Tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA
Facultad de Medicina
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL
GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Tesis que para obtener el grado de:
Doctor en Ciencias Médicas
PRESENTA
MC GABRIEL CEJA ESPIRITU
ASESOR:
D. en C. LUZ MARGARITA BALTAZAR RODRÍGUEZ
D .en C. IVAN DELGADO ENCISO
Colima, Col., marzo 2009
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
DEDICATORIAS
A mis Padres: ¡Cuan grande riqueza es, aun entre los pobres
El ser hijo de de unos BUENOS padres! Gracias Angelina y
J. Guadalupe.
A mi Esposa Patricia, por su paciencia y comprensión
por estar a mi lado en las buenas y en las malas, por su
amor incondicional y ser el pilar de nuestra Hogar
A mis hijos Carlos Gabriel y Kristian Alexander:
Son el motor que me impulsa a seguir adelante,
Gracias por ser como son, y permitirme ser
parte de ustedes.
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AGRADECIMIENTOS:
A mis asesores: Luz Margarita Baltazar Rodríguez e Iván Delgado Enciso, quienes con
Paciencia y sabios consejos, hicieron de estos 2 años una diversión mas que un trabajo,
Gracias, por hacerme el camino mas agradable.
A los pacientes: De quienes aprendemos día a día, Gracias por su colaboración y
permitirnos tratar de entender un poco más sobre las enfermedades que aquejan a la
Humanidad.
A Mario Ramírez Flores quien con paciencia, y entrega, me enseñó las herramientas
necesarias, en el manejo del laboratorio de biología molecular y aportó su granito de
arena para la realización de este trabajo. Gracias
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INDICE
Contenido
Página
Indice
A
Abreviaturas
C
Tablas
D
Figuras y gráficas
E
Resumen
1
Summary
2
Marco Teórico
Antecedentes
a) Definición
3
b) Aspectos epidemiológicos
3
c) Fisiopatología
4
d) Etiología y factores de riesgo
5
e) Manifestaciones clínicas
6
f) Clasificación
7
g) Diagnóstico
7
h) Tratamiento
9
i) Diagnóstico diferencial
12
j) Ateroesclerosis
12
k) Inicio de la ateroesclerosis
14
l) Síndromes clínicos de ateroesclerosis
16
m) Lipoproteínas
16
n) Lipoproteínlipasa
18
ñ) Polimorfismos de lipoproteínlipasa
20
o) EVC y lipoproteínas
23
Justificación
25
Planteamiento del problema
25
Hipótesis de trabajo
25
Hipótesis nula
25
Objetivo General
26
Objetivos específicos
26
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Definición de variables
26
Material y métodos
27
Criterios de Selección
28
Descripción general del estudio
28
Tamaño Muestral
30
Análisis estadístico
31
Consideraciones eticas
31
Resultados
32
Discusión
37
Conclusiones
38
Perspectivas
39
Referencias bibliográficas
40
Anexos
46
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ABREVIATURAS UTILIZADA
EVC
Enfermedad vascular cerebral.
IMSS
Instituto Mexicano del Seguro Social.
ATP
Adenosín 5´ trifosfato.
ATPasa
Adenosín trifosfatasa.
LCR
Líquido cefalorraquídeo
DHL
Lactato deshidrogenasa. VCAM-1, ICAM-1, IL-1, TNF-ALFA,
HDL
Lipoproteína de alta densidad
LDL
Lipoproteína de baja densidad
ADN
Ácido desoxiribonucleico
VLDL
Lipoproteina de muy baja densidad
KB
Kilobase
C
Citosina
G
Guanina
TCA
Timina-citosina-adenina
TGA
Timina-guanina-adenina
POVPC
Palmitol-oxovaleroil-glicero-fosforil colina
PGPC
Palmitol-gloutaroil-glicero-fosforil colina
PEIPC
Epoxiisoprostano E2 –glicero-fosfocolina
IMC
Indice de masa corporal
UI
Unidades Internacionales
TPT
Tiempo Parcial de Tromoplastina
mg
Miligramos
kg
Kilogramos
h
Hora.
EC
Colesteril éster
LPL
Lipoproteínlipasa
CML
Células músculo liso
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TABLAS
Contenido
Tabla I Distribución por grupo etareo de
Página
4
mortalidad por EVC
Tabla II Clasificación de la EVC
7
Tabla III Estudios para evaluar pacientes
8
con EVC
Tabla IV Estudios de Gabinete para
8
determinar tipo de EVC
Tabla V Diagnóstico diferencial de EVC
12
Tabla VI Iniciadores, enzimas de
29
restricción y amplificado
Tabla VII Características de los pacientes
32
grupo control y EVC
Tabla VIII Distribución del polimorfismo,
36
genotipo en controles y casos, valor de p y
OR
Tabla IX Riesgo (OR) ajustado de los
genotipos de los polimorfismos T495G,
N291S y D9N
36
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Figuras y Gráficas
Contenido
Página
Figura 1 Estructura de las lipoproteínas
17
Figura 2 Estructura del gen de la LPL
19
Gráfica 1 Distribución genotípica T495G
33
Gráfica 2 Distribución genotípica N291S
34
Gráfica 3 Distribución genotípica D9N
35
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RESUMEN
Introducción: La etiología de la enfermedad cerebrovascular es heterogénea y el
factor genético contribuye de manera individual en este padecimiento. El gen de la
lipoproteínlipasa humana se localiza en el cromosoma 8p22. El polimorfismo T495G,
N291S y D9N se asocia con elevación de los niveles de triglicéridos, baja de los niveles
de colesterol HDL y por consiguiente con la enfermedad arterial coronaria.
Objetivo: Determinar si los polimorfismos del gen de la lipoproteínlipasa T495G
(G/G+T/G), N291S (G/G+A/G), D9N (A/A+G/A) están asociados al desarrollo de
infarto cerebral
Material y métodos: Se analizaron 120 pacientes sin infarto cerebral y 100 pacientes
con infarto cerebral y se determinaron la frecuencia de los polimorfismos T495G,
N291S, D9N, las frecuencias genotípicas y alélicas se obtuvieron por el método de
conteo y cálculo de porcentaje.
Las frecuencias genotípicas de cada polimorfismo se compararon con las proporciones
esperadas por la Ley de Hardy-Weinberg. Cada polimorfismo cuenta con 3 genotipos
posibles, pero para su análisis, cada polimorfismo se dividió en 2 grupos; genotipos con
alelo de riesgo (según estudios previos) vs genotipos sin alelo de riesgo, y se
distribuyeron de la siguiente manera T495G (GG+TG vs TT), N291S(GG+AG vs AA),
D9N(AA+GA vs GG).
Resultados: Se realizó análisis estadístico con
X2 no encontrándose diferencia
estadística. Los grupos que fueron diferentes en alguna variable de confusión, el OR se
ajustó mediante posestratificación con la prueba de Mantel-Hanzel usándose el
programa SPSS.
Conclusiones: En este estudio muestra que ningún genotipo de los polimorfismos
T495G, N291S, D9N se asocia a infarto cerebral, en nuestra población
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SUMMARY
Introduction: The etiology of the cerebro-vascular disease is heterogeneous and the
genetic factor contributes in an individual way in this suffering. The gene of the human
lipoprotein lipase is located in the chromosome 8p22. The polymorphism T495G,
N291S and D9N associates with increase of the levels of triglyceride, goes down the
levels of cholesterol HDL and consequently with the arterial coronary disease.
Objectives: To determine if the polymorphism of the gene of the lipoprotein lipase
T495G (G/G+T/G, N291S (G/G+A/G), D9N (A/A+G/A) are associated with the
development of cerebral attack
Materials and methods: 120 patients were analyzed without cerebral heart attack and
100 patients by cerebral attack and they determined the frequency of the polimorphisms
T495G, N291S, D9N, the frequencies genotypes and allele they were obtained by the
method of count and calculation of percentage. The frequencies genotypes of every
polymorphism were compared with the proportions waited by Hardy Weinberg's Law.
Every polymorphism relies on 3 possible genotypes, but for his analysis, every
polymorphism divided in 2 groups; genotypes with alello of risk (according to previous
studies) vs genotypes without alello of risk, and GG was distributed of the following
way T495G (GG+TG vs TT), N291S (GG+AG vs AA), D9N (AA+GA vsGG).
Results: statistical analysis was realized with X2 not being statistical difference. The
groups that were different in some variable of confusion, the OR adjusted by means of
posestratification with Mantel-Hanzel's test there being used the program SPSS.
Conclusions: In this study it shows that no genotype of the polimorphisms T495G,
N291S, D9N associates to cerebral attack, in our population
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ANTECEDENTES
EVENTO VASCULAR CEREBRAL
a) Definición
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Enfermedad Vascular Cerebral
(EVC) se define como un síndrome clínico caracterizado por el rápido desarrollo de
síntomas y/o signos correspondientes usualmente a afección neurológica focal, y que
persiste más de 24 horas, sin otra causa aparente que el origen vascular
(1,2)
. La diversa
sintomatología y evolución presentadas por el EVC dependen de la etiología, severidad
y amplitud de la región cerebral afectada. Los pacientes que sobreviven a un EVC
afrontan serias dificultades -tanto sociales como financieras- derivadas de la pérdida en
su capacidad para caminar ó hablar y del deterioro de la autonomía en su cuidado
personal (3) .
b) Aspectos epidemiológicos
Existen de 1.5 a 4 casos de EVC por cada 1000 habitantes en el mundo por año, con
pequeñas variaciones en cada comunidad, y una prevalencia de 8 a 20 por 1000
personas de la población (4)
El EVC es la tercera causa de muerte en Estados Unidos de Norteamérica y la principal
causa de secuelas neurológicas en poblaciones industrializadas
(2,5)
. Puede causar la
muerte en 20 a 30% de los casos o producir secuelas neurológicas en 60% de estos
(3)
.
Se calcula que se presentan 500, 000 casos de EVC al año en el mundo.
En los países occidentales la isquemia y el infarto cerebral constituyen el 85 a 90% de
todo el grupo de EVC. Diez a 15% de los casos de EVC son hemorragias intracraneales;
pero en regiones como Asia las hemorragias constituyen un porcentaje mayor (6).
En México, a partir de 1970, el EVC se ha registrado dentro de las 10 principales causas
de muerte (séptima causa en esa década) con una tasa de 24.7 defunciones por cada 100
000 habitantes. En 1980, el EVC fue la sexta causa de mortalidad (tasa de 21.8 por cada
100 000 habitantes). Durante la actual década, el EVC se ha mantenido entre la sexta y
séptima causa de mortalidad (1,7).
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En el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), las enfermedades cerebrovasculares
ocuparon el cuarto lugar como causa de muerte (tasa de 23.48 por 100 000
derechohabientes usuarios) durante 1997
(8)
. La tasa de mortalidad por grupo etáreo se
observa en la tabla I.
Tabla I. Distribución por grupo etáreo de la mortalidad por enfermedad
vascular cerebral en el IMSS durante 1997.
