de pH que se alejan del óptimo
intracelular, deben poseer sistemas que les permitan regular el pH dentro de valores que
no les afecten. Para controlar el pH intracelular, dichos organismos han desarrollado
mecanismos que regulen la entrada y salida de diferentes iones, los que en muchos casos
son inducidos o reprimidos por las condiciones del pH extracelular.
Existen observaciones que se remontan a más de medio siglo para las bacterias y
al menos un cuarto de siglo para los hongos (Nahas et al., 1982) que sugieren que la
regulación génica puede responder adecuadamente al pH ambiental. Es así que en
muchos microorganismos, sobre todo aquellos que son capaces de crecer en un amplio
rango de pH, su expresión génica puede estar mediada por el pH de su entorno de
crecimiento (Caddick et al., 1986). Entre los genes cuya expresión puede estar
influenciada por el pH del medio como fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina, xilanasas, otras
glicosidasas, proteasas, permeasas, etc que deben funcionar a un pH ambiental distinto al
interno, así como otras enzimas implicadas en la síntesis de metabolitos de exportación,
tales como toxinas y antibióticos, los cuales posiblemente participen en la homeostasis
del pH interno (Fig. 1).
I.1.1 La regulación por el pH
La respuesta a variaciones en el pH del medio por parte de los microorganismos es un
importante mecanismo para su supervivencia. En el caso de los hongos, hasta hoy se han
descrito al menos tres mecanismos que cumplen con esta función. En la levadura
Saccharomyces cerevisae se ha descrito un mecanismo que responde a pH alcalino
1
dependiente de calcineurina, el cual actúa mediante la activación de un gran número de
genes bajo el control del factor de transcripción Crz1p (Serrano et al., 2002). Además se
ha descrito otro mecanismo que depende del gen mds3 en C. albicans. El gen mds3
codifica una proteína que posee un dominio de interacción proteína-proteína tipo Kelch.
Las mutantes homocigóticas mds3/mds3 de C. albicans se encuentran afectadas en la
expresión de varios genes asociados al crecimiento micelial, no pueden formar micelio a
pH alcalino en algunos medios y muestran virulencia reducida en algunos modelos de
infección (Davis et al., 2002).
Sin embargo, el mecanismo de regulación más importante que es controlado por
el pH externo, y que conduce a la síntesis y secreción de varios metabolitos y proteínas,
es una vía de transducción de señales llamada por varios autores como vía Rim para los
hongos levaduriformes o Pal para los hongos filamentosos, que aquí de manera neutral
nosotros la llamaremos Pal/Rim. Esta cascada de señalización conduce a la activación
proteolítica de un factor de transcripción de tipo “dedo de zinc” llamado PacC en los
hongos filamentosos o Rim101p en las levaduras, el cual activa la transcripción de algunos
genes a pH alcalino y reprime otros a pH ácido (Espeso y Arst, 2000). En el sistema más
estudiado, que es A. nidulans, la activación de PacC/Rim101 depende de la acción de seis
proteínas: PalH/Rim21, PalF/Rim8, PalI/Rim9, PalA/Rim20, PalB/Rim13 y PalC/Rim23, así
como de unos componentes de la maquinaria del sistema de endocitosis.
Las proteínas que componen esta vía de señalización están aparentemente
organizadas en dos complejos separados espacialmente; uno localizado en la membrana
plasmática y otro en las membranas endosomales (Peñalva et al., 2008). El complejo de
señalización de la membrana plasmática está conformado por PalH, una proteína con
siete dominios transmembranales; PalF, una arrestina; y muy probablemente PalI, que
contiene tres dominios transmembranales. Las evidencias indican que PalH es
posiblemente el único componente esencial de un receptor de la membrana plasmática,
dado que se sabe que las arrestinas facilitan la señalización de receptores de siete
dominios transmembranales hacia proteínas regulatorias localizadas más adelante en la
vía de transducción de la señal, y se ha demostrado que PalH interactúa fuertemente con
2
PalF. El papel de PalI en esta vía de señalización es contribuir a una adecuada localización
de PalH en la membrana plasmática. El complejo localizado a nivel de la membrana
endosomal está conformado por PalA, PalB, Snf7/Vps32 (maquinaria ESCRT-III) y
probablemente PacC (aunque de manera transitoria). Al recibir la señal de activación
proveniente del complejo de la membrana plasmática, PalA unido a Snf7/Vps32 en la
membrana endosomal, recluta a PacC uniéndose a dos motivos YPXL/I que flanquean el
sitio de corte por PalB, una proteasa tipo calpaína, ubicado en el tercer dominio (dominio
C). PalB elimina dicho dominio de PacC, pasando éste a su forma activa después de una
segunda proteólisis independiente del pH externo. La forma activa de PacC entra
entonces al núcleo de la célula y se encarga de reprimir algunos genes expresados a pH
ácido y promover la transcripción de algunos genes expresados a pH alcalino (Fig. 2). PalC
es la única proteína involucrada en esta vía de señalización a la cual aún no se le ha
asignado una función específica, aunque se hipotetiza que es reclutado por el complejo
de la membrana plasmática de manera concomitante a la internalización mediada por
PalF, para actuar como sitio de anclaje para las membranas endosomales que contienen a
PalA y PalB, con la subsecuente liberación de PacC.
I.1.2 Funciones transcripcionales de PacC/Rim101
Este sistema fue originalmente identificado en A. nidulans, pero un mecanismo similar se
ha descrito en otros hongos como S. cerevisiae, Colletotrichum acutatum, Yarrowia
lipolytica, Candida albicans, Acremonium chrysigenum y Fusarium oxysporum (Peñalva y
Arst, 2002; 2003).
Varios genes o funciones en A. nidulans se han identificado como regulados por
PacC, en particular los ya mencionados genes que codifican enzimas extracelulares,
permeasas y enzimas que intervienen en la síntesis de metabolitos de exportación
(Peñalva y Arst, 2002). S. cerevisiae crece en un amplio rango de pH, pero
preferentemente en un medio ácido, sufriendo un estrés en respuesta a una rápida
alcalinización. Esto se refleja en los análisis de la transcripción de todo el genoma, que
han revelado que los niveles de expresión de varios cientos de genes son remodelados en
3
respuesta a cambios en el pH ambiental. Un subconjunto de estos genes sensibles a pH
son regulados por la vía Pal/ Rim (Causton et al., 2001).
I.1.3. Comportamiento de mutantes en los genes Pal/Rim en A. nidulans
Las mutantes afectadas en la regulación por pH en A. nidulans caen principalmente en dos
categorías. La primera agrupa a las mutantes que mimetizan una respuesta a la
alcalinidad, o sea que independiente del pH del ambiente, dan lugar a un patrón de
expresión genética similar a la del tipo silvestre bajo condiciones alcalinas. La segunda
categoría es la de las mutantes que mimetizan una respuesta a la acidez, las cuales,
independientemente del pH del ambiente, muestran un patrón de expresión similar al
mostrado por la cepa silvestre crecida en medio ácido, mostrando por lo tanto un fenotipo
opuesto a las mutantes de la primera categoría (Tilburn et al., 1995; Caddick et al., 1986).
Además, un pequeño número de mutantes tienen un fenotipo de neutralidad, en las
cuales el patrón de la expresión de genes se asemeja a la del tipo silvestre crecido a un pH
de 6.5 o tienen una mezcla heterogénea característica de mimetización a la alcalinidad o
a la acidez (Mingot et al., 1999).
Al mutar cualquiera de los genes pal/rim se obtienen siempre mutantes que
mimetizan la acidez; es decir, presentan un aumento en la expresión de genes ácidos y
una expresión reducida de genes alcalinos, independientemente del pH del medio. En el
caso de las mutantes de pacC, estas pueden mimetizar la acidez o la alcalinidad,
dependiendo de la naturaleza de la mutación (Espeso et al., 1997).
I.1.4. El sistema Pal/Rim en Saccharomyces cerevisiae
El sistema Pal/Rim en S. cerevisiae, fue identificado inicialmente por su papel como un
regulador positivo de meiosis y esporulación, y no fue sino posteriormente que fue
reconocido por su papel en la respuesta al pH, ya que hasta ese momento el sistema
Pal/Rim era considerado exclusivo de los hongos filamentosos. El homólogo de PacC,
Rim101 es proteolíticamente procesado en respuesta a la señalización Pal/Rim por un
solo corte, el cual corresponde al primer paso en el procesamiento proteolítico de PacC. A
4
diferencia de PacC, Rim101 no parece ser expresado en la alcalinidad (Lamb et al., 2001;
Viladevall et al., 2004).
El control negativo ocurre directamente a través de su unión al motivo consenso
TGCCAAG de los promotores. Por el contrario, el control positivo es mediado por la
represión de Rim101 del gen NRG1 o SMP1 (Lamb y Mitchell, 2003). Rim101 regula
negativamente varios genes incluyendo RIM8/PalF y siendo capaz de unirse a su
promotor in vivo. Este resultado apoya la hipótesis de que la represión de Rim101 sobre
RIM8/PalF provee una retroinhibición para atenuar la respuesta a pH alcalino (Ramón et
al., 1999).
Rim101 es un regulador positivo en la activación de la esporulación, en el
crecimiento invasivo, en tolerancia y adquisición de iones, en la adaptación a pH alcalino y
en ciertas características de la pared celular. Esto ocurre, en parte, a través de la represión
de NRG1 por Rim101, el cual es un regulador negativo de los genes reprimidos por
glucosa, de genes involucrados en filamentación y en crecimiento invasivo y en genes
involucrados en homeostasis iónica. El incremento de la expresión de ENA1, el cual
codifica una ATPasa de Na+, constituye un mecanismo por el cual S. cerevisiae es capaz de
desarrollarse a un pH alcalino y/o con concentraciones elevadas de Li+ y Na+. ENA1 es
controlado por varias vías de señalización, incluyendo la represión de NRG1 un factor de
transcripción que es reprimido por Rim101 (Ruiz y Ariño, 2007). Nrg1 y Rim101 también
funcionan como co-represores de DIT1 un gen específico de esporulación (Lamb et al.,
2001). Rim101 regula negativamente SMP1, el cual se comporta como un regulador
negativo del crecimiento invasivo haploide y de la esporulación. Smp1 es probablemente
un represor de CWP1, el cual codifica una manoproteína que promueve la integridad de la
pared celular. La participación positiva en el ensamble de la pared celular no es
enteramente dependiente de Smp1 sino también de funciones en paralelo con la vía de la
proteína cinasa C (Castrejón et al., 2006).
5
I.1.5. El sistema Pal/Rim en Candida albicans
El crecimiento de C. albicans tanto como un organismo comensal en la mucosa del tracto
digestivo del humano como patógeno oportunista, y su capacidad de respuesta a los
cambios extremos de pH ambiental es esencial. C. albicans puede crecer in vitro a valores
de pH de 2-10. La vía Pal/Rim (CaRim en este organismo) está conservada y tiene un papel
importante en el control de la inducción dimórfica, mediante la cual bajo condiciones
acidas favorece el crecimiento levaduriforme y en condiciones alcalinas favorece el
crecimiento de la hifa (Davis, 2003). La capacidad de C. albicans para llevar a cabo la
transición dimórfica y responder a diversos ambientes es esencial para su virulencia, y al
menos en modelos de infección sistémica en ratones, las mutantes alteradas en la
formación de micelio son en gran parte avirulentas.
