16. Oxígeno y metab

Oxidasas y oxigenasas
Especies reactivas y radicales libres
Antioxidantes
1
2 Fe2+ + ½ O2 → 2 Fe3+ + O2Fe3+ + 3H2O → Fe(OH)3 + 3H+
• Hace aproximadamente 2.700 millones de
•
•
•
años, surgió el oxígeno en la atmósfera
gracias a la fotosíntesis generadora de
oxígeno de las cianobacterias.
Actualmente hay 21 % de O2 en la
atmósfera.
El oxígeno le permite a los organismos
aerobios la obtención eficiente de energía,
actuando como aceptor final en las cadenas
de transporte de electrones, permite obtener
más energía que otros aceptores (como por
ejemplo azufre).
El oxígeno permitió también la formación de
la capa de ozono (O3) que, filtrando la
radiación solar, posibilitó el desarrollo de la
vida terrestre.
3
Tabla de
potenciales de
reducción
estándar
4



La oxidación es el efecto primario de la respiración en el
cuerpo, es un proceso natural que implica que el
oxígeno se reduce a agua mientras que diferentes
moléculas se oxidan, dando como resultado la
liberación de energía que se acumula bajo la forma de
ATP.
Por ej. la oxidación de glucosa (C6H12O6) a CO2 y la
reducción de oxígeno a agua.
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O
Nuestro cuerpo también usa la oxidación como defensa
contra microorganismos, porque las moléculas
oxidantes atacan a las células patógenas y éstas son
expulsadas de cuerpo a través del proceso normal de
eliminación.
Orbitales moleculares del dioxígeno


La molécula de dioxígeno
(O2) presenta dos
electrones desapareados
y tiene naturaleza de
birradical.
En general, las
reacciones del dioxígeno
con las moléculas
orgánicas son lentas
debido a restricciones de
espín.
6
Para poder utilizar al oxígeno, se necesitan enzimas
que lo utilizan como sustrato:
Oxidasas y oxigenasas
Todas (casi) tienen cofactores: metales de transición o
coenzimas orgánicas capaces de formar radicales
estables
7

El O2 acepta los electrones que le cede el sustrato, pero
sus átomos no aparecen en el producto sino que son
reducidos a superóxido (O2.-), peróxido de hidrógeno
(H2O2) o agua (H2O).

