Tecnología de los marcadores moleculares para el
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MARZO 2002 9 [email protected] [email protected] Daniel Ortiz Proyecto Akarapua Tel: 052242622 Luis Alfredo Ruiz Díaz Dirección de Educación Agraria Ministerio de Agricultura Tel: 021585691/2 José Paiva Dirección de Semillas Ministerio de Agricultura [email protected] Carlos Pfingst [email protected] Leoncio Quintana Dirección de Extensión Agraria Ministerio de Agricultura y Ganadería Tel: 021585210 Ministerio de Agricultura y Ganadería Tel: 021227090 Nuvia Valdez Planificación Tel: 021585691/2 Lino Ariste Saavedra Empresa Oro Cuí S.A. Tel: 071202860 Christopher Viot Ministerio de Agricultura [email protected] Carlos Ramón Samaniego Banco Nacional de Fomento [email protected] Perú Jacinto Sánchez Banco Nacional de Fomento Tel: 0322207 Francklin Suárez Instituto Rural Peruano [email protected] Organizaciones Internacionales CIRAD Hugo Rabery Cáceres Facultad de Ciencias Agrarias [email protected] Gustavo Adolfo Sánchez León Empresa Oro Cuí S.A. [email protected] Bernard Hau [email protected] José María Ramírez Villar Empresa Oro Cuí S.A. Tel: 047553 Ramón Santacruz Ortiz Empresa Oro Cuí S.A. Tel: 064422057/58 Pierre Silvie Embajada Francesa [email protected] Luis Enrique Resquin Comercialización Teléfono: 5690352 Victor Manuel Santander Ministerio de Agricultura y Ganadería [email protected] Unión Europea Daniel Roa Duarte Comercialización [email protected] Pedro Javier Seall C.P.S.A.F. [email protected] Comité Consultivo Internacional del Algodón Gerardo Rojas Almada Prodesal Tel: 450890 Felix Arturo Stiegwardt Manufacturas Pilar S.A. [email protected] Alcides Gil Rotela Zaracho Prodesal Jorge Anibal Torres Oficina Fiscalizadora de Algodón y Tabaco Michelle Pierre [email protected] Rafiq Chaudhry [email protected] Carlos A. Valderrama [email protected] Tecnología de los marcadores moleculares para el mejoramiento de las plantas Muhammad Arshad y Sajjad Haidar, Instituto Central de Investigación Algodonera, Multán, Pakistán Iftikhar Ahmad Khan, Universidad de Agricultura, Faisalabad, Pakistán El algodonero pertenece al género Gossypium que incluye unas cincuenta especies, de las cuales cuarenta y cuatro son diploides (2n=2x=26) y seis son alotetraploides (2n=2x=52). Las especies diploides comprenden los grupos genómicos A, B, C, D, E, F, G y K, y las especies alotetraploides están compuestas de dos grupos subgenómicos que tienen afinidad con los genomas A y D (Stewart, 1995). Los algodones cultivados incluyen el G. arboreum L y el G. herbaceum L, ambos especies diploides con un genoma A oriundo de Asia meridional y Afri- ca, y dos especies alotetraploides, el G. barbadense L y el G. hirsutum L, con un genoma AD de la América Central, del Norte y del Sur (Endrizzi et al., 1985). Durante el pasado decenio, las perspectivas de la ingeniería genética del algodón se han elevado gracias a los adelantos en el campo de la biotecnología. En 1996 se lanzaron para la producción comercial las primeras dos variedades de algodón transgénico, creadas para la resistencia a los insectos y a los herbicidas. La producción de algodón transgénico con rendi- 10 mientos más altos, mejor calidad de la fibra y/o propiedades novedosas de la fibra encierra un potencial significativo de tener un efecto amplio sobre la economía mundial. Si bien los programas convencionales de selección siguen logrando pequeños avances en el rendimiento y la calidad de la fibra, el mejoramiento genético de las características agronómicas se está comenzando a estancar debido a que se cuenta con una base de germoplasma cada vez más restringida para la selección. Para contrarrestar esa tendencia, el uso de la ingeniería genética en el algodón se hará cada vez más común como medio para reforzar los esfuerzos de selección. En la actualidad, los seleccionadores seleccionan las plantas deseables basándose en el fenotipo. La mayoría de las características de las plantas que revisten importancia económica son poligénicas con complejas interacciones ambientales y ajenas a los alelos. El análisis biométrico genético también se ha usado durante casi medio siglo para lograr comprender la arquitectura de las características cuantitativas, lo cual ha ayudado a guiar los programas de mejoramiento genético. La variación genética entre las plantas para una característica controlada por uno o pocos genes, heredada