I.2. El modelo de este estudio: Ustilago maydis
Ustilago maydis pertenece a la familia de los Ustilaginales, un orden de los Basidiomicota
que incluyen a hongos patógenos de plantas biotróficos que son comúnmente conocidos
como carbones. U. maydis es un patógeno específico del maíz (Zea mays) y el teozintle (Z.
mays subesp. parviglumis), el posible ancestro del maíz. U. maydis es el agente causal del
carbón común del maíz, enfermedad que se caracteriza por el desarrollo de clorosis,
hiper-produccion de antocianinas, disminución en el crecimiento y especialmente por la
formación de tumores. Los tumores se desarrollan en cualquier parte aérea de la planta y
pueden alcanzar grandes tamaños, particularmente en las plantas maduras.
Las características que han hecho de U. maydis un modelo atractivo para el
estudio genético molecular se pueden resumir de la siguiente manera: la existencia de
una fase haploide, en la cual el hongo forma colonias compactas, que permiten el uso de
técnicas microbiológicas comunes, la posibilidad de construir diploides en el laboratorio,
lo cual hace posible el llevar a cabo exámenes de dominancia y complementación; la
transformación con DNA exógeno; su susceptibilidad de que un segmento genómico sea
remplazado con una copia mutada del gen por recombinación homóloga; la existencia de
meiosis lo cual facilita llevar a cabo análisis de segregación; la capacidad para completar
6
su ciclo de vida en plantas de maíz jóvenes de tres semanas de edad o menos; la
posibilidad de analizar la transición dimórfica (levadura a micelio) in vitro y el hecho de
que
su
genomio
haya
sido
totalmente
secuenciado
y
sea
accesible
(http://mips.gsf.de/genre/proj/ustilago) (Ruiz-Herrera et al., 2000).
I.2.1. Ciclo de vida
U. maydis no es un parasito obligado, pero requiere de uno de sus dos huéspedes
naturales para realizar su ciclo sexual. Solamente los dicariones y los diploides son
infecciosos, lo que muestra la interrelación entre los aspectos de sexualidad, morfogénesis
y patogénesis, y revela la complejidad de los tres procesos. El ciclo de vida del hongo se
muestra en la Fig. 3 (Banuett, 1994; Holliday, 1974; Ruiz-Herrera et al., 2000). En el ciclo
de vida de U. maydis se distinguen dos fases. Una de ellas es saprofítica, durante la cual el
hongo crece en forma de levaduras haploides alargadas que se reproducen por gemación
(también llamadas esporidias). La gema se forma en la zona de máxima curvatura,
formando un ángulo de 30-40 grados con respecto a la célula madre. U. maydis no es un
colonizador eficiente de nichos naturales, ya que el rango de las fuentes de carbono que
puede utilizar es muy restringido (Caltrider y Gottlieb, 1965). La segunda fase es la micelial
y patogénica, durante la cual el hongo crece en forma de hifas dicarióticas que solo se
desarrollan en el interior del huésped. Esta fase se inicia con el apareamiento de dos
células que compartan loci de apareamiento (sexuales) a y b compatibles. La cercanía de
células compatibles provoca una inhibición de la gemación y la formación de filamentos
delgados (tubos de conjugación) que se dirigen el uno hacia el otro por una acción
quimiotrópica, para finalmente fusionarse en el extremo apical para formar el micelio
dicariótico infeccioso, el cual continua su crecimiento y es capaz de invadir a un huésped
susceptible a través de aberturas naturales, por los estomas, por los órganos florales, o
activamente formando un apresorio. En el interior de la planta el hongo crece de manera
intracelular o extracelular sin causar gran daño al huésped originalmente en forma de
micelio delgado. La mayor parte del crecimiento ocurre en los tejidos meristemáticos de la
planta con la formación final de las agallas o tumores en los cuales ocurre la esporulación
7
del hongo. Las hifas adquieren formas irregulares y se fragmentan, cubriéndose
finalmente con una pared gruesa equinulada y pigmentada (Banuett y Herkowitz, 1996).
Durante una fase de este proceso ocurre la cariogamia con la formación del estado
diploide del hongo. Las esporas maduras (teliosporas) son liberadas cuando las agallas se
secan y se abren. Las teliosporas constituyen el estado diploide del hongo y hasta el
momento no se ha logrado su formación fuera de las plantas de maíz o teozintle. La
germinación de la teliospora se inicia con la formación de un tubo germinativo
denominado promicelio. El núcleo de la espora migra hacia el promicelio y en este punto
ocurre la meiosis. A partir del promicelio se forman cuatro basidiosporas en forma
acropetala las cuales geman para reiniciar el ciclo de vida.
I.3. Antecedentes
I.3.1. Sistema Pal/Rim en Ustilago maydis
En nuestro grupo de investigación Aréchiga-Carvajal y Ruiz-Herrera (2005) identificaron,
aislaron e interrumpieron un homólogo de PacC/Rim101 en U. maydis, abriendo el
camino para el estudio de esta vía en otros Basidiomicota, ya que hasta ese momento se
consideraba que la vía era específica de Ascomicota. Cervantes-Chávez y Ruiz-Herrera
(2010) analizaron si la vía Pal/Rim estaba conservada en U. maydis. Se pudo identificar
sólo cinco homólogos de los siete componentes que componen la vía en Ascomicota (ver
arriba), y por medio de análisis in silico se demostró que ésta era una característica de las
especies de los Basidiomicota. Se determinó que solo los genes que codifican PalA/Rim20,
PalB/Rim13 y PalC/Rim23, que constituyen el complejo de la membrana endosomal y
PalI/Rim9 del complejo ubicado en la membrana plasmática estaban conservados en los
Basidiomicota, aunque este último carece de un papel detectable en la transducción de la
señal. Estos datos revelan que la vía Pal/Rim se conserva en los Basidiomicota, pero con
notables diferencias al de los sistemas de los Ascomicota.
Otra diferencia con el mecanismo de la vía en los Ascomicota fue la observación
de que mutantes en PalI/Rim9 de U. maydis mostraron un fenotipo con carencia o
8
ausencia en los ensayos realizados, ya que en contraste con los resultados que han sido
publicados de las mutantes en PalI/Rim9 presentan defectos notables en S. cerevisiae (Li y
Mitchell, 1997) y C. albicans (Cornet et al., 2009). Sin embargo, se observó un fenotipo no
tan marcado en las mutantes en ∆PalI/Rim9 en Y. lipolytica (González-López et al., 2002;
Blanchin-Roland et al., 2008) o en A. nidulans (Arst et al., 1994; Denison et al, 1998), y la
observación de que PacC/Rim101 es correctamente procesado en las mutantes
∆palI/rim9 de A. nidulans (Calcagno-Pizarelli et al., 2007), sugiere un papel de menor
importancia de PalI/Rim9 en la transducción de la señal de pH incluso en algunos
Ascomicota. En contraste con estas diferencias en el complejo situado en la membrana
plasmática la funcionalidad del complejo endosomal parece ser similar. En concordancia
con los miembros que componen este complejo en Ascomicota, los homólogos de U.
maydis de las proteínas PalA/Rim20 y PalC/Rim23 mostraron en su región N-terminal un
dominio característico BRO1. Se sabe que después PalA/Rim20 se une a Snf7/Vps32
(maquinaria ESCRT-III) y la proteasa PalB/Rim13 es reclutada, mientras que a través de su
dominio BRO1 PalC/Rim23 permite la interacción entre los complejos endosomales y los
complejos de la membrana plasmática (Ito et al., 2001, Vincent et al., 2002; Tilburn et al.,
1995; Blanchin-Roland et al., 2008). PalB/Rim13 de U. maydis muestra los dominios de
una calpaína típica y de calpaína III, pero carece de un motivo N-terminal semejante al de
PalB/Rim13 de A. nidulans. El papel de este último dominio durante el ensamblaje del
complejo de señalización a través de la interacción con Vps24 (maquinaria de ESCRT-II) se
demostró recientemente, aunque cabe señalar que PalB/Rim13 de S. cerevisiae carece de
este dominio y es capaz de interactuar con proteínas de ESCRT-III (Ito et al., 2001; Xu et
al., 2004).
La mutación de cualquiera de los genes PacC/Rim101, PalA/Rim20, PalB/Rim13 o
PalC/Rim23 en U. maydis da lugar a un fenotipo pleiotrópico, como ocurre en otros
sistemas, pero los procesos afectados no coinciden estrictamente con los de las mutantes
pal/rim de diferentes especies de hongos. Por ejemplo, las mutantes pal/rim de U. maydis
no fueron afectadas en su capacidad para aparearse o para formar esporas sexuales. Por
el contrario, mutantes ∆palF/rim8, ∆palB/rim13, ∆palH/rim21 y ∆palA/rim20 de
9
Y.
lipolytica mostraron una reducción de la eficiencia de apareamiento y la esporulación
(Lambert et al., 1997; Blanchin-Roland et al., 2008). Otros procesos que no se afectan en
las mutantes pal/rim de U. maydis fueron el crecimiento y el comportamiento dimórfico,
sin importar el papel central ejercido por el pH durante la transición dimórfica (RuízHerrera et al., 1995). Esta característica contrasta con mutantes pal/rim de C. albicans
que no son capaces de formar micelio en respuesta al pH alcalino, a pesar de que todavía
son capaces de hacerlo en presencia de suero (Davis et al., 2000).
En cuanto a la virulencia, las mutantes pal/rim de U. maydis muestran diferencias
con otros hongos, ya que son tan virulentas en las plantas de maíz como las cepas
silvestres. Este comportamiento coincide con la observación de las mutantes pal/rim del
patógeno humano C. neoformans (Liu et al., 2008).
El crecimiento de las mutantes pal/rim de U. maydis se inhibe a pH alcalino, lo que
está de acuerdo con el fenotipo observado en otros hongos; por ejemplo, las mutantes
pal/rim de C. albicans (Blanchin-Roland et al., 2008; Cornet et al., 2009) o de Y. lipolytica
(González López et al., 2002) no crecen a pH de 8.5 10, respectivamente; y las mismas
mutantes de S. cerevisiae son muy sensibles a un pH ligeramente alcalino (Futai et al.,
1999; Castrejón et al., 2006), al igual que las de A . nidulans que son sensibles a pH 8 (Arst
et al., 1994; Denison et al., 1998). Las mutantes pal/rim de U. maydis son muy sensibles a
Li+, aún más que la de otras especies de hongos. Así, las mutantes de U. maydis se
inhiben por LiCl 0.005 M, mientras que las mutantes de C. albicans son sensibles a una
concentración mínima de 0.02 M. La inhibición de U. maydis por NaCl requiere
concentraciones mucho más altas, al igual que ocurre en C. albicans, y la sensibilidad a K+
ocurre sólo a pH alcalino, posiblemente debido al efecto aditivo de ambos factores. Se
observó que altas concentraciones de sorbitol no afectaban a U. maydis, lo que reveló
que la hipersensibilidad a iones monovalentes no se debe a un efecto osmótico, sino
probablemente a alteraciones en su manejo por la célula. En S. cerevisiae el sistema de
Ena (Ena1 a Ena5) es esencial para mantener la homeostasis de iones monovalentes y
Ena1 parece ser el factor más importante para la desintoxicación iónica (Haro et al.,
1991). En U. maydis se ha descrito que el bombeo de iones es llevado a cabo por las
10
proteínas codificadas por los genes UmEna1 y UmEna2 (Benito et al., 2009). CervantesChávez y Ruíz-Herrera (2010) midieron la expresión de Ena2 en U. maydis y sus mutantes
y observaron que la expresión de dicho gen era nula en estas últimas lo que es una
evidencia de que el gen está bajo el control de la vía Pal/Rim. Estos datos concuerdan con
la expresión observada del homólogo de ENA1 en S. cerevisiae o F. oxysporum bajo estrés
salino (Caracuel et al., 2003; Hernández-López et al., 2006).