Grupo etáreo
Lugar que ocupa el EVC como
Tasa *
(años)
causa de muerte
14 a 24
Noveno
1.6
25 a 34
Octavo
2.1
35 a 44
Sexto
6.6
45 a 54
Quinto
20.6
55 a 64
Quinto
51.0
> de 64
Cuarto
199.9
*por 100 000 derechohabientes usuarios.
Fuente: División de Informática. Coordinación de Salud Comunitaria. IMSS México.
En la Delegación Regional IMSS, Colima, el EVC ocupó el 5º lugar como causa de
mortalidad (tasa de 13.45 por 100 000 derechohabientes usuarios) (9) durante 1998.
c) Fisiopatología
El EVC puede ser debido a un proceso intrínseco del vaso sanguíneo, como:
arteriosclerosis, lipohialinosis, inflamación, formación amiloidea, disección por
traumatismo o espontánea, malformaciones en el desarrollo y dilatación aneurismática.
El EVC puede comenzar en un sitio remoto, como ocurre cuando un émbolo del
corazón o de la circulación extracraneal se aloja en un vaso intracraneal; dando como
resultado las causas previamente mencionadas y con ello un inadecuado flujo sanguíneo
al tejido cerebral. Todo lo anterior pone en riesgo la integridad neuronal al no recibir
los requerimientos metabólicos necesarios para su viabilidad (10).
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d) Etiología y factores de riesgo
Las causas más frecuentes de la enfermedad cerebro vascular son:
1. Trombosis arteroesclerótica.
2. Hemorragia cerebral hipertensiva.
3. Crisis isquémica transitoria.
4. Embolismo.
5. Rotura de aneurismas o malformación arterio-venosa (MAV).
6. Vasculitis.
7. Tromboflebitis.
8. Alteraciones hematológicas (policitemia, púrpura trombocitopénica).
9. Traumatismos de arteria carótida.
10. Aneurisma aórtico disecante.
11. Hipotensión sistémica.
12. Jaqueca con déficit neurológico.
Los factores de riesgo más frecuentes de enfermedad cerebro vascular son:
1.Hipertensión arterial-factores cardiacos.
2.Diabetes.
3.Obesidad e inactividad física.
4.Adicción a drogas.
5.Hiperhomocistenemia.
6.Fibrinógeno elevado.
7.Raza inespecífico
8.Factores hereditarios.
9.Anticuerpos antifosfolípidos.
10. Placas ulceradas en la aorta.
11. Tabaco- Alcohol.
12. Anticonceptivos orales.
13. Crisis isquémicas transitorias.
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e) Manifestaciones clínicas
La característica clínica más importante de las enfermedades cerebrovasculares es su
perfil temporal. Una de las manifestaciones más frecuentes de este tipo de enfermedad
es la hemiplejia. Esto, al igual que cualquier otro tipo de déficit neurológico producido
por un EVC, también puede ser causado por otras enfermedades (tumores, abscesos
cerebrales, enfermedades desmielinizantes, trastornos endocrinos y hemodinámicos). Lo
característico de las enfermedades cerebrovasculares -y que orienta al médico clínico en
su diagnóstico- es el comienzo súbito y la rápida evolución del cuadro clínico. El déficit
motor que ocasiona el EVC se expresa al máximo en segundos, minutos, horas o en
unos pocos días. De esta evolución tan aguda es de donde deriva el nombre "accidente"
que se aplicaba al EVC (11).
Los síntomas y signos más orientadores de la enfermedad cerebro vascular son:
1.Déficit motor.
2.Déficit sensitivo.
3.Déficit motor y sensitivo.
4.Otras alteraciones motoras (ataxia, incoordinación, temblor).
5.Alteraciones del lenguaje.
6. Disfunciones corticales (amnesia, agnosia, apraxia, confusión, demencia).
7.Vértigo, mareos.
8.Crisis epilépticas.
9.Alteración del sensorio.
10. Cefalea.
11. Náuseas y vómitos.
12. Signos meníngeos.
13.Otros: signo de Babinski y signos de descerebración o decorticación.
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f) Clasificación
La enfermedad cerebro vascular se pueden clasificar desde un punto de vista anatómico,
fisiopatológico y etiológico, tal como se muestra en la tabla II. (1) .
Tabla II. Clasificación de la enfermedad vascular cerebral.
ARTERIAL
Isquémica
Isquemia cerebral transitoria
Infarto cerebral
Aterotrombótico
Embólico
Hemorrágica
Intracerebral o intraparenquimatosa
Subaracnoidea
VENOSA
Infarto venoso
Fuente: El internista, tercera edición 2008 McGraw-Hill Interamericana volumen II sección XI
179
La Organización Mundial de la Salud excluye como EVC a la isquemia cerebral
transitoria, hematoma subdural y a la isquemia cerebral secundaria a procesos tumorales
e infecciosos (10) .
g) Diagnóstico
La evaluación inicial de un paciente con sospecha de EVC, debe incluir un examen
clínico neurológico completo y además debe incluir lo señalado en la tabla III (12) .
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Tabla III. Estudios necesarios en la evaluación inicial del paciente con
EVC.
Biometría hemática, cuenta plaquetaria, tiempos de coagulación, fibrinógeno,
Electrolitos séricos, glucosa, pruebas de funcionamiento renal y hepático.
Gasometría arterial
Electrocardiograma
Radiografía de tórax
Tomografía computarizada de cráneo
Fuente: El internista, tercera edición 2008 McGraw-Hill Interamericana volumen II sección XI
179
Estos estudios se realizan a fin de determinar no sólo el estado clínico actual, la posible
causa y complicaciones; permiten también determinar si el evento corresponde a un
proceso isquémico o hemorrágico. Esto es importante porque el abordaje terapéutico y
el pronóstico son distintos. Del l5 al 30% de los pacientes fallecen cuando se trata de
lesiones isquémicas y del 31 al 58% fallecen cuando es una lesión hemorrágica (12).
Para establecer el diagnóstico diferencial entre la enfermedad cerebrovascular
isquémica o hemorrágica, actualmente se cuenta con diversos estudios (ver tabla IV).
Tabla IV. Estudios de gabinete que permiten determinar el tipo de EVC.
Ultrasonido doppler de onda pulsada
Tomografía axial computarizada de cráneo
Tomografía con emisión de positrones
Resonancia magnética nuclear
Arteriografía
Fuente: El internista, tercera edición 2008 McGraw-Hill Interamericana volumen II sección XI
179
Cabe destacar que desafortunadamente, estos recursos no están disponibles en la
mayoría de las unidades clínicas de segundo nivel del IMSS. En nuestro medio, se
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cuenta solamente con la tomografía axial computarizada, la cual tiene dos
limitantes:
a) Sólo puede demostrar hipodensidades en el 20% de los casos iniciales de isquemia
cerebral (1,3).
b) Requiere esperar, para su realización, un mínimo de 48 horas de evolución cuando el
infarto ya está establecido para poder hacer la diferenciación entre evento isquémico o
hemorrágico (4,7).
Sin embargo, es importante definir -lo más tempranamente posible- el diagnóstico entre
estos dos eventos, a fin de evitar la progresión del daño neuronal y tratar de establecer
medidas tendientes a restablecer el aporte metabólico a la región afectada y áreas
circunvecinas.
h) Tratamiento
Por otro lado, el tratamiento del EVC isquémico en la fase aguda es controvertido
debido a la falta de evidencia convincente de la existencia de algún fármaco que afecte
significativamente su evolución. Se recomienda por tanto, mantener permeable la vía
respiratoria, sobre todo en pacientes con importante afección del estado de alerta. El
oxígeno sólo se utiliza en caso de que descienda sus niveles y, en complicaciones
respiratorias o cardiacas. En pacientes con estado de coma, deberá colocarse una sonda
nasogástrica para
evitar la regurgitación
de contenido
gástrico
y posible
broncoaspiración, así como mantener el balance hidroelectrolítico, puesto que
la
adecuada hidratación disminuye la viscosidad sanguínea. Otra medida recomendada es
mantener la presión arterial apropiada.
Las crisis convulsivas pueden tratarse con difenilhidantoína,
iniciando por vía
intravenosa a dosis de 15 mg/kg/h, y continuando con 7 mg/kg repartidos en 3 dosis.
El tratamiento para recuperar el flujo sanguíneo cerebral regional (reperfusión), consiste
en disolver el tromboémbolo arterial mediante el empleo de fibrinolíticos. Para este
propósito los fármacos más utilizados son los heparinoides y glucuronados, que tienen
actividad antitrombótica. Estos impiden que el coágulo aumente de tamaño. Su
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actividad se observa por la medición del tiempo parcial de tromboplastina (TPT). Los
heparinoides tienen una actividad selectiva contra el factor Xa.
La estreptocinasa, urocinasa y el activador del plasminógeno se han utilizado como
fibrinolíticos en la enfermedad vascular cerebral. Los estudios realizados con estos
fármacos señalan una reducción del deterioro clínico en 56% y de la muerte en 74%. La
administración intraarterial requiere confirmar el diagnóstico de oclusión por
angiografía. La recanalización del vaso se observa hasta en 61% de los casos. La dosis
de urocinasa o estreptocinasa es de 100 000 UI/h/ en cuatro horas. El activador del
plasminógeno se administra a una dosis de 0.89 a 0.95 mg/kg en 60 a 90 minutos. El
tratamiento se inicia a las seis horas de instalado el episodio.
En la fase subaguda, el tratamiento está encaminado al uso de anticoagulantes,
especialmente la heparina. Esta no debe de administrarse a pacientes que tengan alguna
contraindicación (conversión hemorrágica en la tomografía, hipertensión no controlada
o hemorragia). La dosis utilizada es de 800 a 1 000 UI/hora (8 – 10 mg) en venoclisis
continua durante las primeras 48 a 72 h. A partir de entonces y hasta el séptimo día, la
administración es por vía subcutánea y la dosis se ajusta de acuerdo con el tiempo
prolongado de protrombina, hasta, un valor de 2 a 2.5 veces el valor basal. A partir del
octavo día y durante tres meses, se continúa el tratamiento con anticoagulantes orales a
dosis ajustadas entre dos a tres veces el valor del porcentaje normalizado internacional
(INR), o bien con dosis bajas de heparina de bajo peso molecular.
El tratamiento de las hemorragias intracerebrales o parenquimatosas se basa en la causa
y el tamaño del hematoma. Existe poco beneficio con el tratamiento médico o
quirúrgico en la hemorragia de gran tamaño y deterioro importante del estado de
conciencia del paciente. En caso de un hematoma pequeño, independientemente de la
localización, con buen estado general del paciente y mínima afección neurológica,
deben tratarse los factores etiológicos para evitar recidivas. En la hemorragia de tamaño
intermedio, se debe plantear el beneficio del tratamiento quirúrgico. El incremento de la
presión intracraneal es un factor de mal pronóstico, por tal motivo su control es un
factor determinante para justificar la intervención evacuadora.