ejemplo: citocromo c oxidasa
4 cyt c (red) + O2 + 4 H+ → 4 cyt c (ox) + 2 H2O
8
9
Mecanismo de la citocromo c
oxidasa
10
Catalizan la desaminación oxidativa de aminoácidos
generando al mismo tiempo peróxido de hidrógeno
Aminoácido + FAD + H20  -ceto ácido + NH3 + FADH2
FADH2 + O2  FAD + H202
11
Existe incorporación de átomos del O2 al sustrato.
Se pueden dividir en dioxigenasas y monooxigenasas.
1) Dioxigenasas
los dos átomos del O2 se incorporan al sustrato
X + O2 → XO2
Ej. triptofano 2,3 dioxigenasa
12
2) Monooxigenasas
También llamadas hidroxilasas, oxidasas u oxigenasas
de función mixta.
Un átomo de oxígeno se incorpora al sustrato y el otro
se reduce a agua.
X + O2 + BH2 → XO + H2O + B
los cosustratos dadores de electrones pueden ser
flavinas (FADH2 o FMNH2), NAD(P)H,
tetrahidrobiopterina o ácido ascórbico.
Ej. enzimas con citocromo P450
13
14
Ciclo catalítico del citocromo P450
15
Descubrimiento del oxígeno y las
oxidaciones
Joseph Priestley (1733-1804)
"este aire tiene una naturaleza
exaltada"
Carl Wilhelm Scheele (1742-1786)
"aire fuego"
Antonie Laurent Lavoisier (1743-1794)
"oxígeno" (del griego oxys,
filoso)
Comparten el mérito de haber descubierto el oxígeno y la
oxidación.
Lavoisier, antes de ser ejecutado durante la revolución francesa ("La república
no precisa científicos!"), demostró que el aire estaba formado por un quinto de
oxígeno, que, por oposición al nitrógeno, mantenía la combustión de una vela
así como la vida de un ratón.
Ya Scheele y Priestley observaron que el oxígeno podía tener efectos nocivos16
El oxígeno es tóxico
• A pesar de que es necesario para los organismos aerobios,
el oxígeno es tóxico.
• Un ratón sometido a oxígeno 100 %, hiperbárico, se muere
en 40 minutos.
• Si fuera una droga, no estaría aprobada para el consumo
humano.
En 1954, Rebeca Gerschman (bioquímica argentina,
candidata al Nóbel en la década del 80) publica en
Science pruebas sobre el daño por hiperoxia y su
relación con el daño por radiación ionizante.
17
18
El oxígeno es tóxico
O2
e
O .2
e, + 2 H+
H2O2
-
e, - OH
.OH
e, + H+
H2O
Como subproducto del metabolismo aerobio, se forman
especies oxidantes y radicales libres que, en principio,
pueden reaccionar con prácticamente todos los
componentes de la célula, ácidos nucleicos, proteínas,
carbohidratos y lípidos.
19
20
Potenciales de reducción de las especies derivadas del oxígeno
Eº’ (V)
O2 + 4 H+ + 4 e- → 2 H20
+ 0.815
O2 + 2 H+ + 2 e- → H202
+ 0.281
H202 + 2 H+ + 2 e- → 2 H20
+ 1.349
O2 + e- → O2.-
- 0.33
O2.- + 2 H+ + e- → H202
+ 0.89
H202 + H+ + e- → H20 + .OH
+ 0.38
.OH
+ H+ + e- → H20
+ 2.31
21
•
•
Desde la aparición de una atmósfera rica en oxígeno hace
más de 2.000 millones de años, los seres vivos han tenido
que “aprender” a convivir con ella y en el caso de los
organismos aeróbicos, a utilizarla para aprovechar la
energía de multitud de compuestos químicos.
Sin embargo, al igual que un motor de combustión, las
reacciones de estos procesos no son perfectas y producen
fugas en forma de especies reactivas del oxígeno (ERO)
capaces de alterar enormemente el status quo celular.
• La evolución ha brindado herramientas a los
animales para protegerse, ya sea optimizando
la utilización del oxígeno en la mitocondria,
generando antioxidantes que los capture, o
rediseñando proteínas para eliminarlas.
• Como consecuencia, los animales que mejor
han sabido adaptarse a esta situación son
también los que poseen esperanzas de vida
más largas y menor probabilidad de sufrir un
amplio espectro de enfermedades.
23
.
2
O
.
2
O
H 2O2 O2
En 1969, McCord y Fridovich proponen que, a pesar de
que el radical superóxido (O2.-) es capaz de dismutar
espontáneamente en forma rápida, existe una enzima
capaz de catalizar este proceso.
Si existe una enzima que reacciona con el superóxido,
es porque el superóxido efectivamente se forma en
sistemas biológicos.
24
Es más, la superóxido dismutasa
(SOD) sería esencial para la vida
aerobia.
25
¿Qué son los radicales libres?
Un radical libre es un átomo o grupo de átomos
que tiene uno o más electrones desapareados
(la palabra “libre” es innecesaria)
Por ejemplo: Cu2+, H3C•, HO•, GS•, •NO, O2-•
-
26
¿De qué hablamos cuando
hablamos de radicales libres o
especies reactivas del oxígeno en
bioquímica?
27
 El O2 en estado basal (triplete) puede pasar al estado
singulete, donde sus electrones están apareados.
 Muy reactivo.
 Se puede formar por mecanismos fotoquímicos y no
fotoquímicos.
 En los mecanismos fotoquímicos, la formación de oxígeno
singulete depende de absorción de luz por moléculas fotosensibles
como porfirinas.
 También ocurre por exposición a luz UV.
 Uno de los principales mecanismos no fotoquímicos depende de la
reacción entre peróxido de hidrógeno e hipoclorito, que puede
ocurrir en neutrófilos activados que tienen mieloperoxidasa.
28
• Es el producto de reducción monoelectrónica del
dioxígeno
O2 + 1e- → O2.-
• Se forma a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial, por
autooxidación de moléculas pequeñas y por enzimas
específicas como la xantina oxidasa y la NAD(P)H
oxidasa.
• Es aniónico a pH neutro (pKa del ácido conjugado HO2 es
4.7) y por lo tanto no puede atravesar membranas.
29
- Puede actuar tanto como oxidante como
reductor
E ’(O2/O2.-) = -0.33 V
E ’(O2.-,2 H+/H2O2) = 0.89 V
- Su toxicidad es limitada.
- Puede dismutar espontánea o enzimáticamente
(con la superóxido dismutasa) a dioxígeno y
peróxido de hidrógeno.
30
• Se forma a partir de la dismutación del superóxido y por
acción de diferentes enzimas como xantina oxidasa y
glucosa oxidasa.
•
•
No es un radical libre, no tiene electrones desapareados.
Es un agente reductor y oxidante débil
E ’(O2.-, 2H+/H2O2) = 0.89 V
•
•
•
E ’(H2O2, H+/H2O, .OH) = 0.38 V
Es neutro y puede atravesar membranas biológicas.
Puede reaccionar directamente con tioles o metioninas,
inactivando enzimas.
O puede reaccionar con metales reducidos generando
una especie más reactiva, el radical hidroxilo, .OH.
31
Se genera, entre otros procesos, por radiaciones
ionizantes y por la reacción de Fenton
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + .OH + OH- Es la biomolécula más oxidante que existe
- E ’(.OH/OH-)= + 2.31 V
- Es tan reactivo que reacciona inmediatamente después
de su formación, con lo primero que encuentre.
32
Se forma por acción de la mieloperoxidasa de los neutrófilos.
(3)
H2O2
+
+
H
+
Cl
HOCl + H2O
- No es un radical libre
- Parcialmente aniónico (como hipoclorito) a pH neutro (pKa =
7.5).
- Especie altamente oxidante
E (2HOCl, 2H+/2H2O, Cl2) = 1.63 V
E (OCl-, H2O/ Cl-, 2OH-) = 0.89 V
- Participa en reacciones de oxidación y cloración.
33
- Se forma enzimáticamente con las óxido nítrico
sintasas, a partir de arginina, NADPH y oxígeno.
- Gas hidrofóbico y poco reactivo, es capaz de difundir
y atravesar membranas.
- Es un radical libre.
- Es un importante mensajero celular.
34
- Reacciona con el hierro ferroso de la guanilato
ciclasa formando un complejo hemo-nitrosilo
importante en la transducción de señales.
- Reacciona con la oxihemoglobina formando
nitrato.
- Puede reaccionar con el radical superóxido
para formar peroxinitrito, un oxidante muy
potente.
35
Peroxinitrito (ONOO-)
- Se forma de la reacción, limitada por difusión, de los
dos radicales libres óxido nítrico y superóxido.
(6)
.
NO +
.O2
ONOO -
- Es una molécula oxidante
E ’(ONOO-, 2H+/.NO2, H2O) = 1.65 V
E ’(ONOO-, 2H+/NO2-, H2O) = 1.35 V.
- A pH fisiológico, 80 % está ionizado, pues el pKa del
ONOOH es 6.8.
- Difunde, atravesando membranas biológicas en forma
de ONOOH.
- Puede reaccionar con tioles y centros metálicos.
36
- Puede reaccionar con dióxido de carbono formando
carbonato radical (CO3·-) y dióxido de nitrógeno (·NO2).
- Puede formar nitrotirosina.
O
O
NH3+
HO
NO2
37
38
Los ERO se forman constantemente en las células.
- Aproximadamente 2 % del oxígeno consumido se convierte
en especies reactivas en lugar de agua.
- Algunas especies se forman como subproductos
minoritarios de los procesos enzimáticos.
- Otros se forman deliberadamente. Por ejemplo, se forma
superóxido gracias a la NAD(P)H oxidasa de los macrófagos
en procesos inflamatorios.
- Algunos factores ambientales (drogas, radiaciones, humo
de tabaco) pueden aumentar la formación de radicales libres.
 NADPH oxidasas de células fagocíticas y no fagocíticas.
 Mieloperoxidasa.
 Cadena de transporte de electrones mitocondrial
 complejo I (NADH deshidrogenasa)
 complejo III (coenzima Q).
 Oxidasas como monoamino oxidasa, xantina oxidasa.
 Radiación ionizante.
 Óxido nítrico sintasa.
 NOS constitutiva, bajas concentraciones, efectos señalizadores.
 NOS inducible, altas concentraciones, efectos potencialmente tóxicos.
 Enzimas con citocromo P450
 Lipoxigenasa
40
41



La función biológica de estas enzimas está
relacionada con la generación de ERO.
La NADPH-oxidasa cataliza la transferencia de un
electrón desde el NADPH hacia el O2 con la
formación de radical superóxido (O2.-).
2 O2 + NADPH
2 O2.- + NADP+ + H+
Durante la transferencia de electrones, estos pasan
desde el NADPH hacia el FAD, de este a los grupos
hemo y de estos al O2.


Las NOX son una familia de proteínas
transmembrana que transfieren electrones a
través de las membranas biológicas.
Es una familia de enzimas, constituidas por
◦ la NADPH oxidasa fagocitaria (NOX2/gp91phox)
◦ No fagocitaria: NOX1, NOX3, NOX4, NOX5,
DUOX1 and DUOX2.

Los mecanismos de activación y la
distribución tisular de los diferentes
miembros de la familia son marcadamente
diferentes.
(a) Generación de oxidantes en el fagosoma de neutrófilos luego de la ingestión de una bacteria. La NOX2
se activa en la membrana fagosomal y los electrones se transfieren desde el NADPH a través de la
membrana al oxígeno , generando superóxido, que dismuta a peróxido de hidrógeno. La degranulación
libera (junto con otras proteínas) mieloperoxidasa (MPO), que genera ácido hipocloroso.
(b) Mecanismo propuesto para la generación de oxidantes por la NOX1. Esta enzima se activa por unión de
ligando al receptor de membrana AT1R que se encuentra en el músculo liso vascular. La activación del
receptor (AT1R) por angiotensin II (Ang II), causa el ensamblaje de los componentes de la NOX1 en la
membrana, generándose superóxido a expensas de oxígeno y los electrones del NADPH.
44

Las funciones fisiológicas de las NOX incluyen:
◦
◦
◦
◦
◦

defensa contra las infecciones
procesamiento postraduccional de proteínas
mecanismos de señalización celular
regulación de la expresión génica
diferenciación celular.
Las NOX también contribuyen a un gran rango de
procesos patológicos
◦ La deficiencia de la NOX puede llevar a inmunosupresión
(enfermedad granulomatosa crónica).
◦ La actividad aumentada contribuye a un gran número de
patologías, en particular a enfermedades cardiovasculares y
neurológicas.


Los leucocitos humanos, son movilizados a los
sitios de inflamación donde destruyen a los
agentes invasores a través de la liberación de
especies reactivas del oxígeno (ERO) y enzimas
proteolíticas.
Una vez en el sitio de infección los
monocitos/macrófagos se “activan”, adquiriendo la
capacidad de producir ERO



Frecuentemente la activación
leucocitaria se desencadena
por el contacto y/o fagocitosis
de un micoorganismo
Se caracteriza por un aumento
del consumo de O2, proceso
denominado "estallido
respiratorio",
Este estallido, se debe al
consumo de O2 por la
NADPH-oxidasa.



La actividad de la NADPH-oxidasa fagocítica constituye
una de las fuentes endógenas más importantes de
especies reactivas del oxígeno en el organismo.
Este sistema enzimático está constituido por varias
proteínas, que se encuentran distribuidas en diferentes
compartimentos celulares cuando el leucocito está en
reposo.
Durante la activación leucocitaria, los diferentes
componentes son traslocados hacia la membrana
plasmática o fagocítica donde experimentan un proceso
de ensamblaje que conforma el sistema enzimático
activo.






Flavocitocromo b558 (gp91phox + p22phox)
p47-phox
p67-phox
p40-phox
Rap1A
Rac2
49






Es un heterodímero que se localiza en la membrana de
gránulos específicos ( 90 %) y la membrana plasmática (
10 %) cuando la célula está en reposo.
Después de la activación es transferido a la membrana
plasmática o la de los fagosomas.
Es una flavoproteína que contiene 2 grupos hemo.
Está compuesto por 2 subunidades diferentes: una
glicoproteína de 91 kDa (gp91-phox) y otra proteína no
glicosilada de 22 kDa (p22-phox).
La subunidad gp91-phox posee los sitios de unión para el
FAD y el NADPH.
Es el componente central de la NADPH-oxidasa, pues
contiene todos los elementos que le permiten transportar
los electrones desde el NADPH hasta el O2.



p47-phox: Se localiza en el citosol en forma libre y
formando parte de un complejo de 240 kDa con p67phox y p40-phox. Parece ser el primer componente
citosólico que interactúa con el flavocitocromo b558
durante el ensamblaje. Posee una región catiónica con
múltiples sitios de fosforilación de Ser/Thr quinasa
relacionado con su función reguladora.
p67-phox: Se encuentra en el citosol unido al complejo
de 240 kDa cuando el leucocito está en reposo. Comparte
la unión al NADPH con gp91-phox.
p40-phox: Es el tercer componente del complejo
citosólico. Puede regular negativamente la actividad del
complejo y se ha demostrado que en la activación sufre
varias fosforilaciones.
51


