5 .4-I - Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático

Volumen III
CAPITULO
TEMA
PAGINA
5
ANALISIS DE COMPUESTOS ORGÁNICOS
5 .1
Grasas y Aceites
579
5 .2
Carbono Orgánico Total (COT)
589
5 .3
Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO)
601
5 .4
Demanda Química de Oxígeno (DQO)
631
5 .5
Rclación COT - DBO - DQO
647
5 .6
Métodos Matemáticos para el Cálculo
de los Constantes de Velocidad (K y L)
en la DBO
661
5 .7
Fenoles
683
5.8
Plaguicidas
703
5 .9
Sustancias Activas al Azul de Metileno
727
6
ANALISIS BACTERIOLOGICQS
6.1
Generalidades
753
6 .2
Objetivos del Análisis Bacteriológico
757
6 .3
Indicadores de Contaminación
759
6 .4
Recolección de la Muestra
761
6 .5
Aparatos y Material de Laboratorio
764
6 .6
Preparación, Esterilización y Almacenamiento de los Medios de Cultivo .
767
Lavado y Esterilización del Material
783
6 .7
CAPITULO
6 .8
TEMA
PAGINA
Características y Control cae Calidad
del Agua Utilizada
787
Agua de Dilución y Preparación de Diluciones .
797
6 .10
Cuenta en Placa
799
6 .11
Coliformes 7btales
805
6 .12
Coliformes Fecales
821
6 .13
Estreptococos Fecales
827
6 .14
Bibliografía
839
7
ANÁLISIS BIOLOGICOS
7 .1
Introducción
843
7 .2
Plancton
849
7 .3
Perifiton
923
7 .4
Macrofiton
949
7 .5
Macroinvertebrados del Bentos
953
7 .6
Peces
981 .
6 .9
5. ANALISIS DE COMPUESTOS
OR AN I C OS
-S7 5 .1 GRASAS Y A EI'rE *
5 .1,1
Generalidades.
El término grasas y aceites se aplica a una amplia variedad de -
sustancias orgánicas con características especiales que se refieren a su
baja solubilidad en agua y su tendencia a formar películas muy finas en
la superficie de aquélla.
Las grasas y aceites incluyen hidrocarburos, ácidos grasos, jaba nes, grasas, ceras, aceite y cualquier otro material que sea extraído por
el solvente de una muestra acidificada y que no se volatilice durante las manipulaciones de la determinación.
Particularmente se clasifica como : "grasa" a aquellos aceites, ce ras, grasas y ácidos grasos de alto peso molecular, que en condiciones na
turales y a temperatura ambiente están en estado sólido.
El término "aceite" representa una amplia variedad de hidrocarbu
ros de bajo a elevado peso molecular, de origen mineral, . que abarca desde gasolina hasta combustibles y aceites lubricantes . Además incluye to
dos los gli'éridos de origen animal y vegetal que son líquidos a la tempe ratura ordinaria.
Los aceites y grasas pueden estar presentes en el agua como una
emulsión de residuos industriales o fuentes similares, o en solución corno
una fracción ligera del petróleo,
Las grasas y aceites se producen corno contaminantes en cantidades
* El método de extracción con Soxhlet está considerado como Norma
Oficial Mexicana publicada en el Diario Oficial el 3 de diciembre de 1973 .
considerables en las refinerías de petróleo, industrias petroqufrnicas, empacadoras de carne, rastarps, procesadoras de semillas de algodón y -otras oleaginosas, procesadoras de leche y en las operaciones de carga y descarga de los barcos petroleros, así corno de la limpieza de sus tan ques.
:5 . 1 . 2
Significado sanitario.
Son diversos los problemas ocasionados por las grasas y aceites, -
todos estos originados por su baja solubilidad en agua y su tendencia a for
mur películas muy finas en la superficie, lo que interfiere la transferen cia de oxigeno atmosférico, que es indispensable tanto para 1,a autopurífi ración de los cuerpos naturales de agua, como en los sistemas de trata_
miento biológico.
En el tratamiento de lodos activados, la grasa generalmente
se_
acu
mula en "bolas de grasa" impartiendo un aspecto desagradable a los tanques
4ie
sedimentación final . En los sistemas d alcantarillado causan problemas
por taponamiento de las alcantarillas.
Además las grasas y aceites imparten sabor y olor desagradable aL agua, afectando también el sabor de los peces para consumo humano.
5 . 1 .3
Muestreo y Almacenamiento.
Se debe tener cuida do que la muestra sea representativa . La s -
muestras de películas de aceite tomadas en la superficie de una corriente
o de. otro cuerpo de agua,se .ran casi imposibles de valorar en comparación
con el volumen total de agua, el área total de la película y el espesor comprendido . Es recomendable tomar la muestra en una carda de agua o provocar turbulencia logrando así una muestra más homogénea.
Las muestras deben tomarse en frascos de vidrio de boca ancha, -.
previamente enjuagados con un solvente y secados al aire . No debenilenarse completamente porque puede haber una pérdida de aceite flotante al taparlos.
Las muestras deben analizarse inmediatamente después de su colección, ya que muchos aceites e hidrocarburos son utilizados por las bac
tercas . Si ésto es imposible, se puede inhibir la. actividad bacteriana acidulando con 5 - 10 ml de H C1 1+ 1 ; nunca preserve las muestras con clo roformo o benzoato de sodio.
. Selección del método de análisis.
5 .1 . 4
Para muestras líquidas se han desarrollado tres métodos : el gTs vimtrico de extracción, el infrarrojo de extracción y el de extracción con Soxhlet . El primero se emplea en muestras que no contengan hidrocarburos volátiles que pudieran perderse durante las operaciones de ex
tracción . El método de extracción con Soxhlét se emplea cuando están presentes fracciones del petróleo relativamente polares, o cuando los niveles de las grasas no-volátiles pueden afectar el limite de solubilidad del
solvente.
Los métodos descritos en este capítulo son el gravim frico y el de
extracción con 5oxiil .et, ya que el infrarrojo es aún tentativo.
5 .1 .5
Método Gravimétrico de Extracción.
5 .1 .5 .1
Principio.
Las grasas y aceites disueltas o emulsificadas se extraen del - -
agua por contacto completo con freón (1,1, 2 -tricloro-1, 2, 2 , -trifluoretano) . Algunos compuestos, especialmente grasas no saturadas y ácidos grasos, se oxidan rápidamente ; por lo tanto, se deben tornar ciertas pre
cauciones referentes a la temperatura y al desplazamiento del vapor del
solvente.
5 .1 .5 .2
Interferencias.
El freón tiene la habilidad de disolver no sólo grasas y aceites, sino también otras sustancias orgánicas . No se conoce ningún solvente que selectivamente disuelva sólo grasa y aceite.
La, remoción con solventes resulta en una pérdida de hidrocarbu ros de cadena corta y compuestos aromáticos simples, por volatilización,
Algunos residuos pesados del petróleo pueden contener una porción significativa de materiales insolubles en freón.
5 .1 .5 .3
Equipo.
a)Embudos de separación con llaves de tefión.
b)Matraz de destilación de 125 ml.
c .a.ño de agua .
d)Papel filtro, Whatman No . 40, de 11 cm.
Reactivas.
5 .1 .5 .4
a)Acfdo ctorhfdrico, I 1, 1 + 1.
b)Freón (1,1, 2 - tricloro - 1, 2, 2-trlfluoretano) punto de ebullición
47O, El solvente no debe dejar residuos medibles después de
la evaporación ; destilar si es necesario.
c) Sulfato de sodio, Na 2SO4 , cristales anhidros.
5 .1 .5 .5
Procedimiento.
Recolectar aproximadamente 1, 000 ml de muestra y marcar el ni
vel en el fraseo para determinar posteriormente el volumen exacto . Acidi
ficar a pl-I2 o menor ; generalmente 5 ml de li l son suficientes . Trans ferir la muestra a un embudo de separación . Cuidadosamente enjuagar el
fraseó muestreador con 30 ml de Freón y aííadir estos lavados al embudo
de separación, Agitar vigorosamente durante 2 minutos . Permitir la separación de dos capas . Pasar la capa de freóu a través de un embudo que
contenga papel filtro humedecido con solvente y recoger en un matraz de destilación limpio y tarado . Si no se puede obtener una capa de solución clara, añadir 1 g de Na 2SO4 al cono de papel filtro y lentamente agregar =
el solvente ernulsificado a los cristales . Si es necesario 'añadir más Na 5O4 . Extraer dos veces más con 30 ml de Tren cada vez, pera prime
ro enjuagar el frasco muestreador con cada porción de solvente . Combinar los extractos en el matraz de destilación y lavar el papel filtro con - -
`584-
10 a 20 ml de freón.
Destilar el freón del matraz en un balo de agua a 70° C . Colocar
el atraz en un baño dé vapor tibio durante 15 minutos y hacer pasar aire a través del rntraz por medio de vacío durante el último minuto.
Enfriar en . un desecador durante exactamente 30 minutos y pesar.
5 .1 .5 .6
Cálculos.
Si ée conoce que el solvente usado está libre de residuos, el au LL mento er}peso del matraz de destilación tarado se debe principalmente a
las grasas y aceites . El aumento total en peso (mg) del matraz, A, me nos el residuo calculado (mg) de un testigo de freón, B, es la cantidad de
grasas y aceites en la muestra de agua:
1 grasas y aceites . (A -_) x 1 , 000
l de muestra
F ;1 .
Método de Extracción con Soxhlet.
5 .1 .6 .1
Principio.
Los jabones metálicos solubles se hidrolizan durante la acidificación . La grasa sólida o viscosa y cualquier aceite presente se separan de la muestra liquida por filtración . Después se efectúa una extracción con freón en un equipo Soxhiet, se evapora el solvente y el residuo remanente se pesa para determinar el contenido de grasa y aceites de la pues
tra . Los compuestos que se volatilizan a menos de 1 03 C se perderán -
cuando se seque el filtro.
5 . 1 .6 .2
Interferencia .
El método es enteramente empírico y se pueden obtener resultados
reproducibles sólo apegándose estrictamente a todos los detalles . Por de
finición, cualquier material recolectado se llama grasa y aceite y cual- quier sustancia filtrable, soluble erg &eón, como es el caso del azufre ele
mental y de ciertos colorantes orgánicos, se extrae como grasa y aceite.
La velocidad y el tiempo de extracción en el Soxhlet debe ser
exactamente el indicado, debido a las solubilidades variables de las diferentes grasas . Además, no se debe variar el tiempo de secado y enfriado del material extraído . Puede haber un incremento gradual en el peso, presumiblemente debido a la absorción de oxígeno, o una pérdida gradual
en peso debido a la volatilización.
5 .1 . . 3
Equipo.
a )Equipo de extracción, Soxhlet (figura No . 5 .1-1).
b)Oomba de vacío, u otra fuente de vacío.
c)Embudos Buchner, de 12 cm de diámetro.
d)Parrilla eléctrica, con cubierta,
e)Cartuchos de extracción, de papel.
f) Papel filtro, Whatman No . 40, de 11 cm,
g)Discos de muselina, de 11 cm
Figura No . 5 .1-1 . - Aparato de Extracción Soxhler.
5 .1 . 6 .4
Reactivas.
a)Ac do clorhídrico, Hd1, 1+ 1
b) Preón (1, 1,
llición 47"
2 -
tricloru - 1, 2,
2 -
trifluoretano), punto de ebu-
e, El solvente no debe dejar residuo medible después
de la evaporación, destilar si
es necesario .
587
1
c)Suspensión de diatonnaceus-sílice (Ulyflu Supo•-Cei o equivalente),
10 g por litro de agua destilada.
5 .1 .6 .5
Procedimiento.
Recolectar aproximadamente 1, 000 l de muestra y marcar el -
nivel del frasco para determinar posteriormente el volumen exacto . Aci-_
dificar a. pi-12 o menor ; generalmente son suficientes 5 ml de H 1.
Preparar el filtro que consiste en un disco de muselina cubierto con papel filtro . Humedecer el papel y la muselina y presionar las ori lla .s del papel . Con ayuda del vacío, pasar 100 ml de suspensión de cinto
maceas a través del filtro preparado y lavar con un litro de agua destila
da, suspender el vado cuando ya no pase agua a través del filtro.
Filtrar la muestra previamente acidulada a través del filtro, nue
vamente aplicando vado . Pasar el papel filtro a un vidrio de reloj por medio de unas pinzas . Agregar el material que se adhirió a las orillas -
del disco de muselina . Limpiar los lados y el fondo del recipiente colee
tor, el agitador y el embudo Buchner con trozos de papel filtro impregnados con freón, teniendo cuidado de remover todas las películas de grasa y
recolectar todo el material sólido . Juntar estos trozos con el papel filtro
que se colocó sobre el vidrio de reloj . Enrollar el papel filtro con los trozos usados en la limpieza y acomódarlos dentro del cartucho de extrae
ción . Secar el cartucho con el papel filtro en una estufa de aire caliente
a 103° C durante 30 minutos y afadir al cartucho perlas de vidrio o lana -
de vidrio . Pesar el matraz de extracción.
Extraer la grasa en el aparato Soxhlet, usando free, a una veloci
dad de 20 ciclos por hora durante 4 horas . El tiempo se torna desde eL primer ciclo.
Destilar el freón del matraz de extracción en un baño de agua a - 700 C . Colocar el matraz en un baño de vapor tibio durante 15 minutos y
hacer pasar aire a través del matraz por medio de vacío durante el íilii mo minuto.
Enfriar en un desecador durante exactamente 30 minutos y pesar.
5 .1 .6 .6
Cálculos.
El aumento total en peso (rng)del matraz', A, menos el residuo cal
culado (mg) de un . testigo de fr,en ., B, es la cantidad de grasas y aceites
en la muestra de agua :
mgl grasas y aceites =
5 .1 .7
(A-B) x'1,001.
--m
- de, muestra
Bibliografía.
APILA, AWWA, WPCF . - Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater . - 14th . Edition . 1976.
Sawyer C . N . , Mc Carty P . L . - Chemistry for Sanitary Engineers.
McGraw - Hill Book Company . - Kogakusha . - 2 nd Edition . - 1967.
U .S . Environmental Protection Agency . - Methods for Chemical Analvs1s of Water and Wastes . - 1974 .
- 589 -
5 .2 CARBONO OR AÑI O TOTAL (COT)
.
Generalidades
El método más utilizado para medir el carbono en aguas superindustriales y domésticas, es el de Carbono Orgánico Total
que se basa en la oxidación de la materia carbonosa a bióxido de carbono, en una concentración de 1 a 15 mg/l . La cantidad de bióxido de cal .
bono formado se detecta con una analizador infrarrojo (IR) del tipo no
dispersivo .
Las formas de carbono que pueden ser medidas .por este método
son:
a) Carbono orgánico no volátil soluble, Por ej emplo azúcar narural
b) Carbono orgánico volátil soluble . Por ejemplo mercaptanos,
c) Carbono volátil parcialmente soluble, Por ejemplo aceites.
d) Materiales con partículas carbonosas insolubles, Por ejem
plo fibras de celulosa.
e) Materiales cartonosos solubles o insolubles adsorbidos o atrapados en materiales inorgánicos suspendidos insolubles.
El análisis de carbono basado en la oxidación para formar CO 2
sigue la reacción:
Hb P c
d
-2-
o2 +
O 2 _-CO +1-1
2
E . acuerdo a la reacción anterior Van }lai1,
k
wllranko y Sien gel,
propusieron el primer instrumento que media el CO 2 . , residuo de la materia orgánica y los carbonatos inorgánicos de una muestra, A continuación se muestra un diagrama de flujo del aparato.
GAS ['E ARRASTRE'
HORNO Y
INYECCION
DF C .+ MUESTRA
TUBO DE
CONI VSTICN
CONDENSADOR Y
TRAMPA
OE AGUA
1
CONTROL DE TERMOMETRO
TEMPERATURA
Fig . 5 .2-1 Diagrama de flujo de un analizador de
Carbono Total
591 -
La muestra se introduce junto con el gas de arrastre al analizador, y la materia orgánica se •oxida a 950 ' C en el tubo de combustión,
El vapor de agua se condensa y el CO 2 formado es medido por el LE.
Los analizadores actuales, permiten la determinación simultánea del carbono y el carbono inorgánico . total, pues tienen dos cámaras
de combustión, una similar a la del diagrama anterior para carbono total y otra para carbono inorgánico.
Esta cámara de combustión (carbono inorgánico) mantiene una
temperatura de 150°, está empacada, y el empaque contiene ácido fos
fórico . La relación empaque-ácido libera el CO 2 de carbonatos y bicarbonatos, la temperatura es alta y causa la rápida volatilización del
agua, pero no tan alta para permitir la oxidación de la materia orgánica
La determinación del carbono total y la del carbono inorgánico
total, se realiza inyectando la misma muestra en sus respectivas cama
ras de oxidación . El carbono orgánico total es la diferencia entre las
dos lecturas .
En la figura 5 .2711 se presenta un diagrama de flujo del analiza
dor con dos cámaras de oxidación.
Existe una relación entre el COT y las pruebas de la7QO y
DBO, con la ventaja que el tiempo en la determinación de la primera es
mucho menor que en las dos últimas . Además en esta prueba todos los
g.
CONDENSADOR Y
TRAMPA DE AGUA
ANALJZADOR
INFRARROJO
F J LTRC
CONDEISADC
TRAMPA DE A A
GRAFICADOR
-53-
compuestos orgánicos sor oxidados, siendo esta una gran vcnraia sobre
la nQO
.
La mayor limitación en los análisis de COT eS el hecho de que los resultados no son familiares a los investigadores, cuando éstos tienen un uso directo en la caracterización de aguas residuales y en el mo
nitoreo de la calidad de agua.
5 .2 .2 Significado Sanitario
Como se ha mencionado, la prueba del T es más rápida de efectuarse que la DBO Y DQO además existen relaciones entre ellas, por
ejemplo
Relación DBO/COT
No . de
Muestras
Mínimo
Media
2 .27
1 .52
Agua Cruda
14
1 .52
Efluente Primario
14
1 .36
2 .50
1 .75
Efluente Secundario
14
0 .81
2 .42
1 .08
.
..
Máximo
Relación DQD CDT
No . de
Muestras
Mínimo
Máximo
Media
Agua Cruda
28
1 .69
4 .74
3 .46
Efluente Primario
28
2 .54
3 .27
3 .04 .
Efluente Secundario
28
2J5
3 .00
2 .54
.
- 5 94
Una vez que estas relaciones han sido establecidas, se obtiene
de una manera rápida la estimación de los otros parámetros para expresar el grado de . contaminación orgánica de las aguas residuales.
Consultando la bibliografía se pueden encontrar relaciones DBD,
OQO con C0"1' de muy diversas aguas residuales, como de aguas residuales de efluentes primarios, secundarios, aguas residuales domésticas, desechos de algunas industrias.
5 .2 .3
Muestreo y Alma enamiento.
En la toma de muestra para una profundidad mayor de 2 m se -
usa el rruestreador Kemmerer u otro similar.
Las muestras se almacenan en recipientes de vidrio, de preferencia obscuros (ámbar). Los recipientes de plástico son aceptables,
después de demostrar la ausencia de substancias carbonosas en ellos.
La muestra que no se va a analizar inmediatamente debe protegerse de la descomposición y oxidación, llevándola a una temperatura
cercana a la de congelación y exponiéndola lo mínimo a la luz y la atmósfera o acidificándola a un pH no mayor de 2 . Bajo cualquier condición reducir el tiempo de almacenamiento . .
5 . .4 Método de Análisis
5 .2 .4 .1 Principio
La muestra de agua es previamente homogeniada o diluida, co mo sea necesario, se toma una microporción con una jeringa, y se in-
- 595 -
yecta al aparato, es introducida al horno y arrastrada fuera del horno,
por una corriente de oxígeno o aire purificado.
El agua es vaporizada y la materia carbonosa oxidada a bióxido
de carbono (CO2), que es medido por una analizador infrarrojo del tipo
no dispersivo . El analizador infrarrojo mide todo el carbono de la rnues
tra y la cantidad de CO 0 presente es directamente proporcional a la materia carbonosa en la muestra.
5 .2 .4 .2
Interferencias
Provocan interferencia los carbonatos y bicarbonatos que se eli-
minan acidificando la muestra y purgándola con nitrógeno gaseoso, pero
da por resultado pérdidas de substancias orgánicas muy volátiles.
Se presentan otras interferencias cuando en la muestra existen
partículas que contienen carbono y debido a su tamaño no entran en la
jeringa usada para inyectar la muestra.
Muchas veces es deseable filtrar la muestra, limitando así la
materia inorgánica insoluble, esto ciá corno resultado una pérdida o ga
nancia en la determinación del T, pues existen propiedades físicas
de los compuestos que contienen carbón y la absorción y desorción de
los materiales del filtro.
Cualquier muestra tratada, puede alterar la medición pie carbo no y se hace necesaria tornar en cuenta en la interpretación de resulta
dos cualquier tipo de tratamiento dado a la muestra .
- 596 -
5 .2 .4 .3
Concentración Mínima Detectable
La concentración mínima detectable es de 1mg de carbono.
Esta concentración se puede abatir, ya sea concentrando la muestra 6
►urnerntando la porción usada en el análisis.
5 .2 .4 .4 Equipo
a) Aparato para licuar u boinog n izar la muestra, generalmente del tipo Waring o ultrasónico.
b) Agitador magnético
e) Jeringa hipod rrnica, de 0 a 50 6 0 a 500 1 de capacidad;
(Hatr ilton No 70$ N 6 750 N
- 700 - 20 6 CR - 700 - 200 y la punta
de la aguja estilo No . 3)
d) Analizador de carbono orgánico total (Beckrnan Instruments,
Inc, o equivalente)
5 .2 .4 .5 Reactivos
a) Agua bidestilada ; preparar el testigo y las solucivnIs patrón
con agua destilada.
b) Acido Clorhídrico ; l-1 l concentrado
e) Solución patrón de carbono : Disolver 5 .571 g de oxalato de
sodio anhidro, Na 2C 204 , en agua bidestilada y diluir a 1,000 mi;
1 .00 ml 1 .00 mg de carbono . Se puede usar Indistintamente, cualquier otro compuesto que contenga carbono, pero con la adecuada pure
za, estabilidad y solubilidad en agua .
d) Tubo empacado para la oxidación : Se siguen las indicaciones
proporcionadas con cl anulizaiior de carbono orgánico total.
e) Oxígeno en forma gaseosa ; libre de bióxido de carbono (CO 2>
Nitrógeno en forma gaseosa ; libre de bióxido de carbono
"2)
5 .2 .4 .6 Procedimiento
Como en los analizadores existen diferencias por su forma y tipo, es imposible dar instrucciones detalladas aplicables a todos los ins
trumentos . Es más conveniente seguir las indicaciones proporcionadas
con el analizador.
Si la muestra contiene sólidos grandes o compuestos líquidos in
miscibles, se homogeniza la muestra (licuadora o agitador magnético).
Si el carbono inorgánico se remueve antes del análisis, transfe
r. ir una porción representativa de muestra de 10 a 50 ml a un vaso de -30 ml y agregar 2 gotas ( 0 .1 m1) de ácido clorhídrico cono . para reducir el pH hasta 2 ó menos, y se purga con nitrógeno . gaseoso libre de
0por
10 min.
CO
2
Inyectar la muestra al analizador y obtener la lectura del pico.
Repetir la inyección 2 6 3 veces para obtener picos consecutivos, repro.
decibles con un + 3%.
Si el analizador cuenta con un horno para la determinación sepa
rada de carbonatos y bicarbonatos omitir la decarbonatación con H1
- 58 .-
proceder de acuerdo a las instrucciones dadas por el fabricante,
y
5 .2 .4 .7 Curva de Calibración
Preparar la serie de patrones de carbono de 10, 20, 30, 40, 50,
60, 80 y 100 mg /1 con agua bidestilada por dilución de 10, 20, 30, 40 y
0 mi de la solución patrón en 1,000 m1 y 30, 40, 50 ml de la solución
patrón de carbono en 500 ml . Inyectar y graficar la altura de los . picos
de esos patrones y un testigo con agua de dilución . Corregir la altura
del pico para el testigo y graficar las concentraciones de los patrones
en mg /1 contra las alturas en mm.
Inyectar las muestras y los patrones, la concentración de la muestra, se referirá a las alturas de los picos, que se leerán en la gá
Pica.
5 .2 .4 .8 Cálculos
Para calcular la altura correcta de los picos en mm, se resta el
testigo de los patrones de acuerdo a:
AJ.tura.:del pico corregido en mm = A - B
A
Altura de los picos en mm de la muestra o patrones
B = Altura de los picos en mm de los testigos
Aplicar apropiadamente el factor de dilución cuando sea necesario.
5.
. 5 Bibliografía
APHA, AWWA, WPCF . - Standard M thods for ti-ve Examina-
tion of Water and Wastewater . 14a Ed . - 1976 ..
Water auca Wastes Enginecring . - TOC : Iiow valid 1s ir? . Abril
de 1972 .
Pan American Health Organization . - Analysis of Organic in Natural and Waste Waters .- Mayo 1975 .
5 .3 . DEMANDA 1510?I .11MIGA
17E OXIGENE)*
5 .3 .1
Generalidades
Dentro de los parámetros encaminados a definir la Fracción
orgánica de las aguas residuales se encuentran : la demanda bioc uz rnzca de oxigeno (DBO), la demanda química de oxígeno (f Q) y el carbono or : .Inico w:atal (COI).
La prueba analítica de la demanda bioquímica de oxígeno
(DB0) estima la cantidad de oxígeno que se requiere para oxidar la
materia orgánica de una muestra de aguas residuales, por medio de
una población nricr.obiana heterogénea . La información .oltcnida
Cr1
la prueba de la D13O es de la materia orgánica biodc :mradablc que se encuentra en . el agua residual . En la prueba de la demanda qui-'
rnica,con excepción de ciertos compuestos aromáticos corno el hcncenso que no se oxidan en la reacción y además como es una reacción de oxidación-reducción, ciertas sustancias i educidas como los
sulfuros, hierro ferroso y los sulfitos también e .oxidarán y se ln
cluirán en el resultado de la prueba de la LAG.
La prueba del carbono orgánico total (C()T) rriide todlo . el
carbón presente convertido a CO 2 , y por lo tanto cic~bo removerse
de la muestra, todo el carbono inorgánico volátil (CO 2 ,
etc) -
Este método esta considerado como Norma 0ricial Mexicana
publicada en el Diario Oficial el 19 de mayo de 1976 .
602
del análisis de la muestra.
En la prueba de la Dll se utiliza un procedimiento de binen
sayos que consiste en medir el oxígeno consumido por los organismos vivos (principalmente bacterias) al utilizar como alimento a la
materia orgánica presentes en el desecho bajo condiciones aerobias
y 'favorables en cuanto a nutrientes ( fósforo y nitrógeno ).
En la reacción bioquímica de la DB0 se producen nuevas cé
lelas , H 20, gas carbónico, más un residuo no biódegradable,
Materia + 02 + Nutrientes bacteria uevas + CO2 + H20. -1orgánica.
Células
residuos no biodegradables
Esta ecuación es una representación general de todas las corra
plejas rOa ciones bioquímicas que se suceden en un río o en un caer
po de agua . Se requiere esrequiométrlcatrente que la cantidad de -o geno dtili do en cualquier punto del proceso sea proporcional a
la-cantidad total de materia orgánica que ha sufrido transformación,
o igualmente proporcional alegrado de desarrollo a que ha llegado
la reacción en ese punto del proceso.
La cantidad de oxígeno utilizado por unidad de volumen en la mezcla de desecho, puede usarse como medida relativa de la concentración « materia orgánica, ya que la cantidad de oxígeno utilizado está' en función del grado de desarrollo de la reacción blo
química, así como de la cantidad original de materia orgánica ; la
DBO es función directa del tiempo.
La velocidad a la que se llevan a cabo las reacciones oxidativas de la DBO está regida por la población de microorganismos y
la temperatura . La determinación analítica del laboratorio es oondu
cilla normalmente a una temperatura de 20°C, temperatura que se
ha calculado corno el valor promedio de los cuerpos de agua natura
les .
Los organismos responsables de la estabilización de la mate-'-
ria orgánica son de las especies naturales encontradas en el aguao en el suelo.
Teóricamente se requiere de un tiempo infinito para una oxi
dación biológica completa de la materia orgánica (Fig 5 .3-1 ) ;el proceso de oxidación se efectúa generalmente en dos etapas . Inicial
mente los microorganismos sembrados utilizan la materia ixtra obtener
energía y para su crecimiento . Esta etapa se llama sintetización . El resultado es la utilización de oxígeno y el crecimiento de nuevos
microorganismos.
Cuando se ha removido la materia orgánica inicialmente pro
sente en las aguas residuales, los organismos ( bacterias ) conti-núan utilizando oxígeno para la autoxidación de su propia masa celu
lar (respiración endógena ) . Al
completarse
la oxidación de la
masa celular, sólo queda un residuo celular no biodegradable, liberándose cal, agua y amoniaco,, y la reacción es completa . Esto se
define como la demanda bioquímica última ( DBO u ).
Se ha encontrado, por experiencia, que un porcentaje razona
blemente grande de la DBO total se logra en '5 días, aproximadarnen
te el 70 - 80% en aguas residuales domésticas y muchas industriales, por consiguiente el periódo de 5 días de incubación se ha acep
tado corno el patrón ( Fig . No . 5 .3-II ), el porcentaje exacto depon
de del carácter del inóculo y de la naturaleza de la materia orgáni.
ca, y puede ser determinado sólo experimentalmente . Para ciertos
desechos industriales, es conveniente obtener una curva de oxidación.
El proceso de oxidación se efectúa generalmente en dos eta
pas, la carbonosa y la nitrogenada . La primera etapa se realiza por
organismos que derivan la energía necesaria del desdoblamiento de
compuestos orgánicos ; la segunda etapa se realiza por medio de bac
tenias que requieren compuestos simples no carbonosos para la derivación de energía ( compuestos de nitrógeno ) . Este último tipo de bacterias ( N itros omonas y Nitrobacter ) no cuenta con suficiente población para hacer significativa la demanda de oxígeno sino hasta
aproximadamente después de 8 6 10 días . (Ver figura 5 .3 - III )
- 605 -
— - —
tlarnpa
Irlos]
Fig . 5 .3-11 Curva general de o i dación de la materia orgánica.
'1{ i g .
5 a ;3 -I Cambios en la materia c ,
gánica durante la o a ión biológica
bajo condiciones aerobias .
a la domando CoTr
loado
(CGp uo5 rsi47hi~1
o
4
.
6
IG 12
14
1$
le
eC 22 24 Kl.
Ti apip o i dbe
{
Fig .5 .3-IU Curva de DBO . ( a Curva normal de la o idaci6n
de la materia orgánica y ( b la influencia de la nitrificación
Generalmente existe tia "retraso" entre la oxzdlac'ión de 1 : materia carbonosa y la oxidación . de la nitrogenada . Este ror :raso
es considerablemente menor en el efluente de aguas de desecho tra
radas . La oxidación de las dos etapas, generalmente se realiza si-
rnultáineamente en corrientes altamente contaminadas.
La tasa de oxidación de muchas sustancias químicas inestables puede estimarse a partir de una reacción de "primer orden",
Una velocidad de primer orden es aquella que está caracterizada por
una tasa o velocidad directamente proporcional a la concentración de sustancia que reacciona : En la reacción de la DBO la velocidadde la reacción es proporcional a la cantidad de materia orgánica oxidable remanente y es modificada por la población de organismos
activos ( ver figura 5 .3-IV ) Una vez que la población de organis
mos ha alcanzado un nivel en el cual se presentan soto pequeñas va
Ilaciones, la velocidad de la rección se controla por la cantidad de
alimento utilizable por los organismos y se puede expresar como sigue:
donde
C
de
= Concentración de materia orgánica
oxidable ( contaminante ) al principio de un tiempo t
t — tiempo
Constante de reacción.
Esto significa que la velocidad de la reacción disminuye gradualmente conforme disminuye la concentración C de la materia orliea .
Como no se puede medir la materia orgánica directamente,mide la cantidad de oxígeno necesario para que los Inleroorganis
tnos degraden la materia orgánica, por lo que se utiliza en lugar de
C la letra L . La letra L representa la demanda última, y la expre
Sión
dL
. (2 )
Representa la velocidad a la cáal se destruye la materia orgánica .
Int:cgral do la ecuación ( 2 ) sé obtiene la siguiente expresión:
Lt = e - K't = 10 - Kt
L
(3)
Alimento
Oxidación completo
del substrato
Tiempo
Fig . 5 .3-IV Variación de la DBO con respecto al Alimento
Tamo
Oz
utilio
Fose horizontal
toro cidra de oso cero de reoccidn
de primer orden o Tonomoieaulor
Tiempo
Fig . 5 .3-V Variación de la DBO con respecto a la concentración de
Bacterias y el Oxígeno consumido
donde :
K = K ' /2 .303
l t = concentración de materia orgánica después de un
tiempo t.
L = Concentración inicial de materia orgánica o deman
da última de oxígeno
K ' = Coeficiente ( tasa ) de reacción en base e
K = Coeficiente ( tasa ) de reacción en base 10.
Las ecuaciones anteriores se refieren a la materia orgánica
medida en términos del oxígeno remanente al final de un periódo de tiempo.
La materia orgánica oxidada, o el oxígeno utilizado es.
Y _ L - Lt
ecuación ( 4 )
Sustituyendó la ecuación ( 4 ) en la ( 3 )
Y~ L ( 1-10-Kt )
donde :
Y= DBO ejercida en el tiem po t
L= D13O total ó última
Estas ecuaciones pueden representarse gráficamente ( Ver
figura 5 .3-V1)
-610N
---------moterio orpdnico oxidodo'
(oxIeno utilizado )
(L- Lt )
Otlpeno
utilitaria
oxígeno utilizado después
de un tiempo t
L-L 1 )
Tiempo t
Tiempo t
Fig . 5 .3-VI Representación gráfica de la ecuación Y = L - Lt
Como la DBO es en realidad la suma de dos tasas diferentes ( síntesis y respiración endógena ) la ecuación nlononlolecular es sólo una aproximación.
Debido a que tanto K y L son desconocidos, es necesario - emplear el cálculo indirecto . Se han desarrollado varios procedimieti
tos para estos cálculos.
5 .3 .1 .1
Efecto de otros parámetros en la DBO
a) El tiempo
La ecuación de la DBO y = L( 1-10 K' 1 ) denota la importancia
del tiempo.
Cuanto más tiempo transcurra, la reacción estará más cerca de su término . Como se mencionó con anterioridad, la DBO 5 es
sólo parte de la demanda última de oxígeno (DBOu).
b) Temperatura
La temperatura es uno de los más importantes factores en cualquier sistema biológico . Principalmente, los cambios en temperatura producirán un aumento o reducción de la velocidad de reac-
cióu .
1 .a prueba estándar se realiza bajo una iempe'r ; aura de incubación de 20°C ; sin embargo, cuando es necesario conocer el valor
de K1 a cualquier otra temperatura puede utilizarse la siguiente expresión, propuesta por. Van't Hoff.
Kt=K20e( T-20)
donde :
K 2o = Tasa o constante de velocidad de reacción a 20°C
T = Temperatura a la cual se quiere conocer Kt
e
= Constante
e
= 1 .047 ( Phelps )
e
= 1 .056 ( 20 a 30°C Schroepfer )
e
= 1 .135 ( 4 a 20°C Schroepfer )
c) pH
Los organismos responsables de la degradación de la materia orgánica, generalmente ejercen su acción dentro de un ámbito muy pequeño de pH, el cual es alrededor de 6 .5 y 8 .3.
La figura No . 5 .3- VII muestra la variación del porciento de
la DBO óptima con respecto al pH.
En la siguiente figura, se deduce la importancia que tiene el
ajustar el pH en ciertos desechos cuando está fuera de 6 .5 y 8 .3 .
Fig . 5 .3-VII Variación de la DBO con respecto al pH
d) Nutrientes.
Las bacterias requieren de nutrientes orgánicos e inorgánicos
para su metabolismo . En la prueba estándar de la DBO, es el agia
de dilución la que incluye los nutrientes inorgánicos . De estos nutrien
tes, el nitrógeno y el fósforo son los más importantes en la determinación de la DBO, Tal como se muestra en la figura 5 .3- VIII
o
2001»
Fig . 5 .3-VIII Influencia del Nitrógeno y fósforo en la DBO
e) Población Bacteriana.
La aclimatación de la siembra es probablemente el aspecto que mayormente se olvida . La mayor parte de los desechos industriales no cuentan con organismos perfectamente aclimatados y mucho
menos el agua de dilución que se utiliza.
f) Toxicidad
Son muchos los compuestos tóxicos a los microorganismos.
Concentraciones altas de estos compuestos pueden matar la población microbiana o reducirla considerablemente . Serán necesarias -ción
pruebas especiales cuando se tengan dudas de la inhibición de la -reacción en determinados análisis.
5 .3 .2
Significado Sanitario
La demanda bioquímica de oxígeno es una medida del oxíge-
no requerido para la estabilización química y biológica de la mate-
ria orgánica en un intervalo específico . Entre más sea la cantidadde materia orgánica vertida a un cuerpo de agua, mayor será la ne
cesidad de oxígeno para su descomposición, por lo tanto habrá una
baja en el oxígeno disuelto creando condiciones que van en detrimen
to de la vida acuática y otros usos benéficos.
En ciertos casos provoca la completa extinción del oxígeno disuelto en las corrientes, dando por resultado la extinción de peces
y otras formas acuáticas . En tales condiciones el cuerpo de agua es antiestético.
Un alto valor de la DBO puede indicar un incremento en la microflora presente e interferir en el equilibrio de la vida acuática,
una cantidad excesiva de algas, además de producir olores y sabores desagradables, tapan los filtros de arena utilizados en las plan
tas de tratamiento.
Las principales fuentes de contaminación responsables del aumento en la Demanda Bioquímica de Oxígeno en los cuerpos de -agua son, además de las urbanas, las industrias cerveceras, textiles, papeleras, empacadoras e ingenios azucareros.
5 .3 .3
Determinación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno
5 .3 .3 .1
Principio
La determinación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno se -
basa en las determinaciones de oxígeno disuelto a diferentes interva
los de tiempo ; consecuentemente la exactitud de los resultados se ve afectada grandemente por el cuidado al efectuar el análisis . Los
métodos para determinar el Oxigeno Disuelto, se encuentran descri
tos en el capitulo 4 .12.
En el procedimiento se recomienda que la temperatura de in ,
cubación sea de 20°C . Cuando se utilice una alícuota, el agua de di
lución debe aerearse previamente con el fin de que el contenido de
gases disueltos . sea constante ( cercano al punto de saturación ).
En la determinación se llenan dos o más botellas para D13O
con la muestra, en caso necesario se añade agua de dilución . Se determina el OD inmediato cuando menos a una botella y las otras
se incuban a 20°C durante 5 días . Después de este tiempo se deter
mina la cantidad de O1) remanente ; la DliO será igual a la cantidad
de 01) inicial menos 01) al quinto día, dividido entre el
¡'0
du dilu
ción ( cn decimales).
5 .3 .3 .2
Equipo
a) Incubadora controlada a 20°C ± 1°C
b) Refrigerador
c) Estufa a 120°C
d) Balanza analítica
e) hatcnciómetro
O
Frascos claros y de color ámbar de 2,000
ml ( para rcae
tivos),
g) Frascos de 300 ml especiales para DBO (mínimo 3 para
cada muestra)
h) Bureta graduada de 50 ml
i) Soportes metálicos
j) Pinzas para bureta
k) Pipetas volumétricas de 100 ml de punta alargada
1) Pipetas graduadas de 10 ml de punta alargada
nc~l Matraces Erlenmeycr de 250 ml.
n) Matraces aforados de 1000 ml
ñ) Tubo de vidrio de 0 .6 cm de diámetro
o) Tubo de hule de 0 .6 cm de diámetro
p) Pinzar Mohr
q) Frascos gotero de 30 ml
5 .3 .3 .3
Reactivos
a) Agua destilada
El agua que se use para la preparación de las soluciones Y
para el agua de dilución debe ser de la más alta calidad, destilada
en alambiques de cristal o con refrigerantes de estaño ; debe contener menos de 0 .01 mg/1 de cobre y debe estar exenta de cloro, cloraminas, sustancias orgánicas o ácidos y alcalinidad caústica.
b) Solución amortiguadora de fosfato.
Disuelva 8 .5 g de KH 2 PO4 ; 21 .75 g de K 2 H PO4 , 33 .4 g de
Na 2 FI PO4 ( 7 H20 ) y 1 .7 g de NH 4C1 en unos 500 ml de agua des
tilada y diluya a 1 litro . El p11 de esta solución amortiguadora es de
7 .2 sin ajuste alguno .No debe presentar ningún tipo de crecimiento brin
lógico si se conserva en la incubadora.
c) Solución de Sulfato de Magnesio .- Disolver 22 .5 g de MgSO4 . 7H20 en agua destilada y diluir a 1 litro.
d) Solución de cloruro de calcio .- Disolver 27 .5 g de CaC1 2
-enagudstilyr1o.
e) Solución de Cloruro Férrico : Disolver 0 .25 g de
-
FeCl -611 0 en agua destilada y diluir a l liiz-o.
3
2
f) Soluciones de ácidos o álcalis, 1N .- Para neutralización delas muestras de desechos que sean caústicos o ácidos.
g) Solución de Sulfito de Sodio 0 .025N .- Disolver 1 .575 g de Na2SO 3 en 1000 ml de agua destilada . Esta solución no es estable y debe prepararse diariamente.
h) Reactivos para determinación de oxígeno disuelto .- . Ver ca
pítulo 4 .12
i) Inóculo .- La finalidad del inóculo es introducir en la muestra una población biológica heterogénea capaz de oxidar la materia
orgánica del desecho . Cuando tales microorganismos ya están presentes como en las aguas residuales domésticas o efluentes no clorados y en aguas superficiales, no es necesario inocular las muestras .
Cuando hay razón para creer que la muestra contiene muy pocos microorganismos, como resultado por ejemplo de la cloración,
o con temperaturas elevadas o pH extremo, el agua de dilución de
be ser inoculada . El naterial inoculante es desecho doméstico sedi
mentado que ha sido incubado a 20°C durante 24 a 36 horas.
Muchos desechos industriales contienen residuos orgánicos
que no están sujetos a 'la oxidación por el inóculo de las aguas residuales domésticas.
Para evaluar el efecto de esos desechos en un sistema de tratamiento, es mejor emplear un inóculo que contenga microorganismos capaces de alimentarse con los compuestos orgánicos presentes por lo que se debe obtener ese inóculo del efluente de un pro
ceso del tratamiento biológico que recibe el desecho en cuestión, o
del agua receptora colectada abajo del punto de descarga del desecho particular ( de preferencia 3-8 km abajo ).
.Con desechos periódicos difícilmente susceptibles a la oxidación biológica, es más. práctico formar un inóculo aclimatado en
el laboratorio . Esto se puede hacer aereando y aclimatando el dese
cho o agua receptora con pequeños incrementos diarios del desecho
particular, junto con el agua residual doméstica, hasta que se desa
rrolle un inóculo satisfactorio . En estos casos especiales se rcquic
re de un inóculo con una concentración superior a 1-2 ml/l.
5 .3 .3 .4
Procedimiento
a) Pretratamiento
1) Muestras que contengan alcalinidad caústica o acidez.
Neutralice a un pf-1 aproximado de 7 con 11 2 504 IN o NaOH IN,
usando un potenciómetro o azul de bromotimol cono indicador.
El pi-1 del agua de dilución inoculada no debe variar al preparar la dilución más baja de la muestra.
2) Muestras que tienen cloro residual.
El cloro residual casi siempre se elimina dejando reposar las muestras durante 1 a 2 horas . Las diluciones de las muestras para determinar la DBO se deberán preparar con agua de dilución y el inóculo apropiado . Contenidos elevados de cloro residual en - las muestras neutralizadas, se deben eliminar por la adición de sul
fito de sodio ( Na 2SO3 ) . La cantidad adecuada de solución de sulfito de sodio se determina en una porción de 100 a 1000 ml de mues
tra adicionando 10 ml de ácido acético 1+ 1 o de ácido sulfúrico ( H 2SO4 ) 1 + 50, más 10 ml de solución de loduro de Potasio ( Ki . )
( 10 g en 100 ml de agua destilada ) y valórese con una solución -
0 .025 N . de sulfito de sodio ( Na 2SO3 ) hasta el punto final del vire,
usando solución de almidón . como indicador . Agréguese a un volumen
de muestra, la cantidad de solución de sulfito de sodio ( Na 2 SO3) de
terminada por la prueba anterior, mézclese y después de 10-20 minu
tos examínese el cloro residual de la muestra asegurándose que se
ha eliminado todo el cloro . Prepárese las diluciones de la DBO con
el agua de dilución inoculada.
3) Muestras que contienen sustancias tóxicas.
Las muestras como las de los desechos industriales frecuente
mente requieren estudio y tratamiento especial, por ejemplo ; metales tóxicos, derivados de desechos de recubrimientos ,de metales.
4) Muestras sobresaturadas con OD.
Las muestras que contienen más de 9 mg/1 de OD a 20°C
pueden encontrarse durante los meses de verano o en localidades
donde las algas estan en activo crecimiento . Para evitar la pérdida
de oxígeno durante la incubación de estas muestras, el OD debe redu
ciase hasta saturación, llevando la ,muestra a 20°C aproximadamente
o aereándola con aire comprimido.
b) Preparación del agua de dilución
Se ha usado una amplia variedad de aguas en la determinación de la DBO . Las aguas superficiales parecen ser ideales pero -
- 621 -
tienen un número de desventajas entre las que se encuentran :DBO va
riable, población variable de tnicroor.ganismos ( a menudo incluyen algas y poblaciones significativas de bacterias nitrificante~s ) y corta
nido mineral también variable . Se ha usado el agua corriente, pero
sufre de la mayoría de las limitaciones encontradas en las aguas su
per ficiales más la posibilidad de toxicidad por cloro residual . A tra
vés de la experiencia se ha visto que un agua de dilución sintética-preparada con agua destilada es la mejor para la prueba de la DBO
ya que se pueden controlar las variables antes citadas.
Corno se mencionó anteriormente, el agua destilada utilizada
para la preparación del agua de dilución es de primordial importan
cia y debe de estar libre de sustancias tóxicas . El- cloro o las clo
raminas y el cobre son las más comunes . En muchos casas es necesario declorar el agua que alimenta el alambique para obtener un
destilado libre de cloro . La contaminación por cobre se debe normal
mente al cobre del condensador.
El agua destilada preparada de abastecimientos potables tiene
una DBO muy baja por lo que se puede usar para la preparación del
agua de dilución cuando solamente tenga una temperatura cercana a
20°C y esto se consigue con el almacenamiento adecuado.
El agua destilada que . se usa para este propósito se debe -conservar en garrafones con tapones de algodón, por un tiempo su-
ficiente para que se sature con OD . También se puede acarear el agua, bien sea agitando el garrafón parcialmente lleno o por medio
de una corriente de aire comprimido . Utilice . el agua destilada a una
temperatura de 20+ 1°C.
Viértase el volumen deseado de agua destilada. en un frasco
adecuado y añada 1 ml de cada una de las soluciones : Amortiguadora de fosfatos, sulfato de magnesio ( MgSO 4 ), cloruro de calcio ( CaC1 2 ) y cloruro férrico ( FeCl 3 ) por cada litro de agua . Si el
agua de dilución se va a• guardar en la incubadora, añada la solu- ción amortiguadora de fosfatos antes de usar el agua de dilución.
La solución amortiguadora es esencial para mantener un pH
favorable durante todo el análisis . Las condiciones osmóticas adecuadas se mantienen por los fosfatos de sodio y potasio agregados
para proporcionar la capacidad amortiguadora . Las sales de calcio
y magnesio se agregan para contribuir al contenido total de sales.
El cloruro férrico, el sulfato de magnesio y cloruro de amonio suministran los requerimientos de fierro, azufre y nitrógeno . La solución amortiguadora de fosfatos proporciona el fósforo que se necesite . Todas estas sales son esenciales para el crecimiento y metabo
lismo de los microorganismos .
62,3 -
El límite máximo de DBO que se permite en el agua de dilución es de 0 .2 mg/l.
1) Control del agua de Dilución
Llene dos botellas de OBO sin inóculo, tape ambas y selle hidlr :a1 icalllente tina de ellas para llevarla a incubación . I)et:uriniti
el 01) inmediato en la primera i ot .ella y el 01,) de la segunda butcíla
a los 5 días . Los resultados del OD en estas dos botellas se usancomo un control de la calidad del agua de dilución ; cualquier dato obtenido no se deberá restar al resultado en la muestra . La disminución del 01) en las dos botellas no debe ser mayor de 0 .2 mg/l y
de preferencia que no exceda a 0 .1 mg/l.
c) Inóculo
Si es necesario, añádase al agria de dilución el inóculo ;missatisfactorio para cl Llese.ch)
particular en estudio . Solamente por
experiencias anteriores se puede determinar la cantidad efectiva de
inóculo que se agregue por litro . Sin embargo, puede servir cornoguía usar de 8-10 ml. del agua residual doméstica por litro, ó 1 a
50 ml por litro de agua de río, incubándose a 20±1 0 C durante 24 a
36 horas .
•
El. agua de dilución inoculada debe usarse el mismo día que
se haga .
d) Método de Dilución.
Este método se basa en el concepto fundamental de que la ve
locidad de la degradación bioquímica orgánica es directamente proporcional a la cantidad de material no oxidado.
1) Sin Inóculo
Aeree el agua destilada hasta que se sature de oxígeno . Agre
gue los nutrientes al agua aereada y continúe la aereación.
Estime la dilución necesaria para producir un consumo de oxf
geno mayor a 2 mg/1 después de 5 días de incubación . Las diluciones recomendadas son las siguientes.
TIPO DE DESECHO
DBO5 en mg/1
PORCIENTO DE DILU
( estimada )
CLON
Desecho industrial concentra
do .
500 - 5000
0 .1
-
1 .0
Aguas residuales domésticas
100 -
500
1 .0
-
5 .0
20 -
100
5 .0
-
25
Aguas superficiales contaminadas 5 -
20
Efluentes tratados
25
100
Utilizando como guía el valor estimado de la DBO, se calculan las diluciones apropiadas para obtener el abatimiento deseada del
contenido de oxigeno.
La disminución en un ámbito de 40-60 % del OD inicial, darálos resultados más confiables . Las diluciones que muestren consumo
de oxígeno cuando menos de 2 mg/l se pueden considerar las mis seguras.
Prepare varias diluciones .de la muestra para obtener las dis
minuciones de OD requeridas.
Con un sifón pase cuidadosamente el agua de dilución a unaprobeta graduada de 1,000 a 2,000 ml, llénese la probeta hasta la mitad procurando no hacer burbujas para evitar la entrada de aire.
A íiâdase cuidadosamente la cantidad de muestra para hacer la dilución . Mezcle bien, con un agitador de tipo émbolo, :evitando también
la entrada de aire . Pase la dilución mezclada en dos frgscos de DBO,
procurando que el líquido se derrame, tape herméticamente evitando
las burbujas de aire . Incube un frasco a 20°+ 1°C, durante 5 . días y
en el otro determine el OD inicial ( ver determinación OD en el capítulo 4 .12 ) de la mezcla . Ponga un sello de agua en los frascos de DBO ó invie'rtalos en una charola con agua.
Prepárense diluciones sucesivas de concentración más bajas
en la misma manera.
Si el agua residual representa el 1% del volumen total, y se
sabe que el OD del agua residual es prácticamente cero, el cálculo se debe basar en el OD del agua de dilución .
La técnica de dilución se puede simplificar bastante cuandola DBO de la muestra es medida directamente en los frascos de capacidad conocida . Se llenan los frascos con las cantidades apropiadas de la muestra, usando una pipeta volumética de punta alargada
y se completa el volumen con el agua de dilución justamente para que
el tapón pueda ' colocarse sin dejar burbujas de aire . El extremo del
conducto del agua de dilución debe permanecer sumergido mientras se llena el frasco para evitar que le entre el oxígeno . atmosférico.
Incube el testigo del agua de dilución y las muestras diluidas,
por 5 días a 20°C en oscuridad absoluta . Al final de la incubación determine el Cbcrgeno Disuelto Remanente.
2) Con inóculo
Hay muchos desechos industriales que no tienen flora bactc - - .
riana para la determinación de DBO, debido a su composición quími
ea o al proceso de manufactura realizado.
Desechos de .este tipo deben ser inoculados con el tipo y número apropiado de organismos para obtener valores de DBO más -aproximados al valor exacto.
Calcule el porcéntáje del inoculo que se requiere para prcxlu cir una DBOde por lo menos 0 .5 mg/1, en 5 días . Calcule las diluciones del desecho en particular al igual que en la sección anterior
.627
Disminuya la concentración del desecho lo suficiente para tornar en
cuenta la utilización del oxígeno por el inóculo . Mida la cantidad de
desecho que se requiere . Agregue a la muestra aproximadamente la mitad de la cantidad de agua de dilución necesaria . Esto es necesario para asegurar que el desecho concentrado no causa toxicidad
:1
los organismos del inóculo . Proceda según las técnicas desexi
las en la sección anterior.
Si el agua de dilución fue inoculada, determine la disminución de oxígeno debida al ínóculo, preparando una serie . de diluciones de inóculo y seleccionando en las que hubo una reducción del 40 al 70% del oxígeno en 5 días . Utilice una de estas diluciones pa
ra calcular la corrección debida a la pequeña cantidad de inóculo en
el agua de dilución . No utilice cl testigo con inóculo para efectuar
la' córr. ec.ción debido a que cl testigo del agua de dilución inoculado
está sujeto a ciertos errores , que no se presentan co la muestra inoculada.
5 .3 .3 .5
Cálculos
a) Corrección por la demanda inmediata de oxígeno
Como se mencionó, algunos desechos industriales contienen
sustancias oxidables por el oxígeno, tales como el fierro ferroso sulfitos, sulfuros y aldehídos que .ocasionan una demanda química
iamediata de oxigeno disuelto que debe ser tomada en consideración .
I-a demanda total de oxígeno de esos compuestós debe determinarse
calculando el OD inicial después de 15 minutos de siembra . El ticm
Po de 15 minutos se ha seleccionado arbitrariamiente.
DBO5= Demanda total - DIOD
Demanda Total = OD inicial - OD final
DIOD= Demanda inicial de Oxígeno Disuelto
DIOD= OD inicial - OD después de 15 minutos de siem
bra.
b) Cuando no se requiere de siembra:
DB05(rng/1) = ( DIOD mg/1 - OD mg/1 )
DIOD: Demanda Inmediata de Oxígeno Disuelto
OD
: Determinación de . Oxígeno disuelto después dr. 5 días
de incubación.
c) Cuando se emplea una dilución:
C DIOD mg/1 - OD mg/l al 5 2 día )
DBO5 mg/l
% de dilución expresado en decimales
d) Corrección por Demanda de Inóculo
El valor de la corrección por la demanda del inóculo se obtiene determinando la D80 del inóculo mismo . Determínese el abati
miento de oxígeno del inóculo y selecciónese aquel que consume
del 40 al 70% del oxígeno en 5 días . Uno de estos abatimientos se-
usa luego para calcular la corrección debida a la pequeña cantidadde inóculo en el agua de dilución.
Corrección por el inóculo
(B1 - 132 ) f.
Bl = 01) del agua de dilución inoculada antes de la incuba- elón
132 = O)) del agua de dilución inoculada después de la incubación
f, = factor
f = .% del inóculo en la muestra diluida
o del inóculo en el - agüá de dilución para control
5 . 3 .4
Bibliografía
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5 .4 .
5 .4 .1
DEMANDA QUIMICA DE OXIGENO* .
Generalidades.
El método de la demanda química de oxígeno determina la cantidad
de oxígeno necesario para oxidar a la materia orgánica de un desecho,por
medio de un agente oxidante,bajo ciertas condiciones de acidez, tempera tura y tiempo, transformando la materia orgánica en bióxido de carbono y
agua, como se muestra en la ecuación.
Materia orgánica Agente oxidante
condiciones ácidas
m bióxido de carbóno +.
agua
La prueba de la DQO (Demanda Química de Oxígeno) es tan antigua
como la DBO, y al igual que esta última, desde su principio se ha expresa
do por medio de muchos términos . En Inglaterra se le llamó Cantidad de
Oxígeno Absorbido (COA) ; otros términos utilizados incluyen : oxígeno con
sumido (OC), Demanda Completa de Oxígeno (DCO), Demanda de Oxígeno
del Dicromato (DOD), pero en la actualidad el término DQO es el más em
pleado.
5 .4 .2
Significado sanitario.
Una de la principales limitaciones de la prueba de la DQO es la de
oxidar a la materia orgánica del desecho sin importar su degradabilidad biológica . Por ejemplo, la glucosa (C6 06H12 ) es biológicamente oxidable
mientras que la lignina (C H 0 ), producto proveniente de la .madera y
10 13 3
de las plantas leñosas, es relativamente inerte ; sin embargo, ambos com
puestos son oxidados completamente en la reacción . Una segunda limita
*Este método está considerado como Norma Oficial Mexicana publicada en el Diario Oficial el 8 de abril de 1976 .
- 632 -
ción= es la de no proporcionar la velocidad de estabilización del desecho tal
como ocurrirfa en la naturaleza, por medio de la oxidación por microorga
niamos .
Buswell propuso como criterio de calidad del agua la determinación
del carbón total del desecho . Con la ayuda de la tabla 5 .4-1 y el criterio de Buswell se pueden comparar los diferentes tipos de análisis de oxidación,
incluyendo a la demanda química de oxígeno,
Tabla 5 .4 . -1 . - Relación de la prueba de la DQO con otros análisis de oxida
ción.
Temp.dela
PRUEBA .