No están bien establecidas las indicaciones del tratamiento quirúrgico, pero debe
realizarse en el caso de hemorragia intracerebral lobar secundaria a un aneurisma o
malformación arteriovenosa y en caso de que el paciente empiece a deteriorarse. En
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otros casos, la hemorragia de tamaño intermedio son discutibles y debe individualizarse
cada caso, tomando en consideración las condiciones clínicas del paciente, la edad, el
estado neurológico focal, y el grado de deterioro del estado de conciencia. El
tratamiento médico está encaminado a establecer las medidas generales comentadas en
el tratamiento del infarto cerebral.
En las hemorragias infratentoriales,
deben de ponerse en práctica las medidas de
soporte vital y tener una vigilancia estrecha del estado neurológico del paciente. No se
justifica el uso de corticoesteroides para el edema cerebral. El tratamiento quirúrgico,
aun con
técnica estereotáxica debe reservarse a los hematomas localizados, de
contenido líquido, debidos a rotura de una malformación arteriovenosa. No se
recomienda en los casos de hemorragias hipertensivas.
En las hemorragias cerebelosas el tratamiento se basa en la vigilancia estrecha de la
evolución neurológica y el uso correcto de la cirugía. No está indicada la intervención
quirúrgica en los hematomas de pequeño y mediano tamaño en pacientes con buen
estado de conciencia, los pacientes con hematomas de gran tamaño y deterioro
progresivo del estado de conciencia deben ser intervenidos de inmediato. Es importante
tener presente que el coma al momento del ingreso, siempre que no exista daño
irreversible del tronco encefálico, no contraindica la cirugía.
En la hemorragia subaracnoidea, el tratamiento médico específico se enfoca a sus dos
principales complicaciones, el vasoespasmo y la nueva hemorragia, mediante los
fármacos antagonistas del calcio y antifibrinolíticos.
Antagonistas de canales de calcio. Tienen por objetivo evitar la presentación de
vasoespasmo arterial. El fármaco utilizado ahora es la nimodipina, que se administra
inicialmente por vía intravenosa a dosis de 15 microgramos /kg/h durante las primeras
cuatro horas. Luego, la dosis es de 30 microgramos/kg/h durante dos semanas y a partir
de la tercera semana se administran 60 mg cada cuatro horas por vía oral.
Antifibrinolíticos. Su administración es controvertida, ya que pueden producir
vasospasmo arterial, por ello no deben administrarse solos, sino conjuntamente con los
antagonistas del calcio. El objetivo de estos medicamentos es evitar la lisis del coágulo
que cierra la fisura del aneurisma arterial para que no se produzca una nueva
hemorragia. Se utiliza el ácido tranexámico a la dosis inicial de 20 mg/kg cada cuatro
horas en una solución glucosada al 5% por vía intravenosa mediante microgotero y con
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duración de 10 minutos cada dosis. La demostración de un aneurisma roto indica su
intervención quirúrgica.
Es preciso señalar que estudios previos acerca del proceso de muerte neuronal, han
mostrado que una intervención temprana puede evitar la progresión hacia la muerte
celular y favorece la recuperación funcional de las células (2).
Como se puede observar, el tratamiento difiere entre un tipo de evento y otro, lo que
hace que la aplicación de un esquema terapéutico equivocado tenga consecuencias
fatales para el paciente (3).
i) Diagnóstico diferencial de la enfermedad vascular cerebral
El EVC constituye la causa más frecuente de debilidad unilateral muscular. Sin
embargo debe hacerse un diagnóstico diferencial con otras enfermedades (ver tabla V).
Tabla V. Diagnóstico diferencial de la enfermedad vascular cerebral.
______________________________________________________________________
Hipoglucemia
Parálisis posictal (parálisis de Todd)
Parálisis de Bell
Encefalopatía hipertensiva
Hematoma epidural/subdural
Tumor/absceso cerebral
Migraña complicada
Encefalitis
Cetoacidosis diabética
Coma hiperosmolar
Meningoencefalitis
______________________________________________________________________
Fuente: Medicina de Urgencias, cuarta edición 1997 McGraw-Hill Interamericana capítulo 193.
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j) Ateroesclerosis
La ateroesclerosis es la primera causa de muerte e incapacidad en el mundo
desarrollado. Son muchos los factores de riesgo de tipo general o sistémico que
favorecen su desarrollo, pero la enfermedad afecta preferentemente a determinados
territorios de la circulación y produce manifestaciones clínicas singulares que dependen
del lecho vascular afectado. La ateroesclerosis coronaria suele causar infarto de
miocardio y angina de pecho. La ateroesclerosis del sistema nervioso central se asocia
sobre todo a isquemia cerebral transitoria e ictus. En la circulación periférica, la
ateroesclerosis puede desencadenar una claudicación intermitente y gangrena. La
afectación del territorio esplácnico es causa de
isquemia mesentérica e infarto
intestinal. La ateroesclerosis puede dañar directamente el riñón, y además el riñón
constituye un asiento frecuente de enfermedad ateroembólica.
De igual manera, la ateroesclerosis afecta preferentemente a las porciones proximales de
las arterias renales y, en el territorio cerebrovascular, a la bifurcación carotídea. Las
lesiones ateroescleróticas tienden a aparecer en los puntos de ramificación arteriales,
que son las zonas de flujo sanguíneo turbulento(13).
La ateroesclerosis se desarrolla de manera intermitente, no solo en el espacio como se
ha señalado, sino también en el tiempo. En el hombre, la aterogénesis es un proceso que
generalmente se extiende a lo largo de muchos años, en general en varios decenios. Sin
embargo, es probable que el crecimiento de las placas ateroescleróticas sea discontinuo
en lugar de lineal, con periodos de inactividad relativa interrumpidos por episodios de
rápida evolución. Después de una fase “silente” habitualmente prolongada, la
ateroesclerosis puede hacerse manifiesta. Sus expresiones clínicas pueden ser de
naturaleza crónica, como sucede en la angina de pecho estable asociada al esfuerzo o en
la claudicación intermitente, previsible y reproducible; otras veces, en cambio, provoca
episodios clínicos agudos mucho más graves, como un infarto de miocardio, un
accidente cerebrovascular o muerte súbita de origen cardíaco, que constituyen la
primera manifestación de la enfermedad. Algunas personas jamás sufren
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manifestaciones clínicas de la enfermedad arterial, aunque su estudio necroscópico
revele una ateroesclerosis difusa y generalizada.
Las arterias normales están compuestas por tres capas morfológicamente diferentes: la
íntima, la media y la adventicia.
La íntima está formada por una capa única de células endoteliales que tapiza la luz del
vaso. Este revestimiento celular endotelial descansa sobre una membrana basal y, a su
vez, sobre una capa de fibras elásticas organizadas que se denomina lámina elástica
interna. En el momento del nacimiento, la íntima es muy delgada, con muy poco
material o ninguno en el espacio subendotelial entre las células endoteliales y la lámina
elástica interna. Con el paso de los años la íntima se va engrosando en forma
concéntrica debido, sobre todo, al depósito de colágeno, fibras elásticas y matriz de
tejido conectivo.
La media de una arteria está constituida por células de músculo liso muy compactas y
ordenadas, rodeadas por pequeña cantidad de elementos de tejido conectivo laxo. En las
zonas más externas de la media, las fibras elásticas toman un aspecto más organizado
parecido a una lámina, la lámina elástica externa, que separa la media de la adventicia.
La adventicia es una capa de organización poco compacta, formada por células de
músculo liso, fibroblastos, colágeno, algunas fibras elásticas y mucopolisacáridos, que
se denominan glucosaminoglucanos.(14).
k) Inicio de la ateroesclerosis
a) Formación de la estría grasa. La lesión inicial de la enfermedad es la “estría grasa”, la
formación de estas primeras lesiones parece deberse a la acumulación localizada de
lipoproteínas en ciertas regiones de la capa íntima arterial. La acumulación de las
partículas lipoproteicas en la capa íntima arterial durante la primera fase de la
aterogénesis no se debe tan sólo a una mayor permeabilidad o “gotera” del endotelio
suprayacente. Más bien sería su unión a los componentes de la matriz extracelular, que
facilitarían su permanencia en la pared arterial, la que favorecería el depósito de las
lipoproteínas en la íntima arterial. Las lipoproteínas que se acumulan en el espacio
extracelular de la íntima arterial suelen asociarse con moléculas de proteoglucano de la
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matriz extracelular arterial. En las zonas en las que se inicia la lesión, el equilibrio entre
los distintos componentes de la matriz podría sufrir variaciones importantes. Por
ejemplo, de los tres grandes grupos de proteoglucanos, un exceso relativo de las
moléculas de sulfato de condroitina podría favorecer la retención de las partículas
lipoproteicas a través de su unión con ellas y la consiguiente lentificación de su salida
de las lesiones iniciales. Las partículas lipoproteicas del espacio extracelular de la
íntima, sobre todo aquellas que se unen a las macromoléculas de la matriz, podrían
experimentar también modificaciones químicas.
b) Oxidación de las lipoproteínas. Las lipoproteínas secuestradas dentro del espacio
extracelular de la íntima, a salvo de los antioxidantes del plasma, podrían ser muy
sensibles a la modificación oxidativa. Las lipoproteínas de baja densidad (LDL)
oxidadas no son homogéneas sino que, en realidad, forman una mezcla variable y mal
definida. Las modificaciones de los lípidos incluirían la formación de hidroperóxidos,
lisofosfolípidos, oxiesteroles y productos aldehídicos de la degradación de los ácidos
grasos. Entre los productos recientemente descritos procedentes de la oxidación de los
fosfolípidos se encuentran la palmitol-oxovaleroil-glicero-fosforil colina (POVPC), la
palmitol-gloutaroil-glicero-fosforil colina (PGPC) y la epoxiisoprostano E2 –glicerofosfocolina (PEIPC). Las modificaciones de la apoproteína consiste en roturas del
esqueleto peptídico y la derivación de algunos aminoácidos. El grupo amino de la
cadena lateral de la lisina podría condensarse con componentes de los lípidos oxidados
(4-hidroxinonenol o dialdehído malónico). Una modificación reconocida recientemente
podría ser consecuencia de la producción local de ácido hipocloroso por las células
inflamatorias de la placa, con la consiguiente aparición de radicales clorados como las
porciones clorotirosil.
c) Glucosilación no enzimática. Es probable que en los pacientes diabéticos con
hiperglucemia mantenida se produzca una glucosilación no enzimática de las
apolipoproteínas y de otras proteínas arteriales que alteraría su función y aceleraría la
aparición de la aterogénesis.
