Documento descargado de http://www.elsevier.es el 26/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. Med Clin (Barc). 2011;137(5):221–229 www.elsevier.es/medicinaclinica Revisión De la citogenética convencional al análisis por micromatrices. Cincuenta años del cromosoma Filadelfia Jesús M. Hernández a,*, Isabel Granada b y Francesc Solé c, en representación del Grupo Cooperativo Español de Citogenética Hematólogica a Servicio de Hematologı´a, Hospital Universitario de Salamanca y Unidad de Diagnóstico Molecular y Celular del Cáncer, Instituto de Biologı´a Molecular y Celular del Cáncer (IBMCC), Centro de Investigación del Cáncer, Universidad de Salamanca, Salamanca, España b Servicio Laboratorio de Hematologı´a, Hospital Germans Trias i Pujol, Institut Català d’Oncologia, Badalona, España c Laboratori de Citogenètica Molecular, Servei de Patologı´a, Hospital del Mar, Escola Citologia Hematològica Soledad Woessner/Institut Municipal d’Assistencia Sanitaria (IMAS), España I N F O R M A C I Ó N D E L A R T Í C U L O R E S U M E N Historia del artı´culo: Recibido el 31 de marzo de 2010 Aceptado el 27 de abril de 2010 On-line el 29 de junio de 2010 Desde la descripción, en el año 1960, del cromosoma Filadelfia como una alteración asociada con la leucemia mieloide crónica se han descrito una multitud de alteraciones citogenéticas en los enfermos con hemopatı́as malignas, de manera que, en la actualidad, la realización de estos estudios es imprescindible en estas enfermedades. La presencia de cambios citogenéticos no solo contribuye a un mejor diagnóstico y clasificación de las leucemias y de los linfomas, sino que es un factor pronóstico de primer nivel. Por esto, la clasificación de la Organización Mundial de la Salud las ha incluido como parte fundamental del diagnóstico de las hemopatı́as malignas. El desarrollo de la hibridación «in situ» fluorescente y, más recientemente, de las micromatrices ha contribuido a un mejor conocimiento de estas enfermedades, por lo que se consideran un complemento de los estudios citogenéticos. Los cambios citogenéticos observados en estos enfermos son, en ocasiones, una pieza clave en el enfoque terapéutico. ß 2010 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. Palabras clave: Citogenética Hemopatı́as malignas Cromosoma Filadelfia Hibridación in situ fluorescente From conventional cytogenetics to microarrays. Fifty years of Philadelphia chromosome A B S T R A C T Keywords: Lymphoma cytogenetics Hematological malignancies Philadelphia chromosome Fluorescence in situ hybridization In 1960 Ph-chromosome was found associated with the presence of chronic myelogenous leukemia. In these 50 years an increasing number of cytogenetic abnormalities have been found associated with hematological malignancies. The presence of these abnormalities is not only important for the diagnosis of the patient, but it also contributes to the prognosis of patients with leukemia or lymphoma. For this reason the WHO classification of hematological disease has included these studies for the correct characterization of leukemias and lymphomas. In addition, the use of FISH and micromatrix methodologies have refined the genetic lesions present in these malignancies. The cytogenetic changes observed also provide further information in relation to the therapy. ß 2010 Elsevier España, S.L. All rights reserved. Introducción Se cumplen 50 años de la observación realizada por Nowell y Hungerford de un cromosoma pequeño en cultivos de la medula ósea de pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC)1. A este cromosoma se lo llamó Filadelfia (Ph), porque su descubrimiento tuvo lugar en esta ciudad americana. En el año 1970 Prieto et al * Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (J.M. Hernández). definieron que el cromosoma pequeño correspondı́a al cromosoma 222 y, más adelante, con técnicas de bandeo cromosómico (bandas G) se confirmó que era resultado de la traslocación entre los cromosomas 9 y 22, la traslocación(9;22)(q34.1;q11.2)3 (fig. 1). Por tanto, se considera que el descubrimiento del cromosoma Ph marcó el inicio de la citogenética hematológica o la citogenética tumoral. Posteriormente se identificó otra serie de alteraciones asociadas con tumores hematológicos, como el linfoma de Burkitt, la leucemia aguda promielocı́tica o los sı́ndromes mielodisplásicos (tabla 1)4. A partir de este momento, los análisis citogenéticos adquirieron mayor importancia en el estudio de las neoplasias y, 0025-7753/$ – see front matter ß 2010 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. doi:10.1016/j.medcli.2010.04.016 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 26/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. [()TD$FIG] J.M. Hernández et al / Med Clin (Barc). 2011;137(5):221–229 222 Figura 1. Citogenética convencional e hibridación in situ con fluorescencia en un paciente con leucemia mieloide crónica Filadelfia positiva. A) Cariotipo en el que se observa la t(9;22)(q34;q11). B) Hibridación «in situ» de este enfermo que demuestra la fusión del gen BCR (verde) localizado en el cromosoma 22 y del gen ABL (rojo) localizado en el cromosoma 9. Tabla 1 Principales alteraciones citogenéticas Abreviatura Significado Concepto Ejemplo þ t der del inv i Trisomı́a Monosomı́a Translocación Cromosoma derivado Deleción Inversión Isocromosoma Ganancia de un cromosoma Pérdida de un cromosoma Intercambio recı́proco del material genético entre 2 o más cromosomas Intercambio no recı́proco del material genético entre 2 o más cromosomas Pérdida del material genético dentro de un brazo de un cromosoma Intercambio recı́proco del material genético dentro del mismo cromosoma Pérdida completa de un brazo de un cromosoma acompañada de la duplicación del otro brazo þ8 7 t(9;22) der(9)t(9;22) del(5) inv(16) i(17)(q10) sobre todo, de las hemopatı́as malignas. Los avances registrados en este campo, complementados con las técnicas de fluorescence in situ hybridization (FISH, ‘hibridación in situ fluorescente’) o de matrices de comparative genomic hybridization/single nucleotide polymorphisms (CGH/SNP, ‘hibridación genómica comparada/ polimorfismos de un único nucleótido’) o genómicos, han permitido identificar subgrupos clı́nicos asociados con cambios cromosómicos especı́ficos y, en muchas ocasiones, los genes implicados. Estas alteraciones cromosómicas han sido y siguen siendo de gran utilidad para diagnosticar la enfermedad, en su seguimiento, en el pronóstico y, en casos concretos, para ofrecer al paciente un tratamiento especı́fico en función del cambio genético. Por este motivo, en la actualidad es impensable abordar el diagnóstico de neoplasia hematológica sin realizar su estudio citogenético5. En la interpretación de los resultados citogenéticos es imprescindible considerar la historia clı́nica del paciente, los hallazgos de laboratorio (analı́tica, citologı́a o citometrı́a de flujo) y otras técnicas de biologı́a molecular. Por esto, es necesaria una estrecha colaboración entre los citogenetistas, los hematólogos y los demás profesionales implicados en el diagnóstico, para interpretar el significado y el valor del cambio cromosómico hallado en un paciente. A nivel técnico, es asimismo importante tener en cuenta el tipo de material que debe utilizarse para la realización de un estudio citogenético, que necesariamente corresponderá al tejido en el que está más expresada la enfermedad. En los linfomas hay que analizar los ganglios linfáticos, mientras que en la leucemia linfática crónica (LLC) y en otras enfermedades linfoides el estudio puede efectuarse en sangre periférica al hallarse en esta una gran proporción de células leucémicas. No obstante, tanto para el mieloma múltiple como para los sı́ndromes mielodisplásicos (SMD), las neoplasias mieloproliferativas (NMP) y las leucemias agudas se requiere el estudio de la médula ósea para obtener la debida información citogenética. Métodos de estudio citogenético A partir de 1980 se desarrolló una serie de metodologı́as, como la FISH, la PCR (polymerase chain reaction) y, más recientemente, las matrices genómicas, que permiten solventar las principales carencias de la citogenética6. Serı́a un error importante pensar que estas técnicas son sustitutorias de la citogenética convencional, sino que son técnicas complementarias. Seguidamente se describen las principales caracterı́sticas y aplicaciones de estos métodos. Citogenética convencional La citogenética se basa en la visualización de los cromosomas para la realización del cariotipo. Es necesario un cultivo celular y la obtención de células en división. Esta técnica sigue y seguirá siendo vigente porque proporciona una visión global del genoma y permite detectar alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales. Sin embargo, entre sus principales limitaciones hay que destacar la dificultad en la obtención de metafases de las células neoplásicas y su baja resolución (tamaño mı́nimo de las alteraciones), que no permite la detección de alteraciones cromosómicas que afecten a regiones genéticas inferiores a 10 Mb (tabla 1). Hibridación «in situ» fluorescente La FISH permite detectar y localizar secuencias especı́ficas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) sobre preparaciones cromosómicas, extensiones celulares y cortes de tejido. Es un complemento de la Documento descargado de http://www.elsevier.es el 26/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. J.M. Hernández et al / Med Clin (Barc). 