en una forma única y mendeliana, es fácil de manipular en un programa de selección. El análisis biométrico genético determina los efectos acumulativos de todas las posiciones o loci genéticos inherentes a una característica cuantitativa pero no está en capacidad de identificar la posición o locus específico responsable. Si se pudieran resolver las características cuantitativas identificando sus componentes genéticos individuales mediante el uso de marcadores del ADN íntimamente relacionados con cada característica, quizás sería posible manipularlos de manera eficiente para las características determinadas por un solo gen. La tecnología de los marcadores del ADN ha proporcionado a los seleccionadores una herramienta para seleccionar plantas deseables basándose directamente en el genotipo en vez del fenotipo. Por lo general, la selección convencional del algodonero persigue el mejoramiento de características importantes desde el punto de vista agronómico o de interés por otras razones, mediante la combinación de caracteres presentes en diferentes líneas de progenitores de las especies cultivadas o de sus parientes silvestres. Ello se ha logrado mediante la generación de poblaciones F2 y el despistaje de fenotipos de plantas individuales o en grupos para la presencia de características deseables. Una vez hecho esto se inicia un proceso, costoso y que requiere mucho tiempo, de retrocruces, autopolinización y pruebas. Todo eso depende de métodos de despistaje precisos y exactos y de la disponibilidad de líneas con caracteres fenotípicos claramente definidos. Por ende, la combinación de caracteres codificados por genes múltiples con efecto aditivo (loci o posiciones de caracteres cuantitativos), genes recesivos o acumulación (piramidización de genes que codifiquen el mismo carácter) es difícil de lograr con los métodos clásicos. Sin embargo, los marcadores moleculares facilitan todos esos procesos, pueden acelerar la generación de varie- ICAC RECORDER dades nuevas y permiten relacionar los caracteres fenotípicos con las posiciones o loci genómicos responsables de los mismos. Esas dos propiedades determinan que los marcadores moleculares sean indispensables para el mejoramiento del algodonero. Los científicos de las plantas han utilizado las características morfológicas y fisiológicas de las mismas para comprender la diversidad genética. Se identificaron algunos genes bautizados según su apariencia física, independientemente de la naturaleza y ubicación en los cromosomas de su ADN. Los caracteres morfológicos calificables son muy pocos en el algodonero si se le comparan con genes biológicamente activos. En las especies y variedades íntimamente relacionadas del algodonero existen muy pocas diferencias morfológicas, que de hecho no representan las verdaderas diferencias genéticas al nivel del ADN. Más aún, en la mayoría de los casos, un genoma de la planta tiene grandes cantidades de ADN repetitivo que no se expresa y no contribuye a la apariencia fisiológica ni morfológica de la misma. Por ende existe la necesidad de estudiar el polimorfismo al nivel del ADN, que puede ser indicativo de la diversidad genética en el algodonero. El número de marcadores polimórficos morfológicos es limitado en el algodonero, especialmente en los cruces intraespecíficos, y su expresión sufre la influencia del medio ambiente. Por lo tanto se tienen que considerar marcadores más confiables (como proteínas) o variantes alélicas más específicas de diferentes enzimas (las llamadas isozimas) y otros caracteres bioquímicos (como lípidos o azúcares). El número de las isozimas es limitado y con frecuencia, su expresión está restringida a una etapa específica de desarrollo de los tejidos; y su presencia se puede determinar mediante electroforesis y colorantes específicos. A diferencia de las isozimas, el número de marcadores del ADN es ilimitado, no es necesaria su expresión para detectarlos y todos los marcadores se pueden detectar con una sola técnica. El polimorfismo se ha detectado en el ADN genómicos restringido de las plantas, lo cual abrió el camino para el desarrollo de marcadores moleculares para la selección en el algodonero. Hoy se cuenta con diversas técnicas nuevas de marcadores y de estrategias para la selección, adaptadas específicamente para la inclusión de los marcadores del ADN. El resultado de esos esfuerzos es un número creciente de marcadores moleculares de caracteres