Determinación de patógenos en Alimentos por Biología

Determinación de patógenos en
Alimentos por Biología Molecular
Hugo Mingo Agilent Technologies
Jesús García Microbial System
Introducción a la PCR
Se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para
replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién
formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar
que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas
Las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de
desnaturalización del ADN) suponen la inmediata
desnaturalización de toda proteína,,
Polimerasas de m.o
Thermus aquaticus
(polimerasaTaq)
Pyrococcus furiosus (Pfu)
Thermococcus litoralis
(Vent) Thermus
termophilus (Tth).
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Introducción a la PCR
Los 7 componentes de una PCR:
http://genomics.agilent.com/
1-Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
2-Dos cebadores o iniciadores (primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos
hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 6 y 40 nucleotidos. Deben estar situados enfrentados y a no mucha
distancia ,definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
-Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan
en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción.
-La proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas.
-Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.
http://eu.idtdna.com/Home/Home.aspx
3-Se suele usar magnesio (Mg2+) Cofactores de la polimerasa.
4-Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
5-ADN polimerasa
6- ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
7-Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman
un ciclo.
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Introducción a la PCR
Inicio 94-96 °C 1-9 minutos
Desnaturalización(94-95 °C) 60 seg
La temperatura depende: de la proporción de G+C y longitud de la hebra
Alineamiento40-68 °C durante 20-40 segundos
El cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde.. Los puentes
de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman
cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde.. Los
cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser
amplificada.
Elongación
PCR; 20 a 35 cambios repetidos de temperatura
llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 3
pasos a diferentes temperaturas.
El tiempo de extensión depende
+ ADN polimerasa
+Longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.
**A la temperatura óptima la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un
minuto…… polimerasa Taq 75-80 °C
Elongación final 70-74 °C 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR.
-Electroforesis en gel de agarosa……fragmentos grandes
-Gel de acrilamida……………………...fragmentos pequeños
*Marcador de peso molecular
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Introducción a la PCR
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PCR a tiempo real: introducción
Técnica de alta sensibilidad que permite la detección y cuantificación de un producto
de PCR en tiempo real.
Amplio rango de aplicaciones: análisis de expresión génica, determinación de carga
viral, determinación de GMOs, genotipado de SNPs
Basada en el uso de fluoróforos (termociclador)
light
light
Real-time PCR
Detección de productos
Colorantes que se
unen al ADN
Sondas específicas
marcadas
SYBR Green I™,
EvaGreen,
LCGreen, SYTO9
TaqMan®
Molecular Beacons
Sondas FRET
Taq
Taq
Real-time PCR
Colorantes – SYBR Green
SYBR Green:
 Se une al surco menor del ADN de doble
cadena
 Fluorescencia muy baja cuando no está
unido
 1000x cuando se une al ADN
 Ventaja: analizar muchos genes
Desventaja: poca especificidad
Real-time PCR
Sondas específicas – Taqman
Reporterdye
Acceptordye
(Quencher)
unbound probe
free in solution
Light
energy transfer
Light emission
 Sondas específica con fluoróforo y
quencher .
Desventaja: diseñar una sonda para
cada target
Taq
Light
Light emission
Taq
Ventajas: alta especificidad
Permite multiplex: varios target en la
misma reacción
Real-time PCR
Sondas específicas – Molecular Beacons
 Estructura de pinza
Fluorescencia cuando anilla con el
molde
Real-time PCR
Sondas específicas – Sondas FRET fluorescence resonance energy transfer
Fluoróforo donante
Fluoróforo aceptor
 Dos sondas que hibridan
próximas
Suelen llevar fluoróforos
compatibles solo con algunos
equipos
Excitación
Transferencia
Emisión
Real-time PCR
Resumen fluoróforos
Amplia variedad de
fluoróforos, permite
multiplex
Compatibles con el
equipo y espectros de
emisión distintos
Fluoróforo
Excitación máxima
(nm)
Emisión máxima
(nm)
Oregon Green
492
517
FAM
494
518
SYBR Green
494
521
TET
521
538
JOE
520
548
VIC
538
552
HEX
535
553
Cy3
552
570
ROX
587
607
Cy5
643
667
Texas Red
596
615
Real-time PCR
Términos básicos
Línea base: nivel de ruido de los primero ciclos
donde no hay incremento detectable de la
fluorescencia.
Treshold: determinado valor de fluorescencia en
la región exponencial de la curva de
amplificación
Treshold cycle (Ct): ciclo en el que la curva de
amplificación alcanza el treshold. Permite
calcular el material inicial de partida
Señal reporter: señal fluorescente generada por
el fluoróforo durante la reacción.
Señal normalizada (Rn): intensidad la señal
reporter dividida entre la señal del colorante de
referencia pasivo
Real-time PCR
Métodos
Múltiples aplicaciones:
• Partiendo de ARN (valorar niveles de expresión, carga viral…)
El ARN se transcribe a cADN
RT-PCR en 2 pasos
Varias PCRs a partir de una RT
Flexibilidad en los primer para la RT
Almacenamiento de cADN
RT-PCR en 1 paso
Manipulación más simple
Rápido
Bajo riesgo contaminación
•Partiendo de ADN (detección de patógenos, GMOs, genotipado SNPs)
June, 2008
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Real-time PCR
Tipos de cuantificación
PCR convencional: la mayoría de reacciones habrán alcanzado la fase de
plato de la amplificación.