2011;137(5):221–229 223 Tabla 2 Ventajas e inconvenientes de las técnicas de hibridación in situ «convencionales» y de las nuevas técnicas de citogenética molecular Técnica Ventajas Inconvenientes FISH centromérica FISH especı́fica del locus FISH pintada cromosómica No requiere células en división No requiere células en división Muy útil para alteraciones complejas FISH multicolor Permite obtener información de todos los cromosomas Muy útil para descifrar cariotipos complejos CGH No requiere células en división Requiere una pequeña cantidad de ADN Permite estudiar el material archivado Permite detectar las ganancias (>4–5Mb) y las pérdidas (>10–20Mb) de todo el genoma No requiere células en división Requiere una pequeña cantidad de ADN Permite estudiar el material archivado Permite detectar las ganancias y las pérdidas de cualquier parte del genoma con una resolución de 5–100Kb Pueden detectar UPD o LOH Solo informa de alteraciones numéricas Solo informa del locus que se estudia Requiere células en división Solo informa del cromosoma analizado Requiere células en división No detecta alteraciones estructurales dentro de un mismo par cromosómico No detecta alteraciones estructurales de ADN menores de 500–1.500Kb No detecta alteraciones equilibradas Requiere una infiltración tumoral mı́nima del 50% No permite la cuantificación de las ganancias o de las pérdidas SNP/CGH matriz No detecta alteraciones equilibradas Baja sensibilidad (30%) ADN: ácido desoxirribonucleico; CGH: hibridación genómica comparada; FISH: hibridación «in situ» fluorescente; LOH: pérdida de heterozigosidad; SNP/CGH: comparative genetic hybridization/single nucleotide polymorphisms; UPD: disomı́a uniparental. citogenética convencional y suple parte de sus limitaciones (tabla 2). A continuación se explican los tipos básicos de FISH. Hibridación in situ fluorescente convencional Se usan 3 tipos principales de sondas: centroméricas, de pintado cromosómico y de secuencia única o especı́ficas de locus7,8. Las sondas centroméricas están formadas por una secuencia repetitiva de ADN que hibrida con el ADN de la región centromérica. Permiten detectar alteraciones cromosómicas numéricas en metafase y en núcleos en interfase (citogenética interfásica). Mediante su uso se puede valorar la presencia o la ausencia de las alteraciones numéricas (monosomı́as o trisomı́as) sin la necesidad de tener células en división. Las sondas de pintado cromosómico están formadas por un conjunto de sondas que hibridan con todo el cromosoma. Permiten visualizar las alteraciones citogenéticas numéricas y estructurales sobre las metafases, y permiten confirmar de forma inequı́voca los cariotipos con traslocaciones complejas o con cromosomas marcadores. Las sondas de secuencia única hibridan con el ADN de una región genómica concreta, correspondiente a un gen o a una banda cromosómica. Con estas es posible detectar alteraciones numéricas y estructurales tanto en las metafases como en los núcleos interfásicos. Estas sondas son de gran utilidad para precisar alteraciones cromosómicas difı́ciles de identificar con las técnicas de bandeo convencionales y permiten visualizar alteraciones genéticas sin necesidad de tener células en división (muy útil para utilizar sobre los tejidos parafinados, la frotis de sangre o de la medula ósea). Hibridación in situ fluorescente multicolor Las técnicas de FISH multicolor o spectral karyotyping se desarrollaron con la intención de resolver las carencias de la FISH «convencional» y de aportar una mayor información en el conocimiento del cariotipo6,9. Se basan en la cohibridación de 24 sondas de pintado cromosómico marcadas con fluorescencia sobre las metafases. El resultado de la hibridación permite visualizar simultáneamente cada par cromosómico de un color diferente. Son muy útiles para determinar de forma inequı́voca los cariotipos complejos y los cromosomas marcadores. Sin embargo, necesitan analizar células en división y no permiten el reconocimiento de reordenamientos de regiones de pequeño tamaño (inferiores a 500–1.500 Kb), para los que es necesario utilizar sondas de locus especı́fico8,9. Hibridación genómica comparada La hibridación genómica comparada (CGH) es una técnica que permite detectar cambios numéricos de secuencias de ADN (pérdidas, deleciones, ganancias y amplificaciones) en el tejido tumoral. En esta se hibridan el ADN tumoral y el ADN control, marcados con fluorocromos de distinto color, sobre las metafases normales. Se ha aplicado al análisis de los cambios numéricos en los tumores sólidos y en las neoplasias hematológicas de ı́ndice proliferativo bajo, ya que no es necesaria la obtención de las metafases10. Es de gran utilidad en aquellos casos que presentan cariotipos complejos. Sin embargo, únicamente detecta los cambios presentes en una proporción elevada de células tumorales (50%) y tiene una baja resolución. Además, no permite detectar traslocaciones o inversiones (inv), ya que no conllevan ganancias o pérdidas de material genético. Micromatrices El desarrollo tecnológico, junto con la mejora de las herramientas informáticas, ha permitido la creación de plataformas que realizan el análisis simultáneo de hasta 40.000 genes de una