clase 3

Microbiología
Ambiental
5to Semestre 2016, LGA
1 Clase 3:
o  Estructura y replicación del ADN.
o  Plásmidos bacterianos: concepto y
significado biológico.
o  Mutaciones. Tipos de mutaciones.
Agentes mutágenos.
o  Recombinación genética: concepto,
conjugación, transformación y
transducción.
o  Relevancia sanitaria & ambiental
2 Estructura y replicación del ADN Genoma: conjunto de
elementos genéticos.
En procariotas los elementos
genéticos son:
ü  Cromosomas
ü  Elementos no cromosómicos:
plásmidos, virus y Transposones
El material genético de las bacterias se encuentra en
el citoplasma: nucleoide, cuerpo nuclear o región
nuclear.
3 Estructura y replicación del ADN Cromosoma bacteriano: doble
cadena de ADN (~1 mm de
longitud), circular y
cerrada de manera covalente. El ADN bacteriano no está
rodeado por una membrana,
tiende a aglomerarse como
una estructura definida: el
nucleoide
La célula bacteriana es
haploide, existe una copia
sencilla de cada gen.
4 Comparación tamaños genomas
5 Tamaño depende de estilo de vida…
Giovannoni et al. 2005
6 Estructura y replicación del ADN Los procesos genéticos requieren
tres tipos de polímeros:
o  Acido Desoxirribonucleico
(ADN).
o  Acido Ribonucleico (ARN).
o  Proteínas.
7 Componentes de los Ácidos Nucleicos
Las cadenas poliméricas de los ácidos
nucleicos están conformadas por monómeros,
denominado NUCLEÓTIDOS constituidos por:
o  Un azúcar pentosa (ribosa o desoxirribosa,
según el ácido nucleico)
o  Un grupo fosfato
o  Una base nitrogenada (purina o
pirimidina).
8 Componentes de los Ácidos Nucleicos
•  Las purinas de una cadena
forman puentes de
hidrógeno con las
pirimidinas.
•  El par A-T con 2 uniones
•  El par G-C con tres
uniones.
•  Cada una de las cuatro
bases esta unida a una
fosfo-2’-desoxirribosa
para formar un nucleótido.
•  El contenido de pares GC
es herramienta taxonómica
9 ADN
•  La longitud de una molécula de
ADN se expresa en miles de
pares de bases o en kilobases
(kb).
•  Por ejemplo: el cromosoma de
una bacteria, E. coli, tiene
4,500,000 pares de bases o 4500
kb.
10 ARN
Existen 3 diferencias entre la química del
ADN y la del ARN :
1.  Las macromoléculas del ARN contienen el
azúcar ribosa en lugar de desoxirribosa.
2.  El ARN tiene la base uracilo en lugar de
timina.
3.  El ARN no es una molécula de tira doble,
sin embargo,se puede doblar sobre si
misma en regiones complementarias.
11 ARN
Las bacterias contienen 3 tipos de RNA:
1. ARNm: (mensajero), su función es copiar el
código genético del gen (DNA cromosómico) y
llevar este mensaje al sitio de síntesis de
proteínas (Ribosomas).
2. ARNt (transferencia,
"adaptadoras”),traducción del mensaje de RNA
en una secuencia específica de aminoácidos.
3. ARN (ribosomal) síntesis de proteínas.
12 ARN Ribosomal
21 Proteínas
16S rRNA
Ribosoma
5S rRNA
34 Proteínas
23S rRNA
Escherichia coli
16S rRNA
13 Enzimas
1. 
2. 
3. 
4. 
5. 
6. 
Topoisomerasa II: promueve el superenrollamiento
(ADN girasa)
Toposiomerasa I: controla el desenrrollamiento.
ARN polimerasa: hace que las dos tiras de ADN se
desenrollen de modo que se pueda transcribir la
información.
ADN ligasa: une los fragmentos sintetizados.
Primasa: inicia la síntesis de un fragmento roto.
Endonucleasas de restricción: causan rupturas en
la doble cadena en secuencias especÍficas que
presenten simetría binaria
14 Elementos no cromosómicos:
Plásmidos 15 Plásmidos
•  ADN bicatenario (circular)
•  Tamaño de 1- 100 Kpb
•  Pueden haber varias copias en la misma
célula
•  Pueden haber varios plásmidos diferentes
(compatibles) en la misma célula
•  Los plásmidos son generalmente elementos
que se replican independientemente del
cromosoma del hospedador.