d) Formación de las células espumosas. Dentro de la íntima los fagocitos
mononucleares se transforman en macrófagos que finalmente se convierten en células
espumosas cargadas de lípidos. Para la transformación de los fagocitos mononucleares
en células espumosas es necesaria la captación de las partículas lipoproteícas a través de
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una endocitosis medida por los receptores. La acumulación de los lípidos y, en
consecuencia, la tendencia a formar un ateroma tiene lugar cuando los lípidos penetran
en la pared arterial por medio de los fagocitos mononucleares u otras vías en mayor
cantidad de los que salen. Los macrófagos desempeñan una función primordial en el
equilibrio del metabolismo lipídico de la pared arterial durante la aterogénesis. Algunas
células espumosas perecen, por apoptosis. La muerte de los fagocitos mononucleares
origina un núcleo necrótico rico en lípidos dentro de la lesión, rasgo característico de las
placas ateroscleróticas complicadas. Determinados factores de crecimiento o citocinas,
sintetizados por los fagocitos mononucleares, estimulan la proliferación de las células
del músculo liso y la producción de matriz extracelular, que se acumula en las placas
ateroscleróticas. La IL-1 y el TNF-alfa constituyen ejemplos de citocinas que favorecen
la producción local de los factores de crecimiento, entre ellos el factor de crecimiento de
origen plaquetario y el factor de crecimiento fibroblástico, junto a otros que podrían
intervenir en la evolución y complicación de la placa. La aterogénesis depende muy
probablemente de un complejo equilibrio entre los mediadores que facilitan la lesión y
otras vías que mitigan el proceso aterógeno.(15)
l) Síndromes clínicos de aterosclerosis. La mayoría de los ateromas no producen
síntomas y jamás llegan a causar manifestaciones clínicas. Muchos enfermos con
ateroesclerosis difusa fallecen como consecuencia de procesos no relacionados sin haber
experimentado nunca una manifestación clínicamente importante de aterosclerosis. En
las fases iniciales de desarrollo del ateroma, la placa suele crecer alejándose de la luz
(crecimiento abluminal). Los vasos afectados por la aterogénesis tienden a aumentar de
diámetro, una especie de remodelación vascular conocida como agrandamiento
compensador. Hasta que la placa no cubre más del 40% de la circunferencia de la
lámina elástica interna, no comienza a estrecharse la luz arterial. Por ello, durante gran
parte de su evolución el ateroma no produce estenosis alguna con limitación del flujo
sanguíneo.
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En las fases más avanzadas de la placa suelen aparecer estenosis que dificultan el flujo.
Muchas de estas placas se manifiestan a través de síndromes estables como la angina de
pecho inducida por el esfuerzo, la claudicación intermitente de los miembros o
trastornos neurológicos.
En general, una erosión superficial del endotelio o de una rotura manifiesta o fisura de
la placa generan un trombo. Este trombo puede ocasionar una isquemia cerebral
transitoria o, si causa una obstrucción lo bastante prolongada, un infarto cerebral.
Hoy se sabe que las manifestaciones clínicas de la ateroesclerosis dependen tanto de las
características biológicas de la placa de ateroma como del grado de afectación de la luz.
El mayor conocimiento de la aterogénesis permite profundizar en la forma en que los
tratamientos actuales pueden mejorar el resultado final, a la vez que sugiere los nuevos
objetivos de las intervenciones futuras.
m) Lipoproteínas. Las lipoproteínas son moléculas complejas cuya función consiste en
transportar lípidos plasmáticos hidrófobos, en particular el colesterol y los triglicéridos
y transportar desde el intestino y el hígado a los tejidos periféricos y, desde éstos,
devolver el colesterol al hígado para su eliminación del organismo en forma de ácidos
biliares. Están compuestas por moléculas de lípidos y proteínas, encontrándose en su
superficie unas proteínas específicas, las apolipoproteínas, cuya función además de
mantener la estabilidad de las lipoproteínas, actúan como ligando de receptores y sirven
como cofactor para determinadas enzimas. Los principales lípidos de los cuales están
conformadas las lipoproteínas son el colesterol, triglicéridos y fosfolípidos.(33,34) Como
se muestra a continuación en la figura 1.
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Fosfolípidos
Colesterol
(libre)
Apoproteínas
Triglicéridos
Colesterol
(éster)
Núcleo
Membrana de lípidos
Figura 1 Estructura de las lipoproteínas (Medwave Edición Abril 2005 )
Las lipoproteínas se clasifican fundamentalmente de acuerdo a su densidad en cinco
grupos:
-Quilomicrones
-Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)
-Lipoproteínas de densidad intermedia (IDL)
-Lipoproteínas de baja densidad (LDL)
-Lipoproteínas de alta densidad (HDL)
En los seres humanos, las vías que originan las lipoproteínas son dos: la primera, a
partir de las grasas ingeridas en la dieta, las cuales conformaran a los quilomicrones,
constituyendo así la vía exógena. En esta vía, los quilomicrones se sintetizan en el
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interior de las células de la mucosa intestinal a partir de triglicéridos y colesterol libre;
estos triglicéridos son degradados a través de la acción de las lipoproteínlipasa (LPL)
dando origen a una partícula denominada remante de quilomicrón, la cual es captada
finalmente por receptores hepáticos para ser excretada en la vía biliar. Por otra parte, en
la vía endógena se producen las lipoproteínas de muy baja densidad, por medio de la
síntesis hepática, a las cuales degrada la lipoproteínlipasa originando así las
lipoproteínas de peso molecular intermedio, que pueden ser captadas por los receptores
de LDL en hígado, para lo cual sirven como ligandos la apolipoproteina B 100 y E o
bien transformarse en lipoproteínas de baja densidad, las cuales se encargan de
transportar entre 60 a 80% del colesterol circulante.(35)
La cantidad de triglicéridos en los depósitos depende del balance entre la lipogénesis y
la lipólisis. Los ácidos grasos libres usados para la lipogénesis en los adipositos se
genera por degradación de triglicéridos en partículas lipoproteínicas del plasma; la
enzima fundamental que regula el proceso es la Lipoproteínlipasa (LPL). En el tejido
adiposo la actividad de dicha enzima es estimulada por la insulina y esta última también
estimula la reesterificación celular de los ácidos libres mencionados.(36) En cambio, en
músculo, la actividad de la LPL es inhibida por la insulina. No obstante tal inhibición es
anormal en obesos diabéticos, donde se ha demostrado que la insulina intensifica la
actividad de LPL.(37,38)
n) Lipoproteínlipasa. La lipoproteínlipasa (LPL), es una enzima con estructura
glucoproteíca localizada en la superficie luminal de las células endoteliales, es la
enzima que cataliza la hidrólisis de los triglicéridos de los quilomicrones y lipoproteína
de muy baja densidad (VLDL). Los ácidos grasos libres son tomados principalmente
por el corazón, músculo esquelético y adipocitos, y son los principales sitios de síntesis
de LPL. (26)
La enzima activa es un homodímero no covalente. Este homodímero está en equilibrio
con la forma monomérica de la enzima, la cual, al contrario que el homodímero, es
inactivada con mayor rapidez. Los dominios de la molécula implicados en la formación
de este dímero no se conocen en la actualidad.
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Actualmente se dispone de ADN codificante de la LPL de diversas especies como el
hombre, vaca, cobaya, rata y ratón. El gen humano de la LPL es de aproximadamente
32 kb de longitud y se en encuentra localizado en el cromosoma 8p22. (27,28,29)
En el hombre se producen dos especies de ARNm debido a una poliadenilación
alternativa, una de 3.350 pb y otra de 3.750 pb. El peso molecular de la preproteína
LPL es de 50.394 daltons, la cual, después de glucosilarse, pasa a ser de
aproximadamente 55.000 daltons en el caso de la forma monomérica madura de la
proteína.
Se ha demostrado, que el gen de la LPL contiene 10 exones interrumpidos por 9
intrones 8-9, se aprecia en la figura 2.
S132G
H136A
G139S
V69L G142E
D9N T86A
N43A
N359A
H241E
H241Q
R243H
S244T
D250N
S251C
A261T
Y262H
N291S
P310A
L365W
P397A
G409R
P432A
T495G
Figura 2. Estructura del gen de la LPL y localización de mutaciones. En los recuadros superiores se
indican las mutaciones puntuales encontradas mediante el código de una letra y la posición numérica del
residuo mutado. (Capitulo 7 bases genéticas, moleculares y celulares de la quilomicronemia).
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La actividad de transferasa de la LPL induce el aumento de células de músculo liso
(CML) en aortas expuestas a colesteril oleato, lo que es de importancia en el proceso de
aterogénesis.
Un aspecto del potencial papel aterogénico de la LPL está ligado a su capacidad de
aumentar la unión de lipoproteínas a receptores celulares, la unión a la superficie celular
es esencial en la transferencia transmembrana de colesteril éster (EC).
La deficiencia familiar de LPL se caracteriza, en su forma homocigótica, por una
fuerte hipertrigliceridemia debida a la acumulación de quilomicrones y VLDL en
plasma (hipertrigliceridemia de tipo I). Esta es una patología autosómica recesiva de la
población general (prevalencia: 1 en 10 5), pero en ciertas poblaciones, y debido al
efecto fundador, puede llegar hasta a 1 en 5.000 o 1 en 10.000. (30)
Mutaciones LPL: Durante la última década volvió a cobrar interés la relación entre
LPL y ateroesclerosis en los seres humanos. Tres mutaciones LPL comunes (Ser447s,
D9N y N291S), que ocurren con frecuencia relativamente elevada, permitieron a los
investigadores observar el nexo entre variación genética LPL y enfermedad coronaria
(EC).
Las tres variantes se asocian con niveles alterados de triglicéridos (TG) y
colesterol de alta densidad (HDLc).