misma muestra. Esta tecnologı́a recibe el nombre de micromatrices, biochips o microarrays11–13. Se puede aplicar al estudio de los niveles de expresión de genes, mediante el análisis del ARN mensajero de la muestra, y al estudio de las alteraciones genómicas, básicamente las ganancias y las pérdidas, mediante el análisis del ADN genómico de la muestra de interés13. Con el mismo fundamento de la CGH ha surgido la técnica denominada matriz-CGH o matriz genómica, en la que la hibridación del ADN tumoral microarrays de cromosomas artificiales de levadura (BAC) o sobre microarrays de oligonucleótidos (arrays de CGH o de polimorfismos de un único nucleótido [SNP]), representativos de todo el genoma, que permiten detectar cambios genéticos inferiores a 1 Mb. Las micromatrices se han aplicado al estudio de todas las neoplasias hematológicas. Los SNP matrices tienen la ventaja añadida de poder detectar disomı́as uniparentales (UPD) o pérdidas de heterocigosidad (LOH) neutras, cambios genéticos que conllevan que un gen esté en homocigosis sin existir ni ganancia ni pérdida de material genético. Mediante los SNP matrices se ha comprobado la presencia de disomı́as uniparentales asociadas con hemopatı́as malignas14,15. Dada la existencia de Documento descargado de http://www.elsevier.es el 26/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. J.M. Hernández et al / Med Clin (Barc). 2011;137(5):221–229 224 distintas plataformas de micromatrices y chips con distintos niveles de resolución, deberán establecerse unas recomendaciones de consenso para que todos los grupos utilicen los mismos criterios a la hora de definir la presencia de las alteraciones genéticas16. La citogenética en el estudio de las hemopatı́as malignas Leucemias agudas La importancia del estudio citogenético en el diagnóstico de las leucemias agudas ha motivado su inclusión como herramienta fundamental para la clasificación de las hemopatı́as malignas de la Organización Mundial de la Salud junto a la morfologı́a, el inmunofenotipo y las caracterı́sticas clı́nicas5. Además, se ha demostrado repetidamente que las anomalı́as cromosómicas halladas en el momento del diagnóstico son el principal factor pronóstico independiente, tanto en las leucemias mieloides agudas (LMA) como en las linfoides. Leucemia mieloide aguda Hasta la fecha se han descrito más de 200 alteraciones cromosómicas recurrentes en la LMA, que incluyen traslocaciones, deleciones, inserciones, isocromosomas, trisomı́as o monosomı́as (tablas 1 y 3)17. Las alteraciones más frecuentes varı́an en función de la localización geográfica y con la edad del paciente: la traslocación(15;17)(q22;q21) de la leucemia promielocı́tica aguda se encuentra con mayor frecuencia en la población latina que en la blanca, mientras que la traslocación(8;21)(q22;q22) se observa con más frecuencia en la población asiática y es menos frecuente en nuestro paı́s18 (fig. 2). La incidencia de los cariotipos alterados es menor en el adulto que en los pacientes pediátricos diagnosticados de LMA de novo (el 55 frente al 76%)19. Ası́, las traslocaciones que implican el gen MLL localizado en 11q23, son 4 veces más frecuentes en los niños que en los adultos. Otras alteraciones se producen solo en niños, como es la traslocación(1;22)(p13;q13), con fusión de los genes OTT-MAL, que se asocia con la leucemia megacarioblástica y es casi exclusiva de los niños con edades inferiores a los 2 años, al igual que ocurre con la traslocación(7;12)(q36;p13). Por el contrario, la traslocación(15;17) y la traslocación(8;21), las 2 anomalı́as más frecuentes en los adultos y en los niños mayores, nunca se han observado en niños menores de un año. De igual manera, la traslocación(3;3)(q21;q26) o la inv(3)(q21q26), que se detectan en el 2% de los adultos, nunca se producen en pacientes diagnosticados de LMA de novo de edades inferiores a 12 años (tabla 3)19. La reunión internacional de cromosomas en leucemia de 1984 (4IWCL) fue el primer gran estudio prospectivo y multicéntrico que definió el cariotipo del diagnóstico como factor pronóstico Tabla 3 Frecuencia y pronóstico de las alteraciones más recurrentes en la leucemia mieloide aguda Alteración cromosómica LAM infantil (%) LAM adulto (%) LAM viejo (%) Pronóstico t(15;17)(q22;21) PML-RARA t(8;21)(q22;q22) RUNX1-RUNX1T1 inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) CBFB-MYH11 t(9;11)(p22;q23) MLLT3-MLL Cariotipo normal þ8 Y 9q þ21 Alteraciones 11q23/MLL 7q 7 5q/5 t(6;9)(p23;q34) DEK-NUP214 t(9;22)(q34;q11) BCR/ABL inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26) RPN1-EVI1 t(1;22)(p13;q13) RBM15-MKL1 Cariotipo complejo (3 alteraciones) 9,9 11,6 5,9 6,4 24 9,5 3,8 2,8 5,1 13,1 1,5 2,8 1,2 1 0,2 0 0–3 9,7 9 4 2 – 47 9 2 2 2 3 6 8 <1 1 3 – 9 5 4,5 2,5–5 – 45–48 – – – – 0,9 – – – – – – – 13–15 Bueno Bueno Bueno Intermedio Intermedio Intermedio Intermedio Intermedio Intermedio Intermedio Intermedio Malo Malo Malo Malo Malo Malo Malo inv: inversión; LAM: leucemia mieloide aguda; t: translocación. [()TD$FIG] Figura 2. Cariotipos parciales de las principales alteraciones citogenéticas relacionadas con buen y con mal pronóstico en la leucemia mieloide aguda. Documento descargado de http://www.elsevier.es el 26/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. J.M. Hernández et al / Med Clin (Barc). 