Prole °C
Tiempo de la
Reacción
Sistema de
Oxidación
Oxid ac ión
~nzim ático ,
D BO
20
5 dios
OCIO
145
2 horas
50%H2SO 4 ,
K2 Cr207 ,Cotalfzg
dor
`Demando lame—
dieta de Oxígeno
Disuelto DtOD
20
Combustión
con Detección
Infrarrojo
950
*Demanda
de
Cloro
20
15 min .
Oxigeno
Disuelto
Oxigeno
Atmosférica
Catolizado
20 min .
Solución
HClO
Variabilidad
de
la
Prueba
Tipos de compuestos exis
tentes en el desecho (Tdxicos, Biodegradables }
Susceptibilidad de la musa-tra paro ser Oxidado.
Incluye los compuestos y lo
materia rñpidomente oxidable
por ejemplo el fe , SH
El carbón detectado es comparoble al carbón teórico
Buena Oxidación del Amonioto NH3 . La Oxidación de
otros compuestos es variable
* Se entiende por demanda de cloro al consumo de éste por muchos compuestos
químicos presentes en las aguas residuales.
De la tabla 5 .4-1 se concluye que encontrarse resultados iguales de
la DQC) y cualquier otra prueba de oxida c ión es fo.rtuitc' pues las condieioo nes de cada una de las pruebas son muy diferentes.
Sólo en los desechos én donde la materia orgánica es oxidada en las
reacciones de la DBO y DQO, y conociendo el grado de estabilización del desecho, puede establecerse una relación confiable DBO/DQO . Bajo estas condiciones se puede tomar el resultado de la DQO para determinar las diluciones en la prueba de la DBO . Este criterio se emplea en las plantas de
tratamiento de aguas negras para controlar las pérdidas en la tuberías de . desechos y para el control de las diferentes etapas del proceso . Esto se ve mucho más claro con la ayuda de la tabla 5 .4-II en donde se tratan dese
chos domésticos municipales.
Tabla 5 .4 .11 . Relaciones de la DQO con la DBO y % de remoción de DQO en cada_etapa del proceso.
1 N F L U ENTE
TRATAMIENTO PRIMARIO
Cribado + Desarenador y
Sedimentador
DQO.
DBO mg/1 DQO mg/I DQO / DBO %Remoción
200
550
2 .70
.0
132
275
2 .08
50
TRATAMIENTO SECUNDARIO
1-- Lodos Activadas : Aer)acily y Clarificac'i
12
100
8 .33
8 L .9
2-Nitrif icacidn + Dósnitrificacidn
12
100
8 .33
81 .9
3-Coagulacioíi y Sedirinentacidn
10
40
4 . 00
92 .3
CI
12
> 12
97 .8
4.-Carbón Activado
(Filtros de Arena + Columnas de Carbón)
- 634 -
En las destilerías y refinerías, cuando no se utiliza un catalizador
para acelerar la oxidación de la mayoría de los compuestos, el valor de la DBO es mayor que el de la DQO, lo que significa que existe una mayor
cantidad de materia orgánica biológicamente oxidable que químicamente oxidable . Si en ja muestra del desecho predomina mayor cantidad de ma
terial que puede ser químicamente oxidado, el valor de la DQO será ma yor que el de la DBO; esto sucede en los desechos de las industrias textil
y del papel y en cualquier desecho que contiene altas concentraciones de celulosa (C6 I 1 o05)n .'
En las aguas naturales la DBO disminuye más rápido que la DQO, lo que significa que en la naturaleza la oxidación enzimática destruye rápidamente los compuestos biológicos existentes (ésto sucede en las plan Las de tratamiento por procesos biológicos) . Una vez muertos los micro organismos, su masa celular o detritus tiene una DBO baja, pues está for
macla por compuestos en una etapa avanzada de estabilización, pero el valor de su DQO es alto, ya que los compuestos no son biológicamente oxida
bles . Esto significa que en la naturaleza la relación DQO/DBO tiende a aumentar con el tiempo, el tratamiento del desecho y/o las condiciones que
favorezcan a la estabilización.
Con ciertos desechos que contienen substancias tóxicas, la prueba
de la DQO o una determinación de carbono orgánico total (CGT) puede ser
eficaz para la determinación de la carga orgánica en el desecho .
- 635 -
5 .4 .3
Muestreo y preservación de la muestra.
Las muestras con sólidos sedimentables deben homogenizarse su
ficientemente con un mezclador para que sean representativas . Deben ana
lizarse inmediatamente después de su recolección ; si no es posible, se pre
servan con 2 ml de ácido sulfúrico por litro de muestra . Para desechos con alta DQO hacer diluciones iniciales en matraces volumétricos con el fin de reducir los errores inherentes en mediciones de pequeños volúmenes.
5 .5 .4
Selección del método de análisis.
Se han propuesto varias substancias para la determinación de la -
demanda química de oxígeno, incluyendo el permanganato de potasio (KMnO4 ), el ácido iodhidrico (HI), el cual presenta el problema de reque rir un control muy estricto en su proceso ; el sulfato cérico Ce(SO4 )2 . 4H2 0,
que no es muy buen oxidante ; el ácido perclórico (HCIO4 ) y el dicromato de .
potasio (K2 Cr 2 07 ) .Se ha encontrado que éste último es el más práctico de todos, ya que es muy buen oxidante en soluciones fuertemente ácidas y ade
más, es un compuesto relativamente barato y puede ser obtenido en un ele
vado grado de pureza.
5 .4 .5
Método del dicromato de potasio.
5 .4 .5 .1
Principio.
Se basa en la oxidación química de la materia orgánica e inorgá-
nica con dicromato de potasio y ácido sulfúrico; el exceso de dicromato se
valora con sulfato ferroso amoniacal . La cantidad de materia oxidable se
- 636 -
mide como oxígeno equivalente y es proporcional al dicrom to de potasio
consumido.
5 .4 .5 .2
Interferencias.
Ciertos compuestos no son susceptibles a la oxidación dentro de las condiciones de' la prueba de la DQO o son demasiado volátiles para poder permanecer en el matraz sin ser oxidados a la temperatura elevada del sistema.
Substancias inorgánicas como los iones ferroso (Feh, sulfuros (S= ), sulfitos (S03), y tiosulfatos (S 2 43 -) son oxidados bajo ciertas condiciones creando una DQO inorgánica, la cual interfiere cuando se estima el contenido orgánico del agua residual.
Los compuestos alifáticos de cadena lineal, hidrocarburos aromáticos y piridina no son oxidados en alguna cantidad apreciable . Los compuestos de cadena lineal son oxidados más facilmente cuando se usa sulfato de plata como catalizador ; sin embargo, el sulfato de plata reacciona
con los bromuros, cloruros e ioduros dando un precipitado que sólo es
parcialmente oxidado durante el proceso.
No existe ventaja en el uso del catalizador para la oxidación de hi
drocarburos alifáticos, pero es esencial en la oxidación de ácidos y alcoholes de cadena lineal.
Las dificultades causadas por cloruros pueden eliminarse con el uso de técnicas complejas para la eliminación del cloruro y van acornpa-
riadas por la adición de sulfato mercúrico a la muestra, antes del reflujo.
El sulfato enmascara al ion cloruro, en forma de complejo soluble
de cloruro mercúrico, reduciendo su poder para reaccionar poste .riormen
te .
El nitrito ejerce una DQO de 1 .1 mg/mgN . Donde la concentrac ián
de nitrito en aguas contaminadas raramente excede 1 ó 2 mg/1, la interferencia se considera . insignificante y generalmente se ignora.
Para eliminar una interferencia significativa debida a los nitritos,
se agregan 10 mg de ácido $úlfámico/mg de nitrito en el matraz de reflu jo . Si se agrega el ácido sulfámico a la solución de dicromato, deberá . - también ser incluida en el testigo.
Los cloruros también presentan interferencia en la determinación
de la DQO, pero se pueden eliminar agregando 11gSO 4 para formar un corre
plejo.
5 .4 .5 .3
Equipo.
Ver figuras 5 .4 . -1 y II.
Matraces Erlenmeyer de 25 ,0 a 500 ml con cuello esmerilado
de 24/40 .
-
Refrigerantes Friedrich, Liebig, West u otro equivalente de
300 mm con uniones esmeriladas de 24/40.
pleta .
-
Tubo de hule de 0 .6 cm de diámetro.
-
Tela de alambre con asbesto para lograr una ebullición com
- 638 -
Pinzas para soporte con abrazaderas.
-
Pinzas para bureta.
Matraces volumétricos,de 1000 y500 ml,
▪
Bureta graduada,de 50 ml.
Matraces Erlenmeyer,de 500 ml.
•
Probeta graduada,de 100 ml.
Pipetas volumétricas,de 20, 10 y 5 ml.
-
Pipetas serológicas,de 10, 5 y 1 ml.
Codos de vidrio,de 90' con 0 .6 de diámetro.
Conexiones de vidrio en forma de T.
Frascos gotero.
Parrilla que tenga energía suficiente para producir al menos
1 .4 w/cm2 (9 w/in2) de superficie calefactora, o una equivalente para a segurar ebullición adecuada.
5 .4 .5 .4
a)
Reactivos.
Solución de dicromato de potasio, 0 .250 N . - Disolver 12 .159 g de
dicromato de potasio, K2 Cr2 O.7 , de calidad estándar primario, previa - mente secado a 103° C por dos horas,en agua destilada y diluir a 1 000 ml.
b)
Acido sulfúrico, H2SO4, concentrado,con 22 g de sulfato de plata -
Ag2SO4 (el método de la EPA recomienda 23 .5g) por frasco de 4 kg ; para
la disolución se requiere de 1 a 2 días .
- () :i() -
c)
Solución de dicromato de potasio, K 2Cr2 07 , 0.025 N . - Tomar
100 ml de la solución 0 .25 N y diluir a 1 000 ml con agua destilada.
d)
Solución titulante patrón de sulfato ferroso amoniacal, 0 .01 N : -
Disolver 39 g de Fe (NH 4 ) 2 (SO4) • 6
H2
en agua destilada . Agregar -
20 ml de H 2 SO4concentrado, enfriar y diluir a 1000 .0 ml . Esta solución
se debe valorar con la solución de K 2Cr 2O7 el día que se vaya a usar.
Valoración:
Diluir 10 ml de la solución de 1( Cr207 en 100 ml . Agregar 2
30 ml de H2 SO 4 concentrado y enfriar ; valorar con solución de sulfato
ferroso amoniacal, usando 2 ó 3 gotas (0 .1 a 0 .15 ml) de ferroín corno indicador.
Normalidad =
e)
m1 de1(2 Cr2 0 7 x0 .25
ml de Fe NH4) 2
(SO4) 2
Indicador de ferroín . Disolver 1 .485 g de 1, 10 fenantrolina ano
nohidratada y 695 mg de FeSO 4 . 7H20 en agua destilada ; diluir a 100 ml.
Esta solución se puede adquirir ya preparada.
f)
Sulfato mercúrico, HgSO 4 , en cristales, grado analítico.
g)
Acido sulfmámico . - Se requiere si hay interferencias de nitri -
tos.
5 .4 .5 .5
a)
Procedimiento.
Para muestras con valores de DQO superiores a 50 mg/l.
Colocar 50 ml de muestra o una alícuota pequeña de ella y diluir
a 50 ml, en un matraz de reflujo de 500 ml . Agregar 1 g de HgSO4 . Agregar el H2 SO4 muy lentamente, mezclando para disolver el HgSO 4
Enfriar mientras se mezcla para evitar posibles pérdidas de ma
serial volátil de la muestra . Agregar 25 ml de la solución de K 2 Cr2 O 7
0 .250 N y mezclar otra vez . Colocar el matraz en el refrigerante y po nerlo a funcionar . Agregar 70 ml de H2 SO4 a través de la entrada que está en la parte superior del refrigerante . Mezclar perfectamente antes
de aplicar calor, de lo contrario puede haber calentamientos locales en
el fondo del matraz y la muestra sería expulsada fuera del refrigerante.
(Ver figura 5 .4-I)
Se usa 1 g de HgSO 4 con los 50 ml de muestra para formar un complejo con 100 mg de ion cloruro . Si hay mas iones cloruro, agregar
más HgSO4 , pues debe mantenerse una relación de 10 :2 . de HgSO4: Cl.
Si se desarrolla un ligero precipitado no afectará su determina
ción . Como una regla general el parámetro de la DQO no podrá ser me
dido exactamente en muestras que contienen más de 2 gil de cloruros.
Llevar a reflujo por 2 horas (el aparato debe estar listo con las
conexiones de agua corriente) como se muestra en la figura 5 .4-II. Para desechos particulares, se puede usar un tiempo más corto en el re
flujo si se encuentra que da la máxima DQO .
- 6-t 1
Entrado de
. aguo frío
Entrada de agua pwu
tavodc►,.,.
ami
'•
Salido del aspa
1
l`
_ Refrigerante
Friederichs
- Matraz de Reflujo
de 250-500 mI
Figura 5 .4-1 . - Equipo necesario para efectuar la DQO.
?igura 2 .5 .4-II . - Reflujo de la DQO . T = 2horas .
Cubrir la parte superior (abierta) del refrigerante con un pequeño
vaso, para evitar la entrada de material extraño a la mezcla que se encuentra a reflujo . Enfriar y lavar el refrigerante con agua destilada (es
recomendable usar una piseta de plástico).
Diluir la mezcla casi al doble de su volumen con agua destilada : enfriar a la temperatura ambiente y titular cl exceso de clicromato con la
solución de sulfato ferroso amoniacal, usando ferroín corno indicador.
Usar generalmente 2 6 3 gotas (0 .1 - 0 .15 ml) del indicador . Aunque la cantidad deferroín no es crítica, usar un volumen constante . Tomar co mo punto final de la titulación el cambio de color, que va del azul-verde al café-rojizo, apareciendo después de varios minutosjl azul-verde.
Llevar a reflujo un testigo de agua destilada, con el mismo volu men de agua destilada usado en la muestra, junto con todos los reactivas,
cuidando que la ebullición se inicie al mismo tiempo que la muestra.
b)
Procedimiento alternado para muestras con poca Dc1O.
Se sigue el procedimiento descrito anteriormente (a) con sólo dos
excepciones : 1) . ' Usar una solución 0 .025 N de K 2Cr2 O 7 .
2)
Titular la solución anterior con sulfato ferroso amoniacal
0 .10N.
Este procedimiento debe efectuarse con un cuidado extremo, porque una pequeña cantidad de materia orgánica en el material de vidrio
oo
en la atmósfera, causa un alto error . Si se requiere un incremento mayor en la sensibilidad, reducir la muestra a 20 m1 (volumen total final 6(1
ml) por ebullición en el matraz de reflujo sobre una parrilla, con todos los reactivos . Llevar un testigo con el mismo procedimiento y reactivos.
Esta técnica tiene la ventaja de concentrar la muestra sin pérdidas significativas de materias volátiles de fácil digestión . Las materias volátiles
de difícil digestión,tales corno ácidos volátiles, se pierden . Pero se gana
un aprovechamiento sobre los métodos de evaporación -concentración ordinarios . Como el volumen de la muestra aumenta, la concentración de
cloruros también aumenta y se requiere más HgSO 4 .
Se pueden usar procedimientos alternativos para volúmenes de muestra en un ámbito de 10 .0 a 50 .0 ml con tal de que los volúmenes, pe
sos y normalidades estén en proporción, siguiendo los procedimientos antes mencionados (a y b).
Los ejemplos típicos están dados en la siguiente tabla.
Tabla 5 .4 . -III .- Relaciones de volúmenes de reactivos con volúmenes de
-._ muestra .
Muestra
en ml
Oicromato02.5N
en ml
10
20
30
5 .0
10 .0
15 .0
40
50
20 .0
25 .0
H2SO4 conc .
con 42 504
en ml
HgSQ4 en g
Volumen final
Normalidoddel antesdolgtitulocián
Fe(NH~2lSOg12
en ml
15
30
0 .2
0.4
0.05
0.10
70
140
45
60
75
0.6
0.8
1 .0
0 .15
0 .20
0 .25
210
280
350
- 645 -
5 .4 .5 .6
Cálculos.
DQC) iag/I
(a -b) N x 8 .000
ml de muestra
Donde:
a = m1 de Fe (NH4)2 (SO4) 2 usados para el testigo.
b = ml de Fe (NH 4)2 (SO4) 2 usados para la muestra.
N _ normalidad de Fe (NH4)2 (SO4) 2
5 .4 .6
Bibliografía.
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ter and Wastewater . - 14th edition . - 1976.
Clair N . Sawyer y Perry L . Mc Carty . - Chemistry for Sanitary Engineers . - Mc Graw Hill book . - KogaKusha . - 1967.
U . S. Environmental Protection Agency . - Water Quality Studies . Water Programa Operations . - May 1974 .
- 647 -
5 .5 RELACION CO'1'-DUO-Ix )
5 .5 . 1
Definiciones.
a)
Demanda teórica de oxígeno (DTO).
Representa la cantidad de oxígeno que se requiere para oxidar los componentes de un desecho hasta sus más altos estados de oxidación.
La DTO se logra solamente por medió de una combustión perfecta, a una temperatura elevada en exceso de oxígeno.
Por ejemplo, si un desecho estuviera compuesto de C~ 4 NO2 y
S la DTO sería la cantidad de oxígeno requerido para transformar
es
tos componentes en CO 2 , NO 3 y SO4 .
La D`TO representa el patrón sobre el cual todos los demás mé todos pueden ser comparados ; es un valor único, abstracto, que nunca
ha sido determinado.
b)
Demanda bioquímica de oxígeno (DBO) ..
Se define como la cantidad de oxígeno requerido para oxidar la materia orgánica e inorgánica, por medio de una población microbiana heterógenea (figura No . 5 .5-I).
Demanda último
5 día
Tiempo
Figura 5 .5-1 Curva de la DBO
La demanda última serla ejercida si se completaran todas las reacciones . La demanda última de la primera etapa se, manifiesta cuan
do toda la materia carbonosa ha sido oxidada.
La demanda bioquímica de oxígeno al quinto día, representa la cantidad de oxígeno que se consume en los primeros cinco días.
La segunda etapa de la curva de la DBO puede deberse a un pro ceso de nitrificación y/o a una oxidación lenta de algunos compuestos po
co biodegradables.
La demanda última global asf corno la de la primera etapa tienen
valores abstractos que nunca pueden ser alcanzados
c) Carbono orgánico total (COT).
El carbono orgánico total es un partimetro que al igual que la DQO proporciona una manera rápida de estimar el grado de contamina ción de materia orgánica que presenta un agua residual.
En la prueba se determina el contenido de materia orgánica bio degradable exceptuando la materia nitrogenada y la materia inorgánicaEl resultado que se obtiene es la diferencia de una oxidación del carbono
total menos la oxidación del carbono inorgánico.
Si presuponemos una variedad innumerable de organismos, su adaptación biológica y un tiempo de reacción infinito, la DBO última se ría igual a la DTO .
- 649
d)
T)enlanda química de oxígeno
Es una medida del oxígeno equivalente a la porción de la materia
orgánica e inorgánica en una muestra, que es susceptible de oxidarse ba
jo condiciones específicas de un agente oxidante, temperatura y tiempo.
e)
Demanda inmediata de oxígeno (DIO).
Representa la demanda de oxígeno que se ejerce espontáneamente al ponerse en contacto algun desecho con el oxígeno . La prueba pue de incluir al oxígeno utilizado en la reacción con el ion ferroso, los sul
Pitos, los sulfuros, los grupos sulfhídricos u otros agentes reductores
que reaccionarían dentro de los primeros 15 minutos.
5 .5 .2
Generalidades.
Frecuentemente se efectúan comparaciones entre varias pruebas
de demanda de oxígeno y los análisis de carbono de soluciones preparadas en el laboratorio o de muestras reales.
En la figura 5 .5-11, se puede observar el tipo de relaciones que existe entre la demanda bioquímica de oxígeno (DBO), la demanda quími
ca de oxígeno PQO), la demanda teórica de oxígeno (DTU) y el carbono orgánico total (COT) . Si ninguna de estas determinaciones coincide con otra, todas llegan a sobreponerse en una determinada área, la que nos determina al carbono orgánico biodegradable, o lo que puede ser medi 1$
do mediante todas estas técnicas analíticas.
Teóricamente la relación de la demanda química de oxígeno con -
respectó del carbono orgánico total adquiere valores que van desde ce ro, para el dióxido de carbono, hasta S .33 para el metano, siempre y cuando no haya ningún agente reductor inorgánico . La uniformidad en las concentraciones de los compuestos, influye enormemente en la esta
billdad de la relación . Si el desecho tiene una composición relativamen
te constante, se puede establecer una muy buena correlación, por consi
guiente podríamos reemplazar la prueba de la DQO por lade COT, esto
es valioso debido a que la última determinación es más rápida.
En un desecho de una refinería se vió que la DQO era proporcio
nal al COT . Las correlaciones entre DBO y COT son poco confiables cuando se tienen desechos industriales, a diferencia de los desechos do
mésticos . En este último caso, si la DBO última es equivalente a un 9070 de la demanda teórica y la DBO5 a un 77% de la DBO última, la re lación de la DBO S con respecto al COT tiene un valor de 1 r 85 . Se han reportado valores para esta relación que van desde 1 .35 a 2 .62 ; mien
tras que para la relación de la DQO/COT de 3 .0 a 4 .0.
En la siguiente figura se muestra la relación existente entre la
DBO, DQO, COT y DTO .
DTO
Hidrocarburos aromáticos
Alifóticos de cadena lineal
Inorgánicos oxidables
(sutfitos, nitritos,etc .)
Nitrógeno orgánico
Nitrógeno amoniaco!
Carbón orgánico biodegradable
Carbón orgánico no biodegradable
Figura No . 5 .5-1I . - Relación DBO, DQO, COL DTO
- 652 -
Williams determinó en un desecho especifico, las relaciones DBO/COT y DQO/COT ; es de notarse que los valores disminuyen eun forme se van oxidando los desechos.(Tabla No. 5 .5-1)
Tabla No . 5 .5-1. - Relación DBO/COT y DQO/COT . Para un desecho específico.
DBO / COT
11o. de muestras
M u e s t r a
Mínimo
Máximo
Promedio
Desecho sin tratar
14
1 .52
2 .27
1 .82
Efluente primario
14
1 .36
2 .50
1 .75
Efluente secundario
14
0 .81
2 .42
1 .08
Máximo
Promedio
DQO / COT
No . de muestras Mínimo
_..
Muestra
Desecho sin tratar
28
1 .69
4 .74
3 .46
Efluente primario
.28
2 .54
3 .27
3.04 .
28
2 .15
3 .00
2 .54
Efluente secundario
En general,
de
compuestos
si se tienen muestras con niveles altos y variables
poco biodegradables,una DBO muy grande por la canti -
dad de materia nitrogenada presente no conviene correlacionarla con los resultados del COT.
Ostendorf y F3yra reportaron valores de COT para un efluente de una fábrica de papel por medio de un proceso de sulfito basándose -
-653-
en los resultados que se muestran en la figura No . 5 .5-111, coneluvcnm
que se puede establecer una correlación aceptable para conocer el nivel
de desperdicio orgánico de un efluente . También efectuaron estudios en
efluentes municipales, y demostraron que, baáandose en los resultados
del COT, se podría estimar la DBO con una variación del 3%.
io
Límites de confion ;a
del 95%
9
2-
1
1
2
3
1
4
r
S
.
6
.
7
9
9
10
COT en mg/I x 100
Figura No . 5 .5-III . - Relaciones entre la DBO y COT para un desecho de una fábrica de papel con proceso de sulfito.
Algunos compuestos no se degradan en forma satisfactoria por
medios bioquímicos; sin embargo, muy pocos resisten la oxidación ejercida por el dicromato . La demanda teórica de oxígeno alcanza el valor más alto debido a que la mayoría de los compuestos orgánicos se
oxidan por este método.
-654 -
Los valores de las relaciones dependerán de la clase de compuestos presentes en la muestra.
Wood, Perry y Hitchcock, reportan valores para las relaciones
DBO/DQO, DBO/DTO y DQO/DTO, de tratamiento de aguas rnunicipa les . La relación DBO/DTO tiene un ámbito de 0 .1 a 0 .6 y la de - DQO/DTO de 0 .5 a 0 .9 (tabla No . 5 .5-II) . La utilización de materia biodegradable a través de un tratamiento biológico está indicada por los
valores más bajos de las relaciones en los efluentes con respecto de
los influentes.
'Tabla 5 .5-II . - Relaciones entre la DBO, DQO y DTO para las muestras
de plantas de tratamiento municipales.
v uestra
.Ti -Ce e
D ri/DTS
íi /L~l'O
Influente de una planta
pequeña
0.55
0 .54
0.99
Efluente
0.33
0.35
1 .05
Influente de una planta
grande
0 .55
0 . 54
0.99
Efluente
0 .38
0.42
1 .03
Ford sugirió varios razonamientos para explicar la disminución
de los valores de las relaciones conforme los desechos van siendo tratados durante el proceso ; la naturaleza del desecho determinaría cual explicación es válida:
a)
Los compuestos que se oxidan fácilmente por el dicroma
to 'de potasio son normalmente biodegradables.
Los compuestos orgánicos que dan valores bajos de DQO son más
resistentes a la bíodegra.dación y permanecérán intactos a través de to .do el tratamiento biológico . . Como en la prueba del COT medimos el - .contenido de materia orgánica, el efecto neto se traduce en un abatimien
to ile la relación DQO/COT, conforme transcurre el tratamiento.
b)
Los compuestos orgánicos e inorgánicos volátiles, que - -
ejercen una DQO significativa, se eliminan mediante el valor de la reta
ción de la DQO con respecto del COT.
c)
La oxidación biológica inicial origina compuestos interrne
dios sin favorecer la transformación de la materia orgánica en CO 2 : por
lo tanto, la DQO tiende a disminuir antes de que pueda notarse un abati miento del CO
d)
2.
La constante de velocidad de reacción (K) para la . DBO va-
ría de 0 .15 a 0 .30 para un desecho crudo recientemente vertido ; su valor
depende del poder de oxidación que tenga el agua residual.
El valor de K para el efluente cae dentro de un ámbito de 0 .02 a 0 .08; por lo tanto, una pequeña fracción de DB0 última en el efluente se
rá ejercida a los cinco días ;lo que no ocurre con el influente . Esto cau
sará que las relaciones DBO/COT y DBO/DQO sean menores en mes- tras del efluente .
Spacek y Strizic, efectuaron algunos análisis de DBO y DQO en hidrocarburos . parafínicos y compararon los resultados obtenidos con la
prueba de la demanda teórica de oxígeno . La prueba de la . DBO produce
resultados extremadamente bajos, tal como se indica en la tabla - No . 5 .5-1II, debido a que en la determinación normal no se mezclan o emulsionan los compuestos orgánicos insolubles.
Ep la prueba de la DBO, las grasas, los aceites y los hidrocarbu
ros se separan de la fase acuosa y flotan sobre la superficie en la botella; su biodegradación está limitada debido a la falta de contacto con los
microorganismos y porque la mayoría del oxígeno sé disuelve en la fase
acuosa .
Se obtuvieron valores más altos de DBO, sin llegar a igualar la DTO, cuando se introdujeron los hidrocarburos en la botella después de
haberse llenado completamente ; de esta manera, se desplazaron menos
hidrocarburos al taparse la botella . También se utilizó un agitador ma£
nético para incrementar el contacto.
Al correr pruebas de la DQO se obtuvieron resultados bajos ; por
lo que es inadecuada para este tipo de compuestos .
-657-
Tabla No . 5 .5-Hl . - Oxidación de los hidrocarburos parafínicos por
medio de la D110 y la DQO.
Compuesto
DBO estándar
% de oxidación .
DBO morfi fidada
% de oxidación .
1X1O
% de oxidación.
n-Hexano
0
18
1
n-Heptano
0
40
5
n-Decano
1
59
2
n-Dodecano
1
68
1
n-hexadecano
2
67
1
n-heptadecano
2
98
0
5 .5 .3
Conclusiones.
a)
geno y
Cualquier relación entre las pruebas de demanda de oxi-
el carbono orgánico total es fortuita, porque todas las determina
ciones miden el grado o susceptibilidad de oxidación bajo condiciones muy diversas .
b)
El valor de las relaciones depende de la clase de compues
tos que forman la muestra.
c)
Si la muestra contiene elementos que son susceptibles de
oxidarse por un procedimiento bioquímico y uno químico, se podría es tablecer una relación entre la DBO y la DQO.
d)
La
DQO excede
usualmente a la DBO ;' sin embargo, puede
ocurrir lo contrario cuando se tenga un desecho con un alto contenido de
celulosa,en tales casos la DQO no es una medición confiable del poten cial de desoxigenación.
e)
Si la DBO es, muy grande y la DQO es muy pequeña, es -
posible que se deba a un desecho de una destilería o refinería.
fl Los valores altos de la relación DQO/DBOen un desecho
orgánico que presente las características de ser biodegradable, puede
ser un indicio de la presencia de agentes tóxicos.
g)
La demanda bioquímica de oxígeno nunca iguala a la deman
da de oxígeno teórica.
h) Las correlaciones de la DBO con el COT son poco confia
bles cuando se tienen desechos industriales . Si la DBO varía mucho o
es muy grande debido a la presencia de compuestos de nitrógeno, no conviene relacionar el . parámetro con el COT.
5 .5 .4
Bibliografía .
.
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1ETODOS MATEMATICOS PARA EL CALCULO DE
5.
LAS CONSTANTES DE VCLOC11)A1• .) (K y L EN LA DHO
5,6 .1 Generalidades
De todas las mediciones no específicas de materia orgánica, la
prueba de la DB es la más utilizada . ,
La prueba mide la presencia de materia orgánica disuelta que
puede favorecer el crecimiento de microorganismos dentro de condicio
nos aerobias relacionándola con el oxígeno empleado en esta oxidación
mic?obiana . La prueba de la DBO se desarrollo con la suposición implícita que lo que ocurre en un desecho o en una corriente tambiun ocurrirá en la botella con la muestra en el laboratorio.
Los estudios de la reacción
s
x
Lic
.
la 1)130 establecen que,
CM
la tiia••
,
ybría de los casos, la expresión sigue ano reacción cinética :Je primer.
orden . Una vez que los r Microorganismos han alcanzado un cierto nivel
donde sólo hay muy pocas fluctuaciones, la demanda de oxigeno por uní
dad de tiempo es proporcional a la cantidad de materia orgánica presa
te sin oxidar . Esto se expresa de la siguiente manera.
d
ci t
donde :
C
t
= Concentración de materia oxidable
tiempo en días y
k = Constante de velocidad
662
Al integrar la ecuación 1 nos• dá
Lae = kt
t
ci
= e~ 111 41* (2)
donde :
concentración de materia orgánica remanente a un tiempo t
Ci: concentración presente al principio del intervalo de tiempo
En lugar de expresar la reacción en términos de concentración
de materia orgánica, es más común expresarla en términos de cantida
des experimentales definibles.
Para ello se utilizan los logaritmos con base 10 en lugar de los
logaritmos naturales.
Efectuando las modificaciones, la curva de la DBO mostrada en.
la figura 5 .67I puede ser expresada como una fracción de la demanda
última presente en un tiempo t
.Lt
.—
.
.
Rkr
= lo
o
I.ag
_ lo g
- L
-
(4)
don de
L = demanda Intima de oxígeno
_t =. demanda de oxigeno remanente e un tiempo t
y
demanda de oxígeno satisfecha a un tiempo t
rearreglando los términos:
y
L - (1 - 10 `kt
. . .
(5)
que es generalmente la fórmula de la DBO
aso
300-
1 eDBO faltante
250-
zoo-
loo
1 #Otal
y =D60 satisfecha
0
4 - - --
e
7
8
9
IC
Tiempo (dios,
Fig . 5 .6-1 Curva de la D£#()
Las pruebas de la DBO se realizan durante un período de tiempo
específico, generalmente 5 días . La muestra de agua de desecho se incuba en la oscuridad a 20°O y la disminución del oxígeno disuelto duran
te la incubación representa la DBO a los cinco días o Dl
5
Cuando
es necesario las muestras se diluyen con agua destilada que contiene nutrientes inorgánicos y una solución amortiguadora para mantener el 1)11 .
Cuando la cantidad de organismos que contiene la muestra es deficiente para oxidar la materia orgánica, es necesario inocular orga
nismos a la muestra . El uso de cinco días para la prueba de la DB0 da
tale principios del siglo .: En el : reporte de la Comisión Real Inglesa de 1908 se informó que el tiempo en que viaja un río en Inglaterra era
de 5 días o menor ; entcincs cualquier demanda de oxígeno que era necesitada después de los 5 días no tenía importancia con la calidad del agua del río . Una razón más obvia para la selección de los 5 días de
incubación, es que se ha encontrado que la desviación de los datos (la
DBO necesitada) es menor en 5 días que en cualquier otro período de in
cubación . También se sabe que frecuentemente sólo la demanda cal-be
nosa, y no la nitrogenada.,
se ejerce durante los primeros 5 días . Sin
embargo, se sabe que tanto la demanda carbonosa como la nitrogenada
ejercen en cualquier tiempo dependiendo de la . naturaleza y la cantidad
de sustrato y de las especies y número de microorganismos presentes.
La prueba de la DBO en 5 días es inadecuada desde varios puntos de vista, Como la velocidad de la LIBO es sumamente variable, la
proporción de L (la DBO última) representada por la DBO , es indetermada si no se conoce la k . Es mucho más ,útil determinar L, :.
que es una medida de la totalidad de materia orgánica presente . Para
determinar L, es necesario determinar k, la velocidad de estabilización bioquímica . La constante de velocidad k varía de acuerdo con la
temperatura; los ámbitos típicos de valores de k se presentan en la tabla 5 .6-1
Tabla 5 .6-1 Constantes de velocidad de tDBO para varios
tipos de desecho.
Desecho
Desecho municipal crudo
0 .20 - 0,30
Efluente de sedimentaclor
primar io
0 .25 - 0 .30
Efluente de filtros
rociadores ,
0 .17 - 0,23
Lodos activados:
alta velocidad (75%)
0 .15 - 0 .25
convencional (90%)
0 .05 - 0 .12
Cuerpo receptor
0 .05' - 0 .10
Las variaciones en la constante de velocidad de la DBO que se
ejerce después de un tiempo, se muestran en la tabla 5 .6-11 y en la fira 5 .6-II . El error que puede hacerse al extrapolar los datos de la
DBO de 5 días para los valores de la demanda última se muestran en la
figura 5 .6-11I donde la demanda última para un desecho con una DBO 5
de 200 mg/l, está dada para varios valores de k .
Tabla 5 .6-11 Efecto de la constante de velocidad de reacción
sobre la DB
Tiempo (en días)
1
2
3
k - 0.05
k -- 0 .10
11
21
29
21
5
37
44
60
68}¡}
6
7
10
30
50
55
68
90
75
80
90
99+
4
k
0 .15
29
0
j/5~ 4
37
50
90
94
96
99
99+
.IS
0 .25
44
8
8 {~
7
84
82
87
91
97
99+
I
T ie mpo
k
37
60
75
4
0 .20
k
90
911
.~
97
98
99
99
'
20
.( dios)
fig . 5 .6-11 Efecto de la constante de velocidad en la DRO para
una demanda última dada,
10
iS
' 20
Ti rapo (días)
Fig . 5 .b-7114 - Efecto de la constante de velocidad sobre la
DBO última para una DB05 de 200 mg/l.
Existe una gran variedad de métodos para evaluar k y L de una
serie de datos de DBO a En todos los métodos hay un número de medido
nes de y a diferentes periodos de incubación¿ La continuación de este
capitulo trata los diferentes métodos de evaluación de los datos de la
DBO.
5 .6 .2 Cálculos
5 .6 .2 .1 Método Cinético General.
El método más simple (y el menos exacto) para estimar la demanda última de oxígeno L es rafiear los valores de la DB . ejercida
contra tiempo (y vs t) . Esto produce una curva hiperbólica de primer
orden y la L está representada por la as itota de la curva, . Sin embargo, es muy dificil dibujar una hipérbola con datos que tengan cierta
desviación . Además, aGn cuando no exista desviación en los datos se
tiene que utilizar un gran número de puntos para definir la curva y obtener la asintota con cierta exactitud.
Las gráficas semilogar. f n iras de la cantidad de reactivos rema
neurtes en un cierto tiempo (L - y) contra el tiempo en días, serán linea
l s con una pendiente = k. El método supone un conocimiento de la concenc raczán de los reactivos iniciales L, uno de los parámetros que se
trata de determinar.
5 .6 .2 .2 Determinación gráfica de las constantes de la DBC
Este método es simple utiliza todas las determinaciones expe
rimeiitales . Los cálculos pueden realizarse con una regla de cálculo
en pocos minutos . El método fuó ideado por Thomas y se basa en la
similitud de dos funciones matemáticas.
FI - 1 - 10- k t
F
= (2 .3kt) (1+(2 .3/6)kt)-3
(6 )
(7)
La similitud de estas ecuaciones se ve en la expansión en serie
de las ecuaciones 6 y 7.
[1 - 1/2 (2 .3 kt) + 1/6* (2 .3 kt)2
1 _ 10-kt = (2 .3 kt)
- 1/24 (2 .3 kct) 3 + . . . .]
(8)
Y
l - 1/2 (2 .3 kt)
(2 .3 kt) (1+ ( .3/) kt) -3 = (2 .3 kt)
+1/6 (2 .3 kt) 2 -1/2 1 .6 (2 .3 kt)+ .
n
i
. r
(9)
respectiva mente . .
Los primeros tres términos en cada serie son idénticos y la diferencia entre los términos del cuarto grupo es pequeña .
Al rcc mpia
zar la ecuación 8 por la ecuación 9 en la ecuación de la DBO (ecuación
5) los resultados se aproximan ala siguiente ecuación:
y = L (2 .3kt) (1+(2 .3/6)kL
(10)
ecua-
Al ruarrct ;lar y sacar la raíz cCibica sic ambos lados,
ción 10 puede transformarse como sigue.
(t/Y)1/3
1
(2 .3 kl) 1/3
+ (2 .3 k) 2 /3
fi
t
La ecuación 11 es lineal en (t/ ) 1/3 y t . La intersección y la
pendiente resultante se define por los símbolos A y B respectivamente.
Intersección
lnd.ienE ,
A
1
(2 . k) 13
li = ( 2 .3 k) 2/ 3)
(- 01 3
(12)
(13 )
Al resolver la ecuación, 12 para L 1 / 3 y sustituir en la ecuación
13, obtenemos.
0
(2 .3 k)2/3A = .k
6 (2 .3 k) 1/36
(14)
2 .61 B/A
(15)
Sustituyendo la ecuación 15 en la ecuación 12, se puede resolver
para L :
-1/3
1:2 .3 (2 .61 BA)L
A
L = 1/ (6 A 2B)
(17)
El procedimiento para determinar las constantes de la DBO puede resumirse como sigue.
a) De los resultados experimentales "y, " y t calcule el valor de
(t/y) 113 para cada día.
b) trafique (t/y) 1/3 vs . t en un papel milimétrico y trace una
línea recta entre los puntos,
c) Determine la intercepción A y la pendiente B de la gráfica.
d) Calcule k y L de las ecuaciones 15 y 17
K
2 .6]. B/A
(15)
L
1/ (6A%)
(17)
Los datos en . la tabla 5 ,6-111 y la gráfica de la Figura 5 .6-IV
dan un ejemplo de la aplicación del método . De la figura 5 .6-I, A
0 .30 y B = (0 .416 - 0 .300) ( . 0 ) = 0 .0145 . Sustituyendo en ia. ecua
cin15y17 .
.
k = 2 .61 (0 .0145) / .30 0 .13 por diá
L
1/(6) (0 .30)2 (0 .0145) = 129 mg/l
Tabla 5 .6-111 .- Datos de [)BO usados en el método gráfico de
4.. .
2
t. días .
Q
1
6
(DBO
{Cfjx)
mg /1)
0
32.
0 .315
84.
57
0 .327 . 0 .362
1.[16
0 .34
0.29
0
1
4
5
6
Tiempo (días)
Fig . 5 .6-IV,- Análisis de los datos de DBO de acuerdo
coca el Método de ahornas
] 11
0,416
- 672 -
Como la gráfica de la linea recta se ajusta por medio visual exis
te un elemento subjetivo presente . Gamo no se introducen grandes erro
res al ajustar la recta visualmente, no es necesario un método de mínimos cuadrados . Existe una desviación teórica de la línea recta al gra ficarla debido a una falta de similitud completa entre las ecuaciones 6 y
7 . Esta desviación no es apreciable mientras no se haya completado el 90% de la DBO . Consecuentemente, los valores de y que exceden de
0 .91_ no deben usarse para ajustar a linea recta.
5 .6 .2 .3 Método de momentos
Uno de los métodos más empleados para la determinación de la
constantes de la DBO es el de los morllenios
A consecuencia iie errores determinados e indcierininados al to
«p ar la muestra y medir el oxig ilo disuelto en la prueba de la DBO y a
las variaciones al azar en la velocidad de la 1)$O en las botellas de mues
tra, los datos de la DBO no siguen exactamente una curva teórica de primer orden.
Sí tenemos n observaciones de y en intervalos de acuerdo a una
secuencia de tiempo especificada (por ejemplo 1,2, , 4 , 5, 7, y 10 días;
n 7) deseamos utilizar los datos para encontrar los parámetros de la ecuación.
y : L (1 - 3-1Cr)
1 (1 - 10 - ) .
(17)
Donde y es la DBO teórica {mg l) en un tiempo t (días), L es la -
DBO última de primer orden (mg/1), K es la constante de la velocidad
con base e y k es la constante de velocidad con base 10 . En cualquier
tiempo ti la Di30 es y i , sin embargo la DBO teórica dada por la ecua
ción 5 es y _ L (1-10 -1 ) . Esta relación se muestra en la figura 5 .6-11
Curva te&rico (ajustada a los datos)
T~ig .5 .ó-V .- Relaciones entre los 300valores observados y teóricos de 250DBO
a, . 200oo 150-
Y
o
1005010
$
1
15
20
Tiempo (dios)
Existen dos parámetros desconocidos, K y L, en la ecuación.
Podemos hacer que los dos primeros momentos de los valores observa
dos de DBO sean iguales respectivamente a aquellos graficados en la curva teórica.
1. n
n
1 Yi =
i=o
i=o
n
y=
i=o
L (1 _ e -kt i) (momento cero)
o
n
i=o
n
yi (n+1) L - L
i=o
e-kt i
(18)
ll .
n
n. .
i=o
ti L (1 - e -kt i )
primer moniento
ti yi =
ti Yi
i=o
ó
n
n
=L
i=o
n
L
i=o
ti e- kt i
(19)
' i=o
L . puede eliminarse al dividir la ecuación 18 entre la
ecuación 19
n e-kti
(n+1) 1=o
t
n
n
11
(20)
t i e- kt i
i = o.
i =o
i=o
El lado derecho de la ecuación 20 es función de K (por tanto k)
ti Y.
i —
sólo para una secuencia de tiempo especificada . Por ejemplo, conside
re la secuencia t = 1,2,3,4,5,6, y 7 días.
El lado derecho de la ecuación 20 puede ser escrito como:
-2k +
8 - (e -0k + le -k . + 2e
-k
28 - (OeOk + le
+ 2e -2k +
+ e-7k )
+ 7 e -7k )
.
Es necesario preparar una gráfica de k contra la función del la
do derecho como se muestra en la figura 5 .6-VI . Con esta curva y un
valor numérico de la relación del lado izquierdo de la ecuación 20 como
se determinó en la serie de la DBO _puede encontrarse directamente el
valor ajustado de k . Para determinar la curva para el lado derecho de
la ecuación 20 contra k para un tiempo dado es necesario una serie de
cálculos laboriosos .
Sin embargo, una vez preparada
comprobar la relación
la curva
es fácil
leer k de la curva.
. y /ty y
En la figura 5 .6-VI se muestran
curvas
para 4 series comunes
de tiempo de incubaciones de DBO.
Para determinar. L
una vez que
k es conocida, la ecuación 18
puede utilizarse cuando se escribe de la siguiente forma:
n
n
L - yi L
=
e-Kt
1
i=i
(21)
Como y = 0 al t = O, dividiendo la ecuación 18 entre nL obtenemos .
1-
1
n
e-kt = F(k)n
(22)
i=1
El lado derecho de la ecuación 19 es función de k sólo para una
secuencia de tiempo dada . La gráfica del recíproco de esta función para
varias
secuencias de tiempo n se muestra en la figura 5 .6-VII . Entonces
nL = F1
tY
(k)n
6
L
n
F1 (k)n
y
0.2
0.2 _
0.20
Serie I :
Serie II
Serie 111
Serie 131
1
l2,3,4,5 ) 67 dios
1,2, 3,4,5,10 dios
1,2,3,4,5,7, 10 días
I,2,3,4,5,7,10 0 15,20dias
1
el
I
~
IY
IE
m
O
1
1
N
O
0.08
0.04
0.00
1YI1ty
Q0800
Q0840
0.0880
0.0920
Q1600
0.1640
0.1740
0.1680
0.1780
0.172C'
0.1820
0.2080
0.2120
0. 1900
0.2000
0.2040
Q0960
0.1760
0.1860
.2160
0.1000
0 .1800
0.1900
0.2260
0 1040
Q 1840
0 .1940
0.2240
0.1060
611880
0.1980
0.2280
0.1120
0 .1920
0.2020
0.2320
0 .1160
0.1960
0` .2060
0.2360
Fig . 5 .6-VI . - Método de evaluación de DI30 por momentos . Gráfica de k Iv/tv para diferentes
3 .2
.
2.8
maza
4.
Serie L
1, 2,3,4,5,6,7 di as
Sri II=
[ ,3,4,5,10 dial
1,2,3,4,5,7, 10 dios
Serie U_
Serte 1 , 2 , 3, 4 , 5 ,7,
> 7 .10,
1 0 , 1 5 , 20 vs
34
,
1. 2
22
0.8
qffi'M
E
E IBW"l
0.0
000
f .8
gin
1 .4
1 .0
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
Constante de la velocidad de rea ccíon
0.24
Fig . 5 . fi -VII . - Método de momentos para la evaluación de la
DB . Gráfica de nL
y contra k para cuatro
medidas de tiempo.
La aplicación del método de momentos puede ser visto considerando los datos presentados en la Tabla 5 .6-IV para 4 desechos a 20 " C
utilizando las diluciones apropiadas.
Tabla 5 .6_-IV' Datos y .Cálculos por el método de momentos
EMIR .
5 (dise)
0
1
2
Yi (mg I)
0
8
112
153
163
176
192
.2 0
yi ti
o
82
224
459
652
880
1152
1400
6
i = 1078
2Yi t i = 4849
1078
Yi
= 0 .2223
4849
i
1Yi t
D e la figura 5 . -Vl serie 1, se lee k i
193 día -1 ; de la figu-
ra 5 . -VIII, serie 1, con k = 0 .193, se obtiene un valor de nl y = 1 .33.
Entonces L = 1 .33 (1078)/7 = 205 mg /1
La figura 5 .6- VIll muestra la gráfica del logaritmo (L - y) vs
t para los datos de la tabla 5 .6-1V
La linea Lé ajustada con los datos de los valores de k y L calcu
lados de la tabla 5,6-IV.
S1_'ntodo de los momentos es simple y exacto . Su única desventaja es que el análisis está limitado al tiempo para el cual existen
curvas apropiadas (si no el anal ista debe elaborar sus propias curvas)
e
0.0
1
3
4
Tiempo (dios)
Fig . 5 .-VIII . - Gráfica de datos del calculo de
k y L . por el método de momentos .
5 .6•.2 .4 Método de Mínimos Cuadrados,
El método de mínimos cuadrados fu aplicado por primera vez
para datos de DB por Therliault . Aunque el logaritmo de la DB0 (y) es
lineal con relación al tiempo, se tiene una desviación de datos . En la técnica de n Ínirr os cuadrados la diferencia . entre el valor de "y" en la
linea ajustada y un valor correspondiente observado T 'yf" se determina
por medio - de un residuo . La curva mejor usada es aquella para la cual
la suela de los cuadrados de la diferencia es un rninimo . Para una línea
recta con una pendiente rn y que intercepta en b, la solución sitnult nca'
de las dos ecuaciones siguientes para m y b da las constantes necesarias .
rn
t + nb -
rn x 2 + bz x
i=0
-2xy1
' (23)
=
(24)
0
Este es el método más exacto para estimar k y L de una serie
de datos de DBD . Sin embargo, corno su solución se realiza por pruebas de tanteo, la solución es tediosa si no se utiliza en los cálculos una
computadora de alta velocidad.
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y , B . now . se wa ge indu s -
- 681
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bife IHealth Bulletin 1973, - U . S . Puhlic líealth Servfce . - Washington, 1927 .
- 683
FENOLES
5 .7 .E
Generalidades
El fenol, derivado monohidroxilado del benceno, es ampliamente
usado como desinfectante y en la síntesis de productos orgánicos, particu
larmente resinas del tipo fenólico : Se presenta corno componente natural
de las aguas residuales de las industrias del petróleo, gas de alumbrado,
plantas de coque y de procesos que comprenden el uso del fenol como ma tera prima.
El término "fenoles" incluye una mezcla de derivados del fenol, como : fenoles, orto, meta y parasustituídos por halógenos o por un grupo
alquflico, aldehido, arilico, nitro, . fenilo, nitroso y del ácido sulfónico.
En un abastecimiento de agua, que contenga fenol propiamente dicho, usualmente estarán asociados otros compuestos fenólicos cuya sensibilidad a los reactivos usados en los métodos de determinación no sea necesariamente la misma . Como regla general, la introducción de grupos sustituyentes en el núcleo del benceno baja la sensibilidad del compuesto
particular para desarrollar color con el indicador.
El porcentaje de composición de los diversos compuestos fenólicos
presentes en una muestra dada es impredecible . Por tanto, es obvio que una
solución patrón que contenga una mezcla de fenoles no puede ser aplicable
a todas las muestras . Por esta razón, el fenol propiamente dicho ha sido
seleccionado como un patrón y cualquier color producido por la reacción
- 684 -
dotros compuestos fenólicos se reporta como fenol.
Entre las principales fuentes de contaminación con este tipo de
compuestos tenemos : las industrias de aluminio, automotriz, de compues
tos químicos orgánicos, refinación del petróleo,' materiales plásticos y
sintéticos, papel y de acero.
Significado
5. 7.
'Sanitario
líos fenoles son indeseables en abastecimientos de agua para las
industrias de bebidas , y alimentos debido a los problemas de sabor y olor
resultantes . La ingestión del agua de suministros domésticos contaminada con fenol produce dolores, irritación renal, conmoción y
algunas
ocasiones puede causar muerte, aunque la posibilidad de que esto . suceda
es remeta ya que,hasta en concentraciones muy bajas,los fenoles imparten
al agua un sabor tan desagradable que no es problable que se consuman cantidades perjudiciales sin darse cuenta.
La dosis que se puede considerar letal es de 1 .5 g y el lfrni.te permisible es de 0 .001 mg l . La remoción de los olores provocados por el
fenol, es un problema serio en las plantas de tratamiento . Para resolver
lo, se usan varios procesos como : supercloración, tratamiento crin dióxido de cloro o cloro-amoniaco, ozonización y adsorción con carbón activado . También es importante el control de la cantidad de fenoles en los cuerpos de agua por su acción tóxica sobre los peces y otros organismos
acuáticos y por el sabor desagradable que imparten a la carne de pescado .
Las concentraciones letales para los peces están relacionadas con las especies, tiempo de contacto, temperatura y otras condiciones.
5 .7 .3
Muestreo y Almacenamiento
Se debe tener cuidado de obtener una muestra que sea representa-
tiva de las condiciones existentes . Se enjuaga el recipiente de muestreo
dos o tres veces con el agua del mismo sitio de muestreo . El recipi ente
debe ser de vidrio y el volumen requerido para efectuar el análisis es de
500 ml .
Los fenolesj en las concentraciones encontradas generalmente en
las aguas . de desecho, están sujetos a oxidaciones biológicas y químicas
por lo que, si no son , analizados dentro de las cuatro horas seguidas a su
recolección, será necesario preservar las muestras acidificando a pH aproximadamente de 4 con H3 PO4 usando el indicador de anaranjado de
metilo o . un potenciómetro . Si se sabe que ha y H 2S . ó SO2 , aerear brevemente o agitar la muestra can precaución . Adicionar 1 .0 g de Cu 504.
5H2 Oil de muestra para inhibir la biadegradación de los fenoles . Guardar las muestras a temperaturas entre 5 - 10°C y analizar dentro de las
24 horas siguientes a la recolección.
5 . 7 .4
Selección del Método de Análisis
Los métodos analíticos para determinar fenoles incluyen técnicas
turbidimnétricas, calorirnétricas, de infrarrojo, ultravioleta y croa ato _
gráficas . De estas técnicas los métodos colorimétricos son los más am-
pliamente usados debido a su versatilidad y relativo bajo costo.
El metado de la 4 aminoantipirina con extraed & con cloroformo,
es usado en muestras que contengan menos de 1 mg/1 de fenol.
El método de la 4 aminoantipirina directo, se usa para concentraciones de fenol mayores de 1 mg/1 y en muestras donde no se requiera un
alto grado de sensibilidad.
El método de aminoantipirina para fenoles halogenados, es un proce
dimiento tentativo usado donde se requiera una estimación de fenoles para
sustituidos especialmente de tipo balogenado . Se usa el
2,
4 dicloro fenol
como patrón.
El método de Cromatografía Gas-líquido (tentativo) es aplicado a muestras o concentraciones de más de 1 mg/1 de compuestos fenólicos.
A continuación solo se verán los dos primeros métodos ; para conocer la
técnica de los oteros consultar los Standard Methoda ter the Examination
of water and wastewater, l4th edition, 1976, FHA, AWWA, •W?CF.
5 .7 .5
Paso Preliminar de la Destilación
5 .7 .5 .1
Principio
Los fenoles se destilan de las impurezas no volátiles a una velocidad
más o menos constante . La velocidad, de volatilización de los fenoles es gradual, f que el volumen del destilado debe ser igual, al de la muestra
que se destila . El uso de sulfato de cobre durante la destilación de una
nuestra ácida permite la formación de sulfuro cúprico sin descomposición subsecuente ácido sulfhídrico . La solución ácida también evita la
precipitación de hidrácido cúprico, que actúa corno oxidarte con los fenoles.
Interferencias
5,7 .5 .2
Las aguas residuales, domésticas e Industriales, pueden contener
interferencias tales como bacterias que degraden los fenoles, sustancias
oxidantes y reductoras y valores alcalinos de pH . La degradación bacterio
lógica se inhibe con la adición de sulfato de cobre a la muestra . La acidiflea .clán con ácido fosfórico asegura la presencia del le cobre y elimina
posibles cambios químicos resultantes de la presencia de condiciones alcalinas fuertes.
Algunos de los procesos de tratamiento usados para la remoción de
interferencias antes de realizar el análisis, pueden ocasionar pérdidas
inevitables de algunos tipos de fenoles . Consecuentemente, algunas aguas
de desecho altamente contaminadas pueden requerir técnicas especializadas para la eliminación de interferencias y para la recuperación cuantitativa de los fenoles.
Algunas de las principales interferencias se pueden eliminar, de la
manera siguiente:
a) Los agentes oxidantes como cloro y los detectados por libera-
- 88 -
ción de yodo al acidular en presencia de yoduro de potasio, se remueven
inmediatamente después del muestreo por la adición de un exceso de sulfato ferroso (FeSO4 ) o de arsenito sódico, lar
} . Si los agentes oxi-
dantes no son removidos, los compuestos fenólicos serán oxidados parcial
mente y los resultados serán bajos.
b) Los compuestos de azufre se remueven acidulando la muestra
a un pH menor de 4 .0 con ácido fosfórico (PI PO 4 ) usando anaranjado
de metilo como indicador o un potenciómetro y arreando brevemente con
agitación antes de la adición de sulfato de cobreLeuS 4) . Esto debe eliminar las interferencias de ácido sulfhídrico (H S) y dióxido de azufre
(S02).
c Aceites y breas contienen fenoles, por tanto, se requiere una
extracción alcalina antes de la adición de sulfato de cobre . El pH de la
muestra se ajusta a 12 - 12 .5 por la adición de lentejas de hidróxido de
sodio . El aceite y la brea se extraen de la solución acuosa con tetracloruro de carbono, se descarta la capa que contien aceite o brea . Cualquier
exceso de tetracloruro en la capa acuosa se remueve calentando a baño
maría antes de proseguir con el paso de la destilación.
5 .7 .5 .3
Equipo
a) Aparato de destilación, talo de vidrio, que consta de un matraz de destilación pyrex, de 1 litro, con un condensador Graham .
b) Poter ci6metro.
Reactivos.
5 .7 .5 .4
Todos los reactivos deben prpararse con agua destilada exenta
de fenoles y cloro.
a) Solución de sulfato de cobre . - Disolver 100 g de CuSO4 .5H20
en agua destilada y diluir a 1 litro.
b) Solución de ácido fosfórico, 1 + 9 . - Dhluya 10 mi de H31)04 al
85% a 100 m1 con agua . destilada.
cy Indicador de anaranjado de metro . - Disolver 0 .5 g de anaranjado de metilo en un litro de agua destilada.
d) Reactivos especiales para destilados turbios:
1) Acido sulfúrico, 1 N
2) Cloruro de sodio
cloroformo o ¿ter etílico
4) Hidr ido de sodio 2 .5 N . - Diluir 41,7 m1 de NaOH
a 100 ml
o disolver 10 g de NaOH en 100 ml de agua destilada.
5 .7 .5 .5
Procedimiento.