Rap1A: Es una proteína de la superfamilia Ras de
proteínas de unión al GTP. Se asocia estrechamente
con el flavocitocromo b en la activación. Puede
activar a la proteína quinasa C y participar así en la
regulación del complejo.
Rac2: Es una proteína de unión al GTP que se
encuentra en el citosol durante el reposo, unida a
un factor de intercambio de nucleótidos de guanina
(Rho-GDI). Con la activación intercambia GDP por
GTP, se disocia del factor y es translocada a la
membrana plasmática simultánea e
independientemente del complejo de 240 kDa.
52


En el reposo, el complejo
citosólico se mantiene
estabilizado a través de
diferentes interacciones
En la activación:
◦ p47-phox es fosforilada.
◦ El complejo es translocado a la
membrana donde la p47-phox se
libera de su unión a p67-phox que
establece un enlace de alta afinidad
con el flavocitocromo b558.


El O2.- es rápidamente
convertido en peróxido de
hidrógeno, radical hidroxilo
y ácido hipocloroso (por
acción de la MPO).
Estos, junto a los derivados
reactivos del nitrógeno y al
contenido de los gránulos
constituyen el mecanismo
fundamental de defensa
inmune innata.
54
(3)




H2O2
+
+
H
+
Cl
HOCl + H2O
Es una hemoproteína
Es parte del sistema de defensa de los PMN.
Es responsable de la actividad anti
microbiana contra un amplio espectro de
organismos.
En los PMN estimulados, la MPO cataliza la
producción ácidos hipohalogenosos,
principalmente ácido hipocloroso, y otros
intermediarios tóxicos que aumentan
poderosamente la actividad microbicida.
55
También el medio ambiente
Humo de tabaco
- Tanto la fase gaseosa como la fracción particulada
contienen oxidantes y radicales libres (O2.-, H2O2,
.NO, .NO , ONOO-, aldehídos reactivos y CO).
2
- 1017 moléculas oxidantes por cigarrillo, presentes
en el humo o generadas a partir de él (por ejemplo,
por autooxidación de hidroquinonas).
- El humo de tabaco, además, ocasiona una
respuesta inflamatoria en el pulmón en la cual los
leucocitos forman aún más radicales libres.
57
Qué nos mantiene vivos y “sanos” (por algunos
años) a pesar de la generación continua de ER?
58

De alto peso molecular
◦ Enzimáticas
◦ Proteínas capaces de transporte e inactivación de
metales de transición (ceruloplasmina, ferredoxina,
transferrina, etc.)