2011;137(5):221–229 independiente en la LMA20. Desde entonces muchos estudios han confirmado este hecho. Sobre la base de los resultados del cariotipo pretratamiento, se han definido 3 grupos citogenéticos de riesgo: favorable, intermedio y adverso; aunque en el significado pronóstico de algunas alteraciones, como los reordenamientos 11q23 y la pérdida de 7q, hay divergencias entre los diferentes estudios publicados21–23. Una de las anomalı́as de riesgo favorable es la traslocación(15;17), con fusión de los genes PML/RARA, en la que el tratamiento con ácido all-transretinoico en combinación con quimioterapia obtiene una tasa elevada de curaciones. El resto de las LMA se tratan con quimioterapia intensiva o con trasplante de progenitores hematopoyéticos. La inv(16)(p13q22) y la traslocación(8;21)(q22;q22) pertenecen al grupo de riesgo favorable, con supervivencias globales a los 5 años superiores al 50%. Por el contrario, la inv(3)/traslocación(3;3), la traslocación(6;9), la monosomı́a del cromosoma 7 y los cariotipos complejos (3 alteraciones) se asocian con mal pronóstico y con supervivencias globales a los 5 años cercanas al 10%21–23 (fig. 2). Los pacientes con citogenética normal se incluyen en la categorı́a de riesgo intermedio, con supervivencias globales a los 5 años del 40%. Una pequeña fracción de LMA con cariotipo normal tiene genes de fusión asociados con reordenamientos crı́pticos que implican segmentos pequeños imposibles de identificar mediante un análisis citogenético estándar (bandas G). Un ejemplo serı́a las insersiones crı́pticas de un pequeño segmento de 17q que contiene el gen RARA en el locus del gen PML del cromosoma 15q en pacientes diagnosticados de leucemia promielocı́tica aguda, que puede detectar fácilmente, con una buena orientación diagnóstica, el citogenetista mediante técnicas de hibridación «in situ». Recientemente, los estudios de matrices de expresión han demostrado que las LMA con alteraciones citogenéticas presentan un perfil de expresión caracterı́stico y distintivo de cada una de estas. Además, el uso de matrices genómicas ha definido la presencia de nuevas alteraciones genéticas en este tipo de leucemias24–27. La presencia de un cariotipo normal en el diagnóstico no significa que los blastos leucémicos no tengan alteraciones genéticas. En muchos de estos casos se observan anomalı́as a nivel molecular, como la duplicación en tándem del gen MLL (PTDMLL), la duplicación interna en tándem del gen FLT3 (FLT3 ITD), las mutaciones puntuales de D835 del gen FLT3 y de los genes NPM1, N-RAS, CEBPA y RUNX1, las pérdidas y las mutaciones puntuales de PU.1, las pérdidas homocigóticas de GSTM1 y de GSTT1, ası́ como la sobreexpresión de los genes BAALC y EVI1. Estas alteraciones también tienen influencia pronóstica en los pacientes con LMA y cariotipo normal. De estas, la duplicación interna en tándem del 225 gen FLT3 se asocia con peor pronóstico. Por el contrario, las mutaciones de los genes NPM1 y CEBPA se asocian con buen pronóstico en las LMA (tabla 3)28. Leucemia linfoblástica aguda Se observan cariotipos alterados entre un 64–85% de los casos de leucemia linfoblástica aguda (LLA) del adulto y en un 90% de los niños. Las alteraciones estructurales más frecuentes son la traslocación(9;22)(q34;q11), la traslocación(4;11)(q21;q23), la traslocación(1;19)(q23;p13.3) y la traslocación(12;21)(p13;q22); los reordenamientos de 11q23, las deleciones de los cromosomas 9p, 6q y 12p, y los reordenamientos de los genes de los receptores de las células T: aTCR-dTCR (14q11), bTCR (7q34) y gTCR (7p1415) (tabla 4). Las alteraciones numéricas de más relevancia son la hiperdiploidı́a superior a 50 cromosomas y la hipodiploidı́a de 30–39 cromosomas. La incidencia y las caracterı́sticas clinicobiológicas de estas alteraciones varı́an en relación con la edad y constituyen un factor pronóstico independiente29. La alteración más frecuente en la LLA-B infantil es la traslocación(12;21), con fusión de los genes TEL (ETV6) y AML1 (RUNX1), que es una alteración crı́ptica desde el punto de vista citogenético. Su frecuencia depende mucho de la edad, ya que supone el 25% de las LLA-B de los niños, pero es excepcional después de los 18 años30. Los pacientes con el reordenamiento TELAML1 (RUNX1) tienen una probabilidad de supervivencia global cercana al 90%, lo que se debe a la gran sensibilidad de los linfoblastos a la quimioterapia31. Por el contrario, la incidencia de la traslocación(9;22) en la LLA aumenta con la edad. Ası́, se observa en menos del 3% de los pacientes de menos de 18 años y su frecuencia aumenta progresivamente hasta situarse en el 53% de los adultos de más de 55 años32. Esta alteración conlleva muy mal pronóstico, pero con los nuevos fármacos inhibidores de tirocinasas, como el mesilato de imatinib, el pronóstico ha mejorado de forma significativa33. Con respecto a las alteraciones cromosómicas numéricas, la hiperdiploidı́a de más de 50 cromosomas solo se observa en torno al 5% de las del adulto, porcentaje muy inferior al descrito en las LLA pediátricas (25%), y se asocia con pronóstico intermedio o favorable34. Los pacientes con hiperdiploidı́a de más de 50 cromosomas y traslocación conocidas presentan las mismas caracterı́sticas clı́nicas y de supervivencia que los casos con la t aislada (seudodiploidı́a). Por el contrario, la hipodiploidı́a, que se asocia con un pronóstico desfavorable, se encuentra alrededor del 5% de los casos, con igual frecuencia entre niños y adultos35,36. Por consiguiente, conforme aumenta la edad se incrementa la frecuencia de las lesiones citogenéticas y moleculares que comportan un mal pronóstico, a la par que hay una marcada Tabla 4 Frecuencia y significado pronóstico de las alteraciones citogenéticas más frecuentes en la leucemia linfoblástica aguda Alteración cromosómica LLA niño (%) LLA adulto (%) Pronóstico Cariotipo normal Hiperdiploidı́a (>50 cromosomas) Hipodiploidı́a (30–39 cromosomas) (presencia de clon triploide acompañante) t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL1 t(4;11)(q21;q23)/AF4-MLL t(v;11q23)/reordenamientos MLL t(1;19)(q23;p13.3)/TCF3/PBX1 t(8;14)(q24;q32)/IgH/c-MYCa t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1 del(6)(q15-q27) Alteraciones de 9p21.3 P16ink4a (CDKN2) Alteraciones de 12p13/ TEL (ETV6) t de los genes TCRb t(10;14)(q24;q11)/TLX1-TCR 31–40 23–26 1 2-6 2 4–5 20–25 6–9 7–11 15–36 4–10 4 11–37 3–8 2–7 3–4 2 – 4–7 5–40 Intermedio Bueno Malo Malo Malo Malo Bueno Intermedio Bueno Intermedio Malo 7–9 3–4 – 4–5,5 2 2–3 Intermedio Intermedio Intermedio del: deleción; Ig: inmunoglobulina; LLA: leucemia linfoblástica aguda; t: translocación. a Incluye sus variantes t(2;8)(p12;q24)/IgK/c-MYC y t(8;22)(q24;q11)/IgL/c-MYC. b aTCR-dTCR (14q11); bTCR (7q34); gTCR (7p1415). Documento descargado de http://www.elsevier.es el 26/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 226 J.M. Hernández et al / Med Clin (Barc). 2011;137(5):221–229 disminución de las lesiones asociadas con un pronóstico favorable (tabla 4). Al igual que en las LMA y en las NMP, en los SMD hay mutaciones genéticas. Recientemente, se ha descrito la mutación del gen TET-2 en el 20–30% de los pacientes45. Sı´ndromes mieloproliferativos o neoplasias mieloproliferativas Sı´ndromes linfoproliferativos Dentro de esta entidad se encuadran la LMC, la trombocitemia esencial, la policitemia vera y la metaplasia mieloide con mielofibrosis. El diagnóstico de la LMC se basa en la presencia de la traslocación(9;22)(q34.1;q11.2) o del cromosoma Ph, aunque en un 5% de los casos esta alteración solo es visible por técnicas de FISH o polymerase chain reaction37. En esta traslocación se fusionan el gen BCR, situado en el cromosoma 22, y el gen ABL1 del cromosoma 9. El conocimiento en profundidad de esta alteración genética ha permitido diseñar fármacos con actividad antitirosina cinasa, base del actual tratamiento de la LMC, que han mejorado de manera notoria su superviviencia38. En la crisis blástica de la LMC es frecuente observar otras alteraciones añadidas al cromosoma Ph, como la presencia de un doble cromosoma Ph, þ8, þ19, Y o isocromosoma del 17q17. El establecimiento de la clonalidad en las NMP se ha resuelto con la detección de la mutación V617F del gen JAK-2. Esta alteración está presente en la mayorı́a de los enfermos con policitemia vera y en la mitad de los casos de mielofibrosis idiopática y de trombocitemia esencial. Las alteraciones citogenéticas son infrecuentes en el resto de las NMP, por lo que no es preciso usar esta metodologı́a en los casos con mutación de JAK-2. Sin embargo, es importante realizar estudios de citogenética y de FISH en las NMP Ph negativas, sobre todo porque algunas de estas tienen reordenamientos de los genes PDGFRa o PDGFRb y estos enfermos responden bien a los inhibidores de la tirosina cinasa39,40. Sı´ndromes mielodisplásicos Este grupo de enfermedades son, en ocasiones, difı́ciles de diagnosticar. Por esto, la detección de alteraciones citogenéticas permite definir la clonalidad del proceso y ayudar a su diagnóstico. Al igual que en la LMA, el cariotipo contribuye a su estratificación pronóstica. El cariotipo normal, la pérdida de un fragmento en el brazo largo del cromosoma 5 (5q), 20q y la pérdida del cromosoma Y, todas estas como única alteración citogenética, se consideran anomalı́as de buen pronóstico, mientras que las alteraciones del