Medir 500 ml de muestra en un vaso, bajar el pH a 4 .0 aproximadamente coi la solución de H SP 4 1 + 9 usando el indicador de anaranjado de
metilo o un pc tenciómnetro, agregar 5 m1 de . la solución de sulfato de cobre
y pasar al aparato de destilación . Usar una probeta graduada de 500 ml como receptáculo . Las adiciones de aculo fosfórico y de sulfato cúprico
e-
- 690 -
den omitirse si la muestra se preserva corno se describió anteriormente,
Figura 5 .7- 1 .- Aparato de destilación
a) Destilar 450 m1 de la muestra ; suspender la destilación y cuando la ebullición cese agregar 50 rnl de agua destilada al matraz de destilación .Continuar la destilación hasta qué se haya colectado un total de 500
ml .
b) Una destilación debe ser suficiente para la purificación de la
muestra . Ocasionalmente, sin embargo, el destilado es turbio . Ep este
caso acidular el destilado turbio con H3 1'04 1 + 9, agregar 5 ml de la solución de sulfato cúprico y destilar como se describió en el párrafo anterior .
- 691 -
Tratamiento cuando el segundo destilado es turbio.
Extraer una porción de muestra, de 500 ml copio sigue:
Agregar 4 gotas del indicador de anaranjado de metilo y suficiente ácido
sulfúrico 1 para hacer ácida la solución . Pasar a un embudo de separación y agregar 150 g de cloruro de sodio. Agitar. can cinco adiciones de
cloroformo, usando 40 ml en la primera adición y 25 mi en• cada una de las
adiciones siguientes . Colocar Ja capa de cloroformo en un segundo embudo de separación y agitar con tres adiciones sucesivas de solución 2 .5N de
Na OH, usando 4 .0
en la primera adición y 3 .0 rnl en cada una de las .
adiciones siguientes . Combinar los extractos alcalinos, calentar a baño
maría hasta que el cloroformo se remueva, luego enfriar y diluir a . 500
ml con agua destilada . Proseguir con la destilación como se describió en
los párrafós anteriores.
Nota: El, éter,dietílico puede ser usado en lugar del cloroforriio, es pecialrnente• si se forma una emulsión cuando se extrae la solución de cloroformo con hidróxido de sodio . Cuando se usa éter, se obtiene un mejor~
coeficiente de distribución para el fenol entre las fases etérea y acuosa y
no es necesario usar cloruro de sodio . Se prefiere . el cloroformo debido
al peligro que existe al manejar éter .
5, 74 6
Método de la 4- mino•• antipirina con extracción con cloroformo.
5 .7 .6 . i
Principio
Los fenoles destilables reaccionan con la 4-amino-antipirina en pre
simia de un agente oxidante (ferricianuro de potasio) y a pH del 0 + 0,2
para formar un colorante de antipirina . Este colorante se extrae de la solución acuosa con cloroformo y La absorbancla se mide a 460 nrn . EX fenol
( 6H5 OH) es más sensible y todos los resultados se reportan, por costumbre, en términos de fenol.
Este método cubre el ámbito de concentración de fenol de 0 .0 -1000
,,ug l con una sensibilidad de 1 Jag 1.
La reacción que se efectúa es la siguiente :
P
A'
CH3 -N C
.C% -N CEO
!
k3 - C
5 .7. 6 . 2
I
C -H
O
A
OH
I
H2
CHA
C=-
Interferencias
Todas las interferencias son eliminadas o reducidas a un mínimo,
si la muestra es preservada, almacenada y destilada como se indicó anteriormente .
Equipo
5 .76 .3
a) Espectrofotómetro o fotómetro de filtro, para usarse a 460 nm,
equipado con celdas de absorción de 1-10 cm, dependiendo de las características individuales del fotómetro ; en general, si las lecturas de absorbandia son mayores de 1 .0 Con un tamaño-determinado de celda, use el
tamaño menor inmediato.
b) Embudos del tipo Buehner, con disco de frita (corno de 15 ml
Corning No . 36060 ó equivalente).
e) Papel filtro, - Un papel filtro adecuado, de 11 cm, y sulfato de
sodio anhidro puede . usarse para filtrar los extractos de cloroformo en
lugar de los embudos 8uchner .
d)
Potenciómetro
e) Embudos de separación . - De 1000 ml, de forma Squibb, con
tapón esmerilado y llave de teflón . Por lo menos se requieren 8.
f) Tubos de Nessler, de 50 ml, de forma alta.
55 .7 . 6 .4
Reactivos
Deben prepararse con agua destilada exenta de fenoles y cloro.
a) Solución madre de fenol . -Disolver 1 .00 g de fenol, grado na tivo, en agua destilada, recientemente hervida y enfriada y diluir a 1,000 ml . Ordinariamente esta pesada directa del fenol consti .
y una solución valorada . Sin ,embargo, si se requiere extrema exac
titud, valorar de la siguiente manera .
. (694 -
A 100 ml de agua destilada, en un matraz de 500 mi, con tapón esmerilado, agregar 50 ml de la solución patrón de fenol y 10 ml de la solución bromato-bromuro 0 .1 N . Inmediatamente agregar 5 mI de ácido clorhídrico concentrado y agitar suavemente el matraz tapado . Si el color café del bromo libre no persiste, agregar porciones de 10 ml de solución de
bromato-bromuro hasta que ercolor persista . Guardar el matraz tapado y
dejar reposar .10 minutos ; luego agregar 1 g aprOximadamente de yoduro
de potasio . Usualmente 4 porciones de l 0 ml de solución de bromato-bromuro se requieren, si la solución patrón de fenol contiene 1 , 00 rng/l de
fenol .
Preparar un testigo exactamente de la misma manera, usando agua
destilada y 10 ml de la solución 0 .1 N de bromato-bromuro . Valorar el testigo y la muestra con la solución 0 .025 N de tiosulfato de sodio, usando solución de almidón corno indicador.
Calcular la concentración de la solución de fenol como sigue:
mg/1 de fenol 7 .842 (AB - )
donde A = ml de tiosulfato para el testigo; B = ml de la solución de bromato-bromuro usados para la muestra divididos entre 10, y = ml de tiosulfato usados para la muestra.
b) Solución intermedia de fenol . - Diluir 10.0 ml de la solución ma
dre a 1,000 ml con agua recientemente destilada ; 1 ml = 10 .0 ji g de fenol.
Preparar la solución el día que se vaya a usar .
-ó95-
e) Solución Patrón de Fenol . Diluir 50.0 m1 de la solución intermedia de fenol a 500 ml con agua destilada recientemente hervida y enfriada;
1 ml = 1 .0 ,i ,de fenol . Preparar esta solución dentro de las 2 horas anteriores a su uso.
d) Solución de bromato - bromuro, 0 .1 N . - Disolver 2 .784 g de bro
mato, de,pot isio anhidro, K OrO, en agua destilada, agregar 10 g de bromuro de potasio (K Ea') en cristales, disolver y diluir a 1,000 ml.
e) Acido clorhídrico concentrado f) Tiosulfato de sodio 0 .025 N . -Disolver 6 .205 g de Na2S203 .51120
en agua destilada, recientemente hervida y enfriada y diluir a un litro . Pire
secar con la adición de 5 ml de cloroformo ó 0 . .4 g de hidróxido de sodio
par litro, ó 4 g de bórax mas 5 a l0 mg de Hg1 por litro.
Valoración . - Disolver 1 .226 g de dicromato de potasio, l r
7
(previamente secado a 103 0C durante 2 horas) en agua destilada y diluir a
ten litro . Disolver 2 g aproximadamente de yoduro de potasio, Il, exento
de yodato en un matraz Erlenmeyer con 100 - 150 ml de agua destilada ; < agregar 10 ml de ácido sulfúrico, H2SO4 , 1 + 9 exactamente 20 ml de la
solución de dicromatd de potasio . Dejaren. la oscuridad por 5 minutos -.
diluir a 400 m1 aproximadamente ; valorar con la solución 0 .025 N de tiosulfato de sodio .
Normalidad
20 x 0' .025
m1 de tiosulfato
- 6 96 -
les)
Solución de Almidón . - Agregar una suspennsiór, fría de 5 g de -
almidón soluble o de arrurruz a 800 ml aproximadamente de agua en ebullición, con agitación . Diluir a 1 litro, dejar ebullir unos cuantos minutos
y reposar toda la noche . Usar el líquido sobrenadante . Preservar con 1 .25 g de ácido salicílico por litro o unas cuantas gotas de tolueno, ;
11)
Solución de cloruro de amonio . - Disolver 50 g de NH 4 Cl en --
agua destilada y diluir a 1,000 ml.
i) Hidróxido de amonio cono.
Solución de aminoantipixina, - Disolver
2 .0
g de 4-aminc ntipiri
na en agua destilada y diluir a 100 ml . Esta solución debe prepararse el
dfa que se use.
k) Solución de ferricianuro de potasio . - Disolver S .0 g de K3 Fe (Q9) 15
n agua destilada y diluir a 100 ml . Filtrar si es necesario . Preparar cada
semana,
1) Cloroformo.
ni) Sulfato de sodio anhhidro, granulado, (Na SO 4 )
n) Yoduro de potasio, cristales, (Ni)
S .7 .6 .5
Procedimiento
Colocar 500 m1 del destilado o una alícuota adecuada diluida a 500
mi, en un vaso de 1 litro . Si se usan los 500 m1 del destilado, no debe
c_ontenex' más de 50 g (0 .1 mg l) de fenol .
- Si la concentración aproximada de fenol de la muestra original
no es conocida, determínese par una prueba preliminar de una alkuota
adecuada del destilado y del cloroformo para usarse en la determinación
final . .Esto puede hacerse sin extracción con cloroformo efectuando la
reacción en tubos de Nessler de 50 ml y comparándolos con los patrones
adecuados de fenol.
- Preparar un testigo de 500 ml de agua destilada y una serie de
patrones de fenol de 500 ml que contengi9n 5,10,20,30,40 y 50
4
de
fenol.
- Tratar la muestra, testigo y patrones corno sigue : agregar 10 ml
de la solución de cloruro de amonio y ajustar el pH a 10 .0+ 0.2 con
hi-
dróxido de amonio concentrado . Pasar a embudos de separación de un litro, agregar 3 .0 ml de la solución de antipirina, mezclar bien, agregar
3 .0 ml de la solución de ferricianuro de potasio, mezclar bien, de nuevo y
dejar que el color se desarrolle en 3 minutos, La solución debe ser clara
y ligeramente amarilla.
T
Extraer inmediatamente con cloroformo, usando 25 ml para celdas
de 1 - 5 cm y 50 m1 para celdas de 10 cm . Agitar el embudo de separación
por lo menos 10 veces, dejar que el cloroformo se separe, mezclar de nue
vo 10 veces y dejar que el cloroformo se vuelva a separar.
R
Filtrar cada uno de los extractos de cloroformo a través de papel
filtro o a través de embudos de vidrio de frita que contengauna capa de 5 g
.-68-
de sulfato de sodio anhidro . Colectar los extractos sectas c :n celdas limpias
para las medidas de absorhancia ; no agregar más cloroformo.
- Leer la abs orbancia de la muestra y de los patrones contra el tes o a' una longitud de onda de 460 non . traficar aorbancia contra g de
los patrones- de fenol para la curva de calibración . Una curva de calibración debe ser construida para cada fotómetro y debe revisarse periódicamente para asegurar su reproducibilidad.
5 .7 .6 . 6
Cálculos
j.ig l de fenol =
A
B
x 1,000
donde: A ;tg de fenol en la muestra, de la curva de calibración y
B=
5 .7 .6 . 7
de la muestra original.
Procedimiento Alternativo.
a) Si no se hacen análisis frecuentes de fenol, se debe preparar sólo
un patrón de fenol en lugar de una serie de soluciones y una curva de calibración .
b) En este caso, preparar un patrón de fenol de 500 ml, aproximadamente igual al contenido fenólico de la porción de muestra original usada
para el análisis final . También preparar un testigo de 500 ml de agua destilada . Proseguir como se describió en la sección anterior .
c) El cálculo del contenido de fenol de la muestra original es:
,X -
Jug /1 de fenol
E
1 , 000
B
donde:
C ; .1g
de la solución patrón de fenol,
1) lectura de absorbancia de la muestra,
E absorbancia de la solución patrón LI fenol y
B = ml de muestra original.
5 .7 .7
Métodó directo de la 4- aminoautipirina.
5 .7 .7.1
Principio
filos fenoles destilables reaccionan con la 4-aminoantlpirina el presencia de un agente oxidante (ferricianuro de potasio) a pH de 1 .0+
0 . 2,
para formar un colorante el cual se mantiene en una solución acuosa y se
mide su absorbancia a 510 nrn . Ya que este método no requiere sensibi lidades extremas, se pueden usar volúmenes más pequeños de destilado
para realizar el análisis . Por ejemplo, esto permite la determinación de
0 .5 mg de fenol expresado como C6FI 50H, en un volumen de 100 ml de des
tilado. PrLticarnente el volumen más pequeño de destilado podría ser de
10 1 . Consecuentemente este método cubre un ámbito de concentración
de 0.0 a 50 rng l con una sensibilidad de 1 mg /l .
`700-
Interferencias
5 .7 .7, 2
Todas las interferencias son eliminadas u reducidas a un mínimo
si se efectúa. la destilación.
5 . 7 . 7 .3
Equipo
a) Fotómetro equipado con celdas de absorción provistas de un paso de luz de 1 a 5 cm y equipado con un filtro verde que exhiba su
máxima transmitancia cercana a 510 ntn, o un espectrofotómetro para
usarse a 510 nm.
b Potenciómetro
5 .7 .7 .4
Reactives
Ver sección 5 .7 .6 .4
5 .7 .7 .5
?rocedimiento
Tomar 100 ml del , destilado o una porción adecuada que contenga
g ro más de 0 .5 i de fenol en 100 ml de muestra.
Preparar un testigo con agua destilada y una serie de patrones que
contengan 0 .1, 0. 2, 0, 3, 0 .4 y 0 .5 mg de fenol, Tratar la muestra, el
testigo y 10 ; patrones . como sigue: Adicionar 2 .0 ml de la solución de cloruro de ama-n.o y ajustar el pH a 10 .0 0 .2 con la solución de hidróxido de arnonio . Adicionar
2
.0 ml de la solución de aminoantipirl-
na, mezclar bien y adicionar 2 .0 ml de la solución de ferricianuro de
potasio y mezclar nuevamente.
Después de 15 minutos, transferir la solución a las celdas y leer
la absorbancia de la muestra y patrones contra el testigo, a 510 nm.
5 .7 .7 .6
Cálculos
Hacer una curva de calibración, graficando los valores de absorbancia obtenidos de los patrones, contra sus respectivas concentraciones . Obtener de la gráfica la concentración de la muestra.
mg/1 fenol
A
B
X 1,000
donde :
A = mg de fenol en la muestra (Valor obtenido de la curva de calibración)
B = ml de muestra original
Cuando sólo se usa un patrón, el cálculo es el siguiente:
mg/1 fenol = CD
E
X
donde :
C = mg de solución patrón de fenol
D = absorbancia de la muestra
E = absorbancia de la solución patrón de fenol
B = ml de muestra original
1, 000
B
5 .7 .8
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703
PLAGUICIDAS
5 .8 . i Generalidades
Los plaguicidas son sustancias químicas, naturales o sintéticas,
usadas para el control o destrucción de la vida animal o vegetal que se
considera como adversa a la sociedad humana.
Desde 1940 se han desarrollado un gran mimero de compuestos
orgánicos sintéticos para este propósito . En la actualidad hay miles de
formulaciones registradas, incorporando aproximadamente 900 diferen tes compuestos químicos.
Los plaguicidas a menudo son clasificados segun su uso (Ver tabla 5 .8-1), 'o según su toxicidad (ver tabla 5,8-11)
La introducción del plaguicida al medio ambiente puede ser deba
da
a: Aplicación intencional por control de plagas o debida a contamina-
ción accidental, siendo ésta la mis frecuente . a) Aplicación intencional directa . - Esta ocurre cuando se unili
za el plaguicida en animales, campos, suelos, agua (para control de mosquitos, de hierbas acuáticas, etc .) y para uso doméstico.
b) La contaminación indirecta (accidental) puede ser de varios
tipos .
Desechos industriales descargados al agua, suelo y aire:
Fábrica de plaguicidas
Desechos de industrias alimentarias .
2) Corrientes de aire, nevadas, lluvia, agua y aire.
3) Descarga de limpieza de tanques rociadores hacia el agua y
suelos,
4) Agua de alcantarillado de casas habitación.
Distribución de basura.
Ea el agua podemos considerar que las principales fuentes de contaminación de plaguicidas son los escurriniientos de tierras tratadas, descargas industriales y domésticas.
A continuación se muestra la tabla 5 .8-1 en la cual se dotalb la clasificación de los plaguicidas según su uso, la 5 .8-11 que presenta la clasificación de plaguicidas de acuerdo a su toxicidad, la - -5 .8-111 en la cual se presenta una Lista de los principales plaguicidas existentes en México y la 5 . b- l V cm la que se muestran algunos ejemplos de plaguicidas con sus respectivas, fórmulas .
Toblo
.8-'I . C losificación de los Plaguicidas segán su uso.
Arsenicales
Arsenoato de Plomo
Arsenioio de Sodio
Fluoruros
Fluoruros
Fluorosilicoios
Cianuros
de Hidrógeno
Cianuro de Calcio
(Furn.iyantes de espacios cerrados)
Cianuro
Aceites de Pe#relea
Veg e ta l e s
Nicotina
Prretrinós
Rotenorra
Endrín
Diedrín, Eido. rn
Clorodos
Fosforados
DDT, Endosulfán
-Ieptocloro,Tedidn
Lindcno
Fosfonolos . - . --•
Dipierex
Dylox
Butoreuto
FoSfalbs
Dibfrfn
DDVP
Tiofesfnfos
Ditiofosfatos . --
Diazirron
tidn
Rger '
Peraihiones
ewin
lsalan
Carbamotos • letrl
Dimetil
Predodores
Agentes infeotivos
Hormonas
Acaricidas
Orgánicos
Clorados (Keltono)
Sulfoclorodos IOvex
Nemol icidos
Orgánicos
Clorados {Telones
Crorobromadcs (fumazone)
inorgánicos
Fungurcidos
Herbicidas
Azufre
Oxido cuproso y Sulforo dibasico de cobre
Orgd,nico s
Tiocorbamatas, ditixati rruotos
Cl radas
erc~riples lAcelcta fenrl mercúrico)
Arrtib¡r ticos
Estreptomicina
Inorgánicos
(minero es)
Con mercurio (calomelanos)
Sales de asidos (clhroto sindico!
orgánicos
alfil de dcida fenanrocítrce (24 D, 245 T }
l)eriv,de friatina ti razina)
Ureas sustituidas
inorgánicas
Rade ticidos
{
Orgánicos
Carbonato de bario,Carbonato de talio
Naturales ¡escila)
. Sintesis
Anticoagulantes
bifacinona
Warfcrina
F!uoraoefata de soda
- .706 -
''abis . 5 .8-11 Clasificación Uc los plaguicidas de acuerdo
a su toxicidad
e'
i
(mg kg)
1
I
Altamente
tóxicos
0 a 50
I - 'S
HALACION (ig.
/1) (ppm en volumen) 1 h . de
exposición)
1- D 'MI
•-•R
(mg kg)
2,4 h . de contar
to
0 a 200
0 a 2000
0 a 200 pprn)
200 hasta 2000
2000 hasta 20000
(200 hasta 2000
' II Muy
tóxicos '
111 Mediana- .
miente
Tóxicos
' 50 hasta 500
500 hasta 5000
PIr,1)
2000 hasta 20 000
.
20,000
(2000 ppm)
i
IV Poco
tóxicos
5000
20,000
* e dntiende por dosis letal oral aguda media (DL5O-ORAL), la cantidad de producto, expresada en miligramos por kilogramo de peso y administrada de una sola vez por vía oral, capaz de matar, dentro del las,
so de -14 días, la mitad de una población compuesta por lo menos de I0
ratas de laboratorio . Se determina mediante una .serie de pruebas.
-707-
Tabla 5 .8-111 Principales Plaguicidas existentes en
México
Existen en nuestro Pafs más de 50 insecticidas orgánicos Msicos los cuales están registrados para emplearse en el cultivo algodone
ro y en los cultivos básicos de consumo : un número casi igual de fungui
cillas y unos 20 herbicidas . Sin contar otros tantos los de importación.
RÜP
I
PRODUCTO
PLAGUICIDA
LD50-ORAL
OBSERVACIONES
33.l
Fosforo
minio y sus mezclas
Funguicida
LD1 pprn .
Importación
O. F .
Etil Paratión
Insecticida
3 - 6
Imp . y Fab . Nal.
O ,.C..
Endrín
Insecticida
7 .5-17 .8
Imp . y Fab . Nal.
O. F.
Meta Paratión
Insecticida
12 - 17
Imp . y Fab . Nal.
O. C .
Aldrín
Insecticida
39 - 60
Importación
O . C.
Dieldrín
Insecticida
46
Importación
80 - 90
Fab . Nal .
100 - (i . a .)
Prod . Form . lrnp
TAPO
!L ,
GRUPO II
.C
Toxafeno
Insecticida
Baygon 50
' Insecticida
Heptactor o
Insecticida
100 - 162
Importación
O .C .
DDT
Insecticida
113 - 118
Fab . Nal.
O. C .
Toxafeno
Insecticida
283
Importación
.
lordano
Insecticida
335 - 430
Importación
430
Importación
,C ,
0.
O. F.
Dibrom (Naled Insecticida
- 708 -
GRUPO 111
.1- IPt
PRODUCTO
PLAGUICIDA i D50
OBSER V ACIONES
Insecticida
510 850
Importación
O . F . Malatión
Insecticida
1375
Importación
O . C . Atra íri
Herbicida
1 750 - 3080
Fab . Na 1,
ón
Herbicida
300
Imp . Y Fab . Nal,
1 íerbiciLla
3500 - 3700
Fab . Nal.
O .S . . Prometrín
1lerbicida
3750
Fab . Nal.
O . C, Pilan
Her bicida
3860-330
(i,a .)
Prod . F Forrn . €rllp,
Sevín
C.
CO . C .
C.
I
!
Monurón
GRUPO
Si rn aZln
1 íerbicida
5000
Fab . Nal.
Tordon
Hei-bic ida
8200
Importación
Herbicida
8 900
Importación
1lerbiciria
10000
Importación
Corlara
4
i altor olín
( I"reflan)
l
O .F . ORGANO 1 7OSFO1 ADO
O . C . ORGANO CLORAID
O, S . ORGANO SULFURADO
O.
*
CARBAMICO
DE OTRO TIPO
709
Ipuestoz Relocioaados
robla 5. 6-1V . Lisa de P a iicidaag Herbic dos y
No, Nombro
Fórmula
Peso
Moled lar
~rrrdOrto
coHoCI 1
290.135
Estructuro
Cl
Cl .
Tapo 0rgonocrarodos
C15 Cl
Heptflcloro
Aidn'n
caz el
3 i e l d rir1
364.6
.G1 zHsC C6 O
O141-I$ Ci4
DDE
318.03
1
Endrin
11 DDD
12
o,p-DDT
t3
r
Cl
3732
cJ
c1 d•
eCla D
38026
CI ~— C
il
cC12
Cf
I somero Endo - E n do del
CI
0ieldrin
Cl
, p '- D T
CI
CCI3
14 Keltino
C„ y O1 0
OH
370.50
CJ
C
Cf
CCI 3
15 MetoxicJoro
CI 5.C13 0
345.65
H
CE30-0- IC -~>-i?CH I
Cei 3
710 Tabla 5 .8-1V (ontinuoclon)
Niz
Nombre
38
Atraxin
1
Pesa
Formula
H
Estructuro
lulo tin
14 C1N 5
Ci
215.73
C
HN
1
11
0 2 143 - N -- C
N
1
C --NIMC - CH 3
N
3
CH
40
. Monurán
C $ H„ C1N 2 O
198.65
J!
3
Cl --~~~ NH - C-- N
\H 3 .
41
Diván
C9F1,
CJ
1 2 N 20
233,10
H3
--
NH-C91 –N
°1--
CI
CH
Tipo Organofosforadoa
28
Pa rallón
Ci oH k NO5 PS
29127 C AOS
O
P-o—Q z
C2HS
24
Meta P%ratió
. C 5 H I.0NO 5 PS
CNO
26327
~l
P—O
NO2
CH 3 O
42
Sevf i
N
Ci
,i NO2
C K,11 ." 5
Tipo Carbdmico
201 .24
Tipo Or onosulfurado
SCH3
241 .41
C
H
N
N
k
3
CH3
CH3
5 .8 .,
Significado Sanitario
La liberación de los plaguicidas al medio ambiente, presenta un
daño inherente para muchos organismos (no sólo los que se pretenden
matar) . El pelito para los ecosistemas acuáticos depende de las propiedades físicas y químicas del plaguicida, tipo de formulación, frecuen
cia, la tasa y método de aplicación y la naturaleza del sistema receptor.
Los que más nos conciernen, son aquellos que persisten por lar
gos periodos y se acumulan en el medio, aquellos que son altamente tó
xicos al hombre, peces y vida silvestre y aquellos que se usan en gran-
des cantidades en áreas extensas . Entre estos podemos mencionar - D1)T, aldrín, dieldrih, endrin, Ii ptacloro, rnalatión, metil paratión etc.
La mayoría de estos compuestos son insecticidas o herbicidas,
usados generalmente en agricultura, salud publica y jardinería.
Todos los plaguicidas orgánicos están sujetos a degradaciones
en el medio ambiente ; sin embargo,compuestos específicos varían mucho en su velocidad de degradación y algunas de las formas degradadas
pueden ser tan persistentes y tóxicas como los compuestos originales.
Algunos plaguicidas, principalmente los compuestos organocloralos, son extremadamente estalles, degradándose lentamente o forman
do productos persistentes de deradación . Los organismos acuáticos
pueden acumular esos compuestos directamente por absorción del agua
0 mediante la cadena alimentaria por contaminación de un organismo
- 712 -
de un nivel tráfico inferior.
Algunos de estos plaguicidas (oronoclorados) son considerados
especialmente dañinos por su persistencia y acumulación en orgauisrnos acuáticos.
Estos compuestos incluyen algunos de sus rnetaboliros que son
directamente tóxicos a varias especies acuáticas en concentraciones de
1 mg/l . Su acumulación en sistemas acuáticos presentan daños, reales
y potenciales, a animales en los niveles tráficos más altos, incluyendo
al hombre.
5 .8 .3 Muestreo y Almacenamiento.
Se deben usar botellas de vidrio de boca ancha, equipadas con tapón de rosca de teflón, no se debe usar botellas de plástico, puesto que ellas introducen interferencias y absorben plaguicidas . El tamaño
de niuéstra es dictaminado por la sensibilidad requerida para un propó
sito general, particular y por el sistema de detección que vaya a emplearse Si se va a emplear en el análisis más de un método, se requie
re un volumen de muestra mayor, suficiente para abastecer la necesidad de cada análisis, así mismo para que permitan que se corran dupli
ca g as . acabados de análisis . Para evitar la rotura de las botellas de
vidrio, conteniendo las muestras, se ponen 'éstas en moldes de polietileno .
En los frascos debe anotarse ; fecha, hora, ubicación, profunâi-'
dad, contaminantes sospechosos, tipo de muestra, así como cualquier
otra información que'pued ser útil en la interpretación de los resultados . Acerca de la recepción de las muestras en el laboratorio, éstas
deben registrarse inmediatamente ; debido a la inestabilidad de muchos
de los plaguicidas en agua, las muestras deben extraerse y analizarse
tan pronto corno sea posible después de su colección, Si las muestras
se tienen que almacenar, deben ponerse en un lugar frío y oscuro (de
prefexrencia en refrigeración).
5,8 .4 Técnica Analítica (Cromatografía de Gas)
5 .8 .4 .1 Generalidades
La crromatograffa es un método físico para la separación de corra
ponentes en una mezcla . La base del proceso descansa en una columna
de separación, la cual normalmente es una tubería de diámetro pequeño,
empacada con una cama estacionaría de gran área de superficie . Una
fase móvil se filtra a través de la cama estacionaria . El nombre de
"cromatografía de gas" denota que la fase que se mueve es un gas,
"C romatografza de gas-sólido" es el término específico aplicado al pro
ceso cuando la fase estacionaria es un adsorbente sólido activo, " Gromatografía de separación gas--líquido" tiene, corno fase estacionaria,
un liquido distribuido sobre la superficie de un soporte sólido.
Los procesos básicos responsables de las separaciones cromatográficas gas-sólido y gas-líquido son, respectivamente adsorción y
- 714 -
separación o partición . La última es más popular.
Aunque las separaciones pueden llevarse a cabo por medio de análisis por elución, frontal y de desplazamiento ; en la práctica, la técnica de elución es la más común.
En el método de elución de cromatografia de gas, una corriente
de gas transportador fluye a través de la columna . Una muestra se inyecta dentro del gas transportador como un "tapón" de vapor que es
arrastrado dentro de la cabeza de la columna crornatográfica empacada.
La separación de los componentes que comprende la muestra, resulta
de una diferencia en las rnúltiples fuerzas por las cuales los materiales de la columna tienden a retener cada uno de los componentes, a
sea que la naturaleza pie la retención sea adsorción, solubilidad, liga—
duras, químicas, polaridad, o filtración molecular, la columna retiene
algunos componentes más tiempo que a otros . Cuando en la fase gaseo
sa, los componentes se mueven hacia la salida de la columna, son selecr.ivamente retenidos por la fase estacionaria . Como consecuencia,
todos los componentes pasan a través de la columna a velocidades variables y emergen en orden inverso a su retención en los materiales de la columna . Al emerger de la columna, la fase gaseosa entra irme
diatamente a Lrn detector contiguo a la columna . Aquí los componentes
individuales registran una serie de señales que aparecen como una sucesión de picos arriba de la linea base en la curva registrada o croma
tograma . El área abajo del pico us una indicación cuantitativa del com
ponente ; el . tiempo entre la inyección y la aparición de los picos sirve
para identificarlos.
Una ventaja significativa de la técnica de elución es la caracterís
tica de . autopurgado, en el cual, la columna se regresa generalmente a
su condición original al final de cada análisis.
a) Clasificación de las Técnicas en Crotnatografía
Operación
Disposición de la
{ fase Estacionaria
Papel
Fase Móvil
Líq . - sólido
En el Espacio Capa fina
L ;q . - sólido
Columna
Liq . - sólido
Crómatografía En el tiempo
Líq . - sólido
1
Gas - sólido
Columna
Gas - líquido
Lfq . - Líq.
b) Ventajas de la crómatografía de gas
Alto poder de resolución., rapidez, sensibilidad, versatilidad, se
pueden analizar muestras complejas, se pueden obtener análisis cuanta
tiros y cuantitativos .
- 716 -
5 .8 .4 .2 Equipo
a) CromarógTafo de Gas
Básicamente, todos los cromatórafos de gas de laboratorio estan constituidos de seis partes : (1) el regulador de presión y medidor de
flujo para el abastecimiento del gas transportador, (2) un sistema de in
yec ión de la muestra, (3) la columna de separación, (4) el compartimiento térmico, (5) el sistema de detección, y (6) un registrador . Para algunos propósitos, se incluyen un purificador del gas transportador
y un sistema de recolección para el gas efluente.
Gas acarreador
Area de
inyección
Registrador
Detector
Columna y
horno
-
Fig . 5 .6-1 Sis rema croratográfico,
Mnndmetro
Regí strador
Horno
Fig . 5 .8-I1 Diagrama de flujo
1) Regulador de presión y medidor del flujo
La eficiencia de operación de un cromatógrafo depende directa-
mente del mantenimiento de una velocidad muy constante del flujo del
gas transportador . El gas transportador, procedente del tanque, pasa
a través de una válvula de palanca, un medidor de flujo, más de ; un metro de restrictores capilares de metal, y un barómetro de presión.
El medidor de flujo, indica la velocidad del flujo en el lado de referencia de la celda de conductividad térmica.
Los contaminantes en el gas transportador pueden afectar el corre
portamien to de la columna, así corno la respuesta del detector, cuando
se emplean detectores de ionización,
2) Sistema de inyección de la muestra
El problema más severo en la cromatografra de gas se presenta
en el sistema de inyección de la muestra . Este pequeño dispositivo, de
be introducir la muestra en una forma reproducible y, si es un líquido,
vaporizarlo instantáneamente . Se requieren grandes cantidades de calorâ a pesar, de ello, la muestra no debe descomponerse ni producir
aumento brusco de presión.
Las muestras líquidas se inyectan con jeringas hipodérmicas a
tráves de un diagrama de hule de sin e& autosellado dentro de un bloque de metal calentado evaporador relámpago).
La inserción, inyección y remoción de la aguja, deben llevarse
a cabo rápidamente . Para la máxima eficiencia se debe utilizar una muestra lo más pequeña posible, dependiendo de la sensiblidad del de-
718 -
tector (1 - 10 ) 11 ) .
Los sólidos se deben disolver en líquidos volátiles o temporalmente convertirlos en líquidos por exposición al calor infrarrojo.
Las muestras de gas se inyectan por medio de una jeringa especial para gas o por una válvula de . muestreo de gas, llamada divisora de
corriente.
3) Columna cromatográfica
El corazón del cromatógrafo es la columna, empacada o capilar,
en la cual se efectúa la separación . La columna empacada comunmente
es un tubo de 4 mal de diámetro interior, de acero inoxidable, cobre,
cuproniquel, o vidrio, ya sea doblada en forma de U o en serpentín.
Dentro de la variedad de soportes sólidos disponibles(con los cua
les se en pasan las columnas), los derivados de tierras diatomáceas son
los tnás populares . Se emplean corno fase estacionaria en la crornatografía de gas-sólido absorbentes tales corlo gel de sílice, criba . molecular, alúmina y carbón . activado . Comercialmente se encuentran columnas que cubren una amplia variedad de material de soporte y fases
líquidas.
Los requerimientos generales de una fase líquida son : buenas propiedades disolventes para los componentes, separación diferencial
de los componentes de la muestra, estabilidad térmica elevada y una baja presión del vapor a la temperatura de la columna . Es necesario
el acondicionamiento de la columna antes de utilizarla, para eliminar .
todos los materiales que puedan tender a salirse cuando se calienta el
empacado, por primera vez, durante varias horas a la temperatura md
xima del uso subsecuente.
El gas transportador puede ser nitrógeno, helio, hidrógeno o
argón . La disponibilidad, pureza y el tipo de derectór empleado determina la elección.
4) Compartimiento térmico
Es un requisito el control preciso de La temperatura de la colum
rea, si lo que se intenta es mantener una temperatura invariable o proveer de una temperatura proga-arpada . La temperatura de horno de la
columna debe controlarse por medio de un sistema que sea sensible a
cambios de 0 .01 'C y el cual mantenga un control de O I C.
5) Detectores
El fin de los detectores es controlar la colwirna efluente, inidien
do variaciones en su composición . Ellos, sin embargo, no identifican
los componentes de una mezcla.
La rnaorfa de los detectores son de los llamados de tipo "diferencial' T , ellos dan señal cero cuando el gas transportador puro pasa a través de ellos, pero cuando un componente de una mezcla es detectado, la señal es proporcional a la concentración . o masa de ese componente, Los detectores "integrales", por otro lado, dan una señal con-
-720-
tima quo es proporcional a la cantidad total de substancias que han sido
elurdas .
Entre los factores que se deben considerar están la aplicabilidad,
tiempo de respuesta, margen lineal dinámico,sensiblidad señal de fondo .
Detectores de ionización .- El proceso tísico ,fundamental que de
linóa la operación de todos los detectores de ionización es la conducción
de la electricidad por medio de gases . A temperaturas y presiones nor
males [in as se comporta corno un .iísl,'ai1re per leido ; sin c.tei rgo,Hi es
ean presentes átomos cargados eléctricamente, moléculas o clec! ro_ líes libres, su movimiento libre en dirección a un campo eléctrico, hace conductor al gas . En ausencia de conducción por las propias molécu
las del gas, se puede observar la conductividad incrementada debido a la presencia de muy pocas moléculas cargadas y esto explica la gran sen
sihilidad i[e los métodos de ionización para el análisis de gases.
Dentro de este tipo de detectores están el de flama, que responde a todos los compuestos orgánicos excepto al ácido fórmico ; el de seo
ción cruzada o transversal y el de argón.
Detector de captura de electrones . - Al contrario de otros detec
tares de ionización, mide la pérdida de la señal debido al fenómeno de
r.ecombinagión más bien que a la medición de una corriente eléctrica
positivamente producida . Este detector es extremadamente sensible a
grupos funcionales electronegativos tales como carbonatos conj ugados,
nitritos,halógenos, anhidridos etc .,no es sensitivo a grupos aminos, cetinas etc . . Por su sensibilidad a los grupos mencionados se puede considerar aceptable para plaguicidas organoclorados y organofosforados.
6) Registro de la señal de corriente
En el área de lectura, la elección del registrador determina la
exactitud final del c.rornatógafo . La velocidad de la respuesta debe estar abajo de un segundo.
b) Cristalería
Procedimiento de limpieza .
Es particularmente importante que el equipo de vidrio usado en
el análisis de residuos de plaguicidas, esté escrupulosamente limpio
antes de su uso ' inicial, así como tambi n,despu s de cada análisis se lave tan pronto como sea posibles lavando con mezcla crónica, agua y
el solvente que se va a utilizar.
5 .8 .4 .3 Purificación de reactivos químicos
a) Solventes (hexano, nceno,etc
m )
Las razones de purificar estos solventes es que con el tiempo
baja su pureza ; aún los de gi-ado ' fplaguicida'T se ha encontrado que
son de ' una calidad muy pobre, por lo que necesitan purificación.
Entre los métodos usados están : destilación, columna y doble destilación
b) Adsorbentes (al m a, florisU) se purifican mediante filtra`
- 722 -
clones y lavados.
e) Sulfato de sodio, se debe secar,
d) Aguase purifica mediante extracción.
5 .8 .4 .4
Procedimiento
a) Definición de algunos términos
1) Cromatograrna . - Es el trazo de la respuesta del detector
contra el tiempo o volumen del gas transportador . Este trazo normalmente se realiza en un graficador y de aquí que la respuesta del detector contra el tiempo sea su forma usual.
2) Cresta . - Es la respuesta del graficador de un detector dife
rencial debida a un componente de la muestra
3) Línea base . - Es la porción del crorn tograrna entre cres-
tas, donde el componente
la muestra no se ha eluido ..
4) Area Integrada .- Es el área bajo una cresta, que se obtiene con un integrador eléctrico o m canica.
5) Resolución .- Es el factor de separación entre crestas.
6) Evaluación del crornatograma . - Los análisis se basan en medir las crestas hechas en los cromatogramas.
Las medidas más fundamentales son las áreas de la cresta, pero las medidas de las alturas de las crestas dan resultados frecuentemente satis factor ios .
Las áreas de las crestas pueden determinarse de varias mane-
- 723 -
ras : por planíxnetro, por cortar la cresta de la carta y pesando el papel y por integración eléctrica o mecánica.
Otros métodos aproximados para estimar las áreas de las crestas y que frecuentemente son dtiles son:
Midiendo la altura media y multiplicándola por la anchura.
Dibuj ando tangentes a cada lado de la cresta y haciendo con ellas un triángulo con la línea base ; el área de este triángulo es aproi- `
imadamente proporcional al área de la cresta.
b) Metodología (Método Canadiense para aguas)
1) En la botella de la muestra, adicionar 8 ml de henceno por
cada litro de agua, agitar 30 veces por inversión, verter sobre un embudo de separación de dos litros . (El tamaño del embudo depende del
volumen de agua extraída . Para un litro de agua se usa un embudo de
dos litros), enseguida lavar la botella de la muestra con 50 6 60 ml de
agua y dos veces con 60 ml de hexano; adicionar la solución de lavado
al embudo .
2) Agitar el contenido vigorosamente y permitir que se separe
la capa orgánica . Si se forma emulsión añadir unas cuantas gotas de
cualquiera de la siguientes soluciones : Solución saturada de sulfato de
sodio, rnetanol, isopropanal, ó de .ee octanol . Todos los compuestos
químicos usados, deben ser de alta calidad y probar que estén ausentes
de picos extraños .
- 724 -
3) Precaución .- No añadir mucho alcohol, pues puede resultar
un pico largo del solvente, 5 6 10 gotas pueden ser suficientes, drenar
la capa orgánica bajó una succión rápida a través de una columna corta
con sulfato de, sodio (50 gramos), usar un matraz de bola de 500 ml como recibidor.
4) Repetir la extracción dos veces (paso 1 y 2), con 35 ml de
hexano, después de la anima extracción lavar el embudo de separación,
dos veces, con 20 ml de hexano y pasar a través de sulfato de sodio anhidra .
5) Concentrar los extractos combinados de hexano bajo vacío
hasta aproximadamente 3 ml ; durante la evaporación la temperatura del
baño de agua no debe exceder de 40°.
6) Usando una pipeta Pastear, transferir el concentrado cuantitativamente a una columna de Florisil preparada corno sigue:
- A una columna crotnatográfica de 19 mm de diámetro interior,
con lana de vidrio al fondo, añadir 3/4 partes de hexano, adicio
nar 2 gramos de sulfato de sodio pretratado y 15 gramos de 14o
risil al 5% de humedad, golpear ligeramente la columna mientras se va a adicionando ; drenar algo de hexano para asentar la
capa de Plorisil y adicionar otros 3 gramos de sulfato de sodio.
- Prelavar la columna con 50 ml de benceno seg3uida por dos adj.
clones sucesivas de hexano, drenar y descarnar los elucntes .
-75-
- Eluir la misma columna con 200 ml d benceno-hexano
y pasar el eluyente a un matraz de bola de 500 ml y concentrar
a 1 rnl (si se llega a menos de 1 ml aforar hasta el mililitro)
7) Manejo del Aparato .- por la -an diversidad de . equipos, se
guir las instrucciones del . fabricante.
5 .8 .5 Bibl iogx a fía
EPA .- Water. Quality Criteria, March 1973.
Willard, Merritt, Dean . - Métodos instrumentales de análisis . CE A . - 1971.
Rcsaurces lnvestigations of the United States Geological Sur vey . Techniques of Water . - Chapter A .- Methods for Analysi of Organie
Substances in Water .- Washington, 1972 .
5 .9 . SUSTANCIAS ACTIVAS
AL AZUL DE METILENO (DETERGENTES) *
5 .9 .3.
Generalidades.
Los detergentes son sustancias que tienen la propiedad de reducir
la tensión superficial del líquido en el cual se encuentran disueltos, de modo que éste adquiera mayor poder de penetración a través de los poros
de ciertos materiales, a la vez que se extinde más fácilmente en .la su -
perficie de los cuerpos en los que se aplica.
A partir de 1945 los detergentes sintéticos han tenido gran acepta
ción debido a que no son afectados por las sales minerales contenidas en
las aguas duras, además tienen elevado poder humectante, son neutros en aolución, de fácil producción y precio moderado.
Los detergentes están . constituidos, en un 20 a 30%, de una sustan
cia activa llamada surfactante o agente tensoactivo, y en un 70 a80 de aditivos que sirven para aumentar las propiedades de los detergentes ; en
tre los aditivos más comunes están los siguientes:
Tripolifosfato de sodio
25 - .S o
Sulfato de sodio
5 -
Silicato de sodio
2 . - 1_0%
10
Blanqueadores ópticos, colorantrazas ,
tes, enzimas
La molécula del surfactante está . constituida por una cadena polar
alifática , que es hidrofl tica (soluble en agua) y una arórnática que se ca* El método del azul de metileno está considerado como Norma
Oficial Mexicana
publicada en el Diario Oficial el 29 de diciembre de
1976 . . ,.+
- 728
racteriza por ser hidrofóbicá (insoluble en agua) . A esta dualidad en la
naturaleza de la molécula, se deben las propiedades humectantes, disper
santos y emulsificantes de los detergentes.
Gruposhilarofóbicos
Grupos hidrofflicos
ácidos grasos
carboxilatos
parafinas
sulfatos
olefinas
sulfonatos
a lquil -bencenos
hidroxilos
alcoholes
arnonio cuaternario
alquil -fenoles
polioxipropilenos
5,9 . 1 .1
Fenómeno de la detergencia.
Consiste en poder eliminar de una superficie :aceites, grasas o partfculas sólidas dispersas en aceite.
La forma en que actUan las moléculas de surfactante es la siguien
te : la parte hidrofóbica rodea las partfculas de suciedad separándolas de
la superficie y la parte hidrofflica actúa como emulsi ,cante haciendo que
permanezcan las partfculas en suspensión.
Clasificación
.9 .1 .2 ' de los surfactantes de acuerdo a su disociación
electrolítfca.
Esta clasificación depende de la naturaleza del grupo polar y pue-
- 7-
de ser de tres tipos : aniónicos, atiánicos y no idnicos.
a) Surfactantes aniónicos . - Son sales de sodio que al ionizarse
producen un ion positivo, que es el sodio, y un anión, o ion negativo, que
es el surfactante activo . Los más comunes son el sulfonato de alquil- benceno (ABS) y el sulfonato del alquilo lineal (LAS) : La principal Bife- rencia entre ellos es la 'configuración molecular : . en el LAS es lineal y por lo tanto más biodegradable aunque más tóxico, y en el ABS es rarnifi
cada y por consiguiente menos biodegradable, pero menos tóxico.
H
f
H-C-H
H H H
1
H~- C
c
H
Grupo metilo
1
H-C-H
H
H
1
.-_
---
e-
1 .
1
.
H. ~H H H
1
1
H
Cadena
Alquflica
H
H -C -H
H
H
CH
1
II
HC .
CH
0=5=0
01
1
a
Suifonato de alquil - Benceno (AM)
Anillo
Besnico
H
H
1
C
C
H
FI
Fi
H
H
H
H
H
Fl
1
1
1
1
I
1
1
1
1
C 1
H
H
H
_ C - C -
- C - C
1
1
1
1
1
H
H
F-1
H
H.
1
_H
1
1
FI
H
He
CH
fl
HC
lf
C
Sulfonato de alquilo Lineal (LAS)
Na
- 731 -
b) -Surlactantes catiónicos . - Los surfactantes catiónicos típicos,
son compuestos cuaternarios de amonio que presentan actividad anti id crobial . Se usan como agentes sanitarios debido a sus propiedades desin
fectantes . Su fórmula es:
x
L
R4
R 1 , R y R 3 = grupos alquilo
R4
= anillo aromático
X = halógeno
e) Surfactautes no-i hicos . - Son ci resultado de la polimeriza - ción de moléculas de óxido de etileno . Este producto puede reaccionar con alcoholes grasos, alquil-fenoles, grasas y ácidos grasos, emulsio- nándolos en el agua, Una característica de estos compuestos es que pre
sentan poca tendencia a formar espuma cuando se combinan con otros ma
teriales.
Su fórmula general es:
[c2H4o1
0
R = grupo alquilo .
11
- 732 -
d) Detergentes biológicos . - Recientemente aparecieron en el mor
cado una serie de detergentes llamados biológicos, que son una mezcla de
detergente común, perfume, colorantes y un agente biológico, que es una
enzima proteolftica producida por una bacteria llamada Bacillus subtilis, Esta enzima, al encontrarse en condiciones favorables de temperatura y humedad, provoca la desintegración de las moléculas de grasa, incluyendo
también a las proteínas.
5 .9.2
Sipificado sanitario.
bien todos los detergentes se degradan por un ataque biológico,
el grado de descomposición se relaciona con su estructura química . Así.
tenemos que las ramificaciones en la cadena alquiiica del surfactante - ABS, causan un retardo definitivo' en su degradación ; ésta resistencia per
sirte aún después del tratamiento biológico normal . En los efluentes de las plantas de tratamiento de lodos activados, se observa una degrada- ción del en el ABS y de un
9095
en el LAS, en relación con el influen -
te .
Entre las dificultades causadas por un alto contenido de detergen
tes en el agua y aguas de desecho tenemos:
a) Espuma . - Desde el punto de vista estético es indeseable la formación de espuma en los cuerpos de agua . En plantas de tratamiento
provoca problemas de operación, oculta los equipos de control y recubre
las superficies de trabajo con sedimentos que contienen altas concentraciones de surfactantes, grasas, proteínas y lodos ; afecta la sedimenta- ción primaria, ya que engloba partrculas haciendo que la sedimentación -sea más lenta ; también dificulta la dilución y difusión del oxigeno atmosfé
rico en el agua.
b) Toxicidad en la vida acuática . - No es posible dar un valor co rno límite de toxicidad debido a que las sensibilidades de cada organismo
van a variar con relación a la especie, tamaño, tipo de detergente
y -
-
otros factores ffsicos del medio ambiente . Debido a. su importancia echo
;mica y al papel que desempeñan en las cadenas de alimentación, se han
hecho 'Investigaciones, principalmente en peces, y se ha encontrado por
ejemplo que la concentración máxima que puede soportar la especie Pirnefhales prometas es de 1 .2 ppm de LAS . Para Lepomis macrochlrus
es de 3 pprn con LAS de 12 átomos de carbono y 0 .6 ppm de LAS con 14 átomos de carbono.
Las agallas de los peces son sensibles a concentraciones de 0 .5 ppm de LAS.
El camarón de. agua dulce y las truchas se ven afectadas con 2 .5 a
14 ppm de cualquier surfactante.
Se puede concitar de estas investigaciones que la concentración le
tal en' los peces seleccionados varía de 0 .2 a 10 pprn de. acuerdo con los -
- 734 -
factores mencionados anteriormente.
c) Toxicidad en agricultura . - Al utilizar aguas que contengan de
tergentcs,para irrigación, se puedencontaminar los suelos, y por consi
guiente, los cultivos; así, por ejemplo, se ha visto que el ABS inhibe el
crecimiento de las plantas corno et girasol en un 7070 a una concentración de 10 ppm y en un 10070 a 40 ppm.
d) Eutroficaclón . - Los detergentes presentan un alto contenido de fosfatos, los cuales son nutrientes, por lo que su presencia provoca
una sobrepoblación de la flora acuática, la cual al morir, sufre -una ac ción degradativa rnicrobiana, ocasionando una mayor demanda de o cfge no, que perjudica a la .' fauna y al propio cuerpo de agua.
e) Entre otros efectos secundarios producidos en los procesos de tratamiento de aguas residuales, se pueden mencionar : cambios en
la DBO y en los sólidos suspendidos, efectos corrosivos en algunas par tes mecánicas de las plantas, interferencias en el proceso de cluración
y en la determinación de oxígeno disuelto ; algunos aditivos usados en - los detergentes pueden interferir en la formación de flóculos.
5 .9 .3 .
Muestreo y almacenamiento.
Deben evitarse condiciones espumosas o por lo menos despejar
las áreas antes de muestrear.
El recipiente para la muestra puede ser de vidrio o plástico pe ro en la limpieza de éstos nunca se debe usar detergentes ya que pueden
quedar trazas de éstos en los recipientes y, por consiguiente, obtenerse .
resultados falsos Positivos . Para su limpieza puede usarse mezcla crb mica .
Las muestras deben mantenerse en refrigeración (4° y el aná lisis debe efectuarse én un lapso no mayor a 24 horas.
Selección del método de análisis.
5 . 9 .4
Primero hay que analizar la muestra por el método del azul de metileno . Si la concentración es baja (500 Iag l) no se realizan otros análisia, ya que la suma de las interferencias (generalmente positivas) rnAs la concentración real del ABS es tal, que la concentración no es un
valor significativo en el agua,
El procedimiento del azul de metileno es satisfactorio cuando no
se obsean problemas en . el cuerpo de agua . Cuando el análisis nos indica concentraciones altas es importante saber ctiánto representa la con
centración real de ABS y cuánto las interferencias . En tales casos se
hace una determinación infrarroja o si no se cuenta con este equipo, se
efectúan los primeros pasos del método de infrarrojo para la recupera- ción del ABS y después se completa con el colorirn tr1co del azul de rneti
leno,
La mayor desventaja del método de infrarrojo es que comparada
con el cólorimtrica del azul de metileno,es demasiado complicado y
tardado.
El método de absorción con carbón (infrarrojo) es aplicable sólo
a muestras de aguas crudas y no en desechos industriales o domésticos.
El método del azul de metileno se aplica al análisis de surfactantes arrió
Hicos en suministros de agua potable.
Desafortunadamente las aguas residuales, efluentes de plantas de
tratamiento y aguas contaminadas, normalmente contienen gran cantidad
de substancias que interfieren en la determinación de los surfactantes - por lo que es difrcil obtener un valor exacto de éstos, pero se puede te- ner una estimación aproximada . Sin embargo, aguas con concentra clones de cloruros cercanas a 1 000 mg/l, muestran interferencias positivas y corno no se conoce el grado de interferencia en forma cuantitativa,
definitivamente no puede usarse el método para agua de mar, o aguas con
esas concentraciones de cloruros.
Corno el surfactante más comunmente usado en la fabricación de detergentes es el sulfonato de alqull-benceno (ABS), es el que con mayor
probabilidad se puede encontrar en las aguas crudas de los abastecimien
tos . Por esta razón se ha seleccionado al ABS corno el compuesto pa trón para los métodos de análisis.
5 . 9. 5
Método del azul de metileno.
5 .9 .5 .1
Principio.
Este método depende de la formación de una sal colorida azul, -
cuando reacciona el azul de rnetileno con los surfactantes aniónicos, incluyendo ABS, sulfatos de alquilo, y sulfatos polietoxil-alquflicas . Todas
las sustancias determinadas, son designadas corno sustancias activas al azul de metileno . La sal que se forma, es soluble en cloroformo y la
intensidad de su color es proporcional a la concentración, La intensi- dad es medida mediante lecturas espectrofotométricas en este solvente a una longitud de onda de 652 nm . Este método
es aplicable en un ámbi-
to de 0 .025 a 100 mg /1 de ABS.
5 .9 .5 . 2
Interferencias.
Cuando se determina el ABS en el agua, los errores positivos
son más comunes que los negativos . Entre las interferencias positivas
'se tienen los sulfatos orgánicos, sulfonatos, carboxilatos, fosfatos y fenoles, . los cuales forman complejos con el azul de metileno, lo mismo que los cianatos inorgánicos, cloruros, nitratos y tiocianatos, los cuales
forman pares de iones con el azul de rnetileno, ocasionando interferen- ciar positivas . Compuestos orgánicos, especialmente aminas, compiten
con el azul de metileno en la reacción, causando resultados bajos.
5 .9 .5 .3
Equipo . .
.
a) Espectrofotómetzo, para usarse a 652 nm, provisto de un paso
de luz de 1 cm o más largo, b un fotómetro de filtro, provisto de un paso
de luz de 1 cm o más largo y equipado con un filtro de color rojo que ex-
hi pa su máxima transmitancia a 625 nrn.
b) Embudos de separación de 500 ml, preferentemente con llaves
de teflón.
5 .9 .5 .4
Reactivo s
a) Solución madre de sulfonato de alquil benceno (ABS) . - Se pesa
1 .0 g de ABS en base 1002 activo . Se disuelve en agua destilada y se di
luye
a
1 000 ml 1 .0 ml
= 1 .0 mg
de ABS .
Se conserva
en refrigeración -
para evitar su blodegradación . Es necesario prepararla cada semana.
b) Solución patrón de ABS .- Se diluyen 10 ml de la sol . madre de
ABS a 1 000 ml con agua destilada ; 1 .0 ml 0 .01 mg de ABS . Se debe preparar diariamente.
c) Indicador de fenolftaleína . - Se disuelven 5 g de fenolftalefna en
500 ml de alcohol etílico o isopropilico al 95% y se agregan 500 ml de agua destilada . Si es necesario, se agrega hidróxido de sodio 0 .02 N, go
ta a gota, hasta que aparezca una . débil coloración rosa.
d) Hidróxido de sodio IN . - Se disuelven 40 g de hidróxido de so dio (NaOH) en agua destilada y se diluye a un litro.
e) Acido Sulfúrico
N -
Se diluyen cuidadosamente 28 ml de H2 -
504 concentrado, de un peso específico de 1 .84 g/cc en un litro de agua
destilada .
f) Cloroformo, calidad ACS .
g) Reactivo de azul de metileno . - Se disuelven 100 mg de azul
de rnetileno (Eastman No . P 573 equivalente) eh 100 ml de agua destilada . De esta solución se pasan 30 ml a un matraz volumétrico de un litro
y se agregan 500 ml de agua destilada, 6 . S ml de ácido sulfúrico concen .
tocado y 50 g de ortofosfato mono sódico monahidratado (NaH PO4. H20), agitando hasta su completa disolución, y se diluye hasta el aforo.
h) Solución de lavado . - En un matraz volumétrico de 1 000 ml se agregan 6 .8 l de i SO 4 concentrado a 500 ml de agua destilada . Se
adiciona a continuación 50 g de NaH 2PO4 • H20 y se agita hasta completa
disolución . Se diluye hasta el aforo.
5 .9 .5 .5
Procedimiento.
a) Curva de calibración . - Prepare una serie ..de . 10" embudos de separación con O, 1, S, 5, 7, 9,11,13, 15 y 20 ml de : i ;solucid rr : patrón' de -:ABS . Se agrega agua destilada hasta obtener un' volumen de 100 ml , en ca
da embudo de separación : Se siguen los pasos de'extracCió , :desarroklo
del Color-y medición como se describen póster1órrn ñte ;, y - fié . traza una
curva' de calibración de mg de ABS contra absorbancia
b) Selección del volumen de la mues ra:..= :l i.:volumen de: la .rnues
tra de agua para ser analizada, se toma de acuerdo a la concentración probable de ABS :
Concentración esperada de ABS
( mg
l)
Muestra a tomar
( m i)
0 .025 - 0.080
400
D .08 - 0 .40
250
0 .4
- 2 .0
100
2 .0
- 10
20
10 .0
- 100
2
Si el volumen indicado de la muestra es menor a 100 ml puede di
luirse con agua destilada hasta 100 mi ; que es el volumen que comunmen
te se utiliza.
c) Extracción y desarrollo del color . - coloque La muestra en un
embudo de separación, alcalinice la solución agregando gota a gota Na 011 IN, usando fenolftalefna corno indicador . En seguida adicione -F1
FI
24
gota a gota hasta la desaparición de color rosa.