agronómicos importantes, disponibles para todos los cultivos. En los proyectos más avanzados, ello ha llevado a la clonación basada en mapas de los genes responsables. Técnicas Las técnicas para los marcadores moleculares incluyen el polimorfismo de fragmentos de longitud por restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) y el ADN polimórfico amplificado aleatorio basado en la reacción en cadena de la polimerasa (RAPD, por sus siglas en inglés); polimorfismo amplificado de fragmento de longitud (AFLP, por sus siglas en inglés); y MARZO 2002 los mini y microsatélites. A continuación se describe cada una de esas técnicas. Polimorfismo de fragmentos de longitud por restricción (RFLP) Las endonucleasas de restricción cortan el ADN genómico en secuencias específicas de reconocimiento palindrómico, generando millares de fragmentos de longitud definida, el número de los cuales depende del número de secuencias de reconocimiento presentes en un genoma dado. Si una secuencia de reconocimiento está presente en una posición específica del genoma en un individuo pero no en el otro, la enzima genera fragmentos por restricción de tamaños diferentes para esa posición o locus Este polimorfismo de la longitud se detecta mediante una sonda complementaria de ADN con rotulación radioactiva derivada del mismo locus. Estos RFLP fueron los primeros marcadores del ADN aplicados a la cartografía del genoma. En principio, las sondas RFLP son marcadores de copia única, cada uno de los cuales sólo detecta un fragmento genómico definido, aun cuando también se usan sondas para locus múltiples, tales como el ADN repetitivo o el cADN, las cuales pueden detectar varios fragmento por vez. Los RFLP son marcadores codominantes y su fase de acoplamiento se puede determinar al nivel experimental, ya que se detectan los fragmentos del ADN de todos los cromosomas homólogos. Por ende, los RFLP son marcadores muy confiables en el análisis de los vínculos o enlaces y en la selección, en particular si el carácter vinculado está presente en un individuo en un estado heterocigoto u homocigoto. Esa información es muy deseable para los caracteres recesivos. Varios investigadores han documentado la idoneidad del RFLP para dilucidar las características cuantitativas complejas (QTL, por sus siglas en inglés). A pesar de su utilidad, la generación y aplicación de los marcadores RFLP requiere tiempo y es costosa. Primero, sólo uno de varios marcadores proporciona el polimorfismo. Ese problema es grave, especialmente en un cruce entre líneas de selección cultivadas con una estrecha relación. Segundo, para cada locus de polimorfismo sometido a prueba en un cruce, se tiene que realizar un experimento y ello representa una tarea formidable con mapas saturados, como es el caso del tomate o el maíz, con centenares de marcadores. Debido a que el método también requiere una gran cantidad de ADN, el material de una generación F2 se agota con rapidez y ello limita el número de marcadores que se pueden someter a prueba. Para superar esos problemas se ha sugerido la aplicación de poblaciones estables para la cartografía. Los marcadores RFLP se pueden usar para la cartografía de las QTL, para los genes que participan en la resistencia a las enfermedades, y para la relación entre los componentes del genoma tetraploide del Gossypium hirsutum y sus antecesores. ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD) El ADN polimórfico amplificado aleatorio basado en la reacción en cadena de la polimerasa es mucho más rápido y más 11 barato que el análisis del RFLP y se usa sólo en cantidades diminutas de ADN. En lugar de cebadores complementarios de secuencias conocidas, como en la PCR normal, se usan oligonucleótidos sintéticos generados en forma aleatoria de 912 bases como puntos de partida para las polimerasas termoestables de ADN (Welsh y McClelland, 1990: Williams et al.,1990). Ese enfoque produce de 1 a 10 fragmentos de una PCR con cebador único, los cuales son altamente polimórficos y se pueden detectar con gran facilidad en geles de agarosa coloreados con bromuro de etedio. Este enfoque tiene varias modificaciones. Por ejemplo, el uso de oligonucleótidos más cortos (típicamente de 5 a 15 nucleótidos en combinación con la electroforesis en gel de poliacrilamida [PAGE] y coloración de plata de alta sensibilidad), resulta en un número mucho mayor de bandas visibles en la identificación por amplificación