Una alteración fenotípica importante en las mutantes pal/rim de U. maydis es su
sensibilidad a rojo Congo y enzimas líticas (Arechiga-Carvajal y Ruíz-Herrera, 2005;
Cervantes-Chávez y Ruíz-Herrera, 2010), lo cual sugiere una alteración en la construcción
de la pared celular. Del mismo modo, el crecimiento de la mutante ∆palB/rim13 de C.
albicans es afectado por calcofluor 10 µM a pH 8 (Li et al., 2004), y las mutantes
∆palH/rim21 de S. cerevisiae son hipersensibles a enzimas líticas (Castrejón et al., 2006).
Es factible que en U. maydis, así como en la levadura existe una cooperación entre la vía
Pal/Rim y la vía PKC, esta última implicada en el mantenimiento de la integridad de la
pared celular a través de la fosforilación de Slt2, un homólogo de una MAP cinasa (Tong
et al., 2004; Castrejón et al., 2006).
Las mutantes pal/rim de U. maydis no sobreviven al estrés ácido, oxidativo, o de
choque térmico de una magnitud que no afectan a las células silvestres (CervantesChávez y Ruíz-Herrera, 2010), y presentan como una característica importante en su
fenotipo, tornar el medio a viscoso por la secreción de un polisacárido (Arechiga-Carvajal
y Ruiz-Herrera, 2005; Cervantes-Chávez y Ruíz-Herrera, 2010). Es posible que el efecto del
estrés sea aditivo a la existencia de una pared celular débil o una membrana plasmática
alterada. En este sentido, es oportuno indicar que la adaptación de S. cerevisiae a la
acción de los ácidos débiles es regulada a través de la vía Pal/Rim, principalmente a través
de la activación transcripcional de genes implicados en el ensamblaje o remodelación de
la pared celular (Mira et al., 2009).
Una característica general de todas las mutantes de los hongos afectadas en la vía
Pal/Rim es su incapacidad de secretar enzimas extracelulares (Peñalva y Arst, 2002;
2004). U. maydis no es una excepción, y las mutantes pal/rim mostraron ser incapaces de
11
digerir gelatina en placas de agar en comparación con las cepas silvestres, debido a que
carecían de una proteasa para digerirla (Arechiga-Carvajal y Ruiz-Herrera, 2005;
Cervantes-Chávez y Ruíz-Herrera, 2010).
Las mutantes de ganancia de función pacCc de A. nidulans resultantes del corte
proteolítico que elimina un fragmento correspondiente a los aminoácidos 100-412 de la
región C-terminal de PacC, muestran un fenotipo de mimetización de la alcalinidad
(Espeso et al., 2000). De acuerdo con este fenómeno, y considerando que los genes
PalA/Rim20, PalB/Rim13 y PalC/Rim23 de U. maydis están involucrados en la activación
proteolítica del factor de transcripción Rim101, todos los fenotipos mutantes mostrados
por las mutantes pal/rim fueron revertidos por la introducción de un plásmido que
llevaba la versión truncada de PacC/RIM101 carente de la región C-terminal (CervantesChávez y Ruíz-Herrera, 2010). Este resultado también indica que todas las características
fenotípicas de las mutantes de la vía se debían a la falta de función de los genes
correspondientes.
12
II. OBJETIVOS
II.1. Objetivo general
Con las bases descritas en la introducción, se planteó como objetivo general analizar la
interacción de los mecanismos de regulación de algunas rutas metabólicas con la vía
Pal/Rim en Ustilago maydis.
II.2. Objetivos específicos
1. Identificar la naturaleza, del polisacárido secretado por las mutantes afectadas en
la vía Pal/Rim de U. maydis.
2. Determinar si existen diferencias en la estructura y composición química de la
pared celular de la cepa silvestre y las cepas afectadas en la vía Pal/Rim de U.
maydis.
3. Evaluar la sensibilidad a otros tipos de estrés en las mutantes afectadas en la vía
Pal/Rim de U. maydis.
4. Evaluar la secreción de otras proteínas extracelulares en las mutantes afectadas
en la vía Pal/Rim de U. maydis.
5. Determinar los cambios que sufre el pH interno en las cepas silvestre y mutante
pal/pim en respuesta a cambios del pH externo.
13
III. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Como se mencionó en la introducción, las mutantes en la vía Pal/Rim en los sistemas
analizados presentan un fenotipo pleiotrópico. En el caso particular de U. maydis, los
procesos que se afectan no coinciden estrictamente con las mutantes pal/rim de otras
especies de hongos. Las mutantes pal/rim de U. maydis presentan una inhibición en el
crecimiento a pH alcalino, sensibilidad a iones alcalinos (Li+, Na+ y K+), susceptibilidad a
estrés ácido y oxidativo, deficiencias en la construcción de la pared celular, y la secreción
de un polisacárido, que posiblemente sea el resultado de la alteración en la estructura de
la pared celular.
Para poder entender la relación de la vía Pal/Rim en los procesos arriba
mencionados en U. maydis, se consideró inicialmente caracterizar el polisacárido
secretado al medio de cultivo mediante una serie de métodos químicos y físicos:
cromatografía en capa fina, digestión con enzimas, inmunodetección con anticuerpos,
cromatografía de intercambio aniónico, espectroscopía de infrarrojo y resonancia
magnética nuclear. Posteriormente, se consideró evaluar las diferencias existentes en la
pared celular de las cepas silvestre y mutante; mediante el análisis de su composición
química, su estructura por medio de microscopía electrónica y análisis de la expresión de
genes que codifican a las quitinas sintasa y glucana sintasa por medio de RT-PCR.
También, se consideró necesario evaluar la sensibilidad de respuesta a estrés
hiperosmótico, otros compuestos que afectan a la pared celular, estrés oxidativo y estrés
a iones divalentes. Con el objeto de evaluar la capacidad de secreción de proteínas, se
determinó la actividad de lipasas extracelulares. Tomando en cuenta que las mutantes
pal/rim se ven afectadas en su crecimiento a pH alcalino y que posiblemente se deba a la
incapacidad de regular el pH interno, se consideró necesario determinar la estabilidad del
pH intracelular de las cepas silvestre y mutante sometidas a diferentes cambios del pH del
medio de cultivo, y analizando la expresión de algunas ATPasas de la membrana
citoplasmática por medio de RT-PCR.
14
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
IV.1. Organismos utilizados
En la Tabla 1 se presenta una relación de todos los organismos empleados en este
trabajo.
IV.2. Medios y condiciones de cultivo
IV.2.1. Medios para el cultivo
Medio completo (MC) (Holliday, 1974). Glucosa, 1%; hidrolizado de caseína, 0.25%;
extracto de levadura, 0.1%; NH4NO3, 0.15% y 62.5 ml/l de solución de sales (KH2PO4, 16g;
Na2SO4, 4g; KCl, 8g; MgSO4, 2g; CaCl2, 1g; H3BO3, 0.06g; MnCl2.4H2O, 0.4g).
Medio mínimo (MM) (Holliday, 1974). Glucosa, 1%; NH4NO3 0.3% para pH3, o KNO3 0.3%
para pH7 y 62.5 ml/l de solución de sales. Cuando fue necesario se sustituyo la glucosa
por aceite de oliva al 1%. Para preparar medios sólidos se añadió 2% de agar
bacteriológico.
IV.2.2. Determinación del efecto de varios tipos de estrés
Se prepararon cajas de Petri con MM de pH 9 adicionado de sorbitol 1, 2 ó 3 M, calcofluor
al 2%, H2O2 7, 14, 21 ó 28 mM, MgSO4 o CaCl2 0.2, 0.3 ó 0.5 mM, o cafeína 5 mM. Se
prepararon diluciones decrecientes en forma logarítmica de una suspensión celular
conteniendo 108 células por ml y se depositaron volúmenes de 10 µl en los diferentes
medios, se incubaron a 28 oC por dos o tres días y se fotografiaron.
IV.3. Purificación del polisacárido
Se partió de un cultivo celular de 40 h a 28 oC en MM líquido al pH requerido.
Posteriormente se eliminaron las células por centrifugación a 3000 rpm. Se extrajo el
polisacárido con dos procedimientos diferentes:
15
1) Precipitado con etanol absoluto frío de acuerdo a Aréchiga-Carvajal y Ruíz-Herrera
(2005).
2) Concentrado del medio en un Rotavapor de un volumen inicial de 800 ml a 100 ml
finales. Se conservaron 50 ml en líquido a 4 oC y los otros 50 ml se liofilizaron.
IV.4. Determinación de proteína
Se usó el método de Bradford (1976). Se preparó una solución patrón de albúmina bovina
de 1 mg/ml en agua destilada estéril, para preparar la curva estándar. Se utilizaron
volúmenes de 35 µl y como blanco, agua destilada estéril. Se agregó 1 ml de reactivo,
(100 mg de azul brillante de Coomasie G-250 en 50 ml de etanol al 95% y 100 ml de ácido
fosfórico al 85% en un volumen final de 1 L), y al cabo de 10 min se midió la Absorbencia
(A) a 600 nm. En el caso de proteínas celulares, a una alícuota de células se agregaron 5
ml de NaOH 1M y se incubó 2 h a temperatura ambiente, se tomó una alícuota y se
procedió como se indicó para proteínas solubles.
IV.5. Determinación de azúcares neutros
Se usó el método de la antrona (Dimler et al., 1952). Se preparó una solución estándar de
glucosa de 1 mg/ml en agua destilada estéril. Se utilizaron volúmenes de 10-100 µl de
muestra y agua destilada estéril como blanco. Se llevó la muestra a 1 ml con agua
destilada estéril. Se adicionaron 2 ml de reactivo de antrona (solución de antrona al 0.2%
en ácido sulfúrico concentrado), posteriormente se incubaron las muestras en ebullición
durante 10 min y se midió la A a 630 nm.
IV.6. Digestión del polisacárido con β-1,3-glucanasa
Se utilizó polisacárido liofilizado obtenido por el método 2. Se adicionó 1 ml de una
suspensión que contenía 0.4 mg de Liticasa (Sigma) en regulador de fosfatos 50 mM de
pH 7 por cada mg de polisacárido. Se incubó a 25 oC y se determinaron azúcares neutros
con antrona a las 5, 8 y 10 h.
16
IV.7. Hidrólisis ácida del polisacárido o las paredes celulares
Muestras del polisacárido obtenidas mediante el método 2 o de las paredes se
hidrolizaron con HCl 2N o HCl 6N en ampolletas selladas al vacío a 100 oC por 4 u 8 h. Se
evaporó el ácido en un desecador al vacío sobre NaOH anhidro y se resuspendieron las
muestras en NaOH 0.005 N.
IV.8. Cromatografía en capa fina (TLC)
Se utilizaron muestras de polisacárido hidrolizado, de las cuales
se aplicó 1 µL de
muestras de 10 mg/ml en placas de TLC de 8x11 cm. Se desarrolló la placa con una mezcla
de propanol-butanol-agua (12:3:4 v/v/v) por aproximadamente 4 h. Las placas se
revelaron de acuerdo a Anderson (2000) con una solución de difenilamina-anilina-ácido
fosfórico a 100 oC por 10 min. Este reactivo tiñe a las aldosas de color azul y a las cetosas
de color rosa. Como estándares se utilizaron glucosa, oligosacáridos de glucosa de DP=3,
DP=4 y DP=5, arabinosa, manosa y galactosa (1 µL de soluciones conteniendo 10mg/ml en
agua destilada estéril).
IV.9. Inmunodetección del polisacárido
Se utilizó una solución del polisacárido obtenido con el método 2 y como control un
hidrolizado de paredes celulares de C. albicans con Zymoliase (Sigma). Diluciones de 1, 2,
4, 8, 16, 32, 64 y 128, además de la muestra sin diluir de ambas muestras se aplicaron con
vacío sobre una membrana de nitrocelulosa. Las muestras se revelaron como describe
Burnette (1981), con un anticuerpo policlonal específico anti-β-1,6-glucana (dilución
1/1.000) y un segundo anticuerpo de chivo anti-conejo con peroxidasa unida
covalentemente (dilución 1/10.000).
IV.10. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear con Transformada de
Fourier (FT-NMR)
Se realizó NMR de protón (1H) en estado líquido del polisacárido en solución obtenido con
el método 2 y disuelto en D2O. El NMR de carbono (13C) en estado sólido se realizó con
17
polisacárido obtenido con el método 1. Para ambos análisis se utilizó un espectrómetro
Varian de 300 MHz de 32 barridos, a una temperatura de 30 oC con un tiempo de
adquisición de 3.5 seg y un pulso de 90o.
IV.11. Espectroscopía de Infrarrojo Medio con Transformada de Fourier (FT-IR)
Se realizó el análisis espectrofotométrico de infrarrojo medio con transformada de Fourier
(FT-IR) del polisacárido obtenido por el método 1. El espectro fue determinado de 4000 a
400 cm-1 usando un espectrómetro de infrarrojo medio con transformada de Fourier
Beckman.
IV.12. Cromatografía de Intercambio Aniónico (HPAEC)
El producto obtenido de la digestión del polisacárido con β-1,3-glucanasa se analizó por
cromatografía de intercambio anionico (HPAEC). Se prepararon soluciones de 0.05 mg/ml
filtradas con filtros de 0.22 µM. Las muestras se corrieron en un Dionex con una columna
CarboPac PA-100 con una temperatura de 25 oC. El sistema de solventes fue: Eluente A;
NaOH 0.15M, y Eluente B; Acetato de sodio 0.5M + NaOH 0.15M en un gradiente lineal,
con una inyección de 0.8 ml/min.
IV.13. Purificación de las paredes celulares
Se siguió el protocolo descrito por Ruíz-Herrera et al., (1996). Se cosecharon las células de
U. maydis de las cepa silvestre y mutante palB/rim13 cultivadas en medio mínimo de pH
8.5 por 20 h a 28 oC, y se lavaron con Tris-HCl 10 mM pH 7.5 adicionado con una tableta
de cocktail de inhibidores de proteasas (Roche). Se adicionaron 3 volúmenes de perlas de
vidrio de 0.45 mm de diámetro. La mezcla se agitó en un agitador de vórtice a velocidad
máxima con intervalos de 30 seg, y 30 seg de descanso en hielo por alrededor de 40-45
pulsos. Se comprobó el rompimiento celular por observación en microscopio con
contraste de fases. Posteriormente se separaron las perlas de vidrio por decantación, y las
paredes se recogieron por centrifugación a 3000 rpm por 15 min, y se lavaron con NaCl
1M 6 veces y con agua destilada estéril fría otras 6 veces, para finalmente liofilizarse.
18
IV.14. Determinación secuencial de los componentes de la pared celular
Se realizó una hidrólisis parcial de 10 mg de paredes celulares en 2 ml de KOH 2N en
ebullición por 2 h. Se centrifugó el hidrolizado a 3000 rpm y el sobrenadante se dividió en
2 alícuotas: a una de ellas se le determinaron azúcares neutros con antrona. Esta
determinación corresponde a la suma de mananas y β-1,3-glucana álcali soluble. A la otra
fracción se añadieron 2 volúmenes de reactivo de Fehling (mezcla de 1 volumen de
CuSO4.5H2O al 7% con 3 volúmenes de tartrato de sodio y potasio al 3.4% en NaOH al
10%) y se incubo a 4 oC toda la noche. Se lavó el sedimento con reactivo de Fehling y agua
destilada estéril, se disolvió en ácido acético 1N y se determinaron azúcares neutros. Esta
fracción corresponde a las mananas. El contenido de glucanas solubles se obtuvo por
substracción de este valor del valor correspondiente a los azúcares solubles en álcali de la
primera alícuota.
El sedimento de la hidrólisis alcalina se lavó con agua destilada estéril y se
resuspendió en fosfato de potasio 10 mM pH 7.0 con 2 mg/ml de Zymolyase (Sigma) y se
incubó a 30 oC por 5 h. A una alícuota del sobrenadante obtenido se determinaron
azúcares neutros. Esta fracción corresponde a la β-1,3-glucana álcali insoluble.
Posteriormente una alícuota del sobrenadante se dializó y a una alícuota del producto
dializado se determinaron azúcares neutros. Esta fracción corresponde a la β-1,6-glucana
(Fig. 4).
IV.15. Determinación de quitina
Se utilizó el hidrolizado de paredes celulares en HCl 6N. Se determinó la glucosamina
producto de la hidrólisis de acuerdo a Dische (1962). Se usó como estándar glucosamina 1
mg/ml en agua destilada estéril. Las muestras se llevaron a 1 ml con agua destilada estéril
y se adicionó 1 ml de reactivo A (1 ml de acetil acetona en 25 ml Na2CO3 1.5N) y se incubó
20 min en ebullición y se dejó enfriar para posteriormente adicionar 1 ml de reactivo B
(0.8 g de p-dimetilaminobenzaldehído en 30 ml de HCl concentrado con 30 ml de etanol),
se incubó 10 min a 70 oC, y se midió la A a 530 nm.
19
IV.16. Microscopía electrónica
Células cultivadas por 20 h a 28 oC en MM de pH 8.5, se fijaron con glutaraldehído al 1%
en regulador de cacodilato de pH 7. Se lavaron con regulador de cacodilato y se postfijaron con tetróxido de osmio. Se deshidrataron las muestras en una serie gradual de
acetona. La técnica de contraste se realizó con acetato de plomo y acetato de uranilo. Se
incluyeron en resina epóxica y se cortaron con un ultramicrotomo. Las secciones se
observaron en un microscopio Phillips Morgagni 268 y se tomaron fotografías de cortes
medios.
IV.17. Purificación de RNA
El RNA se aisló por el método de TRIZOL (Invitrogen), siguiendo las condiciones descritas
por el fabricante. Con el objeto de eliminar DNA contaminante que pudiese afectar en los
experimentos posteriores, las muestras se trataron con DNasa I de Invitrogen. La
concentración de RNA total se midió por su absorbancia a 260 nm en un
espectrofotómetro Nanodrop ND-1000.
IV.18. Transcripción reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
Para la síntesis de DNA complementario (cDNA) por RT (transcripción reversa) se utilizaron
2 µg de RNA total y la transcriptasa reversa Super Script II (Invitrogen). Se siguió el
siguiente programa: incubación a 65 oC durante 5 min con oligo-dT, transferencia
inmediata a un baño de hielo, adición del inhibidor de ribonucleasa, incubación a 42 oC
durante 2 min, y se procedió a la amplificación con Taq polimerasa recombinante
(Invitrogen), y como molde se utilizó 1 µl del producto de RT según lo antes mencionado.
El protocolo usado fue el siguiente: un ciclo de desnaturalización inicial a 94 oC por 2 min,
seguido de los ciclos correspondientes para cada par de oligonucleótidos enlistados en la
Tabla 2, con desnaturalización a 94 oC por 15 seg, extensión a 70 oC por 1 min; y extensión
final a 70 oC por 5 min. Los productos de la amplificación se separaron en geles de agarosa
al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio, y se fotografiaron bajo iluminación con luz
ultravioleta.
20
La determinación de los niveles de transcritos se realizó con el programa ImageJ. El
software hace una lectura de los pixeles de la banda obtenida y la convierte en una curva,
a partir de la cual determina su área, obteniéndose de esta curva unidades arbitrarias del
área en pixeles. Para corregir la variabilidad en la expresión de los genes analizados en los
experimentos, se utilizó como control de carga el valor de un fragmento del gen FE α1
(factor alfa de alargamiento de la síntesis de proteínas de jitomate). Para ello se
expresaron los datos como la relación entre el valor de cada gen obtenido en el programa
antes señalado, dividido entre el valor correspondiente al gen FE α1 (área de gen a
analizar/área FE α1 = unidades de expresión del gen a analizar).
IV.19. Determinación de actividad de lipasa
Se cuantificó la actividad de lipasa por el método descrito por Kronstad (2004). A 300 µl de
sobrenadante de cultivos de MM con aceite de oliva como fuente de carbono se
añadieron 3.6 ml de Tris-HCl 20 mM de pH 8 conteniendo Tween 20 al 2% como substrato
y 100 µl de CaCl 120 mM. Se incubó a 37 oC por 30 min y se midió la turbidez como
densidad óptica (D O) a 600 nm.
IV.20. Determinación de pH intracelular
IV.20.1. Calibración in vivo
Se colocaron alícuotas de 200 µl de regulador de fosfatos del pH deseado en placas de
Elisa de 96 pozos, se inocularon con 106 células de U. maydis y se adicionaron 2 µl de
fluoróforo conjugado (BCECF-AM; Sigma) 100 µM. Se incubó la placa por 75 min a 28 oC en
agitación. A continuación se adicionaron 10 µl de nigericina 96.8 µM y se incubó 30 min a
28 oC en agitación. Este protocolo se realizó con el objetivo de equilibrar el pH extracelular
con el intracelular, ya que la nigericina es un intercambiador K+/H+.
Tomando en cuenta que el fluoróforo BCECF-AM posee dos espectros de excitación y uno
de emisión, y que la relación que existe entre los dos espectros de excitación está en
función del pH; se emplearon dos longitudes de onda de excitación de 450 nm y 505 nm, y
21
una longitud de onda de emisión de 535 nm. La relación entre las dos longitudes de onda
de excitación se representa en la curva estándar de la figura 5.
IV.20.2. Medición del pH intracelular
Se colocaron alícuotas de 200 µl de regulador de fosfatos del pH deseado en placas de
Elisa de 96 pozos y se inocularon con 106 células de U. maydis y se adicionaron 2 µl de
fluoróforo conjugado (BCECF-AM) 100 µM. Se incubó 75 min a 28 oC en agitación. Se leyó
la fluorescencia como se indica arriba.
Para calcular el pH en las condiciones arriba mencionadas, las mediciones a las 2
longitudes de onda de excitación, se divide el valor correspondiente a la lectura de 450
nm entre el valor correspondiente a la lectura de 505 nm. El resultado obtenido del
cálculo se interpola en la curva de calibración in vivo y el dato obtenido corresponde a las
unidades de pHi.
IV.21. Determinación de la reproducibilidad de los métodos usados
Todas las determinaciones cuantitativas se realizaron por triplicado, determinando el
error experimental con el programa estadístico Minitab15. En aquellos experimentos en
que se manejaron grupos de datos se determinó la significancia por medio del método
estadístico Anova (http://www.quimica.urv.es/quimio/general/anovacast.pdf).