cromosoma 7 (7q y 7) y los cariotipos complejos se asocian con mal pronóstico y el resto se consideran de pronóstico intermedio, como la trisomı́a 841–44 (fig. 3). La estratificación pronóstica de los SMD tiene implicaciones clı́nicas evidentes. Ası́, en los enfermos con 5q el tratamiento con lenalidomida mejora la calidad de vida con una disminución de requerimientos transfusionales, mientras que en los enfermos de alto riesgo puede estar indicado el trasplante de progenitores hematopoyéticos o la administración de inhibidores de ADN metiltransferasas. En la LLC es difı́cil obtener metafases analizables y es recomendable estudiar estos enfermos además mediante FISH. Las alteraciones más frecuentes son la pérdida de un fragmento del brazo largo del cromosoma 13 (13q-) y la trisomı́a del cromosoma 1246,47. Las LLC con pérdida en 13q o sin alteraciones citogenéticas tienen un pronóstico favorable, mientras que los casos con pérdida de 17p (gen TP53) o de 11q (gen ATM) tienen pronóstico adverso. Los casos con trisomı́a del cromosoma 12 presentan un pronóstico intermedio o adverso46,47. Además, los enfermos que no tienen mutación del gen IGH o presentan mutación del gen TP53 tienen peor pronóstico48. En la leucemia prolinfocı́tica son frecuentes los reordenamientos de la región 14q32 y las pérdidas de 17p, que suponen la pérdida del gen TP5346–48. Al igual que ocurre en las LLC, en el mieloma múltiple la obtención de metafases analizables es difı́cil, por lo que no son frecuentes los casos con alteraciones citogenéticas. Por esto, algunos centros prefieren realizar el análisis mediante FISH. La alteración más frecuente es la pérdida de 13q, seguida de los reordenamientos del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (Ig) H, localizado en 14q3249,50. La presencia de una traslocación(11;14)(q13;q32) o la ausencia de alteraciones citogenéticas se asocia con buen pronóstico, mientras que la traslocación(4;14)(p15;q32), la traslocación(14;16)(q32;q22) y la pérdida de 13q, especialmente cuando se asocia con estas alteraciones, ası́ como la pérdida de 17p, condicionan un pronóstico adverso, tanto si se observan por FISH como por CGH51. Los estudios de los SNP matrices han demostrado que en el mieloma múltiple puede haber otras regiones afectadas como 1q, con amplificación del gen DKK152. Además, el estudio de la expresión génica ha precisado que las células proliferantes en los mielomas son distintas a las de la macroglobulinemia de Walldeström y a las de la LLC53. La mayorı́a de los linfomas no hodgkinianos (LNH) tienen una alteración citogenética caracterı́stica, que casi siempre es una traslocación (tabla 5). Los linfomas foliculares se caracterizan por presentar la traslocación(14;18)(q32;q21), en la que se fusionan los genes IGH y BCL-2, los linfomas de las células del manto presentan la traslocación(11;14)(q13;q32), con fusión de los genes IGH y BCL1 y en los linfomas difusos de células grandes (LDCG) es frecuente observar reordenamientos del gen BCL6, situado en 3q27, pero no es la única que se presenta en los LDCG, ya que puede existir también la traslocación(14;18). Además, la presencia de reordenamientos de BCL6 se asocia con mejor respuesta al tratamiento, mientras que los casos de LDCG con traslocación(14;18) tienen peor pronóstico5. Mediante los biochips de [()TD$FIG] Figura 3. Imagen de un matriz genómico en un enfermo con sı́ndrome mielodisplásico en el que se aprecia la presencia de pérdidas en 2p, 5p, 5q, 7q, 12p, 12q y 13q, ası́ como la existencia de ganancias en 8q, 13q y 19. Documento descargado de http://www.elsevier.es el 26/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. J.M. Hernández et al / Med Clin (Barc). 2011;137(5):221–229 expresión, los LDCG se pueden clasificar en 2 grupos: célula B activada (ABC), con mejor pronóstico, y célula B del centro germinal (BCG)12,54. Los estudios de CGH matrices han permitido definir nuevas regiones alteradas en estos linfomas a la vez que determinan que las ganancias de 2p y las pérdidas de 17p se asocian con peor pronóstico55. Los linfomas de Burkitt presentan reordenamiento del gen C-MYC, situado en 8q24 y que puede reordenarse con Ig H, traslocación(8;14)(q24;q32) o con los genes de las cadenas ligeras de las Ig (k o l), traslocación(2;8)(p12;q24) y traslocación(8;22)(q24;q11), respectivamente. Además, en estos linfomas son frecuentes las ganancias de la región 1q y del cromosoma 7, ası́ como las pérdidas de 13q56. De nuevo, el estudio mediante micromatrices de expresión permite distinguir estos linfomas del resto57,58. En los linfomas extranodales de bajo grado se observa la traslocación(11;18)(q21;q21), con fusión de los genes API2 y MALT59. Esta alteración es la única que es exclusiva de un tipo de linfomas y se relaciona con la ausencia de respuesta al tratamiento antibiótico erradicador del Helicobacter pylori. La alteración citogenética más