del ADN (DAF, por sus siglas en inglés). La elevada sensibilidad del método aplicada al ADN predigerido permite la rotulación de la posición o locus específico para algunos caracteres en líneas casi isogénicas del algodonero. Los marcadores RAPD se pueden usar para la clonación basada en mapas de los genes resistentes a las enfermedades en el algodonero. El proceso de amplificación aleatoria introduce algunas dificultades en la reproducción de los patrones del RAPD en diferentes laboratorios y en diferentes termocicladores. Los informes recientes sostienen que esos problemas surgen debido a las impurezas y que por ende, se pueden resolver. Minisatélites, microsatélites y ADN disperso repetitivo Si bien los marcadores RFLP, así como muchos de los marcadores RAPD, reconocen más de un locus en un genoma dado, el número de loci reconocidos es limitado, así como su contenido de información polimórfica. Los marcadores derivados de elementos pequeños, repetidos y dispuestos en tándem ofrecen un modo de resolver esa limitación. Esos marcadores son llamados micro o minisatélites, o repeticiones simples en tándem (STR, por sus siglas en inglés),debido a que la organización de sus secuencias es similar a la disposición en tándem del ADN clásico satélite. Esas secuencias están dispuestas en el genoma eucariótico en muchas copias de unidades numéricas repetidas variables. Debido a sus números repetitivos variables en cualquier locus dado, los elementos cambian con frecuencia su longitud por el mal apareamiento de filamentos deslizados y otros procesos no bien comprendidos. Las secuencias de copia única circundantes normalmente no se ven afectadas y por ende proporcionan una fuente valiosa de polimorfismo para muchos propósitos, incluido el análisis de vínculos (Nakamura et al., 1987), la identificación de especies y variedades, y la selección asistida por marcadores (Beckmann y Soller, 1990). Los minisatélites (unidades repetidas de 9-20 nucleótidos) se pueden hibridar para convertirlos en ADN restringido y separado por electroforesis sobre membranas de nailon (Jeffreys et al., 1985). Los microsatélites (unidades repetidas de 1-5 nucleótidos) se pueden hibridar para convertirlos en ADN en 12 geles secos (Ali et al., 1986) o se pueden clonar, dividirse en secuencias y detectar con el polimorfismo amplificado de fragmentos de longitud mediante la PRC, utilizando como cebadores los oligonucleótidos del ADN monomórfico circundante. Esos sitios de microsatélites en secuencia y rotulados (STMS, por sus siglas en inglés; Beckman y Soller, 1990), al igual que los RFLP, son marcadores codominantes y por ende muy informativos, lo cual justifica el gran volumen de trabajo necesario para su generación. Los microsatélites están presentes en diferentes formas en los genomas de las plantas. Polimorfismo amplificado de fragmentos de longitud (AFLP) Esta técnica se basa en la detección de fragmentos genómicos por restricción mediante la amplificación de la PCR. El ADN se corta con enzimas de restricción y se ligan adaptadores de filamentos dobles a los extremos de los fragmentos de ADN para generar la plantilla del ADN para su amplificación. La secuencia de los adaptadores y el sitio adyacente de restricción sirven como sitios de enlace del cebador para la amplificación subsiguiente de los fragmentos de restricción. Se incluyen nucleótidos selectivos en los extremos de 3 pies de los cebadores de la PCR, los cuales, por lo tanto, sólo pueden cebar la síntesis del ADN a partir de un subconjunto de sitios de restricción. Sólo se amplificarán los fragmentos de restricción en los que los nucleótidos que flanquean el sitio de restricción se correspondan con los nucleótidos selectivos. El AFLP produce un número mayor de polimorfismos que los marcadores RAPD o RFLP. Es una técnica fuerte y con un alto nivel de reproducción. Aplicaciones ICAC RECORDER Selección asistida por marcadores El uso de los marcadores moleculares permite a los seleccionadores del algodón conectar la acción genética subyacente a un fenotipo específico con las distintas regiones del genoma en que el gen reside (por ejemplo, la expresión fenotípica de la calidad de la fibra se limita a las especies domesticadas). Los adelantos genéticos en la calidad de la fibra se pueden hacer indicativos de la existencia de genes que contribuyen a esa calidad en el germoplasma que no expresa el fenotipo. Los marcadores moleculares podrían brindar la oportunidad de usar la precisión para identificar el fenotipo de esos caracteres. Los marcadores moleculares permitirán la selección directa de genotipos, proporcionando así un medio más eficiente de selección para las propiedades de la fibra. La manipulación genética de las propiedades de la fibra del algodón utilizando estrategias moleculares depende de la identificación y aislamiento de los genes que controlan el desarrollo de la fibra y/o que afectan directamente una propiedad estructural particular de las fibras. Los marcadores moleculares brindan una oportunidad para identificar y aislar los genes relacionados con los caracteres de la fibra mediante la clonación basada en mapas. Una vez determinados los marcadores para un carácter interesante, los mismos debieran hacer posible la predicción de los caracteres de la fibra, del rendimiento o de la resistencia de los descendientes individuales derivados de un cruce, exclusivamente mediante el patrón de distribución de los marcadores en el genoma del descendiente. Aparte de la explotación de los polimorfismos genómicos para la utilización del germoplasma y la protección de las variedades, en el presente, el interés de los seleccionadores del algodón en los marcadores moleculares se concentra en tres puntos fundamentales: • La aceleración de la introgresión de genes resistentes únicos para los agentes fitopatógenos de las especies silvestres o de líneas cultivadas de donantes en variedades superiores en todos los demás aspectos. • La acumulación (piramidización) de genes de resistencia mayores y/o menores en las variedades para generar resistencias múltiples y más duraderas (horizontales) contra diferentes patotipos del mismo agente patógeno. • El mejoramiento del valor agronómico del algodón mediante la selección para caracteres heredados cuantitativamente, tales como el rendimiento, y la tolerancia a la sequía y al frío. Diversidad genética Los polimorfismos del ADN son explotados en los algodoneros por un número siempre creciente de técnicas de marcadores moleculares para la diferenciación entre individuos, accesiones, y especies de plantas, patógenos y plagas. Su resolución elevada, en comparación con todos los demás marcadores, los convierte en una herramienta valiosa para la identificación de las variedades y los progenitores para la protección de los derechos de los seleccionadores del algodón. Los marcadores del ADN incrementan el repertorio de herramientas para determinar la relación evolutiva entre las especies y familias del Gossypium. Además, los marcadores moleculares permiten comprender la relación entre los cromosomas de las especies relacionadas del Gossypium. Visto que los agentes patógenos y las plagas del algodonero también despliegan diversidad genética, su distribución, variación y flujo de genes se pueden medir esos parámetros en función del tiempo y el espacio. Junto con las pruebas de agresividad, el estudio de la diversidad genética echó las bases para detectar los cambios anuales en la distribución de los agentes patógenos, lo cual se puede usar para pronosticar y prevenir futuras epidemias. Selección para la resistencia La principal ventaja de usar los marcadores moleculares en el algodón es la introgresión de los genes de la resistencia en las variedades para ahorrar tiempo. El uso de los marcadores del ADN podría acelerar ese proceso en tres generaciones de plantas al permitir la selección de descendientes resistentes que contengan la cantidad más baja del genoma donante en cada generación (Tanksleet al.,l, 1989). Las resistencias de genes únicos (resistencia vertical) son con frecuencia desintegradas MARZO 2002 por los agentes patógenos, convirtiendo así a la variedad previamente resistente en una variedad susceptible. Por ende, los seleccionadores buscan acumular varios genes de resistencia menores y mayores en una variedad para lograr resistencias más duraderas. Con la selección convencional es casi imposible combinar tantos genes diferentes. La acción de los genes de resistencia diferentes no se puede diferenciar ni siquiera con un conjunto de patotipos diferentes. Sin embargo es posible determinar muchos loci de resistencia de diferentes fuentes mediante marcadores vinculados en cruces paralelos. Análisis de los loci de caracteres cuantitativos Muchos caracteres interesantes desde el punto de vista agronómico, como el rendimiento, son