22
V. RESULTADOS
Para poder abordar cada uno de los objetivos planteados en este estudio y hacer más
práctico el trabajo, se consideró conveniente utilizar solo una mutante pal/rim que
presentará todas las características fenotípicas anteriormente mencionadas. Por ello, se
empleo la mutante ∆palB (AC401) y la cepa silvestre (FB2) de U. maydis (CervantesChávez y Ruiz-Herrera, 2010).
V.1. Identificación del polisacárido secretado por la mutante ∆palB
V.1.1. Evaluación de la secreción del probable polisacárido secretado por las cepas
pal/rim en función del pH
Como se indicó previamente, una de las características fenotípicas más notables de las
mutantes pal/rim, es la secreción al medio de cultivo de un material, que tentativamente
se consideró que era un polisacárido. Para evaluar si la secreción de dicho compuesto
dependía del pH del medio de cultivo, se determinó la cantidad de polisacárido secretado
por la cepa AC401 después de 40 h de incubación en MM de diferentes valores de pH,
medido como peso seco y por su contenido de azúcares neutros. El aislamiento del
polisacárido se llevo a cabo mediante el método 1 (ver Materiales y Métodos). Se observó
un buen crecimiento celular a pH 7, 8, 9 y 10, en tanto que a pH 11 éste decayó
considerablemente (ver Tabla 3). El peso seco del material precipitado con etanol
obtenido en cada uno de los cultivos fue prácticamente constante (Fig. 6) y debido a eso
solo se seleccionó una muestra para determinar el contenido de azúcares neutros
presentes en él, el cual fue de casi el 92% del peso seco total, lo que es una evidencia de
que efectivamente, el material precipitado con etanol es un polisacárido.
V.1.2. Identificación de los azúcares presentes en el polisacárido
Como un primer acercamiento para la identificación del polisacárido, se realizó un análisis
por cromatografía en capa fina (TLC) de hidrolizados del mismo con HCl (ver Materiales y
Métodos). Como se puede observar en la Fig. 7a, al revelar la placa de TLC se observaron
23
manchas de color azul que coinciden con el marcador de glucosa en los dos tiempos de
hidrólisis usados, y como era de esperarse a las 8 h de hidrólisis la mancha fue más
intensa que la de las 4 h de hidrólisis. También se presentan dos manchas con un Rf
menor que el de la glucosa, que coinciden con los correspondientes a un trisacárido y un
tetrasacárido indicando que posiblemente corresponden a una hidrólisis incompleta.
Posteriormente se procedió a realizar otra TLC con otros azúcares como marcadores para
determinar si la muestra del polisacárido contenía otros azúcares. Los marcadores
empleados fueron glucosa, manosa, arabinosa y galactosa, debido a que son azúcares que
están presentes en la pared celular de U. maydis (Ruiz-Herrera et al., 1996). Como se
puede observar en la Fig. 7b; la placa de TLC presentó el mismo patrón de manchas que el
de la Figura 7a para los dos tiempos de hidrólisis, mostrando que el hidrolizado del
polisacárido solo contiene glucosa.
V.1.3. Inmunodetección del polisacárido
Con el objeto de determinar el tipo de unión de la glucosa en el polisacárido secretado
por la mutante pal/rim de U. maydis, se realizó un ensayo con un anticuerpo que
reconoce β-1,6-glucanas (ver Materials y Métodos). No se observó ninguna señal de la
presencia de β-1,6-glucana con el anticuerpo en cada una de las diluciones del
polisacárido fijadas en la membrana de nitrocelulosa. Por el contrario en un hidrolizado
de paredes celulares de C. albicans obtenido con Zymoliase que se empleó como control
positivo, se observó una señal intensa en todas las diluciones empleadas (Fig. 8), lo que
indica que el polisacárido no es una β-1,6-glucana.
V.1.4. Análisis del polisacárido por medio de hidrólisis enzimática
Se realizó una digestión del polisacárido purificado por el método 2 con β-1,3-glucanasa
(“liticasa”; ver Materiales y Métodos). A las primeras 5 h se obtuvo una digestión del 70%,
a las 8 h se obtuvo 89.4% digestión y a las 10 h ésta fue del 96%.
Posteriormente el producto de 10 h de digestión se sometió a cromatografía de
intercambio aniónico (HPAEC), para evaluar los productos obtenidos. En el cromatograma
24
se pudo observar un pico muy definido y abundante con un tiempo de retención de 5.53
min correspondiente a glucosa (Fig. 9), dato que correlaciona con el resultado obtenido
en los análisis por TLC.
Con estos resultados podemos decir que, el polisacárido está constituido
aparentemente casi en su totalidad de β-1,3-glucana y el monómero que lo constituye
posiblemente es glucosa.
V.1.5. Identificación del polisacárido por espectroscopía de infrarrojo (IR) y resonancia
magnética nuclear (NMR).
Con el objeto de obtener una identificación más definida del polisacárido, se realizó un
análisis de su absorción en el infrarrojo (IR; ver Materiales y Métodos). En el espectro de
infrarrojo se observó la presencia de una banda a los 886 cm-1 característica de un enlace
glucosídico tipo β (Fig. 10). Por otro lado no se observó ninguna banda característica para
un enlace glucosídico tipo α a los 850 cm-1 en el espectro de IR. De acuerdo con estos
resultados podríamos afirmar que el polisacárido está formado por glucosa unida por
enlaces glucosídicos tipo β y no por enlaces tipo α.
Además se realizaron dos estudios de NMR, uno de protón (1H) en estado líquido y
otro de carbono (13C) en estado sólido del polisacárido (ver Materiales y Métodos). Se ha
descrito que las señales anoméricas para β-1,3-glucana en un espectro de NMR de 1H en
estado líquido se encuentran entre 4.7-4.8 ppm y 3.0-3.2 las de β-1,6-glucana aparecen
entre 4.4-4.6 ppm (Sugawara et al., 2004). En el espectro del NMR de 1H se observó un
doble pico situado en 4.7 ppm y un triple pico situado en 3.2 ppm (Fig. 11), lo que indica
la presencia de residuos de glucosilpiranosas ligadas por uniones en β-1,3, lo que apoya
que el polisacárido secretado es una β-1,3-glucana, sin que tenga ramificaciones en β-1,6.
Se ha descrito que al analizarse por NMR de
13
C en estado sólido, el carbono
anomérico (C-1) de un glucósido aparece entre 100-110 ppm, y que los C-2, C-3, C-4, C-5 y
C-6 de un anillo glucosídico lo hacen entre 60-80 ppm (Gangoza et al., 2005). En el
espectro del NMR de 13C, se observó que los desplazamientos químicos de los átomos de
carbono (C) se encontraban en 103.76 ppm el C-1, 74.45 ppm el C-2 y C-5, 86.17 ppm el C-
25
3, 68.59 ppm para el C-4 y 68.33 el C-6 (ver Figura 12b). Estos valores son muy similares a
los caracterizados para β-1,3-D-glucanas y el espectro es típico de muestras secas de β1,3-D-glucanas (Fig. 12a). Tomando en cuenta estos resultados se puede concluir que el
polisacárido secretado por las mutantes pal/rim de U. maydis es una β-1,3-D-glucana.
V.2. Análisis de la estructura y la composición química comparativas de la pared
celular de la cepa silvestre y la mutante ∆palB de U. maydis
V.2.1. Estructura de la pared celular
La estructura de la pared celular de la cepa silvestre y la mutante ∆palB de U. maydis fue
observada por microscopía electrónica de muestras tratadas con el protocolo normal de
osmio (ver Materiales y Métodos y Figs. 13A y 13B). El corte de ambas paredes aparecía
igual, prácticamente sin teñirse, lo que sería de esperarse por la técnica de tinción usada,
sin ninguna característica distintiva. Para hacer una comparación representativa del
grosor de la pared celular de la cepa silvestre y la mutante, se realizaron mediciones en 4
puntos de la pared celular, con la ayuda de una lupa, de 10 fotografías de células de cada
cepa fotografiadas con el mismo aumento (22,000X). El promedio del grosor de la pared
celular de la cepa silvestre fue de 0.24 +0.03 µm (Fig. 13C). En cambio, en la cepa mutante
el promedio fue de 0.16 +0.015 µm. Estos valores son significativamente diferentes
según se determinó por el método de Anova (Fig. 13D). Estos resultados revelan que el
grosor de la pared celular de la mutante pal/rim es considerablemente menor que el de la
cepa silvestre.
V.2.2. Análisis de la composición química de la pared celular
Al realizar el análisis de la composición química de las paredes celulares de la cepa
silvestre y mutante ∆palB de U. maydis, se observó que la composición química de las
paredes celulares de ambas cepas presentaban notables diferencias en su contenido de
azúcares neutros totales, quitina y proteína (Tabla 4). Las paredes celulares de la cepa
silvestre, mostraron alrededor del 63% de azúcares neutros totales, 13% de quitina y 16%
26
de proteína presente. Para el caso de la cepa mutante, los valores fueron de alrededor del
52% de azúcares neutros totales, 5% de quitina y 10% de proteína.
En base a las diferencias obtenidas en azúcares neutros totales entre la cepa
silvestre y la mutante, se realizó un análisis cuantitativo de los polisacáridos neutros
presentes en las paredes celulares. Para ello, se siguió el protocolo descrito en Materiales
y Métodos para determinar los polisacáridos álcali solubles (mananas y β-1,3-D-glucana) y
azúcares álcali insolubles (β-1,3-D-glucana y β-1,6-D-glucana). Se observó que la cepa
mutante presentaba notables diferencias en comparación con la cepa silvestre en los
azúcares álcali solubles, principalmente en β-1,3-D-glucana; para los azúcares álcali
insolubles. Los datos se resumen en la Tabla 6.
V.2.3. Análisis de la expresión de los genes que codifican quitina sintasa (CHS) y glucana
sintasa (GLS)
Se determinaron los niveles de transcrito de los genes que codifican quitina sintasas (CHS)
y del único gen que codifica glucana sintasa (GLS) de la cepa silvestre y la mutante ∆palB
de U. maydis, debido a las diferencias cuantitativas encontradas en la composición
química de los aislados de paredes celulares. Para ello se empleó el método de
transcripción reversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Las
células se cultivaron en MM líquido de pH 8.5 por 20 h, se cosecharon, lavaron y de las
células se aisló el RNA, y se procedió a medir los niveles de transcrito por medio de RTPCR (ver Materiales y Métodos). Los datos se expresaron en forma relativa a los niveles
de transcrito del gen del factor de alargamiento de la síntesis de proteínas α. Los
resultados de la figura 14 muestran que la expresión de los genes de CHS1, CHS2, CHS6 y
CHS8 presentó valores menores en la mutante con respecto a la cepa silvestre. Los genes
de CHS3, CHS4, CHS5, CHS7 y GLS presentaron prácticamente los mismos niveles de
transcrito en las cepas silvestre y mutante.
27
V.2.3. Determinación de la proteína presente en el medio de cultivo
Se determinó la proteína presente en el medio de cultivo de las cepas silvestre y mutante
crecidas por 24 h a pH 8.5 (ver Materiales y Métodos). Los resultados obtenidos se
resumen en la Tabla 6, donde podemos observar una mayor cantidad de proteína
presente en el medio de cultivo de la cepa mutante respecto a la cepa silvestre. Este dato
contrasta el hecho de que las mutaciones en la vía Pal/Rim afectan negativamente la
secreción de unas proteasas (Arechiga-Carvajal y Ruíz-Herrera, 2005; Cervantes-Chávez y
Ruíz-Herrera, 2010), y una lipasa (ver más adelante). Sin embargo creemos que la
presencia de una mayor cantidad de proteínas en el medio se deba probablemente a una
inadecuada estructuración de la pared celular que permita una salida facilitada de
proteínas, normalmente asociadas a la pared celular, hacia el medio de cultivo. Debe
recordarse que el mecanismo por el cual se regula la secreción de enzimas es específico y
opera a nivel de la transcripción (Peñalva y Arst, 2002).
V.3. Sensibilidad de la mutante pal/rim a diferentes tipos de estrés
V.3.1. Sensibilidad a estrés osmótico y salino
La sensibilidad al estrés osmótico, se midió como la capacidad de la cepa para crecer en
presencia de altas concentraciones de sorbitol (ver Materiales y Métodos). La sensibilidad
al estrés salino por cationes divalentes se midió por su capacidad de crecer en presencia
de diferentes concentraciones de iones calcio o magnesio. En ninguno de los dos ensayos
se observaron diferencias entre el crecimiento mostrado por las cepas mutante y silvestre
en el medio que contenía sorbitol 1, 2 ó 3 M, o CaCl2 o MgSO4 0.2, 0.3 ó 0.5 M, a pH 9.
Estos datos se muestran en las figuras 15, 16 y 17 respectivamente.
V.3.2. Estabilidad de la pared celular
Para evaluar la posibilidad de que la mutante ΔpalB tuviera defectos en la construcción de
la pared celular se procedió a comparar su capacidad de crecer en presencia de
calcofluor, una substancia que se une a la quitina de la pared y disminuye el crecimiento
28
celular. Se observó una fuerte inhibición en el crecimiento de la mutante respecto a la
cepa silvestre, como se puede ver en la Figura 18.
V.3.3. Sensibilidad al estrés oxidativo
Se evaluó el efecto del estrés oxidativo causado por el peróxido de hidrogeno (H2O2) de la
mutante ΔpalB con respecto a la cepa silvestre (ver Materiales y Métodos). Se observó
una inhibición en el crecimiento de la mutante con respecto a la cepa silvestre (Fig. 19).
V.3.4. Análisis de una posible relación de la vía Pal/Rim con las vía PKA y MAPK
involucrada en el crecimiento levaduriforme de U. maydis respectivamente
Para evaluar si existe una relación entre la vía Pal/Rim con la vías PKA involucrada en el
crecimiento levaduriforme de U. maydis, se midió el efecto de la cafeína, un agente que
incrementa los niveles de AMPc, en el crecimiento de la cepa silvestre y la mutante ΔpalB.
Como controles se usaron una mutante pka- y una mutante mapk-. Encontramos que la
mutante ΔpalB y la mutante mapk- crecieron igual que la cepa silvestre. Solo el
crecimiento de la mutante pka- fue inhibido en el medio que contenía cafeína 5 mM (Fig.
20). Estos resultados indican que probablemente no existe una comunicación entre las
vías Pal/Rim y PKA de U. maydis.
V.4. Determinación de la secreción de enzimas al medio
V.4.1. Secreción de lipasa
Se sabe que las mutantes en la vía Pal/Rim están afectadas negativamente en la secreción
de enzimas que operan en un medio alcalino (Peñalva y Arst, 2002; 2004). En el caso de U.
maydis, se sabe que las mutantes en esta vía son incapaces de secretar una proteasa al
medio de cultivo (Arechiga-Carvajal y Ruíz-Herrera, 2005; Cervantes-Chávez y RuízHerrera, 2010). Con el objeto de determinar si el efecto observado sobre dicha proteasa
era específico, o general para otras enzimas, se procedió a determinar la capacidad de la
mutante para crecer en un medio de cultivo líquido conteniendo aceite de oliva como
única fuente de carbono a pH 9. Simultáneamente se determinó el crecimiento y la
29
actividad de lipasa a las 24, 48 y 72 h como se indicó en la sección de Materiales y
Métodos. A las 24 h de incubación la cepa silvestre presentó crecimiento levaduriforme y
actividad de lipasa; a las 48 h de incubación presentó crecimiento micelial, pero
disminuyó la actividad de lipasa. A las 72 h de incubación presentó un considerable
aumento en el crecimiento micelial y prácticamente la misma actividad de lipasa. Estos
datos coinciden con los descritos por Kronstad (2000) quienes observaron que los lípidos
inducen el crecimiento micelial de U. maydis. Por el contrario, la cepa mutante presenta
muy escaso crecimiento levaduriforme y muy poca actividad de lipasa a las 24, 48 y 72 h.
Estos resultados se pueden observar en la figuras 21, 22 y 23, que muestran la morfología
celular, las curvas de crecimiento y las curvas de actividad de lipasa respectivamente.
Estos resultados son evidencia de que la incapacidad de secreción de enzimas activas a pH
alcalino de las mutantes pal/rim es general, sabiéndose como ya se mencionó antes, que
opera a nivel de transcripción (Peñalva y Arst, 2002).
V.5. Homeostasis del pH intracelular
V.5.1. Determinación de pH intracelular
En experimentos previos se observó que la mutante ∆palB (AC401), tiene la capacidad de
acidificar el medio de cultivo, prácticamente de igual forma que la cepa silvestre. Esta
acidificación es un proceso metabólico catalizada por una ATPasa protónica (Ruíz-Herrera
et al., 1995). Esos datos revelan que la mutante puede crecer en medios ligeramente
alcalinos por ese mecanismo, el cual obviamente está fuera del control de la vía Pal/Rim.
Al emplear un regulador de pH en el medio de cultivo, la capacidad de la mutante para
crecer a pH alcalino disminuyó notablemente. Por ello se pensó que, como ya se indicó
antes, un posible mecanismo que explique la incapacidad de las mutantes pal/rim para
crecer a pH alcalino, sería una alteración en su sistema de control de pH intracelular. Por
ello se procedió a analizar si esta hipótesis era correcta, determinando la capacidad de
respuesta en la homeostasis del pH intracelular de las cepas silvestre y mutante
sometidas a diferentes cambios del pH del medio de cultivo.
30
El ensayo consistió primero en realizar una curva de calibración in vivo con 106
células silvestres de U. maydis incubadas en un regulador de fosfatos con un rango de pH
de 4-9 con el fluoróforo BCECF-AM 1 µM. Para lograr la penetración del fluoróforo a las
células para equilibrar el pH extracelular con el intracelular se empleo nigericina 4.4 µM.
A continuación se procedió a medir la relación de fluorescencia en función del pH como
se describe en Materiales y Métodos,
Posteriormente se procedió a determinar el pH intracelular (pHi) de las cepas
silvestre y mutante cultivadas por 24 h en MM de pH 6 u 8.5. Como se puede observar en
la Tabla 8 la cepa silvestre mostró un pHi de alrededor de 7.83, y la cepa mutante un pH
de alrededor de 7.92 en ambos medios de cultivo (pH 6 u 8.5). A continuación se procedió
a inducir un cambio en el pH del medio de cultivo. Células cultivadas durante 24 h en MM
de pH 6 se transfirieron a MM de pH 9, 9.5 o 10 por 5, 3 y 3 h respectivamente y se
determinó el pHi. Se encontró que la cepa silvestre tiende a mantener el pHi observado en
el ensayo anterior, mostrando valores de pH de 7.89, 7.91 y 7.92 respectivamente para
los tres ensayos. Por el contrario, se observó que la mutante no fue capaz de mantener el
pH de 7.92 del ensayo anterior, ya que presentó valores de pHi de 8.29, 8.47 u 8.67
respectivamente para cada ensayo (Tabla 7). Estos resultados confirman la hipótesis
arriba señalada.
V.5.2. Análisis de la expresión de los genes que codifican dos genes de ATPasa de H+ de
la membrana citoplasmática
Tomando en consideración los aspectos planteados anteriormente, se consideró
importante evaluar la expresión de los genes que codifican ATPasas de H+ de tipo P de la
membrana plasmática, PMA1 e intercambiador Na+/H+. Para ello las cepas se cultivaron
en MM líquido de pH 8.5 por 20 h, se cosecharon las células, se aisló el RNA, y se procedió
a medir los niveles de transcrito por medio de RT-PCR. Los datos se expresaron en forma
relativa a los niveles de transcrito del gen del factor de alargamiento α. Los resultados de
la figura 24 muestran que el transcrito del gen que codifica la ATPasa PMA1, en la cepa
silvestre presentó mayores valores a pH ligeramente ácido, mientras que en la cepa
31
mutante presenta mayores valores de transcrito a pH alcalino y menores a pH
ligeramente ácido con relación a la cepa silvestre. Al parecer, el gen que codifica esta
ATPasa está bajo una regulación negativa por la vía Pal/Rim, la cual no se presenta en la
mutante.
Los datos mostrados en la figura 25 muestran los mismos niveles de transcrito en
las cepas silvestre y mutante de la ATPasa Na+/H+ a pH alcalino y a pH ligeramente ácido.
Se observa que en ambas cepas los niveles de transcrito aumentaron a pH alcalino, lo que
sugiere que esta enzima no está bajo el control de la vía Pal/Rim.
32
VI. DISCUSIÓN
La respuesta a variaciones en el pH del medio por parte de los hongos es un importante
mecanismo para su supervivencia en condiciones naturales. Hasta hoy se han descrito al
menos tres mecanismos que poseen esta función, siendo aparentemente el más
importante la vía que denominamos Pal/Rim (revisado por Peñalva y Arst, 2004; 2008). En
nuestro grupo de investigación se logró identificar la presencia de un homólogo de
PacC/Rim101 en U. maydis (Arechiga-Carvajal y Ruiz-Herrera, 2005), mostrando que,
contra lo que se pensaba, la vía no es específica de los Ascomycota. Posteriormente se
identificaron en este hongo los homólogos de otros miembros de la vía Pal/Rim
confirmando la conservación de esta vía de señalización U. maydis (Cervantes-Chávez et
al., 2010). Cabe mencionar que a diferencia de los Ascomycota, en U. maydis solo se
identificaron los homólogos de los genes PalA/Rim20, PalB/Rim13 y PalC/Rim23, que
constituyen el complejo de la membrana endosomal y PalI/Rim9 del complejo membrana
plasmática; y análisis in silico demostraron que esta característica era general para los
Basidiomycota (Cervantes-Chávez et al., 2010).
La mutación de los genes PacC/Rim101 o PalA/Rim20, PalB/Rim13 o PalC/Rim23
en U. maydis da lugar a un fenotipo pleiotrópico, como ocurre en otros sistemas, pero los
procesos afectados no coinciden estrictamente con los de las mutantes pal/rim de
diferentes especies de hongos. Las mutantes pal/rim de U. maydis presentan una
inhibición en el crecimiento a pH alcalino, sensibilidad a iones alcalinos (Li+, Na+ y K+),
susceptibilidad a estrés ácido y oxidativo, deficiencias en la construcción de la pared
celular, y la secreción de un polisacárido, que posiblemente sea el resultado de la
alteración en la estructura de la pared celular (Cervantes-Chávez et al., 2010).
Nuestro principal interés en este trabajo fue analizar qué vías involucradas en la
fisiología celular de U. maydis estaban bajo la regulación o tenían una interrelación con el
sistema Pal/Rim, debido al fenotipo pleiotrópico presentado por las mutantes de los
miembros de la vía. De acuerdo con este objetivo, se procedió a analizar algunas de las
características fenotípicas presentadas por las mutantes pal/rim de U. maydis
33
adicionalmente a, o a mayor profundidad que, las previamente descritas por CervantesChávez et al., (2010).