Real-time PCR nos asegura estar en la fase exponencial.
Tipos de cuantificación:
Absoluta: determinamos la cantidad total del gen de interés,
expresado en valores de número de copia o concentración
Relativa: determinaremos una relación entre la cantidad del gen de
interés respecto a un gen endógeno de referencia.
Real-time PCR
Cuantificación absoluta
Standard curve
R2 = 0.999
Slope = -3.366
Amplification
efficiency = 98.2%
Real-time PCR
Cuantificación relativa
Gen endógeno de referencia: su expresión no varía entre las distintas
condiciones experimentales (genes housekeeping: β-actina, 18s RNA…)
Método ∆∆Ct de cuantificación relativa:
∆Ct (muestra problema)= Ct gen target- Ct gen referencia
∆Ct (calibrador)= Ct gen target- Ct gen referencia
∆∆Ct= ∆Ct (muestra problema)- ∆Ct (calibrador)
Nivel de expresión= 2 ∆∆Ct
Real-time PCR
Instrumentos
The Stratagene Mx Platform es una plataforma flexible, tanto a
nivel de fluoróforos con de aplicaciones.
Hardware Specifications
• Quartz tungsten-halogen lamp
• 1 PMT detector
• 2 customizable filter wheels
• 350-750nm excitation
• 350-700nm emission
• 14” (33cm) W x 20” (46) D x 18” (43) H
• 45 pounds (20.4 kilograms)
Real-time PCR
Instrumentos
Emission filter wheel
Hot top
Excitation filter wheel
Thermal system
Tungsten/Halogen Lamp
Fiber optic cable
and scanning arm
Mx3000P/Mx3005P
Real-time PCR
Instrumentation
 Más de 10 años de experiencia en instrumentos de
real-time QPCR
 Posibilidad de elegir la configuración de filtros que
necesitas.
 Sistema de excitación: lámpara halógena
Sistema óptica que escanea pocillo a pocillo
Placa de 96 pocillos
 4 colores (Mx3000P™) or 5 colores (Mx3005P™)
 Sistema de detección: PMT
 Recuperación de datos en caso de fallo en el ordenador
Real-time PCR
Instrumentos – Sistema térmico
• Uniformidad de temperatura:
(+/- 0.25°C @ 72°C).
• Sistema térmico Peltier
• Rampa de temperatura: hasta 2.5°C/s
• Hot Top.
others
Mx3005
Variation of amplicon Tm
Herrmann et al., Clin. Chem. 52 (2006) and 53 (2007)
Real-time PCR
Instrumentos - Óptica
Emission filter wheel
4 or 5 filters
Halogen lamp
Excitation range
350-750 nm
Excitation filter wheel
4 or 5 filters
Photomultiplier
Highly sensitive
detection of
fluorescence
Fibre optics cable
Optics
• Excitation
– Quartz-tungsten halogen
– Range of 350-750nM
– 4 or 5 filter sets
• Emission
hν
e-
– Photomultiplier tube (PMT)
– Range of 350-700nm detection
– Filters before the PMT blocks cross-talk
Escaneado vs. iluminación y detección
Asynchronous (scanning)
Constant intensity
(No positional effects)
Simultaneous (CCD)
Intensity depends on well position
Lamp
Higher intensity
lower intensity
3.5 s scanning time per dye
Real-time PCR
Instrumentos – Fluoróforos detectados
Excitation range: 350 to 750 nm
Emission range: 350 to 700 nm
TET
Alx350
Atto425
FAM
HEX TAM
JOE Cy3
TxRd
ROX
Standard filter set on Mx3005P
Mx3000P®
Elige la combinación de filtros que necesites!
Cy5
MxPro™ QPCR Software
•
Software para el manejo del equipo y
tratamiento y análisis de datos.
•
Intuitivo, fácil de usar, incluso para
nuevos usuarios de QPCR.
•
Se pueden ver y analizar datos en
tiempo real.
•
Se pueden exportar gráficos a Excel &
PowerPoint, en formato de texto y
también las imágenes
•
MEA Multiple experiment análisis:
analizar varias carreras en un único
proyecto.
MxPro Software: flexible y fácil de usar
Utilization of the Stratagene Mx3000P
QPCR System for the Detection and
Quantification of Mycotoxigenic Fungi
Standard curves generated for Aspergillus, Penicillium,
and Fusarium.
A mixture of DNA from A. flavus, P. chrysogenum, and F. verticilliodes
was serially diluted 10-fold and analyzed by the genus-specific multiplex
real-time PCR. The initial DNA concentration was 10 ng/μl for A. flavus,
P. chrysogenum, and F. verticillioides.
Analysis of stored distiller’s grain (DG) by multiplex real-time qPCR assay.
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Fish Identification Methods
•
•
•
•
Objective results
More resistant to sample processing
Easy to perform
High specificity/sensitivity
DNA-based methods
Sequencing
 High initial investment (> 100K $)
 High maintenance costs
 Not usable with mixed samples
 Method of choice for new species
PCR-RFLP
 Discrimination of highly
related species
 Works with mixtures
 Low initial setup costs
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Fish Identification Kit - Workflow
Sample
purification
Amplification of
species ID target
Generation of specie
specific patterns
<1h
~ 1.5 h
~2.5 h
(depends on # samples)
Pattern analysis
using RFLP Decoder Software
~ 6 h from sample to result
<1h
(depending on # samples)
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