ñ) Polimorfismos de la lipoproteínlipasa. Se calcula que la frecuencia de portadores
de mutaciones en el gen de la LPL asociadas con déficit familiar de LPL es de alrededor
de 1 por cada 500 sujetos. Durante la última década volvió a cobrar interés la relación
entre la Lipoproteínlipasa (LPL) y aterosclerosis en los seres humanos. Cuatro
mutaciones de la LPL (HindIII, N291S, D9N y S447X), que ocurren con frecuencia
relativamente elevada, permitieron a los investigadores observar el nexo entre variación
genética de la LPL y enfermedad coronaria. Sin embargo, la frecuencia y variedad de
las mutaciones de la lipoproteínlipasa difieren entre los diferentes grupos étnicos;
Mientras que la población canadiense reporta un alto porcentaje de mutaciones de la
lipoproteínlipasa (17%)(39) la frecuencia de estas mutaciones es relativamente baja en
población china (7%). La mutación S447X ocurre con mayor frecuencia en personas de
raza blanca y se asocio con menores niveles de TG y mayores de HDL en hombres y
pacientes con enfermedad coronaria, se han encontrado en el 10% de la población
general y es además la única variante asociada con aumento en la actividad de la
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lipoproteínlipasa. De los polimorfismos que disminuyen la actividad de la
lipoproteínlipasa el HindIII es el más común encontrándose en el 20% de la población
diabética.(40) El papel de los polimorfismos D9N y N291S también fue investigado y
contrariamente a lo que sucede con HindIII, su frecuencia no es tan elevada. Ambas
variantes son predictoras de bajos niveles de HDL en hombres con obesidad grado I y
II. El polimorfismo N291S se ha encontrado tan solo en el 2-5% de la población
caucásica. Por otro lado, los japoneses reportan que la mutación G916 es la más común
entre su población, mientras que las mutaciones HindIII, D9N, N291S y S447X no son
tan frecuentes.(41) La variante T231G fue encontrada en el 76.4% de la población
africana y solo en el 1.7% de la población Caucásica.(42,43) Algunos estudios han
mostrado que los polimorfismos de la lipoproteínlipasa se encuentran asociadas a una
reducción en la actividad de esta, la cual incrementa el riesgo de hiperlipidemia y
aterosclerosis prematura.(32) También se ha publicado una fuerte asociación entre el
polimorfismo HindIII y la presencia de eventos macrovasculares en pacientes con DM
tipo 2, así como a una variabilidad de la respuesta lipídica al cambiar de una dieta rica
en grasas saturadas a una dieta pobre en grasas saturadas(44). Recientemente se ha
publicado que otras mutaciones relativamente comunes en este locus están asociadas
con trastornos ligeros en el metabolismo de los lípidos y obesidad. Por tanto, se ha
encontrado que el polimorfismo de cambio de sentido (N291S) en el exón 6 es mayor en
poblaciones diabéticas obesas.(45,46) Otra variante (D9N) se ha asociado con niveles
elevados de TG y con una mayor progresión de la aterosclerosis coronaria.(47,31,48)
HINDIII. El polimorfismo HindIII es debido a un cambio de timidina por guanina en la
posición 495 del intron 8 del gen de la lipoprotein lipasa. Este cambio impide el
reconocimiento de la secuencia de la enzima HindIII y permite que el alelo H1 sea
diferencie del alelo H2. El genotipo H2H2 ha sido asociado con niveles elevados de TG
y LDL. Este polimorfismo ha sido asociado con enfermedad arterial coronaria y con
microalbuminuria en pacientes con DM tipo 2.- Solini y colaboradores identificaron la
hiperlipidemia como factor determinante en nefropatía diabética.(49) El polimorfismo
HindIII ocurren con más frecuencia en personas de raza blanca en pacientes con
Enfermedad coronaria.
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Larson y colaboradores encontraron que el alelo H1 del polimorfismo HindIII de la
lipoproteínlipasa es un factor cardioprotector en comparación al alelo H2, el cual se ha
asociado con un incremento en los niveles de colesterol y con aterogénesis acelerada.(50)
Este alelo se asoció con protección contra Enfermedad Coronaria en los hombres pero
no en las mujeres.(51) Ukkola y colaboradores estudiaron el efecto de la variación del gen
de la lipoproteínlipasa sobre la susceptibilidad en pacientes con diabetes tipo 2 con
enfermedad vascular aterosclerótica, encontrando que el polimorfismo HindIII y pvuII
de la lipoproteínlipasa modulan el riesgo de macroangíopatia diabética en pacientes
diabéticos tipo 2.(52)
El papel de los polimorfismos D9N y N291S también fue investigado, y contrariamente
a lo que sucede con HindIII, su frecuencia no es tan elevada. Ambas variantes son
predictoras de bajos niveles de HDLc y de TG elevados en los hombres. La variante
N291S se asoció con bajos niveles de HDLc en pacientes con EC, mientras que se
vieron altos niveles de TG en aquellos con el polimorfismo D9N, con aterosclerosis de
progresión acelerada. En un estudio, esta mutación incrementó marcadamente el riesgo
de enfermedad cardíaca isquémica en hombres fumadores.(51,54)
N291S. El polimorfismo N291S es debido a un cambio de asparagina por serina y se
asocia con niveles alterados de TG y HDLc.(57) Es un polimorfismo común de la
lipoproteínlipasa que conduce a una hiperquilomicronemia, ya que disminuye levemente
la actividad enzimática de la LPL. Algunos datos sugieren que este polimorfismo
incrementa los niveles de lipemia postpandrial.(42) Por lo que, los portadores del
polimorfismo N291S se encuentran con un mayor riesgo de aterosclerosis.(56)
D9N. Resulta de la sustitución del aminoácido aspartato por asparagina en residuo 9
(N9) de la proteína. La frecuencia reportada varía de población a población y va desde
un 2% hasta un 13%.(42) Razzagi y colaboradores como parte de un estudio reportaron la
frecuencia para el polimorfismo D9N en dos grupos étnicos: 4% en hispanos y 5% en
blancos americanos. Identificando además que esta frecuencia se encuentra
incrementada en pacientes obesos, con un metabolismo alterado como ocurre
frecuentemente en pacientes diabéticos tipo 2. A pesar de que el EARS reporta una
frecuencia similar tanto en diabéticos como en personas sanas (4.2 y 4%
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respectivamente)(57) otros estudios en cambio, han mostrado diferencias significativas
entre estos dos grupos, Ruel y colaboradores reportan una frecuencia del 7% en
población general vs un 16.9% en diabéticos tipo 2. Talmud y colaboradores un 3% en
sujetos sanos vs un 11% en diabéticos tipo2. Además se ha reconocido que estas
frecuencias aumentan cuando se encuentra asociado a otro polimorfismo.
El polimorfismo D9N participa en la secreción de LPL, produciendo una alteración, con
la consecuente baja actividad de la LPL. Aunque se ha estudiado junto con otros
polimorfismos de la LPL como son el N291S, HindIII y S447X, el efecto de este
polimorfismo sobre el metabolismo de los lípidos no está bien dilucidado. Se cree que
esta asociado con una disminución en los niveles de HDLc, una rápida progresión de
aterosclerosis y una mortalidad cardiovascular incrementada. Recientemente un
metaanálisis sugiere que los portadores del polimorfismo D9N tienen un perfil lipídico
alterado en pacientes diabéticos tipo 2. Wittrup y colaboradores reportaron que este
polimorfismo se encuentra asociada a un incremento sustancial en el riesgo de
enfermedad arterial coronaria.
La mutación Ser447s ocurre con más frecuencia en personas de raza blanca
encontrándose en 17% al 22%(31) y se asocia a menores niveles de TG y mayores de
HDLc en hombres normolipémicos y pacientes con EC. Este alelo se asoció con
protección contra EC en los hombres pero no en las mujeres.
El papel de las mutaciones D9N y N291S también fue investigado, y contrariamente
a lo que sucede con Ser447s, la frecuencia de esta mutación no es tan elevada. Ambas
variantes son factores asociados con bajos niveles de HDLc y de valores elevados de
TG en los hombres. La variante N291S (también llamada RsaI) se asoció con bajos
niveles de HDLc en pacientes con colesteril éster, mientras que se vieron altos niveles
de TG en aquellos con mutación D9N, con ateroesclerosis de progresión acelerada.
El gen T495G(conocido también como HindIII) que se encuentra en el intrón 8 de la
lipoproteínlipasa ha sido asociado con la variación de los niveles de lípidos en sangre y
con enfermedades cardiacas en la raza caucásica, más comúnmente el alelo G se asocia
en forma adversa con la elevación de lípidos y riesgo de enfermedades cardiacas.(32)
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o) EVC y lipoproteínas. En la literatura se reportan diversos estudios, donde se
pretende encontrar una correlación entre la presencia de hiperlipidemias y enfermedad
cerebrovascular, debido a la asociación que se ha establecido entre la variación de los
niveles de lípidos y la ateroesclerosis, encontrándose además la presencia de genes,
siendo el candidato más viable el gen que interactúa con la lipoproteínlipasa y de esta
forma contribuir a la variación interindividual en los niveles de lípidos.(16-21)
Los lípidos y las lipoproteínas han sido implicados en la patogénesis de la enfermedad
cerebrovascular isquémica. La lipoproteínlipasa juega un papel importante en el
metabolismo plasmático de las lipoproteínas. Estudios recientes han encontrado una
asociación entre Ser447s y la mutación de la LPL en enfermedad arterial coronaria.
Otros polimorfismos (D9N y N291S) de la LPL
han sido relacionados en forma
significativa con dislipidemia. Shimo-Nakanishi et al. publicaron un artículo de casos y
controles en julio del 2001 donde investigaron cómo el polimorfismo T495G se asocia
con un incremento en el riesgo de enfermedad cerebrovascular isquémico, estudiaron
177 pacientes con EVC isquémico, donde encontraron que la mutación del Gen T495G
de la LPL es un marcador genético para bajo riesgo de infarto cerebral
aterotrombótico.(22-24)
De acuerdo a nuestro conocimiento, no existen reportes sobre la asociación de los
polimorfismos T495G, N291S, D9N, del gen de la lipoproteínlipasa con infarto cerebral
isquémico en una población latinoamericana.
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JUSTIFICACIÓN
La enfermedad
cerebrovascular tiene una alta incidencia nacional, por lo que es
considerada un problema de salud pública, ya que se encuentra entre las primeras causas
de morbi-mortalidad en la población adulta, aunado al pobre pronóstico que tiene
dejando secuelas neurológicas incapacitantes, provocando un impacto negativo desde el
punto de vista socioeconómico, a la familia, a las instituciones de salud y la sociedad
en general.
En la actualidad no existe ningún indicador, que nos determine la asociación de los
polimorfismos, del gen de la lipoproteínlipasa con infarto cerebral isquémico en
población de Latinoamérica. Sería interesante conocer desde el punto de vista genético,
cuales polimorfismos de este gen influyen en el desarrollo del infarto cerebral para, en
la medida de lo posible, modificar el medio ambiente que interactúa con estos factores
de riesgo genético en el desarrollo, de la enfermedad.
Con este estudio se pretende identificar en la población del Estado de Colima, los
polimorfismos, en la vía metabólica de los lípidos (gen LPL) y determinar su asociación
con el infarto cerebral.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿Existe una asociación entre la presencia de polimorfismos (T495G, N291S, D9N) del
gen de la lipoproteínlipasa e infarto cerebral?
HIPÓTESIS DE TRABAJO
Los
polimorfismos
del gen de la lipoproteínlipasa son factores de riesgo para
presentar infarto cerebral
HIPÓTESIS NULA
Los polimorfismos del gen de la liproteínlipasa no son factores de riesgo para
presentar infarto cerebral
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OBJETIVOS
General
Determinar si los polimorfismos del gen de la lipoproteínlipasa T495G (G/G+T/G),
N291S (G/G+A/G), D9N (A/A+G/A) están asociados al desarrollo de infarto cerebral.
Específicos
1.
Conocer las frecuencias genotípicas de los
polimorfismos del gen de la
lipoproteínlipasa T495G, N291S, D9N en los pacientes con diagnóstico de infarto
cerebral.
2. Conocer las frecuencias genotípicas de los polimorfismos T495G, N291S, D9N del
gen de la lipoproteínlipasa en individuos sin infarto cerebral.
3.
Determinar si
los
polimorfismos T495G, N291S, D9N
del gen de la
lipoproteínlipasa son factores de riesgo para el desarrollo de infarto cerebral.
DEFINICIÓN DE LAS VARIABLES
a) Variable dependiente
Polimorfismos T495G (G/G+T/G+T/T), N291S ( G/G+A/G+A/A), D9N
(A/A+G/A+G/G)
Definición conceptual
Polimorfismo: La existencia en una población de dos o más alelos alternativos,
determinados por factores genéticos y que presentan frecuencias demasiado
elevadas para que puedan ser mantenidas sólo por la mutación, por ejemplo, la
frecuencia más rara aún de dos alelos con una manifestación en la población de al
menos 0,0l.