•  No tienen formas extracelulares en la
naturaleza
16 Plásmidos
Confieren ventajas al hospedador
determinadas condiciones:
en
ü  Resistencia antibióticos
ü  enzimas para degradación de compuestos
orgánicos
ü  rutas metabólicas especiales
•  Se pueden transferir mediante contacto
célula-célula.
17 Plásmido R (resistencia)
Confieren resistencia a inhibidores del
crecimiento:
• Antibióticos
•  Metales pesados
Otras funciones codificadas
por plásmidos:
•  Factores de virulencia
•  Degradación de compuestos
recalcitrantes (ej tolueno)
• Producción de bacteriocinas
• Fijación de Nitrógeno
18 Plásmidos conjugativos
•  Gobiernan su propia transferencia de
una célula a otra por contacto.
•  La transmisibilidad por conjugación
esta controlada por un conjunto de
genes (región tra) dentro del
plásmido.
•  Los no-conjugativos no pueden
iniciar la conjugación, sólo se
transfieren con la asistencia de
plásmidos conjugativos
19 Plásmidos de diseño
•  las técnicas de ingeniería genética
han hecho posible la construcción en
el laboratorio de un número
ilimitado de nuevos plásmidos
artificiales.
•  Incorporación de genes de una amplia
variedad de orígenes
•  Aplicación en biología molecular,
terapias génicas, biotecnología
20 Elementos no cromosómicos:
Virus 21 Virus
•  Parásitos obligados
•  Pequeños (20-200nm)
Ciclo de vida en dos fases:
•  Fase extracelular no activa (virión)
•  Fase intracelular (replicación)
modifican el funcionamiento celular
(hospedador) para su propia
subsistencia
22 Ciclos lítico y lisogénico
23 Elementos no cromosómicos:
Elementos genéticos
transponibles
24 Elementos genéticos
transponibles
•  Pueden “moverse” de un lugar a otro del DNA
•  Se replican con la molécula de ADN en la cual
están insertos
En procariotas:
1. Secuencias de inserción (IS)
•  750 –1600 pb
•  gen tnp codifica la transposasa
•  secuencias repetidas inversas en extremos
2. Transposones:
•  IS (dos) + otros genes
•  (ej. resistencia a antibióticos)
3. Algunos virus: bacteriófago Mu
25 Cómo se genera la
variación genética?
26 Replicación del ADN
o  Proceso por el cual el ADN que contiene el
código genético se duplica.
o  El producto son dos moléculas, es decir
las dos cadenas se convierten en cuatro.
o  La división es semi-conservadora, las dos
dobles hélices de la progenie constan de
una molécula de la progenie y otra de la
madre, es decir una “nueva” y la otra
“vieja”
Errores durante la replicación:
introducción de variabilidad
genética
27 Replicación del ADN
28 Replicación del ADN
29 Variaciones en la información
genética
La variación en la constitución genética se
puede dar por dos procesos:
1.  La mutación: origina un cambio heredable
en la secuencia de bases del ADN
bacteriano.
2.  La recombinación genética: involucra la
transferencia de ADN entre una bacteria
donadora y otra receptora y la
integración del material transferido al
genoma de la bacteria receptora.
30 Mutaciones
•  Cambio heredable en la secuencia de bases del
ácido nucleico que constituye el genoma de un
organismo.
•  Los errores en la replicación introducen
mutaciones a una velocidad baja 10-9 10-12.
•  Corrección de lectura: ADN polimerasa ejerce
también una actividad 3’-5’exonucleasa que
consiste en remover nucleótidos mal insertados y
reemplazarlo por el correcto.
•  Existen proteínas endonucleolíticas que suprimen
nt insertados erróneamente mucho después que la
polimerasa ha pasado.
•  Los sistemas de reparación (especialmente el SOS)
también tienen errores ocasionando mutaciones
31 Mutaciones
Un mutante diferirá de su progenitor en su
genotipo y fenotipo (no siempre).
ü  Genotipo: constitución génica precisa de
un organismo. (conjunto de genes)
ü  Fenotipo: propiedades visibles de un
organismo
ü  Cepa salvaje o silvestre: cepa aislada de
la naturaleza
Pueden ocurrir cambios perjudiciales,
neutros o beneficiosos.