No enzimáticas
59
•Catalasa, es una hemoproteína
2 H2O2
O 2 + 2 H 2O
•Superoxido dismutasa
2 O2•- + 2 H+
O2 + H2O2
Tres Isoformas:
SOD1 o Cu/Zn-SOD,
SOD2 o Mn-SOD
SOD3 o Fe-SOD
•Glutatión peroxidasa (GP)
H2O2 + 2 GSH
H2O + GSSG
Selenoproteína, actúa junto a la
• Glutatión reductasa (GR)
GSSG + NADPH
H2O2
NADP+
2GSH
GP
H2O
2 GSH + NADP+
GR
GSSG
NADPH+H+
61
•Peroxirredoxina
(Prx)
H2O2 + Trx(SH)2
H2O + Trx(S)2
Con tiol reactivo, actúa con
•Tiorredoxina reductasa (TrxR)
Trx(S)2 + NADPH
H2O2
Trx(SH)2
Prx
H2O
Trx(SH)2 + NADP+
NADP+
TrxR
Trx(S)2
NADPH+H+
62
vitamina E
ácido ascórbico
coenzima Q
ácido úrico
carotenoides
flavonoides
63
CH3
CH3
O
CH3
(CH2)3CH(CH2)3CH(CH2)3CH(CH3)2
CH3
O
CH3
CH3
Reacción con peróxidos lipídicos:
LOO + TOH
LOOH + TO
Reciclaje con ascorbato
OH
O
HO
OH
O
HO
O
O
+ TO
OH
O
AscH
+ TOH
O
O
Asc
64
Concepto clásico de estrés oxidativo
Sies, 1985
Desbalance entre la producción de especies
reactivas y las defensas antioxidantes
65
66
1. Oxidación de lípidos
67
L-H + X
L + XH
Iniciación
3 x 108 M-1 s-1
L + O2
LOO
40 M-1 s-1
LOO + L-H
L + LOOH
LOO + “R
LOOR
”
Ciclo de
Propagación
Terminación
68
El oxidante abstrae un
átomo de hidrógeno de
un metileno bis-alílico.
Energía de disociación
de: C-H alquílico: 104
kcal/mol
C-H bis-alílico: 80
kcal/mol
Se forma un radical
estabilizado por
resonancia.
69
Reacción en cadena
La lipoperoxidación lipídica es un ejemplo de una
reacción en cadena, donde un iniciador comienza el
proceso oxidando un lípido y formando un radical
libre que es capaz de reaccionar con oxígeno
formando una especie secundaria capaz, a su vez,
de oxidar otro lípido.
Un único evento de oxidación da lugar a la
formación de múltiples oxidantes secundarios como
resultado de la reacción en cadena dependiente de
oxígeno.
... y la manteca se puso rancia...
70
Determinación de especies
reactivas al ácido tiobarbitúrico
(marcador de oxidación de
lipídos) en plasma de
personas fumadoras y no
fumadoras.
Yamaguchi, Eur J Clin Invest
35:186, 2005.
71
2. Oxidación de ácidos
nucleicos
72
• El ADN es susceptible a la oxidación.
•1.5 x 105 golpes oxidativos por célula, por día.
•1019 golpes oxidativos por persona.
•Importancia: mutagénesis, cáncer.
• El ADN mitocondrial es más susceptible a la
oxidación que el nuclear.
• Mitocondria: 125 8-hidroxiguaninas por cada 1 x 106
bases.
• Núcleo: 8 8-hidroxiguaninas por cada 1 x 106 bases en
núcleo.
• El ADN puede ser dañado por oxidantes fuertes
como ·OH y H2O2/Fe2+
• El daño puede ocurrir inicialmente en las bases o
en el azúcar.
• Simple hebra: 7% al azúcar.
• Doble hebra: 20% al azúcar.
73
O
-
N7
O
O P O CH 2
-O
4'
3'
4
8 9
3
NH
1
2
N
N
O
6
5
NH 2
O
1'
2'
HN3
O
2
O P O CH 2 O
O
O
4'
3'OH
CH 3
4
5
6
1
N
1'
2'
Abstracción de ·H del azúcar: 1 x 109 M-1 s-1
·OH Adición a doble enlace de la base: 1 x 1010 M-1 s-1
Reacción con el fosfato: 1 x 107 M-1 s-1
74
Ataque oxidativo al azúcar
Si no es reparado, lleva a la ruptura del esqueleto fosfatodesoxirribosa del ADN.
Base
Base
P O CH2
4'
O
sugar
O
P O
.
O
sugar
O
sugar
O
-
O P O
O
CH2
P O CH2
N
Base
N
N
-
O P O
O
CH2
O
sugar
Base
N
P O
•Las rupturas en una hebra del ADN pueden causar daño, aunque
suelen ser reparadas.
•Las rupturas en dos hebras suelen llevar a la muerte de la célula.
75
NH2
O
N
H
N
N
N
H
HN
N
OH
H2N
N
O
OH
O
N
H
O
H
HN
N
H
O
5-hydroxymethyluracil
OH
N
H
H
O
H
5-hydroxy-6-hydrouracil
5-hydroxyuracil
H2N
NH2
N
4,6-Diamino-5formamidopyrimidine
NH CHO
N
O
2,6-Diamino-4-hydroxyformamidopyrimidine
N
H
8,5'-cyclo-2'-deoxyadenosine
O
CH3
OH
OH
H
HN
N
H
Thymine glycol
(cis and trans)
N
H
5-hydroxy-6hydrothymine
N
NH2
NH
O
CH3
H
H
H
N
H
5,6-dihydrothymine
NH2
H
HO
H
H
H
HN
O
O
N
N
CH3
OH
H
H
HN
NH2
N
NH2
HO
O
O
HN
NH CHO
OH
N
H
O
N
O
OH
HN
NH2
H
H
OH
5-hydroxy
hydantoin
O
CH2OH
HN
N
H
O
HN
8-hydroxyguanine
8-hydroxyadenine
O
N
O
N
N
NH2
H
H
OH
H
8,5'-cyclo-2'-deoxyguanosine
N
O
OH
OH
N
H
H
Cytosine glycol
N
O
O
OH
N
H
5-hydroxycytosine
HN
OH
N
H
5,6-dihydroxy
uracil
O
HN
OH
O
CH3
N
OH
H
5-hydroxy-5methylhydantoin
O
76
La 8-hidroxiguanina es utilizada como
marcador de daño oxidativo al ADN
cil
NH2
O
N
H
N
N
N
H
HN
N
OH
H2N
N
N
N
H
OH
O
8-hydroxyguanine
8-hydroxyadenine
O
O
HN
N
H
H
OH
5-hydroxy
hydantoin
O
Existen
métodos adecuados de medida
HN
Ho HPLC/EC
GC/MS
H2N
N
N
OH
O
N
H
OH
H
Es una
de las lesiones predominantes
5-hydroxymethyluracil
5-hydroxy-6-hydrouracil
5-hydroxyuracil
8-hydroxyguanine
O
HN
N
HN
O
N
CH2OH
O
O
H
HN
N
H
O
OH
N
H
OH
HN
H
O
H
N
H
5-hydroxy
hydantoin
NH2
O
ON
N
HN
HN
NH CHO
H
NH CHO
O
H2N
NH2
NH2
N
OH
4,6-Diamino-5-
OH
HN
2,6-Diamino-4-hydroxyEjemplo:
la 8formamidopyrimidine
formamidopyrimidine
HEn fumadores,
O
N
N
H H
H
hidroxiguanina
estáO aumentada,
en
5-hydroxy-6-hydrouracil
plasma y orina. 5-hydroxyuracil
NH2
N
O
N
N
HO
H
O
N
H
OH
2
N
H
H
H
O
8,5'-cyclo-2'-deoxyadenosine
HN
NH CHO
NH2
amino-5-
H2N
NH
HO
N
O
N
N
NH2
H
H
OH
H
8,5'-cyclo-2'-deoxyguanosine
NH CHO
NH2
2,6-Diamino-4-hydroxy-
Yamaguchi, Eur J Clin Invest 35:186,
77
Mutagénesis
Una lesión oxidativa puede causar una mutación
cuando la ADN polimerasa “lee mal” durante la
replicación .
Por ejemplo, la 8-hidroxiguanina
8-h ydr oxygu an in e lleva a una
transversión G-T.O
O
HN
N
N
HN
N
Basepair s
NH
A T
H2N
N
N
H
OH
H2N
8 OH-Gu a (en ol)
H
N
H2N
N
H
O
8 oxo-Gu a (k et o)
O
N
H
H N
G C
8 OHdG A
H
NH
N
N
N
H
N
N
H
8 OH-Gu a
N
H
Aden in e
O
78
3. Oxidación de proteínas
79