Se agregan 10. ml de cloroformo y 25 ml de azul metileno, se a
fi.
ta, en forma oscilatoria, vigorosamente por 30 segundos y se deja que las fases se separen . Una agitación excesiva puede ocasionar la formación de una emulsión . Algunas muestras requieren un período de tiem más largo para la separación de las fases . Antes de extraer la capa de
cloroformo, remover suavemente la muestra, dejar que se asiente.
Se extrae la capa de cloroformo a un sep
. ado embudo de separa-
-741-
cien y se lava el tubo de descarga del primer embudo de separación con
una pequeña cantidad de cloroformo . Se repite la extracción por 3 veces,
usando 10 ml de cloroformo en cada ocasión, si se desvanece o desapare
ce el color azul en la fase acuosa, se debe descargar la muestra repetir la determinación usando un volumen menor de muestra.
Se combinan todos los extractos en el segundo emido de separacrin, se agregan 50 ml de solución de lavado y se agita vigorosamente, (en este paso no hay problemas de que se forme la emulsión), por 30 se gundos ; se deja reposar y se extrae la capa de cloroformo a través de un embudo de tallo que contenga lana de vidrio, a un (matraz aforado de
100 rnl y se repite el lavado dos veces, usando 10 ml de cloroformo en cada ocasión . Se lava la lana de vidrio con cloroformo, recogiéndose los lavados en el mismo matraz aforado, y se diluye hasta el aforo, (con
el cloroformo), y se mezcla bien.
d) Medición . - Se determina la absorbancia de la solución a 652
nrn contra un testigo de cloroformo.
5, 9 .5 .6
Cálculos.
rnl AB total aparente =—,.rn..~-.
85 leidos
. en la curva de calibración x 1 00
ml de muestra .
Método de adsorción con carbón (tentativo).
5 .9 .6
5.
9 . 6 .1
Principio.
Este método involucra la separación de la concentración de ABS
presente en una muestra y su determinación cuantitativa basada en la absorción infrarroja de una amina compleja de ABS.
Aunque tardado, este método es especifico y exacto para bajas con
centraciones de ABS en el agua y elimina a los alquil-sulfatos.
Cuando no se cuenta con un espectrofotómetro de infrarrojo :puc
de efectuarse una determinación colorirnétrica recuperando el ABS puro y empleando después el método del azul de metiteno.
Aplicación.
5 .9 .6 .2
Este método es aplicable sólo en muestras de aguas crudas y no para desechos industriales o domésticos.
- Precauciones . - La mayoría de las muestras contienen anexas
fases, líquida y sólida . El ABS es altamente concentrado en la fase sólida . Para óbtener una exactitud en el análisis es esencial que los sólidos
muestreados sean representativos o excluidas.
5 .9 .6 .3
Equipo.
a) Tubo de adsorción de carbón
Y -
Cargar la columna de vidrio,
aproximadamente 5 x 60 cm, con 100 g de carbón, coro rejillas de acero
- 743 -
inoxidable o bronce aproximadamente de malla 30, dividiendo el carbón
en secciones de 20, 30, 40 y 10 g como se muestra en la figura 5 .9-I.
Rejillas de Acero Inoxidable
o Bronce
FIG. 5.9- I . Tubo de Adsorción de Carbón
b) Embudo Buchner de 500 mi, de mediana porosidad.
c) Potenciómetro.
d) Matraz volumétrico de 2 6 5 ml .
e) Embudos de separación . de 500 ml.
f) Espectrofotómetro de infrarrojo para usarse de 2 a 15p.
g) Material de vidrio enjuagado previamente con acido clorhídri
co, uno a uno, para eliminar el ABS adsorbido.
5 .9 .6 .4
Reactivos.
a) Solución patrón de ABS . - Ver preparación en el método de azul de metileno.
b) Carbón activado, no triturado . de malla 30, para el tubo de adsorción de carbón . Prueba para las impurezas en el carbón . - Extraer
100 g de carbón mediante ebullición por 1 hora con 1 litro de solución de
alcohol-henceno . Filtrar . lavar con 100 ml de alcohol mefítico, adicio nando tos lavados a la mezcla remanente de solvente, evaporar a seque
dad en baño de vapor y pesar.
El residuo está constituido de impurezas orgánicas extraibles y debe ser menor a 10 mg ; no incluir ningún residuo del solvente.
c) Solución de alcohol-benceno . - Mezclar 500 m1 de benceno li bre de tiofeno ; 420 ml de alcohol metilico y 80 m1 de KOI-I 0 .5N.
d) Alcohol metflico absoluto.
e) Acido clorhídrico concentrado.
f) Hidróxido de sodio, IN.
g) Eter de petróleo, con un ámbito de ebullición entre 35 y 60°C .
-745-
h) Alcohol etilico de 95%.
i) Acido sutfGrico, IN.
j) Solución reguladora . - Disolver 6.8 g de fosfato monopotásico
dihidrogenado (KH2PO4) en un litro de agua destilada . Ajustar el pH de
6 .8 a 6.9 con hidróxido de sodio 6 N.
k) 1 - metil-heptil - amina.
1) Solución para extracción de ABS . - Disolver 400 mg (20 gotas)
de 1 rnetil heptil -amina en 400 ml de cloroformo . Preparar diariamen
te .
m) Cloroformo (CHCI 3 )
n) Disulfuro de carbono (CS
5 :9.6 .5
Procedimiento.
a) Curva de calibración . - Colocar 25 mg de la solución patrón
de ABS en un vaso de vidrio de 20 litros y diluir aproximadamente con 15 1 de agua destilada . Mezclar perfectamente y usando un tubo de hule
sintético resistente, sifonear toda la solución a través de la columna de carbón . Tratar como se indica desde c-1 hasta c -7.
Repetir con 20, 15, 10, 5 y 0 mg de ABS . Hacer 2 curvas de Cali
bración trazando las concentraciones de ABS en las abscisas y las absor
bancias máximas de 9 .6 y 9 .9,u, en las ordenadas.
b) Volumen de muestra . - Estimar la concentración de ABS en -
- 746 -
la muestra ; calcular el volumen de muestra requerido para suministrar de 10 a 25 mg de ABS . Si se usan 2 1 de muestra o menos, medir aproximadamente 10 g de carbón activado granulado dentro de una probeta graduada de 2 litros, adicionar la muestra y agitar bien por 2 minutos . Fil
trar en embudo büchner de mediana porosidad, de vidrio aglutinado Si
se requiere un volumen de muestra mayor a 2 litros, pasar la muestra a
través de la columna de carbón a una velocidad de 630 ml/min o menos.
c) Extracción y medición del ABS.
1) Transferir el carbón del embudo büchner o de la columna,
tratando las secciones separadamente, a discos evaporadores de porcela
na y secar a 105° - 110° C . Colocar el carbón seco de cada disco en matraces de destilación de 2 litros . Adicionar un litro de solución de aleo
hol-benceno . Adicionar perlas de vidrio y poner a reflujo con un conden
sador de aire, por una hora . Filtrar con vacío a través de un embudo büchner y extraer todo el líquido . Quitar el vacío y adicionar 100 ml de
alcohol metflico ; agitar con una varilla de vidrio y extraer el lavado con
vacío . Lavar una segunda vez con otra porción de 100 ml de alcohol metilico.
Regresar el carbón al matraz, adicionar solvente en la -
forma que se indicó anteriormente y poner a reflujo 1 hora . Mientras se hace la segunda extracción evaporar el solvente de la primera y de los lavados . Efectuar esta evaporación en un vaso de 2 litros y en un ba
fío dé vapor . (Una corriente suave de nitrógeno o aire en la superficie ace
-747-
lerará la evaporación).
2) Filtrar los segundos extractos y lavar el carbón corno ya
se indicó antes . Adicionar el extracto y los lavados a los vasos que con
tienen las primeras extracciones . Descartar el carbón . Evaporar suficientemente para combinar en un vaso los extractos de las secciones de
20, 30 y 40 g de la columna . Tratar los extractos de la sección de 10 g
-:separadamente a través de todo el proceso . Después que el solvente ha
sido removido, colocar el residuo en 50 ml de agua destilada caliente . Transferir a un matraz erlenmeyer de 250 mi . Enjuagar el vaso con 30 m1 de ácido clorhídrico concentrado y añadirlo lentamente al matraz.
(En este paso se forma dióxido de carbono) Enjuagar el vaso con 50 ml de agua destilada y combinar con los otros lavados en el matraz . Poner a reflujo con un refrigerante de aire por una hora.
3) Quitar el refrigerante' y continuar la ebullición hasta que
el volumen se reduzca de 20 a 30 ml . Transferir a un baño de vapor y evaporar aproximadamente hasta sequedad . (Un chorro de aire aplica
do en la superficie del liquido ayudará mucho a la evaporación) Colocar
los sólidos en 100 ml de agua destilada y neutralizar, con solución de -.
hidróxido de sodio, a pH de 8 a 9 . Extraer una vez con 50 ml de éter de
petróleo . Adicionar alcohol etílico al 7070 si es necesario para romper
emulsiones . Lavar el éter de petróleo 2 veces con porciones de 25 ml de agua destilada, descargar la capa de éter de petróleo y adicionar los
- 748 -
lavados a la solución acuosa . Hervir lejos de donde se encuentre el alcohol que se adicionó.
4) Enfriar y transferir cuantitativamente a embudo de separación de 500 ml. Neutralizar por adición de ácido sulfúrico hasta la acidez
al papel tornasol . Adicionar 50 ml de solución reguladora y dos gotas de metil-heptil-amina y agitar vigorosamente . Adicionar 50 ml de la solo ción para extracción del ABS y 25 mI de cloroformo : agitar por 3 minutos
y dejar que se separen las fases . Si se forma dentro del embudo de sepa
ración una emulsión retirar la fase inferior (de cloroformo), incluyendo la emulsión y filtrar a través de una capa de fibra de vidrio humedecida con cloroformo, usando succión si es necesario . Remover la fase de cloroformo en un vaso de 400 ml y regresar la solución acuosa al primer em
budo de separación . Lavar el filtro de fibra de vidrio con 10 ml de cloroformo y adicionar el lavado al extracto de cloroformo.
5) Hacer una extracción adicional con 50 ml de la solución pa ra extracción del . ABS y 25 ml de cloroformo . Agitar 2 minutos y separar
las fases como se indicó en el número 4), de ser necesario . Extraer una
tercera vez con 5 ml de solución de amina y 45 ml de cloroformo . Evapo
rar los extractos combinados de cloroformo en un baño de vapor adicionan
do 10 ml de cloroformo ; transferir cuantitativamente el residuo a vasos de 50 ml usando tres porciones de 5 ml de cloroformo para enjuagar.
Evaporar a sequedad y continuar calentando en un baño de vapor por 30 minutos para remover el exceso de amina . Colocar el residuo en
aproximadamente 1 m1 de disulfuro de carbono y filtrar a través de fi
bra de vidrio en un embudo con tallo de 2 mm de diámetro, dentro de
un matraz aforado de 2 a 5 ml . Diluir a la marca a través del fil tro con varios enjuagues del vaso.
6) Transferir una porción de la muestra a una celda del infra rrojo sin efectuar nuevas diluciones . Correr la curva de absorción infrarrojo de 9 a 10.5 micras contra un testigo de solvente . Medir la absor -bancia de los picos a 9 .6 y 9 .9
.0
usando líneas bases de 9.5 a 9 .8 y de
9 .8 a 10 .1 }a . De curvas apropiadas de calibración calcular la concentra
ción del ABS de la muestra original . Reportar los valores basado en cada
longitud de onda separadamente (si no se cuenta con el equipo de infrarrojo usar el colorimétrico) . Romper el complejo amina-sulfato por ebulli ción con solución alcalina acuosa . Después que la amina ha sido eliminada (como lo indica una faba de olor de amina) y se han hecho adecuadas di
luciones, los resultados colorirnétricos deben corresponder con los valo res de infrarrojo.
7) Evaporar una porción de sol . de ABS de 0.5 a 1 mi, colocar
la en una celda de cloruro de sodio . Registrar el espectro de absorción de 2 a 15 }t para una identificación cualitativa positiva del ABS.
Precauciones : El uso de la adsorción por carbón en todas las
muestras, separa el
ABS
de muchas otras sustancias presentes. y reduce -
las dificultades de emulsión .
- 750 -
Nota . - Durante la hidrólisis ácida, pueden perderse de 10 a 50 ml
de agua a través del refrigerante de aire de 60 x 1 cm . Esta pérdida, s i
no afecta la hidrólisis, reduce la cantidad de agua que necesita ésta para
la ebullición después de quitar el condensado.
5 .9 .7
Bibliografía.
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New York.
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Water andWastewater,-14 edition 1976.
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ra y la Fauna .-1971.
11 .S . Environmental Protection Agcncy .-N,lethods for Chemical -- Analysis of Water and Wastes,-1974.
E P A . - Water Quality Criteria .-1972 .
6. ANALISIS 6ACTERIOLOGICOS
- 753 -
6 .1 GENERALIDADES
La calidad sanitaria .del agua y su adaptabilidad a usos generales,
con respecto de la presencia de bacterias, se determina por medio de los análisis bacteriológicos rutinarios.
Los estudios bacteriológicos del agua sirven para determinar fo cos de organismos de importancia para la salud pública así como esta blecer procedimientos que permitan descubrirlos, identificarlos y destruirlos . En general, la microbiología del agua estudia además de es tos aspectos, los concernientes a la flora microbiana natural de lagos, ríos, pantanos y mares, de gran importancia en las diferentes funcio- nes que tienen lugar en la naturaleza, pues la actividad de los organismos microbianos interviene en diversas transformaciones químicas que
permiten un equilibrio normal de la vida acuática y cooperan además en
varios procesos geoquímicos.
Una gran variedad de microorganismos se presentan en todas las
fases del ciclo hidrológico; el agua atmosférica contiene la flora microbiana presente en las pequeñas partículas que arrastra el aire, el agua
superficial (arroyos, ríos, pantanos, lagos y mares) alberga infinidad de microorganismos naturales y extraños, presentes estos últimos por
causa de contaminación, y los aportados durante los primeros minutos
de la precipitación pluvial ; mientras que la calidad bacteriológica del -
- 754 -
agua edáfica comunmente es buena.
Los gérmenes patógenos que con más frecuencia se propagan
por el agua son generalmente causantes de infecciones intestinales
(fiebre tifoidea, paratifoidea, disentería y cólera).
Comunmente , el agua superficial se contamina por las desear
gas residuales domésticas e industriales . Las aguas residuales
pueden contener millones de bacterias por mililitro, entre las que se incluyen cóliformes, estreptococos, bacterias Proteus y otras más
que proceden del tracto intestinal humano y animal, además de protozoarios, virus, nernatelmintos, platelmintos y agentes causantes de
enfermedades.
Los agentes etiológicos más comunes presentes en las aguas
residuales son: Escherichia coli . - Ciertos tipos producen diarrea
e infecciones gastrointestinales y urogenitales.
Aerobacter aerogenes . - Comunmente se le encuentra como patógeno de las plantas ; sin embargo, también se le ha encontrado, aunque muy raras veces, en infecciones del tracto urogenital.
Klebsiella pneumoniae . - Produce neumonía (con un alto índi
ce mortal), sinusitis, faringitis, abscesos del hígado, peritonitis, endocarditis y otras enfermedades.
Proteus . - Causa infecciones gastrointestinales y urogenitales (Proteus no fermenta la lactosa) .
-755-
Salmonella tiphosa . - Produce fiebre e infección aguda, fiebre
tifoidea.
Salmonellaparatypri, S, shottmuellerl y S . hirshefeldii . - Producen fiebre paratifoidea, de carácter menos agudo que la tifoidea.
Salmonella enteriditis y S . typhirnurium . - Producen salmonello
sis y diarrea aguda.
Shigelia . - Produce disenteria bacilar.
Vibrio cometa y vibrio culera . -
Graves enfermedades en los
humanos.
Bruceila abortus (bobina), B. melitensis (caprina) y B . suis (por
cina) . - Producen fiebre de malta en el ganado y su contagio origina abortos
.Entamoaeba hystol tica (protozoo)Produce disentería amibiana.
Las aguas residuales vertidas sin tratamiento adecuado, pueden
ocasionar los siguientes daños y posibles peligros:
a) Diseminación de microorganismos patógenos.
b) Mayor peligro al usar las reservas hidrográficas naturales
con riesgo de enfermedades.
c) Contaminación de las diversas formas de vida acuática que
las hace peligrosas para el consumo humano.
d) Devaluación de los lugares destinados a recreación.
e) Exterminio de la vida acuática por agotamiento del oxfgeno
- 756 -
disuelto en el agua por acción de la materia orgánica inestable de las
aguas residuales.
f) Devaluación de la propiedad por causa de malos olores y, acumulación de residuos.
Muchas de las bacterias no tienen significado sanitario debido a:
a) Una rápida muerte en el agua.
b) Dificultades bacteriológicas para su clasificación.
c) No tener conocimiento o asociación sospechosa con desechos
animales o humanos .
OBJETIVOS DEL ANAL I+SI BA TERI LOGICO
6 .2
Los objetivos que se pretenden en un análisis bacteriológico son
los siguientes:
a) Conocer el grado de contaminación de las aguas por desecho
de origen animal o relacionado con las condiciones sanitarias precarias de
los pueblos.
b) Calificar la calidad sanitaria del agua y tener el control de
las mismas sometidas a previo tratamiento de potabilización.
c) Fijar las normas de calidad referentes al número de bacterias
permisibles, dependiendo del uso o usos a que se destine el agua,
d) Conocer la recuperación de los cauces dañados por aguas re sic:bales .
- 759 -
6 .3
INDICADORES ,DE CONTAMINACION
Los análisis bacteriológicos que se practican, habitualmente es-
tán encaminados ala obtención y determinación de microorganismos cu
ya presencia indique contaniiaación por aguas residuales domésticas y
aguas residuales agrícola-ganaderas,
6 .3 .1
Propiedades de un indicador bacteriológico de contamina
ción fecal:
a) Ser de origen animal (del aparato digestivo).
b) Estar presente en el agua cuando los patógenos estén presen
tes .
e) No reproducirse en el agua.
d) Su densidad debe tener relación directa con el grado de tonta
minación fecal.
e) Mayor supervivencia en el agua que los patógenos entr icos .
f) Desaparición rápida, posterior a los patógenos.
g) Siempre ausente en aguas bacteriológicamente seguras.
h) Requerir de técnicas sencillas para su identificación.
6 .3 .2
Grupos indicadores de contaminación.
a) Conformes totales.
b) Conformes fecales.
c) Estreptococos fecales,
d) Otros indicadores de contaminación .
Los análisis bacteriológicos no permiten el aislamiento de orga
nisrnos patógenos debido principalmente a las siguientes razones:
a) Los gérmenes patógenos no sobreviven en el agua durante
mucho tiempo.
b) Si existen en pequeño número, es fácil que escapen á la detección .
- 761
6 .4
RECOLECCION DE LA MUESTRA
6 .4 .1
Generalidades.
El muestreo deberá someterse estrictamente a las siguientes re
comendaciones:
a) La muestra ha de recogerse en un frasco limpio, enjuagado
con agua destilada y esterilizado.
b) La muestra deberá ser representativa del abastecimiento del
que proceda.
c) Deberá evitarse la contaminación de la muestra durante su re
colección y transporte.
d) La frecuencia del muestreo permitirá establecer la calidad sa
nitaria del agua.
Los frascos de muestreo deben ser de vidrio resistente o refrac
tario, de boca ancha, preferentemente con tapones de cristal esmerilado
o bien tapones de rosca de materiales que no produzcan compuestos tóxicos durante la esterilización.
Para evitar la acción bactericida del cloro residual, se usa el tio
sulfato de sodio, el cual se aplica a los frascos limpios y secos antes
de la esterilización en una cantidad que proporcione una concentración
aproximada de 100 mg/1 (se logra agregando 0 .1 ml de solución de tiosulfato de sodio al 10%) . Esta cantidad es suficiente para neutralizar
una'muestra que contenga 15 mg/1 de cloro residual.
Si las muestras contienen altas concentraciones de Cu o Zn u
otros metales pesados, éstas deben tornarse en frascos que contengan
un agente quelante que reduzca la toxicidad del metal . El ácido etil-dia
minotetracético (EDTA) se considera un agente quelante satisfactorio,
una concentración de 372 mg/1 es adecuada.
El EDTA puede adicionarse al frasco de muestreo separadamen
te antes de la esterilización (0 .3 m1 de una solución al 15% para un fras
co de 120 ml) o puede combinarse con el tiosulfato de sodio antes de la
adición . .
La esterilización se efectúa como se indica en la sección 6 .7.
6 .4,.2
Procedimiento para la toma de la muestra
Cuando se toma la muestra, se debe dejar un espacio (por lo menos
de 2 .5 cm) para facilitar el mezclado.
Cuando se muestrea un grifo, se purga el sistema, abriendo la
llave por 2 ó 3 minutos y en el momento del muestreo de restinge el flu
jo de la llave para que no salpique el frasco .
- 763 -
Cuando la muestra se va a tomar directamente, el procedimiento
es : tomar la botella cerca de su base y aflojar el papel que está prote
giendo al tapón . Luego sumergirla cerrada, con el cuello hacia abajo, se destapa y se gira de modo que el cuello quede ligeramente más ele vado que la base . La boca debe dirigirse contra la corriente . Una vez
llenadas las 3/4 partes del recipiente, se tapa y se saca.
El hecho de meter el frasco cerrado y destaparlo dentro del agua
se encuentra a discusión, porque algunos autores no lo consideran necesario, ya que el frasco puede destaparse afuera del agua.
Si el sitio del muestreo es profundo se puede usar un dispositivo,
como es algún muestreador bacteriológico.
6 .4 .3
Preservación y almacenamiento.
Las muestras deben analizarse de inmediato . De no ser posible
analizarlas dentro de la hora siguiente al muestreo, se deben conser var en una hielera mientras son transportadas . La temperatura que se debe mantener es menor a 10' C durante un tiempo máximo de trans
porte de 6 horas . Cuando las condiciones no permiten que se efectúe el análisis después del tiempo máximo indicado, se recomienda efectuar el análisis en el sitio de muestreo con un equipo portátil de campo.
En el caso de muestras de agua potable, el tiempo no debe exce der de 30 horas .
- 764 -
6 .5
APARATOS Y MA'PER1A1 DE 1,ABORA'I'OR10
1) Incubadoras equipadas con dispositivos mecánicos para la cfr
culación del aire, con termómetro exacto y termostato de funcionamiento
perfecto, que mantengan uniforme y constante la temperatura.
2) Estufas de esterilización de aire caliente,capaces de indicar
con precisión temperaturas entre 160° y 180° C.
3) Autoclaves en perfecto funcionamiento, con termómetro y rna
nómetró exactos . Las autoclaves pueden ser substituídas por ollas de
presión .
4) Baño de agua con control de temperatura, para usarse a - 44 .5° C+ 0 .2 . La profundidad del agua debe ser lo suficiente para que el tubo quede sumergido hasta el nivel del medio de cultivo.
5) Contadores de colonias . De preferencia usar el aparato "Que
bec Counter", o un equivalente.
6) Equipo para la determinación de pH con una variación menor
de 0 .1 unidades de pH.
7) Balanzas con un ámbito desde 0 .1 g hasta 150 g y una balanza analítica de menos de 1 mg hasta 10 g.
8) Recipientes de vidrio de borosilicato ó de acero inoxidable
para la preparación de medios.
9) Pipetas con error de calibración menor a 2 .5%.
10) Pipeteros de aluminio o acero inoxidable de medidas necesarias
- 76 5 -
para conservar las pipetas estériles . Los pipeteros pueden ser suhsii•
tuídos por papel aluminio o papel "Draft".
11) Frascos o tubos de dilución, de cristal Pyrex, con tapones de
cristal, caucho o cápsulas de rosca de materiales que no produzcan subs
tancias tóxicas durante el proceso de esterilización . Pueden usarse tam
bién de plástico o de material no tóxico y que pueda esterilizarse adecuada
damente .
12) Cajas de letra de 100 mm de diámetro, de cristal Pyrex . o
bien de plástico desechable, de 15 mm de altura . Las cajas de plástico
de 60 x 15 mm son adecuadas para la técnica de filtro de membrana.
13) Tubos de ensaye con capacidad necesaria (25 x 200 mm, 25 x 150 mm, 20 x 150 mm) de cristal Pyrex, de preferencia con tapón
de rosca .
14) Tubos Durham o de hemólisis.
15) Gradillas metálicas.
16) Mecheros.
17) Asas de siembra de cromo o platino-iridio con una lazada mínima de 3 mm de diámetro . También pueden usarse aplicadores de
madera dura, siendo de 0 .2 a 0 .3 cm de diámetro y de 2 .5 cm más largos que el tubo de ensaye y deben esterilizarse por calor seco y guarda
dos en un tubo de vidrio u otro recipiente no tóxico.
18) Frascos de muestreo de vidrio, resistentes, de boca ancha,
-766-
con tapón de vidrio esmerilado o tapón de rosca, de material que no
produzca substancias tóxicas al ser esterilizado y que por consiguiente soporte las temperaturas de esterilización . De capacidad suficiente para qué quede un espacio de aire además de la muestra (120 ml - aproximadamente) . Se consideran adecuadas las botellas de plástico
de tamaño requerido, boca ancha y hechas de material no tóxico.
19) Unidades de filtración (aparato con extractor a vacío)
20) Membrana de filtración reticulada, cojines absorbentes (dis
cos de papel filtro).
21) Pinzas de extremos redondeados
22) Microscopio
- 767 -
6 .6
PREPARACION, ESTERILIZACION Y ALMACENAMIENTO
DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
6 .6 .1
Preparación de los medios de cultivo.
Nunca prepare los medios de cultivo a partir de sus ingredientes
básicos, cuando se cuente con lós medios deshidratados . Siga las instrucciones del fabricante para rehidratar y esterilizar los medios . Los
medios comerciales preparados en forma líquida (ampolleta u otra) ; también pueden usarse si se conoce que su efectividad es equivalente.
6 .6 .1 .1
Medio de cultivo para la cuenta en placa.
a) Agar extracto triptona - glucosa
Extrácto de carne
3 .0 g
Triptona
5 .0 g
Glucosa
5 .0 g
Agar
Agua destilada
15 .0g
1 litro
El pH deberá estar entre 6 .8 y 7 después de la esterilización.
- 768 -
b) Agar para Cuenta en Placa . (Agar - triptona - glucosa - levadura)
Triptona
5 .0 g
Extracto de levadura
2 .5 g
Glucosa
1 .0 g
Agar ,
15 .0 g
' Agua destilada
1 litro
El pH deberá ser de 7 .0+ 0 .1 después de la esterilización.
6 .6 .1 .2
a)
Medio de cultivo para coliformes totales.
Agar Endo
Peptona
10 g
Lactosa
10 g
K 2 HPO 4
Agar'
3,. 5 g
15 g
Sulfito de sodio
2 .5 g
Fucsina básica
0 .5 g
Agua destilada
1 Miro
El pi-1 después de esterilizar, debe ser de 7 .4, El medio debe
tener una ligera coloración rosa cuando está caliente y ser casi incoloro cuando se enfría .
- 769 -
b)
Agar - eosina azul de metileno
Peptona
10 .0 g
Lactosa
10 .0 g
2 K 2HPO4
.0 g
Agar
Eosina
0.4 g
Azul de metileno
0 .065 g
Agua destilada
c)
15 .0 g
1 litro
Caldo lactosado
Extracto de carne
3 .0 g
Peptona
5 .0 g
Lactosa
5 .0 g
Agua destilada
1 litro
El pH debe estar entre 6 .8 y 7 después de esterilizar.
Antes de esterilizar, distribuya el caldo en tubos de fermentación (tubo durham invertido en un tubo de ensaye).
Cuando los tubos de fermentación se inoculen con 10 ml o 100 ml
de muestra, el medio debe ser de tal concentración que la adición del vo
lumen de muestra al medio en el tubo de fermentación no reduzca la con
centración de los ingredientes.
Cuando se use el medio deshidratado las concentraciones adecua
das son:
Inoculo
ml
1
Cantidad de medio
en el tubo
ml
Volumen del
Requerimiento c
medio+inoculo caldo lactosado
ml
deshidratado
g/1
10 6 mas
11 6 mas
13
10
10
20
26
10
20
30
19 .5
100
50
150
100
35135
50.1
100
20
78 .0
120
39
d) Caldo lauril triptosa.
Triptosa
20 .0 g
Lactosa
5 .0 g
K 2HPO4
2 .75 g
KH PO
2 4
Na C1
2 .75 g
Lauril sulfato de sodio
0 .1 g
5 .0 g
Agua destilada
1 litro
El pH debe estar aproximadamente a 6 . 8 después de la esterilización . Antes de esterilizar, distribuir el caldo en tubos de fermenta
ción (tubo durham invertido en un tubo de ensaye) . Al igual que en el caldo lactosado cuando se usen volúmenes grandes de muestra, se de -
be variar la concentmcióri . En el caso de usar medios deshidratados pesar la cantidad del medio según el volumen corno se indica en la
sí- -
guiente tabla :
Inóculo
ml
Cantidad de medio
en el tubo
ml
1
10 6 mas
11 6 mas
35 .6
10
10
20
71 .2
10
20
30
53 .4
100
50
150
106 .8
100
35
135
137 .1
100
20
120
213 .6
e)
Volumen del
*Requerimiento
medio + inoculo de caldo lauril
ml
tri pto sa
g/1
Caldo lactosado bilis verde brillante.
Peptona
. 10.0 g
Lactosa
10 .0 g
Bilis de buey deshidratada
20 g
. Verde , brillante
0.0133 g
Agua destilada
1 litro
El pH debe ser de 7 .2 después de la esterilización . Antes de esterilizar distribuya el caldo en tubos de fermentación (tubo durham inver
tido en un tubo de ensaye).
_172 _
f)
Agar Endo.
Peptona
10.0 g
Lactosa
10 .9 g
K 2HPO4
3 .5 g
Agar
15 .0 g
Sulfito de sodio
2 .5 g
Fuc sisa básica
0 .5 g
Agua destilada
1 litro
El pH final después de esterilizar debe ser de 7 .4
g)
Reactivos para la Unción gram.
1.
Alcohol - acetona . - Mezclar volúmenes iguales del alco-
hol etílico 95% con acetona.
2 : Solución de lugol . - Triturar 1 g de cristales de iodo y 2 g
de ioduro de potasio en un mortero . Adicionar agua destilada en peque ñas porciones, mezclando bien después de cada adición hasta completar
un volumen total de 300 ml.
3.
Oxalato de arnonio - cristal violeta . - Disuelva 2 g de cris
tal violeta (90 % de contenido seco) en 20 ml de alcohol etílico al 95% ; di suélva 0 . 8 g de oxalato de amonio monohidratado en 80 ml de agua destilada ; mezcle las dos soluciones y deje en reposo por 24 horas antes de usarla ; filtre a través de papel dentro de un frasco ámbar.
4.
Safranina . - Disolver 2 .5 g de safranina en 100 ml de al -
cohol etílico de 95% . Adicionar 10 m1 de . la solución alcohólica de safra
nina. a 100 ml de agua destilada.
Medios de cultivo para conformes totales por la técnica de
6 .6 .1 .3
filtro de membrana.
a)
Medio M-Endo.
Triptosa o polipeptona
10.0 g
Tiopeptona
5.0 g
Casitona o tripticasa
5 .0 g
Extracto de levadura
1 .5g
Lactosa
12 .5 g
NaCI
5 .0gg
K 2HPO4
4 .375 g
KHPO
24
1 .375 g
Laurii sulfato de sodio
0 .050 g
Desoxicolato de sodio
0.10g
Sulfito de sodio
2 .10 g
Fucsina básica
1 .05 g
Rehidratar en 1 litro de agua destilada que contenga 20 ml de alco
bol al 95% . Calentar a ebullición y retirarlo inmediatamente del calor . Enfriar a temperatura menor a 45° C . .No esterilizar en autoclave . El pH
final es de 7 .1 a 7 .3 . Conservar el medio en la obscuridad entre 2 y 10°C
- 774 -
y descartar el medio después de 96 horas . Este medio puede hacerse
sólido adicionando 1 .2 a 1 .5% de agar.
b)
Medio M - Endo preservativo.
Preparar como en el inciso anterior y adicionarle 3 .84 g de ben
zoato de sodio por litro ó 3 .2 ml de una solución de benzoato de sodio
al 12% .
Solución de benzoato de sodio.
Disolver 12 g de benzoato de sodio en suficiente agua destilada
hasta . un volumen de 100 ml . Esta solución puede esterilizarse en auto
clave o por filtración . Descartar la solución después de 6 meses.
c)
Cicloheximida.
La adición de la cicloheximida al medio preservativo M - Endo es
opcional . Puede usarse para muestras que previamente hayan mostrado
un sobrecrecimiento de hongos y levaduras ; adicionar 500 nlg/1 . 1?stn
solución debe guardarse en el refrigerador y descartarse después de 6
meses . La cicloheximida es un poderoso irritante de la piel por lo que
debe manejarse con cuidado.
d)
Agar LES Endo.
Extracto de levadura
1 .2g
Casitona o tripticasa
3 .7 g
Tiopeptona
3 .7 g
Triptosa
7 .5 g
- 775 -
Lactosa
9 .4 g
K2 P
3 .3 g
1KH1 7 4
.0 g
Cloruro de sodio
.3 .7 g
Desoxicolato de sodio
0 .1g
Lauril sulfato de sodio
0.05 g
Sulfito de sodio
1 .6 g
Fucsina básica
0. 8 g
Agar
15 .0g
Agua destilada
1 litro
Rehidratar en agua destilada que contenga 20 ml de alcohol edil co al 95% . Llevar a ebullición, enfriar a 45 - 50°
colocar volúmenes
de 4 m1 dentro de cada caja Petri de plástico o vidrio . Si las cajas son de otro tamaño, Multar la cantidad dada a una profundidad equivalente . Conservar en oscuridad no más de 2 semanas a 2 - 10° .
e)
Medio LES MF Holding.
Triptona
caldo MF
3 .0 g
M-
Endo
3K 2 HPO4
3 .0 g
.0 g
Benzoato de sodio
I .O g
Sulfanilarida
1 .0 g
Acido para-aminobenico
1 .2 g
Cic1ohexirnida
O. 5 g
Agua destilada
1 litro
Rehidratar en agua destilada sin calentar . El pH final debe ser
de 7 .1 + 0,1.
6 . 6 .1 .4
Medios de cultivo para .coliformes fecales.
a)
Caldo lactosado, ver preparación en 6 .6 .1 .2 c,
b)
Medio 4C.
Triptosa o tripticasa
20 .0g
Lactosa
5 .0
Mezcla de sales biliares
1 .5 g
K FHPO
4
2
KHPO
2 4
Cloruro de sodio
4 .Og
Agua destilada
g
1 .5 g
5 .0 g
1
litro
El pH final después de la esterilización debe ser de 6 .9 . Verter
el medio en tubos de fermentación (tubo durham invertido en un tubo de
ensaye) y esterilizar.
6 .6 .1, 5
Medio de cultivo para coliformes fecales por la técnica
de filtro de membrana.
Caldo MF C
- 777 -
Triptosa
10 g
Piratea sa, peptona o polipeptona
5 .0
Extracto de levadura
3 .0 g
Cloruro de sodio
5 .0 g
Lactosa
12 .5 g
Sales biliares
1 .5 g
Azul de anilina
0 .1 g
Agua destilada
1 litro
Rehidratar en aguó destilada que contenga 10 ml de ácido rosólt
co al 1% en NaOH 0 .2 N . Calentar a ebullición y enfriar a• temperatura
inferior a 45'C . No esterilizar en autoclave . El phi final es igual a '7 .4 . El medio debe conservarse de 2 a 10° C . El tiempo de duración del medio es de 96 , horas como máximo.
b)
Medio M-VFC Holding.
Este medio no puede obtenerse en forma deshidratada por lo que
hay-que prepararlo a partir de sus ingredientes:
asitona, vitamina libre
0 .2 g
Benzoato de sodio
4 .0 g
Suifanilarnida
O.
Etanol (95%)
Agua destilada
g.
10 .0 ml
1 litro
_778_
Calentar para disolver el medio y esterilizar por filtración a tra
v s de un filtro de membrana (diámetro de poro de 0,22)a )- El pH final
debe ser de 6 .7,
El medio preparado debe conservarse a 2 - 10 ' C y se debe des cartaar después de un mes . Para preparar 100 ml del medio, hacer una
solución acuosa 1 : 100 de casitona y adicionar 2 ml.
6 .6 .1 .6
a)
Medios de cultivo para estreptococos fecales.
Caldo azida dextrosa.
Extracto de carne
4 .5 g
Triptona o polipeton
15 .0 g
Glucosa
7,5 g
NaCI
7 .5g
Azida de sodio, Na N
3
Agua destilada
0.2 g
1 litro
El pft final después de esterilización debe ser de 7 .2 . Colocar
este medio en tubos de ensaye antes de esterilizar.
b)
Caldo azida violeta de etilo (EVA).
Triptona
20 .0 g
Glucosa
5 .0 g
NaCI
5 .0 g
K HPO4
.2 .7 g
2 .7 g
KH2PO4
Azada de sodio, NaN
0 .4 g
3
Violeta de etilo
0 .00083 g
Agua destilada
1
litro
Él pH final después de esterilizar debe ser de 7 .0 . Distribuir el Medio en tubos de ensaye antes de esterilizar.
6.6.1 .7
Medio de cultivo para Estreptococos Fecales por la técni
ca de filtro de membrana.
Agar KF estreptococos.
Proteasa peptona No . 3
o polipeptona
10.0
g
Extracto de levadura
10.0
g
5 .0
g
Glicerofosfato de sodio
10.0
g
Maltosa
20 .0
g
Lactosa
LO
Azida de sodio
0 .4
g
Agar
20 .0
g
Agua destilada
`i litro
Cloruro de sodio
Mezclar 7 .64 g del medio deshidratado con 100 ml de agua destilada estéril, en un frasco estéril . Calentar en un baño de agua a ebulli-
ción para disolver el agar . Seguir calentando pnr 5 minutos . Knfrlar- a 50-W ' C; y adicionar 1 ml de-solución acuosa cstCril de cloruro ck 2,
3, 5 trifenil-tetrazolio al 1% por 100 ml . Ajustar b1 pH a 7 .2 con Na 2 CO3 al 10J, si es necesario . El medio debe mantenerse a 45-50' C
por 4 horas antes de vaciarlo a las cajas . Tiempo de almacenaje del -medio: 30 días de 2 a 10 'C y en la obscuridad.
b)
Agar selectivo Pfizer para Enterococos (PSE).
Peptona C
17 .0
g
Peptona B
3 .0
g
Extracto de levadura
5 .0
g
10 .0
g
'Cloruro de sodio
5 .0
g
Citrato de sodio
1 .0
g
Esculin
1 .0
g
Citrato férrico de amonio
0 .5
g
Azida de sodio
0 .25
g
Bilis bacteriológica
Agar
Agua destilada
15 .0
1
g
litro
Después de la esterilización elpH debe ser de 7 .1 . El medio debe estar a 45-50 C por 4 horas antes de verterlo a las cajas.
781 -
6 .6 .2
Almacenamiento de los medios de cultivo . .
Los medios deshidratados deben estar en frascos perfectamente
cerrados, en la oscuridad, a temperaturas inferiores a 30' C y en una atmósfera de baja humedad, No los use si han perdido color o se han aterronado.
La cantidad de medio que se prepare debe ser tal que todo el me
dio se ocupe en menos de 1 semana.
Si el medio liquido en los tubos de fermentación se guarda en refrigeración o a temperaturas moderadamente bajas, puede disolver al
re suficiente para producir durante la incubación a 35° C una burbuja de
aire en el tubo . Es necesario, por consiguiente, que los tubos de fermentación que han sido almacenados. a baja temperatura sean incubados
mentación
antes de usarlos para descartar aquellos tubos que tengan aire.
Los tubos de Fermentación pueden guardarse aproximadamente a 25' C ; ya que la evaporación puede proceder rápidamente bajo esas condiciones dando como resultado cambios en la concentración de los in
gredientes, el almacenamiento a esta temperatura no debe exceder de - un perrada de una 'semana .
6. b . 3
.
Esterilización.
Todos los medios, excepto los caldos con azocares y caldos con
otras especificaciones, se esterilizan en autoclave a .121°. C durante un perfodo de 15 minutos después de que la autoclave . haya alcanzado 12 1
;
782 -
para los medios que contengan carbohidratos se da un periodo menor a
la misma temperatura (por lo general 12 minutos),
En cuantó la autoclave tengo una presida cero retire el medio y
enfríe rápidamente para evitar la descomposición de los azucares por
exponerlos al calor un tiempo prolongado.
El .tier, po máximo de exposición de los azúcares a temperaturas
altas es de 45 minutos .
-783
6 .7 LAVAN} Y ESTERILIZACION DEI_ MATERIAL
6 .7 .1
Material de vidrio
Se debe limpiar con un detergente adecuado y agua caliente, los
enjuagues con el agua caliente tienen por objeto remover todas las trazas de compuestos residuales del lavado . Dar los últimos enjuagues
con agua destilada.
6 .7 .1 .1
Residuos inhibidores en el material de vidrio.
Ciertos agentes humectantes o detergentes usados en el lavado del material de vidrio pueden contener sustancias bacteriostáticas o ínhi
bidoras, que requieren de 6 a 12 enjuagues sucesivos para remover todas las trazas de la superficie del vidrio y asegurar que estén libres de
residuos bacteriostáticos.
Se recomienda efectuar la siguiente prueba para el análisis bioló
gico del material de vidrio donde los residuos bacteriostáticos o inhibidores puedan presentarse . Si se usa material de plástico prelavado y
preesterilizado, también debe hacerse la prueba.
6 .7 .1 .2
a)
Procedimiento de la prueba
Lavar 6 cajas Petri, de acuerdo a la práctica usual de la
boratorio y designar como grupo A.
b)
Lavar. 6 cajas Petri como se indicó al principio,enjuagan
do 12 veces con porciones sucesivas de agua destilada y . designar como
grupo B .
- 784 -
c)
Enjuagar 6 cajas Petri con el agua de lavado del detergen
te (en la concentración usual), secar sin enjuagar y designar corno gru po C .
d)
Esterilizar las cajas en los grupos A, B y C por el proce
dimicnto usual . Para probar las cajas de plástico, establecer un grupo
D consistente en 6 cajas Petri estériles.
e)
'Adicionar hasta 1 m1 de una muestra de agua que pro-
duzca de 50 a 150 colonias y seguir el procedimiento descrito en la sección 6 .10 . de cuenta en placa . Si hay dificultad en obtener tina muestra
apropiada, inocular tres cajas de cada grupo con 0 .1 ml y otras 3 de ca da grupo con 1 ml.
6 .7 .1 .3
Interpretación de resultados.
Diferencias menores al 1.5%, en el número promedio de colonias -
en placas de los grupos A, B, C y D, indican que el detergente no tiene 'toxicidad o características ínhibidoras, o que las placas de plástico preesterilizadas son aceptables.
Diferencia mayor al 15%, en la cuenta de colonias entre los , r, pos A y B 6 D y B, muestran la presencia de residuos inhibidores debido
a los procedimientos de lavado rutinarios.
Diferencias menores al 15% en los promedios, entre los grupos A y B y mayores al 15% entre A y C, indican que el detergente de limpie
za tiene propiedades inhibidoras que son eliminadas durante el lavado ru
tinario .
6 .7 .2
Esteriliza ien.
El material de vidrio, excepto cuando se encuentra dentro de re
oipientes metálicos , debe esterilizarse en un tiempo no menor a una ho
ra a temperaturas de 170° C . A menos que se conozca que la tempera
Cure es uniforme, 16 C serán suficientes . El material de vidrio que
se encuentre en recipientes metálicos deberá esterilizarse a 170 ' C por
más de dos horas.
laos frascos de vidrio para las muestras pueden esterilizarse en
la forma . ya mencionada o en autoclave a 121° C por 15 minutos, colo- candoles previamente a la esterilización, si el tapón es esmerilado, una
tira de papel entre el cuello y la tapa del frasco para evitar que se pegue
la tapa con el calor ; encima de la tapa, cubriendo a su vez . el cuello del frasco, colocar un capuchón de ' papel de aluminio o papel kraft.
Las botellas de plástico que se deformen en la autoclave, deben es
t erilizarse usando gas de óxido de etileno a bajas temperaturas .
- 787 -
6 .8 CARACTERISTICAS Y CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA USADA
EN BACTERIOLOGIA.
Para la preparación de medios de cultivo, sólo debe usarse agua
destilada o desmineralizada, la cual haya sido probada que se encuentra
libre de trazas de metales disueltos y compuestos bactericidas o inhibi dores .
La toxicidad del agua destilada puede derivar del agua fluorada alta. en sílice . Otras fuentes de toxicidad son plata, plomo y varios com
plejos orgánicos sin identificar . También pueden encontrarse residuos de cloruros o cloraminas . Si se encuentran compuestos de cloruro en el
agua destilada, éstos deben neutralizarse por adición de una cantidad - equivalente de tiosulfato de sodio o sulfito de sodio.
El agua destilada también debe encontrarse libre de nutrientes y
debe almacenarse en frascos limpios y de preferencia lejos de la luz del sol para prevenir el crecimiento de algas.
6 .8 .1
Prueba para la calidad bacteriológica del agua destilada.
6 .8 .1 .1
Principio.
La prueba se basa en el crecimiento de Enterobacter aerogenes
en un medio de crecimiento definido . La presencia de un agente tóxico
o de algún nutriente alterará la población a las 24 horas por un incre- mento del 20% o mayor, cuando se compare con un control .
- 788 -
Material.
6 .8 .1 .2
a)
Material de vidrio . - Todo el material de vidrio usado de
be ser de borosilicato y debe recibir un enjuague final con agua recién destilada . La sensibilidad y reproducibidad de esta prueba depende en parte de la limpieza de los recipientes que contienen las muestras,de los frascos de dílución,de tubos y pipetas . A menudo es conveniente u sar material de vidrio nuevo y destinarlo exclusivamente para esta - prueba .
b)
Inóculo . - Cualquier cepa de coliforme del tipo IM ViC--++
(E . aerogenes) . Esta puede obtenerse fácilmente de alguna muestra de
un rfo contaminado o de aguas negras.
6 .8 .1 .3
Reactivos.
Usar sólo reactivos de alta pureza , algunas . marcas de -
fosfato de potasio dihidrogenado, KH 2PO , contienen grandes cantidades
4
de impurezas . La sensibilidad de la prueba es controlada en parte por la
pureza de los reactivos usados y éstos deben prepararse con agua redes
tilada recientemente en un destilador de vidrio.
a)
Solución de citrato de sodio . - Disolver 0 .29 g de citra -
to de sodio Na 3C 6H5O7 . 2H 20 en .500 mI de agua bidestilada.
h)
Solución de sulfato de amonio . - Disolver 0 .60 g de sulfa
to de amonio (NI1 4) 2 SO4 en 500 ml de agua bidestilada.
c)
Solución mezclada de sal . - Disolver 0 .26 g de sulfato de
de magnesio MgSO -7H 20; 0.17 g de cloruro de calcio, CaC1 2 . 2H 2O ; 4
0 .23 g de sulfato ferroso, FeSO 4 ' 7H20 y 2 .5 g de cloruro de sodio, NaCl, en 500 ml de agua bidestilada.
d)
Solución reguladora de fosfato . - De la solución madre -
reguladora de fosfatos (ver 6.9 .1 a) diluir 1 :25 en agua bidestilada.
6 .8 .1 .4 .
Esterilización de los reactivos.
Todas las soluciones deben hervirse de 1 a 2 minutos para matar
las células vegetativas . Esas soluciones pueden almacenarse en frascos
de vidrio, tapados, estériles y en la oscuridad, a 5° C por varios meses,
verificando su esterilidad antes de cada período que se usen . Puesto que
la solución mezclada de sal desarrollará una turbiedad clara dentro de 3 a 5 días, ya que la sal ferrosa se oxida al estado férrico,es conveniente preparar la solución mezclada de sal sin el sulfato ferroso por el tiempo de almacenaje . Al usarla, adicionar una cantidad apropiada de la sal de fierro prep parada. y hervida recientemente . Deben descartarse las sulucio
nes con una turbidez densa y prepararlas de nuevo.
La contaminación bacteriológica puede causar turbiedad en la solu
ción reguladora de fosfatos, la cual debe descartarse si ésto ocurre.
6 .8 .1 .5
Preparación de la muestra de agua destilada de calidad des
conocida .
Colocar de 150 a 200 ml de la muestra de agua en un frasco estéril
de vidrio de borosilicato y hervir por 1 6 2 minutos para matar cualquier
-790-
célula vegetativa presente . Evitar un tiempo prolongado en la ebullición
para prevenir cambios químicos en la muestra.
6 .8 .1 .6
Procedimiento.
Rotular 5 frascos o tubos : A, B, C, D y E . Adicionar muestras de
de agua, reactivos y agua bidestilada a cada frasco como se indica en el
siguiente cuadro:
Reactivo
'rue•- Contro m
- Agua des
tilada de
Control
calidad A
desconocida . B
Prueba • .ciona m
Alimento Fuente Fuente
disponible
de
de
C
Nitróge Carbo
no . no
D
E
1) Solución de Citrato
de sodio
2 .5
2 .5
--
2 .5
--
2) Solución de sulfato
de amonio
2 .5
2 .5
--
--
2 .5
3) Solución mezclada
de sal
2 .5
2 .5
2 .5
2 .5
2 .5
4) Solución reguladora
de fosfatos (7 . 3"4) .1)
1 .5
1 .5
1 .5
1 .5
1 .5
5) Agua de calidad des
conocida
--
21 .0
21 .0
21 .0
21 .0
21 .0
--
5 .0
2 .5
2 .5
6) Agua bidestilada
17o-lumen total
0.0
Adicionar una suspensión de Enterobacter aerogenes (IMViC tipo ---I-f), de tal densidad que cada frasco contenga de 30 a 80 células/mi, -
_ 791 -
prepararla como se indica más adelante.
Una densidad más baja de ese ámbito de células da valores que no son consistentes, mientras que densidades superiores a 100 células/ml dan como resultado un decremento de sensibilidad a los nutrientes
en la prueba para el agua . Hacer una cuenta inicial bacteriana, por tri plicado, de placas con porciones de 1 ml de cada frasco de cultivo, en agar para cuenta en placa . Incubar las pruebas A, B, C, D y E a 35° C
por 24 * 2 h. Preparar una cuenta en placa final de cada frasco usando diluciones de 1, 0 .1 , 0 .01, 0 .001 y 0.0001 ml.
6 .8 .1 .7
Preparación de la suspensión de bacterias.
a)
Crecimiento de la bacteria . - El día anterior al de la de -
terminación de la prueba del agua, inocular una cepa de E,aerogenes so
bre agar nutritivo inclinado, en un tubo de 125 x 16 mm con tapón de ros
ca . . Rayar la superficie entera d'el agar para desarrollar una película continua de crecimiento e incubar 18 a 24 h . a 35° C.
b)
Recolección de las células viables . - De un frasco de 99
ml de agua destilada estéril tomar con una pipeta de 1 a 2 ml del agua y vaciarlos sobre el cultivo de 18-24 he . Formar una emulsión en el tu
bo por frote suave de la película bacteriana con la pipeta, teniendo cuida
do de no romper el agar ; posteriormente tomar la suspensión con la pi peta y regresarla al frasco testigo original de 99 ml de agua.
c)
Solución de la suspensión bacteriana . - Hacer una dilución
1 :100 del frasco original a un segundo testigo de agua ; a su vez otra dilo
ción 1 :100 de este segundo frasco a un tercer testi gode agua , y por Glti
mo 10 ml del tercer fraco a un cuarto frasco de agua, agitando vigorosa
mente después de cada transferencia ..
Tomar con una pipeta 1 ml de la cuarta dilución (1 :106) y añadirto a cada uno de los frascos A, 13, C, D y E . Mediante este procedimien
to encontraremos en la dilución final organismos en un ámbito de 30 a 80 células viables por cada mililitro de solución de prueba.
d)
Verificación de la densidad bacteriana . - Variaciones en-
tre cepas del mismo organismo, diferentes organismos, medio
y. área -
superficial del agar inclinado posiblemente necesitará un ajuste al procedimiento de la dilución para llegar a un ámbito de densidad específico
entre 30 y 80 células viables . Para establecer el ámbito numérico de crecimiento para un organismo e pecifico y un medio, se hacen una se ríe de cuentas en placa de la tercera dilución para determinar la densidad bacteriana . Entonces se escoge el volumen adecuado de esa tercera dilución, la cual, cuando se diluya con
B, C, D y E,
los
30 ml en los frascos A, -
contenga de 30 a 80 células viables/ml . Si los procedi-
mientos se normalizan tanto para una superficie inclinada del agar como
para la técnica del laboratorio, es posible reproducir los resultados
en experimentos repetidos con la misma cepa de microorganismos.
e)
Dificultades del procedimiento . - Los problemas que a -
menudo surgen en este método se deben a:
1)
Almacenar una muestra de agua destilada de calidad deseo
nacida en recipientes de vidrio, blando.
2)
El uso de sustancias químicas en la preparación de reacti-
vos que no sean de grado reactivo analítico o que no sean de reciente manufactura .
Contaminación del reactivo por agua destilada con un am- Mente bacteriano . Para evitar este problema preparar una cuenta en pla
ca estándar con todos los reactivos del medio antes de iniciar la prueba.
4)
Fallas al obtener la concentración inicial deseada o eles- -
cien incorrecta de la dilución usada para obtener la cuenta en placa de 24
horas .
5)
Prolongación del tiempo de incubación mas allá del límite -
de 26 horas.
6 .8 .1 .8
a)
Cálculo.
Para sustancias que inhiben el crecimiento:
cuenta de colonias/mi frasco B
Proporción = cuenta de colonias ml frasco A
Una proporción de 0 .8 a 1 .2 (inclusive) muestra que no hay surtan
ciar tóxicas . Una proporción menor a 0 .8 indica presencia de sustancias
inhibidoras de crecimiento en la muestra de agua.
Para fuentes de nitrógeno y carbono que promueven el are_
cimiento:
Proporción
e)
Para fuentes de nitrógeno que ayudan al crecimiento:
Proporción
u)
cuenta de colonias n l frasco C
cuenta de colonias ml frasco A
cuenta .de colonias! ml frasco D
cuenta de colonias f ml frasco A
Para fuentes de carbono que ayudan al crecinhicnto:
Proporción
cuenta de colonias f mi frasco E
cuenta de colonias ml frasco A
calcule las proporciones de los . incisos b, c v d cuando la pro
porción del inciso "a " indique reacción tóxica . Para las proporciones de
los incisos b, c ó d un valor en exceso de 1,2 indica una fuente útil para
el crecimiento de la bacteria,
6 .8 .1 .9
Interpretación de resultados . La cuenta de colonias del -
fraseo A despuós de 20 a 24 horas a 35' C depender del. 'número de or
anisuios iiiieiaLcs sembrados en el Frasca A ] de la cepa de E . aer.oge usada . ' Esta es La razón por la que el control, frasco A, debe hacer
se con cada serie individual de pruebas . Sin en-t rgo, para una cepa de
andenes, bajo condiciones del medio ambiente idénticas, la cuenta
terminal debe ser razonablemente constante cuando la siembra inicial - sea La, misma . Las diferencias en la cuenta inicial de 30 y 80 serán a proximadamente tres veces más grandes para los 80 organismos semi- -
- 795 -
brados inicialmente en el frasco A, previendo constante la relación de
cr citiriento remanente . Entonces es. esencial que la cuenta inicial de
colonias en el frasco A y frasco B sea aproximadamente igual para ase
gurar la exactitud de ios datos.
Cuando las proporciones excedan a 1 .2, puede asumirse que están
presentes sustancias estimuladoras de crecimiento . Sin embargo, este procedimiento es extremadamente sensible y las proporciones mayores a 3 . 0 tendrán poco significado . Por lo tanto, cuando la proporción esté entre 1 .2 y 3 .0, las pruebas C , 1) y E no parecen ser necesarias, excep
to en circunstancias especiales.
Usualmente el frasco C será muy bajo y los
frascos
D
y
E tendrán
una relación menor a 1 .2 cuando la proporción del _frasco B al frasco A este entre 0 . 8 y 1 .2 . Los factores lirnitantes de crecimiento en el Eras
co A son el nitrógeno y el carbono orgánico presentes . Una cantidad extremadamente grande de . nitrógeno amoniacal sin carbono orgánico podría
incrementar la proporción en el frasco D arriba de 1 .2 ola ausencia del
nitrógeno con alta concentración de . carbono podría dar relaciones supe riores a 1 .2 en el frasco E, con una proporción B :A entre 0.8 y 1 .2 ..
Una proporción menor a Q, 8 indica que el agua contiene surtancías tóxicas, y esta proporción incluye todas las tolerancias permisibles.
Como ya se mencionó la proporción puede ser desde 1 .2 hásta 3 sin nin gana consecuencia indeseable .
No pueden recomendarse medidas de corrección específicas en caos de aparatos de destilación defectuosos . Sin embargn, debe etec -,
tuarse una inspección cuidadosa del equipo de destilación y una revisión
de la producción y manipulación del agua destilada.
A menudo el agua de alimentación para el destilador, se pasa a
través de una columna desionizadóra y un filtro de carbón . Si esa ce- lumna tiene buen mantenimiento, la mayoría de los contaminantes orgánicos e inorgánicos serán removidos . Si el mantenimiento es pobre, el
agua de salida puede ser de calidad más baja que la que tema antes de entrar al destilador.
El mejor sistema de destilación se hace de acero inoxidable, - cuarzo, Vycor o vidrio Pyrex, erg este orden de preferencia . Todas las
conecciones deben ser de acero inoxidable, tubos de Pyrex o tubos de - plástico hechos de cloruro de polivinilo (PVC) . Los tanques de almacenamiento deben ser de acero inoxidable estar protegidos del polvo.
6 .8 .1 .10
Sensibilidad de la prueba.
Tomando el cobre corno una medida relativa de toxicidad del agua
destilada, la . . sensibilidad máxima de la prueba será de 0 .05 mg de co bre/1 en una muestra de agua destilada .
- 79)7
6 .9 AGUA DE DILUCION Y PREPARACION
DE DILUCIONES.
6 .9 .1
Preparación del agua de dilución.
a)
Solución Madre de Fosfatos . -Disolver 34 g de fosfato reno
nobásico de potasio ( H PO 4 ) en 500 mi de agua destilada, ajustar el pH
a 7 .2 con NaOH 1N y diluir a 1 litro con agua destilada.
Agua de Dilución . - Agregar 1 .25 mI de la solución madre
y 5 ml de sulfato de magnesio (50 g MgSO •711, 70/l) a un litro de agua des
4
tilada y distribufr en frascos o tubos con voliimenes que permitan obtener
después de esterilizar 15 minutos, 99+ 2 mi ó 0 .9+ 0 .2 ml.
6 .9 .2
Diluciones.
a)
Diluciones en frascos.
:100= t0"2
.D i : i oo =10-4
- 798
ti)
níluciones en tubos.
1m1
Muestra
1 m1
-799 -
6 .10 CUENTA EN PLACA
El procedimiento de cuenta en placa proporciona una medida de la densidad de las bacterias heterótrofas, .erob s y anaerobia facultativas en el agua . Esta es una medida empírica, ya que la bacteria aparece aislada, en pares, cadenas, racimos o paquetes y no solo los me dios sencillos de crecimiento o una serie de condiciones físicas y qufrni
cas pueden satisfacer los requerí mientos fisiológicos de todas las bacte
rías en una muestra de agua . Consecuentemente el número de colonias
puede ser substancialmente más bajo que el nOmero real de bacterias via
líes presentes.
6 .10 .1
Aplicación de la cuenta en placa.
Para determinar la eficiencia de operaciones de separación y des
trucción de microorganismos, el recuento se efectúa antes y después de
cada operación ; los resultados revelan la reducción de la población bacriana . Esta técnica es muy útil para determinar la calidad sanitaria del
agua potable y determinar ias condiciones sanitarias en equipos, En general, podemos decir que sirve para facilitar la recopilación de datos confiables para las medidas de contról de la calidad del agua especial- mente para propósitos comparativos y legales.
6 .10 .2 .
Limitaciones.
No se obtiene información acerca de los cambios bacterianos de posible origen fecal no hay diferenciación entre la forma patógena y las
'-8Ó0-
formas inocuas pues ea una evaluación sólo de crecimiento.
6 .10 .3
Técnica para la cuenta en placa.
6 .10.3 .1
Equipo.
El mismo de la sección 6 .5 excepto los números 4, 13, 14, 17,
19, 20, 21 y 22.
6. 10 .
3.
2
Medios de cultivo . - Agar extracto glucosa triptona o altar
para cuenta en placa.
6 .10 .3 .3
Preparación de la muestra,
Marcar cada . caja con el nfrrtro de muestra, fecha, y otras infor
malones necesarias antes del análisis de la muestra . Preparar duplica
dos de placas para cada volumen de muestra a muestra . diluida.
Agitar bien las muestras haciendo 25 movimientos completos de
arriba hacia abajo, de aproximadamente 30 cm en 7 segundos . Opcio
nalmente usar un agitador mecánico y agitar por 15 segundos . Antes de
iniciar la siembra, coloque la muestra en un baño de agua a 35°.
6 .10 .3 .4
Selección del volumen de muestra.
En la caja se debe sembrar un volumen de 1 ml o de 0 .1 mi en
caso de que ese volumen sea muy concentrado, se procede a efectuar di
luc iones hasta llegar a un volumen tal que la cuenta total de colonias se
encuentre entre 30 yy 300 .
80] -
.10 .3, 5
Procedimiento.
Trabajar en condiciones estériles (desinfectar la mesa y trabajar
cerca de la flama de un mechero).
Use una pipeta estéril diferente para transferir de cada dilución.
Cuando torne la muestra no introduzca la pipeta mas de 2 .5 cm abajo de
la superficie de la muestra o dilución.
Colocar con la pipeta el volumen de muestra o dilución seleccio
nado en una caja petri estéril . Prepare por lo menos otras dos cajas por
cada dilución de muestra usada.
Colocar el medio de agar sólido en un baño de agua para licuarlo
o en un flujo de vapor en un recipiente parcialmente cerrado, pero evite exposiciones prolongadas a altas temperaturas durante y después de li -cuan el medio.
Descarte el medio de agar ya fundido si presenta precipitado.
Mantenga el medio licuado en un baño de agua entre 44 y 46G C hasta que
sea usado.
Verter de 10 a 12 ml del medio liquido a 44-4T C dentro de la ca
ja . Mezclar por rotación, primero en una dirección y después en otra,
teniendo cuidado de no mojar el borde de la caja . Dejar solidificar duran
te 10 minutos, sobre una superficie plana ; después invertir la caja y colo
carta en la incubadora .
- 02 -
6 .10 .3 . (
Control de esterilización.
Comprobar la esterilidad del medio y la dilución, colocando una
caja testigo por cada serie de muestras . Pueden prepararse controles
adicionales para determinar la contaminación de la caja, pipeta y aire del cuarto.
6 .10 .3 .7
Incubación.
Incubar a 35 ± 0 .5° C durante 48 3 h todas las placas sombra dae excepto las de agua embotellada.
Para la cuenta en placa de agua . embotellada las placas se incuban
a 3-0.5° C d72 - 4h.
6.1.0.3 .8
Cuenta de las colonias.
Contar todas las colonias . Si la cuenta debe aplazarse temporal
mente, almacenar las placas a 5 - 10'C durante un periodo menor a 24 h, pero procurar evitar esto.
Usar un contador como el Quebec, para auxiliarle en la cuenta . Si tal equipo no se encuentra disponible, la cuenta puede hacerse con al gCn otro contador provisto de una lente de aumento e iluminación uiva
lente .
Generalmente no es deseable sembrar más de 1 ml de agua en una placa ; sin embargo, cuando el número total de colonias desarrolladas en la caja de 1 ml es menor a 30 , es necesario usar un volumen
mayor de muestra . Con esta excepción sólo placas que muestren de 30
-03-
a 300 colonias, deben considerarse en la determinación de la cuenta en placa .
Registrar La cuenta de bacterias por mililitro mediante la multiplicación del número promedio de colonias en cada placa por la dilución
usada .
Registrar corno cuenta estándar en placa por ml . Si todas las pla
cas tienen más de 300 colonias, usar la placa que tenga la cuenta más cercana a 300 colonias . Sí todas las placas no tienen colonias ; reportar
la cuenta como menor a 1 multiplicado por la dilución más . baja . Por ejem
pío, si no se desarrollan colonias en la dilución 1 :100 registrar la cuenta como menor que 100.
Cuando el número de colonias por placa excede a 300 no se debe
reportar coirio "incontables" . Si hay menos de 10 colonias/cm2, .se hace
la cuenta en 13 cuadros (del Quebec) teniendo una distribución representa
tiva de colonias . Si es posible, seleccione 7 cuadros consecutivos hori zontalmente a través de la placa y 6 cuadros consecutivos en ángulo recto,
empiece cuidando de contar cada cuadro sólo una vez . Multiplicar por 5
2
la suma de las colonias en los 13 cm representativos, para registrar las colonias estimadas por placa, cuando el área de placa es de 65 cm2 . Cuando hay más de 10 colonias em 2 , contar 'cuatro cuadros representad
vos, tornar la cuenta promedio por cm 2 y multiplicar por el factor apropiado para estimar las colonias por placa (por lo general es aproximada-
- 804 t .
Inerte de
6E ) .
.
Cuando la cuenta bacteriana en placa es mayor a 100 col cm 2 se
reporta el resultado como mayor a 6 500 veces la más alta dilución se' o
brada .
Si-en la placa se encuentran colonias extendidas, seleccionar la
cuenta de colonias en porciones representativas sólo cuando : a) las colo
nias estén bien distribuidas en áreas libres de separación y b) el área cubierta por el separador no excede un medio del área de la placa.
Cuando se cuenten las colonias extendidas, se hace de la siguen
re amanera. : a) si hay una cadena de colonias que parece ser causada por
desintegración de un upo de bacterias cuando se mezcló el agar y In muestra, se cuenta cada cadena como una colonia, b) cuando hay desar'ro
llo de una película de crecimiento entre el agar y el fondo de la caja petris o se forma una pe,Iidula de agua en el borde o sobre la super fície del
agar, se considera que se desarrolla un extendimiento por una acumulación de humedad y cubre más de la mitad de la caja . Si las cajas preparadas tienen excesivo crecimiento extendido, reportar "extendido" cuando sea incontable.
Cuando las cajas son Incontables porque la dilución falló, hubo
goteo accidental y se contaminó, o la caja de control indica que el medio
o material estaba contaminado reportar corno " accidente de laboratorio 1"
6 .11
LIF RM S TOTALES .*
Definición.
611 .1
Son bacilos cortos, no esporulados,aerobios y anaerobios facultativos, grana negativos, que fermentan la lactosa con producción de gas y
acidez a 5 ± 0 .5° C ea 48 horas.
.11 . 2
Ventajas del grupo conforme corro indicador de contamina
cien.
Su ausencia es evidencia, de un agua bacteriológica mente se
gura .
b)
Los conformes se presentan en mucho mayor número que -
los microorganismos patógenos de origen intestinal.
Los coliformes están siempre presentes en el Intestino humano y de otros animales de sangre caliente y son eliminados en gran ná
mero por las heces.
d)
Los coliformes persisten más en el desarrollo acuático que
las bacterias patógenas de origen intestinal.
e)
Pueden ser determinados por técnicas sencillas.
Limitaciones.
6 .11 . 3
a)
Algunos de los constituyentes . del grupo coliforrne ., tienen -
una extensa distribución en el ambiente.
b)
Las pruebas están sujetas a interferencias debido a otras -
especies de bacterias, por ejemplo la presencia de pseudomonas da resul
tados iguales a los coliformes fecales.
* El método de tubos de fermentación está considerado corno Norma Oficial Mexicana publicada en el Diario Oficial el 24 de febrero de 1977 .
- X06
Algunas especies pueden multiplicarse en ciertas aguas como son A . aerogenes.
d)
Porque en los problemas de multiplicación ocasional el -
grado de contaminación es difícil de evaluar.
6 .11 .4
Técnicas de identificación del grupo coliforrne.
6,11 .4 .1
Tubos de fermentación múltiples.
a)
Medios .:, caldo .lactosado o caldo lauril triptosa, caldo lac
Losado, bilis verde brillante (LBvB), agar eosina azul de metileno (EA f)
o agar ENDO, agar inclinado, agua destilada desmineralizada y despro vista de sustancias bactericidas o in€iibidoras, agua de dilución y para la tinción gran : cristal violeta, lugol, alcohol-acetona y safranina.
b)
Aparatos y material de laboratorio . Ver lista en la sec - -
ción 6 .5 excepto los números 4, 19 y 20.
c)
Técnica de tubos de fermentación múltiple . Para usar la -
técnica del IMP se utilizan series de tubos, los cuales constan de tres di
luciones por lo menos (10, 1, 0 .1 ml) y por cada dilución debe haber 3
5 tubos .
1)
Prueba presuntiva:
La cantidad y concentración del medio está de acuerdo al volumen
de muestra como se indica en 6 .6 .1 . 2 . c.
Inocular una serle de-tubos de fermentación que tengan caldo tacrosado o caldo lauril triptosa con cantidades apropiadas de la muestra que
se va a analizar (múltiplos o submúltiplos de 1 ml) . Mezclar con cuidado . Incubar a 35 ± 0 .5 0 C los tubos de fermentación inoculados.
Examinar cada tubo a las 24 - 2 horas . Agitando suvamente an -
tes de examinarlos . Los tubos que presenten formación de gas se consideran positivos . Los tubos que no presenten formación de gas se vuel ven a incubar otras 24 ± 2 horas.
La formación de gas dentro de 48 ± 3 horas, constituye una prue ba presuntiva positiva .y nos da un indicio de la presencia de coniformes.
La ausencia de gas al final de 48 ± 3 horas, indicará una prueba
negativa es decir ausencia de coliformes y por lo tanto el análisis queda
rá concluido.
2)
Prueba confirmativa.
Los tubos positivos de la prueba presuntiva se resiembran con un
asa de siembra en caldo lacrosado bilis verde brillante (LBvB) y se incubana35- 0 .5'C.
Examinar cada tubo a las 24 - 2 horas . Los tubos que presentan
formación de gas, se consideran positivos . Los que no presenten forma+
ción de gas se incuban otras 24. - 2 horas.
La formación de gas dentro de 48 - 3 horas, constituye una prueba
confirmativa de la presencia de coliformes.
La ausencia de gas al final de 48 ± 3 horas, nos indicará la ausencia del grupo conforme .
- 808 -.
Alternativa.
3)
Cuando hay 3 o más tubos positivos por cada dilución (mfnimo 3
diluciones), a las 24 h de la prueba presuntiva, se pueden resembrar sólo los tubos positivos de las dos Últimas diluciones (las que tienen me
nos muestra), para hacer la 'prueba confirmativa ; para efectuar las lec
taras se considerarán • positivos en la prueba. c fírmativa los-tubos poli
Uvas
de, las dilupiones no resembradas, aunque den negativos los tubos.-
que.: si r'elembraron para la coalla-nativa.
•E caso de que se vuelvan positivos loé tubos negativos de 24 h } de la prueba presuntiva, entonces sf se deben resembrar todos los tubos
que hayan cambiado a positivos a las 48 h.
Si se tiene meros de , 3 tubas positivos por cada dilución en la - -prueba presuntWva, ó si se realizaron menos de 3 . diluciones, se deben resembrar todos los tubos para la prueba cotifirmativa.
4)
Prueba complementaria.
los tubos ,positivos de LBv$ se resiembra con un asa por es -
trías en cajas con medio EAM, medio agar Endo, incubando a - 35 - 0 .5 C y se hacen observaciones a las
,24 . -
2 horas . Se siembra -
1 o más cajas por cada tubo positivo. - La•;ptesen la de colonias típicas
(nucleadas con o sita rillo metalícb), se coii fdor-a como una prueba pósi
tiva ; de las colonias ' picas, se toma una muest ut lizandG el asa y se resiembra :
En tubos de fermentación con caldo lactosado, incubando
a 35+ O .5° C . Se observa a las 24-48 horas . La, producción de gas es
una prueba complementaria positiva.
Ens tubos con altar nutritivo inclinado, incubando a 35+
, se observan a las 18-24 horas y se hacen preparaciones
gram .
En la figuara 6,11-1 se presenta una síntesis de los pasos de la
prueba para determinar conformes totales.
5)
Tinción gram . La presencia de bacilos gram negativos
no esporulados, son una prueba complementaria positiva.
Técnica para hacer una tinción gram,
Preparar una emulsión de la bacteria en una gota de agua
destilada, tomando una pequeña cantidad de la muestra y extendiéndola
bien sobre la superficie limpia y desengrasada de un portaobjetos . Secarla al aire y una vez seca, fijarla pasando el frotis tres veces cerca
de la flama, en forma rápida.
Cubrir el frotis con cristal violeta-oxalato de amnonio du
rante 1 minuto .
Lavar con agua de la llave, sin que se arrastre la preparación .
Cubrir el frotis con legal y dejar actuar un minuto.
Lavar con agua de la llave.
Decolorar con alcohol-acetona durante 10 segundos, o go
PRUEBA PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES
[sT,A1
r
Ira
el caldo Iodosodo o el
caldo laurii frOosa o 35±0.!
CALDO LAC7OSADO O
CALDO LA,_TRIPTOSA
(Tunosde rna modo)
=1
Fin* paltiva= formación de
ouaquier cantidad de gas
c1
Lid
1
Tubos Positiva
24 t Uva,
Tubos Regalitos
- 24 t 2 Hrs .
Tiempo totd úe incubación
48±3 Hrs.
cI
P
L
l
I
.1 a
1
1 I
CALDO LACTOSA BILIS`
VERDE BRILLANTE :
_ tubosdelrente*iión
r
Tubos
E. i
N1i
24±
f
Tubos Po M s
2 4 t ?frs.
Incubar los tubos can LBVB
48±3 Hrs . a 35±0.5 0 C
s-
Tala Posid has Tubos eiáatiws
4B± 3Nrs .
48- 3t s,
'GRUPO CO'L)F
AUSENTE
t
Incubar las pocos de EAMa AGAR
PLACAS DE EAM
0AGARENDO
a
ENDO pnr
4z
Tubos con AbAR
Caldo
18-24 fip% 35± 05*C
I
Tincidn Gnon
o I
I
Gmm-E
Gram -
Tubob .Ptosihv s
GRUPO COUrE
AUS E ñtTE
ez
cc
LJ
1
I
cc
cI
tocada
i# — 24 Hrs.
351 O5°C
NUTRITIVO IliCLINADO
O
COLIPORME
PRESENTE
2412
Hr. a 35
. °C
ta a gota hasta que la última no arrastre colorante.
Lavar con agua de la llave,
Cubrir con safranina y dejar reaccionar 15 segundos.
-
Lavar con agua de la llave y quitar el exceso de agua con
un papel filtro . Dejar secar al aire.
-
Observar al microscopio de inmersión
d)
Aplicaciones de las pruebas a los exámenes de rutina.
La prueba presuntiva se puede aplicar al examen de muestras
de aguas negras y afluentes de plantas de tratamiento . También para
muestras de rutina de aguas crudas en una planta de tratamiento.
La prueba confirmativa sirve para el examen de muestras de agua en las que se conoce de antemano que no es aplicable la prueba pre
suntiva (como único examen) : para muestras de agua potable, en proceso
de potabilización, para afluentes dorados de las plantas de depuración
de aguas negras y para aguas de balnearias . Para muestras de agua don
de los resultados se usen para el control de la calidad de aguas crudas o
terminadas.
La prLebá completa se aplica principalmente para confirmar y ca
lificar la calidad sanitaria de agua cruda o potabilizada.
Nota: Para la observación del gas producido por actividad+ microbiana se usan los tubos l urham, los cuales deben estar llenos a toda su
capacidad, libres de burbujas y quedar cubiertos por el 'medio contenido en los tubos de ensaye ; después de la esterilización se someten a un
examen previo de esterilidad incubándolos a 35° por 24 horas ; los tubos Durharn que presenten burbujas, o aquellos que manifiesten fermen
ración, se desechan.
e)
Lectura.
La producción de gas desalojará un volumen del medio contenido
en el tubo Durharn, esto es una característica positiva de la prueba ; agi
tarado levemente se observa la liberación de gas en forma de pequeñas burbuj as.
Los resultados se 'expresan en forma de quebrado, en donde el
numerador es el número total de tubos positivos y el denominador, el to
tal de tubos empleados en cada dilución ; por ejemplo : 3/3, 2/3, 1/3 significan 3 cubos positivos para la primera dilución (10 ml), 2 tubos poli
tivos para la segunda dilución (1 ml) y un tubo positivo para la tercera
dilución ( .1 ml), por cada dilución se emplearon tres tubos con un cocal
de 9 . El NMP se lee en las rabias que aparecen al final de capitulo, en
este ejemplo el valor obtenido para el c 6digo 3, 2,1, es de 150 colifor mes por. 100 ml de muestra.
En caso de no aparecer en la tabla el código obtenido, el NMP se
puede estimar mediante la siguiente fórmula.
NMP 100 ml =,
No . detubos positivos x 100
ml de muestra en los
m1 de muestra de
tubos negativos .
todos los tubos,
6 . 11 .4,2
a)
Técnica de filtro de membrana.
Generalidades.
Esta técnica se originó en Alemania durante la segunda guerra
mundial, actualmente es un método normal para el exámerr bacteriold
co de , aguas, aguas
b)
negras y muestras afines.
Las principales ventajas de esta técnica, son las siguien
tes ;
1)
Puede examinarse un gran volumen de agua ; teóricamen-
te se puede filtrar cualquier cantidad de agua y retener todos los orga
nismos presentes en ella.
2)
La .membrana puede transferirse de un medio de cultivo
a otro, con fines diferenciales o selectivos.
3)
Los resultados se obtienen más rápido, aproximadamen-
te en 24 horas, y los resultados numéricos tienen mayor precisión . (reproducibilidad) que con el método de tubos de fermentación.
4)
Con medios de cultivo apropiados, pueden estimarse cuan
titativamente las bacterias conformes o las que se pretendan estudiar.
5)
Permite la filtración de muestras en el campo.
c)
Mientras que las desventajas se resumen así.
1)
En aguas con turbiedad producidas por algas y otros ma-
teriales, el taponamiento de los filtros impide la filtración de volúmenes suficientes de muestra .
2)
La turbiedad producida por algas u otros materiales, in-
terfiere con el desarrollo de las colonias bacterianas coliformes.
3)
En aguas con alto contenido de bacterias no coliformes, -
interfiere mucho el desarrollo de colonias bacterianas coliformes, prin
cipalmente por causa de competencia e inhibición,
4)
Algunas muestras que contienen 1 mg/1 de Cu ó Zn 6 am-
bos, dan resultados irregulares de bacterias coliformes.
d)
Características del filtro de membrana.
Los filtros de membrana pueden variar en resultados debido a la
diferencia en los métodos de fabricación, materiales control de cali dad . El poro en el filtro debe estar distribuido uniformemente y tener un diámetro de 0 .4 ± 0.01
.1,
los filtros deben retener la bacteria cuan
titativarnente en su superficie, estar libres de sustancias que inhiben o
estimulen el crecimiento de las bacterias, y libres de materiales que -
directa o indirectamente interfieran con los sistemas de indicador bacte
riológico en el medio.
El filtro y cojín absorbente no deben degradarse en la esterilización a 121 0 C por 10 minutos . La tinta usada para delinear la superficie
no debe ser tóxica.
e)
Técnica del filtro de membrana para el grupo coliformes
totales.
Equipo . Ver la lista en
6.
3 excepto los números 4,13, 14
y 17 .
2)
Medios de cultivo . M-Endó y agua de dilución.
3)
Selección del volumen de muestra . La cantidad ideal de
muestra que se va a filtrar debe ser tal que nos dé un resultado de no menos de 50 colonias y no más .de 200 colonias para todo tipo de agua.
Tabla .11, -Y . - Volumen de muestra más adecuado según el
origen del agua,
u en t e
-- -
gua potable
Volumen de muestra filtrada
ii~~ 0.1
0.01 0.001 0 .0001
ONE
1T1
gua de albercas
X ~n~.
altos, tanques
X
ornas de suministros de agua
Playas de recreo
EE.
MUR.
X
aa
X
x
aros
Aguas de desecho
doradas
Aguas de desecho
crudas
gil=
EMEBEE
EMIR
x
Cuando se tenga duda acerca del volumen de muestra es reco-
mendable hacer duplicados o triplicados de cada muestra.
4)'
Procedimi nto.
En la unidad de filtración, se filtran los volúmenes de muestra
que se desean analizar ; la cantidad filtrada dependen del orfgen de la -
muestra ; (Tabla 6 .11-1') así, para aguas potabilizadas se usan de 100
ml a 500ml ; para aguas de pozo, diluciones de 10 mI y para aguas muy
contaminadas, diluciones convenientes.
La membrana -usada como filtro en la unidad de filtración, que sirve para recuperar las bacterias presentes en la muestra, debe estar
esterilizada antes de usarse.
Después que se ha filtrado la muestra, se lava 3 veces el embudo, usando agua de dilución, en cantidades de 2Q a 30 ml, luego se ' reti
ra la membrana de filtración con las pinzas estériles ; bajo condiciones
de esterilidad se coloca sobre un cojín (papel filtro) que previamente ha
sido saturado con medio de cultivo ( - DD) y que se. encuentra dentro
de una caja i Petri.
El cojín saturado con medio de cultivo, se prepara de la siguien
te manera:
Se coloca el cojín absorbente estéril dentro de las cajas completamente limpias y estériles.
Luego, bajo condiciones de esterilidad, se satura el cojín con. medio nutriente líquido (M -ENDO) en proporciones de 1 . 8 a 2 .2 ml.
Incubación . Los cultivos de membrana se incuban por 24 horas
817 -
a 35+ 0 .5'C, en posición invertida.
5)
Lectura.
Cuando se usa el medio M-ENDO, se cuentan todas las colonias
que presenten un brillo metálico superficial de color rosa-rojo obscuro.
En los cultivos de membrana deben aparecer entre 20 y 80 colonias coliformes, y el total de colonias (conformes o no) no debe exceder a 200 .
La densidad estimativa de conformes, se registratâ en términos
de "colonias conformes por cada 100 ml de muestra", y se calcula de la
siguiente manera:
col . cliforrnes 100 mi = col . conformes contadas x 100
rnl de muestra filtrada
11 .4 .
Técnica de enriquecimiento.
Generalmente el procedimiento de enriquecimiento dará una me
jor evaluación de la calidad de las aguzas . Sin embargo, este paso puede eliminarse en los análisis de rutina de las aguas que muestren resultados adecuados sin usar esta técnica.
Se coloca ún cojín absorbente en una caja estéril y se adiciona
con una pipeta de' 1 .8 a 2 ml de caldo .laurtl triptosa para saturar el coj fn . Con cuidado se remueve cualquier excedente del liquido.
En forma aséptica se coloca la membrana por la cual se ha pasa
do la muestra. Se incubada caja por 1 1/2 a 2 horas a 35+0 .5'C en
una atmosfera de por lo menos 90% de humedad relativa . Posteriormente
818 -
se transfiere con cuidado la membrana a la caja con el medio especifico
(M-ENDO) se incuba
6 .11 .4 .4
t
35+ 0 .5 ' C por. 22 a 24 horas.
Técnica de incubación retardada.
Una modificación de la técnica del filtro de membrana, per mire
el adecuado transporte de la membrana después de la filtración.
Esta técnica puede usarse cuando no es posible mantener la temperatura deseada de la muestra durante el transporte y cuantía el lapso
entre la toma de la muestra y el análisis excede los limites de tiempo
permitidos.
La prueba consiste en filtrar la muestra en el campo e inmediatamente después de la toYna, colocar el papel filtro en un medio que va
a servir de transporte hasta que llegue al laboratorio.
La determinación se completa en el laboratorio al transferir la
membrana a un medio de crecimiento, . e incubarla a 35+ 0 .5 °C por el
tiempo estipulado.
El medio de transporte está diseñado para conservar lbs organismos coli,forres viables no permitir un visible crecimiento durante
el tiempo de transporte.
Los agentes bacteriostáticos impiden el crecimiento de los microorganismos durante el transporte pero permiten un crecimiento nDrmal de los conformes después que la membrana se transfiere a un medio de crecimiento fresco .
a)
Equipo.
3 .) Unidad de filtración para campo.
2) Ver la lista en 6 .5 excepto los números 4,13, 14 y 17.
b)
Medios.
1) M-ENDO preservativo o LES-MF holding.
2) M -ENDO.
c)
Procedimiento.
Colocar un cojfn absorbente en el fondo de una caja Petri y satu
rario con el medio seleccionado . Una vez filtrada la muestra, se quita
con cuidado la membrana y se coloca sobre la caja Petri que ya contiene el medio de crecimiento.
Es importante observar, durante el transporte, que la membra na no se deshidrate . Un exceso del medio en la caja, también es inde
seable .
La muestra puede guardarse en ese medio hasta 72 h sin que exista un crecimiento visible.
Una vez que se llegue al laboratorio se transfiere la membrana
a una segunda caja que contenga el medio de crecimiento.
d)
incubación.
1) Método M- ENDO . - Transferir la membrana del medio -
preservativo M-ENDO a una caja que contenga un cojín absorbente con el medio M-ENDO para el crecimiento e incubar a 3511 O . 5° C por -
h.
2)
Método I .ES. - Transferir, la niert braami cicl iiludi()
MP holding a Agar LES ENDO e incubar a 35 -1: 0.5' C por 20 a 22 h.
Si se observan colonias en el tiempo de transferencia, se recomienda
que la caja Patri que contiene la membrana sea refrigerada hasta que se
incube a 35 ± 0 .5° C por 16-18 horas .
(l . 12 COLIFC)I ES FFCAL1 S .*
0 .12, 1
Definición.
Son bacilos cortos, gram negativos, nó espnrulLtdos, que fermen
tan la lactosa con producción de acidez y gasa temperaturas entre 35 ± O, 5 y 44 .5 0 C . en períodos de 24 a 48 horas.
Ventajas como indicador de contaminación fecal.
6.12 .2
a)
La mayoría crece a altas temperaturas.
h)
Su presencia nos indica contaminación fecal.
c)
La supervivencia del grupo coliforme fecal es más corta
en medio acuoso que la de otros grupos conformes, por lo tanto su pre
sencia indica una contaminación reciente.
d)
Generalmente no se multiplica fuera del intestino de ani-
males de sangre caliente.
6 .12 .3
Limitaciones como indicador.
No hay una correlación establecida y consistente entre
los coliforn-ies totales y los fecales.
6 .12 .4
Técnicas para identificación de coliforrnes fecales.
6 .12 .4 . .1
Técnica del medio EC:.
a)
Equipo . Igual al equipo propuesto en el capítulo
.5 ex--'
repto los números 12, 19, 20, 21 y 22.
b)
Medios de cultivo . Caldo lactosado o caldo lauril tripto
ea y medio EC.
* El método de tubos de fermentación esta considerado corno
Norma Oficial Mexicana publicada en el Diario Oficial el 24 de febrero
,
de 1977 .
Técnica.
1) Prueba presuntiva.
Sembrar directamente de la muestra (10, 1 y 0 .1 ml) o
transferir 1 ml de las diluciones apropiadas a los tubos de fermenta- ción cota caldo lactosado o caldo lauril triptosa e incubar a 35 -110.5' C
por 24 -4& horas .
2) Prueba confirmativa.
De los tubos positivos (los que presentan producción de gas), inocular con un asa a tubos de fermentación con medio EC . Incu bar á 44 .5 ± 0 .2' C en baño maría por 24
2 horas . Una prueba positi
va será la producción de gas . Leer el resultado en las tablas del NMP
que se presentan al final del capitulo . En caso de no aparecer el NMP en las tablas calcularlo corno se indicó en 6 .11 .4 .1 e).
En la figura 6 .12-1 se presenta una síntesis para la determina
ción de coliformes fecales,
6,12 .4, 2
a)
Técnica de filtro de membrana.
Equipo . Ver la lista en el capítulo 6 .5 excepto los neme
ros 13, 14y 17 ..
b)
Medios : Caldo í-FC,
c)
Técnica.
Los procedimientos para el desarrollo de esta técnica -
son semejantes a los ya descritos en la determinación de coliformes to
tales, las diferencias estriban en el medio, temperatura, forma de in -
PIBA PARA LA
Tr
COLFORPES FECALES
CALDO, LACEO 0
CALDO LARIL IRTO
(tutee de #rr~vr )
3
O . *C
rotular
rifes
24 ± 219 i.
libes fn»pya
48 t . Ros,
i
Pibes
3# ,
batey el Rho EC por 24±2 Hrs-
1
e 44 .5 # 0.2 0C ce bobo do epa .
f.
2M 1
o
ti..
_~.
I
1
Tina
4
Ws.
s
. Tubos
24 ± 2 Fl .
C~1J1E
FECALES
AE1TE —
FECAL
PR N
1
1
1
ce] I
u.J
a- 1
}
cubación
lcc ras :
R
]~ili
r~i~cfc>
la Unidad de filtración sc'
'
I itl raii
101;
o -
lúmenes adecuados (ver tabla 6 .12-1) . 'lijo condiciones cdc ester1lidati -
.
se coloca la membrana . en la caja i'etri (preparada con un cojín absorben
te est1ril sobre el que se vacían 2 ml del medio M-FC eliminando con cuidado el liquido en exceso) . La caja se sella y se protege contra la en
tralla de agua mediante el uso de bolsas de plástico, Incubar en bario de
agua a 44 .5° C durante 24 horas.
' Todas las colonias azules son conformes fecales y deben ser de 2(J a 60 colonias . El c. i (culo se hace como sigue:
col .
coliformes/100
X11 ;
—
Col, conformes fecales contadas x 100
m e. muestre f tra a
Tabla No . 6 .12-1 . - Selección del volumen de muestra según su origen.
V OLUMEN
100
50
ECE=rEllEE
QUE
10
O E8 E
F
0- 1
LT R A RS
0.01
E
00001
lagos, depósitos
Pasos,
wio p dntioiee
Tomos de suministros de agua
___
Ríos, m
agrícola
Desechos unícipates
crudos
u.x
N.a
x
O
6 .12 .4 .3
Prueba de incubación retardada para la determinación de coliformes fecales (tentativa).
Este procedimiento es comparable al de incubación retardada
para coliformes totales . Elimina la necesidad de un baño de agua en el
Campo. El medio que se usa es el medio VFC holding, el cual puede mantener hasta 3 días las muestras.
a)
Equipo . Ver la lista en el capítulo 6 .5 excepto los núme
ros 13, 14, 17 y 19.
Unidad de filtración de campo.
b)
Medio de cultivo.
VFC holding.
M-FC
c)
Procedimiento.
Colocar un coj in absorbente en una caja de plástico y saturar
con el medio VFC holding.
Después de filtrar la muestra, remover el filtro de la unidad
de filtración y colocarlo en la caja preparada con el medio.
Es importante prevenir una pérdida de humedad del cojín y del
filtro y también es indeseable un exceso del líquido.
Las cajas pueden ir a temperatura ambiente durante el transpor
te por un máximo de 76 horas . Al llegar al laboratorio se remueve la
membrana del medio y se coloca en otra caja que contenga el medio - -
-826-
M-F C . Se incuban las cajas, colocándolos en bolsas pie plástico y su mergiéndolas en un baño de agua
d)
Li
44 .5" C por 24 horas.
Cálculos .
Número de colflOG ml =
no . de col .' contadas x 100
ml de muestra filtrada
6 .1 ESTREPTOCOCOS FECALES.
6 13 .1 .
Definición.
Son cocos, gram.. positivos, agrupados en pares o cadenas cortas,
crecen .'en presencia de sales biliares, producen acidez, pero no gas, en
rnanitol y lactosa.
6..13 .2
Generalidades.
'La determinación de enterococos o estreptococos fecales, con-
firma la suposición de que los organismos conformes identificados en
una muestra de agua, sean de origen fecal ; los estreptococos normal-mente proceden del intestino de animales de sangre caliente.
Dentro de los estreptococos o enterococos fecales, se incluyen;
Streptococcus faecalis
S . faecium
S . faecalis var . symogenes S . faecium var durara
S . faecalis van liquefaciens S, bovis
S . equinos
Cuyas características especiales son las de formar ácido con la
dextrosa, descarboxilar la tirosina, no producir catalasa, proliferar en
presencia de 6 .5% de cloruro de sodio a pis de 9 .6 en un medio que contenga 0 .1% de azul de rnetileno-altar-leche y 40% de bilis, a temperaturas de 45° 10° . S, symo enes y S, duraras producen beta hemótis is,
pertenecen al grupo serológico D de Lancefield . Los estreptococos son
sumamente resistentes a la estreptomicina, penicilina, tulerito de potes-
sio y sulfonamidas, por lo que la presencia deestos organismos cir }l a gtm los hace Sumamente peligrosos para la salud'-pfibl:icn.
La identificación bioqufrnica de los grupos puede dar informa- cien adicional acerca de la fuente de contaminación, ejemplo : si predomina S .bovis y S . equinus indicará contaminación debida a excremento
de animales de sangre caliente.
Las investigaciones han demostrado que altos números de esas especies asociadas con contaminación involucran procesos alimentarios
como desechos ladeos.
Tienen un corto periodo de supervivencia por lo que su presen
cia en una muestra de agua indica contaminación muy reciente.
faecalis var . liquefaciens no sólo se restringe a los intestinos de hombre y animales, sino que ha sido . asociado . con vegetación, insectos y ciertos tipos de suelos,
El valor e importancia de la determinación de estos organismos
se resume asf:
a)
Sirve para el reconocimiento de contaminación de corrien
b)
En aguas potabilizadas la determinación es importante,
tesa
pues los enterococos son más resistentes a la acción de cloro que las
bacterias coliformes.
c)
Son importantes en estudios de aguas de albercas y bal - -
nearios .
d)
Para el estudio de aguas salobres, en donde los enteroco
cos pueden sobrevivir por más tiempo que los organismos coliformes.
Ventajas como indicador.
6 .13 .3
a)
Estar presentes en excrementos y descargas, dando as -
pecto de contaminación reciente.
b)
No se encuentran en aguas limpias o sitios fuera del con-
tacto con la vida humana.
c)
No se multiplican fuera del cuerpo animal.
d)
Son más resistentes a los electrolitos que las demás bac-
terias ; soportan cierto grado de salinidad.
6 .13 .4
Limitaciones.
a)
La densidad de estreptococos en las descargas es baja en
relación a los coliformes.
b)
El tiempo de supervivencia en el agua, no está determina-
do adecuadamente.
c)
Aún no se conoce su distribución en la naturaleza.
Técnicas para la identificación de estreptococos fecales.
6.13 .5
Técnicas de dilución en tubos múltiples.
Técnicas de filtro de membrana.
6.13 .5 .1
a)
Técnica de dilución en tubos múltiples.
Medios: caldo azida dextrosa, caldo azida violeta de etilo .'
--830-
b)
Aparatos y material de laboratorio . Ver lista en el capa
tulo 6 .5, excepto los números 4, 5, 12, 14, 19, 20, 21 y 22.
c)
Procedimiento (ver figura 6 .13-1)
1) Prueba presuntiva.
Transferir directamente la muestra (10, 1, 0 .1 ml) ó 1 m1
de las diluciones decimales apropiadas, a tubos de ensaye que contengan
caldo azida dextrosa e incubar a 35 +- 0 .5° C, por 24 - 48 horas.
2) Prueba confirmativa.
De los tubos positivos (los que presenten turbiedad), inocular con un asa a tubos de ensaye con caldo azida violeta de etilo . Incu
bar a 35 ± O. D C, por 24-48 horas . Una prueba positiva será la producción de turbiedad o la formación de un botón púrpura en el fondo del
tubo .
Leer el resultado en la tabla del NMP que se presenta al final del
capítulo.
En caso de no aparecer el NMP en la tabla, calcularlo como se indicó en 6 .11 :4 .1 e).
6. 13 .5 .2
Técnica de filtro de membrana.
a)
Medios : agar KF para estreptococos.
b)
Aparatos y material de laboratorio . Ver lista en el ca -
pítulo 6 .5, excepto los números 4, 13, 14, y 17.
c)
Procedimiento . Se filtran los volúmenes deseados de - -
Fi
sI-
. 613-1
PRUEBA PARA LA E E I
I
DE.
ESTREPTOCOCOS FECALES
INCUBAR 'CALDO A D 24 A
46 HRS_ A 35°C
1
1
1
1
1
PRUEBA
=TURBIEDAD O
SEDIMENTO EN EL FONDO
DEL TUBO.
1
TUBOS NEGATIVOS
24t2bRS.
1
1
1
1
1
TUBOS POSITIVOS
T41 OS NIE5AT1VO E TRE TOC C S ¡
8 3 H_
FECALES
AUSENTES
1
1
1
I
CALDO AIAETIL -~ VIOLETA
(EVA)
•
TUBOS POSITIVO
4t2HR,
1
TUBOS NEGATIVOS
24± HRS.
d;t
PRUEBA {TURBIEDAD O FORP AC ON:
DE UN BOTON PURPURA EN EL
FONDO DEL TUBO
Lo
o
ESTREPTOCOCOS RECALE .
PRESENTES
TI1EO POSITIVOS
4e i±
TUBOS NEGATIVOS
46±3 FRS .
41
G
a
I~
1
i
cCI
Ui
¡
ESTREPTOCOCOS FECALES
AUSEWTES.
o
1
- 832 -.
muestra (pueden ser de 100 nzl ; 10 ml, 1 O, 1 ml) usando una membrana estéril . -Luego, bajo condiciones de esterilidad, se coloca la membrana sobre el medio contenido en Ea caja Petri, procurando que la superficie del medio quede completamente adherida a la superficie de la membrana y evitando burbujas de aire . La caja estéril se prepara
colocando un cojín absorbente y colocando 4 a 5 m1 del . medio . La . caja
invertida se ineu} a 35' C por 48 horas.
El número total de colonias debe ser entre 40 y 100 La observa
ción se hace con. estereomicroscopio a 10 X, se consideran positivas to
das las colonias rojas y rosas . El registro se hace en número de coli formes por 100 MI de agua .
TABLA 6-i
Indice del NMP y limite confiable de 95 °les para vorlas
combindeíones . de resultados positivos y negativos ct,an H
se usan '5 tubos con porciones de 10 MI . cado uno .
No . de tubos positivos,
5 tubos con porciones 0 )10 Mr . en
Límite confiable
Inferior
cadG un .o .
0
2
3
4
5
del
95°I°
Indice del NMP
por iOO MI,
2 .2
2 .2
5 .1
9.2
16 .0
>16 .0
0
p_f
0 .5
1_
3 .3
8.0
Superior
6.0
12 .6
19 .2
29.4
52,9
infinito
I
TABLA 6-It
Indice del NMP y límite confiable de 95°%o para varias carnbinoclones de resultados positivos y negativos cuando seusom 5
tubos con porciones de [0 Mi . en coda uno, 5 con porciones de 1 mi.
y 5 con porciones ale 0 .1 MI,
No, de tubos con
reacciones" positivos
Indice
del
NMP
Lirnit8
Confiable
de 95%
5 tubos 5 tubos 5 tubos P or
Inferior Superior
ton
con
con
100
MI.
10 MI . 1 MI . 0.1 MI,
<2
o
0
0
0.
1
2
<0,5
7
o
<0. 5
7
0
2
0
0
4
0,5
1 1.
0
2
1
1
0
0
1
1
1
2
2
2
2.
2
2
2
3
3.
3
3
3
3
3
4
4
4
4
.4 .
4
0
1
.0
1
0
2
4
4
0
0
1
1
2
3
0
1
0
0
. 0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
2
0
0
0
0
1
0
0
.0
a
0
<0,5
<0.5
<0.5
<0.5
0.5
7
11
11
15
15
5
7
7
9
9
12
<0.5
13
17-
1 .
2
2
3
21
21
28
S
11
11
14
14
17
17
1
2
2
4
4
5
5
19
25
25
34
34
46
48
13
17
17
21
26
22
3
5
5
7
9
7
31
46
46
63
78
67
6
No. de tubos con
reacciones positivas
Indice
del
NMP
Limite
Confin bite
de 95%
5 tubos 5 tubos 5 tubos por
Inferior
con
con_ con
100
ML
10 MI, 1 M I, 0.1 MI .
uperiar
26
27
33
34
9
9
11 .
12
78
80
93
93
23
31
43
33
46
63
7
11
15
11
16
21
70
89
110
93
120
150
.2 .
•49
70
94
79
110
140
17
23
28
25
31
37
130
1 70
220
1 90
250
340
3
3
130
44
300
4
4
4.
-4
.4
5
0
1
130
170
220
2#O
350
240
350
540
920
1600
2400
4
4
4
. 4
2
3
3
5
5
5
5
5
5.
0
0
0
1
0
1
2
5
5
5
5
5
5
2
2
2
3
3
3
0
1
2
0
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
.5
0
0
5
5
5
5
5
2
0
3
4
0
1
3
4
5
3 00
35
4 90
43
57 . .700
90
850
120 1,000
68
7 50
120 1,000
180 1,400
300 3,200
640 5,800
TABLA 6-M
Indice del NMP y Idmlte confiable de 95°4 poro +~arius combinaciD
nes de resultados pos1tiaos y negativos cuando se usan : 1 tubo con -porciones de 50 1., 5 tubos con porciones de 10 fw1l . y 5 tubos con por`
ciones de l0~ M 1 -
Límite
Conf labia
de 95°
••
•
• •:
••
Inferior Superior
•
+
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
2
0
<1
1
2
1
0
1
1
2
1
2
3
0
0
0
Q
4
0
2
2
2
3
3
4
0
1
2
0
1
0
2
3
4
1
1
1
1
0
0
0
0
1
0
1
Z
3
0
1
1
1
1
1
1
1
2
. 1
2
3
0
~
<0 .5
<0,5
<0. .5
No- de tubos con
1
reocciostes positivas
Indice
del
Límite
i~onf i a bi e
de 95 . .
NMP '
5 tubos 5 tubos por
Inferior
con
con
50 MI, 10 MI, 1 Mi - 00. 0 ML.
1 tubo
can
4
6
4
1
1
1
Q :5
6
1
<0 .5
8
1
6
9
11
8
13
13
1
3
5
5
<0 .5
<0 .5
<0,5
<0,5
<0 .5
<0 .5
1
3
4
6
3
<0 .5
<0 .5
<0,
<0 .5
<0,5
4
9
11
15
8
5
7
9
5
<0,5
1
2
<0-5
13
17 .
21
13
1
1
1
1
1
2
3
Superior
r
0
1
7
10
12
1
3
3
17
23
28
8
2
19
11
3
26
14
18
21
4
5
6
34
53
66
1
2
3
4
1
0
13
4
31
1
1
17
5
47
1
2
22
1
1
1
t
3
4
5
0
28
35
43
24
7
9
12
15
8
69
65 .
100
120
75
1
2
3
4
.5
35
54
'
32
160
1240
12
18
27
39
100
1 40
2 20
450
1
Í
I
TABLA '6- .m
Indice ;iel NMP y limite conflobie de 95% pgru verlas com .,
binaciones de resultados positl~ros y ne9ativo.9 cuando se 5
tubas con porciones de 5)ML, 5tubos con purciorsos de IQ Ml - y 5 lobas
con porciones de 1 Ml -
No de tubos con
reacciorse
positivas
Indice
L.i m i t e
con#fiable
de 95 lo
del
M
5 .tutros 5tubos 5tubos por
inferior Superior
con
con
con
IOQ
5o mi, to mi, 1 mi .
MI,
<1
0
0
0
0
1
1
<0.5
2
0
0
1
<0,5 . 2
1
0
0
1
2
3
0
C1
1
.
1
.
i
1
1
1
1
S
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
4
4
4
4
'
<0.5
<0.5
<0.5
1
<0 .5
0
1
1 .
1
1
0
1
0
1
2
2
<05
<0- 5
<0.5
< 0.5
<0.5
0,5
0
0
0
1
0
1
1
1
.
1
<0 .5
.
0- 5
<0- 5
<0,5
0.5
<0.5
t
2
2
2
3
3
4
0
1
0
2
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3
<0
.51
1 !
0
0
2
2
2
2
3
3
<0,5
<0,5
0- 5
0-5
3
4
3
1
1
0
1
4
4
1.
1
1
0
0' . 1
1
0
1
1
1
2
2
0
3
3
3
3
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
2
2
.
1
0
0
0
1
1
2
2
3
1
1
0
0
2
2
3
3
4
4
1
.2
0
4
0
1
2
2
. 3
3
1
0
3
0
0
1
1
1
1
<0,5
1
.1
1
Indice
No- de tubos con
2
2
2
2
2
2
2
4
4
2
2
2
4
4
4
L 4rni1 e
Oontiable
de 95%
del
reacciones positivas
N
5lubas 5 tubos 5tubos
con
000
coro
5o M . 10 •M4 4
1
1
4
4
4
4
4
2
2
2
3
1 mi - 100
1
0
3
3
4
4
4
1
5
0
1
5
5
5
5
5
'
0
0
0
1.
1
1
2
0
0
1
17
17
19
9.
9:
17
14
12
0
9
3
1
11
4
2
3
0
14
18
5
6.
6
2
0
1
2
3
7
6
.8
1
17
22
28
35
7
7
5
5
5
5
5
5
5
5
7
-5
5
14
14
3
2
3
4
4
1
2
3
4
0
.
12
14
12
4
4
5
2 ,
2'
2 :
3 j
3
'3
Si
4
4
12
12
2
2
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2
0
5
5
5
5
'5
7
9
7
9
9
9
2
2 1
1
41
3
3
3
3
4
4.
4
7
7
1 .
9
9
9
9
41
5
5
5
5
5
4
4
1
1
5
6
6
7
7.
8
2
2
2
2
1
r
I-
5
5
5
5
5
4
7
7
Inferior !Supe
.4
.4
4
4
5
5
1
2
0
4
4
4
4
4
por
2
3
4
5
.
10
13
~
.
6
7 !
9'
14'
19
23
28
21
26
34
53
31
47
70
85
. 11 .
8
100
24
35
1 1
541
18
27
1 00
1 40
92
160
24 0
39
.75
220
4 20
TABLA 6-Y
indice del NMP y I9mi#e confiable de 95°% para varias combino—
dones de resultados positivos y negativas cuando se uson : 3 tubos
con porciones de 10 Ml ., 3 tubos con porciones de 1 MI, y 3 con porciones de 0-1 M I,
Frrdico
•
0
0
0
3 tubos
con
1 MI,
0
0
0
0
3 tubos
can
01
Limite Confiable
de
del
N. M, P
por
95 %
Superior '
In ferio r
M 1 .,
0
1 .
0
3
3=0,5
3
<0 .5
0
4
7
7
1
0
.
9
13.
<0 - 5
. 20
3
3
21
23
.3
3
3
3
7
4
10
36
37
44
89
47
150
2•
C
0
0
0
2
2
0
3
0
0
23
3
3
3
3
0
0
2
0.
39
64
43
7
4
7
15
7
14
120
130
39C
210
230
120
30
380
93
150
210
240
460
1,100
'2,400
15
30
3
36
71
150
380
440
470
1,300
2,400
4,800
2
9
14
15
20
21
2.8
.2
1
3
3
3'
3
3
3
3
2
2
2
3
3
3
3.
0
2
0
2
3
-
- - --
~-
-
j
,
1•_
-
TABLA -I
Indice del NMP y Límite confiable de 95°% es para varias combinaciones de resultados positivos ynecatívos cuando se usan :5tubos
con porciones de 10 Ml ., 1 tubo con porción de 1 MI. y 1 tubo con por
cien ate 0 .1 ML
N .
con
de
tubos
. reacciones
5 tubos
cara
10 MI .
0
0
positivas
1
tubo
con
0,1 MI.
0
0
1
0
1
0
0
2
2
0
1
3
4
4
4
5
5
5
5
. tubo
con
1 MI.
Indice
.
1
Li' mlte
del
N . M,
por
MI.
<2
2
de
Inferior
Confiable
95 %
l
Superior
0
0 .050
5 .9
13
2 .2
4 .4
0 .050 .
0 .52
13
14
0
0
5
7 .6
0 .54
1',5
19
19
0
0
0
8,8 '
12
1,6
3 .1
29
30
0
0
1
0
1
. 0
15
20 .
21
3 .3
5 .9 .
6 .0
46
48
53.
0
0
1
1
.
0
1
0
1
38
96
240
j240
6 .4
12
12
330
370
3,700
6,14 BIBLIOGRAFiA
U . S . • Environmental Protection Agency . - Current Practicea in
Water. Microbiology . 1974.
APIiA, AWWA, WPCF . - Standard Methods for che Exarnin tion
of Water and Wastew ter . - 14 th Edition . - 1976 . .
Pelczar, M .J . , Reid, R . D . -
Microbiology . - 2a Edición .- IvMc-
ra -I-U11.
U . S . Environrnental Proteccion Ageney . - Handbook for Evaluating Water Batriological Laboratories . - 1975 .
7.
ANALISIS BIOLOGICOS
- 843 7 .1 INTRODUCC ION
La calidad del agua afecta la abundancia, composición y diversi dad de las especies ; estabilidad, productividad y condición fisiológica de las poblaciones de organismos acuáticos . Por consiguiente, una expresión de la naturaleza y salud de las comunidades acuáticas es una ex
presión de la calidad del, agua . Los métodos biológicos usados para me
dir lá calidad del agua incluyen el muestreo, conteo e identificación de
organismos acuáticos ; mediciones de biomasa ; mediciones de grados de
actividad metabólica ; mediciones de la toxicidad, bioacumulación y biomagnificación de contaminantes, así como procesado e interpretación de datos biológicos.
La información sobre estas formas de mediciones, nos puede . ser
vir para uno o más de los siguientes propósitos:
a) Explicar la causa del color, turbiedad, la presencia de olores y sabores desagradables y partículas visibles en el agua (por ejemplo planc
ton).
b) Ayudar a la interpretación de los análisis químicos, por ejemplo, re
lacionar la presencia o ausencia de ciertas formas biológicas con la de
ficiencia ó super saturación de oxígeno en las aguas naturales.
c) Identificar el origen de una fuente de agua que está mezclándose con
otra.
d) Explicar el taponamiento de tubos, cribas, o filtros, y ayudar en el
diseño y operación de plantas de tratamiento para agua y aguas de dese
- 844 -
cho .
e) Determinar tiempos óptimos para el tratamiento de aguas superf icia
les con alguicidas y para comprobar la eficacia de tratamientos.
f) Determinar la eficacia de varios estados de tratamiento para el agua
de consumo humano y ayudar en la dosificación efectiva para el agua en
la planta de tratamiento, tal corno dosificación en relación a materiales
orgánicos-en el agua.
g) Indicar la naturaleza, extensión y efectos biológicos de contaminación.
h) Indicar el progreso de la autopur ificación de los cuerpos de agua.
i) . Explicar el mecanismo de los métodos del tratamiento biológico ó bien, servir como un índice de la efectividad del tratamiento.
j) Ayudar en la determinación de la condición y efectividad de varias unidades en la planta de tratamiento de aguas de . desecho.
k) Probar en periodos cortos o largos, la variabilidad en la calidad del
agua, ya sea alterada por cambios naturales y/o inducida por el hombre.
1) Proveer datos del estado (status) de un sistema acuático sobre una ba
se .
La naturaleza específ ica de un problema y las razones para mees trear, dictaríais cuales comunidades de organismos acuáticos serían exa
minados y cuáles muestras y técnicas analíticas se usarían.
Se considerarán en secciones especiales, las siguientes comunidades de organismos acuáticos :
a) Plancton : Es una comunidad de plantas (Fitoplancion) y animales (Zooplancton) que se encuentra usualmente nadando o suspendidas en el
agua, inmóviles o poco móviles ; debido a ésto son transportados por co
rrientes . En agua dulce son generalmente pequeños o microscópicos ; en agua salada se observan más frecuentemente formas grandes.
b) Perifiton (Aufwuchs) : Es una comunidad de plantas y animales microscópicos asociados con las superficies de objetos sumergidos . Algu
nos son sésiles y otros se mueven alrededor . Algunos de los protozoarios y otros invertebrados pequeños y algas que se encuentran en el - plancton también aparecen en el perifiton.
c) Macrofiton : Son plantas grandes de todos los tipos . - Algunas veces
están sujetas al fondo (bénticas), algunas como libre flotadoras, otras veces totalmente sumergidas y otras parcialmente emergentes . Los ti
pos superiores generalmente tienen raíces verdaderas, tallos y hojas;
las algas son más simples pero pueden tener estructuras parecidas a ho
j as y tallos.
d) Macroinvertebrados : Los invertebrados grandes, están definidos, co
mo todos aquellos retenidos por el tamiz # 30 de la U .S . Standard.
Son generalmente organismos que habitan en los fondos (bentos).
e) Peces : En esta publicación sólo se mencionan los peces locales (Es
tados Unidos).
f) Anfibios, reptiles acuáticos, pájaros y mamíferos : Estos vertebra
dos también pueden ser afectados directa o indirectamente por derrames
o descargas de contaminantes y pueden ser
ütles para monitorcar la pre
sencia de contaminantes tóxicós o cambios a largo plazo en la calidad del
agua . En éste trabajo no se incluye ninguna discusión al respecto.
Gran .número de bacterias y hongos también están presentes en el
plancton y perifiton y constituyen un elemento esencial del ecosistema acuático total, a pesar de sus interacciones con la materia viva y muerta.
Las observaciones de campo son indispensables para interpretacio
nes biológicas signif ativas, pero muchos parámetros biológicos no pue .
den evaluarse directamente en el campo . Estos deben examinarse como
datos de campo o muestras de campo en el laboratorio, porque la importancia de los resultados análíticos dependen de la representatividad de la
muestra tornada, la atención está dada a métodos de campo
así como a -
los procedimientos de laboratorio . En los análisis biológicos, el personal de campo y laboratorio debe ser el mismo ; si no es así sus actividades deben estar coordinadas muy estrechamente.
Antes de comenzar a muestrear, deben estar definidos claramente
los objetivos del estudio . Por ejemplo, la frecuencia de un programa de
muestreo repetitivo puede variar de cada hora, para un estudio detallado,
a cada tercer mes para una evaluación general de condiciones estacionales . El campo de acción del estudio debe ajustarse a limitaciones en el
personal, tiempo y dinero . Al desarrollo de un plan de estudió debe pre
ceder un análisis del área y suficiente bibliografía.
Cuando sea posible un biólogo debe tomar sus propias 'nuestras . Macho del valor de un biólogo experimentado se encuentra en sus observaciones personales de las condiciones en el campo y en su habilidad pa
ra reconocer serias de cambios ambientales como . un reflejo en las varias
comunidades acuáticas.
Muchos artículos para muestreo biológico no están disponibles en las
casas especializadas que abastecen laboratorios, por lo que es necesario
hacerlos uno mismo.
La primera orientación• del capítulo 7 está dirigida al muestreo de
campo asociado con los análisis de laboratorio para ayudar a determinar
el estado de la comunidad acuática bajo condiciones de campó existentes
y ayudar en la interpretación de la influencia de las condiciones ambien
tales pasadas y presentes.