Definición operativa
Se consideró Polimorfismo a la presencia de diferentes patrones de bandas
específicas para cada uno de los polimorfismos en un gel de poliacrilamida al 6%.
Indicador
Genotipos del polimorfismo.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Clasificación de la variable por su naturaleza y escala de medición
Polimorfismo:
cualitativo.
Nominal
dicotómico
T495G(G/G+T/G+T/T),
N291S(G/G+A/G+A/A), D9N (A/A+G/A+G/G).
b) Variable independiente
Infarto cerebral.
Definición conceptual
Infarto cerebral área de tejido cerebral que experimenta necrosis secundaria a la
interrupción del riego sanguíneo, con hemorragia o sin ella. Un infarto puede
deberse a una trombosis, un embolismo o un vasospasmo.
Definición Operativa
Se consideró infarto cerebral cuando se observó en la tomografía craneal
simple y contrastada una imagen hipodensa (densidad escasa=oscuro).
Indicador
EVC isquémico
Clasificación de la variable por su naturaleza y escala de medición
Cualitativa. Nominal dicotómica.
MATERIAL Y MÉTODO
DISEÑO DEL ESTUDIO
Casos y controles
UNIVERSO DE ESTUDIO
Derechohabientes del IMSS delegación Colima.
Muestra
Pacientes con diagnóstico clínico y de gabinete (TAC) de infarto cerebral, ser
derechohabientes del IMSS delegación Colima que acuda a los servicios de urgencias o
consulta externa de medicina interna y neurología del Hospital General de Zona y
Medicina Familiar No. 1
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
CRITERIOS DE SELECCIÓN
a) De inclusión
1. Ser derechohabiente del IMSS delegación Colima.
2. Todo paciente con diagnóstico clínico y de gabinete de infarto cerebral.
b) De no inclusión
1. Que no aceptaron los familiares o el paciente para ser incluidos en el estudio.
2. Que por su gravedad se envió a un tercer nivel de atención médica antes de la
realización de los estudios de diagnóstico.
c) De eliminación
1.Que el paciente o los familiares deseen abandonar la investigación.
2.Que la muestra de ADN sea insuficiente en cantidad o calidad.
3.Que no se tengan los datos clínicos y laboratoriales completos.
DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ESTUDIO
Tiempo:
Se incluyeron pacientes que llegaron a los servicios de Urgencia en el primer año de
estudio, diciembre 2007-marzo 2008
1.- Todos los participantes firmaron una carta de aceptación para participar de manera
voluntaria en el proyecto. Al mismo tiempo se elaboró una historia clínica y se tomaron
datos poblacionales (ver anexo 1).
2.- Las muestras de sangre de los participantes se sometieron al siguiente procedimiento
de laboratorio:
a) Extracción del ADN
El ADN de las personas en estudio se aisló a partir de sangre periférica total por el
método de Proteinasa K (Sambrook, 1992) (anexo 2).
b). Cuantificación del ADN (anexo 3)
Para conocer la concentración del ADN aislado (anexo 4), así como la pureza
(proteínas) se realizó tanto prueba cuantitativa por espectrofotometría y cualitativa
mediante electroforesis.
c). Dilución del ADN
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Después de la verificación de la calidad y cantidad del ADN se prepararon alícuotas de
ADN a una concentración de 100 ng/µl.
3.- Detección de polimorfismo T495G, N291S, D9N del Gen de la lipoproteínlipasa.
Para la detección de los polimorfismos se sometieron las muestras de ADN de ambos
grupos (Infarto Cerebral y Controles) a RCP-RFLP (anexo 5) con el uso de los
iniciadores y enzimas de restricción que se muestran en la tabla IV.
Tabla VI. Iniciadores, enzima de restricción y producto amplificado.
Variante Iniciadores
Enzima
restricción
LPL T495G
5’ GAT GTC TAC CTG GAT AAT Hind III
de Producto
amplificado
355 pb
CAA AG 3’
5’ CTT CAG CTA GAC ATT GCT
AGT GT 3’
D9N
5’ AAA ATC AAG CAA CCC Taq I
234 pb
TCA AG 3’
5’ TAG GGC AAA TTT ACT TGC
GA 3’
N291S
5’ TCT GCC GAG ATA CAA TCT Rsa I
243 pb
TGG 3’
5’ TAA TAT AAA ATA TAA TAC
TGC TTC TTT TGG CTC TGA
CTG TA 3’
En base a los resultados de la genotipificación se formarán los siguientes grupos:
Grupo 1 CONTROLES: incluyeron a los pacientes sin infarto cerebral con y sin los
polimorfismos T495G (G/G+T/G), N291S (G/G+A/G), D9N (A/A/+G/A) en el gen de
la lipoproteínlipasa
Grupo 2 CASOS: se incluyeron los pacientes con infarto cerebral con y sin los
polimorfismos T495G (G/G+T/G) , N291S(G/G+A/G), D9N (A/A/+G/A) en el gen de
la lipoproteínlipas
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
TAMAÑO DE LA MUESTRA
CÁLCULO DEL TAMAÑO MUESTRAL EN ESTUDIOS DE COHORTE
Cálculo del tamaño muestral mínimo necesario para detectar un RIESGO significativamente diferente de 1
Frecuencia de ENFERMEDAD entre los EXPUESTOS
Frecuencia de ENFERMED entre los NO EXPUESTOS
RIESGO RELATIVO a detectar
Nivel de seguridad
Potencia
Número de NO EXPUESTOS POR EXPUESTOS
p1
p2
RR
Tamaño muestral mínimo:
Controles: 65
Infarto Cerebral: 65
0.25
0.75
2.00
0.95
0.80
1
0.25
0.75
2.00
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Las frecuencias genotípicas y alélicas se obtuvieron por el método de conteo y cálculo
de porcentaje. La distribución de estas frecuencias (alélicas y características clínicas) de
las poblaciones se comparó mediante prueba de chi cuadrada.
Las frecuencias genotípicas de cada polimorfismo se compararon con las proporciones
esperadas por la Ley de Hardy-Weinberg en el grupo control.
Se calculó la razón de momios (OR) y los intervalos de confianza para los
polimorfismos. Cada polimorfismo cuenta con 3 genotipos posibles, pero para su
análisis, cada polimorfismo se dividió en 2 grupos; genotipos con alelo de riesgo (según
estudios previos) vs genotipos sin alelo de riesgo, y se distribuyeron de la siguiente
manera T495G (GG+TG vs TT), N291S(GG+AG vs AA), D9N(AA+GA vs GG), la
significancia estadística se consideró cuando P < 0.05.
Cuando los grupos fueron diferentes en alguna variable de confusión, el OR se ajustó
mediante posestratificación con la prueba de Mantel-Hanzel usándose el programa
SPSS 15.
CONSIDERACIONES ÉTICAS
El presente proyecto fue sometido a la consideración del Comité Local de Investigación.
Este estudio se realizó de acuerdo a las normas de la Ley General de Salud de la
República Mexicana y la Declaración de Helsinki (2004) agregada por la Asamblea
General de la AMM, Tokio.
(25)
. Se solicitó al paciente -o en su caso al familiar- el
consentimiento informado para ser incluido en el estudio.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
RESULTADOS
Se estudiaron 100 pacientes con diagnóstico clínico y tomográfico de infarto cerebral,
y 120 controles a
los cuales se les tomó una muestra de sangre venosa para la
extracción de ADN, y se determinó la presencia de los genotipos T495G, N291S, D9N.
La información obtenida por medio de las historias clínicas, de los pacientes con
Infarto Cerebral y los pacientes del grupo control se muestran en la tabla VII.
Tabla VII. Características generales de los pacientes del grupo control y pacientes
con Infarto cerebral
Controles
n=120(%)
EVC
n=100(%)
p
61.6 ± 9.7
67.9 ± 12.5
.000
70 (58)
54 (54)
.669
50 (42)
46 (46)
Hipertensión
69 (58)
49 (49)
.224
Diabetes
89 (74)
47 (47)
.000
Dislipidemia
40 (33)
44 (44)
.126
IMC
29. 4 ± 5.7
27.9 ± 5.0
.041
Tabaquismo
43 (36)
54 (54)
.009
Edad (años)
Genero
Femenino
Masculino
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Para T495G la distribución de los genotipos en el grupo control es concordante con el
equilibrio de Hardy-Weinberg (p=0.30).
La frecuencia del alelo G fue de 0.37 en los controles en tanto que en los casos es de
0.32, sin encontrar diferencias estadísticas entre estos valores (p=0.80).
La distribución genotípica, del polimorfismo T495G se puede apreciar en la figura
No. 1, donde se aprecia un predominio del genotipo T/T, tanto en el grupo control
como en el de infarto cerebral. Se determinó la razón de momios (T/G+G/G vs T/T) con
un valor de p= .494, con un odds ratio de .824 con un intervalo de confianza de .4801.415
C ontrol
Infarto C erebral
70%
62%
57%
60%
P orc entajes
50%
39%
40%
32%
30%
20%
10%
6%
4%
0%
T/G
T/T
G e notipos
Gráfica No. 1 Distribución genotípica T495G
G /G
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Para N2951S la distribución de los genotipos en el grupo control es concordante con
el equilibrio de Hardy-Weinberg (p= 1.0).
La frecuencia del alelo G es de 0.016 en los controles en tanto que en los casos es de
0.005, sin encontrar diferencias estadísticas (p=1.0)
La distribución genotípica del polimorfismo N291S se puede apreciar en la gráfica
No. 2 donde se aprecia un predominio del genotipo A/A, tanto en el grupo control como
en el infarto cerebral. Se determinó la razón de momios (A/G+G/G vs A/A) con un
valor de p= 1.000, con un odds ratio de .832 con un intervalo de confianza de .05113.72
C ontrol
Infarto C erebral
120%
99%
99%
100%
P orc entajes
80%
60%
40%
20%
1%
1%
0%
0%
0%
A /G
A /A
G e notipos
Grafica No. 2 Distribución genotípica N291S
G /G
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Para D9N la distribución de los genotipos en el grupo control es concordante con el
equilibrio de Hardy-Weinberg (p=1.0).
La frecuencia del alelo A es de 0.004 en los controles en tanto que en los casos es de
0.01, sin encontrar diferencias estadísticas (p= 1.0).
La distribución genotípica del polimorfismo D9N se puede apreciar en la gráfica No.