controlados por poligenes, aportando cada gen apenas un pequeño porcentaje a la expresión del carácter. La rotulación de los poligenes con marcadores moleculares requiere un mapa de vínculos saturados con un espaciamiento entre los marcadores que no exceda 20 cM y por lo menos 250 individuos F2 de un cruce entre líneas de progenitores que tengan diferencias marcadas respecto al carácter en cuestión (Tanksley, 1993). Primero se somete a prueba el descendiente respecto al carácter y se determina su genotipo para cada locus marcador. Entonces se calcula la probabilidad de que los datos observados dependan de la presencia de QTL, respecto a la probabilidad de que no haya ninguna QTL presente, para lo cual se usa un soporte lógico (“software”) de computación especialmente diseñado, como el MAPMAKER. Desarrollo de poblaciones para los marcadores del ADN El desarrollo de poblaciones es un paso importante en los estudios con marcadores del ADN. El diseño apropiado de la población de prueba es un paso crucial en el desarrollo de marcadores para los caracteres agronómicos. Ultimamente se han desarrollado varias estrategias para un diseño de esa naturaleza, incluidas diferentes poblaciones de segregación y regímenes de muestreo. Los tipos de poblaciones descritos a continuación se pueden usar para los estudios con marcadores del ADN. Cruces interespecíficos En general se ha encontrado que los cruces de especies silvestres con líneas cultivadas son útiles en el algodón para la elaboración de mapas genéticos debido al grado relativamente elevado de isozima morfológica y de polimorfismos del ADN en las especies silvestres. Esos cruces ayudaron en la elaboración de mapas de vinculación y en la identificación de los loci de resistencia. Una vez establecido el mapa y encontrados los marcadores de vinculación, también se pueden incluir accesiones comercialmente importantes para el análisis de los vínculos con el uso de estos marcadores. 13 Población de segregación F2/F3 Las poblaciones F2 ó F3 se pueden usar para los marcadores del ADN. Mientras se estén haciendo los cruces se debe realizar un despistaje cuidadoso de los progenitores. Esos progenitores deben ser ampliamente diferentes respecto al carácter deseable. La población de segregación se debe someter a un despistaje fenotípico y la población a ser sometida a ese despistaje debe ser grande, por lo general una población de 500 plantas, dependiendo del número previsto de loci inherentes al carácter. Resulta más útil si después de hacer el despistaje de las plantas F2, las familias seleccionadas de las mismas se cultivan y la selección final de plantas para los estudios con marcadores del ADN se basa en la población F3. No se debe incluir la progenie de las plantas F2 que muestre segregación. Por último se seleccionan veinticinco plantas para cada carácter contrastante. La presencia uniforme de moléculas polimórficas de ADN en un grupo de plantas y su ausencia en el otro grupo contrastante de plantas demuestra su vinculación con el carácter de interés. Una población numerosa F2 es la más informativa para la cartografía genómica, en especial si el mapa se encuentra en una etapa temprana y sólo se han trazado unos pocos marcadores. Sin embargo, la selección F2 tiene tres desventajas importantes para el desarrollo de marcadores para los caracteres de interés agronómico en cuestión. • Se tiene que usar el mismo individuo sometido a prueba para el carácter en el análisis de vinculación (por ejemplo, algunas plantas son afectadas demasiado por los patógenos y las plagas para poder proporcionar suficiente ADN para el análisis de vinculación). • Una vez cumplido su ciclo vital, las plantas mueren y no estarán disponibles para retrocruces o para ulteriores análisis genéticos (en especial los individuos con características fenotípicas y genotípicas). • La mayoría de los marcadores de locus múltiples, incluidos los RAPD y los mini y microsatélites, son marcadores dominantes, cuyo estado de homo o heterocigoto no se puede determinar. La generación F2 no permite la diferenciación entre esas dos posibilidades y por ende, se pierde mucha información. Líneas recombinantes Las líneas avanzadas desarrolladas del cruce de dos plantas también se pueden usar para los marcadores del ADN. Se hace el despistaje de una población de por lo menos quinientas líneas recombinantes y se seleccionan unas veinte líneas de cada uno de los pares contrastantes para el análisis del ADN. Cuando se usen líneas recombinantes ó F2/F3, después de la extracción del ADN de las plantas individuales, se puede usar también el análisis de segregación en masa (Michellmore et al., 1991), en vez del ADN de las plantas individuales, en el análisis del RAPD, RFLP ó AFLP, etc. 14 ICAC RECORDER Líneas isogénicas Las líneas isogénicas desarrolladas para un carácter en particular, utilizando el procedimiento del retrocruce recidivante, también se pueden usar para los estudios con marcadores del ADN. El uso de las líneas isogénicas reduce el número de la reacción RAPD/RFLP/AFLP, etc., ya que sólo se usan dos líneas que sean contrastantes respecto al carácter en cuestión. No obstante, el procedimiento para desarrollar las líneas isogénicas es tedioso y requiere mucho tiempo. Para estudios más avanzados con una vinculación muy estrecha entre los marcadores y los caracteres, lo cual es un prerrequisito para la piramidización de los genes de resistencia o para la clonación de genes basada en mapas, se usan, con una eficiencia elevada en varias especies, líneas casi isogénicas (NIL, por sus siglas en inglés), derivadas de varias rondas de retrocruces del receptor de un gen de interés agronómico con el genotipo receptor. Normalmente, las NIL sólo contienen pequeñas cantidades del ADN donante que circunda al gen de interés. Con el fin de evitar la generación de las NIL que toma mucho tiempo, se pueden rotular genes específicos al reunir en masa el ADN de plantas F2 individuales con un desempeño idéntico en las pruebas fenotípicas (de resistencia) (análisis de segregación en masa; Michellmore et al., 1991). El ADN individual de las poblaciones existentes para la elaboración de mapas también se pueden agrupar según la distribución de los marcadores RFLP y después, se puede utilizar el análisis del RAPD para rotular la región que circunda al gen o genes. Por ende, los marcadores del ADN ofrecen dos ventajas: • Recuperación más rápida del genoma recidivante. • Selección más eficiente de genomas que presentan eventos de recombinación cercanos al gen objetivo. La selección asistida por los marcadores está aún limitada por tres factores: • El número de muestras que se pueden analizar. • El número de líneas que se pueden mejorar dentro de un tiempo dado. • La creencia que se requiere la identificación de las QTL siempre que se use germoplasma adicional. Los marcadores basados en la PCR también han abierto nuevas puertas para la manipulación del genoma, ya que su uso permite: • Un muestro más temprano debido a la pequeña cantidad de tejido que se requiere. • Una preparación más rápida del ADN debido a la pequeña cantidad de ADN de plantilla que se requiere. • Un manejo más eficiente de muestras de tamaño grande debido a la eficiencia de la tecnología de la PCR. Este es el momento de considerar el desarrollo de nuevas estrategias para la selección que tomen en consideración las características genéticas, tales como la complejidad del genoma; la naturaleza y el número de los marcadores moleculares disponibles; la complejidad de los caracteres a mejorar; el número de plantas a las que se pueda hacer el despistaje en cada paso de la selección; y el número de poblaciones que se puedan manipular de manera concurrente. También es crucial explorar la complementariedad entre la selección asistida por marcadores y la selección convencional, y desarrollar estrategias integrales que integren, en forma estrecha e interactiva, ambos enfoques. La selección asistida por marcadores para el mejoramiento de caracteres poligénicos es una fase de transición importante, siendo éste un campo que está a punto de producir resultados convincentes. Los esfuerzos recientes en el análisis genético comparativo permiten la identificación, a través de diferentes especies de plantas, de las secuencias genéticas que participan en la expresión de los caracteres objetivo. Los alelos superiores identificados entre los genomas en esos genes objetivo se pueden usar como marcadores del ADN para desarrollar técnicas de despistaje eficientes. Por último, los desarrollos tecnológicos, incluida la automatización, los diagnósticos específicos para los alelos y las pastillas (“chips”) de ADN, harán que los enfoques de selección asistidos por marcadores, basados en el despistaje en gran escala, sean más poderosos y eficaces. Clonación basada en mapas La detección y clonación de