Muchos otros tipos de estudios pueden ser o han sido conducidos más hacia estudios de laboratorio . Tales estudios de laboratorio desarrollarían futuros conocimientos básicos de la comunidad y/u orgattis- reos responsables bajo condiciones controladas que ayudarían a predecir efectos de cambios futuros en las condiciones ambientales de las co
munidades acuáticas.
Las complejas interrelaciones existentes .en un medio acuático es
tan reflejadas en la organización de los siguientes incisos .
Los procedimientos de campo y laboratorio relativos a un inciso
también serán apropiados para otras secciones ; consecuentemente hay referencias que se cruzan entre incisos .
- 849 7 .2 PLANCTON
El término plancton se refiere a aquellas formas microscópicas acuáticas que tienen muy poca o ninguna resistencia a las corrientes y viven flotando libremente en cuerpos de aguas abiertos.
Las plantas planctónicas se denominan fitoplancton y los animales
planctónicos se denominan zooplancton.
El fitoplancton (bacterias y algas microscópicas) existe en formas
unicelulares, en colonias o en forma de filamentos . Muchas realizan foto
síntesis y sirven de alimento al zooplancton y a otros organismos acuáti cos .
El zooplancton en aguas dulces, comprende principalmente proto zoarios, rotíferos, clad6ceros y copépodos ; en aguas marinas encontra mos mucho mayor variedad de organismos.
El plancton, sobretodo el fitoplancton, ha sido usado desde hace tiempo como indicador de la calidad del agua . Algunas especies florecen
en aguas eutróficas, mientras que otras son muy sensibles a los desechos
orgánicos y/o químicos . Los fitoplancters indicadores de agua limpia in
cluyen Melosira islandica, Cyclotella ocellata y especies de Dinobryon . Las especies indicadoras de agua contaminada incluyen Nitzschia palea, Microcystis aerugi.nosa, y Aphanizomenon flos-aquae . Las dos últimas especies pueden formar florecimientos nocivos en aguas contaminadas, desechando toxinas y malos olores . Igual que el fitoplancton, las especies
de zooplancton en una área dada, sor útiles para predecir la calidad del
agua .
Debido a su corto ciclo de vida, .el plancton responde rápidamente
a los cambios ambientales, y por esto el índice de crecimiento y la composición de las especies indica la calidad de la masa de agua en la que se
encuentra . También debido a su pequeño tamaño y gran número, no sólo
influye. fuertemente en ciertos aspectos no biológicos (como pH, color, sabor, olor, etc .) sino que es en realidad parte de la calidad del agua.
7 .2 .1
Torna de la muestra.
7 .2 .1 .1 . Consideraciones generales.
Localizarlas estaciones de muestreo tan cerca corno sea posible
a aquellas seleccionadas para muestreos químicos y bacteriológicos, para
asegurar 'una correlación máxima . Establecer un número suficiente de . estaciones en tantas partes como sea necesario, para definir adecuada-mente las;clases y cantidades de plancton en las aguas estudiadas.
La,naturaleza fisica del agua (estancada, con flujo, marea) influirá. grandemente en 1a - selección de las estaciones . de muestreo.
El uso de sitio$, de muestreo seleccionados de antemano por investigadores asegurará la posibilidad de obtener datos históricos, los cuales
conducirán a una mejor comprensión de los resultados/ y proporcionará -
continuidad en el estudio de un área.
En un río, se deben localizar estaciones aguas arriba y abajo, en
descargas de contaminantes
y
ríos tributarios,
y
a intervalos apropiados
a través de . todo el tramo bajo investigación . Si es posible, se deben loca
lizar las estaciones en ambos lados del río, porque el mezclado natural del agua no ocurre a grandes distancias.
Algunos efectos de contaminación en poblaciones de plancton pueden no ser aparentes en distancias río abajo hasta después de varios días.
De manera similar se deben investigar los ríos tributarios que se sospe
che estén contaminados, pero teniendo cuidado en la interpretación de los datos del río pequeño, porque la mayoría del plancton puede ser de origen perifítico, llegando de sustratos naturales por el flujo del agua.
Las contribuciones del plancton de lagos adyacentes, represas y
áreas de aguas de retorno, tanto como los organismos del suelo llevados
por el río, pueden influir en la interpretación de datos . La profundidad
a la cual el agua es descargada río arriba de represas estratificadas pue
de afectar también la naturaleza del plancton.
Debido a que el agua de los ríos usualmente está bien mezclada verticalmente, el muestreo bajo la superficie es a menudo adecuado para
la toma de una muestra representativa en un punto dado . Se debe muestrear siempre en el canal principal del río, evitando áreas de aguas es-
tancadas, lodazales, etc ., que solo reflejan habitats locales- y no las condiciones del río . En ríos que están mezclados vertical y horizontalmente, las poblaciones de plancton pueden ser estudiadas por el exámen
periódico.* las muestras tomadas en la mitad del río dé 1 a 1 .5 m bajo la superficie.
Se debe usar un transecto o línea transversal al muestrear un lago o represa; tomar un número de muestras 'suficiente para obtener datos
significativos.
Muestrear un lago circular en puntos . estratégicos a lo largo de por lo menos dos transectos de orilla a orilla ; incluír el punto más profun
do . Muestrear a lo ancho del lago en varios puntos a lo largo de al me- nos tres transectos paralelos que sean perpendiculares al largo del lago,
con el primero cerca del influente y el último cerca del efluente.
Debido al gran número de muestras requeridas para evaluar el plancton, puede ser necesario restringir el muestreo a puntos estratégicos, tales como la proximidad de. descargas en el cuerpo de agua, construcciones dentro de éste y las bahías mayores.
En lagos, represas y estuarios donde las poblaciones de plancton
pueden variar con la profundidad se deben tomar las muestras de varias
profundidades . Las profundidades de muestreo serán determinadas por
la profundidad del agua en esa estación, la profundidad de la termoclina
o un isohalino, u otros factores .
En áreas bajas, de 2 a 3 m de profundidad, las muestras de lea sub
superficie son adecuadas . En áreas más profundas, se deben tornar las
muestras a intervalos regulares de profundidad . Niuestrear el plancton estuarino a intervalos regulares desde la superficie hasta el fondo . Colectar muestras marinas lejos de la orilla a intervalos de 3 a 6 m o más
en zonas eufóticas y hasta el fondo si el zooplancton va a ser incluido . Las
profundidades de muestreo para aguas marinas pueden ser arbitrarias en
tre la termoclina y la zona eufótica arriba y abajo del isohalino u otros límites .
Las muestras son referidas como muestras superficiales y'profun
das (subsuper'ficiales), las últimas son muestras tomadas a alguna profundidad estipulada ; debido a estolas muestras de la superficie pueden interpretarse como muestras tomadas tan cerca de la superficie del agua
como sea posible . Una muestra tomada de la capa superficial puede ser
reveladora, pero ordinariamente una cantidad desproporcionada de la ca
pa superficial no debe incluirse en la muestra porque el plancton está a
Menudo mezclado con polen, polvo y otros detritus.
La frecuencia de muestreo está dictada por el propósito o alcance del estudio, al igual que por el ámbito de fluctuaciones estacionales,
las condiciones meteorológicas inmediatas, calidad del equipo y habili dad del personal .
- 854 -
El muestreo frecuente de plancton es deseable debido a la variabi
lidad normal del tiempo y el carácter migratorio de las comunidades de plancton . Las migraciones verticales diarias y las casuales migraciones
horizontales son producidas por el viento, corrientes y mareas . Tomar muestras diariamente, cuando sea posible ; muestrear a diferentes tiem pos durante el día y a diferentes profundidades . Cuando ésto no es posi ble, uri muestreo semanal, quincenal, mensual o trimestral, todavía pue
de ser útil para determinar cambiós de poblaciones.
En áreas de marea de ríos de agua dulce, en extensiones salinas,
en tributarios, estuarios y en aguas marinas, muestrear el plancton de acuerdo con las oscilaciones de la marea y a cada profundidad preselec cionada durante la marea alta y la marea baja, por más de un ciclo de =
marea . Los datos derivados de estas aguas son frecuentemente más sia
nificativos cuando las muestras han sido tomadas cerca del principio o
del fin de ambas mareas, pero algunas muestras pueden tomarse fuera
de los estados de marea.
7 .2 .1 .2
Procedimientos de muestreo.
Una vez que el lugar de muestreo, profundidad, y la frecuencia . han sido determinados se procede a la preparación para el muestreo de campo . Etiquetar los fascos de muestra con suficiente información para
evitar confusiones o errores. Indicar fecha, estación de muestreo - -
área de estudio (rho, lago 6 represa), tipo de muestra y profundidad . - Usar etiquetas a prueba de agua y hacer las anotaciones con lápiz . Cuan
do sea posible colocar el recipiente con la muestra, en un frasco o caja
protectora para evitar que se rorripa . Si las muestras tienen que preservarse inmediatamente después del muestreo, agregar el preservador . al frasco antes de maestrear . El tamaño de la muestra depende del tipo y número de determinaciones que se van a hacer; el número de duplicados depende del diseño estadístico del estudio y los análisis estadísticos selec
cionados para ayudar en la interpretación de datos.
En la libreta de campo anotar el lugar de muestreo, profundidad,
tipo, tiempo, condiciones meteorológicas, turbiedad, temperatura del -agua y otras observaciones de importancia ecológica . Estos datos de - campo son valiosos cuando los datos analíticos son interpretados y a menudo ayudan a explicar cambios poco usuales causados por el carácter va
riable del medio arribiente acuático,
Fito7 p
. 2 .1l.3'anc ton .
Cuando la densidad del fitoplancton es menor a 500 unidades/ml tomar una muestra de 6 1 . En aguas más ricas una muestra de 1 a 2 1, es
suficiente . Para evaluaciones cualitativas y cuantitativas, tomar toda la
muestra (sin filtrar) de agua con un dispositivo consistente en un cilindro
con tapones en los extremos .y un mecanismo de cierre . Introducir el -
- 856 .
muestreador abierto a la profundidad deseada y cerrarlo . por medio de
un mensajero . Los muestreadores más comunmente usados que operan
con este principio son el Kernmerer, Van Don", y Nansen_
Figura 7 .2 .1 . Muestreador I emmerer" . (izquierda)y. Van Dorn ( derecha )
Los muestreadores Kemmerer y Van Dora son similares excepto por el mecanismo de cierre . La botella Nan'sen se usa para muestrear a
grandes profundidades, Algunas veces es útil dividir el plancton basán-
-857-
dose en su tamaño, sin tomar en cuenta el tipo de equipo de muestreo usado .
"Plancton de Red" se define generalmente como plancton con un diámetro de 60 jt o más (red de plancton con abertura de malla del # 20).
Los organismos' menores a 60 Al son designados como nanoplancton y los
menores a 10 u son designados como micro o ultraplancton . Si se usa -tal sistema de clasificación debe describirse cuidadosamente en el repor
te, ya que los rnuestreadores Kemmerer y Van Dorn muestrean plancton
de red y nanoplancton al mismo tieñipo.
El Van Dorn es el más utilizado debido a que por su diseño, no ofrece resistencia al flujo del agua a través del cilindro . También los muestreadores pueden colocarse en serie en una línea,para muestrear si
multáneamente a diferentes profundidades con el uso de mensajeros auxi
liares . Debido . a que por su diseño el disparador de estos muestreadores
es muy sensible, se debe evitar la manipulación brusca.
Introducir siempre el muestreador en el agua sin aventarlo . La capacidad :de los rnuestreadores Kemmerer y Van Dorn varían de 0 .5 a 5 litros . Se prefieren los muestreadores de polietileno o cloruro de poli
vinilo (PVC) a los de metal, porque éstos últimos liberan iones metálicos
que pueden contaminar la muestra . Se recomiendan botellas de almacena
miento de vidrio o polietileno . La contaminación por iones metálicos - -
puede conducir a errores significativos cuando se hacen análisis de algas
o mediciones de productividad.
El muestreo de fitoplancton con redes nos proporciona datos de va
lor limitado porque no se puede medir el monto total, volumen, biomasa
y composición de. especies . Debido a la selectividad del tamaño de la ma
lla, el plancton más pequeño (nanoplancton) que puede ser hasta el 60% de la biomasa total, no es muestreado . Sin embargo la simplicidad de estos muestreadores favorece su uso continuo . Se muestran varios tipos
de redes en las figuras 7 .2-II y 7 .2-II1.
A
Figura 7 .2 II . Diferentes.tipos de redes de plancton.
A) Red cónica, II) Red Flensen, )Red Apstein,D)Red Judai, E )Red Apsrein
con tapa semicircular, F) Red Nansen abierta y G)' Red Nansen cerrada .
Figura 7 .2- IiL Muestreadores de zooplancton de alta velocidad, ocea-
nográficos y/o cuantitativos . A)Muestreador Gulf III, 13)MuestreadorClarke Bumpus, C)Muestreador Hardy con contador de flujo D)Muestreador Sheard de alta velocidad, E)Muestreador de plancton Island
l) Red de propulsión 'llark . .
-86O-
Para determinaciones de productividad primaria se recomiendan
las botellas de muestreo, porque en ellas se atrapan todos los organismos presentes . Usar una bomba para muestreos más rápidos y para obmos
tener grandes cantidades de organismos . Sumergir una manguera larga
y pesada fija a una bomba de succión, a la profundidad deseada y bombear
el agua a la superficie . La bomba es ventajosa porque proporciona una muestra homogénea de una profundidad dada o bien una muestra integrada,
desde la superficie hasta una profundidad determinada, pero debe investí
garse un posible daño a los organismos por el propulsor de la bomba.
Para aguas someras usar el muestreador de superficie Jenkins o
una de las botellas muestreadoras modificadas de manera que las mues-%
tras se tomen horizontalmente . Como muchos de los otros muestreadores mencionados el de "eje de agua" es aplicable para el muestreo de fitoplancton y zooplancton.
Si se van a examinar muestras vivas, llenar los frascos sólo par
caalmente para reducir la inhibición de la actividad metabólica, y almace
nar en un refrigerador portátil o en una hielera . Examinar los especfine
nes dentro de las 3 horas siguientes al muestreo . Si es imposible exami
nar el material vivo, preservar la muestra . Si la muestra va a preserva rsc llenar el frasco completamente . Existen numerosos conservadores para fitoplancton, de los cuales el ,más usado es el formol . Para formas
delicadas, tales como flagelados desnudos, es preferible . una sotiwión de
lugol .
Para preservar las muestras con formol, agregar 40 ml de formol .
amortiguado a 1 litro de muestra inmediatamente después del muestreo.
Otros conservadores populares son el merthiolate y la solución de lugol . Preparar la solución de lugol disolviendo 60 g de ioduro de potasio ( Kl) y 40 g de cristales de iodo en 1 000 ml de agua destilada, agregar
1 ml de la solución de lugol a 100 ml de muestra y almacenar en la oscuridad . Prepara r la solución de merthiolate disolviendo 1 .0 g de merthiolate, 1 .5 g de borato de sodio y 1 ml de solución de lugol en 1 000 ml de
agua destilada . Agregar 36 ml de solución de merthiolate a 1 litro de - muestra y almacenar en la obscuridad . 'Las muestras preservadas con merthiolaté nó son estériles, pero pueden guardarse efectivamente por un año, después de este tiempo debe añadirse formol.
El fijador "M" se prepara disolviendo 5 g de ioduro de potasio, 10 g de iodo, 50 ml de ácido acético glacial y 250 m1 de formol en 1 000 ml
de agua destilada (disuelva el ioduro en una pequeña cantidad de agua para
adicionarlo a la solución de iodo) . Se agregan 20 ml del fijador "M" por
litro de muestra y 'se almacena en la obscuridad . Otros preservadores son alcohol al 95% y el 6-3-1 compuesto de 6 partes de agua,3 partes de
alcohol al 95% y una parte de formol . Un gran volumen de esta solución
es necesario para una preservación apropiada . Generalmente se usan -
- 862
volúmenes iguales de preservadores y muestra.
Para retener el color del plancton preservado, se almacenan las
muestras -en la obscuridad o se añade un ml de solución saturada de sulfato cúprico por litro de muestra:
La mayoría de los preservadores rompen y destruyen ciertas células, especialment 'aquellas formas delicadas tales como Euglena,
1y-
nura, Chromulina y Mallamonas . Un taxónorno experimentado prevee es
tos cambios estrúcturales . Un novato debe familiarizarse con los especí
menes vivos y asociar -las distoriciones producidas por la preservación.
Es muy útil para identificar fitoplancton preservado, una colección de re
ferencia proporcionada por una casa especializada o compilada .por un co
laborados experimentado.
7 .2 .1 .4
Zooplancton.
El muestreador escogido depende del tipo de estudio (distribución,
productividad) y del cuerpo de agua investigado . La distribución especial
del zooplancton en un lago no es uniforme . En ciertos casos, una espe cie particular puede estar distxibuída en una capa delgada contínua, a -una profundidad específica y puede no encontrarse en ningún otro lado, o
puede limitarse en manchas densas ocasionales . Para el muestreo de -zooplancton pequeño (nano), tales como protozoarios, rotiferos pequeños
y microcrustáceos inmaduros se usa la botella de muestreo descrita ante
riormente .
Los muestreadores de botella son inapropiados para el muestreo
de zooplancton grande (de red, tales corno nnicrocrustáceos adultos) los
cuales a diferencia de las formas más pequeñas pueden evitar su captura
y son mucho menos numerosos . Generalmente es necesario concentrar
estos organismos de un gran volumen de agua.
La trampa judas opera con cal mismo principio que el muestreador
de botella pero está especialmente diseñado para muestreo de zooplancton
de red y tiene una capacidad de 10 litros.
Comúnmente el zooplancton más grande se muestren cota una red de
plancton de malla B . Sin embargo, el tamaño de la malla, tipo de mate
rial, tamaño del orificio, largo, métodos de arrastre y volumen mees-Creado, dependerán de las necesidades particulares del estudio . El ta -mamo de 'la malla y el material de la red determinan la eficiencia de filtra
ci6n,, La tendencia do obstrucción, de velocidad, rastreo, y la coñdic .i6n de La muestra después del muestreo.
La mayoría de las redes están hechas de nylon o seda . Estos materiales son resistentes y flexibles, durables y no se dilatan con facilidad;
las redes largas con bocas anchas se recomiendan porque permiten una superficie máxima de filtrado y causan una alteración mínima de la población .
Se usan tres tipos de arrastre :vertical, horizontal oblicuo . Para
hacer un arrastre vertical se introduce la red a la profundidad desuda, después se levanta verticalmente a una velocidad de .5 a J. m/seg . Se estima el volumen (m de agua filtrada a través de la red como - - - V_
'Tr x r2
P. donde:
r.= radio de la boca de la red
P=Profundidad a la cual se introdujo la red
Para arrastres oblicuos y horizontales son más apropiados los muestreadores mostrados en , la figura 7 .2-111.
Para tomar una muestra se jala la red de plancton desde un bote .El bote debe estar equipado con un pescante, cinta métrica, indicador
de ángulo y un malacate . Fijar un peso de 3-5 kg a la red . Se determina la profundidad a la que se encuentra la red multiplicando el largo del
cable, por el coseno del ángulo del cable con la dirección vertical.
Mantener el ángulo del cable controlando la velocidad del bote.
Para arraste oblicuo introducir la red del muestreador a una pro
fundidad predeterminada y luego levantarla a una velocidad constante al moverse el bote hacia adelante . Para arrastre horizontal, introducir la red a la profunidad preseleccionada, jalar la red a esa profundidad por 5 -. 8 minutos, después cerrarla y extraerla . Los arrastres vertical y
ohlfcuo toman una muestra compuesta, -por esto el arrastre horizontal
toma una muestra a una profundidad particular ; para una estimación de
distribución y abundancia se usa el arrastre horizontal .
El
1t streadar de . bombeo de Clarke Burnpus se recomienda para
muestreos cuantitativos de zooplancton, porque es más versátil que otros
aparatos y puede usarse en varios patrones de muestreo . En aguas estancadas se tornan las muestras filtrando de l á 5 m 3 de agua.
Para una estimación de poblaciones de zooplancton de red en aguas
corrientes se toman 20 1 de agua de la superficie con una cubeta se filtran a través de una malla de tamaño apropiado . El borde de la red no de
be sujetarse más de unos pocos centímetros arriba de la superficie del agua para prevenir que los organismos sean impelidos a través de Ca . red.
Se preservan las muestras de zooplancton con etanol aL 7í t , formol amortiguado al 5% o solución de lago' . EL preservador de formal se .
prefiere pero puede causar distorsión en las formas plásticas tales como
protozoarios y rotíferos . Para prevenir evaporación se agrega glicerina
al 5% a la muestra concentrada . En muestras turbias se diferencia el material animal y vegetal agregando colorante de rosa de bengala al - .04%, el cual es químicamente específico para los carapachos (conchas) de
los zooplancter.s.
7 .2 .2
Técnicas de concentración.
Los organismos que se encuentran en las muestras de agua, algu -
nas veces se deben concentrar en el laboratorio antes de los análisis.
Existen tres técnicas de concentración descritas más adelante ; -
sedimentación, filtración por membrana y centrifugación.
7 , 2 .2 .1
Sedimentación.
Este método es ,el preferido porque no es selectivo (a diferencia de la filtración) y no es destructivo (a diferencia de la centrifugación) . El volumen concentrado varfa inversamente con la abundancia de los organismos y es afectado por la turbiedad de la muestra . Este puede ser
tan pequeño . corno:. 10 ml para usarlo en un microscopio invertido o tan -grande como un litro para la enumeración general de fitoplancton y zoo plancton.
La velocidad de sedimentación se acelera por la adición de un detergente líquido casero . Para una muestra sin tratar, dejar asentar una
hora por cada mm de profundidad de la muestra . Para una muestra trata
da ., (10 m1 de detergente por litro) dejar asentar aproximadamente media
hora por mm de profundidad.
La muestra se puede concentrar en una serie de pasos, transfi -riendo cuantitativamente el sedimento del frasco inicial a otros consecutivamente más pequeños, Se llenan los cilindros de sedimentación sin formar remolino, mantenerlos ,,in vibraciones y moverlos cuidadosamen
te para evitar unâ distribución que no sea al azar de la materia sedimentada . Sifonear o decantar los sobrenadantes para obtener el volumen fi nai deseado ( 5 m1 para montar diatomeas ) . Almacenar la muestra
concentrada en un frasco de vidrio cerrado y etiquetado.
7 .2 .2 .2
Filtración por membrana.
El método de filtración se usa principalmente para fitoplancton . No
se recomienda cuando las poblaciones son densas y el contenido de detrií. -
tus es alto, debido a : que el filtro se tapa rápidamente y el lodo puede aplastar a los organismos y cubrirlos quitándolos de nuestra vista . Verter un volumen de muestra bien mezclada en un embudo equipado con un filtro de membrana con tamaño de. poro de .45 }p . Aplicar vacío a .5 atmósferas.
Algunas características de este método lo hacen particularmente
adaptable para su uso en aguas con bajo contenido de lodo y fitoplancton.
El método permite principalmente el uso de altas amplificaciones,para la enumeración de plancters pequeños, no requiere del conteo de plancters individuales para reunir los datos de enumeración, e incrementa la
probabilidad de observar las formas menos abundantes.
7 .2 .2 .3
Centrifugación.
El plancton puede concentrarse por centrifugación contínua o intermitente . Centrifugar las muestras a 1, 000 G por 20 minutos . La centrífuga contínua Foerst no es recomendable generalmente como un aparato cuantitativo, pero puede servir para usarse en programas continuos .
- 868 -
Para un programa diseñado específicamente para un campo de acción li mítado, su rapidez y conveniencia pueden subsanar sus desventajas . Aun
que la centrifugación acelera la sedimentación, puede dañar organismos
frágiles.
7 .2 .3
Montaje y preparación para el exámen.
7 .2 .3 .1
Montaje húmedo semipermanente para fitoplancton.
.Se agita la muestra sedimentada', se concentra' y se aparta del res
to con una pipeta automática de precisión, si se tiene una disponible . Pre
parar los montajes húmedos transfiriendo 0 .1 ml a' un portaobjetos, po niendo un cubreobjetos sobre la muestra y se pega el cubreobjetos con al
gún material adhesivo para evitar evaporación.
Para portaobjetos semiperrnanentes, se mezcla glicerina con la muestra; después de un tiempo, el agua se evapora de la muestra dejando a los organismos en la glicerina . Si el cubreobjetos se pega con al- gún adhesivo la muestra puede conservarse por varios años si se guarda
en la- obscuridad.
7 .2 .3 .2
Montajes de filtro de membrana de fitoplancton.
Se ponen dos gotas de aceite de inmersión en un portaobjetos etiquetado . Inmediatamente después de filtrar, poner el filtro encima del aceite, con un par de pinzas, y agregar dos gotas de aceite en la parte superior del filtro . El aceite impregna al filtro y lo hace transparente . El tiempo de impregnación es de 24 a 48 horas . Una vez que el filtro se -ha
aclarado, se ponen unas Dt is ndieionales de
ai.
eitc en el filtro
y se
cubre
con un Cubzeol ,jetas.
El filtro montado queda listo para pu examen al microscopio,
7 .2 .3 .3
Montaje de diatomeas.
Las muestras concentradas para ánalisis de diatomeas por sedi- mentaeión o centrifugación, pueden contener materiales disueltos, tales
como sales marinas, formol y detergentes, los cuales dejan residuos que
interfieren ; por esto deben lavarse bien con agua destilada antes de su preparación . Pasar varias gotas•de la muestra concentrada y lavada, por
medio de una pipeta o gotero, a un cubreobjetos en una parrilla, calentón
dolo lo suficiente tiara acelerar la evaporación, poro evitando la ehu11i - Se evapora hasta que se seque . Repetir la adición y evaporación hasta que una cantidad suficiente de muestra haya sido transferida al cubreobjetos . Evitar cine se produzca un residuo demasiado denso para que
los organismos puedan ser reconocidos . Si hay dudas acerca de la densi
dad, se examina bajo un microscopio compuesto . Después de la evapora
ción, se incinera el residuo del cubreobbetos en una parrilla a 3OT_500 0 C.
Esto requiere usualmente de 20 a 45 minutos.
Se tratan las muestras concentradas para análisis de diatomeas
por filtración de membrana como se describe por Patrick y eirner . Mez
ciar un volumen igual de ácido nítrico concentrado con la Muestra . Se
' :870, -.
añaden algunos. granos de dieron to de .potasio para facilitar la digestión
del filtro y de fa materia orgánica celular . Se añade más dicromato si el
calor de la solución cambia de amarillo a verde . Se pone la muestra en
una parrilla y se hierve hasta . que se evapore aproximadamente una terne
ra parte del volumen original . Se deja reposar por una noche la muestra
tratada .
Este proceso de limpiado destruye la materia or Anica yy deja sólo
el caparazón de la diatome (frú,stula), Se eñfrfan• las muestras hervidas
y se Lavan con agua destilada . Se montan corno se describe anteriormente.
Precaución : Cuando se trabaja cori ácido nítrico concentrado, se deben
usar gafas de seguridad ; un delantal resistente al ácidb'y guantes, y traba
jar bajo una campana para mayor protección.
Se transfieren-las frústulas limpias a una cubierta de vidrio y se secan corno se describe anteriormente.
Poner una gota del medio para montar, en el centro de un portaobjetos etiquetado . Se usan portaobjetos de. 25 x 75 rnm con los bordes es-merilados.
El medio de montaje microscópico Hyr x (disponible corercialmen
te) asegura montajes fáciles y permanentes para examen bajo aceite de in
mersión.
Se calienta el portaobjetos a casi 90P C por uno o dos minutos an -
tes de poner eL cubreobj-ecos con el residuo de la muestra, para acelerar
la evaporación del soliente en el` medio de montaje . Se pasa el porta - objeto é; a una superficie fría aplicando una presión firme pero leve al cubreobjetos por medio de un instrumento plano durante el enfriamiento - (5 a 10 seg .) para reducir el grueso del
7, 2 . 3 .4
t
ontaje.:.
Montaje de zooplancton.
Para análisis de zooplancton, se remueven 5 ml de muestra del concentrado . Se transfiere la muestra a una celda de tonteo para análisis; como montaje hemedo usar fenol láctico de polivinil para montajes de zooplancton semipermanentes . -Los montajes son buenos por alrededor de un año, después del cual el agente clarificador causará deterio - ros en los organismos . Para montajes permanentes usar montador CMC -10 Turt;ox o un equivalente.
7 . 2 .4
Microscopios y su calibración.
7-.2 .4 . 1
Microscopio compuesto.
Aunque la mayoría prefiere el microscopio compuesto binocular,
se puede usar el tipo monocular, ambos tipos están equipados con un por
taobjetos mecánico capaz de mover todas las partes de una celda de conteo por la abertura de up objetivo . El equipo estándar incluye oculares
de 10 x (apareados cuando se usa un microscopio binocular) y objetivos
en los ámbitos siguientes :
Tipo de objetivos -
.iiriientos :.áproxi.mados totales con el
Ocular 10 x
16 mm (bajo poder, 10x)
100 x
8 mm (medio poder, 20x)
200 x
4 mm (alto poder, seco 43 x)
430 x
1 .8 mm _(aceite de inmersión, 90x)
9ó0 x
El objetivo de 8 mm (c con una distancia de trabajo de 1 .6 mm
se usa eomunmente con una celda de tonteo de plancton de 1 mm de prondidad .
7 .2 ..4 .2
microscopio esteroscópico.
Este microscopio consta esencialmente de dos microscopios completos unidos en un instrumento binocular para dar una visión estereoscópica y una imagen vertical . Este microscopio es indispensable para el -.
estudio y corneo de grandes plancters tales como microcrustáceos maduros . El equipo óptico del microscopio debe incluir pares oculares de -10 x a 15 x en combinación con objetivos de 1 x a 8 x.
Esta combinación de lentes provee ámbitos de amplificación de 10 x a 120 x . Un instrumento del tipo ZOOM de buena calidad con ampli ficaeiones comparables es igualmente útil.
87 :5
Microscopio compuesto invertido.
7 .2 .4 .3
Este microscopio se usa rutinariamente para comeos de plancton
en muchos laboratorios . Este instrumento es único en que los objetivos
están debajo de la platina . y la iluminación viene de arriba . Las muestras
se ponen directamente en una cámara cilíndrica de sedimentación que tiene un fondo de vidrio delgado y claro.
Existen cilindros de varias capacidades ; el tamaño apropiado depende de la densidad de organismos en la muestra . Después de un período aceptable de asentamiento (ver lo anterior) Las muestras se cuentan en
los cilindros de sedimentación.
La mayor ventaja del microscopio invertido es que por una simple
rotación del portaobjetos un especirnen puede examinarse (o contarse) directamente en cámaras de sedimentación a cualquier amplificación que se
desee . No se requiere ninguna preparación o manipulación . Una importtnte desventaja es que los organismos flotantes tales como algas verdetante
azules no se incluyen en el canteo.
7 .2 .4 .4,
Calibración de microscopio.
i equipo usual para la calibración es una rejilla Whipple (micró-
metro ocular, retícula o retículo) el cual s pone en un ocular del micros
copio, y un micrómetro con una escala exacta en el portaobjetos.
En la compra de microscopios para tonteo de plancton se debe ase
¿airar que el ocular aceptará el disco Whipple . (Figura 7 .2-IV) .
Figura . 7 .2 . -IV ; Rejilla Micrométrica Whipple.
EL disco Whipple tiene una rejilla graduada con exactitud, que ha si
do dividida en 100 cuadros . Uno de los cuadros cerca del centro está a su
vez subdividido en 25 cuadros más pequeños . Las dimensiones de afuera
de la rejilla son tales que con un objetivo de 10 x (16 mm) y un ocular de
10 x se delimita un área de aproximadamente 1 mm 2 ' en la platina del mi
giroscopio . Debido a que esta área puede diferir de cm microscopio a - otro, la rejilla Whlpple debe calibrarse cuidadosamente para cada micros
copio antes de usarse en el e.onteo de plancton .
Con el oca Lar y el irii.c róm tro do la platina paralelos y supu r, puc s
tos en parte, marcar la línea al final de la izquierda de la retiicula de Whipple con la marca del cero en la escala del micrómetro del portaobje
tos . (Figura 7 .2-V)
Se determina el ancho de la retícula de Whipple lo más cercano a
0 .01 mm de la escala del micrómetro del portaobjetos . El ancho de la imagen de la rejilla debe ser exactamente 1 mm (1 000 )J) el largo de los
cuadrados será de 1/10 mm (100p) por lado y cada uno de los cuadrados
más pequeños 1/50 mm (20)4.
Cuando , el microscopio se calibra a altas amplificaciones, la esca
la completa en el micrómetro de la platina no se ve y las mediciones debe
rán hacerse lo más cercanas a 0 .001 mm,
G on un ocular de 10 x, la amplificación con el lente del objetivo 10 x (dando una amplificación total de 100 x) no es adecuada para la enu rneración y examen de los plancters de 10» o menos, ya que éstos aparecerán como puntos .no identificables . Se usan objetivos con una aniplifi
cacián de por lo menos 20 x (8 mm) cuando se cuenta nanoplancton . Cuan
do se usa un objetivo de 20 x, cada pequeño cuadro en el campo del rnicró
metro de Whipple es aproximadamente 10 x 10p 6 1009}12 , Los objetivos
convencionales con aumentos mayores de 20 x no pueden usarse para exa
minar plancton en !a celda Sedgwick-Rafter debido a que su distuncia de
-
-
trabajo es menor de 1 mro y pueden romper el cubreobj ecos de la cámara.
f ,os . microscopios con el mecanismo "ZOOM" pueden dar el mismo numen
to con un objetivo 20 x corno con uno ] .0 ic, pero no darían la misma resolución . . Objetivos especiales coro distancia grande de trabajo proveen aumentos mayores que 20 x . El microscopio invertido, como se hizo notar
lllites, evita estos problemas .
'Cuadros peeue ñas ''
skbterbdo un % irzeavo
de los aJadras grandes 5 .2
Cuadrado de WhippEe --cama 9e ve o Íraves del
acular_ (campa de Whipple)
Lineas aparentes
de viabilidad sutiteredida
260 l' sobre lo eseub dei
nvo'prneiro de lo retina_
.
/
\
.
1#
IOO,q
P rcion brnplrficado de una imágen de la
de la platino
scara del mrorometro_4-
Figura 7 .2-V, calibración de la rejilla Whipple , como se observa con
ocular IOX y un objetivo 43X (aumento total de aproximadamente .40X )
-877-
7 .2 .5
Técnicas de. conteo.
7 .2 .5 .1 .
Unidades de conteo para fitoplancton.
El fitoplancton puede ser unicelular o pluricelular (colonial) . La variedad de configuraciones plantea un problema en cuanto a la enumeración de los, organismos . Por ejemplo, si tenemos una colonia de 4 células
de Scenedesmus ( Lámina 7 .E ) se reportará como una colonia 6 como
cuatro células individuales.
El listado siguiente es una propuesta para reportar los datos de
enumeración.
Método de
enumeración
Unidad de
conteo
Unidad de
reporte
Total de células contadas una célula
células/ml
Unidad natural de conteo un organismo
(conteo por grupu)
(cualquier organismo
unicelular o colonia na
.tural).
unidades /ml
Unidad de conteo del
u
nidades
área
4 00 p 2
/ml
Un conteo total de las células lleva mucho tiempo, especialmente
cuando las colonias consisten en miles de células individuales . l.,a unidad
natural o grupo es el sistema más usado y quizá nos da los datos más sil
nificativos . Cualquiera que sea el método escogido, debe ser identificado
en los resultados reportados.
7 . 2 .5 . 2
C"l Iiui
s de (»lateo.
La enumeración de pinneton puede hacerse mejor usando una celda
o cámara de conteo que limita el volumen y área para el cálculo de la den
sidad de población . Cuando se enumera el fitoplancton no se dében contar
las células muertas o diatomeas con corazas rotas.
Se cuentan separadamente las diatomeas pinadas y céntricas va- cías corno "diatomeas céntricas muertas", y "diatomeas pinadas vacías",
para convertir el conteo proporcional de especies de diatomeas eh conteos
por mililitro.
Cuañdo se cuenta con la rejilla Whipple, se establece una convención para contar los organismos que se encuentren en la línea del límite
exterior . . Por ejemplo, en el conteo de un cultivo (cuadro Whipple completo) se designan los límites superior de la izquierda como "lados no
contados ; y los límites inferior y de la derecha como "lacios contados" . Así cada plancter que toque un'l.ado contado" desde adentro o desde afuera se cuenta, mientras que cualquier plancter que toque un lado no corita
do no se cuenta Si están presentes números significativos de filamentos
u otras formas grandes que atraviesan dos o más limites de la rejilla,
contarlos separadamente a menor aumento e incluirlos en el contéo total.
En una franja de conteo, arriba y abajo de la rejilla están "conteo"
y "no conteo" respectivamente, y los plancters se cuentan conforme se mueven a través de la línea vertical del centro .
- 879 -
a) La celda de conteo Sedgwiek-Rafter es la que más comunhilente se
usa para el conteo de plancton, porque es de fácil manejo y provee de da
tos reproducibles y razonables cuando se usa con un microscopio calibrado, equipado con un ocular de medición tal como la rejilla de Whipple . La
celda es de aproximadamente 50 mm de largo por 20 mm de ancho y - 1 mm de profundidad . El área total del fondo es entonces aproximada- mente 1, 000 mm 2 y el volumen total es de 1, 000 mm 3 o sea 1 ml . El lar
go y profundidad de la celda debe comprobarse cuidadosamente con un mi
crórnetro antes de usarse.
La desventaja más grande asociada con esta celda es que no se pue
den usar objetivos de altas amplificaciones.
1) Llenado de la celda S-R . - Antes de llenar la celda con la muestra,
' se pone el cubreobjetós diagonalmente a través de la celda y se transfiere
la muestra con una pipeta gruesa (figura 7 .2-VI ) . El poner el cubreobjetos de esta manera ayudará a prevenir la formación de burbujas en las
esquinas de la celda . ' El cubreobjetos se deslizará suavemente y cubrirá
la . porción interior. de Ja celda S-R durante el llenado . No se debe sobrellenar la celda ya que ésto producirá una profundidad mayor de 1 mm y re
sultará un conteo erróneo . No se debe permitir que aparezcan espacios grandes de aíre causados por la evaporación en la cámara durante un examen largo . Para prevenir la formación de espacios de aire se pone una pequeña gota de agua destilada en la orilla del cubreobjetos . Antes de -
proceder con el conteo se deja reposar la celda S-11 por lo menos l minutos para permitir el asentamiento del plancton.
Se cuenta el plancton sobre el fondo de la celda S-R . Algo del fitoplancton y algunas algas verde-a . zules no pueden sedimentarse, pero en
c .mibio pueden elevarse a la parte de abajo del cubreobjetos . Cuando ésto pasa, se cuenta a estos organismos y se agrega al total de aquellos . - contados en el fondo de la celda,lo que ños da el número total de organismos en la muestra.
2) Contco en franja . - Una "franja" a lo largo de la celda constituye
un volumen que corresponde a
50 mm
de largo, 1
mm de
profundidad
y -
todo el ancho de la rejilla Whipple . Cuando se usan oculares 10 x y 20x
u objetivos más grandes y el ancho de la rejilla de Whipple se calibra pa
ra hacer 0.5 mm (500»), el volumen de una franja es 25 mm 3 cí 1/40 (2 . 5%) del volumen total de la celda.
Para hacer un conteo de franja se usa una amplificación de por lo
menos 200 x . Se calcula el No . total de "plancters" en la celda S-R rnul
tiplicando el conteo real de plancton en la franja por el número (factor de
enumeración) que representa la porción de la celda S- R eonttid .J.
Se cuentan de 2 a 4, franjas generalmente, dependiendo de la densi
dad de
los
plancters ; entre menos plancton,más número de franjas deben
contarse . Cuando se usa un ocular de 10 x y un objetivo de 20 x,el factor
de enumeración para el plancton contado a lo largo dedos franjas debe ser aproximadamente de 20, y para 4 franjas aproximadamente de 10, de
pendiendo de la calibración . Se obtiene el número de plancton de la celda
1-R de lo siguiente:
.No . / ml = O x 1, 000 mm 3
LxPxA x F
Donde :
O = No . de org . contados
L = Largo de cada franja (largo de la celda S-R)
P = Profunidad de la franja (prof . de la celda S-R)
A = Ancho de la franja (ancho de la imagen de la rejilla de
Whipple)
F = No . de franjas contadas
Se multiplica o divide el número de células por militítro por un factor de corrección para ajustarlo a la dilución o concentración de las muestras.
3) Conteo por campo . - En nuestras que contengan mucho plancton (10 ó más plancters por campo), se hacen conteos por campo en vez de conteos por franja . Se cuentan los plancters en 10 6 más campos escogidos al azar, consistiendo cada uno de éstos en una rejilla
Whipplc . L1
nG
mero de campos contados dependerá de la densidad y variedad de plancton
y de la exactitud estadística deseada . Se usa la fórmula siguiente para -
calcular los números por nlililítro de conteos por cal>lpo:
- No . /m1
Ox1,000mm'
Ax
xC
Donde :
O = Número'de organismos contados.
A = Area de un campo (área de la imagen de la rejilla Whipple)
P = Profundidad de un campo (profundidad de la celda S-R)
C = Número de campos contados
Se multiplica o se divide el número de células 'por mililitro,
por
el
factor de córrección para ajustarlo a la dilución o concentración de la muestra . '
b) Celda de nanoplancton Palmer-Maloney (P-M) . - Esta celda está diseñada específicamente para la enumeración de nanoplancton . Tiene una. cámara circular con un diámetro de 17 .9 mm, una profundidad de 0 .4 mm
y un volumen de 0 .1 ml . Se usa una amplificación de 450 x por la celda P-M . No se usa la celda P-M para exámenes de rutina a menos que la - muestra contenga una población densa (10 'ó más plancters por campo).
Se introduce la muestra con una pipeta en uno de los canales de - 2 x 5 mm en el lado de la cámara con el cubreobjetos puesto . Después de
un período de sedimentación de 10 minutos se examinan de 10 a 20 campos
Whipple, dependiendo de la densidad
y
variedad del plancton
y
de la exacti
tud estadística deseada . Las franjas se pueden contar en esta o cualquier
- 883 -
otra celda circular, midiendo el diámetro efectivo y contando dos franjas perpendiculares que crucen el centro . Se calcula el número de placc
ters por mililitro como sigue:
no, /mi a
x 1, 000 mm 3
AxP
Donde:
q T
Número de organismos contados
A = Area de un campo (imagen de la rejilla Whipple)
P - Profundidad de Un campo (profundidad de l
•
celda P" M .)
Número de campos contados . .
Se multiplica o se divide el número de células por mililitro, por el factor de corrección para ajustarlo a la dilución o concentración de la muestra.
e) Otras celdas de tonteo, - La cámara más accesible es el hernocitó
metro médico usado para la enumeración de las células de la sangre.
Esta tiene una cuadricula grabada en una placa de tonteo y se a }us
ta con un cubreobjetos de vidrio esmerilado.
La rejilla está dividida en milímetros cuadrados ; la cámara tiene
0 .1 mm de profundidad . Se introduce la muestra con una pipeta y se observa a un aumento de 450 x, contando todas las células que están dentro
de la rejilla . Una cámara similar es la Petroff-Hauser, diseñada para -
conteos bacteriales y que también puede usarse para enumeración de fitoplancton . Cada una de estas cámaras viene de la fábrica con una hoja de
instrucciones detalladas, conteniendo instrucciones para los cálculos y uso apropiado de la celda . La desventaja de esta celda de tonteo, es que
la muestra debe tener una muy alta densidad de plancton para obtener datos estadísticamente confiables.
d) Conteo en microscopio invertido.
Se prepara. una muestra para análisis llenando una cámara de sedimentación . Después del tiempo deseado de sedimentación, transfiera la cámara a la platina del microscopio . Cuente dos franjas perpendiculares
que crucen el centro del fondo y promedie los valores.
Los campos al azar también pueden examinarse hasta que se cuen
ten al menos 100 unidades de la especie dominante . Calcule el número de
plancters por mi de la siguiente manera:
Conteo en franja (No . /ml)
9x AT
L x A xFxV
Donde :
0 = No . de organismos contados
AT Arel' Total del fondo de la cámara de sedimentación, mm 2
L Largo dé una franja, mm
A Ancho de la franja (el ancho de la imagen de la rejilla -
-
Whipple), mm
F = NCImero de franjas contadas
Volumen de la muestra sedimentada, mi
Canteo por campo .(No . ml} =
O x AT
CxA x V
Donde:
O .= No, de organismos contados
AT= Area total del fondo de la cámara
A = Area de un campo (área de la imagen de una rejilla Whipple,
mm)
No . de campos contados
V Volumen de la muestra sedimentada, ml
7 .2 .5 . 3,
Método del contera ml iicr'ol .ransct to de La gota 1,ackcy.
El método de la gota f acke (microtransecto) es un método simple
para-obtener conteos de considerable precisión con muestras que contienen una densa población de plancton . Este es similar al canteo en franja
de la celda S -R.
Colocar, 0 .,1 ml en un portaobjetos cubrirlo con un cubreobjetos de 22 x 22 mm . Contar los organismos en tres o cuatro franjas a lo an-cho del cubrebj ,etos .
Calcule eL número dr. organismos por mililitro como sigue:
Ido . rnl
0 TA —
Ax Fx V
Donde :
TA Area del cubreobjetos, mm 2
A } Area de una franja, mm 2
No . de organismos contados
F =No . de franjas contadas
y = Volumen de . muestra bajo el cubreobjetos, ml
7 .2 .5 .4
Conteo por filtro de membrana.
Examinar las muestras concentradas en . un filtro de membrana y
montadas en aceite, corno se describió anteriormente, a un aumento de
200 - 400 x . Seleccionar el nivel de aumento y tamaño del campo del mi
croscopio (cuadrante) de tal forma que las especies más abtndantes aparen
can en por lo menos el 70, pero no más del 90% del campo del micros
copio (el 80% es óptimo) . Ajustar el tamaño del campo del microscopio . usando toda la . rejilla Whipple o parte de ella . Examinar 30 campos , al azar y registrar el número de campos en los que se encontraron las mis
mas especies . Determinar el pare lento de aparición (F %) y de la densi
dad por campo (DEC). de la tabla 7 .2-1 . En este método se ignora cual_
887
marca n el filtro che n eml :Iflnn . Reportar los resultados como nr
ganlsnios por n}tiitítro, calculados como sigue:
No . n-il s -D x C
V x FD
Donde :
l7 = Densidad (organismos/campo) de la tabla 7 .2. 0 = Numero de campos por filtro
V Mililitros filtrados
FI.) -= .l zactor de dilución (0,96 puiru formal al 4%)
Fin; .7 . 2-V1 . Celda de Canteo edgwick -Rafter .
888
rabia 7 .2- 1 . - 'Tabla de ;conversión para la ' t ni n dei i`iItri
3'i
na . (Basada en 30 campos anotados)
3 .3
6 .7
10 .0
13 .3
16 .7
20.0
23 .3
26 .7
30 .0
33 .3
36 .7
40 .0
43 .3
46 .7
50 .0
53 .3
56 .7
60 .0
63 .3
66 .7
70.0
73 .3
76 .7
80 .0
83 .3
86 .7
90 .0
93,3
96.7
100 .0
0 .03
0 .07
0 .10
0 .14
0.18
0 .22
0 .26
0 .31.
0 .35
0.40
0 .45
0 .51
0.57
0 .63
0 .69
0 .76
0 .83
0 .91.
1 .00
1 .10
1 .20
1 .32
1 .47
1 .61
1 .79
2 .02
2 .30
2 .71
3 .42
Donde:
F número total de especies aparecidas x 100
número total de campos examinados
111br -
-F2i9-
= Minero de organismos por campo
7 .2 .5 .5.
Contador de partículas.
Varios tipos de contadores de partículas pueden usarse efectiva mente para contar cultivos puros, pero no son recomendables para enume
rar comunidades naturales : de plancton atrapadas en muestras de agua su
perficial porque no discriminan entre el plancton y las partículas de limo
o detritos orgánicos . Estos sistemas pueden detectar partículas sólo en un ámbá o específico de talla . Para acomodar el extenso ámbito de tallas
encontradas en las comunidades de plancton los contadores deben equiparse con varios orificios.
: .5 .
Canteo proporcional de especies de diatomeas.
Se examinan las muestras de diatomeas preparadas como se indi -
có anteriormente bajo aceite de irnersián a un aumento de por lo menoá 900 x . Examinar las franjas laterales dula rejilla Whipple hasta que se
cuentea. por lo menos 250 células . Se determina el porcentaje de abundan
cía de{cespecie de los grupos contados y se calculan los comeos por -mililitro de cada especie, multiplicando el porciento de abundancia por el
conteo total de diatomeas vivas y muertas obtenido de las cámaras de - conteO.` de plancton.
7..2 .5 .7
Zoo p lancton
Se enumera el plancton pequeño (nano) en una cámara de conteo -
durante el conteo de rutina del fitoplanctori : Se reportan como organis anos por mililitro . Contar el zooplancton más grande (de red), tales como
los cladóceros y copépodos maduros y reportarlos como organismos por metro cúbico . Para formas más grandes, pisar una cámara de conteo de SO x 50 mrn y 2 mm de profundidad . La cámara puede usarse con o sin ta
pa ; una cámara abierta es difícil de manipular debido a que el más ligero
movimiento alterará el conteo . Una ventaja de la cámara abierta, sin embargo, es la accesibilidad del plancton expuesto . Cuando se usa la cá mara de conteo más grande, se ajusta el volumen del concentrado a 8 ml
y se transfiere a la cámara Contar e identificar rottferos y nauplio en 10
franjas .á un aumento de 100 x, usando microscopio compuesto equipado
con una rejilla• .Whipple.
Se cuentan los organismos grandes tales como los microcrustáceos
adultos examinando la cámara entera bajo un microscopio binocular de di-se identifican or
sección de 20 a 40 x de aumento . Cuando sea necesario,
r
ganismos mayores después de su disección y examen subsecuente en el mi
croscopio compuesto Calcular el número de organismos por metros cúbi
cos .
No . m =-~
x
Donde :
' 0 = Número de organismos' contados
' 1 Lumen de la muestra concentrada, mí
Y" Vulurnen contado, ml
% Volumen de la muestra tomada al azar, m 3
7 .2 .6
' Clorofila.
Los pigmentos característicos de las algas son las clorofilas, las
xantofilas y los carotenos . Las tres clorofilas comunmente encontradas
en algas planctónicas son las clorofilas a, b, y c . La clorofila "a" constituye aproximadamente del 1 al 2% del peso seco del material orgánico en todas las algas planctónicas y es, por lo tanto, el indicador preferido
para estimaciones de la biomasa de las algas . Se dispone de dos métodos
para. la determ nac1ón de clorofila "a" en el fitoplancton, el espectrofotomtrco y el fluorométrico . El método fluorométrico es más sensible, requiere menos volumen de muestra y ha sido adaptado para mediciones
en vivo . Existe un método especifico para clorofila "c", más sensible que el método tricromático, descrito más adelante, especialmente para muestras de bajo contenido de pigmentos, pero no se incluye aquí.
La feofitina "a" es un producto de degradación común die 1 1 clorofi
la "a" que puede interferir con las determinaciones espectrofotométricas
o fluromótricas de la clorofila "a", debido a que absorbe luz y despide ra
yos de luz fluorescente en la misma región del espectro como ciorofi -
la " a " y, si está presente, puede causar errores en los valores de ésta, Por lo tanto, cuando se hagan determinaciones de clorofila "a", se debe -.
medir la concentración de feofitin'a "a" en
-muestra . La relación de clo
rofila "a" a feo f7itlná sirve•tá üién coito un den indicador -de las condicio
nes fisiológicas del fit l ton`. Otro bue indicador de la calidad del a-
gua es la relación de `biomasa a clorofila "a" (indice autótrofo) : En aguas
no contaminadas la población de plancton está compuesta en su mayoría -
por algas clorofflicas autótrofas (productores de alimento) . Al enriquecer
se las aguas orgánicamente, la proporción de organismos no clorofflieos y
heterótz fos. consum ores), tales corno las bacterias filamentosas y protozoariaje 1 aumenta . . El indice autótrofo es un medio de relacionar tos can .'
Dios en
lidad
l`a
del~
composición de las especies de plancton con los cambios en la ca
agua . El dite autótrofo (LA) se calcula corno:
Biomasa (peso seco de ' la materia orgánica), . mg m3
clorofila "a" , mg/ rn 3
Los valores normales del fA varían de 50 a 200 . . Valores más
grandes indican una tbrcalidad del agua . '
7 .-2 .6 .1
Determinación de clorofila : a, b y-c p r esp ctrofotometría (rné
Codo tricrom tico)
Los pigmentos se extraen del plancton concentrado, con acetona acuosa
sa y la densidad óptica se determina con un espectrofotómetro . Cuando no es
posible una cxtrrL : ción inmediata de los pigmentos, lag lilut . &l[ra ;
pur, -
den almacenar, congel1ndolas por 30 días y manteniéndolas en l : nl 9 •uri
dad . La facilidad con la cual la clorofila se extrae de las células varia
considerablemente con el tipo de alga . Para efectuar la extracción cumple
ta de los pigmentos, normalmente es necesario romper las células mecani
camente con un triturador de tejidos.
a) Equipo y reactivos1) Espectrofot metro, preferiblemente un instrumento de banda es
trecha, (0 .5 a 2 nm).
Los instrumentos de banda ancha se usan cómunmente pero son menos . exactos . Un espectrofotómetro con una banda de 20 nm de ancho, estimará, cuando mucho, el
del total de la clorofila "a" .
2) Celdas con-1, 4 y 10 cm de paso de luz.
3) Centrífuga clínica.
4) Triturador de tejidos.
5) Tubos de centrifuga de 15 ml, graduados, con tapón de rosca.
6) Equipo de filtración, filtros, membranas (0 .45p de porosidad y
47 mm de diámetro) o fibra de vidrio y bomba de vacío.
7) Suspensión de, carbonato de magnesio : añada 1 .0 g de carbonato de magnesio finamente pulverizado a 100 ml de agua destilada .
8) Solución acuosa de acetona : mezclar 90 partes de acetona -(grado reactivo, BP 56 ) con 10 partes de agua (UN).
- b) Procedimiento.
1) Concentrar la muestra por , centrifugación o filtración (filtro de membrana o de fibra de vidrio) . Agregar 0 .2 ml de suspensión de car
Nonato de magnesio antes de centrifugar o durante la fase final de filtrado. Cuando la extracción se demora se almacenan las muestras concen tradas y congeladas en un desecador en la oscuridad,
2) Colocar la muestra en un triturador de tejido, y cubrirla con 2 6 3 ml de solución acuosa de acetona.
3) Macerar la muestra con el triturador de tejidos ;usar el tritura
dor vidrio/teflón para un filtro de fibra de vidrio y un triturador vidrio/ Vi
cirio para un filtro de membrana.
. 4) Transferir la muestra a un tubo de centrifuga con talión de ros
ca y llevar el volumen a 5 ml con solución acuosa de acetona . Usar poco
solvente y . evitar la dilución excesiva de los pigmentos .Remojar las rnu s
tras por una noche a 4' C en la oscuridad.
5) Clarificar el extracto centrifugando en tubos cerrados por 20 minutos a 500 G . Decantar el'e tiacto clarificado a un tubo de centrifuga
con tapón de rosca, limpio, de 15 m1 y medir el volumen total del extrae
to .
6) Transferir el extracto clan a una celda de 1 cm y determinar
la densi d óptica (DO) a 750, 663, 645 y 630 nrn . Si la densidad óptica a. 663 es menor que 0 .2, utilice celdas más 'grandes.
e) Cálculos .
Usar las lecturas de densidad óp ca a 6 3, 645 y 630 nm para la de
terminación de clorofila a, b y e, respectivamente . La lectura de densidad Óptica a 7,50 nm sirve corno una corrección para turbiedad . Restar es
ta lectura de cada valor de densidad óptica del pigmento de las otras longitudes de onda antes de que se usen en las ecuaciones . La densidad óptica del extracto a 750 nm es muy sensible a cambios en las proporciones acero
na-agua ; de agur que es esencial conservar estrictamente las proporciones
de la fórmula para extracción de pigmentos, de 90 partes de acetona por
10 partes de agua (V /V) . El uso de la lectura a 750 nrn puede evitarse si
la solución pigmentada se clarifica por centrifugación a 500 G por 20 minutos y el paso de luz se limita a 1 cm.
1) Se calculan las concentraciones de las clorofilas sustituyendo la
densidad óptica (corregida) en las siguientes ecuaciones:
a
11 .64 D663 - 2 .16D645 + 0 10 D630
w
Oh, = 20.97 D645
3 .94 D663 -3 .66 D630
4 .22 D 30 - 14 .81 D645-5 .53 D663
896
. Donde :
Ca, Cb y Cc = Concentración de clorofila a, b y c, respectivamente, en el extracto, mg/1
D 63, D645 Y D630 = Densidades ópticas (con un cm de paso de
luz) a las respectivas longitudes de onda.
2) Cuando la cúncentración . de pigmento en el extracto ha sido Meter
minada, se calcula la cantidad de pigmento por unidad de volumen de mues
tra coma sigue:
clorofila
7 .2 . 6 . 2
'TR'"
mvm3 = C a x volumen del extracta)
volumen de la muestra, m 3'
Método fluorométrico para clorofila ' Ta"
Este método es más sensible que el método espectrofotométrico ; requiere una muestra más pequeña y no requiere de la resolución de la ion
gitud de onda que necesita el espectrofotómetro . La sensibilidad óptima para mediciones de clorofila "t a" in vitro se obtiene a una longitud de onda
de 430 nrxi y una emisión de onda de 663 nm . Se dispone de un método para rr ediciones,contrnuas de clorofila "a ," "in vivo' T pero es menos eficiente
que el método in vitro explicado aquí, ya que produce alrededor de una dé
cima de fluorescencia por unidad de peso, corno la misma cantidad en so lución .