frecuente de los linfomas esplénicos de la zona marginal es la deleción de parte del brazo largo del cromosoma 7, seguida de la ganancia del brazo largo del cromosoma 3, mientras que las traslocaciones de 14q32 son menos frecuentes10,60 (fig. 4). Otro tipo de LNH, como el anaplásico Tabla 5 Alteraciones cromosómicas más frecuentes en los linfomas Enfermedad Alteración LNH folicular t(14;18)(q32;q21) t(2;18)(p12;q21) t(18;22)(q21;q11) t(11;14)(q13;q32) t(8;14)(q24;q32) t(2;8)(p12;q24) t(8;22)(q24;q11) t(3;14)(q27;q32) t(3;V)(q27;V) t(9;14)(p12;q32) 6q þ3 t(11;18)(q21;q21) t(14;18)(q32;q21) t(1;14)(p22;q32) t(3;14)(p14.1;q32) del(7)(q32) þ3q t(2;5)(p23;q35) t(2;V)(p23;V) LNH Manto LNH Burkitt LNH Difuso de célula grande B LNH linfoplasmocı́tico Linfoma MALT LEZM Linfoma Anaplásico de Célula Grande IgH-BCL2 IgK-BCL2 IgL-BCL2 IgH-CCND1 IgH/c-MYC IgK/c-MYC IgL/c-MYC IgH-BCL6 BCL6-otros PAX5/IgH API2-MALT1 IgH-MALT1 IgH-BCL10 FOXP1-IgH ST7 NPM-ALK ALK-otros del: deleción; Ig: inmunoglobulina; LEZM: linfoma esplénico de la zona marginal; LNH: linfoma no hodgkiniano; MALT: linfoma del tejido linfoide asociado con mucosas; t: translocación. 227 con expresión de Ki-1, se asocia con la presencia de la traslocación(2;5)(p23;q35), con fusión de los genes ALK y NPM. En los linfomas no hodgkinianos T (LNH-T) puede haber alteraciones de los cromosomas 1, 7, 11 y 14, pero la presencia de alteraciones citogéneticas no es especı́fica de ninguno de los tipos definidos en la clasificación de la Organización Mundial de la Salud y estas alteraciones no conllevan cambios en el pronóstico de estos enfermos. Existe una rara enfermedad conocida como neoplasia de la célula madre, en la que se combina un LNH-T y una NMP y suele presentar una traslocación(8;13)(p11;q12) y un reordenamiento del gen FGFR361. Por último, cabe reseñar que en el linfoma de Hodgkin no es preciso hacer estudios citogenéticos, dado el bajo número de células tumorales (células de Red Stenberg) y su bajo ı́ndice mitótico. Conclusiones Durante el último medio siglo los resultados citogenéticos han demostrado su valor en el estudio de las cromosomopatı́as y del cáncer. Estos estudios son indispensables por su valor diagnóstico y pronóstico, y porque sirven para la monitorización de la enfermedad residual tras el tratamiento. Por esto, se deben aplicar de manera sistemática en el diagnóstico de los enfermos con hemopatı́as malignas o su sospecha. Además, definen la presencia de dianas susceptibles de tratamiento dirigidos que son la esencia del tratamiento actual del cáncer. Sin embargo, aún existen muchas alteraciones cromosómicas que no se correlacionan con unas caracterı́sticas clı́nicas determinadas. Por esto, es preciso realizar un estudio citogenético en todos los pacientes con sospecha de neoplasia hematológica e integrar su resultado con una completa historia clı́nica y ası́ determinar la relación entre el cambio cromosómico y el curso clı́nico de la enfermedad. Por otro lado, el desarrollo de técnicas moleculares ha introducido una nueva dimensión en el estudio y en la comprensión del papel de los cambios cromosómicos en la génesis del tumor, por lo que los citogenetistas y los genetistas moleculares deben trabajar coordinados para aportar una mayor información sobre el origen y el desarrollo del cáncer. Estas técnicas se complementarán con los estudios de micromatrices, que están comenzando a aplicarse en la clı́nica. Gracias al avance, tanto en rapidez como en menor coste, de la secuenciación masiva del genoma humano será posible conocer, en un solo experimento, el genoma y el trascriptoma de la célula tumoral. Aunque su aplicación al diagnóstico está aún en una fase muy inicial, se augura un futuro prometedor para conocer mejor los mecanismos genéticos implicados en la génesis del cáncer. [()TD$FIG] Figura 4. Cariotipo e hibridación in situ fluorescente multicolor de un enfermo con linfoma esplénico de la zona marginal y t(6;14)(p21;q32). Documento descargado de http://www.elsevier.es el 26/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. J.M. Hernández et al / Med Clin (Barc). 2011;137(5):221–229 228 Financiación Trabajo parcialmente subvencionado con Proyectos de Investigación del Consejerı́a de Sanidad de Castilla y León (SACYL) (106/A/ 06 y GRS 355/A09), Fundación Obra Social Caja Burgos, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS 09/01543), Beca Presidencial FIJC-P/ EF (1995–2010), Acción COST-EUGESMA BMBS BM0801 y por la «Acción Transversal del Cáncer» (RD06/0020/1056 y RD07/0020/ 2004), Redes de Investigación RTIIC, Instituto Carlos III. 23. 24. 25. 26. Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. 27. Bibliografı́a 28. 1. Nowell PC, Hungerford DA. Chromosome studies on normal and leukemia human leukocytes. J Natl Cancer Inst. 1960;25:85–109. 2. Prieto F, Egozcue J, Forteza G, Marco F. 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