Esqueleto - abstracción primaria de átomo de
hidrógeno a nivel del carbono alfa.
O
R
R
N
H H O
H
N
HO.
R
Puede resultar en fragmentación

R
O
N
H
H
N
.
O
Cadenas laterales - 20 tipos diferentes
◦ Abstracción de hidrógeno (con
aminoácidos alifáticos)
◦ Adición (con aminoácidos aromáticos)
Puede resultar en la alteración de las cadenas
laterales
80
◦ Se forma un radical proteico a nivel del carbono
alfa.
◦ En presencia de oxígeno se puede formar un
radical peroxilo.
◦ Si un radical reacciona con otro se puede formar
un agregado covalente.
◦ Puede llegar a fragmentarse la cadena
R
H
O
R
H
O- R.
RH
N
N
polipeptídica.
N
N
O R
.
OO
H
O R OOH
H
reduction
-HO 2.
R
O
N
O
R
N
H
R
H
N
O
.
O R
O
N
H
H 2O
R
NH2
O
+
O
O
R
R
N
H
H
N
O
O
R
+
.
O
N
H
81
 Los veinte aminoácidos pueden ser
eventualmente oxidados por diferentes especies
reactivas.
 Los más reactivos son los azufrados y los
aromáticos.
 A partir de los aminoácidos alifáticos suelen
obtenerse peróxidos, alcoholes y carbonilos.
 El daño inicial a nivel de un sitio de la proteína
puede ser transferido a otro sitio.
82
Modificaciones de aminoácidos
alifáticos
Glutamato
Lisina
hidroperóxidos
4-hidroxiglutamato
Leucina
hidroperóxidos
Prolina
alcoholes
-cetoisocaproato
isovalerato
isovaleraldehído Arginina
carbonilos
Valina
hidroperóxidos
alcoholes
carbonilos
Isoleucine
hidroperóxidos
alcoholes
carbonilos
hidroperóxidos
alcoholes
carbonilos
hydroperoxidos
5-hidroxi-2-aminovalerico
hidroperóxidos
alcoholes
carbonilos
83
Oxidación de cisteína y metionina