La feofitina "a" puede también determinarse fluororn tricameiite .
a) Equipo . y reactivos.
1) Fluorórnetro ., . modelo Turnar III . o equivalente, equipado con una lámpara azul de alta intensidad F4T . 5, tubo fotomultiplicador R-136 (sensible al rojo) orificios corredizos de lx, 3x, 10x y 30x, filtros para remisión (cs-2-64) Y exitaclón (es-5-60) de luz.
2) Equipo y reactivos corno se menciona , anteriormente, para la de
terminación de clorofila . por espectrofotometría.
b) Procedimiento.
1) Calibre el fluorómetro coi una. solución de clorofila de coticen tración conocida, como se indica:
- Prepare el extracto de clorofila y analice espectrofotornetri amente .
.
Prepare diluciones seriadas del extracto para proveerse de - concentraciones de aprOxirnadamente 0 .002, 0 .006, 0 .020 y O . 060'mg l de clorofila .''' a"
Haga las lecturas para cada solucina cada nivel de sensibilidad (orificios corredizos).: 1.x 1 . x, . 10x 'y 30x .
Usando los valores obtenidos arriba,derive los factores de cali
oración para convertir las . leas #luorom tric.s en - cada ni r
l :de sensibilldád aconcei trá iones cae clorolla t`a como si
Donde :
Factor de calibración para el nivel . de sensibilidad S.
1.:el,nivel de sensibilidad.
Lectura
oncentración de clorofila "a" determinada espectro
fotomtricarnente, mg/l.
2) Medir la fluorescencia de las muestras a un nivel de sensibilidad que darla una 1etura a media escala . Convertir las lecturas de fluo
rescencia a concentraciones de clorofila "a", multiplicando las lecturas por el factor de calibración apropiado.
7 .2 .6 .3 ' Determinación espectrofotométrica de feofitina "a"
La cantidad de feofitina "a t" se determina leyendo la densidad ópti ca del extracto antes y después de la acidificación . La adición de ácido
a una solución de clorofila elimina el ion magnesio de la molécula de clorofila "a" y la conviene en feofitina "a".
Corno la feofitina tiene una absorción específica más baja, la acidi
ficación de la clorofila causa una disminución en la densidad óptica del ex
tracto a 663 nm, la cual es generalmente usada para determinaciones d clorofila "a" . La acidificación de una solución de clorifila "a' t pura origi
na una reducción de 407 en la densidad óptica a 663 nrn, produciendo una
relación de DO ( 63b/663a) de , 1 .70 . Las muestras de campo con esta relación se considera . que contienen muy poca o casi nada de feofitina "a"
y están en condiciones fisiológicas excelentes, Las soluciones de feofitina pura con la acidificación no muestran reducción en la DO 663 y tienen
una relación (663b/66 a) de 1 .0 . Así, las mezclas de clorofila "a' t y feofi
tina "a" tienen una relación de 0O 663 fluctuante entre 1 .0 y 1 .7 .
- 89 9 -
a),
1u pi a
Además del equipo y reactivos usados para la determinación ospec
trofoton étric a de clorofila (descrito anteriormente), proveerse de HC L -IN.
b) Procedimiento.
1) Extraer el pigmento con 90% de acetona { % ) y clarificar por centrifugación como se describió antes.
2) Leer la ' DO a 663 y 750'nm antes y después de adicionar 0 .02
ml de H 1IN por ml de extracto.
de 750 3)
rim
del
de
l valor
de . la lectura a 663 n en.
R. estar
cada par .
4) Usar las lecturas corregidas a 63 n para calcular la reta- ción Tal 63b r.
6ó3a y la concentración de clorofila y feofOl :.na en la - -
muestra.
c) Cálculos : calcule la clorofila. 'fa" ( C) y feo?'i .tina "a" (F) pez metro
cubico, como sigue:
1)
, tn
26 .73 (63t-663x) x 1
+
2) F, mg m 3 26 . 3 Í1 .7(663a)-66313 x
v1
Donde:
663 b y 663 a = Densidad óptica del 901 de extracto de acetona antes y des
pués de la acidificación, respectiva :rentgcuando se usa -
una trayectoria de luz de 1 .em .
1 ,
Volumen de extracto.
Volumen de la muestra en
7 .2 . 6.
J.
Determinación fluoroni trica de feofitiva "a".
Para determinar fluorom tricarente la concentración de feofitina
"a" se requiere de la medición de la fluorescencia de extractos de acetona
antes y después de la acidificación . La acidificación-de los extractos de
acetona de clorofila "a" y la resultante conversión de clorofila "a" a feofi
tina "a",.- origina una reducción en la fluorescencia, la cual puede usarse -para determinar la concentración de feofi,tina "a" en el extracto,
a) Equipo y reactives, Además del equipo y reactivos para la determinación fluerornétrica de clorofila "a" proveerse de H C1 IN y una solución de clorofila "a" pura* o un extracto de clorofila de plancton con una
relación ( 663b D0 663a) de 1 .7 antes y -después de la acidificación,
b) Procedimiento : calibre el fluorórnetro como se describe antes . Determine la . fluorescencia del extracto a cada nivel de sensibilidad antes
y después de la acidificación, Calcule los factores de calibración (Fs) y
la relación de fluorescencia antes y después de la acidificación, dividien
*Clorofila "a" purificada de Sigma Chemical Company, ST Louis, Io . o
su equivalente .
- 901 -
do la lectura de fluorescencia antes de la acidificación entre la lectura obtenida después de la acidificación.
e) Cálculos : determine la clorofila "a" y la feofitina "a" en extractos
de muestras de plancton, usando las siguientes ecuaciones . :
Clorofila "a'", mg/m3 = Fs
Feofitina "a", mg/rn
F
r
r-1
(lob - Ra) .
rRa - Rb)
s
r-1
Donde :
Factor de conversión para niveles de sensibilidad "S"
Rb
Fluorescencia del extracto antes de la acidificación.
a = Fluorescencia del extracto después de la acidificación.
r = Rb Ra .
7 .2 .7
Determinación de Biomasa (cultivo Estable).
El cultivo estable de plancton puede expresarse corno número de -
organismos por unidad de volumen . Sin. embargo, corno las poblaciones
dplancton varían mucho en tamaño, los números solos no nos dan una imagen adecuada de la población ni de la diversidad y estructura del ecosistema . Los métodos disponibles para obtener una información más completa de la biomasa incluyen la determinación de carbono total, nitró
geno, oxigeno, hidrógeno, 11pidos, carbohidratos, fósforos, sílice (disto
- 91)2
mea), quitina (zooplancton) y clorofila <algas) . Los únicos métodos prácticos pira la evaluación de biomasa del zoáplancton son las determinaciones de volumen y peso seca . Recientemente, los contenidos de ATP - (trifosfato de adenosina) y DNA (ácido desoxiribonucléico) del plancton fueron evaluados corno una estimación de biomasa . Las estimaciones de
biomasa basadas en el ATP parecen estar completamente de acuerdo con
las estimaciones basadas en mediciones tales como clorofila "a" y vulu- aten celular . Sin embargo, la determinación de DNA oto se recomienda co
neo un indicador exacto de biomasa debido a las grandes cantidades de - DNA dutrEtico en la superficie del agua, lo cual puede ocasionar errores
en las estimaciones de biomasa.
7 .2 .7 .1
Clorofila "a".
La clorofila " a"' es un indicador de la biomasa de las algas . Asumiendo que la clorofila "a" constituye un promedio del 1 . 5%del peso seco
de la materia orgánica de las algas, se puede estimar la biomasa del alga
multiplicando el contenido de clorofila "a" por un factor de 67.
7.. 2 . 7 . 2
Riovolumen (volumen celular).
Los datos de plancton derivados de bases de volumen por volurren
son a menudo más útiles que los datos dados corno número por ml . Deter
minar el volumen de una célula usando la configuración geométrica más -
simple que mejor ° vaya' de . acuerdo con la forma de la célula que se está
midiendo (esfera, cono, , cilindro, etc .) El tamaño de las células de un organismo puede diferir grandemente en aguas distintas o en las mis -mas aguas en diferentes épocas del año ; poi* esto es necesario promediar
las mediciones de 20 individuos de cada especie 'por cada perlodo de 'nuca
treo . Se calcula el biovotum n total de cualquier especie multiplicando el
volumen promedio de la célula en'-'micras cúbicas ( tu ) por el número
por mililitros.
Calcular el volumen húmedo total de las algas coma
VP
(PI i x
)
Donde:
VP
PNi
Volumen total denlas célula de plancton, mm 3 l
Número de organismos de su especie/l
Sk i = Promedio del volumen de células de su especie.
7 .2 .7,3
Area de superficie de la célula.
estimación . lélt ,e
:la úpe fr,cl d6 La . .c lula es de valor
al analizar las interacciones `entr la célula y el agua que la rodea.
calcula l promedio del área de superficie en micras cuadradas y se multiplica por el número por mililitros de las especies que se estén con
7 .2 .7 .4
Mét%ados gravimétricos.
La biomasa de una comunidad de plancton puede estimarse por determinaciones gravim tricas, aunque el limo y los detritos orgánicos in terfieren . Determinar l peso seco poniendo 100 mg de la muestra concentrada húmeda en un crisol de porcelana tarado ysecarla a 105°C por
24 horas . Obtener el peso de cenizas por ignición de la muestra a - 500" C por una hora . Enfriar, remojar la ceniza con agua destilada y
llevarla a un peso constante a 105 ° C . La ceniza se remoja para resta irlcccr el agua. de hidratación de la arcilla y otros minerales en la muestra; esta debe ascender, cuando mucho, ul 10% del peso perdido durante
la incineración . El peso de ceniza libre se prefiere aL peso seco cuando
se Nacen comparaciones que involucran varias consideraciones . El con
tenido de ceniza puede constituir el 50% o más de peso seco en el. fitoplancton que tiene estructuras inorgánicas, tales como las diatomeas . Un otras formas el contenido de ceniza es sólo alrededor del
del -
E ic s() seco,
7 .2 .7 .5
AAdenosin trifusf4ito ( 1 P).
Recientemente se han desarrollado métodos para medición de KIdenosía trifosfato (ATP) en plancton dando el único medio para determinar la biomasa de plancton viable . El ATP aparece en todas las plan
ta s y animales, pero sólo en las células vivas; éste no está asociado con partículas de material no vivo . La relación de: ATP a biomasa varía
un poco cic cspecie a especie, pero parece ser lo suficientemente consmn
te
pLIt
permitir estiIat :1Clonc,3 confiables i.k las mediciones ~Ic A I'!'
1. 1 -
método cs simple y relativamente barato y la instrutIientacic n es durable
y de funcionamiento seguro . El método tiene también muchas aplicaciones potenciales en arrastre y trabajos de bioensayo, especialmente en
estudios de mortandad de plancton.
a) Equipo y reactivos.
1) Cristalería : frascospyrex limpios, •. estériles y secos, vasos
y pipetas.
2), Filtros: filtros de membrana de 47 mm y 0 .45 ja de porosidad.
3) Equipo de filtración,.
4) Congelador
0° C)
5) Baño de agua caliente.
6) Instrumentos de detección
diseñados específicamente
para me-
dir ATE'
7)
Microjeringas : 10, 25, 50, 100 y 250)11.
8) Probetas y viales.
9) Solución amortiguadora Tris (0 .02 M, pH 7-7,5). Disolver 7 .5 g
de trlshidroximetilaminornetano en 3, 000 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7 .75 con HC1 al 20%, y meter al autoclave porciones de 150 m1 a
115° C por 20 minutos,
* Dupont, l3eckman, JRB, etc .
10) Preparación de enzima luciferina-lucí#eraz .1 : rehidratur los extractos liofilizados congelados (-200 C) de "luces" de 'luciérnagas con amortiguador, Tris corno indica el proveedor ; dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 ó 3 horas ; centrifugue a 300 0 por 1 minuto y decan
te el sobrenadante a un Cubo de ensaye limpio y seco ; déjelo a temperatura ambiente 1 hora.
11) Patrón de ATP purificado para calibración del instrumento de de
tecclón : Disolver 12 . 3 mg de ATP disodio en 1 1 de agua destilada y diluir
1 .0 ml a 100 mi con amortiguador Tris (0,2 ml = 20 ng de ATP).
b) Procedimiento : para determinar el factor de calibración (F), prepa
re una serie de diluciones del patrón de ATP ; registrar la emisión de luz -
(ver sección análisis de muestra) de varías porciones de cada concentración del patrón . Corregir la medida del área de los patrones restando la
lectura de pico o la media del área de varios blancos, usando O . 2 ml de
Tris . Calcule el factor de calibración F s corno:
F
Donde:
3
SA
F s = Factor de calibración a sensibilidad "s"
SA Lectura de pico o media del área bajo el patrón de ATE curva corregida para blanco.
C = Concentración de ATP en la solución'patrón, mg 1.
+ Dupont, Sigma Chennical, o equivalente .
Tornar de 1 a 2 1 de muestra en un rnue strea-dor estéril . Pasar la
muestra a través de una red de 250a para remover el zooplancton grande
y extraer el-ATY inmediatamente . Extraer al menos tres réplicas de cada muestra.
Pasar la muestra por un' filtro de 47 mm y 0 .4 de porosidad I-ipllcando un vacío de 0 .3 atm (es importante quitar la succión tintes de -.
que la Última película de agua pase a través del fi> .tro) . Colmar rápida-mente el filtro en un vaso pequeño . Inmediatamente cubrir el filtro con 3 ml de Tris hirviendo, usando una pipeta . automática . Poner el vaso en baño marra por 5 minutos y transferir el extracto a un tubo de ensayo calibrado, seco y limpio, con una pipeta Pasteur.
Enjuagar el filtro y el vaso con 2 ml d Tris hirviendo ; combinar
los extractos, anotando el volumen y LIev ndolo a 5 ml con Tris . cubrir los
tubos c.on parafilm . Si las muestras no van a analizarse inmediatamente,
congelar a -25'C . Los extractos pueden almacenarse por muchos meses
en un congelador.
El procedimiento analítico depende del equipo de detección utiliza
do . Si se usa un contador de centelleo, añadir O . 2 ml de la preparación
de enzima a un . vial de vidrio . Cuantificar la emisión de luz de la preparación de enzima(blanco) por 2 ó 3 minutos hasta que la sensibilidad se -.
estabilice cerca de la que se ha anticipado para la muestra . Agregar -O, 2 ml del extracto de la muestra al vial, anote el tiempo y agite el con
908 -
contenido del vial . Empezar anotando la emisión de luz 10 seg después de haber combinado el extracto de ATP y la preparación de enzima, - - anotar la emisión por 2 ó 3 minutos, usando el mismo período de tiempo
para todas las muestras . Determine el promedio de las áreas bajo las curvas obtenidas de la muestra . y corrija restando el promedio de las - áreas bajo las curvas obtenidas de los blancos (los blancos se preparan de acuerdo a Strickland y Parsons).
c) Cálculos.
La concentración de ATP en una muestra se calcula:
ATP ng/l AC x VE x F s
V
Donde:
AC, = Promedio del área corregida bajo las curvas del extracto.
l F~
VoLumen del extracto, ml
V = Volumen de muestra, litro
F
Factor de calibración.
s
El total de biomasa de plancton vivo está dado como
S rng 1
( 4y {l ,
0)
Donde :
BID
=
•
Biomasa de plancton como peso seco de r,atezla orgánica,
* Se asume que el contenido de ATP es de
seco de materia orgánica .
2.
4 pg de ATP/rng de peso -
Mediciones del grado rnetab6lieo.
7. .8
Deben considerarse la condición fisiológica de una comuniad acuá
tica y el espectro de las interacciones liológicas ;en estudios prelimina
res, las principales consideraciones fueron el número, composición de las
especies y biomasa . El reconocimiento de las limitaciones llevaron a realizar .mediciones de las velocidades de los procesos metabólicos tales
corno fotos xtesis (productividad), fijación de nitrógeno, respiración y - transporte de electrones . Estos nos proveen de una mejor comprensión de la compleja naturaleza de un ecosistema acuático.
7 .2 .8 . 1
Fijación de nitrógeno.
La habi i, ad de un organismo para fijar nitrógeno juega un papel
importante en . la dinámica de poblaciones . Los dos métodos mes recientes y confiables para la estimación d las tasas de fijación del nitrógeno
(en el laboratorio) son el método de trazadores de isótopos de N 15 y el método de reducción del acetileno . Debido a que la tasa de fijación de nitrógeno varía mucho con los diferentes tipos de organismos y con la -•
conoentraión de N combinado en el . agua, no es posible usar las tasas -
de fijación del N para estimar la biomasa del nitrógeno fijado por los or
ganlarnos en aguas superficiales . Sin embargo, el método de reducción
de acetileno es útil para medir las acumulaciones de N en ensayos de algas.
7 .2 .8 .2
Productividad (Método de oxígeno).
La productividad se define como la velocidad a la cual el carbono
inorgánico es convertido a su forma orgánica . Las plantas con clorofila
(fitoplancton, perifiton y macrofiton) sirven como los productores primaros en la cadena acuática de alimentación . La fotosíntesis da como resultado la formación de una gran cantidad de compuestos orgánicos, des-'
prendimiento de 0, + la absorción de dióxido de carbono en las aguas
circundantes.
La productividad primaria puede determinarse midiendo los cambios en las concentraciones de oxígeno y CO 2 en el agua . En aguas pobres en sustancias amortiguadoras, el pH puede ser una propiedad sensi
ble para detectar variaciones en el sistema . Corno el CO 2 es removido de los sistemas acuáticos durante la fotosíntesis, el pH se eleva . Este cambio puede utilizarse para estimar la fotosíntesis y la respiración . El
agua de mar y muchas de las aguas dulces contienen demasiadas sustancias amortiguadoras para hacer esto útil, pero [la sido aplicado exitosamente para estudios de productividad en algunos Lagos.
Dos métodos bien establecidos de medición del grado de captación
de carbono y fotosíntesis neta in sita son (a) el método
(la rgenn de -
Gaa-rder y Gran y (h) el método de carbone 14 de Steern n-N1elsan , 1`,n am
'los métodos, las botellas claras y oscuras son llenadas con muestras de
agua y- suspendidas a una profundidad a intervalos regulares por un período de incubación de varias horas.
Las reacciones básicas en la fotosíntesis de algas implican la captación de carbón inorgánico y la liberación de oxigeno resumidos por la ecuación :
.0 -f1 O-- CH 0f 0
2
Las principales ventajas del método de oxígeno son : que provee
una elirnación bruta y neta de la productividad y respiración, y que los análisis pueden realizarse con equipo barato de laboratorio y reactivos comunes . La concentración de oxígeno disuelto se determina al principio
y al final del período de incubación . La productividad se calcula suponien
do que un átomo de carbono es asimilado por cada molécula de oxígeno li
becada.
a) Equipo.
1)
Botellas para DBO, numeradas, de 300 mi, claras,de vidrio
pyre.x o borosilicato,con tapón de vidrio esmerilado y boca acampanada, para incubación de la muestra . Lavar las botellas con ácido y enjuagar con agua destilada y, sólo antes de usarse, enjuagar con el agua que se -
912
esté analizando . No Usar detergentes que contengan fósforo.
Si las botellas oscuras no están disponibles ci>inercialrnente, ardí
car una capa de pintura negra y envolverlas con cinta negra a prueba de agua . Como otra precaución se puede envolver la botella entera en papel
aluminio o ponerla en un recipiente en el que no penetre la luz durante la
incubación .
2)
Una finca de soporte o rejilla que no oscurezca las bote-
lías claras suspendidas para la prueba.
3)
Muestreador Van Doras de Lucita o Uscolita opaca no me-
tálica, o su equivalente, de 3 a 5 litros de capacidad.
4)
Equipo y reactivos de laboratorio para determinaciones
de oxígeno disuelto.
5)
Pirelion tro.
6)
Fotómetro submarino.
h) Procedimiento.
1)
Obtener un perfil de la entrada de radiación solar para
un fotoperíodo con un pireliómetro.
2)
Determinar la profundidad de la zona euf6tica (la región
que recibe el 1% o más de la iluminación superficial) con un fotómetro submarino . Seleccionar los intervalos de profundidad para colocar las botellas . La curva de profundidad de la fotosíntesis se aproxima ponien
do las macaca s intervalos ,ig+u les cié} urna décima de la profundidad de
la zona euf6tica . La productividad en aguas someras puede e tinsi i'sc adecuadamente con menos intervalos de profundidad.
Introducir las muestras . tontadas de cada profundidad en
do botellas, una clara y otra oscura . Insertar el tubo de transferencia
del muestreador al fondo de la botella de la muestra y llenar las botellas
de tal forma que tres volúmenes de agua sean desalojados . Remover el tubo lentamente y cerrar la botella . El agua usada. para llenar una bote I* (una clara y otras oscura y una botella testigo) debe provenir de la mis
ma muestra tomada al azar.
4)
Fijar inmediatamente las muestras tomadas para la deter
rninación de oxígeno disuelto inicial, con sulfato manganóso, álcali-iodu ro y ácido sulfúrico, o analizarlo con otra . prueba para oxígeno,
Los análisis pueden demorarse varias horas si es necesa
rio, siempre y cuando las muestras estén fijadas o refrigeradas y almace
nadas en la obscuridad.
5)
Suspender las 2 botellas, clara y 'obscura, a la profundi -
dad a la cual las muestras fueron tornadas e . incubar por lo menos 2 horas,.
pero o,más del que las burbujas del oxígeno toman para formarse en las
botellas claras o disminuir en las botellas obscuras.
6)
Al final del periodo de exposición, fijar inmediatamente -
- .14-
c l oxígeno de las muestras como, se describe anteriormente v determinar
el oxígeno disuelto.
e) Cálculos,
El incremento en la concentración de oxígéno en la botella clara durante la incubación es una medida de la producción neta, la cual, debido al uso concurrente de oxígeno en la respiración es un poco menor que
la producción total (bruta) . La pérdida de oxígeno en la botella obscura es usada como una estimación de la respiración.
Así:
Fotosíntesis neta = 0D de la botella clara - 0D inicial
lespiración
= 0D inicial - 00 de la botella obscura.
Fotosíntesis bruta = CAD de la botella clara - OD de la botella
obscura.
Promedio de los resultados de los duplicados.
1)
Calcular la productividad neta o bruta para cada profun-
didad de incubación y graficar:
mg de carbón fijado/m 3 mg de oxígeno liberado/1 x 12/32 x, 1 000.
El factor 12/32 se usa para convertir oxígeno a carbón ; una mol de 02 (32 g) es liberada por cada mol de carbono (12 g) fijada.
2)
ducción
La productividad está definida como el grado de prose reporta gencrain]eatc en gr :tinos {le carbón fijado i t)r -
-915. -
m 2 por día'. Determinar la productividad de una columna vertical de
agua de 1m 2 graficando el valor de la 'productividad pava cado profun
didad é integrando gráficamente el área bajo la curva.
3) Usando el perfil de la radiación solar y el grado foto
sintético durante el período de incubación, ajustar los datos para representar la productividad de fitoplancton para el fotoperfodo comple to . Como los grados . fotosintéticos varían mucho durante el ciclo dia
rio, la conversión de los datos obtenidos de otros períodos de exposición que no sean los descritos podría ser difícil o completamente imposible.
7 .2 .8 .3
Productividad ( Método de carbón 14).
Una solución de carbonato radioactivo ( 14 CO3) se añade a una
botella clara y una obscura que han sido llenadas con muestra (como
se describe en 'el método de oxígeno) . Después de su incubación in
sitú, el plancton es concentrado en un filtro de membrana tratado
con ácido clorhídrico fumante para remover el carbono 14 inorgánico,
y probado para radioactividad.
La cantidad de carbón fijado es proporcional a la fracción de
carbón radioactivo asimilado.
Este procedimiento difiere del método de oxígeno en que pro
porciona una medida directa del carbón captado y mide sólamente la
- 916 -
fctostntesis neta . Es básicamente más sensible que el método de oxígeno pero falla en la estimación de los materiales orgánicos que se des- prenden de las células durante la incubación.
a) Equipo y reactivos.
1)
Pireliómetro.
2)
Fotómetro submarino.
3)
Botellas para DBO y aparatos de soporte (ver método de
oxígeno) .
4)
Dispositivo de filtro de membrana y filtros de 25 mm -
con poros de 0 .22, 0 .30, 0 .45, 0 .80 y 1 .2,u de diámetro.
5)
Equipo de conteo para medición de radioactividad : regis
trador electrónico con un tubo
tador
de
de
ventana, detector de flujo de gas o con
centelleo líquido. El tubo de ventana delgada es el menos caro
y cuando se usa con un registrador electrónico provee datos aceptables a un bajo costo .
6)
Cámara fumante . Usar un desecador de vidrio con -
aproximadamente 1 .5 cm de IICI concentrado en la cámara desecadora.
La cámara
desecadora
se recomienda
para
desinfección de los filtros.
7)
Una jeringa hipodérmica
8)
Reactivos para dióxido de carbono, (sección 7 .3 .4 .3) y
alcalinidad (sección 4 .2 .5 .3) .
de 2 ml con
una aguja de 15 cm.
- 917 -
Soluciones de carb onaw radioactivo.
9)
Solución de dilución de cloruro de sodio, solución al 5%
peso/vol de cloruro de sodio en agua destilada . Añadir 0 .3 g de bicarbonato de sodio anhidro y una lenteja de hidróxido de sodio a cada litro de solución . Usarse sólo para estudios marinos.
-
Solución acarreadora libre de carbonato radioactivo dis-
ponible comercialmente, en viales sellados que contienen aproximadamen
te 5)1 Ci de carbono 14/ml.
-
Soluciones de trabajo, con actividades de 1 .5 y 2 .5 µ Ci
14C/2 ml .
Para estudios en agua dulce se usa el acarreador libre de
carbonato radioactivo y para estudios marinos prepare por dilución la so
lución del acarreador libre de carbonato radioactivo con la solución diluf
da de cloruro de sodio.
Ampolletas . Preparar ampolletas que contengan 2 ml de
la solución de trabajo . Llenar las ampolletas usando agujas hipodérmi cas ; selladas en autoclave a 121° C por 20 minutos.
b) Procedimiento.
1)
Obtener un registro de la radiación solar incidente para
el fotoperíodo, con un pireliómetro.
2)
Determine los intevalos de profundidad para el muestreo
s
y la incubación como se describe para el método de oxígeno .
- 918 -
3)
Usar un duplicado de botellas claras y oscuras a cada -
profundidad . Llenar lás botellas con muestra, agregar 2 ml de solución
de carbonato radioactivo (usando la jeringa con la aguja) hasta el fondo de cada botella, y mezclar por medio de inversiones repetidas.
La concentración de carbono 14 en la muestra debe ser aproximadamente de 10,u Ci/l . Para significación estadística, debería haber por lo menos 1 000 cpm (conteos por minuto) en la muestra filtra da . 'Pomar el duplicado de las muestras a cada profundidad para deter minarles la concentración inicial de carbono inorgánico (CO 2, 1ICO) y CO32 ) disponible para fotosíntesis.
4)
Incubar las muestras hasta por 4 horas . Si las medicio-
nes son requeridas para el fotoperíodo completo, sobreponer períodos de
4 horas desde el amanecer hasta que oscurezca . Un período de 4 horas de incubación puede ser suficiente si se usa energía de entrada como labase para la integración del período de incubación en el fotoperfodo coro
pieto (ver procedimiento de incubación en el Método de Oxígeno).
5)
Al final de la incubación, remover las botellas de mues-
tra e inmediatamente colocarlas en la obscuridad o preservarlas aña diendo 40 ml de formol/litro . Filtre las muestras sin preservar inme . diatamente .
6)
Filtrar dos porciones de cada muestra a través de un -
filtro de membrana, teniendo cuidado de que el poro sirva para la reten
ción cuantitativa del plancton . Un filtro con poro de 0 .45p es usualmente el adecuado ; la eficiencia de la retención de la muestra deberfa deter minarse inmediatamente antes del análisis, con un amplio ámbito de ta maño de poro. Aplicar aproximadamente 0 .3 atm de vacío durante la fil
tración . El exceso de vacío puede causar ruptura de las células y pérdida de radioactividad a través de la membrana . El volumen de muestra de
be ser el máximo que se logre filtrar en 1 6 2 minutos.
7)
Después de la filtración, coloque la membrana en humos
de HC1 durante 20 minutos . Cuente los filtros tan pronto corno sea posi ble, aunque es aceptable un almacenamiento largo en un desecador.
8)
Determinar la radioactividad contando con un tubo de ven
tana, un detector de flujo de gas, o un contador de centelleo líquido . LO eficiencia de los métodos de conteo es aproximadamente la siguiente : ven
tana delgada, 3% ; flujo de gas, 50% ; centelleo líquido, 40%.
9)
Determinar el ' conteo geométrico de los detectores de -
ventana delgada y flujo de gas . Usando tres ampolletas de carbono 14, prepare una serie de precipitados de BaCO 3 en filtros de membrana de - 0 .45 N tarados ; cada precipitado contiene la misma cantidad de carbono 14 activo pero varía en el grosor de 0 .5 a 6.0 mg/cm2 . Diluir cada am polleta a 500 ml con una solución de 1 .36 g de Na 2CO 3/1 con agua desti lada libre de CO2 . Colocar con una pipeta 0 .5 ml de esta solución en cada uno de siete matraces cónicos conteniendo 0, 0 .5, 1 .5, 2 .5, 3 .5, 4 .5
- 920 -
y 5 .5 ml, respectivamente, de una solución de 1 .36 g de Na 2 CU3i/1 de - agua destilada libre de CO 2 . Añadir, respectivamente, 0 .3, 0 .6, 1 .2, 1 . 8, 2 .4, 3 .0 y 3 .6 ml de una solución de BaC1 2 al 1 .04% . Dejar reposar
el precipitado de carbonato de Bario durante dos horas, agitando suavemen
te cada media hora . Colocar cada precipitado en un filtro usando un apara
to con un área de filtración comparable a la de las muestras . Con vacío, secar los filtros sin lavarlos, ponerlos en un desecador por 24 horas, pe
sar y contar . La tasa de conteo aumenta exponencialmente con la dismi alción del grosor del precipitado y se extrapola gráficamente (o matemá
ticemente) a un grosor de precipitado de cero . La tasa de conteo de gro sor cero se multiplica por mil para corregir la dilución de la ampolleta . Esto representa la cantidad de actividad agregada a cada botella de mues
y se usa para determinar la fracción de C 14 tomada en las botellas cla ras y oscuras.
c) Cálculos.
.1)
Restar cl promedio de los centeos de leas botellas ose u -
ras al promedio de los conteos de las botellas claras para cada par.
2) Determinar el carbono orgánico disuelto total disponible
para fotosíntesis (carbonato, bicarbonato y CQ 2 libre) de las medidas de
p1l y alcalinidad ; hacer las mediciones directas del bioxido de carbono total de acuerdo con los métodos descritos en la bibliografía (Standard Methods, cap. 407)
3)
•
Determin. r la cantidad de carbono fijado usando la si -
guiente relación:
mg de carbono fijado/l -_ velocidad de conteo de la muestra filtrada
actividad total añadiada a la muestra.
x
mg/1 de carbono inórganico inicial x 1 .064*
x Volu
0 filtrado
en
4)
Integrar la productividad para la profundidad total de -
la zona eufótica y expresarla como gramos de carbono fijado por m 2 por día (ver el método de oxfgeno).
5)
Usando registro de radiación solar y velocidades foto
sintéticas durante el período de incubación, ajustar los datos para representar la productividad del fitoplancton para todo un fotoperíodo . Si las muestra se incubaron por menas de un fotoperíodo completo aplicar el fac
tor de corrección.
7 .2 .9 Bibliografía.
APl EA . AWWA , WPCF . - Standard Methods for the Examination of water
and Wastewater . - Fourtheen Edition . -1976.
* Corección por . efectos de isótopo .
- 923
7 .3 . PERIFITON
7 .3 .1
Introducción.
Las comunidades de microorganismos que crecen en las piedras, -
palos, macrofitas acuáticas y otras partes sumergidas,están grandemente
influenciadas por la calidad del agua y son muy útiles para evaluar los efectos de contaminantes en lagos y ríos . Se incluye en este tipo de organismos designados corno perifiton a las bacterias filamentosas y zoogleas,
a los protozoarios sésiles, a los rotíferos, algas y microorganismos que
se encuentran nadando, arrastrándose o alojados entre las formas fijas.
A diferencia del plancton, el cuál no responde a menudo a la in- fluencia de la contaminación en ríos a una distancia considerable aguas abajo, el perifiton muestra efectos dramáticos inmediatamente abajo de las fuentes de contaminación . Son ejemplos los lechos de Sphaerotilus y otros organismos del cieno observados comunmente en corrientes abajo
de las descargas de desechos orgánicos.
Debido a que la abundancia y composición del perifiton en un lugar
están gobernados por la calidad del agua en ese punto, las observaciones
de sus condiciones son muy útiles para evaluar las condiciones en corrien
tes .
El uso del perifiton en determinaciones de calidad del agua se ve a menudo obstaculizado por la falta de sustratos naturales adecuados en una estación de muestreo deseada . Además, a menudo es difícil tomar -
muestras cuantitativas de estos lugares . Como resultado se han usado va
sustratos artificiales que pueden loc.alizat
c
e a voluntad y esto pnwee
una superficie uniforme, área y orientación.
7 .3 .2
Toma de la muestra.
7 .3 .2 .1
Selección de la estación.
En ríos, se localizan las estaciones de muestreo a poca distancia
aguas arriba y uno ó más puntos aguas abajo de la fuente de contaminación.
En ríos grandes se muestres en ambos lados de la corriente . Como los efectos de un contaminante dependen de la capacidad de asimilación de lacorriente y de la naturaleza del contaminante, los cambios progresivos en
la calidad del agua, aguas abajo de la fuente de ncontaminación,pueden ser
causados por dilución y enfriamiento (como el caso de nutrientes, dese dios industriales tóxicos y contaminación térmica) o por mineralización gradual de materiales orgánicos degradables . En el caso de desechos do
mésticos y algunos industriales, el análisis superficial de los crecimien
tos de perifiton de la orilla y fondo aguas abajo de la salida, pueden reve
lar zonas sobresalientes de respuesta biológica a la calidad del agua, que
serían . útiles para determinar sitios apropiados para establecimiento de estaciones . de muestreo . De esta manera, los límites de varias zonas de
contaminación pueden delinearse y determinarse a lo largo del tramo 'afectado . Cuando un programa de muestreo no es factible, un mínimo de
dos estaciones tic muestreo preveerán datos de la comunidad del perifiton
a un punto de control arriba de la fuente de contaminación y los cambios en el perifiton inducidos por los desechos en la zona aguas abajo de la salí
da,donde ha ocurrido un mezclado completo con las aguas receptoras . En
lagos, -embalses y otros cuerpos de agua quietos donde las zonas de con taminación pueden estar arregladas concéntricamente, situar estaciones en un área adyacente a la salida del desecho.
7 .3 .2 .2
Toma de la muestra.
a) Sustratos naturales : se pueden tomar muestras cualitativas y semi
cuantitativas raspando piedras sumergidas, palos, pilotes y otros sustra tros que se encuentren en la estación . Aunque se han desarrollado muchos
dispositivos para la toma de muestras cuantitativas de superficies irregu lares, no son efectivos.
b) Sustratos artificiales : el sustrato' artificial usado más extensamen
te es el portaobjetos de vidrio plano de 25 x 75 mm, pero también son ade
cuados otros materiales tales como el plexiglas . Durante un estudio, no se
deben hacer cambios en el tipo de sustrato, porque la colonización varía
con el sustrato.
En ríos pequeños de agua someras y en las regiones litorales de los lagos se ponen los portaobjetos en estructuras ancladas al fondo . En ríos grandes y profundos o cuerpos de aguas estancadas donde la turbiedad
varía mucho, los portaobjetos se deben colocar verticalmente en la super-
-92b-
ficie en un enrejado flotante (figura 7 .3-I).
Fig . 7 .3-1 Muestreador de Perifiton
Colocar varios portaobjetos de cada tipo de análisis para asegurar
la toma de bastante material y para determinar la variabilidad en los re sultados causados por diferencias normales en la colonización de portaob
jetos individuales . También debe reconocerse que además de los efectos
de los contaminantes, el largo del sustrato expuesto y los cambios esta cionales de temperatura y otras condiciones ambientales naturales pueden
tener un efecto profundo en la composición de las muestras tomadas.
c) Período de exposición : la colonización de los portaobjetos limpios
procede en un ámbito exponencial para la primera y segunda ; semanas y después disminuye . Debido a que las exposiciones de menos de dos sema
nas pueden dar como resultado muestras escasas, y exposiciones de más
de dos semanas pueden resultar con menos material debido al desprendimiento provocado por la acumulación, este período constituye generalmen
te el intervalo de muestreo óptimo durante el verano Sin embargo, , este
período de exposición imposibilitará el muestreo de los tales adultos y de
algas grandes filamentosas tales como la Cladophora y Stigeoclonium.
7 .3 .3
Análisis de la muestra.
7 .3 .3 .1
Conteo de Sedgwick- Rafter.
Preservar las: muestras que se toman para conteo e identificación
en formalina al 5% u otro material adecuado . Evitar solventes que remue
van la clorofila y otros pigmentos de la célula.
El perífiton se remueve fácilmente de los portaobjetos con una hoja
de afeitar y un trozo de goma . Disperse los restos en el preservador (por
ejem . 100 ml) agitando vigorosamente, transferir un ml a una celda Sedgwick-Rafter, y hacer un conteo en banda como se describe en el capf
tulo anterior . Si el material en la celda Sedgwick - Rafter es muy denso
para contarse directamente, utilice una muestra diluida.
Exprese el conteo como células por milímetro cuadrado de sustra
to, utilizando la siguiente fórmula:
Células /ml de fragmentos suspendidos = conteo/ franja
Volumen de 1 franja (m1)
Células / mm 2 de superficie del portaobjetos = células/ml de fragmentos
suspendidos x 'volumen total de fragmentos
area del portaobjetos c de los por
taobjetos (mm )
7 .3 .3 .2
Conteo proporcional de especies de diatomeas.
La preparación correcta de montaje permanente de diatomeas de las muestras del perifiton, difiere de la preparación para montaje de las muestras de plancton debido a la gran cantidad de materia orgánica extra
celular (tal como los materiales gelatinosos para fijación y formalina), los cuales,
si no se remueven, caerían abajo como depósitos carbonosos
cafés o negros sobre el cubreobjetos cuando la muestra se incinera . Las
sustancias orgánicas pueden descomponerse por oxidación con persulfato
de amonio o ácido nítrico y dicromato de potasio (ver el capítulo 7 .2 .3), antes de montar la muestra, la oxidación con persulfato y la limpieza se
efectúa de la manera siguiente:
Colocar aproximadamente 5 ml de muestra en un vial desechable
de 10 ml . Déjese por 24 horas, desechar el sobrenadante aspirando, res
titufrlo con solución de persulfato de amonio al 5% y agitar . Que no exe
da el volumen total a 8 ml . Calentar el vial a 90° C aproximadamente por 30 minutos . Reposar por 24 horas, desechar el sobrenadante y restitufrlo con agua destilada . Después de tres cambios de agua destilada,transferir una gota de la suspensión de diatomeas a un cubreobjetos con una pipeta desechable, evapore el agua, preparar un montaje y cuente co
mo se describe en el capítulo de plancton.
7 .3 .3 .3
Peso' seco y libre de cenizas.
Reunir varias (al menos tres) réplicas de la muestra en portaobje
tos para determinaciones de peso . Obtener los pesos del material usado
para determinaciones de clorofila o de portaobjetos separados expuestos
expresamente para ese propósito . En el último de los casos, secar al al
re los portaobjetos en el campo; pueden almacenarse si se protegen de la
abrasión, humedad y polvo.
a) Equipo.
1) Balanza analítica, con una sensibilidad de 0 .1 mg.
2) Estufa para secado con doble pared, controlada con termostato
a una variación dé } 1° C.
3) Mufla eléctrica con control automático de temperatura.
4) Crisoles de porcelana de 30 ml de capacidad.
5)' Navaja de afeitar.
a) Procedimiento.
1) Si los pesos seco y libre de cenizas van a obtenerse del material usado para las determinaciones de clorofila, combinar la materia particulada y . el extracto de acetona de cada portaobjetos, evaporar la
acetona bajo una campana en un baño de vapor o en una estufa a prueba de explosión ; secar a peso constante a 105° C ; y poner a ignición por una
hora a 500° C.
Si los pesos van a obtenerse del material seco en el campo, rehidratar con agua destilada y remover de los portaobjetos con una hoja de afeitar o un gendarme . Colocar la raspadura de cada portaobjetos en qn crisol, secar a peso constante a 105° C e incinerar por una hora a 500° C.
2) Rehidratár lás cenizas con agua destilada y secar a peso coas ta n te a 105° C.
Este paso es con el objeto de reestablecer el agua de hidrata ción de la arcilla (y otros minerales), la cual no se elimina a 105° C pero
si se pierde durante la incineración . Si no se corrige ésto, el agua se
anotará como materia orgánica volátil.
a) Cálculos.
Calcular los pesos de varios portaobjetos y reportar como gramos
de peso seco y peso libre de cenizas por metro cuadrado de superficie expuesta . Si se usan portaobjetos de 25 por 75 mm (1 por 3 pulgadas) se usa la siguiente fórmula:
g/m 2 ^ g/portaobjeto (promedio)
0 .00375
7 .3 .3 .4
Clorofila y Feofitina.
La clorofila contenida en una comunidad sésil es un exelente indice de la biomasa del fitoperifiton . Debido a que las determinaciones cuantitativas de clorofila requieren el muestreo de perifiton de una área
conocida, también son apropiados para este propósito los sustratos artifi
ciales . Los pigmentos se extraen con acetona acuosa y la densidad óptica
del extracto se determina con un espectrofotómetro . Cuando la extracción
inmediata del pigmento no es posible, las muestras pueden almacenarse congeladas por 30 días si se guardan e n la oscuridad la facilidad con la cual la clorofila se remueve de las células varía considerablemente con di
ferentes algas . Para llevar a cabo la extracción completa de los pigmen tos es necesario, romper las células mecánicamente con un molino batidor,
desintegrador sónico o por congelación . El molerlas es el más riguroso y
efectivo de estos métodos.
a) Equipo y reactivos: los utilizados para la determinación de cloro fila en plancton.
b) Procedimiento.
1) En el campo, colocar los portaobjetos de vidrio, usados como
sustratos, directamente en 100 ml de acetona acuosa en una botella de bo
ca ancha .
Nota : el plexiglas es soluble en acetona . Si se usa plexiglas como sustrato, raspar el perifiton de la placa antes de la extracción con
el solvente .
2) Si la extracción no _puede hacerse inmediatamente, congelar- las muestras en el campo y guardarlas congeladas hasta procesarlas.
3) Romper las células por medio de un molino y dejar en acetona
por 24 horas en la oscuridad, a una temperatura cercana a 4 " C .
-932-
4) Pa ra determinar la concentración del pigmento, seguir los pro
cedimientos dados en la sección de clorofila en plancton.
c) Cálculos : después que la concentración del pigmento en el extrae
to ha sido determinada, calcular la cantidad de pigmento por unidad de área de muestra como sigue,:
mg clorofila a/m 2 = Ca x volumen de extracto, (litros)
2
área de sustrato, m
Ca = Clorofila a
Productividad.
7 .3 .4
La productividad de las comunidades de perifiton está en función
de la calidad del agua,el sustrato, y los cambios estacionales en temperatu
ra e, iluminación solar . Pueden estimarse cambios temporales en la cosecha (biomasa) por la cantidad de emisión de oxígeno o captación de car
bono.
7 .3 .4 .1
Acumulación de biomasa.
El porcentaje de acumulación de materia orgánica en sustratos -
aritificiales por la fijación, crecimiento y reproducción de organismos
ha sido usado intensamente para estimar la productividad de ríos y lagos.
Se aplica este método exponiendo varias réplicas de sustratos limpios pa
ra un período determinado, se raspa del portaobjetos el material acumu,
lado y se calcina a cenizas, corno ya se ha descrito .
-933`
p = mg de peso libre de ceniza fport: .ojetos
TA
Donde :
P
T
Productividad, mg de peso libre de ceniza indias.
T = Tiempo de exposición, días.
A = Area de un portaobjetos, rn 2 .
Obtener estimaciones de los cambios estacionales en el cultivo estable de comunidades asentadas, colocando muchas réplicas de sustratos en - un punto dé muestreo y entonces recoger al poco tiempo, a intervalos regulares, tales corno cada 2 semanas o cada mes por un período de un año o más . . La ganancia en peso libre de cenizas por unidad de área de un
período de muestreo al próximo, . es una medida de la producción neta.
7 .3 .4,2
Productividad en agua estancada, medida por el método de -oxígeno.
Los porcentajes de emisión de oxígeno captación de carbono por
el perifitan.que crece en aguas estancadas pueden estudiarse confinándo los brevemente en botellas, campanas u otras cámaras . En contraste el
metabolismo de argamsrnos en corrientes de agua es altamente ciependien
te de la velocidad de la corriente y no puede determinarse exactamente
bajo condiciones estáticas.
La medición de productividad en corrien tes, en contraste con a guas quietas, presenta algunos problemas de diferente índole para cada
- 934
ttpci (h . ;agua por lo tanto, los procedimientos deben estar debidanume se
parados.
La productividad y respiración del perifiton epilftico yepip(lico can las regiones litorales de lagos y estanques puede determinarse insertando campanas opacas y transparentes o cámaras de plástico con un extremo abierto,en el sustrato a lo largo de transectos perpendiculares a k orilla . Las cámaras se dejan por la mitad de un fotoperfodo . Se de- termina la concentración de oxígeno disuelto en la cámara al principio y al final del período de exposición . La productividad bruta es la suma de =
la ganancia neta de oxígeno disuelto en la cámara transparente y el oxíge
no usado en la respiración,
Los valores obtenidos se duplican para determinar la productividad
para el fotoperfodo completo . Si se interrumpe la medición de oxígeno disuelto en las cámaras, causado por la fotosíntesis y la respiración del plancton,puede ser la causa de serios errores en la estimación del metate
t
llamo del perifiton . Así que es importante que estos valores se obtengan
cuando el perifiton se está estudiando.
Esto puede }hacerse usando el método de la botella clara y oscura,
ya mencionado para el plancton.
a) Equipo y reactivas.
1) Cámaras claras y oscuras de vidrio o plexiglas, de aproximadamente 20 cm de diámetro por 30 cm de alto, con un orificiolaterlt me
diano, sellado con un tapón de cera para remover pequeñas muestras de agua para análisis de oxígeno disuelto o para la inserción de un electrodo
para analizar oxígeno . Impulsar la cámara con una pequeña hélice o pale
ta a manera de propela operada manualmente.
2) Medidor para oxígeno disuelto, o equipo y reactivos requeridos
para determinaciones de oxígeno disuelto por el método Winkler.
b) Procedimiento.
1) En cada estación se coloca al amanecer o al atardecer una cáma
ra transparente y opaca sobre el sustrato, y se deja por un lapso que abar
que la mitad de un fotoperíodo . Determine la concentración de oxígeno disuelto al comienzo del período de incubación.
2) Al final del período de exposición, mezclar cuidadosamente el agua en las cámaras y determinar la concentración de oxígeno disuelto.
c) Cálculos.
Cuando el período de exposición es de medio día, la producción bru
ta se determina por :
Pb = 2 VL (LF - L1 ) + VD (D I - D
F)
Donde :
Pb = Producción bruta, mg 0 2/m 2/dfa
V L= Volumen de la cámara clara, 1.
LF y L 1 = Concentraciones final e inicial, respectivamente, de
oxígeno disuelto en la cámara clara, mg/l.
-936-
VD = Volumen de la cámara opaca, 1.
D 1 y D1 = Concentraciones inicial y final, respectivamente, de
.oxígeno disuelto en la cámara opaca mg/l.
A = Area del sustrato m 2 .
El grado de producción neta se determina calculando la captación
de oxígeno en la respiración por 24 horas y restando ésta de la produc- ción bruta .
Pb - 24 (D I - DE) .
Pn =
TA
Donde :
Pn = Producción neta, mg 0 2 /m 2/día.
T = Tiempo de exposición, h.
7 .3 .4 .3
Productividad en agua estancada medida por el método de Carbono 14.
El método es similar al que se describe anteriormente para el método de oxígeno . Se colocan sobre el sustrato cámaras transparentes
y opacas . Se inyecta en la cámara por medio de una jeringa carbonato de sodio marcado con carbono 14 bien mezclado, y se deja incubar con el perifiton durante ni dio fotoperfodo . La concentración de carbono inorgánico disuelto disponible para fotosíntesis es determinada por titulación . Al final del período de incubación, el perifiton se extrae del sus
trato y se le analiza el carbono 14 .
a ) Equipo y reactivos.
1) Cámara de incubación : ver 7 .3 .4 .2.
2) Equipo especial y reactivos, ver la sección correspondiente a medidas para el grado metabólico del plancton.
3) Solución de carbonato de sodio marcada con Carbono - 14, con una actividad especifica de aproximadamente 10» Ci/mI.
Otro equipo y reactivas del método por titulación para dióxido de carbono libre.
4) Solución indicadora de Fenolftaleí na : use agua destilada libre de dióxido de carbono para la preparación de esta. solución.
-5) Patrón de Alcali para valorar, usar soluciones de Na 2CO3
0 . 0454N b NaOFI 0 .0227 N . Se requiere un equivalente de NaOFI o dos equivalentes de Na 2 CO3 (1 mol) para convertir 1 mol de CO 2 a bicarbonato.
Para ambos titulantes, 1 .00 ml .= 1 .00 mg CO 2 .
- Patrón de carbonato de sodio, para titular 0 .0454N: disolver - 2.407 g de Na 2CO3 anhidro (patrón primario), secar en la estufa a 140 0 C,
y diluir a 1 litro en un matraz aforado con agua destilada recién hervida por lo menos durante 15 minutos para expulsar el dióxido de carbono y en
triar a la temperatura ambiente . Preparar la solución diariamente o pro
tegerla del dióxido de carbono atmosférico en una botella pyrex.
- Patrón de hidróxido de sodio, para titular, 0 .0227N: diluir - 22 .7 ml de NaOH 1 N a 1 litro con agua destilada libre de CO 2 . Preparar
-938-
el reactivo dita riamente y protegerlo
dci
CO atmosférico en una botella -
pyrex . Valorar como se menciona. en el capítulo de acidez.
6) Bicarbonato de sodio, 0 .01N : disolver aproximadamente 0 .1 g
de NaHCO3 anhidro y diluir a 100 ml con agua libre de CO 2 . Preparar inmediatamente antes de usarse.
7) Lámpara fluorescente luz de día.
8) Tituladores automáticos o potenciórnetros debidamente calibra
dos .
b) Procedimiento.
1) Colocar en cada estación una cámara transparente y una opaca
sobre el sustrato y añadir 10 ji Ci aproximadamente de C 14/1 de volumen
de cámara . Mezclar bien el agua en la cámara, cuidando de evitar disturbios del perifiton. Determinar la concentración de carbono inorgáni co disuelto como se describe en la sección de alcalinidad.
2) Al final del período de exposición, remover de la superficie el
perifiton encerrado en la cámara, congelar y almacenar congelado en un
desecador .
3) Inmediatamente antes del análisis, exponer la muestra a hu mos de HCl por 10 a 15 minutos para eliminar todo el carbono . 14 reteni
do en el perifiton.
4) Quemar la muestra. (o porción) por el método Van Slyke y pro bar la radioactividad por uno de los siguientes métodos : meter el dioxi -
- 939 -
Los grados respitatorios también pueden variar durante el día, bajo ciertas condiciones, pero los factores involucrados no están bien en
tendidos . Los efectos de la respiración y fotosíntesis del plancton en el
balance general de oxígeno pueden estimarse por el método de la botella clara y oscura.
El ámbito en la concentración de oxígeno disuelto (q) en gramos
por metro cúbico, es la suma algebráica de los ámbitos de fotosíntesis
(p), respiración (r), difusión (d) y aporte de influentes subterráneos y
escurrimientos superificiales (a).
q=p-r+ d+a
Si la ecuación se multiplica por la profundidad en metros (z), los
valores resultantes están en gramos por metro cuadrado.
zq=QP - R+D+A
El grado de difusión de oxígeno por área en el agua (D) es un pro
dueto del coeficiente de transferencia del gas (K) basado en el grado de difusión a 0% de saturación, y el porciento del déficit de saturación (s):
D (g/m 2 /hr) = KS
a) Equipo y reactivos.
1) Botellas de DBO, para mediciones de botella obscura y clara . Ver sección 7 .2 .8 .2.
2) Equipo y reactivos de laboratorio para determinaciones de oxí
- 940 -
do de carbono producido por combustión a un contador de flujo de gas o
electrómetro . .
Atraparlo en una solución de carbonato de sodio 0 .1N, precipitarlo
como carbonato de bario en un filtro de membrana, y contar con un tubo de venta.na.
- Analizar la solución de carbonato de sodio por la técnica de centelleo líquido.
c)C1lculos.
(actividad en la muestra) x (carbón inorgánico disuelto) x 1 .064
(actividad agregada)
(área de sustrato )
Donde :
Pn = Productividad neta para el período de exposición.
1 .064 = corrección para el efecto de isótopo.
7 .3 .4 .4
Productividad en agua corriente medida por el métocb de oxígeno.
Los cambios diurnos en la concentración de oxígeno disuelto son el resultado de los efectos integrados de la respiración y fotosíntesis del
perifiton y del plancton, velocidad del agua, turbulencia, turbiedad, profundidad, carga de desechos. orgánicos y aportación de drenaje subterrá
neo y superficial . Diariamente son impuestas fluctuaciones en la produc
ción fotosintética de oxígeno por la demanda relativamente fija de oxíge
no de la actividad respiratoria .
- 941 -
geno disuelto.
3) Cámara de fondo, de 60 por 20 por 10 cm, con una placa para dividir a lo largo, una bomba sumergible con reóstato controlado, un termistor, y un medidor de OD ó tubo de vidrio para remover agua en determinaciones de oxígeno.
4) Cúpula de plástico, plexiglas, de aproximadamente 22 cm de -diámetro interior, con terrnistor flotante y una puerta de cerrado de cau cho para remover muestras de gas.
b) Procedimiento.
Hacer mediciones cada hora continuamente de la concentración de
oxígeno disuelto en una 6 dos estaciones, dependiendo de las condiciones áV
del río, de la presición deseada y la disponibilidad del equipo . Si se han obtenido condiciones similares a alguna distancia río arriba del lugar es tudiado, son suficientes las mediciones de oxígeno disuelto en una sola es
estación para determinar la productividad . Sin embargo, si las condiciones río arriba son muy diferentes a aquellas en el lugar estudiado, se deben hacer mediciones en los límites río arriba y río abajo de dicho lugar.
1) Medir la fotosíntesis del plancton y las cantidades de respira ción por el método de la botella clara y obscura descrito en productividad
de plancton.
2) Determinar el coeficiente de transferencia de gas (K) .
-942-
- Método de una sola estación - calcule el valor de K de -las mediciones de oxígeno disuelto tomada inmediatamente después del atardecer y justo antes al amanecer . Al atardecer:
K Se - r
Z
q
(1)
Donde :
qe = Ambitd ' nocturno . del cambio en oxígeno disuelto.
Se = Déficit de saturación.
Al amanecer:
qm =KSm -r
Z
(2)
Donde :
qm = Ambito diurno del cambio en oxígeno disuelto.
Sm = Déficit de saturación.
Restando la ecuación 1 de la ecuación 2 y reordenando los resultados obtenemos la siguiente relación:
K=Z (qm-9e)
(Sm - Se)
- Método de dos estaciones - Si la aportación es insignificante calcule el ámbito de difusión (D) para un déficit lde saturación dado, res
tando el ámbito de saturación (R) del cambio entre río arriba y río aba jo de oxígeno disuelto .
943 -
DI,
KS
(C - - ) . - k(
Z (C 1 -C)-1l
Donde :
Cl y
2 = Concentración de oxígeno disuelto en las estaciones río
arriba y río abajo, respectivamente
- M todo de la cúpula de plástico : calcule el ámbito de difusión directamente midiendo la pérdida nocturna de oxígeno_ de una cúpula de plástico en contacto con la superficie del agua . Llene la ciipula (de diáme
tro aproximadamente de 22 cm y un vol, de 2 .5 1) con gases atmosféricos
y que flote en el agua . Cada 2 - 3 horas, remueva muestras de 5 m1 de
gas de la cúpula y analice el contenido de oxígeno . Calcule la concentración de oxígeno disuelto en el agua.
3) Determine la respiración del perifiton.
-- Método de una sola estación - Si se conoce el grado de difusión,
calcine el grado de respiración restando el grado de difusión del grado de cambio en la concentración de oxigeno.
• Método de las dos estaciones - Los cambios nocturnos en oxígeno
disuelto , (OD) aguas arriba y abajo de la corriente, observados . en un momento de 100% de saturación son causados por la respiración.
- Método de cámara (cámara de Thornas - O' oneil) - Esta cámara puede considerarse como una modificación de la cúpula . Consiste en -
medir la velocidad de la corriente con un contador y reproducirla dentro
de una cámara, con la ayuda de una bomba, Este método es el único que
produce estimaciones exactas de respiración de perifiton a todas las velocidades en una corriente.
e)
Cálculos.
1) Determinar cada hora los ámbitos de cambio en 0D en la co -
rriente, restando pares sucesiveis de mediciones de OD.