3, donde se aprecia un predominio del genotipo G/G, tanto en el grupo control como en
el infarto cerebral. Se determinó la razón de momios (G/A+A/A vs G/G) con un valor
de p= .380, con un odds ratio de 3.414 con un intervalo de confianza de .375-31.046
C ontrol
Infarto C erebral
120%
97%
100%
99%
P orc entajes
80%
60%
40%
20%
3%
1%
0%
0%
0%
G /A
G /G
A /A
G e notipos
Gráfica No. 3 Distribución genotípica D9N
En el análisis de variables clínicas de confusión, se observó que en edad y diabetes
había diferencias estadísticas entre el grupo de casos y control. Por este motivo se
decidió ajustar el OR del polimorfismo para infarto cerebral con la variable diabetes o
grupo etario mediante postestratificación con la prueba de Mantel-Haenszel, los
resultados se muestran en la tabla VIII.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Tabla VIII. Distribución del polimorfismo, genotipo en controles y casos, valor de p y
OR
POLIMORFISMO GENOTIPO
Controles
n=120
Casos
n=100
T/T
74
57
T/G+G/G
46
43
A/A
119
99
p
OR
.494
.824
(.480-1.415)
1.000
.832
(0.51-13.72)
.380
3.414
(.375-31.04)
T495G
N291S
A/G+G/G
1
1
G/G
116
99
D9N
G/A+A/A
4
1
T, A y G alelos silvestres de los polimorfismos T495G, N291S y D9N respectivamente.
Tabla IX. Riesgo (OR) ajustado de los genotipos de los polimorfismos T495G, N291S
y D9N para el desarrollo de infarto cerebral en la población estudiada
OR Crudo
OR ajustado para
OR ajustado para
Polimorfismo Genotipo de riesgo
(95% IC)
DM (95% IC)
grupo etareo*(95%
IC)
T495G
G/G+T/G
.824 (.480-1.415)
.811(.461-1.424)
.781(.442-1.380)
N291S
G/G+A/G
.832 (.051-13.72)
.964(.084-11.115)
.649(.039-10.692)
D9N
A/A+G/A
3.414 (.375-31.04)6
3.746(.286-49.054)
4.116(.363-46.707)
* Grupos etareos: 54 o menos; 55-59; 60-64; 65-69; 70-74 y 75 o más años.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
DISCUSIÓN
La lipoproteínlipasa (LPL) es una enzima que en los humanos facilita el metabolismo
de los lípidos, contribuye en el retiro de los triglicéridos de la corriente sanguínea; está
involucrada en la fisiopatología de la obesidad central y dislipidemia.
La información obtenida de los estudios en animales transgénicos demuestra que la
LPL está involucrada en la aterosclerosis. El papel protector de la LPL plasmática está
bien documentado, y su modo de acción está ligado a su actividad catalítica, con
disminución de TG y aumento de HDLc en plasma.
En los seres humanos, la LPL podría aumentar la unión de partículas lipídicas
plasmáticas a receptores de lipoproteínas en los macrófagos, lo que promovería la
captación selectiva de colesteril éster, evitando que éstas se adhieran al endotelio
vascular. (24) Li J estudió la asociación del polimorfismo T495G Hind III con obesidad
y dislipidemia y ha sido asociado con variaciones en niveles de lípidos y problemas
cardíacos en caucásicos.(58)
Ma y colaboradores investigaron el polimorfismo T495G en 785 chinos diabéticos
tipo II y un grupo control encontrándose un incremento de este polimorfismo en los
pacientes con triglicéridos elevados tanto en el grupo control como en los diabéticos.(32)
El polimorfismo D9N y el N291S, juegan un papel muy importante en el desarrollo
de hipertrigliceridemia tipo III. La LPL se ha demostrado que eleva los niveles de
lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y baja densidad (LDL) estando asociado
con el incremento en el riesgo de enfermedad coronaria y bajos niveles de lipoproteína
de alta densidad (HDL), siendo potencialmente aterogénico.
Muchos estudios han investigado los polimorfismos genéticos productoras de proteínas
que contribuyen al desarrollo de aterosclerosis de arterias coronarias, trombogénesis y
fibrinólisis y otros procesos significativos para la progresión de enfermedades
isquémicas en el corazón. En las enfermedades isquémicas del corazón, se han
analizado los genes que están en relación con el metabolismo de los lípidos, el sistema
de coagulación y fibrinolítico, así como el sistema renina-angiotensina-aldosterona
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
En el presente estudio no se encontró diferencia estadística en el grupo control y en
los pacientes con infarto cerebral, a nivel genético respecto de los polimorfismos desde
el punto de vista de género, hipertensión, dislipidemia, así como la presencia de los
polimorfismo T495G, N291S, D9N de la lipoproteína lipa Los lípidos y las lipoproteínas
han sido implicados en la patogénesis de la enfermedad cerebrovascular isquémica. La
lipoproteínlipasa juega un papel importante en el metabolismo plasmático
de las
lipoproteínas. Estudios recientes han encontrado una asociación entre T495G y la
mutación de la LPL en enfermedad arterial coronaria.(28) Otros polimorfismos (N291S y
D9N) de la LPL han sido relacionados en forma significativa con dislipidemia. ShimoNakanishi y colaboradores publicaron un artículo de casos y controles en julio del 2001
donde investigaron como el polimorfismo Ser447s se asocia con enfermedad
cerebrovascular isquémico, estudiaron 177 pacientes con EVC isquémico, donde
encontraron que la mutación del Gen Ser447s de la LPL es un marcador genético para
bajo riesgo de infarto cerebral aterotrombótico.(22) A diferencia de este estudio,
analizamos los polimorfismos T495G, N291S, D9N, en relación con infarto cerebral, ya
que estos polimorfismos se han asociado a la presencia de ateroesclerosis coronaria, y
por ende con infarto al miocardio, sin embargo no se encontró asociación del infarto
cerebral, con la presencia de alguno de los 3 polimorfismos estudiados.
Este estudio es el primero que se realiza en una población latinoamericana tratando de
encontrar un factor genético, como desencadenante del infarto cerebral, factores
ambientales y genéticos pueden interactuar y desarrollar un evento vascular cerebral.
CONCLUSIONES:
En este estudio muestra que los polimorfismos T495G, N291S, D9N no se asocian a
infarto cerebral, en nuestra población.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
PERSPECTIVAS:
El estudio de la lipoproteínlipasa es un pilar fundamental para la comprensión de la
aterosclerosis, por lo que es conveniente, continuar dicha ruta, con la finalidad de
entender mejor la implicación genética en los trastornos de los lípidos, por lo que se
deberá:
•
Estudiar otros polimorfismos de la LPL
•
Estudiar otros polimorfismos de otros genes.
•
Estudiar esos polimorfismos en población sana.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
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ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
ANEXO 1
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL
UNIVERSIDAD DE COLIMA
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
PROYECTO : Estudio del polimorfismo T495G, N291S, D9N del infarto cerebral en el
estado de Colima. Investigador.
Lugar y fecha:_________________________________________ Número reg, en el
proyecto _________________
Por
medio
de
la
presente
yo__________________________________________________ de______ años de
edad, manifiesto que acepto participar en este proyecto de investigación, el cual tiene
como objetivo conocer más sobre el problema de la Enfermedad Cerebro-vascular para
tratar de disminuir los problemas y muertes que acarrea.
Se me ha explicado que mi participación consistirá en:
Aceptar que la muestra tomada como parte del procedimiento de mi atención
diagnóstica sangre (10 ml. sangre venosa del brazo) sea incluida para su estudio
dentro de este proyecto de investigación para estudios de laboratorio clínico y molecular
siempre y cuando se mantenga la confidencialidad de mis datos personales.
Declaro que he sido informada que:
• Mi participación es voluntaria y que mi negación a participar no representaría
ningún problema para mi atención en las diferentes instituciones de salud.
• Que el riesgo ( peligro) que enfrento de ninguna forma es mayor al que enfrentaría
cualquier individuo al que se le toman este tipo de muestras ya que son parte de la
atención médica habitual diagnóstica y que generalmente consiste en cierto tipo de
molestia local en el sitio de punción de la aguja y que de presentarse este, contaré
con la atención necesaria en la unidad medica donde se toma las muestras.
• Que mi participación en el proyecto no obliga a la investigación ni sus responsables
a otorgarme atención en cuanto a los problemas de salud que fueran diagnosticados
a partir de las muestras que me serán tomadas, pero si ha informarme si yo lo deseo
los resultados y ha ofrecerme asesoría para buscar la atención correspondiente.
Nombre y firma de la persona otorgante de consentimiento
___________________________________________________
Nombre y firma del testigo
Nombre y firma del testigo
Nombre de la persona que proporciona la información y recabó firma:
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS
LABORATORIO DE GENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR
UNIVERSIDAD DE COLIMA
DATOS GENERALES (POBLACIONALES)
PROYECTO: Estudio del polimorfismo T495G, N291S, D9N del infarto cerebral en el
estado de Colima
RESPONSABLE: DR. GABRIEL CEJA ESPIRITU
FECHA:________________NOMBRE:____ ______________SEXO:______________
FECHA
DE
NACIMIENTO:________________LUGAR
(Mun.
Edo.
País)_____________________
DOMICILIO:___________________________________________________________
TELEFONO:___________________________________________________________
DATOS MEDICOS:
ANTECEDENTES HEREDOS FAMILIARES:
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
ANTECEDENTES PERSONALES NO PATOLOGICOS:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
ANTECEDENTES PERSONALES PATOLOGICOS:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
ANTECEDENTES G/O:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
PADECIMIENTO ACTUAL:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
SIGNOS VITALES:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
EXPLORACION FISICA:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
ESTUDIOS DE LABORATORIO Y GABINETE:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
ANEXO 2
TECNICAS DE LABORATORIO UTILIZADAS
METODO DE EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE SANGRE PERIFÉRICA.
METODO SDS-PK
1. Se tomó sangre periférica en 1 tubo con EDTA de 7 ml, se transfirió a un tubo
Nalgene de 50 ml y se agregó buffer de lisis 10+1, se deja reposar por 30 min.
en refrigeración.
2. Se centrifugó por 15 min. a 5,000 rpm a una temperatura de 4 °C. Y se decantó.
3. Se realizaron los lavados necesarios con buffer de lisis 10+1, y se centrifugaron
en las mismas condiciones que en el paso anterior, hasta que el botón estaba
limpio.
4. Se resuspendió en 3 ml de solución B.
5. Se dejo digerir el botón durante toda la noche a 37 °C agregando 100µl de SDS
al 20 % y 50 µl de proteinasa K (20 mg/ml).
6. Se agregó 3 ml de fenol saturado pH 8.0 y agitó durante 15 min. a 37 °C.
7. Se centrifugó a 5,000 rpm durante 15 min.
8. Se transfirió la capa superior a otro tubo Nalgene.
9. Se agregó 3 ml de solución Cloroformo-Alcohol isoamilico (24:1) a la capa
superior y agitó suavemente por 15 min. (Baño María a 37°C).
10. Se retiró la fase que contiene el ADN (la superior) y se pasó a un tubo Falcon
de 20ml.
11. Se añadieron 2 volúmenes de Etanol frío al 100% para precipitar el ADN
mezclando suavemente.
12. Se retiró el ADN, y se colocó en un tubo eppendorf de 2 ml realizando lavado
con Etanol al 100% y centrifugando a 7,500 rpm durante 10 min.