32 Tipos de mutaciones
o  Selectivas: confiere al mutante una
ventaja, ej. Resistencia a fármacos: el
mutante es capaz de crecer en presencia de
un antibiótico que inhibe a la cepa
parental.
o  No selectivas: No confieren ventajas o
desventajas.
o  Nutricionales: cambian el requerimiento de
factores de crecimiento (cepas auxótrofas
y protótrofas).
33 Tipos de mutaciones
Puntuales:
-Sustitución
(transición)
de
una
pirimidina
por
otra
-Sustitución de una pirimidina por una purina
(transversión)
-Inserciones o deleciones de uno o unos pocos
nucleótidos que ocasionan corrimiento del
marco de lectura
De muchos pares de bases:
-Inserciones
o
deleciones
segmentos de ADN
de
grandes
34 Efectos de las mutaciones
UAC
Codón de
tirosina
CAC
Codón de
histidina
UAU
UAG
Codón de
terminación
PROTEÍNA DEFECTUOSA PROTEÍNA INCOMPLETA MUTACIÓN DE CONTRASENTIDO MUTACIÓN SIN SENTIDO Codón de
tirosina
PROTEÍNA NORMAL MUTACIÓN SILENCIOSA 35 Corrimiento marco de lectura
THE FAT CAT SAT
36 Corrimiento marco de lectura
THE FAT CAT SAT
HEF ATC ATS AT
37 Recombinación genética
o  Proceso mediante el cual los elementos
genéticos de dos orígenes diferentes se
reúnen en una sola unidad.
o  Se transfieren genes completos, grupos de
genes o cromosomas completos.
o  En los procariotas se da por la inserción
en una célula receptora de un fragmento de
ADN genéticamente diferente derivado de
una célula donadora
38 Fuentes de ADN para
recombinación
ü Transformación
ü Transducción
ü Conjugación
39 Transformación
o  ADN libre se incorpora a la célula
receptora y provoca un cambio genético.
o  Una célula capaz de adquirir una molécula
de ADN y transformarse se dice que es
competente (propiedad heredada por el
organismo).
o  Intervienen proteínas especiales en el
transporte e incorporación del DNA.
o  Durante la replicación de este ADN
híbrido, se forma una molécula parental y
otra recombinante.
o  El ADN viral también puede participar en
la transformación mediante el proceso
denominado transfección.
40 Competencia inducida
Experimentos con E. coli han encontrado
métodos de inducción artificial :
o  Tratamiento con cloruro de calcio y
shock térmico.
o  Electroporación: las células se
exponen a campos eléctricos pulsados
para abrir pequeños poros en su
membrana.
41 a)  Fijación del ADN por una
proteína de unión al ADN ligada
a la membrana (autolisina y
nucleasas).
b) Incorporacion del ADN:
Se fija reversiblemente,
luego se vuelve
irreversible.Pasa una
de las dos cadenas mientras la
actividad nucleasa degrada la
otra.
c) Integracion del DNA: la
cadena sencilla se une a
proteína de unión y tiene lugar
la recombinación con regiones
homólogas del cromosoma mediada
por la proteína RecA
d) Célula transformada
42 Experimento de Griffith
43 Transducción
Proceso por el cual el ADN es transferido de una
célula a otra mediante la participación de un
virus.
o  Generalizada: ADN del huésped, de cualquier
parte del genoma, pasa a formar parte del ADN
de una partícula madura del virus en lugar
del genoma de éste.
o  Especializada: ocurre solo en algunos virus
atemperados, el ADN de una región específica
del cromosoma bacteriano se integra
directamente en el genoma del virus,
generalmente reemplazando algunos de los
genes del virus.
44 Transducción generalizada
45 Transducción especializada
Ej. Transducción de los genes
de la galactosa por el fago
atemperado lambda de E. coli
46 Conjugación (apareamiento)
Proceso de transferencia
genética que requiere contacto
célula a célula.
o  Mecanismo codificado por un
plásmido conjugativo.
o  Célula donadora, que
contiene
el plásmido conjugativo y
y una célula receptora
que carece de él.