2) Calcular el porciento de saturación de oxígeno y la tasa de di fusión D para cada muestra y determine el valor promedio para cada intervalo de muestra (si se usa el método de la cúpula de plástico, los valores de D se obtienen directamente),
3) Corregir los valores de q y r para fotosíntesis y respiración de fitoplancton y gra#icar en los mismos ejes . Determinar gráficamente el área entre dos curvás. Esto representa la productividad bruta del perifiton .
4) Determinar diariamente la productividad por metro cuadrado
de superficie, multiplicando la productividad diaria en metro cúbico por
la descarga en metros cúbicos y dividiendo entre el promedio de la profundidad en metros ..
3 .4 .5
Productividad en agua corriente medida por el método de Carbono 14.
El uso del carbono 14 para medir fotosrntesfs del perifiton en
-945-
agua corriente está restringida a cámaras cerradas con circulación forzada . En este caso, el crecimiento de perifiton en sustratos naturales o artificiales puede transferise a la cámara, la cual descansa sobre el fondo de la corriente , o a una cámara abierta en el fondo, la cual se coloca so bre la parte. quieta de la corriente . El carbonato de sodio marcado se in troduce en la cámara y el agua en la cámara circula mecánicamente para
proveer una velocidad de corriente comparable a la del rfo . La muestra
se incuba durante medio fotoperiodo, se remueve y analiza como se describe anteriormente en la parte correspondiente a plancton.
M .db
tia
► =
l2
Tamao del oá
.~ nao.
Figura 7 .3-I1 . - 1?roce.so.s componentes en el, metabolismo del oxígeno
de una sección de una corriente hipotética durante el curso de un
día soleado . Producción (P), Respiración (R), y Difusión (D) están dadas
en base a un área . El \fecto combinado de estos procesos para un río de 1 m de profundidad só da en partes por millon/h (q) . Los valores de
oxígeno reales que resultarían en un río con una larga comunidad horno génea están dados en la curva más baja . De Odum H .T . 1956.
7 .3 .5
Reporte dé resultados.
Aunque se han desarrollado varios sistemas para organizar e in -
terpretar los datos del perifiton, ninguno ha recibido aceptación univer sal . Los métodos pueden' ser cualitativos o cuantitativos . Los métodos
cualitativos tratan de relacionar la composición taxonómica de las comu
nidades con las zonas de contaminación, mientras que los métodos cuantitativos proporcionan índices numéricos de saprobidad, diversidad de la
comunidad y composición.
7,3 .5 . .1
Métodos cualitativos (especies indicadoras y cdmunidades).
El sistema sapróbico desarrollado por KoIK witz y Marsson es -
probablemente el método que se usa más ampliamente para interpretar datos de perifiton . Este esquema divide a la extensión contaminada del rro en zonas polisabróbicas, mesosopróbicas y oligosapróbicas y ealista las especies caracter sticas de cada zona . El sistema ha sido re
finado y ampliado por Ejerdingstad y Sladecek.
7 ..3 .5 .2
Métodos cuantitativos.
Estos métodos incorporan el uso de conteos de células por unidad
de área de . sustrato e índices numéricos de contaminación 6 calidad del agua . Existen datos disponibles de densidades de las células y composi- ción de especies de perifiton en portaobjetos, de ríos contaminados en In glaterr.a . Otros índices incluyen aquellos basados en . el sistema sapróbi co, donde el código de los números asignados para el valor sapróbico y la abundancia de especies individuales se usa para calcular el índice sa - próbico promedio ; la distribución normal de especies de diatorneas, fn
ces de la diversidad de comunidades derivados de la información de ecuaciones teóricas y el índice autotrófico (LA).
7 .3 .6
Bibliografía
AFEA, AWWA, WPCF . - Standard lVlethods for the Examination of
Water are Wastewater . 4th Edition . 1976 .
-9497 .4 MACROFITON
7 .4 .1
Introducción.
El macrofiton consiste principalmente de las plantas acuáticas -
con flores pero también incluye a los musgos acuáticos, hepáticas, hele
chos y las algas marinas superiores . Las formas de agua dulce varían de las menudas lentejas de agua (Wolffia), del tamaño de una cabeza de alfiler, a plantas tales como la espadoña (Thypha), arriba de los 4 me- tros de altura, y la ninfea (Nymphaea), con grandes hojas flotantes . Las
plantas flotantes mayores se encuentran a menudo apiñadas en grandes números y cubriendo áreas extensas de lagos someros, pantanos y canales . Unas pocas de las algas superiores de agua dulce, entre ellas Cha ra y Cladophora, se parecen a las plantas superiores en tamaño, forma
y hábitos, pero no se incluyen en el macrofiton . En aguas marinas so- bresalen las hierbas de las rocas en la zona de intermareas, tales como
Fucus y Ascophyllum y las algas de mar adentro tales como Fucus y Ma
crocystis . Las plantas vasculares marinas o estuarinas, tales como la
zostera marina, Zostera y el pasto de los pantanos Spartina, son esen ciales para el ecosistema acuático.
Se reconocen tres tipos de macrofiton : flotante, sumergido y - emergente . Las plantas flotantes carecen de raíz y su follaje principal
o corona flotante se encuentra sobre la superficie del agua . Todos, o la
mayor parte de los follajes de las plantas sumergidas crecen bajo la su-
perficie del agua ; las plantas pueden o no tener raíces . Las plantas - emergentes son erectas o desplegadas, con su follaje principal en el aire ; éstas están fijadas al fondo por raíces . En algunos casos las mismas
especies pueden crecer como flotantes o emergentes, dependiendo del ni
vel del agua . Las plantas vasculares sumergidas y emergentes generalmente están enraizadas en el fondo . , La mayoría de lás algas marinas grandes, están sujetas mediante cirros especiales.
7 .4 .2
Descripción del macrofiton.
7 .4 .2 .1
Identificación.
1 .,a identificación de las plantas debe hacerse, si es posible, ex-
trayendo las especies de su medio . Es útil para compáráción, una colección de referencia de especímenes identificados ', preservados o monta- dos . Reportar el porcentaje del área de cobertura y cantidad de creci miento.
7 .4 .2 . 2
Extensión de crecimiento (área de cobertura).
Reportar la cobertura como marginal, cuando ésta aparezca en fragmentos, o cuando se extiende continuamente sobre toda o una parte importante de un cuerpo de agua . Las palabras usadas para describir la cobertura de crecimiento son : densa (abundante, excesiva, pesada, profusa) cuando la cobertura del área es continua ; media (común) cuando
el crecimiento cubre aproximadamente la mitad del área ; y esparcida (escasa) cuando el crecimiento se observa rara vez.
Particularmente cuando el crecimiento es denso, se reporta el -
área de cobertura en hectáreas o como porcentaje de superficie cubierta.
Para canales, zanjas y corrientes ; la cobertura puede re strarse como
kilómetros del trecho afectado,
Profundidad de crecimiento.
7 .4 .2 .3
Reportar la profundidad de crecimiento sólido como profundidad
en metros . Las mediciones actuales varían de 1 cm a 3 o 5 metros o más.
Volumen de crecimiento.
7 .4 .2 .4
Aunque se usa rara vez corno medida, el volumen de crecimiento
puede reportarse en metros cúbicos.
7 .4 .2 .5
Biomasa.
Estimar el peso húmedo o seco del crecimiento de muestras . representativas.
7 .4 .2 .6
Estudios preliminares del área.
Subdividir el área de interés en un número de secciones geográ
ficamente distinguibles y trazarlas en. un mapa.
Durante el periodo de máximo crecimiento, hacer un reconocí-
_
0
52 ,
miento en lancha del r a que va a ser estudiada . Anotar en el mapa los
géneros o especies predornirtanpes de vegetación achica para cada subII-ea asignar a cada género o especie un símbolo de abundancia relativa . tTsando el mapa determine la extensión del crecimiento de plantas cero
tttti
pIairilactrc) . 1,as t(xic,grriff s aéreas, especialmente con película
iit{r:trroja, ton un ' valioso complemento para otras observaciones.
7 .4 .3
Bibliografía
APHA, AWW ,,.WPCIT . -
Standard lethods for .the Examination of
Water and Wastewater , -14 th Edition, -1976 .
- 953
7 .5 I A ROI VEI TERRADO DEL
BENTOS
7 .5 .1
Introducción.
Los rnacroinvertebrados del beatos son los animales que habitan -
el fondo de lagos y ríos o están sujetos a piedras u otros objetos sumer
doy . Aunque algunas formas inmaduras pueden ser muy pequeñas, por definición, los organismos muestreados para estudio son aquellos que
quedan retenidos en un tamiz del No . 30 de la U . S . standard (0 .595 mm
de abertura).
Las comunidades de rnacroinvertebrados se muestrean para la composición de las especies y la abundancia de organismos o para t onito
rear cambies a largo plazo en la estructura de las comunidades . Un cuer
po de agua de buena calidad contiene por lo general una fauna bentónica di
versa, sin sobreabundancia de ningún grupo . La contaminación orgánica
puede restringir la variedad de organismos en el agua ; esto puede tara- bien favorecer el desarrollo de gran número de organismos que toleren las condiciones químicas y .ffsicas asociadas a la contaminación . Por otro
lado, la contaminación por substancias tóxicas puede eliminar a casi to –
dos los macrbinvertebrados.
7 .5 .2.
Toma de la muestra.
7 .5 .2 .1
Consideraciones generales.
Antes de conducir un estudio, los investigadores deben determinar
Los objetivos específicos y definir claramente la información a obtener . -
Por ejemplo, para determinar si la comunidad de macroinvertebrados rfo
abajo de la descarga está dañada, solo se necesitan unas pocas estaciones
de muestreo rfo arriba y rho abajo de la descarga : Sin embargo, si el objetivo del. estudio es delimitar la extensión de la zona afectada desde la
descarga o: series de descargas, es necesario tener estaciones de refe- rencia río arriba de las descargas, .para dar a cada descarga un número
de estaciones y establecer estaciones rfo abajo.
Después de comprender completamente los factores que envuelven
un cuerpo de agua en particular ; el investigador .debe seleccionar áreas -
especificas de muestreo . No existe un nOmeroestablecido de estaciones
de muestreo que sea suficiente para monitoreai' todos los posibles tipos de descargas . Ningún estudio de calidad del agua es de rutina, ni debe dirigirse corno "'receta de cocina" . Sin embargo, si se siguen cuidadosa
mente algunas reglas básicas, ésto dará como resultado un buen diseño del estudio. . .
a) Siempre establecer una estación o estaciones de referencia río arriba o en un punto lejano a la posible descarga de aguas de desecho . Co
mo el propósito usual del estudio es determinar el daño que la contaminación causa . en la vida acuática, ésta será la base para la comparación de
la fauna en áreas contaminadas . y no contaminadas . En La ',táctica, es re
comendable tener por lo -menos dos estaciones de referencia .. tina deberá
estar lejos o río arriba de la descarga y otra directamente sobre o .en un
punto inmediato a la descarga del efluente pero no sujeto a la influencia de ésta .
b)
Localizar una estación rio abajo inmediatamente después de la des
carga o en el área atestada después de cada descarga.
c)
Si la descarga no se mezcla completamente con todo el cuerpo de -
agua sino en canales en un solo lado o se dispersa en una dirección espec!
Pica, subdividir las estaciones en tres, una en el lado izquierdo, otra en el centro y la Última en el lado derecho del río, o en arcos concéntricos si
se trata de un lago . Mantener los datos separados por subestaciones.
d)
Establecer estaciones a varias distancias rro abajo de la descarga
para dterminar la extensión lineal del daño producido al río.
e)
Para permitir una comparación de comunidades de macroinverte
becados, asegurarse que todas las estaciones de muestreo sean ecológica
mente similares . Por ejemplo, las estaciones deben ser similares con respecto al sustrato del fondo (arena, grava, rocas o fango), profundidad,presencia de aberturas en el fondo, ancho del río, velocidad de flujo, y condiciones de la orilla.
f)
Tomar muestras para los análisis químicos y ffsicos cerca de las -
estaciones de muestreo para asegurar la correlación de los datos encontra
dos.
.g) .
Localizar las estaciones de muestreo para macroirvertebrados en -
un área que no esté influenciada por habitats no naturales, tales corno -
aquellos creados por puentes.
h)
Para poder hacer comparaciones entre las estaciones de muestreo,
hacer todos los muestreos durante el mismo período de tiempo.
Para un programa de monitoreo biológico de larga duración, los rnacralnvertebrados deben tomarse en cada estación de muestreo por lo
menos una vez durante cada una de las estaciones del año . Si las caracte
rfsticas de cualquier efluente cambian o hay escurrimientos, es necesario hacer muestreos con más frecuencia.
En general, . el periodo más critico para los macroinvertebrados erg un río es durante los períodos de alta temperatura y poco flujo . Por lo
tanto, si el tiempo y los medios disponibles limitan la frecuencia de mues
tren, por lo menos un estudio durante este tiempo producirá informad ten
útil .
7 .5 . 2 .2
Diseño del muestreo.
Una muestra. es una porción tomada de algún cuerpo mayor, de la -
cual obtenemos nuestros resultados . Sin é1 conocimiento de la variación de las muestras, los datos no pueden ser estudiados correctamente para - .
representar una población . . Un recorrido sencillo, duplica muestras de una población o agrega aquellos que deberían haberse tomado y estudiado y sin son correctas las inferencias que se han hecho acerca de la pobla- ción . El diseflo del muestreo debería normalizarse hasta el punto en que se encontraran los siguientes requerimientos :
a)
Definir eL sitio de todas las muestras que van a ser seleccionadas
(separar la población en unidades de muestreo).
b)
Asignar a cada posible muestra una probabilidad conocida de se- -
lección (hacer los muestreos al azar para dar a cada muestra La misma probabilidad de ser seleccionada).
c)
scoger un método para calcular los resultados de la muestra y -
que proporcione un valor Único para cada muestra.
Normalizar la adquisición y grabación de los datos cuandp sea prác
tico . Anotar, y reportar datos en unidades métricas ; cuando sea necesario
anotar entre paréntesis el equivalente en otras unidades.
Una de Las decisiones más difíciles de hacer cuando se . muestreaí
invertebrados acuáticos es determinar cuantas réplicas de muestras de- b en tomarse en cada estación o subestación para obtener información con
fiable . Como los organismos no están distribuidos al azar sobre el fondo
de un rfo o lago.
Los diferentes habitats (arena, lodo, grava o materia orgánica) so
portan diferentes especies y densidades de organismos . Cada uno en un fondo relativamente homogéneo, los animales tienden a aparecer en grupos,
por lo tanto, es forzoso tomar réplicas de muestras para evaluar esta variabilidad.
En la mayoría de los casos
tres o más réplicas de muestras se re
quieren para describir la comunidad de macroinverte girados . Frecuente -
mente; s toman Lie ; .'f . It1 mute_ ni pu e5snici n .a seguro un núrrt-. ru
mayor puede ser :neetsn rib prtra 1ogrrtr el nivel de exaetituU .deseado . Si
existe la necesidad de dividir una estación en subestaciones, entonces ca
da subestación deber-fa muestrearse corno se describe anteriormente.
Estos puntos no se aplican a todas las situaciones posibles y no se
usan con criterio ri;gido . De una manera ideal debería hacerse tin estu- dio previo para determinar el número de muestras necesarias para obtener eL nivel de exactitud deseado en cada estudio . de contaminación.
7 .5 .2 .3
Dispositivos para el muestreo cuantitativo ..
Los muestreadvres cualitativos y cuantitativos han sido diseña dos para obtener organismos de los fondos de corrientes y lagos.
Los dispositivos de muestreo cuantitativos más comunes son latis dragas Ekrnan, Petersen y Ponar y el muestreador de fondo de corriente
conocido cocino pie cuadrado.
Cuando se toma una muestra cualitativa, el muestreador toma mu
chos organismos diferentes . Las muestras pueden tomarse por cualquier
método que capture especies representativas.
La draga Ponar (ligara :7 .5-1).
Se incrementa sis uso en lagos y es capaz de maestrear la más extensa variedad de sustratos.
s similar en tarnafio, peso y comportamiento para la muestra a la draga Petersen, pero tiene placas laterales y, una criba en la parte su -
perior del compartimento de la muestra para prevenir la pérdida durante
el cerrado . Con un juego de pesas, el rnuestreador pesa 20 kg.
Figura 7 .5-1 .- Draga Donar.
b)
La draga Ekrna.n (figura 7 . 5-11).
Es útil para maestrear limo, basura y lodos en aguas con poca co
rriente . No se use en fondos rocosos o arenosos, porque pequeñas pie- -
dms o arenas impiden que cierre completamente . La draga está hecha de
cobre o acero inoxidable y pesa aproximadamente
3.
2 kg . La parte ,en
forma de caja que sostiene la muestra tiene unas mandíbulas en el ex
tramo inferior que deben ser operadas manualmente (teniendo precau ción al manejarla, pues si cierra repentinamente puede ocasionar acci
gentes) . En la parte superior de la draga hay dos tapas que quedan par
cialmenie abiertas durante el descenso por el paso del agua a través del
compartimento de la muestra . Estas tapas se cierran por la presión
del agua cuando el r auestreador se esta subiendo.
La draga esta hecha en tres tamaños, 15 x 15 cm ; 23 x 23 cm y 30 x 30 cm, pero la más pequeña es la adecuada para tomar mues
tras por :duplicado .
Figura 7 .5-11 . -Draga Ekman
e)
Muestreador Surber o "Pie cuadrado" para fondos (figura 7 .5-111)
Es un dispositivo ligero para tomar muestras ea aguas con pro -
fundidades arriba de O . 6 m en corrientes rápidas . Consiste en un fuer te tejido estrecho (0 .595 mm de abertura) de 69 cm de largo (aberturas
de malla irás pequeñas ocasionan que el agua se regrese debido al tapo
namiento) . La red este ensamblada a un armazón de metal (30 .5 x 30 .5
cm) por medio de otro similar.
En operación, el armazón que soporta la red se coloca en iosi - ción vertical ; mientras el otro se tiende en una posición horizontal con tra el fondo . Cubrir la mitad de los espacios laterales entre los arma
zones vertical y horizontal con triarigulos de tela resistente . Colocar la abertura de la red contra la corriente con el objeto de mantener - abierta la red . Empuje el armazón horizontal dentro del material del
fondo del río.
Fig. 7 .5-111 . - Muestreador Surber o "Pie cuadrado "
i ler r r•c de la
+x :-1 cls
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áreas estab1LL .ida s escarbar las rucas y los otr us dc'p6wi
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organismos desalol . R 1 1 w
[ala I}3 Lol
l]
- cniLIi
1 :1
abierta.
Otros dispositivos de muestreo cuantitativo : además de aquellos
d)
mencionados anteriormente, existen muchos otros muestreadores cuantitativos . Algunos de éstos tienen ventajas definitivas para el muestreo
de habitats p rticulares o rnacroiinvertebrados.
Wcich, Pcfnak. :y Barnes han recopilado información de varios de
e-1c,s
liluc,ireadores.
1.)
Draga tipo "cáscara de naranja" (figura 7 .5-IV).
Es una draga redonda con varias manda bulas y un dispositivo d
cerrado de lona en la parte superior que sirve como una porción del - compartimento de la. muestra . Generalmente se utiliza lá draga de - -1 , 600 cm aunque se pueden encontrar dragas de mayor tamaño.
El área maestreada. y el volumen etc
material
recogido
depende de la profun -
didad de penetración . Esta draga es adecua
da para aguas marinas y para lagos profun
dos, donde tiene ventajas sobre otras berra
1
-u lentas cuando se maestrean sustratos are -
nosos .
Fig . 7 .57V Draga Tipo
"Cáscara de Naranja"
i
-93-
2)
I)ril}.1 :r K 'te 1.!-11211 (fi
ra 7 . --V).
Se'. LI - LI 14111pl 141 1 i1eliI e pa ra toli ltl l' Ilitl
.I.+I -
de fi 11i{If] 1
f'C'l li s ;tii l ., ,
grava, marga y arcilla cn corrientes rápidas de aguas profundas . Es una draga de acero tipo a1meja,manutacturada en muchos tarnaños,que
pueden mu strear un área de 0 .06 a 0 .09 m 2 . Por :lo tanto, cada draga debe medirse para determinar su área exacta de muestreo . Pesa aproximadamente i .3 .7 .k pero puede llegar a 31 .8 kg cuando su ponen
pesos auxiliares a los lados . El propósito primordial d los pesos ex tras es el de dar estabilidad a La draga en corrientes rápidas y además
dar una fuerza adicional a la draga cuando se usa en fondos de materia
les duros .
Figura 7 .5-V .-Draga Petcrscn
Preparar la draga y bajarla lentamente hasta el fondo para cvi
tar ios: disturbios de los Materiales ligeros del fondo . Cuando esté ten
sa la cuerda soltar el retén . Conforme se levanta la draga el sistema
cierra las quijadas.
3)
La draga Srnith- cIntyre (figura 7 .5-VI).
Tiene la misma construcción con acero pesado que la Petersen,
pero sus rr andrbulas se cierran por medio de un fuerte resorte espiral.
La g ventajas principales son su estabilidad y fácil cóntrol en aguas tur
bulentas . Debido a su peso y tamaño requiere que su operación se ha ;a desde una embarcación grande equipada con un malacate . La draga
de 45, 4 kg puede muestrear una área de 0 .20 m2.
4)
La gaga Shipek (figura 7 .5-VII).
Está diseñada para tornar una muestra en una área de superficie
de 0 .04 m 2 y aproximadamente 10 m de profundidad al centro . El cona
partimento de la muestra está compuesto de dos medios cilindros con- céntricos . Cuando la draga toca el fondo, la fuerza de
uG
pese indepcn
diente libera un retén . , el resorte helicoidal hace girar 180 grados el medio cilindro interior. El cubo del muestreador puede saltarse del se
micilindro superior liberando dos pasadores, Esta draga se usa princi
palmente en aguas marinas y grandes cuerpos de aguas interiores .
Figura 7 .5-VI .- Draga Smith-Ivic intyre
Figura 7 .5 VII .- Draga Shipek
5)
Nucleadores.
Se utilizan para tornar muestras de sedimentos del fondo . El -
area maestreada en la interface lodo-agua, 13-26 cm 2 os pequeña . Para
su uso eficiente como muestreador de superficie requiere poblaciones animales densas . Los nucleadores varían de tubos que se empujan rea nualmente hasta los que se manejan con explosivos y modelos automáti
cos de superficie.
El tipo Phleger (figura 7 . S- líll) se usa ampliamente en estudios
de calidad del agua . Opera con el principo de la gravedad . Los estilos
y pesos son variables, los pesos van de 7 .7 - 41 kg o más . El largo de
Loa muestra tornada varía con la textura del sustrato, pero tales muestras son adecuadas para la mal yorra de los examenus físi 'Cclurilik- os - o de fósiles para delinear cambios ambientales recientes.
1—1
i''igur.a 7 .5-\! lll-Nucleador.es 'f- ipo•Phlegar
q (7
El muestreador KB
ajak Brink hust) e s útil para obtener es-
tirnaciones de los macroinvertebrados bénticos que habitan los redimen
tos suaves.
El muestreador Wilding (figura 7,5-1X).
Se fabrica en diversos tamaños con muchas modificaciones.
Es especialmente útil para muestras cuantitativas de fondo con creci
mientes densos de plantas vasculares . Puede usarse para tomar mues
tras de vegetación, sedimento de la interfase lodo-agua o ambos . Cuan
do se toman muestras de grandes volúmenes de vegetación, pueden re querir mucho tiempo para procesamiento en el laboratorio,
Figura 7 .5-IX . --Muestreador Wilding
968-
e)
.
• Redes puta .c irr.iente (fisura 7 .5-X).
Se une
fin tif
I1.1ur'rielne iwaera 'm1111 :rar:'
loor
Hule• 1•C
Pi
ilv['
que han emigrado o se -iiau'soltadu del fondo para pu sa t ti la corriente > Los organismos de arrastre son carnada para los peces de la corriente
y por lo tanto, deben considerarse en estudios de poblaciones de peces.
Los invertebrados bónticos . pueden responder a la contaminación aurnen
.
•
'ando su emigración de una área afectada ) por lo que esta emigración -.
es importante en investigaciones de la calidad del agua . El arrastre ta mhi ón
es un factor en la recolonización de áreas desnudas y asf can-
tribu[' r a 11 recupeÉaci in.
Figura 7 .45-
.- Red para corriente
Se . recomienda . usar redes que tengan una abertura de 929 ccm 2 y
malla equivalente a la U . S, standard # 30 (0 .595 mm de tamaño de ma
ila, aunque se puede usar una red nitex c~ori tamaño de malla de 0 .471 mm) . Una vez colocadas en el agua las redes requieren la remoción
frecuente de organismos y desperdicios para prevenir el taponamien to y la salida del agua por la abertura de la red.
Recolectar las muestras para cualquier período de tiempo espe
e Pico (comúnmente 3 horas), pero use siempre el mismo tiempo para cada estación . El muestreo entre el atardecer la 1 :00 arn es el ópti 1110 .
La cantidad total (número de biomasa) de los organismos que pa
san por una estación durante 24 hs . , dividido por el total de la descarga
de la corriente es la mejor medida de la intensidad del arrastre.
Reportar los datos en términos de:
(No . x 24 Moras)
(ni x 24 horas)
7 .5, 2 .4
a)
ó
(biomasa x 24 horas)
m x 24 horas )
Dispositivos para el muestreo cualitativo.
Las redes de arrastre o red barredora.
Varían de las redes montadas en trineos a las que incorporan -
dientes para afianzarse en el fondo . Algunos modelos cuentan con apa
ratos para mantener la red abierta durante el muestreo y para cerrar
la durante el descenso y la recuperación.
b)
Red sumergible.
Las redes sumergibles ' son muy practicas para quitar anima- -
les de la vegetación y otros sustratos cerca de la costa . Seleccionar el
- 070 . .
tamaño forma de la red .que mejor se adapte a los requerimientos del
iuesttco.
e)
Pantallas manuales.
Se puede construir con tela de mosquitero de aproximadamente
1. i y sujeto a dos estacas paralelas de madera . . Son muy utilizados
para atrapar organismos en corrientes y cerca del borde de la playa . Las estacas además permiten sujetar y manipular La tela.
Diseños varios.
ci)
Tales corno rastrillos, navajas de bolsillo, cubetas o tamices se usen para recolectar maeroinvertebrados en una gran variedad de situaciones . La medida de su uso está determinada por el tipo de sus trato que va a muestrarse y el ingenio del recolector.
7 . 5 . 2, 5
:
Dispositivos para el muestreo. con sustrato aritificial.
El uso de sustratos artificiales para colectar organismos acuáti
cc
se está , Hic :rementando debidó a que ofrecen una manera firme para
euuestrear estaciones difciles y extensas, normalizando el procedimien
to de muestreo . `'ambieii eliminan algo de la subJetividad requerida en
el uso de los dispositivos de muestreo ms tradicionales, siempre que
el sitio pueda ser colonizado por la fauna . Aunque el mi srno tipo de ha
bitats esté abierto para la colonización por los organismos en cual- quier estación, los sustratos deben colocarse en forma similar a las es
taciones .
Es práctico recolectar los sustratos artificiales "in situ" en xL
sas de al dón u otros dispositivos para prevenir que los organismos
vR
capen,
a) El muestreador de platos múltiples, está coas[ru%du con ocho platos o tablas duras separadas por siete platos pequeños, exponiendo más de 929 cm2 de superficie total para la fijación de los organismos . Un agujero atraviesa el centro de cada plato . Los platos grandes son de 7 .6 x 7 .6 cm y 3 .2 m de espesor ; los platos pequeños son de 2 .5 x
2 .5
cm y 6 .4 mm de grueso . Los platos se colocan alternativamente
en un tornillo o varilla y unidos todos por dos tuercas en cada extremo
(figura 7, 5-XI) . En lugar de mantenerlo vertical con alambre galvani
zado el cual puede oxidarse, un cordón de nylon puede pasarse a través
de los platos para mantenerlos juntos . Ei muestreadór puede usarse en corrientes o lagos, por cualquier método que lo mantenga colgado en
el . sitio deseado . La profundidad 'y la exposición deben ser acordes en
un estudio dado.
Iniciar la recolección colocando cuidadosamente una bolsa de plástico o red sumergible (de abertura de malla 0 .595) bajo el rnuesCreador . Tomar a los organismos del muestreador, en el campo, sepa
tundo los platos y raspando o cepillando los organismos hacia un reci piente, o bien colocando el muestreador completo en una bolsa de plásti
co para procesarlo en el laboratorio . Preservar el material recolecta-
do en formalina al
i
I o etanol al 701.
Ffgura 7 .5- XI . Muestreador de platos múltiples
b)
El muestreador tipo canasta fue desarrollado para la recolección
de macroinvertebrados en ríos y lagos grandes . El muestreador (figura
7 . 5- Il) cdnsiste en una canasta cilíndrica cromada de 18 cm de diáme Cro y 28 cm de largo, el cual se llena con 30 piedras de 5 a 7 .5 cm de dxá .rnetro . Pesando aproximadamente 7 .8 kg, la canasta es firme, econó
mica y se encuentra fácilmente en el comercio .
07:i
esanzZI .anini suí .,
Figura 7 .5-XII Muestreador tipo canasta
Cuando es posible ;: suspender el muestreador de estructuras estacionarias o flotantes en la zona eufótica (zona donde la penetración
de la luz permite crecimiento de plantas verdes), a una profundidad aproximada de 1 .5 m por un período de 6 semanas de exposición . Si es
tas condiciones no pueden observarse, es importante que la profundidad
y el tiempo de exposición sea fijo en cualquier estudio.
El muestreador recolecta insectos inmaduros, hiozoarios, ce lenterados, y otros macroinvcrtehrados a menudo no recolectados de
los sedimentos del fondo por dragas y redes barredoras.
La recolección comienza colocando cuidadosamente una bolsa
de plástico o red sumergible (de 0 .595 mm de abertura de malla) bajo
el muestreador . Vaciar ias piedras en un tubo parcialmente lleno con
agua . Cepillar cada piedra con un cepillo de cerdas duras para remo ver a los organismos adheridos y volver a colocarlas en la cesta para
otro período de exposición .
7 .5 .3
Análisis de la muestra.
Después de la recolección, vaciar una muestra de fondo tomada
con draga conteniendo arena o materia orgánica, en un tubo, dilurr con
agua, y agitar la mezcla formando remolinos . Vaciar esta pasta aguada a través de un tamiz (U . S. Standard No . 306).
Es necesario que se remuevan los materiales que obstruyen las
rejillas . Series de una o dos rejillas gruesas (por ejemplo 1 cm y 0 .5
cm de malla) retendría hojas, varas, etc . permitiendo que los organis
mos pequeños pasen a través del tamiz No . 30 . Cuidadosamente revi se piedras, varas y otros artefactos en donde se adhieren organismos,
antes de desechar los residuos, lavar el material cribado en un reci- piente y preservar en formalina al 10% (la EPA recomienda no usar for
malina) o'etanol al 70% . (Si se . usa etanol, el material cribado no debe
exeder más de la mitad del volumen del recipiente) . Etiquetar anotan do la localidad, fecha, tipo de muestreador usado, nombre del colector
y otra información pertinente.
Algunos macroinvertebrados tales como : oligoquetos, sanguijuelas y turbelarios son mas fácilmente identificados si están relajados - (con alcohol caliente por ejemplo) para prevenir su coñstricción durante
la preservación.
Para muestras cualitativas es conveniente colocar piedras, va - ras y otros objetos en una palangana blanca parcialmente llena de agua .
Muchos animales flotarían al soltarse de estos objetos y de este modo
pueden tomarse con pinzas.
'Concentrar los organismos tomados de sustratos artificiales en
un tamiz (U .S . Standard No . 30) y preservar con formalina al 10% o
nol al 70%.
Asignarles números de- identificación en el campo o en eL labora
tormo y t-ranscribir información de las etiquetas a libros permanentes.
El líbrp provee de referencias convenientes en cuanto al número de - muestras tomadas en varios lugares, tiempo cle muestreo y característi
cas del agua.
Ya sea que los organismos son separados de la muestra de detri
tos en 4 campo, o en el laboratorio siguiendo los mismos procdinnien tos . Antes de procesar una muestra transferir la información de la eti
queta a una hoja 'le datos que tiene espacio para nombres científicos
y
-
el número de individuos . Coloque la muestra directamente en una cha
rola blanca con agua para ordenarlos . Un método usado para facilitar el arreglo de los organismos de los detritos es teñir a los organismos
de rojo con 200 mg /1 de rosa de bengala en los preservadores, alcohol
y formalina . Examinar la muestra completa y separar a los organismos a menos que estera en gran número . Si, una subrnuestra es ordena mos
da, tenga cuidado de que las formas raras no queden excluidas . Confor
me los organismos son extraídos de la muestra (es útil un lente de 2 x),
enumere las categorías taxonómicas mayores (por ejemplo, Odonata,
Coleoptera y Ephemeróptera) en la boja de datos : .Coloque a los ora nisrnos en frasquitos separados de acuerdo a su categoría y llene con
R
formalina al 5% o etanol al 70% . Etiquetar con el número de la inues
ira, fecha, lugar, nombres de organismos etc . Identificar los anima les en cada vial con la ayuda del estereoscopio y microscopio compues
to, de acuerdo a las necesidades, recursos experiencias disponibles.
7 .5 .4
-
Evaluación y presentación de datos.
Hay dos métodos básicos usados en la evaluación de los efectos
de contaminación en la vida acuática . El primero para hacer análisis cualitativos de la flora y la fauna "arriba y abajo t " o "antes y después",
con lo cual se determinan las especies presentes o ausentes,
Entonces, a través de una interpretación de las• respuestas de va
rias especies contaminantes específicas, uno hace una evaluación de la—
importancia del daño o cambio.
El. segundo método es hacer un inventario cuantitativo del mime
ro de especímenes, especies y de la estructura de la comunidad acuática afectada por los contaminantes y compararlo con Lo que reporta la tí
te:ratura . En la mayoría de los estudios de contaminación los des rnéto
dos se toman en cuenta debido a que ambos proporcionan información interpretativa valiosa .
--977-
7 .5,4 .1
Evaluación de datos cualitativos.
Dos organismos no reaccionan idénticamente a un contaminante
debido a las interrelaciones entre factores genéticos y condiciones am
bientales . Sin embargo, se ha encontrado que ciertos grupos de organis
mes son intolerantes a varios tipo de contaminación.
Por ejemplo, caracoles operculados, estados inmaduros de ciar
tas amas de mayo, (may€lies) moscas pétreas, (stoneflies) €rxgano,(c ddisf ies), escarabajos . de los rabiones (riffle beetles), y larvas
de cQrtdálidoe acuáticos (h ilgrniiimites) son verdaderamente sensibles
a muchos contaminantes . Macroinvertebrados tolerantes a la contarnl
nación, .,tales como gusanos del lodo (sludge worrn, ciertas larvas de
jejenes (gusanos rojos), sanguijuelas, y caracoles pulinonado por lo general crecen en número . bajo condiciones enriquecidas orgánicamente.
Los organismos facultativos, son aquellos que toleran "cantidades" mo
deradas de contaminación, incluyendo la mayoría de caracoles, cochin!
llas y larvas de jején (black fly larvae), Los organismos tolerantes pue
den
ontrarse tanto en lugares limpios corno contaminados de cal mo
do que su presencia no indica si un cuerpo de ama está contaminado . embargo, una población de org .nisnios tolerantes combinados con la ausencla de organismos intolerantes es un buen indice de la presen
cía de contaminación.
Biólogos acuáticos experimentados, a través de estudios cuida
dolos de los tipos de peces, macroinvertebrados, algas y especies de.
bacterias presentes en un sistema receptor, pueden determinar su "sa
Iud" . Este método cualitativo de e valuación, aunque es subjetivo, pro
vee de información rail.
7 .5 .4 .2
Evaluación de datos cuantitativos.
Hay una fuerte tendencia al uso de métodos estadísticos para evaluar y expresar matemáticamente la estructura de la comunidad, -una. respuesta a críticas en cuanto a subjetividad a la mayoría de los es
tudios cuantitativos . Los análisis estadísticos de datos biológicos co-- muninente incluyen determinación de
y uso
la media e intervalo
de confianza
de pruebas tales como, chi-cuadrada, "t" de Students, regresión,
correlación y una o dos formas de análisis de varianza, El uso de ex- presiones matemáticas de la estructura de la comunidad se utiliza para
derivar índices numéricos de la diversidad de comunidades acuáticas
y
están basadas en general, aunque no siempre, en la suposición de que a
mayor sea la diversidad en la vida acuática mayor es la estabilidad es tructural y funcional del sistema y por lo tanto, mayor la salud del . mis
1110 .
Los índices de diversidad son muy utilizados debido a que con- dcnsan considerablemente los datos biológicos en un solo valor numéri co . El uso corriente de los índices de diversidad incluye (diversidad
por, individuo), la cual sigue los conceptos de la teoría de la informa- -
979 -
alón y el ICS (Indice de Comparación Secuencinl) ..
Pire evaluar cstadisticaniente los datos obtenidos en
Lin
estudio
de contaminación, es esencial quitar las fuentes de variabilidad que sc
encuentran comunrnente . La variabilidad en los datos obtenidos de ma
croinvertebrados para evaluar la calidad del agua proviene de mtodüs -
de muestreo y de la distribución de los organismos.
Tal vez,la mejor fuente es maestreando el, error . La distribu ción de los organismos está generalmente agrupada en relación a la - distribución del habitat . Por consiguiente, las muestras tornadas al - azar muestran a mesado alta variabilidad entre las réplicas . Enanâiisis estadísticos de datos cuantitativos se requieren gran náiticro
Lir - -
muestras para detractar estadísticamente diferencias si nifientivas . Se
debe estar ejercitado para usar métodos estadtsUcos paranmétricos debido a que la hipótesis básica de la distribución normal a veces no es verdadera . Existe un peligro en relación a evaluaciones estadísticas para determinar cambios, porque una diferencia estadísticamente sigui
fi.cativa puede o no ser ecológicamente significativa.
7 .5 .4 .3
Presentación de datos.
La presentación de datos en reportes puede tornar tantas formas
como investigadores hay, aunque dentro de la tnayorca de las técnicas básicas usadas están las tablas, barras (verticales y horizontales), día
gramas de pie, cartas ilustrativas (ideogramas), gráficas de líneas, -
418(1 .-
tablas gráficas de distribución de frecuencia, histogramas, polígonos
de frecuencias acumulativas Algunos de estos pueden ser sobrepuestos en mapas .
7 . .; . S
.
Bibliografía.
APÍ A, AWWA, WPCF . - Standard Methods for the Exani nation ()C Water and Wa tccwatcr . - 1.4 t[ Edition . - 1976 .
981-
7 .6 PECES
7 .6 .1. Generalidades
La información de la abundancia ycomposición de las especies
de peces es útil para evaluar la calidad de un cuerpo de agua . Los peces ocupan la cima de la cadena alimenticia (exceptuando la predación
por vertebrados mayores) ; de aquí que su condición constituye la suma
de las condiciones de las formas biológicas menores y es el resultado
de la calidad total del agua . Los factores de la calidad del agua que alteran el balance ecológico piel perifiton, plancton y poblaciones de maxro vertebrados también pueden alterar las poblaciones de peces . Debido a que los peces y los invertebrados tienen diferente suceptibiiidad
a ciertos tóxicos, los peces puede ser afectados por ciertos contaminantes que no causen un cambio demostrable en las comunidades de invertebrados y plantas . Por tanto, es importante muestrear poblaciones
de peces como el producto final de la comunidad acuática . Debido a que
los peces son a bien conocidos y tienen también un valor económico,
son el símbolo más mntelegible de calidad del agua para el público en ge
neral y dn considerarse de gran importancia para propósitos de relaciones públicas como para interpretaciones técnicas.
Donde existen pesquerías comerciales, debe considerarse al personal de pesca y al equipo, especialmente para estudios de corta duración . f,os datos de captura de peces también pueden utilizarse pa-
la dciei-minar algunos cambies ta largo plazo de la culi dad del
7 .6 . 2 Toma de Ja muestra y preservación
Un estudio de peces debe contener información de los tipoi de
peces presentes y de su abundancia relativa . Un estudio a corto tiempo puede proveer información acerca de las especies de peces presentes en un cuerpo de agua . Esto puede ser suficiente, por ejemplo, cuan
do se esta investigando la muerte de muchos peces, pera en muchos
ríos y lagos los cambios en las poblaciones de peces son muy sutiles y
y
deben determinarse a través de estudios a largo plazo.
Cuando se planee el uso de piseicidas en estudios de campo,
be tenerse
1nmi :C10
cuidado, ya que el vertido de sustancias tóxica'
die
5n
cualquier cuerpo de agua está estrictamente regulado.
Los peces deben ser muestreados por una variedad de métodos
tales como el de red barredora (chinchorro), con trampas, con red
rastreadora b por . medio de agentes químicos . Para obtener datos representativos mues 'trear en áreas diferentes y escondidas tanto corno
en lugares comunes . Los huevos y larvas de muchas especies de peces
pueden encontrarse en el plancton . Usar redes de arrastre para los
peces del fondo ;'redes barredoras para maestrear en ranuras y lugares profundos ; para peces en cuerpos de agua abiertos, usar diferentes
tipos de redes y para especies migratorias se deben usar trampas .
-98-
MLIestrear a todas las profundidades, no sólo la superficie y el fondo ..
1 .as rocas y otros tipos de obsrruec.ionc se naue i rcun i nc.I o u s ntk) agentes culi;-ieos.
Las observaciones visuales realizadas por personal entrenado
son Cambien muy útiles.
Algunos métodos de muestreo dp peces tales como las redes de
arrastre y trampas deben utilizarse en la noche ya que muchas especies de peces son sedentarias durante las horas de luz.
7 .6 .2 .1 Dispositivos de Muestreo
Los dispositivos comunmente usados para muestreo de peces son los siguientes:
a) Red barredora o "Chinchorro", se usan para atrapar peces
de aguas someras . En pequeñas corrientes se utilizan "chinchorros"
de varías longitudes . 1 .2 m 6 mayores, con abertura de malla de
3,
6.
á 12 mm, En las orillas de lagos y ribs grandes es mas efectivo utilizar "chinchorros" con una bolsa . Hay dos tallas comunes de ellos, uno
de 7 .5 m de largo y 1 .8 nx de profundidad, con la porción central hecha
con malla de 12 .6 mm de abertura . El centro es una bolsa grande de
hecho con malla de 6 mm de abertura . El otro tamaño, para
peces grandes, es de 30 r de largo y 1 .8 ó 2 .4
n1
de profundidad, con
abertura del 2 .5 a 5 can de abertura en el cuerpo principal de la red y
12 a 25 mm de abertura de malla en el centro de la bolsa . Cuando exis
ten ramas o protuberancias en un cuerpo de agua,el uso de estos iisp i( .ivos reo es muy exitoso . Sin embargo los resultados se expresan eorno número de peces por unidad de área barrida, puesto que un barrido
cuantitativo es muy dificil . El procedimiento es más usado para determinar la variedad de peces que habitan en un cuerpo de agua, que para
muestreo cuantitativo.
b) Redes agalleras (fig .7 .6-I) se usan en estuarios, lagos, embalses o grandes ríos, donde pueden esperarse movimientos de peces .
La red agallera experimental más versátil es de 38 .m de largo, tiene
cinco secciones de 7, 5'con mallas de 19 a 62 mm d abertura ; los resultados se expresan como ndrncro o peso de pez atrapado por el largo
de la red por día.
c) Redes sobrepuestas (fig .7 . . -Il) Estará formados por una capa de malla grande en ambos lados de una pequeña red agallera . Los peces pequeños son capturados en la red agallera y los grandes . son cap
turados en una bolsa-que forma la red agallera con la malla de tamaño
ancle . Los resultados se expresan como número o peso de pez captu
ralo 'por largo de la red y por día.
d) Trampas . - Varían en tamaño, . de pequeños-recipientes con
un cono invertido en la entrada, a estructuras semi permanentes (esclu
sas) (figura 7 .6-111) . Las trampas y esclusas de red son muy usadas
en ríos y estuarios .
Trampas de red, cuando los movimientos de los peces a inter ceptar están localizados, pueden usarse eficazmente para muestrear
Poblaciones de peces en lagos durante ciertas estaciones . La trampa
de red más usada en estudios de peces es la red de aro redondo o cuadrado . Esta red puede tener plomos o aletas sujetas al primer armaón . El segundo y tercer armazón pueden tener cada una, un t/nel estrecho que previene la huida de los peces que han entrado er g cada sec ción . El lado opuesto (cerrado) que es el final de la red puede amarrar
se con una cuerda deslizable para facilitar la extracción de los peces
Los resultados se expresan corno peces por red por día . La mayoría
de los peces pueden mLiestrearse colocando trampas de red de varias
pedidas de malla en varios habitare.
e) Redes de arrastre,- Son instrumentos especializados usados
en grandes áreas de agua? abiertas de represas, lagos, ,randee ríos,
estuarios y áre s marinas alejadas de la costa . (fig . 7 .6-IV) . Se usan
principalmente para obtener información sobre una especie de pez par 1:ieular
Los tres tipos básicos de redes son : la red para pececillos,
con una abertura permanente ; la red de nutria se usa para capturar i ces que viven cerca del fondo y en él ; y la red de profundidad-media, usada para recolectar cardúmenes a varías profundidades .
- 986 -
1
I i'i
7 .( } diferentes tipos de redes . -t ,) Red a gallera, II) Red
sobrepuesta . [O) trampa y IV) Red de arrastre .
1) Dispositivos el crric os para pesca- ; son efectivos para r.eco
lector la mayoría de las especies y tamaños de peces de diferentes medios ambientes . Estos dispositivos variar en tamaño y complejidad . 1
queñas corrientes pueden estudiarse con solo dos personas, una asando
la caja de descarga y la otra sacando a los peces . En ríos y lagos gran
des se requiere un generador y. un equipo de control eléctrico para obre
ner resultados satisfactorios . El estudio de un río grande requiere varios hombres, pero la pesca eléctrica ofrece la ventaja de estudiar una
porción pie agua en corto tiempo y no tener que abandonar el equipo caro,
que puede perderse, como sucede en el caso de las redes . Los disposi
tivos para aplicar las descargas pueden instalarse en botes para muestreo en áreas bajas, La pesca con dispositivos eléctricos puede verse
limitada por la conductancia,turbiedad y profundidad del agua . El € zues
Creo es más eficiente en la noche, pues entonces pueden usarse luces submarinas . Pueden tenderse redes para delinear el área de muestreo
así como para evitar que el pez escape del campo eléctrico.
g) Substancias químicas .- Tales como la rorenona, a menudo se utilizan para recolectar peces de una área restringida . Esta técnica de muestreo se usa generalmente, dependiendo de la localización, en
un tramo corto de río o en una ensenada o bahía de un lago . Los resul
Lados se expresan como peces por unidad de área superficial niuesirea
da,
Ii) Pa1augr , (oIL1el :°la r:g .,-y grueso del que ,penden ramales
con anzuelos, . para Pesca' en . sit-ios 'muy
profundos en donde no es p i.
blu hacerla con red) puede usarse para mu strear una porción de la k blaci6n de peces . Estos . dispositivos se usan principalmente para mues
crear peces que se alimentan n la noche.
1) Tubos de succión o mangueras, las cuales son efectivas para
remover huevos pececillos de los nidos del fondo . El estudio de la
viabilidad de huevos de peces es importante debido a que el "estado de
huevo" es el estado más crítico en el ciclo de vida de un pez.
7 .6 .2 .2 F-o edlm intbs .
1_as obsrvaclones por personal experimentado pueden proveer
mucha información sobre las poblaciones y los habitats ,de peces . Tales observaciones puedn . incrernentarse a través del uso de equipo corno televisión submarina . o cámaras fotográficas, equipo de buceo, o bien un recipiente sumergible.
Preserve el pez en el campo tan pronto como sea posible, despuós de la recolección .
van aan lizarse, el 'mismo dfa, congelarlo
es suficiente . En Casó contrario se preserva con formalina al 10%, a
la cual se le ha afladido 3 g de bórax y 50 ml de glicerina por litro de formalina . Abrir la cavidad del cuerpo del pez 7 .5 cm para preservar
rápidamente losÓrganl s. int rnos . . Al renos hacer una incisión de un
tercio a'lo largo de la cavidad del cuerpo en el lado derecho del pez .
- 98 9 -
I g qulls do la iijaeión ( .1 .
Jt
7 días
ddepC't14 .dieInd
de la Talla), lavar
lo en agua k•.orrlente o en varios cambios de agua por 24 horas y guardar
lo en alcohol isopropilico al 40%.
Colocar marbetes dentro y fuera del recipiente que contenga la
Muestra . Usar papel y tinta a prueba de agua o bien lápiz de grafito.
Los rótulos deben contener la siguiente información ; estación, localiza
ción, fecha, muestreador, instrumentos usados, etc.
Las notas de campo deben tomarse para describir la estación y
proveer otra información necesaria para interpretar los datos obtenidos
de la muestra.
7 .1 .3 Análisis de la muestra
Identificar las especies de todos los peces . Los reportes preparados para personas que no trabajan en el campo ., deben incluir el nombre común de- los peces.
Determinar el peso en gramos y largo total erg centímetros de
cada pez . El largo total se define como la distancia que va de la parte
anterior (con la boca cerrada) al extremo de las aletas caudales.
Edad y grado de crecimiento son dos puntos muy utilizados para
determinar ]os efectos de la calidad del agua en las poblaciones de peces, Los métodos para estas mediciones incluyen a) método frecuencia-longitud b) métodos para otolitos y huesos y e) el método de escama . Se agrupan las longitudes de peces jóvenes (tallas) pe=rTniE .iendo la
separación en edades ,.
c1iñbargo a medida que el pez crece, s ki
sificación por edades . generalmente es menos distintiva . La edad del
pez puede también estimarse contando los anillos de crecimiento anual
en cada hueso, en . las espinas de la vértebras de las aletas, opérculos
y escamas . El método de las escamas es el
nys ampliamente utilizado.
El coeficiente de condición es la relación peso-longitud usada
para expresar la corpulencia relativa o robustez del pez, la cual está
relacionada a condiciones del medio ambiente . La ecuación general es;
= Wx 1O
3
Don de
I = Coeficiente de condición (o factor)
Pesó en g
L = Longitud en mm
La salud en general y el bienestar de un pez tiene influencia en
su respuesta a la contaminación ; así mismo, niveles subletales de con
taranación ': uederi afe târx la .salud del ti'.y su
re ;i t i crn ._ a enfermeda
des . Las epidemias naturales y debilidades de muchos tipos aparecen
entre los peces como entre todos los grupos de organismos . Los peces
deben examinarse previamente en cualquier estudio de calidad de agua
para asf tener presente .su estado general,' parásitos y otros factores
que podrían acentuar o enmascarar los efectos de la contaminación,
- 991.--
Parásitos ; particularmente los parásitos externos fijos tales co
neo copépodos o sanguijuelas, generalmente pueden detectarse examinando la superficie de peces vivos o recientemente muertos en el campo amplio d& microscopio
ice
disección . Examinar, a mayor aumento,
limo raspado de la superficie del cuerpo o de áreas de acumulación alrededor de branquias el cual puede revelar pequeños parásitos externos . Las cicatrices por lampreas pueden aparecer corno rodetes enro
jecidos o áreas con cicatrices viejas de 2 o más cm de diámetro . Arcas
inflamadas o entumecidas, aletas desgastadas, o alguna otra indicacivn
aparente de invalidez . pueden ser visibles externamente y deben reportarse . Los parásitos internos y otros agentes patológicos pueden descu
br irse por microtcnicas apropiadas . Para la identificación de condiciones patológicas, debe conrarse con un laboratorio especializado en este campo.
Cuando se .sospecha una toxicidad crónica o cuando se noca algu
na debilidad o condición penosa en el pez deben hacerse pruebas histo lógicas, fisiológicas vo biockuimicas.
La carne es a menudo no comestible debido a las , ustancias qui
micas presentes en el agua, Muchas de estas sustancias que producen
sabores provienen de los desechos industriales o municipales, sin em bargo fuentes naturales también contribuyen a esro . El análisis organold.piico ha sido el método más útil para detectar carne de pescado - .
eontaiuiLmda . El pez t prueba puede
Lc ;i-
nativo de la c•orrina le,
eKI
Ix,z no contaminado se retiene por medio de jaulas en el área cie prueba
o bien se mantiene en tanques, con el contaminante a probar . Las per
lonas que realicen ésta prueba deben entrenarse para degustar peces y
etc esta manera obtener buenos resultados.
7 .6,4 Producción y Productividad
La producción ea un cuerpo de agua es buena indicadora de su
caij IriLL, 1 .a co x ipo ieión de especies de la comunidad 'carera de pecas
debe ser considerada corno la cantidad relativa de cada especia . La productividad en pesquerías incluye los siguientes conceptos:
Productividad : El grado al cual un cuerpo de agua es capaz de
producir biomasa de peces (generalmente libras/acre/arto).
Producción: La cantidad real (peso) producida en una unidad dd
tiempo (libras /año)
Cultivo estable .- Es la cantidad de peces presentes en un tiem
po dado (generalmente libras/acre) . Esta cantidad puede reportarse como el total para todas las especies o bien el agotamiento del peso real o relativo de cada uno .
Cosecha . - La cantidad de pescado recolectado por el hombre
(l.il ras/año o libras/acre'/añb . '
7,6 .5 Investigación de la mortandad de peces
Existen varias causas que originan la muerte de un pez (la edad
993 -
o la muerte debida a un accidente) de varios o de todos y pueden ser
naturales o causadas por el hombre .
La muerte de peces puede originarse por fenómenos naturales
tales como cambios de temperatura, tormentas, hielo y nieve, descorn
posición de materiales naturales, cambios en la salinidad, mortalidad
en los desoves, parásitos y epidemias producidas por, bacterias o virus.
Los originados por el hombre son los atribuidos a desechos industriales o municipales, actividades agrícolas y actividades para el control
del agua.
Un pez muerto en una corriente puede indicarnos mortandad de
peces ; sm embargo, en un sentido más práctico, para reportar rnortan
dad de peces se debe observar un ámbito mínimo en el número de peces
muertos y otros datos adicionales . Cualquier mortandad es s .inificativa si afecta la pesca deportiva o de valor comercial, si . resulta de una
descarga ilegal o debidas al mal funcionamiento de una planta de tratamiento, o se provoca un darlo al medio ambiente . Las siguientes defini
eiones, basadas en una corriente de 60 m de ancho por. 2 de profundidad,
se sugieren como gufas.
a) Mortandad menor .- De 1-100 peces muertos o moribundos confinados a un área pequeña . Si es recurrente puede ser si,ificativa
debe investigarse.
b) Mortandad moderada .- de 100 - 1000 peces de varias espe-
- .94 -
cíes; en un airea de 15110 w o más de t r i n a eorricnie, lago o v: 1Lr.ario.
c) Mortandad mayor . - 1000 o más peces de muchas especies
muertos o moribundos en una corriente de 16 Knn o mayor o un área equivalente de un lago o estuario.
Para preparar una investigación de campo se deben estudiar los
mapas de la región y determinar el área de mortandad y sus accesos.
Identificar fas descargas de desechos, discutir con el personal de los laboratorios el número y tamaño de las muestras que se deben enviar,
los tipos de análisis requeridos, las fechas de recepción de muestras,
las fechas de embarque, la fecha para la cual se necesitara los resultados y a quién se van a reportar esos resultados.
Dos formas para anotar la información se recomiendan para este trabajo, una forma inicial de contacto con el problema y otra para investigaciones de campo.
En todas las investigaciones contar con un termómetro, equipo
para 017, conductimetro y potenciómetro : o un equipo general de quíri
ca, inuestreadores biológicos, botellas de muestreo y otro tipo de aten
silfos . El grupo de investigadores debe incluir al menos una persona
experimentada en mortandad de peces.
La investigación de campo consiste de observaciones visuales.
muestreo de peces, agua, biota, y mediciones físicas del medio arnbien
te . El primer observador local preparará una guía del área, la cual
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deberá ayudar inicialmente a establecer qué peces han muerto en- realidad .
Si una mortandad aparece en un lugar, inmediatamente comenzar con cl muestreo de peces desde la recolección de los moribundos
o de los muertos recientemente . Para propósitos de comparación reco
lectar peces de un área 'no afectada.
Colocar individualmente a los peces en bolsas de plástico debida
mente etiquetadas y preservar por congelación hasta que el pez pueda
examinarse en ci laboratorio . Desangrar a los peces moribundos o muer
tos durante la recolección hasta obtener por lo menos un ramo de san
gre . Colectar la muestra de sangre en una botella de vidrio lavada con
solvente y cerrarla con un tapón de rosca recubierto de teflón.
Identificar y contar los peces muertos . En un río grande un observador puede contar a los peces muertos desde una estación ya fijada,
corno podría ser un puente, y durante un periodo de tiempo preestablecido . Las extrapolaciones pueden hacerse en relación al tiempo total
utilizado . Alternativamente, en un lago o río grande, puede hacerse
un contco desde la orilla y proyectarlo al área completa . En pequeños
cuerpos de agua recorrer toda el área, para enumerar a todos los pe'.ces muertos.
Recolectar muestras de agua representativas de áreas contami
nadas y no contaminadas en concordancia con las instrucciones dadas
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en la sección correspondiente a plancton . Como mínimo determinar
tcmperatura,pH, OD y conductancia específica . Se pueden efectuar al;unas pruebas adicionales dependiendo de las causas por las que se sos
pecha la muerte de los peces . Tomar muestras para el exámen de planc
ton, perifiton, macrofiton y macroinvertebrados.
Anotar las observaciones referentes a la apariencia del agua, flujo de la corriente y condiciones ambientales . Puede ayudarse para esto tomando fotografías a color.
7 .6 .5 Bibliografía
API-JA, AWWA, WPCF . - Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater . - 14th Edition . - 1976 .