13. Se realizaron 2 lavados más con alcohol frío al 70% en las mismas condiciones
de centrifugación del paso anterior.
14. Se retiró el alcohol y se dejó evaporar el exceso de alcohol.
15. Se agregaron 200 µl de Buffer TE pH 7.5
16. Se colocó el ADN a baño maría en agitación suave a 37 °C toda la noche para
que se disuelva en el buffer TE.
17. Por ultimo se determinó la concentración y calidad del ADN extraído por
espectrofotometría.
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ANEXO 3
CUANTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN DE PUREZA DEL ADN
EXTRAÍDO. MÉTODO CUANTITATIVO
Espectrofotometría
Se basa en la medición espectrofotometrica de la cantidad de radiación UV absorbida
por las bases nucleotídicas. Se tomaron las lecturas a 260nm y 280nm. A 260nm se
calculó la concentración de ácidos nucleicos y a 280nm la de proteínas. Una densidad
óptica(D.O) de 1 corresponde a ~50µg/ml de ADN doble, 40µg/ml de ADN sencillo y
ARN, y ~20µg/ml de oligonucleotidos unicatenarios o sencillos. La pureza de los
ácidos nucleicos se determinó por la razón entre las lecturas a 260nm y 280 nm
(D.O.260/D.O.280) Preparaciones puras de ADN y ARN tienen valores de 1.8 y 2.0
respectivamente. Si hay contaminación con proteínas o fenol, la razón D.O.260/D.O.280
será significativamente menor que los valores mencionados.
Se determinó la concentración y pureza del ADN por medio del método
espectrofotométrico de la siguiente manera:
1. Se calibró el blanco siguiendo las indicaciones del equipo.
2. En una cubeta de 500 µl, se agregó primero 10 µl de la muestra del ADN
extraído y luego 490 µl de agua ultrapura.
3. Se tapó la cubeta con el papel parafina y se mezclo suavemente por inversión el
contenido, evitando la formación de burbujas de aire.
4. Previa limpieza de la cubeta con papel filtro, se introdujo la cubeta en el
dispositivo del electrofotómetro y se leyó la densidad a 260 y 280 nm, ya que el
ADN se encuentra asociado naturalmente a proteínas, y estos son los picos de
máxima absorbancia del ADN y de las proteínas respectivamente.
5. Repetir los pasos para cada muestra.
Se obtuvo la concentración de ADN en la muestra mediante la siguiente fórmula.:
[DNAdc]= (Fd cubeta) x (50ng/µl)/DO260nm.
FD = factor de dilución = Volumen de la cubeta / Cantidad de ADN a cuantificar
Ejemplo: Volumen de cubeta: 500
Cantidad de ADN: 10 µ l Cantidad de Agua Ultrapura: 490 µ l
FD = factor de dilución = 500/10 = 50
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ANEXO 4
CUANTIFICACIÓN Y PUREZA DEL ADN
LA
ESPECTROFOTOMETRÍA
es
un
método
que
sirve
para
determinar
cuantitativamente la cantidad de genoma y de proteínas (concentración y pureza).
Procedimiento:
1. Ajustar el espectrofotómetro a la longitud de onda deseada (260 y 280 nm).
2. Ajustar a cero con el blanco (agua).
3. Colocar 1.0 ml de agua desmineralizada y depositarla en una celdilla de cuarzo,
adicionar 5 µl de muestra de ADN y mezclar.
4. Colocar la celdilla con la mezcla en el espectrofotómetro y obtener la densidad
óptica (DO) a 260 nm para determinar la concentración de ADN y a 280 nm para
determinar la concentración de proteínas.
5. Calcular la concentración y pureza del ADN a partir de los datos obtenidos. La
concentración de ADN se calcula tomando en cuenta el coeficiente de extinción
molar de 50 ng/ml de ADN, que tiene la máxima absorbancia de 1.0 unidad de DO a
260 nm y cuyo valor es 50 y la dilución usada. Para ello se utiliza la siguiente
fórmula:
conc. ADN ng/µl = D.O. 260 nm * factor de dilución ( 1005µl/5µl) * 50 (valor
constante).
6. Determinar la pureza del ADN con la siguiente fórmula:
Pureza del ADN= D.O. 260 nm/ D.O. 280 nm.
El valor mínimo de pureza no deberá ser menor a 1.4 para reacciones estándar de PCR.
El valor de 1.8 o más es el deseable.
LA ELECTROFORESIS es útil para estimar de manera cualitativa la
pureza,
concentración y calidad del ADN.
Procedimiento:
1. Preparar un gel de agarosa al 1% en solución amortiguadora TBE 0.5X .
2. Depositar 5 µl de la solución de ADN con 3 µl de jugo azul.
3. Correr el gel a 120 V por 2 h.
4. Teñir el gel con bromuro de etidio y visualizar el ADN en un transiluminador de luz
UV.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Una banda nítida en el gel indica una pureza e integridad adecuadas para la
amplificación por PCR. La presencia de un barrido es sugestiva de una contaminación
por sales, mientras que la aparición de múltiples bandas es señal de una degradación del
ADN y si no se observa ninguna banda probablemente no se extrajo suficiente cantidad
de ADN.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
ANEXO 5
IDENTIFICACION MOLECULAR DE POLIMORFISMOS DEL GEN DE LPL
MEDIANTE PCR-RFLP
Reacción estándar de PCR:Reactivos
Buffer PCR
Concentración Final
1x
MgCl2
1.5mM
dNTP´s
200µM
iniciador 5´
10 pmol
iniciador 3´
10 pmol
Taq polimerasa
1U
ADN genómico
200 ng/µl
Volumen final
20 µl
c/u
Condiciones para la RCP
Etapa
Temp Tiempo
1.- Desnaturalización
94°C 5 min
Inicial
2.- Desnaturalización
94°C 1 min
3.- Alineación
57°C 1 min
4.- Extensión
72°C 1 min
5.- Del 2 al 4 30 ciclos
6.- Extensión final
7.- Enfriamiento
72°C 10 min
4°C
5 min
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
REACCIÓN ESTÁNDAR DE PCR EMPLEADA EN EL ESTUDIO
Se preparó la PCR mix con las siguientes cantidades:
CONCENTRACIÓN
VOLUMEN
FINAL POR MUESTRA
UNA MUESTRA
Buffer PCR 10X
1x
1µl
MgCl2 50mM
1.5mM
0.3 µl
dNTP´s
200µM
1 µl
Iniciador 5´
0.5µmol
1 µl
Iniciador 3´
0.5µmol
1 µl
Taq
0.5 U
1 µl
ADN genómico
200 ng/µl
1 µl
Agua inyectable
-
4.5 µl
polimerasa
PARA
(19:1)
La PCR se efectuó en un termo-ciclador modelo ROBOCYCLER gradient-40, con tapa
caliente, marca STRATAGENE
ETAPA
TEMPERATURA
TIEMPO
Desnaturalización Inicial
96 °C
7 minutos
Desnaturalización
94 °C
1 minutos
Alineación
55 °C
1 minutos
Extensión
72 °C
1 minutos
Extensión final
72 °C
7 minutos
Enfriamiento
4 °C
Indefinido
Del 2 al 4 por 30 ciclos
Después de la amplificación las muestras se guardaron a 4 °C hasta su posterior análisis
por electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA 6%
1. 1.-Se prepararon cristales y espaciadores en cámara vertical para vaciar la
solución siguiente:
48ml de Buffer TBE 1X
12ml de solución de Poliacrilamida/Bisacrilamida 29:1
600µl de Persulfato de amonio 10%
60µl de TEMED (tetraetil-metil-diamina)
2. Se dejó reposar por 30 minutos. Posteriormente se lavó con agua de la llave.
3. Se colocó en cámara de electroforesis vertical, agregándose Buffer TBE 1X.
4. Se realizó precorrimiento por 10 minutos a 120 volts.
5. Se colocó 5µl del amplificado de cada una de las muestras mezclado con 2µl de
jugo azul (azul bromofenol 0.25%, xilencianol 0.25%, sacarosa 40%).
6. Se montaron en los pocitos del gel, dejando el pocito central para colocar 3.5µl
del marcador de PM de 50pb.
7. Se corrió por una hora 30 minutos a 200volts.
8. Se tiño con Nitrato de plata (AgNO3).
TINCIÓN DE GEL DE POLIACRILAMIDA CON AgNO3
1. Se colocó el gel en un recipiente plano, agregando solución fijadora y agitando
por 20 minutos.
2. Se agregó 100 ml de solución AgNO3 0.2%. Se agitó por 5 minutos y se retiró.
3. Se lavó 2-3 veces con agua desionizada
4. Se agregó solución reveladora usada para eliminar el exceso de AgNO3 y se
retiro.
5. Se agregó 100ml de solución reveladora a la que previamente se le agregó 500µl
de formaldehído y se agitó hasta la aparición de bandas teñidas de ADN
amplificado.
6. Se lavo 2-3 veces con agua desionizada. Y se colocó en papel filtro, dentro de
una bolsa transparente previamente rotulada.
7. Se guardó a 4 °C.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
LA ESTANDARIZACION
PARA PCR QUEDA DE LA SIGUIENTE
MANERA:
POLIMORFISMO
TEMPERATURA
PROGRAMA
CICLOS
T495G
57 C°
59
38
DN9
62 C°
60
38
N2951S
52 C°
61
38
DIGESTIÓN CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (HIND III, RsaI,
TaqI)
1. En un volumen final de 10 µl se colocaron 5 µl de amplificado y 5 µl mezcla de
digestión.
2. Se preparó mezcla de digestión, según el número de muestras:
VOLUMEN
PARA
CONCENTRACIÓN
UNA FINAL
MUESTRA
Buffer Digestión 10X
1µl
Enzima de digestión 0.5µl
1x
0.5 u/µl
(Hind III, Rsa I, Taq I)
Agua inyectable
3.5µl
Amplificado
5µl
Las temperaturas y tiempo fueron los siguientes:
3. Hind III y RsaI a 37º C, por 5 horas, TaqI a 65ºC por 3 horas.
4. Se sometió el producto de la digestión a electroforesis en gel de poliacrilamida
al 6%.
5. Se corrio por 1 hora 45 minutos a 200 volts.
6. Finalmente se realizó tinción con Nitrato de plata y se visualizó para su
interpretación en una lámpara de luz.
ASOCIACION DE POLIMORFISMOS T495G, N291S Y D9N DEL GEN DE LA LIPOPROTEINLIPASA CON INFARTO CEREBRAL
Gel de poliacrilamida donde se observa los polismorfismos, y los cortes con la
enzima
MPM
100pb
400pb
Hind III
D9N
355pb
300pb
260pb
216pb
215pb
200pb
139pb
N291S
100pb
90pb
76pb
HindIII=T495G
Genotipificación con base en el patrón de restricción:
Polimorfismo
Genotipo
Bandas esperadas
T495G
TT
217,138
TG
355,217,138
GG
355
GA
96,72,66
GG
96,66
AA
234,96,72,66
AG
243,218
AA
243
GG
243,218,25
D9N
N291S