47 48 Relevancia sanitaria &
ambiental
o  Transferencia de propiedades:
Ej.: resistencia a
antibióticos, degradación de
xenobióticos
o  Bacterias como indicadores de
mutagenicidad (test de Ames)
49 Relevancia sanitaria &
ambiental
o  resistencia a antibióticos
50 Blancos de los antibióticos
(1) Síntesis de la pared celular
penicilinas
cefalosporinas
vancomycina
(β-lactámicos)
(péptido no-ribosomal)
(2) Síntesis Proteica
erytromycina
(macrolide polyketides)
tetracyclina
(aromatic polyketides)
streptomycina, kanamycina (aminoglycosides)
(3) Replicación del ADN
quinolonas (Cipro)
51 Blancos de los antibióticos
Explotan diferencias celulares procariotas/
eucariotas
(1) Síntesis de la pared celular
Bloquean síntesis de peptidoglicano
(2) Síntesis Proteica
Se dirigen contra el ARN ribosomal 23S y
proteínas asociadas
(3) Replicación del AND
Inhiben la girasa
52 Resistencia a antibióticos
Ocurre cuando un antibiótico pierde
la
habilidad
de
controlar
el
crecimiento bacteriano. Las bacterias
“resistentes”
siguen
creciendo
en
presencia de niveles terapéuticos del
antibiótico
53 Bombas de resistencia
MultiDroga
Proteínas de membrana que bombean cualquier
molécula lipofílica fuera de la célula
Muy poderoso, expulsa muchas drogas
distintas
54 Mecanismos de transferencia
horizontal
1. Transducción
2. Transformación
ü Neisseria gonorrhoeae Penicilinaresistente
3. Conjugación
ü En 1968, 12,500 personas murieron en
Guatemala en una epidemia de diarrea
por Shigella dysenteriae
55 Resistencia a Antibióticos
Droga
Introducción
Aparición de resistencia
Penicilina
1943
1946
Estreptomycina
1945
1959
Tetracyclina
1948
1953
Erythromycina
1952
1988
Vancomycina
1956
1988
Methicilina
1960
1961
Ampicilina
1961
1973
Cephalosporinas 1964
fines de los 60’s
56 Estrategias para demorar la
expansión de resistencia:
ü  No usar antibióticos para tratar
infecciones virales.
ü  Evitar dosis bajas de antibióticos por
períodos largos de tiempo.
ü  Culminar el tratamiento prescripto al
tratar una infección bacteriana.
ü  Reducir/eliminar el uso “preventivo” de
antibióticos en ganado y cultivos.
57 Relevancia sanitaria &
ambiental
o  Bacterias como indicadores de
mutagenicidad (test de Ames)
58 Ensayos de mutagenicidad y
genotoxicidad
Genotoxicidad: toxicidad que afecta al
material genético y que manifiesta una
expresión retardada en el tiempo
o  sustancias genotóxicas:
ü  mutágenos (capaces de incrementar la tasa
de mutación)
ü  carcinógenos (capaces de incrementar la
tasa de aparición de un tumor).
o  pueden alcanzar el medio ambiente, ej. el
acuático, y producir efectos directos o
indirectos sobre el hombre, animales,
59 incluso a bajas concentraciones
Ensayos de mutagenicidad y
genotoxicidad
-ensayos para determinar el potencial genotóxico de una
sustancia química o muestra ambiental:
• intercambio de cromátidas hermanas en peces o el
ensayo
de
determinación
de
micronúcleos
en
los
linfocitos periféricos de larvas de anfibios
• Células de cebolla y roedores han sido empleado en un
ensayo de determinación de la genotoxicidad en el que
se investigan parámetros citológicos como el índice
mitótico, aberraciones cromosómicas, aneuploidía y cmitosis.
Caros, laboriosos, llevan mucho tiempo, como
alternativa se han desarrollado ensayos que
utilizan microorganismos
60 Test de Ames
experimento
Agente mutágeno
control
Extracto de hígado
Cultivo Salmonella his-
Medio sin histidina
Incubación
Colonias de revertientes
Salmonella his+
No hay crecimiento
61 Test de Ames
experimento
Agente mutágeno
Extracto de hígado
Cultivo Salmonella his-
Medio sin histidina
Incubación
Colonias de revertientes Salmonella his+
Crecimiento dosis/potencia dependiente
62 Próxima clase
•  Arrancamos con metabolismo!
•  Repasar óxido-reducción
63 Recombinación -entre secuencias con alta
homología
-mediada por RecA
-fases:
corte de una hebra
apareamiento de hebras
intercambio entre las hebras
resolución de las hebras
64