Dado que es el fenotipo más característico de las mutantes pal/rim de U. maydis,
se consideró como primer paso caracterizar el polisacárido secretado al medio de cultivo
por la mutante palB/rim13 seleccionada en este estudio, mediante una serie de métodos
químicos y físicos. Siguiendo esta metodología exhaustiva, se logró demostrar que el
polisacárido está constituido solamente por glucosa, y con los análisis de susceptibilidad a
β-1,3-glucanasa, IR, 1H-NMR y
13
C-NMR se demostró que el polisacárido tiene una
estructura de β-(1 -> 3) glucana. Y con el uso de un anticuerpo específico para β-1,6glucanas, se eliminó la posibilidad de que fuese un polisacárido ramificado con este tipo
de uniones.
Diferentes tipos de evidencia experimental han sugerido que la vía Pal/Rim
interviene en la expresión de genes que están involucrados en la síntesis de polisacáridos
de la pared celular; por ejemplo, en S. cerevisiae se encontró que PacC/Rim101 es
requerido para la remodelación de la pared celular, ya que regula la expresión de CWP1 y
KNH1 genes implicados en el montaje y organización de la pared celular. KNH1 está
implicado en la síntesis de β-1,6-glucana (Dijkgraaf et al., 1998), que es esencial por la
interconexión de todos los componentes de la pared celular (Klis et al., 2006) y CWP1
codifica una manoproteína de la pared celular vinculada a los polisacáridos β-1,3 y β-1,6glucana a través de un enlace fosfodiéster (Kapteyn et al., 1997; Klis et al., 2006). De
manera interesante en este estudio se encontró que los azucares neutros álcali solubles
encontrados en la pared celular de la cepa mutante, en particular la β-1,3-glucana,
estaban considerablemente disminuidos en comparación con la cepa silvestre. Sin
embargo, el gen que codifica la Gls presentó los mismos niveles de transcrito que la cepa
silvestre, lo que nos indica que no hay ninguna regulación en su expresión por la vía
Pal/Rim. Además, se pudo observar por microscopía electrónica de transmisión que la
pared celular de la cepa mutante es considerablemente más delgada que la de la cepa
silvestre. Estos resultados sugieren que el polisacárido secretado al medio de cultivo por
las mutantes pal/rim puede formar parte natural de la pared celular de las células y
34
debido a la mutación no se está anclando adecuadamente a ésta. Por ello se podría decir
que la vía Pal/Rim tiene una interacción directa con la vía de Map cinasas PKC, que está
involucrada en el mantenimiento de la integridad de la pared celular.
Se encontró además, que la proteína presente en la pared celular de la cepa
mutante se encontraba en menores cantidades que en la silvestre, lo que posiblemente
podría deberse a la deficiente estructuración de la pared celular que impide su retención,
ocurriendo una salida facilitada de las proteínas hacia el medio de cultivo. Apoya a esta
hipótesis el hecho que la proteína presente en el medio de cultivo de la cepa mutante era
mayor que la de la cepa silvestre.
Tomando en cuenta las alteraciones cuantitativas en algunos componentes de la
pared celular de la cepa mutante palB/rim13 se procedió a determinar si estaba afectada
la regulación de los genes que codifican las enzimas responsables de la síntesis de los
polisacáridos estructurales quitina y β-1,3-glucana determinando los niveles de expresión
de dichos genes por medio de RT-PCR, observando una disminución en los niveles de
transcrito de los genes de CHS1, CHS2, CHS6 y CHS8 con respecto a la cepa silvestre,
pudiendo argumentarse que esta alteración en la transcripción de esos genes conduce a
una disminución de la cantidad de quitina presente en la pared celular, lo que originaría
un debilitamiento y fallas en la estructura de la pared. Estos resultados sugieren que
posiblemente dichos genes puedan estar bajo la regulación, al menos parcialmente, del
factor de transcripción PacC/Rim101.
Otra alteración fenotípica provocada por la mutación de los genes pal/rim es una
mayor susceptibilidad a los iones Na+, Li+ y K+. En U. maydis se ha descrito que el bombeo
de los iones alcalinos es llevado a cabo por las proteínas codificadas por los genes
UmEna1 y UmEna2 (Benito et al., 2009). Se demostró que la adición de dichas sales
aumentaba la expresión de UmEna2, pero que las mutantes pal/rim eran refractarias lo
que sugiere que esas ATPasa están bajo el control de la vía Pal/Rim (Cervantes-Chávez et
al., 2010). Contrariamente a estas observaciones, en este estudio se demostró que la
mutante palB/rim13 de U. maydis no presentaba mayor susceptibilidad a iones divalentes
(Ca++ y Mg++) que la cepa silvestre. Al parecer la regulación de la concentración de los
35
iones divalentes en la célula no está afectada por lo que se puede hipotetizar que su
control no está relacionado con la vía Pal/Rim.
Por otra parte, el hecho de que la mutante ∆palB/rim13 no sea mayormente
sensible a la cafeína que la cepa silvestre, a diferencia de la hipersensibilidad que muestra
la mutante pka, sugiere que la vía Pal/Rim no está relacionada con la vías PKA relacionada
con el crecimiento levaduriforme de U. maydis.
Cervantes-Chávez (2010) describió que las mutantes pal/rim de U. maydis no
sobrevivían al estrés oxidativo de una magnitud que no afectan a las células silvestres. Es
posible que el efecto del estrés sea aditivo a la existencia de una pared celular débil o una
membrana plasmática alterada. Sin embargo, cabe mencionar que en este análisis se
desarrolló en MM líquido a una concentración de H2O2 10 mM por 2 h y posteriormente
las células fueron sembradas en placas de medio sólido. En este sentido, consideramos
que dicho método podría ejercer un efecto muy fuerte sobre las mutantes que no les
permitiese recuperarse de dicho estrés, y se consideró analizar el efecto del estrés
oxidativo sobre dichas mutantes utilizando una concentración menor de H2O2 adicionada
a las placas de cultivo. Se observó que efectivamente la mutante pal/rim era más sensible
que la silvestre al estrés oxidativo, pero no en la magnitud que se había establecido
anteriormente.
Una de las primeras características fenotípicas observadas, en las mutantes de
diferentes hongos deficientes en alguno de los miembros de la vía Pal/Rim, fue su
incapacidad de secretar diferentes enzimas inducibles que actúan a pH alcalino (revisado
por Peñalva y Arst, 2004). La mutante ∆pacC/rim101 y las mutantes ∆palB, ∆palA y ∆palC
de U. maydis son incapaces de secretar proteasa al medio de cultivo (Aréchiga-Carvajal y
Ruiz-Herrera, 2005; Cervantes-Chávez et al., 2010). En concordancia con este
comportamiento, la mutante ∆palB/rim13 mostró ser incapaz de secretar una lipasa que
le permitiese utilizar triglicéridos como fuente de carbono mediante la β-oxidación. De
acuerdo con este resultado se pudo concluir que la vía Pal/Rim de U. maydis, al igual que
ocurre con otros hongos, está involucrada en la secreción de las enzimas extracelulares
inducibles que responden al pH alcalino.
36
La inhibición en el crecimiento de las mutantes pal/rim de U. maydis a pH alcalino
está de acuerdo con el fenotipo observado en otros hongos; como son las mutantes
pal/rim de C. albicans (Blanchin-Roland et al., 2008; Cornet et al., 2009), Y. lipolytica
(González López et al., 2002), S. cerevisiae (Futai et al., 1999; Castrejón et al., 2006), y A.
nidulans (Arst et al., 1994; Denison et al., 1998). En base a la similitud en estas
características, nosotros procedimos a analizar si los cambios en el pH externo
influenciaban el pH interno en mayor nivel en la mutante ∆palB/rim13; es decir si la
mutación en la vía Pal/Rim afectaba la homeostasis celular. Se sabe que los cambios en el
pH del medio afectan el gradiente de pH en la membrana plasmática, afectando la
actividad de las ATPasas (Carmelo et al., 1996), habiendo una dependencia del pH
interno con el pH externo (Valli et al. 2005). En este trabajo se observó que la cepa
silvestre de U. maydis tiende a mantener el pH interno independientemente del pH
externo, indicando que puede controlar los mecanismos que regulan el pH interno. Por el
contrario, se observó que el pH interno de la cepa mutante era totalmente dependiente
del pH externo, y que su homeostasis estaba afectada por la mutación en la vía Pal/Rim.
Aunque desconocemos cuál o cuáles son los mecanismos involucrados en la homeostasis
del pH interno, podemos indicar que la regulación de la expresión del gen que codifica la
ATPasa de membrana citoplasmática PMA1 de H+ esta bajo la regulación negativa de la
vía Pal/Rim, ya que observamos que los niveles de expresión de este gen se incrementan
a pH alcalino en la cepa mutante con respecto a la cepa silvestre. Contrariamente la
ATPasa Na+/H+ no está regulada por la vía Pal/Rim.
Como corolario, se puede indicar que originalmente la vía Pal/Rim fue considerada
como específica de los Ascomicota, estando involucrada en la expresión de algunas exoenzimas que responden a los cambios en el pH externo. Se ha revelado por
descubrimientos posteriores, que la vía se conserva en los Basidiomicota, pero con
importantes diferencias en algunos de sus componentes, específicamente los
involucrados en la recepción de la señal, y que posee una gran importancia en la
regulación de mecanismos involucrados en otros fenómenos celulares. Los resultados
descritos en esta tesis son evidencia de que la vía Pal/Rim está involucrada con otras vías
37
de señalización encargadas del mantenimiento de la pared celular, respuesta a estrés y
regulación de la homeostasis del pH celular, como se plantea en el esquema de la figura
26.
38
VII. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
En el presente trabajo se analizó la posible interacción de la vía Pal/Rim con otras vías de
señalización en el hongo Basidiomycota fitopatógeno Ustilago maydis. Para ello se utilizó
una mutante afectada en dicha vía, palB/rim13.
De acuerdo con los resultados es este estudio se pudo llegar a las siguientes conclusiones:
1.
El polisacárido secretado al medio de cultivo por la mutante pal/rim es una β-1,3glucana. Sería interesante emplear este polisacárido en algunas aplicaciones en la
medicina por sus efectos en el sistema inmunitario, ya que estas sustancias son
conocidas como "modificadores de respuesta biológica" por su capacidad de activar
el sistema inmunitario tanto del hombre como de otros animales, y han sido
utilizados como terapia inmunológica para el cáncer (Vetvicka, 1996).
2. Se demostró que la inestabilidad en la pared celular de la mutante pal/rim se debe
posiblemente a los niveles disminuidos de quitina y β-1,3-glucana álcali soluble.
3. Se observó que la vía Pal/Rim regula a nivel transcripcional la expresión de los genes
Chs1, Chs2, Chs6 y Chs8.
4. Se observó que la vía Pal/Rim no regula a nivel transcripcional la expresión del gen
Gls.
5. Se comprobó que la vía Pal/Rim tiene una interacción con la vía PKA encargada del
mantenimiento de la integridad de la pared celular.
6. Se demostró que la vía Pal/Rim no interactúa con la vía HOG de alta osmolaridad, con
el manejo de los iones divalente, y con las vías PKA y MAPK encargadas del
crecimiento levaduriforme y micelial de U. maydis respectivamente.
7. Se demostró que la vía Pal/Rim interactúa con la respuesta a estrés.
8. Se comprobó que la sensibilidad a pH alcalino de las mutantes se debe a que las
mutantes no son capaces de mantener su pH intracelular constante.