genes bien diferenciados en el algodón, con una secuencia y función desconocida, cuando sólo se conocen su participación en caracteres específicos y su ubicación en los cromosomas, ha recibido el nombre de genética a la inversa. A diferencia de ello, los enfoques convencionales, donde un gen se clona sobre la base de una secuencia o producto conocido y después se le localiza en una región cromosómica, comienza con la localización de un gen en una región cromosómica específica mediante la determinación del vínculo del fenotipo que el mismo especifica con un conjunto de marcadores moleculares en sus flancos. Esos marcadores vinculados se usan entonces como puntos de partida para elaborar mapas físicos de la región que flanquea al gen con la electroforesis por pulsos en campo de gel y enzimas de restricción de corte raras. La cartografía en gran escala del sitio de restricción es necesaria, porque las distancias físicas y genéticas entre los marcadores pueden variar en varios órdenes de magnitud. Los mapas físicos son particularmente útiles en los cultivos poliploides, como el algodón, donde las secuencias duplicadas podrían impedir la asignación de marcadores a una sola ubicación bien diferenciada. La construcción y despistaje de bibliotecas del cromosoma artificial de la levadura (YAC, por sus siglas en inglés) es un próximo paso hacia el aislamiento de los genes deseados. Se MARZO 2002 15 seleccionan clonos que contengan por lo menos uno de los marcadores. Los fragmentos terminales de esos YAC se utilizan entonces para construir las zonas circundantes de la región genómica definida por los marcadores, con el fin de identificar el cADN derivado de ese lugar. Los cADN son divididos en secuencias y las secuencias candidatas retransformadas en hospederos heterólogos y homólogos apropiados para probar la identidad del gen por complementación en plantas transgénicas utilizando diferentes técnicas de transformación. Un prerrequisito absoluto para la clonación basada en mapas de los genes del algodonero es la disponibilidad de marcadores estrechamente vinculados que flanqueen el locus de interés. Esos marcadores se pueden encontrar por casualidad pero normalmente son el producto de un esfuerzo sistemático de saturación de un genoma con marcadores polimórficos del ADN. Debido a la dependencia económica del algodón en muchos países, es necesario concentrarse en reducir el costo de producción, en aumentar el rendimiento y la calidad, y en diversificar el espectro de productos de la fibra. Otro objetivo de la investigación algodonera consiste en permitir que las prácticas agrícolas y el procesamiento de la fibra sean menos dañinos para el medio ambiente. La tecnología de los marcadores moleculares ha permitido identificar genotipos que portan los caracteres deseados de manera eficiente y correcta. Ello podría ayudar en la selección de genotipos y reforzar los programas de selección convencional. Beckman, J.S. and M.Soller.1990. Toward a unified approach to genetic mapping of eukaryotes based on sequence tagged microsatellites sites. Biotechnology, 8: 930-932. Endriz, J. 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Resistencia de la fibra El algodón se cultiva por la fibra y a diferencia de otros productos básicos, se comercia basándose en parámetros cualitativos en vez de en el peso. La calidad de la fibra afecta los productos finales hechos de algodón. Si la calidad de la fibra es baja, el desempeño y la eficiencia de la hilatura se verán afectados en forma negativa. Las fibras débiles dan origen a una serie de problemas en la industria actual de la hilatura a alta velocidad, así como a la ruptura de la hilaza durante el procesamiento. Las fibras débiles contribuyen a debilitar la hilaza y por consiguiente, llevan a una calidad inferior de los géneros. Las fibras fuertes se pueden hilar a velocidades superiores, mejorando así los aspectos económicos de la formación de la hilaza. Por lo tanto se requieren fibras más fuertes para contrarrestar las pérdidas de resistencia de la hilaza obtenida con los nuevos procesos de la hilatura a alta velocidad. La resistencia de la fibra se comenzó a medir como práctica de rutina sólo cuando se desarrolló, hace unos sesenta años, el medidor de la resistencia Pressley. Cuando el medidor Pressley se popularizó, la mayoría de las variedades no daban mediciones superiores a las 75.000 libras por pulgada cuadrada. En la