Los aminoácidos azufrados son blancos
importantes, reaccionan rápido con muchos
oxidantes y son fácilmente oxidables.
La metionina se convierte en metionina sulfóxido.
-SCH3
-S(=O)CH3
La cisteína puede oxidarse al disulfuro cistina u
oxiácidos.
RSH
radical
RSH
RSSR (cystine) via thiyl
RS-X, RSOH, RSO2H, RSO3H
La formación de metionina sulfóxido, cistina o
cisteínsulfínico son las únicas modificaciones
proteicas que pueden ser reparadas
enzimáticamente.
84
Oxidación de aminoácidos aromáticos
OH
O
Fenilalanina
o-, m-tirosina
dimeros
O
HN
HN
Phenylalanine
ortho-Tyrosine (o-Tyr)
O
HO
HN
meta-Tyrosine (m-Tyr)
Tirosina
DOPA
ditirosina
O
HN
HO
Triptofano
N-formylkinurenina
kinurenina
5-hidroxitriptofano
7-hidroxitriptofano
O
HO
HN
HO
Tyrosine
3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)
O
NH
O
OH
HN
HO
Histidina
di-Tyrosine (di-Tyr)
O
O
2-oxo-histidina
N
N
Free Radic. Biol. Med., 1999, 27,
1151-1163
N
H
NH
O
N
NH
85
Algunas modificaciones de aminoácidos tienen
utilidad como marcadores de eventos oxidativos
Determinación de nitrotirosina
(marcador de especies
reactivas derivadas del óxido
nítrico) en plasma de personas
fumadoras y no fumadoras.
Yamaguchi, Eur J Clin Invest
35:186, 2005.
O
O
NH3+
HO
NO2
86
CARBONILOS
La formación de carbonilos en las proteínas es muy
utilizada como marcador de estrés oxidativo.
Métodos: reacción de los carbonilos con
dinitrofenilhidracina, reducción de los carbonilos con
borhidruro tritiado, anticuerpos anti-carbonilos.
Los carbonilos se forman por reacción directa de la
proteína con especies oxidantes o secundariamente a la
reacción de la proteína con carbohidratos o lípidos
oxidados.
87
Carbonilos en homogenatos de
mosca
Los carbonilos en las moscas
aumentan con la edad.
Sohal RS, 1993, PNAS 90:7255
Carbonilos en fibroblastos
cultivados de humanos.
progeria
Werner’s
Los carbonilos en los humanos
aumentan con la edad.
Oliver CN, 1987, JBC 262:5488
88
Carbonilos en mosquitas caminadoras y voladoras
Sohal RS, 1993, PNAS 90:7255
voladoras
caminadoras
caminadoras
voladoras
89
Supervivencia máxima versus tasa metabólica para diferentes
especies
90
•Cardiovasculares:
•Aterosclerosis
•Isquemia/reperfusión
•Neurológicas
•Parkinson
•Esclerosis lateral amiotrófica
•Alzheimer
•Cáncer
•Diabetes
•Fibrosis quística
•Hiperoxia
•Enfisema
•Osteoartrosis
•...
91



Las especies reactivas del oxígeno (ERO) juegan un rol
clave en el proceso arteriosclerótico al provocar serie de
cambios moleculares que llevan a la infiltración
macrofágica en el endotelio y a la formación de placas.
Las ERO generan LDL oxidada, activan a metalopeptidasas
de la matríz extracelular (MMPs), estimulan el crecimiento
del músculo liso vascular, e inducen la producción de
citoquinas y moléculas de adhesión inflamatorias (ICAM-1
y VCAM-1).
Las ERO están también involucradas en la disfunción
endotelial debida a inactivación del óxido nítrico (NO), un
potente vasodilatador y antiagregante plaquetario.



El sistema nervioso consume alrededor de un 20%
del oxígeno consumido por el organismo y como
resultado produce grandes cantidades de ERO.
Adicionalmente, el sistema nervioso es
particularmente sensible al estrés oxidativo por el
alto porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados en
las membranas
La generación de ERO por las NOX ha sido
involucrado en una variedad de enfermedades del
SNC tales como esclerosis lateral amiotrófica,
infarto cerebral, enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson, y demencia del HIV.
94
Además de sus roles tóxicos, en los últimos años se ha
recopilado mucha evidencia de que las especies reactivas
tienen roles señalizadores.
Esto ha llevado a una nueva definición de estrés
oxidativo.
En el estrés oxidativo ocurriría un desbalance a nivel de
la señalización redox y su control (Hansen, 2006).
Esto contrasta con el concepto clásico de estrés oxidativo
como desbalance entre la producción de especies
reactivas y las defensas antioxidantes
95