9. Se observó que la vía Pal/Rim regula negativamente a nivel transcripcional a la
ATPasa PMA1 de H+.
39
10. Se observó una inhibición en la secreción de lipasa al medio de cultivo en la mutante
pal/rim.
40
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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45
Figura 1. Modelo genético de regulación por pH en Aspergillus nidulans. PacC/Rim101 se
sintetiza como una forma inactiva cuya activación requiere una señal transducida bajo
condiciones de pH alcalino por la vía de señalización Pal/Rim. La forma activa de
PacC/Rim101 es un represor transcripcional de algunos genes que se expresan a pH ácido,
como pacA y gabA, y un activador transcripcional de algunos genes expresados a pH
alcalino, como ipnA, prtA y palD (modificado de Peñalva y Arst, 2002).
1A
Figura 2. Modelo propuesto de regulación por Ph en A. nidulans. Cuando el Ph externo es
ácido, PacC se mantiene en una conformación cerrada inaccesible a proteasas. Bajo
condiciones alcalinas, se transmite una señal al complejo de membranas endosomales
desde el complejo de la membrana plasmática, por un proceso que probablemente
involucra endocitosis de PalH y/o PalF y la participación de PalC. En dicho complejo, PacC,
unido a PalA a través de los motivos YPLX/I (círculos malva) es sometido a una primera
proteólisis dependiente del Ph, la cual es mediada por PalB, que remueve el dominio C
para dejar a PacC en una conformación abierta accesible a un segundo paso de proteólisis
independiente del Ph, mediado por el proteosoma, liberando la forma activa de PacC, la
cual entra al núcleo de la célula para reprimir los genes expresados a pH ácido y activar
los genes expresados a Ph alcalino. (Peñalva et al., 2008).
3A
Figura 3. Ciclo de vida de U. maydis. Células haploides compatibles se fusionan generando
un dicarión filamentoso patogénico. La fusión celular está gobernada por el locus de tipo
de apareamiento a, mientras que el crecimiento filamentoso está regulado únicamente
por el locus b. Las teliosporas germinan produciendo un filamento corto, el promicelio,
donde se lleva a cabo la meiosis. (Modificado de Martínez-Espinoza et al., 2007).
7A
Figura 4. Esquema de la determinación secuencial de los componentes de la pared
celular.
19A
Figura 5. Curva de calibración de pH in vivo de U. maydis. La calibración in vivo se realizó
con nigericina 4.4 µM y la determinación de pHi se realizó con el fluoróforo BCECF-AM
1µM.
22A
Figura 6. Secreción del polisacárido al medio de cultivo por la cepa ∆palB de U. maydis.
Las células se cultivaron en MM de pH 7, 8, 9, 10, 11 por 40 h. El polisacárido se precipitó
con etanol y se midió su peso seco.
23A
Figura 7. Cromatografía en capa fina del polisacárido. El polisacárido fue hidrolizado con
HCl 2N a 100 oC por 4 u 8 h. La cromatografía se desarrolló con una mezcla de propanolbutanol-agua (12:3:4), y los azúcares se visualizaron con una solución de difenilaminaanilina-ácido fosfórico.
24A
(A)
(B)
Figura 8. Inmunodetección del polisacárido. Se empleó un anticuerpo policlonal anti-β1,6-glucana (dilución 1/1,000). (A) Muestras de polisacárido, (B) control positivo:
hidrolizado de paredes celulares de C. albicans.
24B
No.
Pico
Carbohidrato
Tiempo de
retención (min)
Area
nC*min
Altura
nC
Abundancia
relativa (%)
1
Glucosa
5.53
44.619
253.348
n.a.
Figura 9. Cromatograma de HPAEC del producto de 10 h de digestión del polisacárido
con β-1,3-glucanasa.
25A
(A)
(B)
Figura 10. Espectro de absorción del infrarrojo medio (FT-IR) de la muestra del
polisacárido. (A)Espectro de absorción del FT-IR completo. (B) Amplificación de la
sección en rojo del FT-IR.
25B
(A)
(B)
Figura 11. Espectro de 1H-NMR del polisacárido. (A) Espectro de 1H-NMR completo de la
muestra del polisacárido en estado líquido. (B) Amplificación de la sección en el cuadro
del NMR.
25C
(A)
(B)
Figura 12. Espectro de 13C-NMR del polisacárido. A) Espectro característico de β-1,3-D de
una glucana anhidra (Fairweather et al,. 2004). B) Espectro de 13C-NMR en estado sólido
de la muestra del polisacárido.
26A
(A)
(C)
I = 0.24 ±0.02 µm
IV = 0.24 ±0.03 µm
II =0.22 ±0.02 µm
III = 0.25 ±0.03 µm
(D)
(B)
I = 0.16 ±0.02 µm
IV =0.16 ±0.01 µm
II = 0.14 ±0.02 µm
III = 0.17 ±0.01 µm
Figura 13. Microscopia electrónica de cortes medios de células de U. maydis. (A) Cepa
silvestre. (B) Mutante ∆palB. Barra se amplificación: 5 µm para cada imagen. (C) Medición
del grosor de la pared de la cepa silvestre, el promedio de los cuatro puntos es 0.24 ±0.03
µm; (D) Medición del grosor de la pared de la cepa mutante, el promedio de los cuatro
puntos es 0.16 ±0.015 µm. Los datos mostrados son el promedio de 10 repeticiones de 10
células diferentes con 22K de cada cepa.
26B
Figura 14. Análisis de los niveles de expresión de los transcritos de los genes de Chs y Gls
de la cepa silvestre y la mutante ∆palB de U. maydis durante el crecimiento en MM pH
8.5 por 20 h de cultivo. Los valores se relacionaron con los del transcrito del factor alfa de
alargamiento de la síntesis de proteínas de jitomate.
27B
Figura 15. Efecto del estrés osmótico en el crecimiento de la cepa silvestre y la mutante
∆palB de U. maydis. Se sembraron diferentes densidades celulares en placas de medio
mínimo sólido conteniendo sorbitol al 1, 2 o 3M y se incubaron por 48 h.
28B
Figura 18. Efecto del calcofluor el crecimiento de la cepa silvestre y mutante ∆palB de U.
maydis. Se sembraron diferentes densidades celulares en placas de medio mínimo sólido
con calcofluor al 2% y se incubaron por 48 h. Se fotografió la placa iluminada con luz UV.
29A
Figura 19. Efecto del estrés oxidativo en el crecimiento de la cepa silvestre y la mutante
∆palB de U. maydis. Se sembraron diferentes densidades celulares en placas de medio
mínimo sólido con H2O2 al 7, 17, 21 o 28 mM y se incubaron por 48 h.
29B
Figura 16. Efecto del estrés del Mg++ en el crecimiento de la cepa silvestre y la mutante
∆palB de U. maydis. Se sembraron diferentes densidades celulares en placas de medio
mínimo sólido con MgSO4 al 0.2, 0.3 o 0.5 M y se incubaron por 48 h.
28C
Figura 17. Efecto del estrés del Ca++ en el crecimiento de la cepa silvestre y la mutante
∆palB de U. maydis. Se sembraron diferentes densidades celulares en placas de medio
mínimo sólido con CaCl2 al 0.2, 0.3 o 0.5 M y se incubaron por 48 h.
28D
Figura 20. Efecto del estrés por cafeína en el crecimiento de la cepa silvestre y mutantes
∆palB, pka-, mapk- de U. maydis. Se sembraron diferentes densidades celulares en placas
de medio mínimo sólido con cafeína 5 mM y se incubaron por 48 h.
29C
Figura 21. Morfología celular de la cepa silvestre y mutante ∆palB de U. maydis. Las cepas
crecieron en MM pH 8.5 con acetite de oliva al 1% como fuente de carbono por
diferentes tiempos. A,C, E, cepa silvestre; B, D, F, mutante. A, B, 24 h; C, D 48 h; E, F 72 h.
30A
48
24
72
Figura 22. Cinética de crecimiento con aceite de oliva de la cepa silvestre y mutante en
∆palB de U. maydis. Las cepas crecieron en MM pH 8.5 con acetite de oliva al 1% como
fuente de carbono por diferentes tiempos de cultivo. Se determino el contenido de
proteína celular.
30B
48
24
72
Figura 23. Actividad de lipasa de las cepas silvestre y mutante ∆palB de U. maydis. Se
incubaron las células a 37 oC por 30 min y se midió la turbidez como D O a 600 nm.
30C
Figura 24. Análisis de los niveles de expresión de los transcritos de la ATPasa H+ PMA1 de
la cepa silvestre y la mutante ∆palB de U. maydis. Al cabo de 20 h de crecimiento en MM
pH 6 y 8.
31B
Figura 25. Análisis de los niveles de expresión de los transcritos de la ATPasa Na+/H+ de la
cepa silvestre y la mutante ∆palB de U. maydis. Al cabo de 20 h de crecimiento en MM pH
6 y 8.
32A
Figura 25. Esquema propuesto de la interacción algunas rutas metabólicas por la vía
Pal/Rim. Se incluyen vías que no están relacionadas con la vía Pal/Rim.
38A
RESUMEN
Uno de los factores fisicoquímicos medio ambientales más importante que afectan el
crecimiento y desarrollo celular es el pH. En el caso particular de los hongos, dependiendo del
pH externo, éstos secretan diferentes compuestos de bajo peso molecular y proteínas al
medio ambiente, que desempeñan funciones importantes en su adaptación a las condiciones
variables del mismo. El mecanismo más importante que controla estas funciones en los
hongos es la vía de transducción de señales denominada Pal/Rim. Esta vía involucra una
cascada de señalización que conduce a la activación proteolítica de un factor de transcripción
de dedos de zinc denominado PacC/Rim101, el cual activa o reprime la transcripción de un
determinado número de genes. Esta vía de señalización esta mediada en los Ascomycota por
seis proteínas: PalH/Rim21, PalF/Rim8, PalI/Rim9, PalA/Rim20, PalB/Rim13 y Snf7/Vps32
(maquinaria ESCRT-III).
U. maydis un hongo basidiomicete, patógeno biotrófico que causa el carbón común en
el maíz (Zea mays L.) y en el teozintle (Z. mays ssp. parviglumis), posee al igual que todos los
Basidiomycota analizados sólo los homólogos a PalA, B, C, I y PacC. Estudios en nuestro
laboratorio mostraron que la mutación de los genes PacC o PaA, B o C en U. maydis, daba
lugar a un fenotipo pleiotrópico, que incluía la inhibición en el crecimiento a pH alcalino, la
sensibilidad a iones alcalinos (Li+, Na+ y K), la susceptibilidad al estrés ácido y oxidativo y
deficiencias en la construcción de la pared celular, lo que puede indicar una interacción entre
la vía Pal/Rim y una vía MAPK encargada de la integridad de la pared celular en el hongo, y la
secreción de un polisacárido, que posiblemente sea el resultado de la alteración en la
estructura de la pared celular.
En el presente trabajo se analizaron los mecanismos por medio de los cuales la vía
Pal/Rim regula la sensibilidad a iones (incluyendo divalentes), la sensibilidad al pH alcalino, y la
organización y ensamblaje de la pared celular; es decir aquellas alteraciones que resultan de la
interrupción de esa vía de señalización por mutación de alguno de sus componentes. Los
resultados descritos en esta tesis son evidencia de que la vía está involucrada con otras vías
IX
de señalización encargadas del mantenimiento de la pared celular, respuesta a estrés y
regulación de la homeostasis del pH intracelular.
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