Protocolos de extracción de ADN total de mariposas
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1 Protocolos de extracción de ADN total de mariposas utilizando Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol 1. Materiales -Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL y de 100-1000ul -Baño de María -Incubadora -Campana de extracción -Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm -Juego de disección, que incluya: una tijera pequeña, una pinza entomológica y un bisturí -Congelador (-20°C) -Cámara de electroforesis horizontal -Tubos de 1,5ml -Guantes de látex sin polvo 2. Reactivos -Tris-HCL -EDTA -SDS -NaCl -Proteinasa K -Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol (25:24:1) -Isopropanol -Etanol -TE (10:1) -RNasa 3. Preparación de soluciones A) Buffer de extracción Reactivo Tris-HCl (pH=8.0) EDTA (pH=8.0) SDS NaCl (opcional) Protocolos de laboratorio UEG 2009 Concentración en solución 100mM 50mM 1% 500mM Por: Duina Posso Duque 2 Nota: Mezcle los ingredientes, complete al volumen deseado y autoclave. Este Buffer se puede almacenar por meses en la nevera, a 4°C. B) T10E1 Reactivo Tris-HCl (pH=8.0) EDTA (pH=8.0) Concentración en solución 10mM 1mM Nota: Completar el volumen con agua destilada, autoclavar y guardar al 4°C. 4. Protocolo Tejido utilizable: Patas, antenas, tórax. Los otros tejidos no se utilizan por que contienen metabolitos secundarios que pueden afectar la PCR. 1) Precalentar el buffer de extracción a 55°C por 10min 2) En un tubo de 1,5mL introducir 20g de los tejidos utilizable 3) Agregar 500uL del buffer de extracción precalentado 4) Picar el tejido con la tijera hasta tener trozos muy pequeños 5) Agregar 10uL de ProteinasaK (20mg/mL) 6) Incubar a 55°C por una noche entera 7) Agregar 500uL de Fenol:cloroformo:isoamilalcohol. Resuspender por inversión cuidadosamente hasta que se forme una emulsión (unas 30 inversiones). El fenol:cloroformo es sumamente tóxico y todo el trabajo con este reactivo debe hacerse en campana de extracción (ver ficha MSDS adjunta). 8) Centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. 9) Transferir la fase acuosa (la de arriba) con una pipeta a un tubo nuevo de 1,5mL. 10) Repetir la limpieza con fenol:cloroformo:isoamilalcohol (pasos 7-8-9). Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 3 11) Agregar un volumen de NaCl (5M) correspondiente al 10% de la muestra, y mezclar bien. 12) Agregar un volumen de isoppropanol frio correspondiente al volumen de la muestra resultante del punto 10. 13) Incubar a -20°C de 2 horas en adelante. Nota: En este paso se puede dejar la muestra en el congelador por una noche completa o varios días. Entre más tiempo se deje en frio se puede recuperar una mayor cantidad de ADN. Cuando el ejemplar, esta recientemente colectada (pocos días) no es necesario dejar por más de dos horas. Si el ejemplar es antiguo y no ha sido almacenado correctamente se recomienda dejarlo aunque sea una noche en el congelador. 14) Centrifugar a temperatura ambiente, a 12000rpm durante 5min y descartar líquido por inversión del tubo. 15) Agregar 400uL de etanol frio al 70% 16) Centrifugar a temperatura ambiente a 12000rpm durante 3 min y descartar el líquido por inversión del tubo. 17) Dejar secar el ADN a temperatura ambiente, con el tubo abierto. 18) Resuspender en 50uL de T10E1 (10mM) y agregar 1uL de RNasa (10mg/mL). En su defecto resuspender en agua milliQ autoclavada. 19) Incubar A 37°C por 20min Nota: si la muestra de ADN se ve sucia, con alguna coloración marrón, se puede limpiar una vez más la muestra repitiendo los pasos 12-13-14-15-16-17 y resuspendiendo solo en TE o agua. 20) Visualizar 1ul de la muestra en un gel de agarosa al 0.8% 5. Resultados obtenidos con este método de extracción Tres ejemplares de mariposas fueron utilizados para la extracción de ADN mediante el método de fenol:cloroformo:isoamilalcohol descrito anteriormente. Uno de ellos consistió en una mariposa fresca, capturada el mismo día de la extracción. Los otros dos ejemplares fueron mariposas colectadas en el 2008 y almacenadas en sobres de papel mantequilla hasta el momento de la extracción. La extracción se hizo partiendo de las patas, antenas y el abdomen de las mariposas y se utilizó aproximadamente la misma cantidad de tejido para cada uno de los ejemplares. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 4 El resultado de la extracción se vio en un gel de agarosa al 0.8% (ver Figura1). En el gel puede verse diferencias en la calidad y cantidad del ADN extraído para cada individuo. El ADN obtenido a partir de la mariposa fresca es un ADN de buena calidad, presenta una banda clara en lo alto del gel, y una concentración elevada, alrededor de 200ng/uL. Por el contrario el ADN extraído a partir de las mariposas de un año es un ADN degradado, se ve una mancha a través del canal. Por esto se recomienda trabajar con individuos frescos. Figura1: ADN total de mariposas extraído con el método de fenol:cloroformo:isoamilalcohol. Visualización en un gel de agarosa al 0.8% teñido con Sybr Safe. A) Mariposa fresca. B) Mariposas con un año de antigüedad de colecta. Se sirvieron 3uL de cada muestra en el gel. 6. Bibliografía Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. ‘‘Molecular Cloning: A Laboratory Manual,’’ Cold Spring Harbor Laboratory Martin J.-F., A. Gilles and H. Descimon. 2000. Molecular Phylogeny and Evolutionary Patterns of the European Satyrids (Lepidoptera: Satyridae) as Revealed by Mitochondrial Gene Sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution Vol. 15, No. 1, pp. 70–82. Como citar este protocolo: Duina Posso Duque. Protocolos de extracción de ADN total de mariposas utilizando Fenol:Cloroformo:Isoamilalcohol. Protocolos de laboratorio UEG (http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/). 2009. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Altos de Pipe- Venezuela. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque
