Elucidación de la estructura cuaternaria de la rodopsina Bovina /

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
Decanato de estudios de postgrado
Doctorado en Ciencias Biológicas
ELUCIDACIÓN DE LA ESTRUCTURA CUATERNARIA DE LA RODOPSINA
BOVINA.
Tesis Doctoral presentada a la Universidad Simón Bolívar por:
Rafael Eduardo Medina Seijas
Como requisito parcial para optar al grado de:
Doctor en Ciencias Biológicas
realizado con la tutoría del prof:
José Bubis, PhD.
FEBRERO, 2006
……dedicada a Dios, a mi madre Inés María, a mi padre Jesús Enrique y a Miguel Russa, por dar fe en
vida de que el amor y la constancia, son y serán siempre la mayor fuerza para plantearme metas, esforzarme
para conseguirlas y disfrutar día a día de los logros alcanzados con tesón …GRACIAS A USTEDES.
AGRADECIMIENTOS
Me plena de alegría y orgullo expresar mi más profundo agradecimiento al Dr.
José Bubis por su invaluable guía y apoyo antes, durante y después de la ejecución
de esta tesis doctoral y del Doctorado. Gracias a ti José por tu inteligencia, vocación,
dedicación, paciencia y humildad. Gracias por enseñarme que la ciencia y la vida
comparten un mismo norte, el cual es la constancia. Gracías por creer en Mi y darme
la oportunidad de formarme bajo tu supervisión. Gracías por ofrecer siempre tu
excelente formación, doctrina científica y amistad para todos y cada uno de los que
fuimos, son y serán tus estudiantes universitarios…… Gracias!
A Miguel Russa quien me brindó su apoyo incondicional y desinteresado en la
ultima etapa de este gran reto. Gracias Miguel por estar allí siempre dándome
ánimos y estimulándome para concluir exitosamente esta meta.
Me complace expresar mi agradecimiento al Dr. Heriberto Corria y al Lic.
Germán Fraile, quienes supieron brindarme con su ejemplo, la oportuna guía y
motivación para el planteamiento de la meta más grande en el ámbito de mi
formación académica: la obtención del Doctorado en Ciencias. Gracias por su valiosa
orientación.
Me gustaría también expresar mis más sinceras gracias a la Dra. Graciela
Uzcanga por su invaluable colaboración prestada para la realización de los ensayos
“in silico” de análisis computacional de las distancias moleculares entre los residuos
aminoacídicos de la Rho bovina, propuestos en este trabajo para la interacción con el
sulfo-SMCC. Gracias Grcaiela por tu apoyo y tu constante disposición para contribuir
con la formación científica de todos aquellos quienes llegamos y permanecimos en el
Laboratorio de Química de Proteínas.
También quiero expresar mi aprecio, reconocimiento y agradecimiento a la
M.Sc Deisy Perdomo, quien sin duda ha representado un ejemplo de constancia,
paciencia y perseverancia. Deisy, muchas gracias a ti por tu constancia, por tus
consejos, tu amistad y por enseñar que: si algo no da una vez, y otra vez, no se
pierde el norte, siempre habrá una forma de conseguirlo……
Igualmente me gustaría agradecer muy especialmente a los Doctores Alfredo
Mijares y Juan Carlos Martínez por su constante apoyo y disposición para facilitar
todo aquello cuanto les fue solicitado por Mí, para la realización de algún ensayo de
la presente tesis. Vaya a ustedes, mis más sinceras gracias, por siempre brindar sus
importantes consejos, críticas y valiosos aportes, basados en su experiencia
profesional.
Gracias a la Dra. Marta Mendoza pos sus consejos y sugerencias tanto a nivel
científica como a nivel personal. Gracias a Ti Marta, por ofrecerme tu invaluable
amistad y cariño. Gracias por ofrecer siempre esa alegría y profesionalismo a todo
aquel quien se encuentre en tu camino.
Finalmente, y con mucho cariño, quiero dar las gracias a todos los amigos y
compañeros del laboratorio de Química de Proteínas y del Post grado de Biología
Celular, quienes compartimos día a día los logros alcanzados y las preocupaciones
por los ensayos y evaluaciones, tanto de la tesis como del postgrado. Gracias por
sus contribuciones, consejos, sugerencias y lo más importante, gracias por su valiosa
y constante amistad. Entre tantos debo dirigir estas líneas de agradecimiento a: Juan
Giarritzo, Rocío Camargo, Beatriz Boscan, Carolina Möller, Adriana Izquier, Gladinex
Pérez, Adriana Rodríguez, Joilyneth Ferreira, Isvic Inojosa, Liomary Carrazquel y
Lola del Carmen.
FINANCIAMIENTO
Esta tesis doctoral fue financiada en su totalidad por las siguientes
instituciones:
x
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología (FONACIT). Proyecto N° S12000000514, Caracas, Venezuela.
x
Decanato de Investigación y Desarrollo (DID) de la Universidad Simón Bolívar.
Abreviaturas
>J-32P@ATP
ggo
E-ME
[3H]-GMPpNp
a
CMC
DM
DMSO
EDTA
F1
F2
GDP
Gi
GlcNAc
GMPc
GTP
HEPES
Kav
Man
ME
Meta I
Meta II
MFA
OTG
PDE
Rho
Rho*
S
SDS
SEB
T
Tris
Ve
Vm
J-32P Adenosin 5’-trifosfato
Coeficiente friccional
2-mercaptoetanol
E, J-imido-[3H] guanosina 5’-trifosfato
Radio de Stoke
Concentración micelar crítica.
n-dodecil-E D-maltósido
Dimetil sulfóxido
Ácido etilendiamino tetraacetico
Péptido termolitico grande (Met1-Ser240)
Péptido termolitico pequeño (Ala240-Pro327
Guanosina difosfato
Proteína de unión a GTP la cual inhibe al sistema de la
adenilato ciclasa
N-acetilglucosamina
Guanosina 3’, 5’ mono fosfato cíclico
Guanosina trifosfato
Ácido 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineetanosulfonico
Coeficiente de partición
Manosa
Microscopía electrónica
Forma fotoactivada de la Rho con Absorbancia máxima a
380nm
Forma activada de la Rodopsina capaz de unirse y activar a la
Transducina
Microscopía de fuerza atómica
n-octíl-E-D-tioglucósido
Fosfodiesterasa de GMPc retinal
Rodopsina bovina nativa (oscurida)
Rodopsina bovina fotoactivada (luz)
Coeficiente de sedimentación
Dodecil sulfato de sodio
Segmentos externos de los bastoncillos retinales
Transducina
Tris-(hidroximetil)-aminimetano
Volúmen de elución
Volúmen de migración
RESÚMEN
Existe una controversia sobre la organización monomérica o dimérica de la
rodopsina nativa (Rho) o fotoactivada (Rho*). El entrecruzamiento con sulfosuccinimidilo 4-(N-maleidometilo) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), mmaleidobenzoilo-N-hidroxisuccinimido ester, N,N’-1,2-fenilendimaleimida y N,N’-1,4fenilendimaleimida y la inducción de la formación de enlaces de disulfuro por
glutationilación, sobre la Rho y Rho* purificada por cromatografía de afinidad a
través de una columna de concanavalina A-Sepharose en presencia de n-dodecil ȕD-maltósido (DM), sugirieron la naturaleza dimérica del fotorreceptor. La
caracterización de los parámetros hidrodinámicos de la Rho y la Rho* en detergente,
mediante cromatografía de exclusión molecular sobre una columna de Sephacryl S300 en presencia de 0.1 % de DM, permitió estimar los pesos moleculares de los
complejos de Rho:DM y Rho*:DM. La sustracción del peso de una micela del
detergente, arrojó masas moleculares de 78 kDa para la Rho y 76 kDa para la Rho*.
El contenido de 0.97 g de detergente/g de proteína, resultó en un volúmen
específico parcial para el complejo detergente-detergente de 0.765 cm3/g y una
masa molecular de 64-65 kDa para la Rho. El tamaño de Rho y Rho* fue evaluado
por sedimentación sobre gradientes de sacarosa del 10-30 % en presencia de 0.1 %
de DM, resultando en ~60 kDa con coeficientes de sedimentación de 5.78 S para los
complejos de Rho:detergente. La funcionalidad de la Rho purificada por filtración en
gel y ultracentrifugacion, fue demostrada por: (i) espectros de absorción UV-visible,
(ii) capacidad para fotoactivar a la transducina, y (iii) su habilidad de servir como
sustrato para la rodopsina quinasa. El entrecruzamiento químico de la Rho con sulfoSMCC, generó la incapacidad de la misma para sufrir el cambio conformacional en
la luz, el cual, fue bloqueado en un fotointermediario absorbiendo a 470 nm. La Rho
entrecruzada fue incapaz de inducir el intercambio de nucleótidos de guanina de la
transducina en la luz. La modificación química de Cys y Lys de la Rho, inhibió la
reacción de entrecruzamiento intermolecular de la proteína con sulfo-SMCC,
sugiriendo que estos residuos están en la interfase intradímero. El entrecruzamiento
con sulfo-SMCC de los monómeros artificiales del fotoreceptor, inhibió su proteolisis
con termolisina. Estos resultados concuerdan con una estructura dimérica para la
Rho y la Rho*. Algunos de estos resultados fueron publicados [J. Biol. Chem. (279),
39565-39573; (2004). Anexo 1].
Palabras claves: Rodopsina, dimerización, entrecruzamiento, fotointermediarios.
INDICE GENERAL
DEDICATORIA
II
AGRADECIMIENTOS
III
FINANCIAMIENTO
V
Lista de Abreviaturas
VI
RESUMEN
VII
ÍNDICE GENERAL
VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
XIV
1. INTRODUCCIÓN
1
1.1 LA RODOPSINA COMO EL GPCR MÁS AMPLIAMENTE ESTUDIADO
2
1.1.1 Rodopsina: Primer GPCR con estructura cristalina resuelta
5
1.2 UBICACIÓN DELA RODOSINA EN MEMBRANAS LIPÍDICAS Y EL
PROCESO DE FOTOTRANSDUCCIÓN
8
1.2.1 La Rodopsina embebida en su microambiente lipídico
8
1.2.2 Proceso de fototrasducción para la visión escotópica
10
1.2.2.1 Fenómeno de amplificación de la cascada de señalización visual
13
1.3 ORGANIZACIÓN SUPRAMOLECULAR Y FUNCIONALIDAD DE LOS
GPCRs EN SUS MEMBRANAS CELULARES NATIVAS
14
1.3.1 Análisis de la estructura cuaternaria de los GPCRs y sus posibles
implicaciones
14
1.4 ESTRUCTURA CUATERNARIA NATIVA DEL GPCR, RODOPSINA
16
1.4.1 La Rodopsina como una entidad monomérica en membranas SEB
17
1.4.2 La Rodopsina como una entidad dimérica en membranas SEB
18
1.5 CONTROVERSIA EN REFERENCIA A LA ORGANIZACIÓN
SUPRAMOLECULAR MONOMÉRICA O DIMÉRICA PARA LA RODOPSINA
21
1.5.1 Argumentos en contra de un arreglo nativo dimérico de la Rodopsina
21
1.5.2 Argumentos a favor de un arreglo dimérico de la Rodopsina que rebaten
22
las críticas en su contra
1.6 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE ESTA INVESTIGACIÓN
25
1.7 HIPÓTESIS
27
2. OBJETIVOS
28
3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
30
3.1 MATERIALES
30
3.2 MÉTODOS
31
3.2.1 Obtención de muestras biológicas
31
3.2.1.1 Extracción de retinas a partir de ojos bovinos
31
3.2.1.2 Preparación de los segmentos externos de los bastoncillos retínales
(SEB
31
3.2.1.3 Preparación de membranas de los SEB lavadas (SEBLav) con EDTA
33
3.2.2 Determinación de los espectros de absorción y concentración de
rodopsina en las membranas de los SEB
34
3.2.3 Purificación de proteínas a partir de las membranas de los SEB
34
3.2.3.1 Solubilización y purificación de la rodopsina
34
3.2.3.2 Solubilización selectiva de la rodopsina desde las membranas de los
SEB usando una combinación de Zing (Zn2+) y n-octil-E-D-tioglucósido (OTG)
36
3.2.3.3 Purificación de la transducina (T)
36
3.2.3.4 Preparación de una fracción enriquecida de rodopsina quinasa (RQ)
38
3.2.4 Electroforesis, electrotransferencias e inmunotinciones
38
3.2.4.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (EGPA-SDS)
38
3.2.4.2 Electrotransferencias e inmunodetección de la Rho a filtros de
nitrocelulosa
38
3.2.5 Procedimientos de entrecruzamiento de la Rho y la rodopsina
fotoactivada (Rho*)
39
3.2.5.1 Entrecruzamiento químico de la Rho y la Rho*
39
3.2.5.2 Entrecruzamiento en función del tiempo y de la concentración de la
Rho purificada
39
3.2.5.3 Inducción de la formación de enlaces de disulfuro por glutationilación
en presencia de diamida
40
3.2.5.3.1 Generación de GSH marcado con biotína (GSH-biotína) para las
41
reacciones de glutationilación de la Rho.
3.2.5.3.2 Detección de proteínas glutationiladas con el reactivo GSH-biotína.
41
3.2.6 Caracterización de los parámetros hidrodinámicos de la Rho y Rho*.
42
3.2.6.1 Cromatografía de filtración en gel de la Rho y la Rho* solubilizadas en
DM.
42
3.2.6.2 Sedimentación por ultracentrifugación de la Rho y la Rho* purificas en
DM.
43
3.2.6.3 Determinación de la concentración de DM unido a la Rho eluída de la
sephacryl S-300.
44
3.2.7 Ensayos para la evaluación funcional de las proteínas purificadas.
45
3.2.7.1 Ensayos de unión de [3H]GMP-pNp a la T activada por Rho.
45
3.2.7.2 Ensayos de la actividad de GTPasa de la T activada por Rho
46
3.2.7.3 Ensayos de fosforilación de la Rho*
47
3.2.8 Reacciones de marcaje diferencial de la Rho en membranas lavadas de
los SEB.
48
3.2.8.1 Marcaje de la Rho en membranas de los SEBLav usando Nhidroxisuccinimida-biotína (NHS-biotína)
48
3.2.8.2 Marcaje de la Rho en las membranas de los SEB con [J-32P]ATP
49
3.2.9 Procedimiento de blanqueo de la Rho* para la eliminación del todo-trans
retinal unido a la opsina.
49
3.2.9.1 Generación de una mezcla de opsinas desnaturalizadas marcadas
diferencialmente
49
3.2.9.2 Proceso de eliminación del detergente de muestras de opsinas
marcadas diferencialmente y desnaturalizas con SDS
50
32
3.2.9.3 Exclusión molecular de la mezcla de opsinas marcadas con [J- P] o
con biotína usando sephadex G-15
50
3.2.9.4 Precipitación con acetona de las opsinas marcadas con biotína o con
[J-32P]
51
3.2.10 Intento de renaturalización de las opsinas marcadas diferencialmente
con biotína o [J-32P] en presencia del 11-cis-retinal, a su estado de Rho nativa
51
3.2.11 Cambios en los espectros UV/Visible de la Rho entrecruzada
52
3.2.11.1 Fotoisomerización del retinal unido a la Rho entrecruzada con sulfoSMCC en función del tiempo
3.2.12 Bloqueo del entrecruzamiento de la Rho mediante modificación
52
química de los residuos de cisteína y lisina
53
3.2.13 Obtención de monómeros de Rho
54
3.2.13.1 Solubilización de las Rho marcadas con biotína o [3H]-NEM de las
54
membranas de los SEBLav
3
3.2.13.2 Filtración molecular en Gel de las Rho marcadas con biotína o [ H]NEM
54
3.2.14 Proteolisis con termolisina de las Rhos monoméricas o diméricas
entrecruzadas con sulfo-SMCC
56
4. RESULTADOS
57
4.1 PURIFICACIÓN DE LA RODOPSINA Y LA TRANSDUCINA
57
4.1.1 Purificación de la Rho por afinidad a concanavalina A
57
4.1.2 PURIFICACIÓN DE LA TRANSDUCINA
59
4.2 ENTRECRUZAMIENTO QUÍMICO DE LA RODOPSINA
60
4.2.1 Entrecruzamiento covalente de la Rho embebida en las membranas de
los SEBLav
60
4.2.2 Entrecruzamiento covalente de la Rho extraída y purificada en DM
62
4.2.3 Reacciones de entrecruzamiento Rho en función del tiempo
66
4.2.4 Entrecruzamiento de la Rho en función de su concentración
69
4.2.5 Entrecruzamiento de la Rho inducido por un mecanismo de
glutationilación
71
4.3 CARACTERIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS HIDRODINÁMICOS DE
LOS COMPLEJOS FORMADOS ENTRE LA RODOPSINA Y LA RODOPSINA
FOTOACTIVADA CON EL DM
74
4.3.1 Filtración en gel de la Rodopsina en presencia de DM
74
4.3.2 Determinación del peso molecular de los complejos Rho:DM y Rho*:DM
76
4.3.3 Estimación del Volumen específico parcial de los complejos Rho:DM
78
4.3.4 Sedimentación por ultracentrifugación analítica de la Rho y Rho*, en
gradientes de sacarosa y en presencia de DM
80
4.3.4.1 Determinación de la masa molecular de la Rho y la Rho* en DM, a
partir de su coeficiente de sedimentación
4.3.5 Determinación del coeficiente friccional (ƒ/ƒo) para los complejos
82
Rho:DM y Rho*:DM
84
4.4 INTEGRIDAD DE LOS COMPLEJOS DIMÉRICOS DE RHO EN
DETERGENTE, AISLADOS POR CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN
GEL Y SEDIMENTACIÓN POR ULTRACENTRIFUGACIÓN
85
4.4.1 Evaluación de la funcionalidad in vitro de los complejos diméricos de la
Rho obtenidos por cromatografía de exclusión molecular y por sedimentación
a través de gradientes de sacarosa
85
4.5 INTENTOS DE RENATURALIZACIÓN DE LOS DÍMEROS DE RHO A
PARTIR DE OPSINAS MARCADAS QUÍMICAMENTE CON NHS-biotína o [J32
P]ATP
90
4.5.1 Resultados del marcaje diferencial de la Rho con NHS-biotína o con [J32
P]ATP
91
4.5.2 Generación de la mezcla de opsinas desnaturalizadas marcadas
diferencialmente
93
4.5.3 Intento de renaturalización de las opsinas marcadas diferencialmente
con biotína o [J-32P]ATP en presencia de 11-cis-retinal
95
4.6 EFECTOS DEL ENTRECRUZAMIENTO QUÍMICO SOBRE LA
FUNCIONALIDAD DE LA RODOPSINA
96
4.6.1 Fotoisomerización del retinal unido la Rho control o entrecruzada con
sulfo-SMCC en función del tiempo
96
4.7 Protección de las Cys y Lys involucrados en el entrecruzamiento químico
de la Rho con sulfo-SMCC, mediante modificadores sitio-específicos
102
4.8 Medición de la actividad de unión de GMPpNp de la T por la Rho
entrecruzada con sulfo-SMCC
105
4.9 EFECTO DE LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE DM in vitro SOBRE
LA ESTRUCTURA CUATERNARIA DIMÉRICA DE LA RODOPSINA
107
4.9.1 Disociación de los dímeros nativos de Rho a altas concentraciones de
detergente
107
4.10 PROTEOLISIS CON TERMOLISINA DE LA RHO EN CONDICIÓN
DIMÉRICA O MONOMÉRICA
4.10.1 PROTEOLISIS CON TERMOLISINA DE LA RHO MONOMÉRICA O
112
DIMÉRICA ENTRECRUZADA CON sulfo-SMCC
114
5. DISCUSIÓN
116
6. CONCLUSIONES
148
7. BIBLIOGRAFÍA
151
8. ANEXOS
170
INDICE DE FIGURAS
Figura. 1.1 Estructura secundaria de la rodopsina bovina
4
Figura. 1.2 Diagrama de cintas de la Rho preparado desde la estructura de
cristal a 2.8 Å de resolución
5
Figura. 1.3 Representación de un bastón retinal de vertebrado, membrana de
los discos y un modelo de Rho en la membrana
9
Figura. 1.4 Cascada de señalización visual escotopioca
12
Figura. 1.5 Morfología de los discos nativos intactos absorbidos a mica
preparados para MFA en solución buffer
19
Fig. 1.6 Topografía de los discos abiertos aplanados y esparcidos, absorbidos
a mica y preparados para la MFA
20
Figura. 4.1 Purificación de la Rodopsina
59
Figura. 4.2 Purificación a homogeneidad de la Transducina heterotrimérica
60
Figura. 4.3 Entrecruzamiento de la Rho en membranas de los SEBLav con los
reactivos bifuncionales sulfo-SMCC y MBS
62
Figura. 4.4 Entrecruzamiento de la Rodopsina purificada por cromatografía de
afinidad a través de Con A Sepharosa 4B con los reactivos bifuncionales
sulfo-SMCC y MBS
64
Figura. 4.5 Entrecruzamiento de la Rho purificada con los reactivos
bifuncionales o-PDM y p-PDM
65
Figura. 4.6 Reacciones de entrecruzamiento de la Rho purificada en función
del tiempo
67
Figura. 4.7 Inmunotinción de la reacción de entrecruzamiento en función del
tiempo de la Rho con el agente MBS
68
Figura. 4.8 Entrecruzamiento de la Rho purificada en función de su
concentración.
69
Figura. 4.9 Evaluación del efecto de la concentración de la Rho sobre el
cociente de dímero a monómero de la Rho entrecruzada con sulfo-SMCC
70
Figura. 4.10 Ensayos de glutationilación de la Rho y la Rho*
73
Figura. 4.11 Filtración en gel de la Rho purificada (A) y la Rho* (B) sobre una
columna de Sephacryl S-300.
75
Figura. 4.12 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de
los complejos Rho:DM y Rho*:DM
76
Figura. 4.13 Curva de calibración para la estimación de los radios de Stokes
de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM
77
Fig. 4.14 Inmunotinción de la Rho sedimentada por ultracentrifugación en
gradientes lineales de sacarosa
80
Figura. 4.15 Curva de calibración para la determinación de los coeficientes de
sedimentación de los complejos Rho:DM y Rho*:DM
82
Figura. 4.16 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de
la Rho y Rho* sedimentada por ultracentrifugación
83
Figura. 4.17 Espectros de absorción UV/Vis de los complejos Rho:detergente
obtenidos por filtración en gel (FG) y sedimentación por ultracentrifugación (S)
85
Figura. 4.18 Ensayo de enlazamiento de [3H]GMPpNp de la T inducida por los
complejos de Rho:detergente obtenidos por filtración en gel (FG) y
sedimentación por ultracentrifugación (S)
87
Figura. 4.19 Estimulación de la actividad de GTPasa de la T dependiente de
la luz
88
Figura. 4.20 Ensayos de fosforilación de la Rho en los complejos
Rho:detergente por la rodopsina quinasa
89
Figura. 4.21 Marcaje con biotina de las membranas SEBLav
91
Figura. 4.22 Marcaje con [J-32P]ATP de las membranas intactas de los SEB
93
Figura. 4.23 Filtración molecular en Sephadex G-15 de la mezcla de opsinas
desnaturalizadas marcadas diferencialmente con biotina o [J-32P]ATP
94
Figura. 4.24 Fotoisomerización del retinal unido a la Rho no entrecruzada
97
Figura. 4.25 Fotoisomerización del retinal unido a la Rho entrecruzada con
sulfo-SMCC
99
Figura. 4.26 Evaluación por EGPA-SDS de la Rho entrecruzada con sulfoSMCC restringida para el cambio conformacional dependiente de la luz
101
Figura. 4.27 Modificaciones químicas de residuos de Cys y Lys involucrados
en las reacciones de entrecruzamiento con el sulfo-SMCC
103
Figura. 4.28 Activación dependiente de la luz de la actividad de unión de
[3H]GMPpNp de la T por la Rho entrecruzada con sulfo-SMCC
106
Figura. 4.29 Cromatograma de la filtración en gel de las Rho-biotina y Rho[3H]NEM
108
Figura. 4.30 Detección de la Rho-biotina eluída de la Sephacryl S-300 en
presencia de 10 mM DM
109
Figura. 4.31 Registro de la radioactividad de [3H]NEM (cpm) incorporada a la
Rho eluída de la sephacryl S-300 en presencia de 10 mM DM
110
Figura. 4.32 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de
los complejos Rho-biotina:DM- y Rho-[3H]NEM:DM eluídos de la Sephacryl
S-300 en presencia de 10 mM DM
111
Fig. 4.33 Proteolisis con termolisina de la Rho monomerica o dimerica
113
Fig. 4.34 Proteolisis con termolisina de la Rho monomérica o dimérica
entrecruzadas con sulfo-SMCC
115
Fig. 5.1 Fotociclo de la Rodopsina
133
Fig. 5.2 Análisis de las distancias moleculares de resíduos de Cys y Lys de la
Rho propuestos como blacos de acción para el entrecruzador sulfo-SMCC.
140
Fig. 5.3 Análisis de disponibilidad espacial de los resíduos de Lys245 o la
Lys248 para la reacción en conjunto con el sulfo-SMCC interaccionando con la
Cys140.
142
1
1. NTRODUCCIÓN
Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la más amplia y
caracterizada familia de proteínas integrales de membrana, parcialmente expuestas
en la superficie celular. Estos receptores se han particularizado al interés científico
dada su amplia versatilidad para mediar y comunicar al interior celular, señales
biológicas consistentes en fluctuaciones de niveles de hormonas, neurotransmisores,
y péptidos, actuando como sensores especializados al nivel de la membrana
plasmática. Adicionalmente, estos receptores presentan la capacidad intrínseca para
mediar respuestas de reconocimiento a estímulos tan diversos como olores y
sabores, así como también la captación de estímulos específicos tales como fotones
de luz para dar inicio al proceso de la fototransducción a nivel del tejido retinal
(Banéres y Parello, 2003, Suda y col., 2004).
Existen aproximadamente 950 genes dentro del genoma humano, responsables
de la codificación de proteínas inherentes a esta súperfamilia (Park y col., 2004). Los
GPCRs de mamíferos habían sido comúnmente divididos dentro de tres distintas
subfamilias (A, B, C) en atención a sus similaridades de secuencia (Bockaert y Pin,
1999; Okada y col., 2001; Pierce y col., 2002). Más recientemente, con base en
análisis filogenéticos más especializados y actualizados de los genes humanos
codificantes de GPCRs, ha sido obtenida una nueva clasificación para estas
moléculas, divididas en cinco grupos distintos. Este sistema de clasificación ha sido
nombrado como GRAFS por las iniciales de los cinco diferentes grupos de
receptores tipo GPCR, entendiéndose como: glutamáto, rodopsina, receptores de
adhesión, receptores tipo frizzled/gusto2, y los receptores de secretina (Fredriksson y
col., 2003).
Los GPCRs en general se caracterizan por presentar aspectos estructurales básicos
altamente conservados y, en estas moléculas, la disposición de los residuos
aminoacídicos que conforman su estructura primaria, así como la adopción de su
estructura secundaria, se presentan como rasgos altamente homólogos. La
estructura basal de estas moléculas consiste de un dominio central de siete hélices
transmembranales, estructuralmente homólogos entre los miembros de esta
2
súperfamilia. El dominio transmembranal se encuentra conformado en el lado
extracelular, por un dominio de unión a ligando. Por otra parte, el lado citoplasmático
de estas moléculas presenta el llamado dominio para la interacción con la proteína G
heterotrimérica y otras proteínas intracelulares.
1.1 LA RODOPSINA COMO EL GPCR MÁS AMPLIAMENTE ESTUDIADO.
Históricamente, el receptor visual tipo GPCR rodopsina (Rho), ha sido el mas
extensivamente estudiado tanto a nivel estructural como a nivel de caracterización
funcional, dada su temprana purificación a homogeneidad en cantidades abundantes
desde hace ~ 20 años atrás. Este receptor pertenece a la clase más simple de los
GPCRs (clase A), en la cual se encuentran otros como: receptores de adenosina,
adrenérgicos, angiotensina, dopamina, muscarínicos, de opioides y de vasopresina
(Sakmar, 1994). Esta clase también agrupa a los receptores para pequeñas
moléculas de ligando como es el caso de numerosos odorantes.
La inspección completa de la estructura de la Rho reveló que este receptor es
propiamente dicho un fotopigmento que se encuentra constituido de una secuencia
polipeptídica (opsina) de 348 aminoácidos (Ovchinnikov y col., 1982; Hargrave y
col., 1983), a la cual se une covalentemente un cromóforo lipídico (11-cis-retinal), al
nivel de la Lys296, el cual se comporta como un agonista inverso para el receptor. El
cromóforo lipídico 11-cis-retinal se encuentra interaccionando con el aminoácido
Glu113, el cual actúa como un contraión para la base de Schiff protonada establecida
entre la Lys296 de la opsina y el retinal
(Sakmar y col., 1989). El Glu113
esta
desprotonado y negativamente cargado cuando el cromóforo se encuentra en su
estado basal (oscuridad). Cuando se forma la Meta II (Rho*), y el cromóforo se ubica
en su estado excitado, el Glu113 pasa a su forma protonada, actuando como el
aceptor y estabilizador neto del protón de la base Schiff en el estado fotoactivado de
la proteína. La región N-terminal de este receptor presenta una glicosilación a nivel
de los residuos Asn-2 y Asn-15 (Hargrave, 1977). Esta glicosilasilación consiste en la
adición postransduccional de grupos Į-D-manósidos.
3
La inspección completa de la secuencia de opsina, mostró que esta presentaba
regiones reconocibles de aminoácidos predominantemente polares e hidrofílicos,
mientras que otras regiones agrupaban aminoácidos predominantemente no-polares
e hidrofóbicos. En este orden de ideas, la realización de numerosos estudios
topográficos basados en la utilización de métodos enzimáticos y modificaciones
químicas, mostraron que las regiones hidrofílicas estaban localizadas a nivel de la
superficie
acuosa
de
la
membrana
celular,
mientras
que
las
regiones
predominantemente hidrofóbicas serían las responsables de que la Rho y en general
de los GPCRs, atraviesen siete veces a la bicapa lipídica, dándole a estos receptores
y en especial a las hélices de aminoácidos hidrofóbicos, su carácter transmembranal,
lo cual fue revisado por Hargrave (1982).
A partir de estas informaciones estructurales primarias, fue posible el desarrollo
del modelo topográfico publicado por Sakmar (2002) para la Rho bovina y
presentado en la Fig. 1.1, donde se indica tanto la disposición de los siete segmentos
transmembranales de la Rho abreviados a partir de ahora como H I – H VII, los
cuales son a su vez estructuralmente conservados entre los miembros de la
súperfamilia de los GPCRs. En el modelo mostrado en la Fig. 1.1, se ilustra también
la disposición conservada de las tres asas extracelulares o intradiscales, abreviadas
a partir de ahora como EC I (entre las H-II y H-III), EC II (entre las H-IV y H-V) y EC
III (entre las H-VI y H-VII). Dicho modelo también exhibe la disposición de las asas
citoplasmáticas o intracelulares (ínterdiscales), abreviadas a partir de ahora como IC
I (entre las H-I y H-III), IC II (entre las H-III y H-IV) y IC III (entre las H-V y H-VI). Un
aspecto realmente novedoso también presentado en el modelo de la Fig. 1.1, tiene
que ver con la presencia de una hélice 8 a nivel del dominio C-terminal, adicional a
las siete hélices ya descritas en el modelo propuesto por Hargrave y col. (1983) y
Oliveira y col. (2002). La hélice 8 fue descrita por Sakmar (2002), como una D-hélice
de carácter catiónica anfipática extendida paralelamente a la superficie citosólica de
la membrana, desde el aminoácido Gln-312 al Gly-324 y fue evidenciada como una
extensión Į-helical del lazo putativo C4, a partir del análisis del dominio
citoplasmático de la Rho bovina realizado por Menon (2001) desde la estructura de
cristal reportada por Palczewski (2000). Esta nueva hélice es perpendicular a la H7 y
4
estaría conectada a la misma por el tripéptido Met-309/Asn310/Lys-311 (flechas negras
en la Fig. 1.1), que actuaría como un enlazador corto. La H8 se encuentra en un
medio ambiente principalmente hidrofóbico, lo cual podría contribuir a su
incrementada estabilidad helical (Menon y col., 2001). Otro aspecto resaltado en el
modelo de la Fig. 1.1 de la Rho y validado para los demás miembros de la clase A,
tiene que ver con la palmitoilación de las Cys322 y Cys323 descrita por Ovchinnikov y
col. (1988) y Papac y col. (1992). Estas palmitoilaciones están representadas en Fig.
1.1. La palmitoilación de esos residuos, sirve como base para el establecimiento de
un cuarto lazo citoplasmático putativo (C4), con funciones sugeridas en la activación
de la transducina (Marin y col., 2000; Ernst y col., 2000). Finalmente, la presencia de
un residuo de Cys a nivel del final carboxilo del EC I y otro en la mitad del IC II
permite el establecimiento de un puente de disulfuro esencial para el correcto
plegamiento de la proteína.
Fig. 1.1 Estructura secundaria de la rodopsina bovina. Los residuos de aminoacidos son descritos en
códigos de una letra. La cola amino terminal (N) y el dominio extracelular, se ubican en el tope de la figura. La
cola carboxi-terminal esta en la base. Los segmentos D-helicoídales transmembranales (HI-HVII) y la hélice
catiónica anfipática H8 son mostradas como cilindros. Se muestra el enlace de disulfuro esencial entre la Cys110 y la Cys-187 (flecha fucsia). Las Cys-322 y Cys-323 están palmitoiladas (flecha morada). Los dominios
extracelulares E1-E3, los lazos citoplasmáticos C1-C3, y la hélice anfipática H8 son mostrados. Inserto:
estructura del cromóforo 11-cis-retinal. Los átomos de carbono están numerados del 1-20. Las flechas negras
señalan el tripeptido M-N-K enlazador del retinal. Tomado de Sakmar (2002).
5
Como fue mencionado al inicio de esta sección, la Rho es
el GPCR mejor
estudiado tanto fisiológica como estructuralmente. En efecto, es el único para el cual
se ha podido obtener una estructura cristalina con una resolución de 2.8 Å
(Palczewski y col., 2000) y con dos modelos adicionales mejorados que han sido
subsecuentemente publicados (Teller y col., 2001 ; Okada y col., 2002).
1.1.1 Rodopsina: Primer GPCR con estructura cristalina resuelta.
La Rho es el primer GPCR que ha podido ser cristalizado (Okada y col., 2000) y
el primero cuya estructura cristalina fue recientemente obtenida con una resolución
de 2.8 Å (Palczewski y col., 2000), lo cual representa un valor excelente de
resolución,
considerando
que
el
proceso
de
cristalización
de
proteínas
transmembranales sugiere un grado de dificultad bastante grande. Un diagrama de
cintas para representar la estructura cristalina de la Rho es mostrado en la Figura
1.2.
Fig. 1.2 Diagrama de cintas de la Rho preparado
a partir de estructura de cristalina a 2.8 Å de
resolución. El amino terminal (N) y la superficie
extracelular (o intradiscal), están ubicados en el tope
de la figura. El carboxi-terminal (C) y la superficie
intracelular (o citoplasmática), están en la base de la
figura.
Se muestran los siete segmentos
transmembrana
(H1-H7),
los
cuales
son
característicos de los receptores acoplados a
proteína G.
Los segmentos transmembranales
están coloreados de acuerdo al espectro de un
arcoiris, iniciando con el azul y terminando con el
rojo. El cromóforo 11-cis-retinal es mostrado en
color magenta, y las cadenas laterales de la Lys-296
y Glu-113 son mostradas para resaltar la región de
la base de Schiff del bolsillo de unión al retinal. El
nitrógeno imino de la base de Schiff es mostrado en
azul oscuro. La estructura cristalina de la Rho no
resuelve un pequeño segmento del lazo C3
enlazante de la H5 y la H6 o un segmento mas largo
de la cola carboxi-terminal distal a la H8. Los
segmentos transmembranales están inclinados con
respecto al plano presumido de la membrana. Ellos
son generalmente D-helicoídales, pero contienen
significativas enroscaduras e irregularidades. La
figura fue producida usando el programa
MOLSCRIPT y representa la cadena A de la
estructura cristalina publicada por Palczewski y col.
(2000). Tomado de Menon y col. (2001).
6
El diagrama de cintas presentado, ha permitido delinear de una forma más
precisa las bases estructurales de la Rho, aportando sin duda un importante avance
en la comprensión y correlación de todos los aspectos estructurales y funcionales
que por varias décadas habían sido estudiados con la aplicación de metodologías
bioquímicas, biofísicas y de biología molecular, entre otras.
Dado que en los
objetivos de este estudio no esta contemplado el análisis y la comprensión detallada
de dicha estructura, no serán profundizados aquí los aspectos cristalográficos; sin
embargo, es importante mencionar la relación existente entre el modelo de estructura
secundaria planteado por Sakmar (2002) (Fig. 1.1), y el modelo de la estructura
cristalina presentado en la Figura 1.2. En ambos casos es notoria la correlación de
la ubicación espacial de cada una de las tres regiones topográficas definidas para la
Rho, con relación a la membrana discal de los SEB, a saber: a) dominio de superficie
extracelular; b) dominio embebido en la membrana; y c) dominio de superficie
intracelular.
El modelo presentado en la Figura 1.2, sugiere que el dominio de superficie
extracelular estaría conformado por una cola amino-terminal y tres asas
extracelulares (EC I, EC II, EC III). La estructura cristalográfica confirma tal
información y además muestra como este dominio presenta un grado significativo de
estructura secundaria, lo cual favorece la ocurrencia de interacciones ínterdominio,
aportando los cimientos estables desde los cuales se extenderían los siete
segmentos transmembranales (Menom y col., 2001).
El dominio de la proteína embebido en la membrana, se correlacionó con los
modelos hipotéticos anteriormente planteados.
En este sentido, la estructura
cristalina de la Rho sugirió que 194 residuos aminoacídicos constituyen los siete
segmentos transmembranales (HI-HVII). Así, según la estructura cristalina, la
conformación definitiva de las hélices transmembranales sería: H-I (aminoácidos 3564); la H-II (aminoácidos 71-100); H-III (aminoácidos 107-139); H-IV (aminoácidos
151-173);
H-V
(aminoácidos
200-225);
H-VI
(aminoácidos
247-277);
H-VII
(aminoácidos 286-306). Adicionalmente la estructura cristalina de este dominio
señala un numero de enroscaduras
y distorsiones para cada segmento
7
transmembranal individual, las cuales no fueron estimadas en los modelos
estructurales hipotéticos construidos con base en los estudios de criomicroscopía
electrónica realizados por Baldwin y col. (1997) o Kreps y col. (1998), entre otros. Un
aspecto en el cual hubo, sin embargo, una extrema correlación entre los estudios
estructurales previos por criomicroscopía electrónica y la estructura cristalina de la
Rho, consiste en la predominancia de la estructura secundaria de Į-hélices,
adoptada por los segmentos transmembranales.
Por último, es muy notoria la
existencia en este dominio de numerosas y complejas interacciones intramoleculares
estabilizantes, algunas mediadas por la presencia del retinal y otras originadas
principalmente desde interacciones ínterhelicoidales independientes del bolsillo de
unión al cromóforo (Menom y col., 2001).
El dominio citoplasmático de la Rho no fue claramente resuelto en la
estructura cristalina, específicamente las extensiones desde los residuos 236-239 y
328-333, razón por la cual una información completa acerca de la estructura general
de este dominio se vio francamente limitada. Un rasgo a destacar de la estructura
cristalina de este dominio, es que el borde entre los segmentos helicoídales
transmembranales y los lazos citoplasmáticos, no necesariamente representan los
limites entre la fase acuosa y la bicapa lipídica como se había sugerido desde los
modelos hipotéticos iniciales de estructura secundaria; de hecho los segmentos
helicoídales generalmente se extienden hacia la fase acuosa citoplasmática, y una
prueba de ello es que los residuos aminoacídicos que han sido involucrados en la
unión y activación de la transducina, están ubicados en los segmentos helicoídales;
así el Glu-134 está en el final citoplasmático de la H-III, y la Lys-248 en el final
citoplasmático de la H-VI.
El movimiento de estas hélices hacia la fase acuosa
citoplasmática por efecto de la luz, con el fin de exponer dichos residuos para la
interacción con la transducina, apoyaría el resultado del análisis cristalográfico de
este dominio, en el cual, no se evidenciaron ubicaciones exclusivamente
intramembranales
para
los
extremos
citoplasmáticos
intracitoplasmáticas para los extremos de cada lazo.
de
las
Į-hélices
o
8
1.2 UBICACIÓN DE LA RODOPSINA EN
MEMBRANAS LIPíDICAS Y EL
PROCESO DE FOTOTRANSDUCCIÓN.
1.2.1 La Rodopsina embebida en su microambiente lipídico
La Rho se encuentra ubicada al nivel de las células fotorreceptoras retínales
conocidas como los bastones retínales, desempeñando la función de captación de un
fotón de luz que daría inicio a la cascada de señalización para la visión escotópica o
visión en la oscuridad. En los bastones de vertebrados, la Rho se encuentra tanto a
nivel de las membranas celulares como a nivel de las membranas de los discos de
los segmentos externos (SEB), estructuras de membranas especializadas que se
caracterizan por estar estrechamente apiladas una sobre otra en un número
aproximado de más de 2000, dispuestos desde la parte media de la célula (limite con
el segmento interno del bastón), hasta la parte mas apical de las mismas, porción
celular donde tiene lugar la cascada de señalización visual. El apilamiento de estas
estructuras de membrana interna garantiza un denso empaquetamiento de la
rodopsina para la absorción de la luz. En este sentido, Liang y col. (2003), calcularon
una densidad de Rho en estas membranas de a 60.000 por Pm2 con una densidad
promedio de a 40.000 moléculas por Pm2. En función de esto, se ha encontrado que
la Rho corresponde representa al 90% de todas las proteínas presentes los SEB. En
la Fig. 1.3, se muestra un modelo esquemático publicado por Hargrave (1983), que
representa la disposición de los discos de membranas apilados en los SEB y al
mismo tiempo la ubicación de la Rho embebida en dichas estructuras membranales.
En la Fig. 1.3, también se muestra la micrografía estructural de una sección de un
SEB retinal.
9
Fig. 1.3 Representación de un bastón retinal de vertebrado, membrana de los discos y un modelo de
Rho en la membrana. Los segmentos externos de los bastones contienen discos de membranas apilados
con la proteína fotorreceptora Rho empacada en ellos. La representación de sección cruzada expandida de
los discos muestra la bicapa lipídica de la membrana de ambas superficies del disco. Las moléculas de Rho
están densamente empacadas atravesando la bicapa lipídica, como lo muestran las formas ovales. En la
vista expandida a la derecha de la figura se representa la concepción de cómo puede estar dispuesta la
cadena polipeptídica de la Rho en tercera dimensión. La región N-terminal con las dos cadenas de
carbohidratos unidas está expuesta a la superficie intradiscal (extracelular). La cadena de polipéptido
atraviesa la membrana como siete regiones helicoídales empacadas y termina en el final C-terminal, a nivel
de la superficie citoplasmática. La vista de sección cortada transversalmente muestra al retinal unido a la
hélice final, en un bolsillo formado por la superficie interna del penacho helical compacto. Tomado de
webvision.umh.es/webvision/ imageswv/rhodop1.jpeg ; adaptado desde Hargrave (1996).
10
1.2.2 Proceso de fototransducción para la visión escotópica.
Como fue mencionado en la sección anterior, el proceso de captación de fotones
de luz ocurre exclusivamente al nivel de los SEB, dada la presencia en ellos del
pigmento visual rodopsina Rho. En este sentido, los SEB se caracterizan por
aglomerar el cúmulo complejo de proteínas responsables en su totalidad, de llevar a
cabo la cascada de señalización celular, tendente a la producción del estímulo visual.
Así, el proceso visual ha sido uno de los más caracterizados en cuanto al flujo de
información bioquímica, generado por la activación de las diferentes proteínas que en
el participan. En una forma muy general, se puede acotar que el proceso visual se
resume en la transformación de una energía lumínica, a una señal neuronal, para la
producción final del estimulo nervioso en el cerebro. Este proceso, en general, se
compone de una sucesión de reacciones bioquímicas que conforman la llamada
cascada de señalización para la visión escotópica y cuyo evento primordial depende
de la captación de un fotón de luz por parte de la Rho.
La fase de inicio de la cascada visual, es mostrada en la Fig. 1.4 (esquema
central) y la sucesión de eventos bioquímicos ocurre de la siguiente manera: la Rho,
densamente empacada en los discos de los SEB, realiza la captación de un fotón de
luz, a través del cromóforo de naturaleza lipídica, el 11-cis-retinal. La captación de un
fotón de luz por parte de la Rho, genera el proceso de isomerización del cromóforo,
desde su forma 11-cis-retinal, a la forma tautomérica
trans-retinal.
Ese evento
provoca un cambio a nivel del bolsillo de unión del cromóforo, delimitado por el
arreglo estructural de las hélices expandidas en la membrana. El cambio estructural
del bolsillo de unión del retinal, no sería más que la transducción de la señal de
excitación captada en el lado intradiscal del receptor, hasta regiones de la proteína
embebidas en la membrana. Dicha señal de activación es posteriormente transmitida
hacia la superficie citoplasmática del receptor. El cambio conformacional promovido
en la estructura de la rodopsina, convierte al receptor en su forma activa
metarodopsina II (M II) o rodopsina fotoactivada (Rho*), promoviendo su unión a la
proteína G heterotrimérica T, en su forma inactiva o unida a GDP (T
Į,ȕ,Ȗ),
(Kühn,
1981). Esta interacción se traduce en la liberación del GDP y en un intercambio de
11
GDP por GTP en el bolsillo de unión de nucleótidos de la subunidad TĮ, con la
concomitante disociación de la holoenzíma en sus unidades funcionales TĮ-GTP
(subunidad activa) y el complejo TȕȖ. Posteriormente la TĮ-GTP pasa a estimular a la
enzima efectora de este sistema que es una fosfodiesterasa de GMPc (PDE),
activándola por causar la remoción de su subunidad Ȗ-inhibidora (Fung y col., 1981)
(ver Fig. 1.4, esquema a la derecha). La activación de la PDE, promovería la
hidrólisis y la posterior disminución de los niveles de GMPc intracelular. La rápida
disminución del GMPc en los SEB, resulta en el cierre de los canales de compuerta
dependientes GMPc, ubicados en la membrana plasmática de dichos segmentos
externos. Este evento conllevaría al bloqueo de la entrada de iones de Na+ y Ca++, y
por ende a una reducción de la corriente eléctrica circulante. Esto se traduce
finalmente en una hiperpolarización de la membrana y a la generación de una señal
neuronal, que sería posteriormente trasmitida a neuronas retinales secundaria, las
cuales se encargarían de trasmitir dicho impulso nervioso al cerebro (Baylor, 1996).
En cuanto a la fase de apagado de la cascada visual (Fig. 1.4, esquema a la
izquierda), una vez que la Rho* ha cumplido con su función de activar a la T, y se ha
producido una reducción importante de los niveles de Ca++ intracelular por efecto de
la reducción basal del influjo de Ca++ y Na++ como consecuencia del cierre de los
canales de compuerta dependientes de GMPc, la rodopsina quinasa (RQ) es
disociada de la recoverína que la mantiene anclada a la membrana. En este punto, la
RQ fosforila la cola C-terminal de la Rho* en residuos de Ser y Thr, ejerciendo su
función de inactivación por fosforilación del receptor. La Rho* y fosforilada en su cola
C-terminal, por la acción de la rodopsina quinasa, se convierte en sustrato de la
arrestína 1 visual (Arr1), la cual inhibe así su capacidad para reconocer y activar a
otras T inactivas. Finalmente, la Rho* es defosforilada y simultáneamente libera al
todo-trans retinal unido (ver Fig. 1.4).
12
1
2
Fig. 1.4 Cascada de señalización visual escotópica. La Rho (R) capta un fotón de luz sufriendo un cambio
conformacional por la isomerización del retinal unido (barra en blanco dentro de R), pasando a su forma
fotoactivada (R*). R* interacciona con la T heterotrimérica (TDEJ). TD se une al GTP y se disocia del complejo
TEJ. TD-GTP (subunidad activa se une a la fosfodiestresasa de GMPc (PDE) (panel inferior derecho)
disociandola de sus subunidades reguladoras. La PDE activada lleva a cabo la hidrólisis del GMPc a GMP. Se
reducen los niveles intracelulares de GMPc, lo cual resulta en el cierre de los canales de Na+ y Ca++ de
compuerta dependiente de GMPc. Se reduce el influjo de corriente entrante y el influjo de Ca++ a la celula. Este
evento resulta en una hiperpolarización de la membrana conducente a la generación del impulso nervioso hacia
neuronas retinales secundariaas y finalmente al cerebro (Baylor, 1996). En la fase de apagado (panel izquierdo)
La R* es fosforilada por la rodopsina quinasa (R*-Kinase) favoreciendo el reconocimiento y unión de la arrestina
(A) al receptor fosforilado (R*-P-P). La R*-P-P es posteriormente desfosforidada y libera el todo-trans retinal
unido.www.sinnesphysiologie.de/ photor/pho08al.jpg
13
1.2.2.1 Fenómeno de amplificación de la cascada de señalización visual.
La cascada de señalización visual, presenta un aspecto compartido con otros
eventos de señalización a nivel subcelular, importante de destacar, como lo es la
ocurrencia de un llamado efecto de amplificación a través de la secuencia de
reacciones bioquímicas. El efecto de amplificación explica la alta eficiencia con la
que es realizada la transducción de señales durante el proceso visual, el cual
trascurre en solo milésimas de segundos. En este sentido se han descrito etapas
muy puntuales de amplificación dentro de esta ruta de señalización.
El primer paso de amplificación fue demostrado en la etapa inicial de la
cascada, es decir a nivel de la interacción de la Rho* con la T heterotrimérica unida a
GDP (Fig. 1.4, flecha 1). La unión de un nucleótido de GTP a nivel de la subunidad
TD en el complejo de la T heterotrimérica, genera un cambio importante en la afinidad
de TĮ-GTP por el complejo dimérico TȕȖ. TĮ-GTP también disminuye su afinidad por la
Rho* luego de activarla. De esta forma ocurre la liberación de la Rho* desde el
complejo con la TĮ-GTP. Este fenómeno favorece que el receptor fotoestimulado
actué cataliticamente (Stryer, 1983), ya que continua activado y con capacidad de
estimular a otras transducinas inactivas.
En este orden de ideas, un estudio
demostró que un número estimado de ~ 500 moléculas de TĮ-GTP pueden ser
formadas por una molécula simple de Rho* (Fung y col., 1981). En estos estudios
dirigidos a elucidar la magnitud del fenómeno de amplificación de la cascada visual,
se determinó que el fenómeno de amplificación estaría reflejado directamente en el
rápido descenso de los niveles de GMPc intracelular, por efecto de la activación de la
PDE. El resultado de la amplificación en la primera fase durante la activación de la
transducina por la Rho*, incrementa la hidrólisis del GMPc intracelular en el orden de
102 (Fung y col., 1981).
El segundo paso de amplificación fue publicado durante la fase de hidrólisis de
GMPc por la PDE activa (Fig. 1.4, flecha 2), con un incremento en la hidrólisis de
GMPc de aproximadamente de 103 (Yee y Liebman, 1978). Todo lo anterior indicó
que una molécula simple de Rho* tiene la capacidad de hidrolizar mas de 105
moléculas de GMPc. Es importante destacar que el efecto de amplificación de la
14
cascada de señalización visual contempló una consideración implícita e intrínseca de
una estequiometría funcional 1:1 referida al acoplamiento de una Rho* con una
proteína G (T) en el primer paso de la cascada (ver Fig. 1.4).
1.3 ORGANIZACIÓN SUPRAMOLECULAR Y FUNCIONALIDAD DE LOS
GPCRs EN SUS MEMBRANAS CELULARES NATIVAS.
Para una adecuada comprensión de cómo operan los GPCRs en el medio
ambiente de membranas donde estos se encuentran profundamente insertados, y
entender los mecanismos de engranaje molecular de estos, con las proteínas
específicas con las cuales están comprometidos a interaccionar, es importante
revisar los datos existente referidos a la organización supramolecular (estructura
cuaternaria) de estos importantes receptores transmembranales.
1.3.1 Análisis de la estructura cuaternaria de los GPCRs y sus posibles
implicaciones.
Todos los GPCRs inicialmente fueron asumidos como moléculas monoméricas
con capacidad intrínseca de interaccionar con su proteína G heterotrimérica, siendo
un hecho conocido que un GPCR simple puede activar secuencialmente un gran
numero de proteínas G en una misma cascada de señalización.
En efecto,
diferentes GPCRs pueden activar al mismo subtipo de proteína G, y similarmente, un
GPCR puede acoplarse a diferentes subtipos de proteína G, al menos en
condiciones in vitro. Sin embargo los mecanismos de activación del receptor parecen
ser conservados para todos los miembros de la súperfamilia de los GPCRs
(Mirzadegan y col., 2003; Okada y col., 2001; Teller y col., 2003). Estos hallazgos
sugieren que el acoplamiento productivo de los diferentes GPCRs (en su respectivo
arreglo supramolecular) con las proteínas G y las arrestínas debe ser un mecanismo
análogo (Filipek y col., 2004). Siendo este el caso, debe establecerse un acentuado
15
énfasis en conocer si es realmente la organización supramolecular de los mismos, un
rasgo estructural igualmente conservado.
A este respecto, investigaciones tempranas y divergentes habían sugerido que
por ejemplo la clase más simple de los GPCR (clase A), incluyendo a la rodopsina y
numerosos receptores de olores, funcionaban como monómeros, aunque algunos de
ellos serian hábiles para formar homodímeros o heterodímeros con otros GPCRs de
la misma clase. Contrariamente, la clase más compleja de esta súperfamilia (clase
C), incluyendo los receptores metabotrópicos de glutamáto (Romano y col., 1996) y
los receptores de GABA (White y col., 1998), funcionan como homo y heterodímeros
obligatorios. En este orden de ideas sigue aun vigente una de las preguntas más
fundamentales, referida a como operan realmente los GPCRs.
Con miras a responder esta pregunta fundamental, un creciente cuerpo de
evidencias farmacológicas, bioquímicas y biofísicas sugirieron fuertemente que estos
receptores funcionan como homo- y heterodímeros así como también bajo la forma
de oligómeros de orden superior. Recientemente, ha sido publicado que los
receptores de dopamina D2 forman complejos homodiméricos a partir de contactos
establecidos entre la hélice H-VI (H-VI) (Guo y col., 2003; Lee, y col., 2003). Técnicas
de transferencia de energía bioluminiscente por resonancia (BRET), han evidenciado
que los receptores ȕ2-adrenérgicos y muchos otros son capaces de formar
homodímeros constitutivos y funcionales (Angers y col., 2000). Similarmente, fue
publicado que los receptores muscarínicos cardiacos son capaces de formar
complejos diméricos estables (Peterson y col., 1986; Zeng y Wess, 1999). Estas
investigaciones conjuntamente con muchos otros no mencionados aquí, parecieran
apuntar a que los receptores tipo GPCR en general, se encuentran organizados y
más aún, funcionales a nivel de sus membranas nativas como homo y
heterodímeros, así como también bajo la forma de oligómeros de orden superior (Lee
y col., 2003; Bretwieser, 2004).
Sin ser el objetivo de este análisis, el citar todo el amplio compendio de
publicaciones científicas que sugieren la condición oligomérica nativa (constitutiva) o
bien inducida por la activación del receptor, a la fecha se ha podido inferir que el
fenómeno de oligomerización de los GPCRs tendría como significado biológico, el
16
agrupar a dichos receptores en regiones muy particulares de la membrana. En líneas
generales, el proceso de oligomerización de los GPCRs ha sido entendido como
critico para la ocurrencia de las cinéticas apropiadas de señalización, selectividad,
desensibilización e internalización, mediadas por el GPCR específico a considerar.
Adicionalmente, se ha publicado que la oligomerización de receptores GPCR podría
beneficiar a la maduración del receptor durante el proceso de su biosíntesis o bien
favorecer su transporte a la membrana plasmática en la cual ejercería sus funciones
de señalización activa (Overton y col., 2003).
1.4 ESTRUCTURA CUATERNARIA NATIVA DEL GPCR, RODOPSINA.
A pesar de que la vasta mayoría de los aspectos moleculares actualmente
aceptados para la población general de los GPCRs, fue en un principio el resultado
de las investigaciones sobre la Rho, el nuevo paradigma de la dimerización de los
GPCRs, no había sido interpolado a este receptor, dado que la extensiva
caracterización estructural y funcional realizada sobre el mismo, en la década de los
años 70 a 80, fue ejecutada bajo la premisa implícita de que estos receptores debían
encontrarse bajo un arreglo monomérico en las membranas de los discos de los
SEB. En este sentido, los datos disponibles fueron interpretados hacia la existencia
de Rho en una disposición monomérica exclusiva. Sin embargo, dado el auge de la
aparición de cientos de publicaciones de dimerización de receptores tipo GPCR
(clases A B y C), suscitados a partir de los años 90, hubo un nuevo énfasis en el
estudio de la estructura cuaternaria de este fotorreceptor. En efecto, resultados
contrapuestos a la condición monomérica asumida para la Rho, fueron publicados a
partir del año 2003 (Fotiadis y col., 2003 y 2004, Liang y col., 2003). En este sentido
y para dar a conocer los aspectos más importantes publicados hasta la fecha en esta
diatriba de una organización monomérica o dimérica para este fotorreceptor, se
presentará aquí una breve revisión de los mismos.
17
1.4.1 La Rodopsina como una entidad monomérica en membranas de los
SEB.
Las evidencias biofísicas que sugirieron inicialmente que la Rho se encontraría
organizada como un monómero a nivel de las membranas de los discos de los SEB,
estuvieron fundamentadas en estudios tempranos de difracción de rayos X de ángulo
bajo y resultados de análisis de difracción de neutrones, realizados por Chabre,
(1975) y por Blasie y Worthington (1969). Los resultados de estas investigaciones
habrían indicado que la Rho se encontraba aleatoriamente dispersa a lo largo de la
membrana de los discos de los SEB, y dispuesta de forma inespecífica, carente de
algún ordenamiento especial. Estudios posteriores de microscopia electrónica (ME),
realizados sobre las membranas de los discos SEB apuntaron que posiblemente la
Rho exhibía una organización monomérica en dichas membranas, dado que estos
estudios evidenciaron un patrón disperso, densamente empacado y no ordenado del
fotorreceptor, embebido dentro de los discos de membrana (Chen y Hubbell, 1975;
Roof y Hauser, 1982).
Adicionalmente a estos resultados, las evidencias biofísicas
más importantes que sugirieron que la Rho podría encontrarse como un monómero
al nivel de las membranas de los discos, surgió en parte de estudios de fotoblanqueo
(fotoactivación) y de dicroísmo de la Rho, los cuales dieron como resultado que este
fotorreceptor exhibía constantes de rápida difusión lateral y rotacional en su medio
ambiente de membrana,
con un tiempo de relajación de aproximadamente 20
microsegundos (Ps) a una temperatura de 20 °C (Liebman y Entine, 1974; Cone,
1972; Poo y Cone, 1974; Wey y col., 1981). Experimentos bioquímicos basados en
técnicas de entrecruzamiento, también sirvieron para sugerir que la Rho se
organizaba bajo una forma monomérica en la membrana de los SEB (Brett y Findlay,
1979; Downer, 1985).
De las investigaciones anteriormente citadas, la que predominantemente sirvió
para sugerir como funcionaba la Rho, tuvo que ver con el hecho de que esta proteína
difundía rápidamente a nivel de las membranas lipídicas compuestas por fosfolípidos
altamente insaturados para encontrarse con la T. Este hecho, apuntó indirectamente
18
a que la Rho se organizaba en entes separados e independientes uno de otro en
dicho entorno. Esa libre fluidez en el medio ambiente de la bicapa lipídica, fue
planteada como inconsistente con la existencia de esta proteína bajo la forma de
grandes complejos oligoméricos; razón por la cual, se asumió que la Rho existía en
un arreglo de tipo monomérico exclusivo.
1.4.2 La rodopsina como una entidad dimérica en membranas de los SEB.
En contraposición a los importantes y pioneros estudios biofísicos y bioquímicos
comentados en la sección anterior, los cuales argumentaron a favor de la posible
existencia de la Rho bajo un arreglo monomérico en las membranas de los discos de
los SEB, hallazgos controversiales mostrando organizaciones más complejas de la
Rho en sus membranas nativas, fueron publicados por Fotiadis y col. (2003 y 2004)
y Liang y col. (2003). Estos investigadores publicaron la obtención de imágenes de
homodímeros estructurales de Rho, organizados en arreglos paracristalinos a nivel
de las membranas de los discos de los SEB, en modelos múridos y en condiciones
nativas. Estas imágenes fueron obtenidas a partir de la aplicación de la novedosa
técnica de microscopía de fuerza atómica (MFA), sobre muestras de discos de los
SEB, preparadas bajo condiciones de oscuridad. En este punto y dado el carácter
controversial de estos resultados, a continuación se presenta una descripción
detallada de los mismos en la Fig. 1.5, tomada del trabajo de Liang y col. (2003).
Nótese en la Fig. 1.5 A (imagen de altura) y B (imagen de deflexión), la morfología de
un disco nativo intacto absorbido sobre la mica. En estas imágenes, pueden ser
fácilmente distinguibles tres tipos diferentes de superficie: el lado citoplasmático del
disco (tipo 1), los lípidos co-aislados (tipo 2) y la superficie de mica (tipo 3). La
superficie citoplasmática del disco (tipo 1) fue altamente corrugada indicando la
presencia de proteínas densamente empacadas (Fig. 1.5, tipo 1), comparada con la
superficie de los lípidos propios de la bicapa (Fig.1.5, tipo 2).
19
Fig. 1.5 Morfología de los discos nativos intactos absorbidos a mica preparados para MFA en
solución buffer. A) Imagen de altura. Se muestra un disco de membrana con un grosor típico de 16-17
nm. Superficies evidentes: superficie citoplasmática (tipo 1), lípidos co-aislados (tipo 2), mica (tipo 3). B)
Imagen de deflexión. Se muestra el carácter rugoso de la superficie tipo 1 comparado con los lípidos (tipo
2), indicación de proteínas densamente empacadas. Las cabezas de flechas muestran defectos inducidos
por la MFA. Escala de barras (250 nm). Tomado de Liang y col. (2003)
Los discos abiertos, aplanados y esparcidos, absorbidos como membranas de capa
simple y de forma circular, a la mica, exhibieron cuatro diferentes tipos de superficie
(Fig. 1.6). El primer tipo de superficie (Fig. 1.6 A, tipo 1) se caracterizó por una
topografía altamente texturizada consistente de líneas dobles densamente
empacadas de cúmulos formando arreglos paracristalinos de Rho (Fig. 1.6 B). Dado
que como se ha mencionado en secciones anteriores, la Rho representa
aproximadamente el 90 % de las proteínas presentes a nivel de las membranas de
los discos de los SEB, estos hallazgos sugirieron que las líneas densamente
empacadas visualizada por MFA en la Fig. 1.6 (B), correspondía con dicha proteína
abundantemente empaca en tales membranas. El segundo y tercer tipos de
superficies en la Fig. 1.6 (A), correspondieron con los lípidos de membrana y la
superficie de mica, respectivamente. Otro hallazgo importante publicado por estos
autores con el uso de la MFA, tuvo que ver con el análisis de un cuarto tipo de
superficie mostrado en la Fig. 1.6 (A), superficie tipo 4 y Fig. 1.6 (C).
Estas
imágenes presentaron la misma morfología a la encontrada en la Fig. 1.6 (B),
20
excepto en que los paracristales de Rho se formaron en los llamados microdominios
de membrana resistentes a detergentes o balsas lipídicas. Estos microdominios de
membrana funcionan como plataformas de señalización que contienen diferentes
proteínas de una misma ruta de señalización celular. En este caso, las líneas de
dímeros de Rho en arreglo paracristalíno, se encontraron separadas por lípidos de
membranas. En la Fig. 1.6 (B) y (C), los elipses señalan a los dímeros de rodopsina
desde las regiones densamente empacados o los conglomerados ubicados en las
balsas lipídicas, respectivamente (Liang y col., 2003). Evidencias adicionales muy
similares de la organización de la opsina en líneas de dímeros dispuestas en un
arreglo paracristalíno, fueron obtenidas igualmente por MFA (Liang y col., 2003).
Fig. 1.6 Topografía de los discos abiertos aplanados y esparcidos, absorbidos a mica y preparados
para la MFA. A) Imagen de altura de los discos. Superficies evidentes: superficie citoplasmática (tipo 1 y 4),
lípidos (tipo 2), y mica (tipo 3). Las topografías de las regiones 1 (b) y 4 (c) de alta magnificación revelaron
líneas de dímeros de rodopsina densamente empacadas. Se muestran los paracristales de dímeros simples
de rodopsina (elipses de líneas cortadas) y los monómeros ocasionales de rodopsina (cabezas de flechas),
flotando en la bicapa lipídica. Escala de barras (250 nm) (a) y 15 nm. Tomado de Liang y col. (2003).
21
1.5 CONTROVERCIA EN REFERENCIA A LA ORGANIZACIÓN MONOMÉRICA
O DIMÉRICA PARA LA RODOPSINA.
1.5.1 Argumentos en contra de un arreglo nativo dímérico de la Rho.
Dado que el trabajo publicado por Fotiadis y col. (2003), fue altamente
controversial por evidenciar la posible existencia de líneas de dímeros de Rho
dispuestos en arreglo paracristalíno en condiciones nativas en membranas de los
discos de los SEB, surgió una interesante polémica por parte de investigadores que
realizaron la caracterización biofísica-estructural de la Rho en dichas membranas, a
favor de la existencia del receptor como una entidad monomérica. Básicamente, el
trabajo de Fotiadis y col. (2003), fue criticado por el hecho de que, tal arreglo
empaquetado de la Rho en las membranas nativas de los SEB, pudiera haber
resultado del efecto de una reorganización artificialmente inducida, por la
segregación de proteínas y lípidos causada por las condiciones de temperatura a las
cuales fue sometida la preparación de los discos de membrana previo a la MFA (15 h
de incubación a 0 °C, en 2 mM Tris-HCl) (Chabre y col., 2003). Este argumento,
lógico por demás, pudiera ser posible, ya que en una preparación de estos discos de
membrana bajo tales condiciones, seria factible la generación de un brote osmótico
en los mismos, alterando su estructura membranosa nativa y por tanto, la
organización de la Rho embebida en estas (Chabre y col., 2003).
Adicionalmente, los resultados de fotoblanqueo y dicroísmo, previamente
comentados aquí, sugirieron que la Rho exhibía constantes de rápida difusión lateral
y rotacional en su medio ambiente de membrana (Liebman y Entine, 1974; Cone,
1972; Poo y Cone, 1974; Wey y col., 1981). Estas rápidas constantes exhibidas por
la Rho en membranas SEB, fueron asumidas como propias de una proteína de
membrana en arreglo monomérico. En sentido contrario, estas proteínas en arreglo
dimérico u oligomérico, no podrían exhibir tales difusiones laterales y rotacionales
rápidas en un modelo de mosaico fluido de membrana (Singer y Nicolson, 1972),
tradicionalmente aceptado para las membranas celulares (Park y col., 2004).
22
Por otra parte y en el mismo orden de ideas, criticas al trabajo de Fotiadis y
col., (2003), surgieron por supuestas inferencias resultantes de los trabajos de Chen
y Hubbell (1973), Roof y Hauser (1982), y Olive y Recouvreur (1977) en los cuales a
pesar de no haber sido mencionado un arreglo monomérico o dimérico para la Rho
en membranas como un hecho taxativo, fue asumido que los diámetros medidos (40
Å) para la Rho por estos autores, correspondían a monómeros del receptor.
Finalmente, otra fuerte crítica fue realizada a los trabajos de Fotiadis y col.,
(2003) y (2004) y Liang y col. (2003), por parte de Chabre y le Maire (2005),
consistente en el hecho de que, hasta la fecha ninguno de los estudios
cristalográficos previos realizados sobre la Rho había sugerido la existencia de un
dímero. Estos autores argumentan que en todas las publicaciones de estructuras
cristalinas de la Rho publicadas hasta ahora, los contactos proteína-proteína se dan
entre moléculas de Rho dispuestas en forma antiparalela, lo cual seria un arreglo no
fisiológico para la Rho en membranas nativas.
Con base en todo lo anteriormente expuesto, un arreglo supramolecular
dimérico nativo de la Rho en membranas queda en discusión. Más aún, estos datos
experimentales en conjunto con otra importante cantidad de hallazgos moleculares
de tipo estructural y funcional de la proteína G heterotrimérica T, han sido utilizados
para la proposición reciente de un modelo de acoplamiento de la Rho en un arreglo
monomérico y su respectiva proteína G (T) (Chabre y le Maire, 2005).
1.5.2 Argumentos a favor de un arreglo dimérico de la Rho que rebaten
la existencia de una estructura monomérica.
Fotiadis y col. (2004) y Liang y col. (2003) prepararon membranas de discos
nativos a temperatura ambiente, desde el aislamiento de los SEB a partir de las
retinas múridas, hasta la preparación de la muestra para los registros por
imaginología usando micrografía electrónica ME y MFA. Nuevamente bajo estas
condiciones mas aproximadas a las fisiológicas, la dimerización y formación de
oligómeros de orden superior (arreglo paracristalíno), también fueron observadas en
dichas membranas nativas de forma idéntica a la mostrada en la Fig. 1.6 (B). Este
23
hallazgo indicó que el arreglo de líneas de dímeros de Rho no fue un artefacto
inducido por la preparación inadecuada de la muestra.
Por otra parte, la argumentación de que la Rho debería ser asumida como un
monómero nativo en las membranas de los SEB, basado en las rápidas constantes
de difusión lateral y rotacional en su medio ambiente de membrana, lo cual era
consistente con el comportamiento de estas proteínas en los modelos de mosaico
fluido de membrana (Singer y Nicolson, 1972), quedo prácticamente sin efecto con la
identificación de las líneas de dímeros de Rho en arreglo paracristalíno en las balsas
lipídicas a nivel de las membranas de los SEB (Fig. 1.6, C) (Liang y col., 2003). En
efecto, se ha evidenciado que las balsas lipídicas albergan importantes componentes
de la transducción de señales mediada por los GPCRs (Feron y col., 1997; Huang, y
col., 1997; Wu y col., 1997; Chini y Parenti, 2004). En este sentido, la Rho como un
prototipo de GPCR, no escapa de estas nuevas concepciones de membrana.
Publicaciones bioquímicas muy recientes han evidenciado la localización constitutiva
de este receptor visual en la bicapa lipídica y en las balsas lipídicas y más importante
aún se ha demostrado la reubicación de la T en estas para interaccionar con su
receptor, por efecto de la luz (Seno y col., 2001; Nair y col., 2002). La presencia de la
Rho embebida en secciones uniformes y no uniformes de membrana (balsas
lipídicas), sugirió que las velocidades de difusión y rotación de la Rho en los SEB
podrían variar o cuando menos, no ser tan constantes como fue planteado en los
estudios
biofísicos
previos.
Adicionalmente,
se
ha
podido
conocer
que
aproximadamente un cuarto de las moléculas de Rho son inmóviles y que su
movilidad difiere dependiendo de su localización axial en los discos en los cuales
ellas se encuentran insertas (Wey y col., 1981). Así pues, la concepción de que la
Rho es monomérica, en atención a sus habilidades de rápidas y constantes
difusiones laterales y rotacionales en membranas lipídicas (~20 Ps ) poco uniformes
en cuanto a su constitución de lípidos y proteínas, podría ser acuciosamente
invalidada. En adición, los hallazgos de que aproximadamente un cuarto de las Rho
son inmóviles y que su movilidad dependería de su localización mas o menos
inclinada al insertarse en la membrana (localización axial), se oponen directamente a
24
esos estudios que sugirieron las rápidas difusiones laterales y rotacionales o al
menos a su extrapolación al total de las Rho en membrana.
En contraposición a las interpretaciones de los diámetros medidos para la Rho
en membranas de los SEB por Chen y Hubbell (1973), Roof y Hauser (1982) y Olive
y Recouvreur (1977), supuestamente atribuibles a tamaños esperados para
monómeros del fotorreceptor; revisiones actuales realizadas por Park y col. (2004),
apuntarían mas bien a una correspondencia de esos mismos diámetros, con la
existencia de dímeros u oligómeros de Rho, en lugar de argumentar para la
existencia de los monómeros.
Por último, la supuesta inexistencia de publicaciones cristalográficas previas
donde se exhibieran arreglos diméricos de la Rho (Chabre y le Maire, 2005),
pareciera también ser fácilmente discutible dado que, existen cristales de Rho que
demuestran la propensidad de este fotorreceptor a formar estructuras de orden
superior, conocidas como cristales bidimensionales. Estos cristales fueron obtenidos
por la extracción de Rho de las membranas de los SEB de ranas, usando Tween 20
como detergente (Schertler y Hargrave, 1995). En cuanto a la existencia de cristales
en los cuales habría una orientación antiparalela de las rodopsinas en los dímeros,
Fotiadis y col. (2004), realizaron un análisis de la orientación de las rodopsinas en los
cristales bidimensionales publicados por Schertler y Hargrave (1995) y encontraron
que igual a los datos visualizados por MFA, dichos cristales bidimensionales
contenían a un dímero como la unidad celular y tenían moléculas orientadas
unidireccionalmente en la membrana, tal y como debería esperarse para la Rho en
configuración fisiológica (Fotiadis y col., 2004). Estas evidencias constituyen así la
data experimental que ha sido recientemente argumentada para proponer la
ocurrencia de un posible arreglo cuaternario de tipo dimérico para la Rho, quien
representa al GPCR prototipo de esta superfamilia de receptores de membrana. De
forma similar a los proponentes de un arreglo molecular monomérico para la Rho, los
proponentes del modelo dimérico han publicado un modelo de acoplamiento de la
Rho en arreglo cuaternario dimerico y su respectiva proteína G (T) (Filipek y col.,
2004). En este punto resulta pertinente resaltar lo siguiente: dado que las evidencias
experimentales a favor de una estructura dimérica para la Rho (Fotiadis y col., 2003,
25
2004; Liang, y col., 2003), no pudieron ser rebatidas en su totalidad por los datos
argumentados por Chabre y col. (2003) y Chabre y le Maire (2005), pareciera que la
Rho pudiera organizarse en forma dimérica y disponerse en forma de arreglo
paracristalíno de líneas de dímeros, a nivel de las membranas de los discos de los
SEB. Sin embargo,
es indudable que se hace necesaria la implementación de
abordajes adicionales que finalmente corroboren tal organización supramolecular,
aun rodeada de un carácter ambiguo.
1.6 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DE ESTA INVESTIGACIÓN.
La concepción clásica universalmente reconocida en cuanto a la organización
y funcionalidad de los recetores tipo GPCR a nivel de las bicapas lipídicas en las
cuales están embebidos, estuvo fundamentada en modelos que asumían una
condición
molecular
tipo
monomérica,
contemplando
así
un
modelo
de
estequiometría funcional tipo 1:1, es decir, la estimulación de un GPCR monomérico
por su agonista específico, promovería la interacción del mismo con su proteína G
respectiva, como un requisito indispensable par la iniciación de la cascada de
señalización especifica.
Este modelo estequiométrico 1:1, ha sido muy controversial en los últimos
tiempos, dado el conocimiento del conjunto creciente de evidencias, las cuales
sugieren que probablemente los GPCRs pueden existir y mas aún ser activos, bajo
formas de organización más complejas a nivel de la membrana, es decir como
complejos homodiméricos, homotriméricos o bien como multímeros mayores de
GPCRs. La oligomerización de los GPCRs, asimilaría a estos receptores con otras
clases de receptores de superficie de membrana, en los cuales un estado de
oligomerización constitutiva o promovida por ligando, sería esencial para el proceso
de señalización celular, tal y como es el caso de los receptores tirosin quinasas
(Schlessinger, 2000).
Estudios bioquímicos muy recientes realizados por una combinación de
técnicas de espectrometría de masa, dispersión de neutrones y entrecruzamiento
químico, sobre el receptor tipo GPCR BLT1 (específico para mediar respuestas a
26
estímulos por leucotrieno B4), hicieron un importante aporte en el estudio de la
estequiometría funcional entre los GPCRs y sus respectivas proteínas G. En este
sentido, Baneres y Parello (2003), demostraron inambiguamente mediante técnicas
de espectrometría de masa, entrecruzamiento químico difracción de neutrones, que
el complejo señalizante activo entre el BLT1 y su respectiva proteína G (tipo GDi),
podía ser aislado como un ensamblaje de tipo pentamérico, es decir, estos autores
demostraron que una proteína G se une a un dímero del receptor activado. Estos
autores a partir de este resultado, sugirieron que la dimerización del receptor podría
ser un evento crucial para la transducción de señales mediada por el receptor BLT1.
El reporte del primer aislamiento de complejos pentaméricos señalizantes de GPCR:
G, para el BLT1, ha contribuido interesantemente a reforzar la idea de que los
GPCRs en general, podrían organizarse y funcionar como entes diméricos, y más
allá, ha sugerido que la estequiometría real funcional entre GPCR : proteína G podría
ser de tipo 2:1, en sustitución de la estequiometría clásica 1:1. Esta nueva
estequiometría podría ser válida para todos los GPCR, incluso para la Rho, dado que
mucha de la información estructural actualmente reconocida para la súperfamilia de
los GPCRs, ha sido derivada de los estudios pioneros realizados sobre el
fotorreceptor visual como el prototipo de estos receptores. Sin embargo las
evidencias experimentales de la dimerización de la Rho obtenidas hasta los
momentos y discutidas en las secciones anteriores, no permite establecer de forma
inambigua, cual es la organización cuaternaria nativa de este fotorreceptor. Este
hecho es probablemente debido a que los abordajes de tipo biofísico y bioquímico
empleados para el estudio de esta organización cuaternaria, se han visto
influenciados por variables de tipo experimental, las cuales hacen a tales resultados
susceptibles a cuestionamiento. Adicionalmente, los estudios más importantes e
influyentes presentados y discutidos aquí, a favor de organizaciones monoméricas o
diméricas, han estado enmarcados en técnicas que permiten en efecto la
visualización o la inferencia de los tentativos arreglos de la Rho en membranas. Sin
embargo, los abordajes en cuestión, fueron limitados para evaluar más allá de la
organización del receptor en membranas, aspectos inherentes a la funcionalidad de
la Rho en cualquiera de los dos arreglos estructurales en cuestión.
27
Considerando lo dicho anteriormente, es determinante la implementación de
técnicas que permitan evaluar la ocurrencia de interacciones Rho-Rho en sus
membranas nativas o bien solubilizada en detergente. La solubilización del receptor
debería realizarse en forma tal que el mismo no pierda su arreglo molecular nativo
exhibido en membranas. De igual manera resulta de interés la ejecución de
procedimientos bioquímicos que permitan conocer directamente la masa molecular
nativa del receptor solubilizado. Estos procedimientos aportarían información clave
acerca de si el receptor puede ser aislado bioquímicamente como monómero o como
dímero y permitirían la ejecución de pruebas funcionales que indiquen bajo que tipo
de estequiometría (2:1 o 1:1) funciona el receptor, en dependencia del tipo de
complejo dimérico o monomérico mayoritariamente aislado. Los resultados producto
de la ejecución de estos abordajes, son importantes, dado que permitirían obtener un
conocimiento más apropiado y menos ambiguo en cuanto a la organización
supramolecular de la Rho en condición nativa o fotoactivada, contribuyendo así a
aportar una tercera opinión que apoyaría a una de las dos tendencia existentes,
referentes a la ocurrencia de la Rho en estructura monomérica o dimérica,
actualmente en activo debate.
1.7 HIPÓTESIS
En la presente tesis doctoral, se plantea que la estructura supramolecular de la
Rho en condición nativa o fotoactivada, a nivel de las membranas SEB o bien
solubilizada en detergente, debe obedecer a un arreglo cuaternario de tipo dimérico.
Por lo tanto, mediante la aplicación de procedimientos de entrecruzamiento químico
con agentes entrecruzadores bifuncionales y la caracterización de los parámetros
hidrodinámicos de la Rho y la Rho* solubilizada en el detergente n-dodecíl E-Dmaltósido, debe ser posible dilucidar la estructura cuaternaria de la Rho bovina.
28
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GENERALES.
x
Determinar la estructura cuaternaria de la Rho en su estado basal y fotoactivado,
mediante técnicas de entrecruzamiento químico, evaluación de sus parámetros
hidrodinámicos.
x
En caso de evidenciar formas monoméricas, diméricas u oligoméricas, evaluar su
funcionalidad en cuanto a la medición de los espectros Ultravioleta / visible
(UV/Vis) característicos en el rango de 250-650 nm, habilidad de activar a la
transducina (T), y su capacidad de servir como sustrato para la rodopsina
quinasa.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
x
Obtener SEB intactos de retinas bovinas y purificar la rodopsina a partir de los
mismos. Se determinará la integridad funcional de la proteína fotorreceptora
(Rho).
x
Realizar ensayos de entrecruzamiento químico de la Rho en oscuridad y
fotoactivada, con agentes entrecruzadores bifuncionales específicos.
x
Realizar reacciones de entrecruzamiento de la Rho en función del tiempo y
evaluar
el
efecto
de
la
concentración
de
la
Rho
en
el
cociente
monómero:oligómero producto del su entrecruzamiento.
x
Estimar las propiedades hidrodinámicas de la Rho nativa y fotoactivada, a partir
de procedimientos de Cromatografía de exclusión molecular y sedimentación por
ultracentrifugación en gradientes lineales de sacarosa.
x
Determinar la integridad estructural y funcional de los complejos de Rho nativa
aislados por procedimientos de filtración molecular en gel, mediante la realización
de espectros UV/Vis, medición de la capacidad de inducir el intercambio de
nucleótidos de guanina de la transducina, activación de la función de GTPasa
29
intrínseca de la transducina, y de servir como sustrato para la fosforilación
mediada por la rodopsina quinasa (RQ) de los SEB.
x
Demostrar la capacidad de obtener monómeros de Rho por efecto de las altas
concentraciones de detergente (DM). Aislar dichos monómeros disociados a altas
concentraciones de DM a través de un procedimientos de filtración en gel a altas
concentraciones de DM.
x
Realizar reacciones de entrecruzamiento químico especifico de los monómeros
disociados de la Rho, digerirlos parcialmente con termolisina y determinando la
posible ocurrencia de entrecruzamientos intramoleculares en la proteína Rho.
x
Determinar la capacidad de las opsinas derivadas de rodopsinas marcadas
diferencialmente con NHS-biotína y [J-32P], de ser renaturalizadas bajo un estado
dimérico en presencia de 11-cis-retinal y en oscuridad.
x
Medir los efectos de los entrecruzamientos de la Rho sobre las propiedades
espectrales de la misma a 4 °C a periodos variables de iluminación. Al mismo
tiempo evaluar la capacidad de la Rho entrecruzada de inducir la actividad de
intercambio de nucleótidos de guanina de transducina dependiente de la luz.
30
3.- PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES:
3.1 MATERIALES:
Los ojos bovinos fueron comprados en el Matadero Caracas, C. A. Los
reactivos utilizados en el abordaje experimental fueron obtenidos de las siguientes
casas comerciales: [8-3H]GMPpNp (17.9 Ci/mmol), [J-32P]ATP (3000 Ci/mmol), >3H@N-etilmaleimida (>3H@-NEM) (60 Ci/mmol – 1 mCi/ml), liquido de centelleo (OptiPhase
Hisafe II), concanavalina A-Sepharose 4B y Sephacryl S-300, Amersham
Biosciences;
sulfo-succinimidilo
4-(N-maleidometilo)
ciclohexano-1-carboxilato
(sulfo-SMCC), m-maleidobenzoilo-N-hidroxisuccinimido ester (MBS), anti-IgG de
ratón conjugado a fosfatasa alcalina, avidina acoplada a peroxidasa de rabano
(avidina-HRP), estreptavidina acoplada a agarosa (estreptavidina-agarosa), el
sustrato quimioluminiscente para peroxidasa (West pico, Supersignal) y Sulfo-HNSbiotina,
Pierce;
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro blue tetrazolium
(NBT), Promega; n-dodecil-ȕ-D-maltósido (DM), Anatrace y Sigma; N,N’-1,2fenilendimaleimida (o-PDM), N,N’-1,4-fenilendimaleimida (p-PDM), kit de marcadores
de peso molecular para Cromatografía de Exclusión Molecular, sustrato precipitable
para peroxidasa (diaminobenzidina), L-glutation reducido y diamída, N-etilmaleimida
(NEM), Sigma; dietilaminoetil-Sepharose (DEAE-Sepharose), Whatman; membranas
de difluoruro de polivinilideno microporosa (PVDF) y filtros HA (0.45 μm), Millipore;
membranas
de
nitrocelulosa
(0.45
Pm),
Advantec;
termolisina,
Behring
Laboratories, placas médicas para rayos X (X-Omat) Kodak. El anticuerpo
monoclonal 1D4 dirigido en contra de la cola carboxi-terminal de 18 aminoácidos de
la Rho, fue donado por el Dr. Barry Knox (State University of New York). Todos los
otros reactivos no mencionados fueron de grado analítico. El análisis de las
distancias moleculares entre los residuos de Cys140 y Lys245 o Lys248 de la Rho para
la interacción con el agente sulfo SMCC, fue realizado sobre la estructura cristalina
de la Rho bovina depositada en el banco de datos de proteína (BDP) con el
identificador 1U19. Para el ensayo molecular computacional, se hizo uso del
programa de visualización y estudio de macromoléculas Rasmol versión 2.7.1.1.
31
3.2 MÉTODOS:
3.2.1 Obtención de muestras biológicas
3.2.1.1 Extracción de retinas a partir de ojos bovinos.
Los ojos bovinos fueron obtenidos en el Matadero Caracas, C. A.,
empaquetados en bolsas negras y trasladados al laboratorio sobre hielo, bajo
condiciones de estricta oscuridad. Los ojos fueron mantenidos por un mínimo de dos
horas a 4 °C en oscuridad, previo a su disección, con el fin de lograr la reconstitución
de la rodopsina.
La disección fue realizada en un cuarto oscuro, bajo luz roja de seguridad
(lámpara Phillips), manteniendo los ojos siempre en cavas de hielo. A cada ojo se le
realizó una pequeña incisión a aproximadamente 5 mm de distancia del iris
empleando una hojilla de disección. Paso seguido, usando una tijera bien afilada se
continúo la disección manteniendo la distancia desde el iris, realizando un corte casi
total alrededor del mismo y en forma continua, sin desprender la región frontal del
ojo. Se realizó la remoción del cristalino, el humor acuoso y el humor vítreo, y luego
se hizo la inversión del globo ocular empujando al mismo desde el nervio óptico
hacia fuera con el dedo pulgar. Colocando la cara convexa del ojo hacia abajo, se
procedió a lavar esta sección con Buffer Tris salino [25 mM Tris-HCL (pH 7.4), 137
mM de NaCl y 2.68 mM de KCl]. Este lavado permitió el desprendimiento de la retina
desde la cara convexa del globo ocular más próxima al nervio óptico, visualizada
como una membrana colgante. Una vez separada la retina, se procedió a córtala
desde su conexión con el nervio óptico, usando una tijera y se recogió a la misma en
un tubo de polipropileno. Cada tubo fue cargado con 25 retinas. Finalizada la
extracción de todas las retinas, cada tubo fue envuelto en papel aluminio y
conservado a – 70 °C.
3.2.1.2 Preparación de los segmentos externos de los bastoncillos retínales
(SEB).
Los SEB fueron preparados a 4°C en condición de oscuridad utilizando una
luz roja de seguridad. Se partió de las retinas extraídas como se describió en la
32
sección 3.2.1.1. Las retinas fueron sometidas a flotación y centrifugación en capas de
gradientes de sacarosa siguiendo la metodología descrita por Kühn (1978). Todas las
soluciones de sacarosa fueron preparadas en un buffer de moderada fuerza iónica o
Buffer isotónico (Buffer A) >100 mM Fosfato de Sodio (pH 6.8), 5 mM Acetato de
Magnesio]. El Buffer A fue completado con la adición de 5 mM ȕ-mercaptoetanol (ȕME), y 0.1 mM de fenil-metil-sulfonilo-fluoruro (PMSF) al momento de su utilización
para todos los casos.
Un numero de 100 retinas fueron descongeladas y a cada tubo se le añadió
15 ml de solución de sacarosa al 30 % p/p. Las retinas fueron homogeneizadas por
agitación vigorosa en un vortex durante 1 min. aproximadamente. Los homogenatos
fueron centrifugados a 5.000 rpm por 6 min en una centrifuga Sorvall RC-5B, rotor
SS-34. El sobrenadante resultante de todos los tubos fue colectado en una fiola de
0.5 lts de capacidad, mantenida en hielo y en oscuridad. Los sedimentos resultantes
de la extracción anterior fueron re-extraídos con 15 ml más de sacarosa al 30 % p/p,
y vueltos a centrifugar a 5.000 rpm por 6 min. El sobrenadante de esta centrifugación
fue igualmente colectado en la misma fiola juntamente con los anteriores. Se duplicó
el volumen del sobrenadante recogido en la fiola, usando para ello Buffer A frió. Esta
dilución se hizo muy lentamente y en agitación constante a 4 °C, con la finalidad de
reducir a la mitad la concentración de sacarosa (del 30 al 15 %) sin causar un
choque osmótico. La preparación fue centrifugada a 10.000 rpm por 10 min a 4° C. El
sedimiento resultante fue resuspendido en 40-50 ml de sacarosa al 15 % p/p usando
un vortex. El sedimento resuspendido fue entonces dividido en 4 tubos de centrifuga
de 50 ml de capacidad. Utilizando una cánula de aluminio larga se procedió a formar
un colchón en el fondo de cada tubo, con una solución de sacarosa a una
concentración de 0.64 M. Los tubos así preparados fueron centrifugados a 10.000
rpm por 10 min a 4 °C. El sedimento de esta centrifugación contenía a los SEB. Este
sedimento fue resuspendido en 40-50 ml de sacarosa 0.64 M utilizando un vortex.
Para lograr una mayor homogeneización y una completa disgregación de las
membranas, el homogenato fue pasado a través de una aguja N° 18 y
posteriormente por una N° 23, tres veces por cada una.
33
Para el aislamiento específico de las membranas de los discos de los SEB, se
prepararon 4 gradientes discontinuos de sacarosa en tubos de centrífuga Beckman
Ultra-Claros de 25 X 28 mm. Los gradientes contenían tres capas de 9 ml cada uno,
servidas con una cánula larga de la siguiente manera: una primera capa (fondo del
tubo) con sacarosa 0.84 M, luego y por debajo de esta se colocó muy lentamente la
segunda capa de sacarosa 1.0 M. Finalmente y por debajo de esta se colocó la
tercera capa de sacarosa 1.2 M. En el tope de cada gradiente discontinuo así
formado, se procedió a sembrar muy cuidadosamente una cantidad igual a 9 ml de
los SEB resuspendidos en sacarosa 0.64 M. Los gradientes sembrados fueron
centrifugados a 25.000 rpm por 35 min. a 4 °C y sin freno, en una centrifuga
Beckman L3-50 utilizando el rotor SW28.
Las membranas de los discos de los SEB se ubicó como una banda roja en la
interfase entre las capas de 0.84 M y 1.0 M de sacarosa. Esta interfase fue
cuidadosamente aspirada utilizando una pipeta Pasteur que fue introducida a ese
nivel. Estas membranas fueron diluidas con 50 ml de Buffer A frío y posteriormente
centrifugadas a 35.000 rpm por 30 min a 4°C en una centrifuga Beckman L3-50
utilizando el rotor 42 Ti. Esto fue realizado con el fin de eliminar el contenido de
sacarosa en las membranas de los discos de los SEB. El sedimento resultante fue
resuspendido con 5-10 ml del mismo buffer, para luego ser conservado en oscuridad
a – 70 °C hasta la posterior cuantificación de su contenido de rodopsina.
3.2.1.3 Preparación de membranas lavadas de los SEB (SEBLav).
Las membranas de los SEB fueron desprovistas de todas aquellas proteínas
periféricas y asociadas a estas, mediante el sometimiento de las mismas a lavados
por homogeneización con buffer hipotónico o Buffer B [5 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM
acetato de magnesio conteniendo 5 mM E-ME y 0.1 mM PMSF, adicionados al
momento de su utilización], y su posterior centrifugación a 35.000 rpm en una
ultracentriguga Sorvall, modelo RC M120, rotor 120AT, por 20 min a 4 °C.
Posteriormente
el
sedimento
de
membranas
lavadas
hipotónicamente
fue
homogeneizado y con Buffer C [5 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM acetato de magnesio,
5 mM E-ME, + 2 mM EDTA]. Los lavados con Buffer C en presencia de EDTA fueron
34
realizados hasta que ninguna cantidad de proteína significativa fuera liberada en el
último lavado. Las membranas SEBLav fueron almacenadas en oscuridad a – 70 °C.
3.2.2 Determinación de los espectros de absorción y concentración de Rho en
las membranas de los SEB.
Para la determinación de los espectros de absorción y la concentración de
Rho en los SEB, se procedió de la siguiente manera: un volumen igual a 50 Pl de los
SEB intactos en Buffer A adicionado con 5 mM ȕ-ME y 0.1 mM de PMSF, fueron
diluidos primero con 50 Pl de una solución conteniendo 23.2 mM de Nonidet-P40 y
12.8 mM de DM y luego con 50 Pl de 1.5 M de Genapol X100. Esta mezcla fue
sometida a agitación vigorosa en vortex por aproximadamente 1-2 min. Se realizo
una dilución 1/10 de la mezcla de los SEB con los detergentes, por la adición de H2O
destilada en cantidad suficiente para completar un volumen final de 500 Pl. Esta
dilución fue centrifugada a 14.000 rpm en una microcentrifuga Eppendorf, modelo
5415, por 5 min aproximadamente. Todo el procedimiento fue realizado en oscuridad.
El sobrenadante mantenido en oscuridad fue sometido a un espectro de absorción
UV/Vis en el rango de 250 – 650 nm, en un espectrofotómetro Beckman DU 640.
Una vez registrada la absorbancia (abs.) a 498.5 nm, la muestra fue sometida a
irradiación intensa con un bombillo de filamento de 150 watt de potencia y 365 nm de
emisión por 1 min. Un segundo espectro fue registrado bajo esta condición, para
registrar la abs. a 380 nm, característica de la Rho fotoactivada (Rho*). La
concentración de Rho en los SEB, fue calculada a partir de la abs. a 498.5 nm y
utilizando su coeficiente de extinción molar (H = 40700 M-1 cm
-1
) (Wald y Brawn,
1953).
3.2.3 Purificación de proteínas a partir de las membranas de los SEB.
3.2.3.1 Solubilización y purificación de la rodopsina (Rho).
Se siguió el procedimiento de purificación por cromatografía de afinidad a una
columna de concanavalina A Sepharose, descrito por Litman (1982), basado en la
presencia de grupos Į-D-manósidos en los residuos Asn-2 y Asn-15 (región Nterminal de la Rho) (Hargrave, 1977). Este método fue modificado en primer lugar
35
mediante la utilización de 0,1 % de n-dodecíl-ȕ-D-maltósido (DM) en vez de
octílglucosido, como detergente para la solubilización de la Rho.
Una segunda
modificación del protocolo de purificación propuesto por Litman (1982), consistió de
una reducción de 10 veces en la concentración final de DM en las fracciones de la
Rho solubilizada, con el fin de mantener la estructura nativa de la misma, sin afectar
su grado de solubilización en el medio acuoso. Brevemente, la membrana de los
discos fue solubilizada en Buffer Rho [buffer YOSHI pH: 6.6 (50 mM Hepes, pH 6.6,
140 mM NaCl, 3 mM MgCl2); 20 % glicerol y 2 mM CaCl2] conteniendo 1 % DM (19.2
mM), por agitación vigorosa en vortex por aproximadamente 3 min. La concentración
de detergente de las membranas solubilizadas fue diluida 10 veces con el uso de
Buffer Rho sin DM. El procedimiento cromatográfico por afinidad fue realizado bajo la
modalidad de incubación de la resina con un volumen fijo del homogernato de
proteínas en detergente o de la respectiva solución de elución en tubos cónicos de
15 mL. En este sentido, a un volumen de aproximadamente 5 ml de concanavalina A
Sepharose 4B, previamente equilibrada en Buffer Rho, se le adicionó la mezcla de
membranas solubilizadas y con una concentración final de detergente de 0.1 % DM.
La muestra fue incubada con la resina en oscuridad a 4 °C y en agitación constante
durante toda la noche, con el fin de permitir el contacto y la fijación de la Rho a la
resina. El sobrenadante conteniendo lo que no se pegó a la resina fue recogido y
guardado en oscuridad y se procedió a realizar el lavado de la resina con 10
volúmenes de Buffer Rho + 0.1% DM. Finalmente, se realizó la elución de la Rho
unida a la concanavalina A usando un volumen de Buffer de elución [Buffer Rho + 0.1
% DM + 0.5 M D-metil-manósido] equivalente al volumen de resina. El procedimiento
de elución fue prolongado por 12 h a 4 °C y 2 h a temperatura ambiente para
garantizar el desprendimiento completo de la Rho unida a la resina. Al eluato
obtenido se le realizó el respectivo registro UV/Vis de 250 a 650 nm para el cálculo
posterior de la concentración de Rho solubilizada y purificada. Alícuotas de 60 Pl de
cada paso de la solubilización y purificación por afinidad fueron tomadas para la
visualización en geles de poliacrilamida-SDS.
36
3.2.3.2 Solubilización selectiva de la rodopsina de las membranas de los SEB
usando una combinación de zinc (Zn2+) y n-octil-E-D-tioglucósido (OTG).
Basado en el procedimiento descrito por Okada y col. (1998), los SEB
fueron solubilizados en una relación molar de 350 detergente:Rho usando el
detergente n-octíl-E-D-tioglucósido (OTG) en presencia de Buffer octil [50 mM Mes
(pH 5.0), 80 mM cloruro de zinc], con agitación vigorosa por 1-2 min. La muestra fue
incubada en oscuridad a temperatura ambiente por un periodo de 4 h, en agitación
constante. La mezcla de solubilización fue centrifugada a 35.000 rpm en una
ultracentrífuga Sorvall, RC M120, a 4 °C por 20 min. El sobrenadante resultante
contentivo de Rho selectivamente solubilizada, fue sometido a un espectro de
absorción UV/Vis (250-650) nm con el fin de conocer la absorbancia a 498.5 nm de la
muestra y se procedió a calcular la concentración de Rho.
3.2.3.3 Purificación de la Transducina (T).
La transducina fue aislada a partir de las membranas de los SEB preparadas
en presencia de luz en una cava a 4 °C. Este procedimiento se basa en el
enlazamiento por afinidad descrito por Kühn (1980). El protocolo seguido para la
purificación de la T heterotrimérica dura tres días. Durante el primer día de
purificación, se realizo la obtención de las membranas de los SEB, utilizándose un
número de 200 retinas para la preparación, razón por la cual los volúmenes en el
procedimiento fueron duplicados. A diferencia de la preparación de los SEB para la
purificación de la rodopsina, los SEB para la purificación de la T fueron preparados
en presencia de luz. Una vez aislados los SEB de los gradientes de sacarosa, estos
fueron diluidos en Buffer A y mantenidos en una cava hasta el día siguiente bajo
iluminación constante.
En el segundo día de purificación, los SEB fueron sedimentados por medio de
una centrifugación a 20.000 rpm por 30 min en una centrifuga Beckman J2-21, rotor
JA-20. Por cada lavado se realizó una resuspensión manual de los SEB en el buffer
adecuado usando un vortex y posteriormente el homogenato fue pasado a través de
una aguja N° 18 y seguidamente por otra N° 23, tres veces por cada una. Las
37
membranas fueron lavadas tres veces isotónicamente con 200 ml de Buffer A
conteniendo 5 mM ȕ-ME y 0.1 mM PMSF, y centrifugadas a 20.000 rpm por 30 min.
Posteriormente se realizaron tres extracciones adicionales con 200 ml de Buffer
hipotónico (Buffer B). En cada extracción, los SEB fueron sedimentados a 20.000
rpm por 30 min. a 4 °C.
Para la elución de la T de las membranas de los SEB lavadas
hipotónicamente, se realizó otra ronda de lavados hipotónicos con Buffer D >buffer B
conteniendo 100 PM del nucleótido GTP@. Se centrifugó la preparación a 20.000 rpm
y se repitió el lavado dos veces más. Se tomaron alícuotas de 60 Pl de los
sobrenadantes de cada lavado isotónico, e hipotónico en presencia de GTP, así
como de la suspensión inicial de los SEB para los análisis realizados por
electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS.
Los extractos combinados de los tres lavados con GTP fueron sometidos a
cromatografía en una columna de DEAE Sepharose (Baehr y col., 1982). Para ello el
intercambiador aniónico había sido previamente equilibrado en 0.75 M Tris (pH 7.5)
por toda la noche a 4 °C, lavado por decantación con agua, y finalmente
resuspendido en Buffer C. La suspensión de la resina fue empaquetada en una
columna de 3 X 23 cm, hasta un volumen muerto de aproximadamente 50 ml.
Posteriormente se equilibró la columna con 350 ml de Buffer C. Después de la
aplicación de los extractos conteniendo la T, se lavó la columna con el mismo buffer
de equilibrio durante toda la noche a 4°C.
En el tercer día de la purificación, se lavó la columna con 100 mM NaCl en
Buffer C, se siguió la absorbancia a 280 nm del lavado con un monitor UVICORD SII
LKB, modelo 2238, acoplado a un registrador de dos canales LKB, modelo 2210. Se
recolectaron fracciones de 3 ml, con un colector de fracciones Pharmacia. Después
de observarse dos picos de absorbancia en este lavado de baja fuerza iónica y una
vez recuperada la línea base en este registro, la T fue eluída con un buffer de mayor
fuerza iónica: 500 mM de NaCl en Buffer C. Se tomaron alícuotas de 60 Pl de las
fracciones de la columna correspondientes al pico de elución de la T para ser
posteriormente analizadas por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS. Una
vez visualizado el pico de la T, la fracciones fueron concentradas por diálisis contra
38
buffer de almacenamiento [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 50 % glicerol, 5
mM Acetato de Magnesio, 10 mM ȕ-ME]. La diálisis fue realizada toda la noche a 4
°C y el dializado fue guardado a -20 °C.
3.2.3.4 Preparación de una fracción enriquecida de rodopsina quinasa (RQ).
Las membranas SEB recientemente aisladas fueron lavadas 3 veces con Buffer A
conteniendo 5 mM E-ME y 0.1 mM PMSF. Luego de una centrifugación a 35.000 rpm
en una ultracentrífuga Sorvall, RC M120, rotor 120AT a 4 °C por 20 min. El
sedimento de membranas SEB resultante fue extraído con Buffer B, mediante su
resuspensión en este buffer y el pasado posterior a través de una aguja N° 18 y
luego por una N° 23, tres veces por cada una. Esta extracción fue sometida a
centrifugación bajo las mismas condiciones anteriormente descritas. El sobrenadante
resultante consistió de la fracción enriquecida de RQ. El procedimiento completo fue
llevado a cabo en la oscuridad utilizando luz roja de seguridad.
3.2.4 Electroforesis, electrotransferencias e inmunotinciones.
3.2.4.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (EGPA-SDS).
Las electroforesis fueron realizadas en presencia de SDS, en geles de 1.5 mm de
grosor, conteniendo 12 % de poliacrilamida, de acuerdo a la metodología propuesta
por Laemmli (1970). Para las tinciones de los geles se utilizó el reactivo azul de
Coomassie R-250 o plata (Rabilloud y col., 1988). Las muestras conteniendo Rho
nunca fueron hervidas previo a la realización de las EGPA-SDS para así evitar su
agregación en complejos multiméricos. Las electroforesis realizadas para visualizar
los productos proteolíticos de la Rho en membranas solubilizada, fueron realizadas
en geles de poliacrilamida al 15 %.
3.2.4.2 Electrotransferencias e inmunodetección de la Rho en filtros de
nitrocelulosa.
Las proteínas separadas por EGPA-SDS fueron electrotransferidas (0.25 Amp
por 1 h 15 min a 4 °C), a filtros de nitrocelulosa, en buffer de transferencia [48 mM
Tris (pH 8.2, 39 mM glicina, 0.0037 % SDS, y 20 % de metanol] (Towbin y col.,
39
1979). Las inmunotinciones fueron realizadas por la incubación de los filtros de
nitrocelulosa con el anticuerpo monoclonal 1D4 (dilución 1:15.000). Luego de los
lavados respectivos, las membranas fueron incubadas con un anticuerpo secundario
anti-IgG de ratón acoplado a fosfatasa alcalina a una dilución de 1:5.000. Las bandas
inmunoreactívas fueron visualizadas por la incubación de las membranas con el
sustrato precipitable para la fosfatasa alcalina, bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)
y nitro blue tetrazolium (NBT).
3.2.5 Procedimientos de Entrecruzamiento de la Rho y la rodopsina
fotoactivada (Rho*).
3.2.5.1 Entrecruzamiento químico de la Rho y la Rho*
Las reacciones de entrecruzamiento químico fueron realizadas a muestras de
las membranas lavadas de los SEB y a de muestras de Rho purificada. La
concentración de la Rho utilizada en estas reacciones fue de 1.28 PM. Las muestras
fueron incubadas en oscuridad o en presencia de luz con los siguientes
entrecruzadores: sulfo-SMCC (5 mM), MBS (5mM), o-PDM (2-8 mM) y p-PDM (2-8
mM), por 1 h a 37 °C. Las soluciones madres conteniendo 150 mM de los
entrecruzadores insolubles en agua tales como MBS, o-PDM y
p-PDM, fueron
preparadas al momento de realizar la reacción, disolviéndolos en dimetil sulfóxido al
100 %. El entrecruzador sulfo-SMCC fue disuelto en agua desionizada a una
concentración de 20 mM. Las reacciones con sulfo-SMCC y MBS fueron realizadas
en presencia de 10 mM fosfato de sodio (pH 7.2) + 5 mM acetato de magnesio. Las
reacciones con ambas fenilendimaleimídas se ejecutaron en 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
y 5 mM acetato de magnesio. Como controles de cada reacción, se incubaron las
mismas cantidades de proteínas bajo con las mismas condiciones y con las
cantidades de cada uno de los vehículos en los cuales se encontraban disueltos los
entrecruzadores.
3.2.5.2 Entrecruzamiento en función del tiempo y de la concentración de la Rho
purificada.
40
Las reacciones de entrecruzamiento en función del tiempo realizadas por la
incubación de la Rho purificada (1.28 PM) con 5 mM de los entrecruzadores sulfoSMCC, MBS, o-PDM y p-PDM como se describió en la sección anterior. A intervalos
de tiempo determinados (0-60 min), se detuvieron las reacciones con la adición de 20
mM de E-ME. El efecto de la concentración de Rho sobre el entrecruzamiento
obtenido también fue analizado. En este sentido, varias concentraciones de Rho
purificada en el rango de 1.28 hasta 20.5 PM fueron incubadas por 1 h a 37 °C con 5
mM de sulfo-SMCC. En todos los casos, las muestras fueron separadas por EGPASDS, y los productos entrecruzados fueron visualizados por tinción con plata de los
geles.
3.2.5.3 Inducción de la formación de enlaces de disulfuro por glutationilación
en presencia de diamida.
La glutationilación de proteínas puede ocurrir en presencia de glutatión
oxidado (GSSH), el cual puede sufrir una reacción de intercambio de disulfuros con
grupos thioles reactivos presentes en los residuos de cisteína de las proteínas
blancos. Cuando esta reacción se lleva a cabo en presencia de diamida, se puede
inducir la formación de enlaces de disulfuro en dichas proteínas. Las reacciones de
glutationilación de la Rho y la Rho* purificadas selectivamente en presencia de OTG
y Zn2+ (Okada y col. 1998), fueron llevadas a cabo mediante incubación de las
proteínas por 1 h a temperatura ambiente, con 150 PM de diamida y 225 PM de GSH
marcado con biotína (GSH-biotína), en Buffer de Glutationilación [10 mM Fosfato de
potasio (pH 7.2), 40 mM KCl]. La concentración de proteínas empleada en estos
ensayos fue de 7.5 PM de acuerdo con lo publicado por Humphries y col. (2002). Las
reacciones fueron detenidas por la adición de buffer de muestra 5X (Laemmli, 1970)
bajo dos modalidades: sin E-ME (condiciones no reductoras) o con E-ME
(condiciones reductoras). El análisis de las proteínas glutationiladas fue realizado en
EGPA-SDS. Como control positivo de la reacción, la subunidad catalítica de la
proteína quinasa A (sC-PKA) purificada a partir de corazón porcino se incubó en
presencia de Buffer de glutationilación con 100 PM de diamida y 125 PM de GSH
41
(Humphries y col., 2002). La sC-PKA (7.5 PM) fue previamente desprovista de E-ME
mediante diálisis en contra del buffer de glutationilación en membranas de diálisis
SpectraPor, con un punto de corte de 3.000 Da de masa molecular.
3.2.5.3.1 Generación de GSH marcado con biotína (GSH-biotína) para las
reacciones de glutationilación de la Rho.
El GSH fue marcado con el reactivo N-hidroxisulfosuccinimida–biotína (NHSbiotína), siguiendo la metodología descrita por Humphries y col. (2002). Brevemente,
el marcaje ocurre por la reacción de la amina primaria del GSH con la porción Nhidroxisulfosuccinimida (NHS) de la biotína. Esta reacción fue llevada a cabo por la
incubación de 1.5 mM de GSH con 1.5 mM de NHS-biotína (relación molar 1:1) en
presencia de buffer fosfato salino 1X (pH 7.5) (PBS 1X) [97 mM Na2PO4, 5 mM
NaH2PO4, 73 mM NaCl]. La incubación fue realizada por 1 h a temperatura ambiente.
La cantidad de NHS-biotína que no reaccionó con el GSH, fue neutralizada por la
adición de 10 mM etanolamina.
3.2.5.3.2 Detección de proteínas glutationiladas con el reactivo GSH-biotína.
Las proteínas sometidas a glutationilación siguiendo el procedimiento descrito
anteriormente y usando el reactivo GSH-biotína, fueron separadas por EGPA-SDS
bajo condiciones no reducidas y transferidas a filtros de nitrocelulosa (Towbin y col.,
1979). Las membranas fueron incubadas en Buffer de bloqueo (5 % de leche
descremada) disuelta en Buffer TBST >50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM cloruro de
sodio y 0.05 % Tween 20), por 2 h a temperatura ambiente. Luego de tres lavados
en buffer TBST, las membranas fueron incubadas por 1 h a temperatura ambiente,
con avidína acoplada a peroxidasa de rábano (20 Pg/ml) en buffer TBST. Una vez
realizados los lavados respectivos, las membranas fueron incubadas con 0.7 mg/ml
del sustrato precipitable de la peroxidasa, diaminobenzidína (DAB), hasta que las
bandas esperadas fueran evidentes.
42
3.2.6 Caracterización de los parámetros hidrodinámicos de la Rho y Rho*.
3.2.6.1 Cromatografía de filtración en gel de la Rho y la Rho* solubilizadas en
DM.
La muestra de partida para este procedimiento fue la Rho purificada en presencia
de 0.1 % (1.96 mM) de DM. Dado que la concentración de DM en el cual esta
solubilizada la Rho, se encontraba por encima de la concentración micelar critica del
detergente (CMC = 0.18 mM), se esperaba la formación de micelas de DM, y por tal
razón la Rho solubilizada y purificada estaba insertada en dichas estructuras
micelares, formando complejos de Rho:DM. Las muestras purificadas de Rho o Rho*
(0.5-0.8 mg), fueron aplicadas en el tope de una columna de Sephacryl S-300. La
columna tenía un tamaño de 120 X 1 cmts de longitud y fue cargada con un volúmen
total (Vt) = 50.3 ml de resina. La columna fue previamente equilibrada en Buffer de
exclusión [50 mM HEPES (pH 6.6), 150 mM NaCl, 3 mM cloruro de magnesio, 2 mM
cloruro de calcio, 5 mM E-ME y 0.1 % DM]. Para la calibración de la columna se
utilizaron las siguientes proteínas estándares para filtración molecular: ȕ-amilasa
(200 kDa) 0.8 mg; alcohol dehidrogenasa (ADH) (150 kDa) 1.4 mg; albúmina de
suero bovíno dimérica (BSAd) (67 kDa) 1.0 mg; ovoalbúmina (Ovo) (43 kDa) 1.3 mg;
quimiotripsinógeno A (Chym A), (29 kDa) 0.8 mg; ribonucleasa A (Rb), (13.4 kDa),
0.8 mg; y citocrómo C (Cit C) (12.4 kDa) 1.0 mg. Las proteínas estándares fueron
disueltas en un volumen de 0.5-1.0 ml de la Rho o Rho*solubilizada y purificada en
0.1 % DM. Las proteínas estándares y las muestras conteniendo Rho o Rho*, fueron
cromatografiadas en conjunto a 4 °C en oscuridad (Rho) o en presencia de la luz
(Rho*). El volumen excluido de la columna (Vo) y el volumen incluido fueron
estimados mediante corridas cromatográficas de azul de dextrano y dicromato de
potasio, respectivamente. Separaciones adicionales de la Rho en la misma columna
de Sephacryl S-300 fueron llevadas a cabo en ausencia de las proteínas estándares.
La columna fue corrida a un flujo constante de 150 Pl/min. Las fracciones eluídas
fueron monitoreadas simultáneamente a las Abs de 280, 380, y 498.5 nm, para la
detección de aminoácidos aromáticos, Rho* y Rho, respectivamente. Las fracciones
contentivas de proteínas según los registros de absorbancia, fueron separadas por
43
EGPA-SDS con la finalidad de determinar los picos de elución de las proteínas
estándares y calcular los respectivos volúmenes de elusión (Ve) de las mismas. La
elución de la Rho o de la Rho* fue inmunológicamente monitoreada por la
inmunotinción de los filtros de nitrocelulosa a los que fueron electrotransferidas las
proteínas de cada una de las fracciones eluídas de la columna. Esto, con la finalidad
de poder determinar los Ve de cada una de las proteínas problema. Una vez
calculados los volúmenes de elución de cada una de las proteínas estándares y de la
Rho, se procedió a calcular el coeficiente de partición (Kav) de cada una mediante la
aplicación de la siguiente ecuación:
Kav = (Ve – Vo)/(Vt – Vo)
(Ec. 1)
El peso molecular del complejo entre Rho:DM fue empíricamente determinado
graficando el valor de Kav de cada uno de los estándares versus el logaritmo de su
peso molecular. Una relación lineal fue adicionalmente obtenida desde la grafica del
(-log Kav)1/2 en contra de los radios de Stokes de cada uno de los estándares. (Siegel
y Monty, 1966).
3.2.6.2 Sedimentación por ultracentrifugación de la Rho y la Rho* purificas en
DM.
La Rho fue sedimentada en gradientes lineales de sacarosa del 10 al 30 %
preparados en un volumen total de 4.6 ml. Las soluciones de 10 y 30 % de sacarosa
fueron disueltas en buffer de sedimentación [50 mM Tris-HCl pH 8.0), 0.1 mM EDTA,
5 mM cloruro de magnesio, 0.15 M cloruro de amonio, 0.2 mM dithiotreitol, y 0.1 %
DM]. Los gradientes fueron calibrados mediante la sedimentación de marcadores de
peso molecular con coeficientes de sedimentación conocidos tales como: E-amilasa
(E-am), 200 kDa, 5.1 nm); alcohol dehidrogenasa (150 kDa), 4.5 nm; ovoalbumina
(43 kDa, 3.05 nm); quimiotripsinogeno A (Chy), 25 kDa, 2.09 nm; ribonucleasa A
(Rb), 1.64 nm; y citocromo C (Cit C), 12.3 kDa, 1.7 nm; y una forma soluble de una
glicoproteína variante de superficie VSG de un aislado Venezolano de Trypanosoma
evansi, cuyo coeficiente de sedimentación fue publicado por Uzcanga y col. (2004).
44
La muestra conteniendo a la Rho (0.3 mg, Vt = 300 Pl), sirvió para la resuspensión
de los estándares señalados arriba. Las proteínas resuspendidas en conjunto fueron
servidas en el tope del gradiente de sacarosa, en oscuridad. Los gradientes fueron
ultracentrifugados a 200.000 x g, por 18 h, a 4 °C en una centrifuga Beckman, rotor
SW 50Ti. Las fracciones fueron colectadas desde la base del tubo por punción con
una aguja, colectándose un volumen de ~ 170 Pl por fracción. Las alícuotas
colectadas de cada gradiente fueron analizadas por EGPA-SDS, para determinar el
pico de cada uno de los estándares y a partir de esto determinar el respectivo
volumen de migración (Vm). La migración de los complejos Rho:DM fue determinada
por el monitoreo de la absorbancia de cada fracción a las longitudes de onda de 280,
380, y 498.5 nm y por inmunotinción de las proteínas electrotransferidas a
membranas de nitrocelulosa (Towbin y col., 1979), usando el anticuerpo monoclonal
1D4. Posteriormente el Vm de cada proteína estándar fue graficado en contra de su
respectivo coeficiente de sedimentación (S). La curva lineal resultante de esta grafica
fue utilizada para calcular el S del complejo Rho:DM, de acuerdo con lo publicado por
Martin y Ames (1961). La masa molecular entre los complejos de Rho y el DM fue
estimada a partir de una curva de calibración de las masas moleculares de las
proteínas estándares versus sus radios de Stokes multiplicados por sus coeficientes
de sedimentación (Siegel y Monty, 1966). Un procedimiento idéntico fue empleado
para determinar el S y el tamaño del complejo entre la Rho* y el DM, con la única
variación de que la muestra de Rho a ser sedimentada, fue previamente fotolizada
por irradiación intensa durante 1 min con un bombillo de filamento de 150 watt de
potencia y 365nm de emisión.
3.2.6.3 Determinación de la concentración de DM unido a la Rho eluida de la
Sephacryl S-300.
La concentración de DM unido a la Rho separada por exclusión molecular fue
estimada a través de la realización del método colorimétrico de antrona (Plummer,
1978). Este método permite la cuantificación específica de carbohidratos tipo
pentosas incluyendo a la manosa (Man) y otras pentosas y ha sido utilizado para la
determinación cuantitativa de detergentes tipo maltósido como es el caso del n-
45
dodecil-ȕ-D-maltósido utilizado en esta investigación. Brevemente, el método
requiere de la construcción de una curva de calibración a partir de soluciones de
concentraciones conocidas del detergente DM (rango entre 10 a 100 Pgs). En este
sentido, 200 Pl de cada solución patrón de DM fueron mezcladas con 800 Pl del
reactivo de antrona (2 g/litro del reactivo en 17 M H2SO4). Las reacciones fueron
calentadas por 15 min a 100 °C. Luego del enfriamiento completo de las reacciones,
las mezclas fueron diluidas con 10 ml de 17 M de H2SO4, y sobre las muestras así
diluidas se procedió a realizar el registro de la absorbancia a 620 nm. Obtenido el
registro de absorbancia en cada punto, se procedió a construir la curva de calibrado
de Abs620nm versus la concentración de DM. Considerando que Rho es una
glicoproteína conteniendo dos sitios de glicosilación en los residuos Asn2 y Asn15
(Hargrave, 1977), los cuales contenían predominantemente pequeñas ramificaciones
de N-acetil-glucosamina (GlcNAc) y de residuos de manosa (Man), dispuestas como
GlcNAc3Man3, con cantidades similares de cadenas de Man4 y Man
3
(Fukuda y col.,
1979; Liang y col., 1979). Se prepararon muestras controles conteniendo un exceso
en moles de D-metilmanósido con respecto a los moles de Rho utilizados en la
determinación (20 moles de D-metilmanósido/mol de Rho). Bajo las condiciones a las
cuales fue realizada la determinación, esta cantidad de carbohidrato contribuyó en
menos del 1 % en los valores de absorbancia a 620 nm medidas y no influenció
sobre las estimaciones de la concentración de DM en las muestras. En estas
determinaciones no fueron incluidos controles de N-acetiglucosamína, dado que ha
sido publicado que las hexosamínas no dan color en las reacciones de antrona
(Spiro, 1966). Similarmente ha sido publicado que el triptófano puede influenciar la
absorbancia a 620 nm por su reacción con el reactivo de antrona (Spiro, 1966). En
este sentido, se adicionó una cantidad conocida de albúmina de suero bovino, la cual
contiene 5 veces más triptófano que la Rho como control de triptófano en exceso.
Esta proteína también contribuyó menos del 1 % a la Abs medida a 620 nm.
3.2.7 Ensayos para la evaluación funcional de las proteínas purificadas.
3.2.7.1 Ensayos de unión de [3H]GMP-pNp a la T activada por Rho.
46
La unión del nucleótido de guanina no hidrolizable [3H]GMP-pNp a la T
heterotrimérica fue medido mediante un ensayo de filtración en filtros Millipore HA
(0.45 μm) (Bubis, 1995). Brevemente, se preparó una mezcla de reacción
conteniendo 0.2 PM (4 Pgs) de T y 0.6 PM (6 Pgs) de Rho en membranas SEBLav o
purificada en 0.1 % DM. La mezcla contenía además una concentración fija de
[3H]GMP-pNp (0.2 PM). La reacción fue llevada a cabo en un volumen final de 250 Pl,
en presencia del buffer de enlazamiento [10 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl, 5
mM acetato de magnesio, 5 mM E-ME]. El procedimiento se realizó de la siguiente
manera: Las proteínas T y Rho, fueron inicialmente incubadas en oscuridad en
presencia del buffer de enlazamiento a 4 °C por 15 min. Luego de esta estabilización
de las proteínas en el buffer, se adicionó la concentración referida de [3H]GMP-pNp,
y la mezcla fue expuesta a irradiación intensa con un bombillo de filamento de 150
watt de potencia y 365 nm de emisión, a temperatura ambiente y en agitación
constante. Una alícuota de 100 Pl de cada reacción (100 Pl) fue transferida a un
equipo de filtración Millipore cargado con los papeles de filtro Millipore HA (0.45 μm),
previamente equilibrados en el buffer de enlazamiento y con cada reservorio cargado
con 5 ml del mismo buffer para sembrar la muestra. Una vez filtrada la muestra por
vació a través de los papeles, estos fueron lavados tres veces con buffer de
enlazamiento frió para remover el exceso no unido del nucleótido no hidrolizable.
Finalmente, los papeles fueron secados y colocados en viales de centelleo
conteniendo 4 ml de líquido de centelleo (Optiphase Hisafe II). Como controles del
experimento, fueron incluidas muestras de: membranas SEBlav (solas) iluminadas;
Rho purificada en presencia de la T (incubadas en oscuridad) y también a la T en
ausencia del receptor iluminada.
3.2.7.2 Ensayos de la actividad de GTPasa de la T activada por Rho.
Los ensayos de hidrólisis de GTP fueron ejecutados como fue descrito por Bubis,
(1995). Brevemente, 0.2 PM de T heterotrimérica fue incubado con 0.1 PM de Rho
solubilizada y 20 PM de [J-32P] GTP en presencia de buffer de enlazamiento. Estos
componentes fueron mezclados en oscuridad y en ausencia de [J-32P] GTP. La
mezcla fue posteriormente sometida a iluminación intensa por 1 min. con un bombillo
47
de filamento de 150 watt de potencia y a temperatura ambiente. La reacción fue
iniciada por la adición del [J-32P] GTP. Alícuotas de (20 Pl) de la reacción fueron
tomadas a los 0, 2, 4, 6, 8 y 10 min. de iniciada la reacción y se les adicionó 200 Pl
de una solución de ácido molibdíco (10.1 mM de ácido molibdíco y 1.3 M de H2SO4).
Posteriormente se le adicionó a la mezcla una solución reductora (100 Pl), la cual
contenía 230 mM Na2S2O5, 15.9 mM Na2SO3, y 4.2 mM de ácido 1-amino-2-naphtol4-sulfónico. La mezcla fue extraída por agitación vigorosa en vortex con 700 Pl de
alcohol isoamílico. Luego de realizar la separación de las fases por centrifugación,
600 Pl de la capa orgánica fue colocada en viales conteniendo 4 ml de líquido de
centelleo (Optiphase Hisafe II), para medir la liberación de [32P] Pi en un contador de
centelleo LKB Wallak, RACKBETA 1209. Como controles del experimento, se
evaluaron también las muestras en ausencia de la luz.
3.2.7.3 Ensayos de fosforilación de la Rho*.
Estas reacciones fueron llevadas a cabo con 50 PM [J-32P]ATP (actividad
especifica ~ 4.500 cpm/pmol), y en presencia del buffer de fosforilación [50 mM TrisHCl (pH 8.0), 5 mM acetato de magnesio, 20 mM Fluoruro de potasio]. Las
reacciones de fosforilación fueron realizadas usando 50 Pl de la fracción enriquecida
de rodopsina quinasa. La rodopsina solubilizada en detergente y purificada, fue
incubada por 1 h a temperatura ambiente y en presencia del [J-32P]ATP y de la
fracción enriquecida de rodopsina quinasa. Las reacciones fueron iniciadas por la
irradiación intensa de las muestras a evaluar. Las reacciones de quinasa fueron
terminadas con la adición de buffer muestra 5X (Laemmli, 1970). Las muestras
fosforiladas fueron sometidas a geles de poliacrilamida-SDS y electrotransferidas a
membranas
de
difluoruro
de
polivinilideno
(PVDF).
Las
membranas
electrotransferidas fueron expuestas a películas de Rayos X (Kodak X-Omat), por un
periodo de 24 h a – 80 °C, en un cassette con placa intensificadora para el isótopo
utilizado. Las bandas fosforiladas fueron sometidas a un análisis cuantitativo por
autorradiografía.
48
3.2.8 Reacciones de marcaje diferencial de la Rho en membranas lavadas de
los SEB.
3.2.8.1 Marcaje de la Rho en membranas de los SEBLav usando Nhidroxisuccinimida-biotína (NHS-biotína).
Las membranas intactas de los SEB en buffer isotónico fueron lavadas con
EDTA. Una cantidad de 3 ml (5.7 mg totales de Rho = 84.62 PM) de las membranas
de los SEBLav fueron centrifugadas en una ultracentrífuga Sorvall, RC M120, rotor
120AT,
a 35.000 rpm, por 30 min a 4 °C. El sedimento de membranas fue
resuspendido en 1.5 ml de 100 mM buffer borato (pH 8.8) para una concentración
final de Rho de 3.8 mg/ml. Esta resuspensión fue centrifugada nuevamente y el pellet
resultante fue re-equilibrado dos veces mas en el mismo buffer, siguiendo las
condiciones descritas arriba. El sedimento de membranas equilibrado en buffer
borato, fue resuspendido en una solución de NHS-biotína en buffer borato a una
concentración final de 3.6 mg/ml, manteniéndose una relación de 250 Pgs del ester
de biotína/mgs de Rho presente en las membranas. La mezcla fue incubada a
temperatura ambiente por 4h en oscuridad. La reacción de biotinilación de la Rho en
SEBLav fue detenida por la adición a la mezcla de cloruro de amonio a una
concentración final de 220 mM. La mezcla fue incubada por 20 min a temperatura
ambiente y en oscuridad. Las membranas fueron centrifugadas a 35.000 por 30 min y
el sedimento resultante fue lavado tres veces por centrifugación en presencia de
buffer isotónico. El sedimento final de membranas fue resuspendido en 520 Pl de
buffer isotónico y una alícuota de 20 Pl fue tomada para su corrida electroforética. El
gel fue posteriormente electrotransferido a membranas de nitrocelulosa y las
proteínas biotiniladas fueron detectadas usando el sistema de avidína acoplada a
peroxidasa de rábano (20 Pg/ml) disuelta en buffer TBST. Posteriormente, los filtros
fueron
incubados
con
el
sustrato
precipitable
para
la
peroxidasa,
DAB.
Adicionalmente algunas membranas fueron reveladas por luminografía, mediante su
incubación con el sustrato quimioluminiscente (Supersignal) y posteriormente
49
expuestas a placas de rayos X, hasta que las quimioluminiscencia de las bandas fue
evidente.
3.2.8.2 Marcaje de la Rho en las membranas de los SEB con el fosfato gamma
del ATP ([J-32P]ATP).
A partir de una cantidad de 5.7 mg totales de membranas intactas de los SEB
se procedió a realizar el procedimiento de fosforilación endógena de la Rho. Las
membranas en buffer isotónico fueron sometidas a centrifugación en una
ultracentrífuga Sorvall modelo RC M120, rotor 120AT a 35.000 rpm por 30 min a 4
°C. La reacción fue llevada a cabo con 75 PM [J-32P]ATP (actividad especifica ~
4.500 cpm/pmol), y en presencia de el Buffer de fosforilación [50 mM Tris-HCl (pH
8.0), 5 mM acetato de magnesio, 20 mM fluoruro de potasio]. Las membranas
intactas de los SEB en presencia de la mezcla de fosforilación fueron incubadas por
1 h a temperatura ambiente y en agitación constante. Las reacciones fueron iniciadas
por la iluminación intensa de las membranas. Transcurrido el tiempo de marcaje, se
procedió a centrifugar las membranas nuevamente a 35.000 rpm por 30 min a 4 °C.
El sedimento de membranas marcadas con [J-32P], fue lavado tres veces en buffer
isotónico siguiendo la metodología de resuspensión y centrifugación respectiva. El
sedimento de membranas SEB fue sometido a un lavado con 2 mM EDTA para la
eliminación de las proteínas asociadas a membrana. Las SEBLav fueron
resuspendidas en 320 Pl de buffer isotónico. Una alícuota de 20 Pl fue tomada para
su evaluación en EGPA-SDS y análisis por autorradiografía. El volumen restante de
las membranas fosforiladas fue congelado a – 80 °C.
3.2.9 Procedimiento de blanqueo de la Rho* para la eliminación del todo-trans
retinal unido a la opsina.
3.2.9.1 Generación de una mezcla de opsinas desnaturalizadas marcadas
diferencialmente.
Las membranas de los SEBLav marcadas con [J-32P] o con biotína fueron
mezcladas en proporción molar 1:1 y sometidas a centrifugación en una
50
ultracentrífuga Sorvall RC M120, rotor 120AT, a 35.000 rpm, por 30 min a 4 °C. El
sedimento de membranas fue resuspendido en buffer de blanqueo [10 mM TrisAcetato (pH 7.4), 50 mM hidroxilamina]. La mezcla fue agitada vigorosamente en un
vortex e incubada por 2 h a temperatura ambiente y bajo iluminación intensa con un
bombillo de filamento de 150 watt de potencia y 365 nm de emisión, con el fin de
eliminar la totalidad del retinal unido a la Rho. Las membranas así blanqueadas,
fueron nuevamente centrifugadas y el sedimento resultante fue lavado tres veces con
buffer Rho para eliminar el exceso de hidroxilamina y del todo-trans retinal extraído.
Las opsinas marcadas diferencialmente con [J-32P] o con biotína fueron sometidas a
una solubilización y desnaturalización fuerte utilizando el detergente SDS al 0.1 % en
Buffer Rho. Procedimientos idénticos fueron aplicados a membranas SEBLav y
marcadas con [J-32P] o con biotína por separado, las cuales sirvieron como controles
individuales para los intentos de co-precipitación de las rodopsinas marcadas
diferencialmente.
3.2.9.2 Proceso de eliminación del detergente de muestras de opsinas
marcadas diferencialmente y desnaturalizas con SDS.
3.2.9.3 Exclusión molecular de la mezcla de opsinas marcadas con [J-32P] o con
biotína usando Sephadex G-15.
El procedimiento de filtración en gel para eliminar el detergente SDS presente
en la mezcla de opsinas desnaturalizadas y marcadas diferencialmente, fue llevado a
cabo en una columna de Sephadex G-15. El volumen total de la resina (Vt) fue de 15
ml. La columna fue previamente equilibrada en Buffer Rho. La mezcla de opsinas
marcadas diferencialmente y solubilizadas en 0.1 % de SDS, fue aplicada sobre el
tope de la columna. La columna fue corrida a un flujo constante de 130 Pl/min. El
volumen excluido de la columna (Vo) y el volumen incluido fueron estimados
mediante corridas cromatográficas de azul de dextrano y el dicromato de potasio,
respectivamente. Las fracciones eluídas fueron monitoreadas por medición de la
absorbancia a 280 nm, para la detección de las fracciones contentivas de proteína.
Los picos de elución de las opsinas marcadas con biotína presentes en la mezcla y
parcialmente desprovistas de SDS, fue monitoreada por el método de detección de
51
proteínas biotiniladas una vez electrotranferidas a membranas de nitrocelulosa. Por
su parte la detección de las opsinas marcadas con [J-32P], fue realizada por el
registro de la radioactividad de [J-32P] en un contador de centelleo liquido y por
autorradiografía de las fracciones contentivas de opsina-[J-32P] separadas en EGPASDS. Muestras controles de opsina-[J-32P] y opsina-biotína solubilizadas en SDS al
0.1 %, fueron cromatografiadas por separado en la misma columna de Sephadex G15 y bajo las mismas condiciones para eliminar el contenido de detergente presente.
Procedimientos idénticos de detección a los aplicados anteriormente fueron llevados
a cabo para detectar la presencia del pico de elución de cada población de opsinas
marcadas diferencialmente.
3.2.9.4 Precipitación con acetona de las opsinas marcadas con biotína o con [J32
P].
Para una completa eliminación del SDS remanente en la mezcla de las
opsinas marcadas diferencialmente con biotína o [J-32P] y que co-eluyeron en la
columna de Sephadex G-15, se procedió a practicar una precipitación de las mismas
en presencia de acetona fría. Una primera reacción de precipitación fue llevada a
cabo por la adición de acetona a una relación porcentual igual al 80 % con respecto
al volumen total de la solución de proteínas a precipitar. El tiempo de precipitación
fue establecido en 1 h a temperatura ambiente. La reacción de precipitación fue
centrifugada posteriormente a 14.000 x g durante 25 min a temperatura ambiente. El
sobrenadante fue descartado luego de la detección de una muy escasa
radioactividad de [J-32P] mediante el uso de un contador Geiger ( del 10 % de la
radioactividad total medida antes de la precipitación). El precipitado de proteínas
conteniendo entre un 80-90 % de la radioactividad en cpm de la mezcla original de
proteínas, previo a la precipitación inicial, fue resuspendido en 100 % acetona fría y
centrifugado bajo las mismas condiciones descritas arriba.
3.2.10 Intento de renaturalización de las opsinas marcadas diferencialmente
con biotína o [J-32P] en presencia del 11-cis-retinal, a su estado de Rho
nativa.
52
Las opsinas marcadas con biotína o fosforiladas con [J-32P], las cuales
coeluyeron en la columna de Sephadex G-15 y fueron precipitadas con acetona fría,
fueron resuspendidas en Buffer Rho y posteriormente sometidas a regeneración a su
estado nativo mediante la incubación de las mismas en presencia del cromóforo 11cis-retinal. Las condiciones de incubación para la regeneración fueron establecidas
en 48 h a 37 °C, en oscuridad y agitación constante, siguiendo la metodología
descrita por Katre y col. (1981).
3.2.11 Cambios en los Espectros UV/Visible de la Rho entrecruzada.
3.2.11.1 Cambios de la fotoisomerización del retinal unido a la Rho
entrecruzada con sulfo-SMCC en función del tiempo.
Se realizaron espectros UV/Vis desde 250 – 650 nm de la Rho en ausencia
(control) o entrecruzada con sulfo-SMCC (Rho-SMCC). Ambas rodopsinas fueron
solubilizadas selectivamente de las membranas de los SEB, usando el detergente
OTG y Zn2+. Las membranas lavadas de los SEB a una concentración final de 0.4
mg/ml de Rho, fueron incubadas con 5 mM de sulfo-SMCC. La reacción de
entrecruzamiento químico se realizó en oscuridad, a 37 °C, por 30 hs y en agitación
constante. Transcurrido el tiempo de incubación, la reacción de entrecruzamiento fue
detenida con 10 mM ditiotreitol. Una reacción control de membranas de los SEB con
igual contenido de Rho, fue llevada a cabo en presencia del buffer de
entrecruzamiento sin sulfo-SMCC. Posteriormente se procedió a solubilizar
selectivamente a la Rho entrecruzada o no entrecruzada desde las membranas de
los SEB usando el detergente OTG y Zn2+, siguiendo la metodología descrita por
Okada y col. (1998). El procedimiento de solubilización per se de la Rho, permitió la
eliminación del exceso de sulfo-SMCC que no reaccionó con la proteína. Esto fue
importante dado que se minimizó de esta forma el ruido que pudiera aportar la
presencia del entrecruzador en el medio en el cual se realizaron los espectros de
absorción. Los espectros UV/Vis de la Rho control o la Rho-SMCC, fueron realizados
a 4 °C en un espectrofotómetro Beckman DU 640, conectado con un recirculador de
agua con refrigeración controlada marca Lauda RC-20, el cual permitió mantener una
temperatura constante de 4 °C en el portacubeta del espectrofotómetro. La
53
realización de los espectros UV/Vis a temperaturas de refrigeración, favoreció la
preservación en le tiempo de los fotointermediarios de la Rho control y de la RhoSMCC. Las muestras de Rho fueron sometidas a intervalos variables de iluminación
con un bombillo de filamento de 150 watt de potencia. La distancia entre la cubeta y
la lámpara en cada iluminación fue siempre constante (~ 10 cmts). Los intervalos de
tiempo establecidos para la iluminación de las muestras en la cubeta fueron: 0 seg’
(tiempo cero o Rho nativa); 5 seg; 20 seg; 45 seg y 60 seg. Para el caso de la Rho
control, fue posible la realización de todos los espectros de absorbancia luego de
cada periodo de iluminación. En el caso de la Rho-SMCC, luego del primer intervalo
de iluminación (5 seg), se formó un precipitado que enturbió la solución de proteína,
lo cual imposibilitó la realización de los siguientes registros espectrofotométricos de
la Rho iluminada. En este sentido, se procedió de la siguiente manera: se hizo la
medición del espectro de la Rho entrecruzada a tiempo cero para registrar el
espectro correspondiente a 498.5 nm. Posteriormente se sometió la muestra a una
iluminación constante por 1 min en la cubeta. De forma inmediata, la muestra en su
totalidad fue transferida a un tubo Eppendorf de 1.5 ml y centrifugada a 14.000 x g,
por 5 min, en una microcentrifuga Eppendorf modelo 5545, previamente enfriada a 4
°C en nevera. Se tomó el sobrenadante, el cual fue sometido a un nuevo espectro
UV/Vis.
3.2.12 Bloqueo del entrecruzamiento de la Rho mediante modificación química
de los residuos de cisteina y lisina.
Para la modificación química de los residuos de cisteína en la Rho se seleccionó
el modificador específico N-etilmaleimída (NEM) y para la modificación de los
residuos de lisinas se dispuso de los reactivos fenil-isotiocianato (Pit C) y del
anhídrido acético (AA). Las reacciones fueron llevadas a cabo en presencia de 10
mM fosfato de sodio (pH 7.2) y 5 mM acetato de magnesio La Rho purificada en DM
(3 Pgs), fue sometida a pre-incubaciones con 5 mM de cada uno de los reactivos
modificadores por separado o combinados por 1 h, a 37 °C en agitación constante y
bajo condiciones de oscuridad. Trascurrido ese tiempo, a las muestras se les
adicionó el reactivo entrecruzador sulfo-SMCC (5 mM) y se incubaron por 1h a 37 °C,
54
en oscuridad. Las reacciones fueron detenidas por la adición de buffer de muestra 5X
para su posterior separación en EGPA-SDS al 12 % (Laemmli, 1970). Los geles
resultantes fueron teñidos con plata. Como controles internos del ensayo, la Rho fue
incubada bajo las mismas condiciones descritas arriba,
con buffer de
entrecruzamiento solo, en presencia del entrecruzador o con cada uno de los
modificadores químicos utilizados. Soluciones madres de los modificadores fueron
preparadas en dimetil sulfóxido (NEM), y Acetonitrílo (Pit C y AA).
3.2.13 Obtención de monómeros de Rho.
3.2.13.1 Solubilización de las Rho marcadas con biotína o [3H]-NEM de las
membranas de los SEBLav.
Las membranas SEBLav marcadas diferencialmente con biotína o [3H]-NEM
fueron sometidas a solubilización en altas concentraciones de DM (19.6 mM) por
separado, para favorecer la obtención de monómeros de Rho, de acuerdo a lo
publicado por Jastrzebska y col. (2004). Brevemente, las membranas en Buffer A
fueron centrifugadas en una ultracentrífuga Sorvall, RC M120, rotor 120AT, a 35.000
rpm por 30 min a 4 °C. El sedimento de membranas fue mezclado con 400 Pl de
Buffer Rho conteniendo 1 % DM (19.6 mM). Esta mezcla fue agitada vigorosamente
en un vortex por 1-2 min e incubada sobre hielo por 2h. El homogenato de las
membranas fue sometido nuevamente a centrifugación bajo las mismas condiciones
usadas anteriormente. El sobrenadante obtenido de cada población de Rho fue
dividido en dos alícuotas cada uno. Un total de cuatro alícuotas fueron hechas, cada
una conteniendo ~ 800 Pgs de Rho marcada diferencialmente. Dos alícuotas de Rho,
una marcada con biotína y la otra marcada con [3H]-NEM, fueron sometidas a un
procedimiento de exclusión molecular en Sephacryl S-300.Las otras dos alícuotas
fueron guardadas a – 80 °C, las cuales serian posteriormente utilizadas como
controles para las reacciones de co-precipitación.
3.2.13.2 Filtración molecular en Gel de las Rho marcadas con biotína o [3H]NEM.
55
Las muestras de partida para este procedimiento fueron las rodopsinas marcadas
diferencialmente con biotína o [3H]-NEM, previamente solubilizadas en presencia de
1 % DM (19.6 mM). Dado que la concentración del DM en la cual esta solubilizada la
Rho, se encuentra por encima de la concentración micelar critica del detergente
(CMC = 0.18 mM), se esperaba la formación de micelas de DM, y por tal razón la
Rho solubilizada y cromatografiada se encontraba insertada en dichas estructuras
micelares, formando complejos de Rho-DM. Las muestras de Rho marcadas (0.8
mgs c/u), fueron aplicadas en corridas por separado en el tope de una columna de
Sephacryl S-300. La columna tenia un volumen total (Vt) = 38.5 ml de resina. La
columna fue equilibrada en Buffer de exclusión [50 mM HEPES (pH 6.6), 150 mM
NaCl, 3mM Cloruro de magnesio, 2 mM Cloruro de calcio, 5 mM E-ME y 0.5 % DM
(10 mM)]. La calibración de la columna y el procedimiento de exclusión molecular fue
realizada de forma idéntica a la descrita en la sección 3.2.6.1 de Procedimientos
experimentales. Las proteínas estándares fueron disueltas en el volumen que
contenía a la Rho marcada y solubilizada en 1 % DM. Las proteínas estándares y la
Rho marcada fueron cromatografiadas en conjunto, en oscuridad y a 4 °C. Las
fracciones eluídas fueron monitoreadas simultáneamente a las absorbancias de 280,
380, y 498.5 nm, para la detección de aminoácidos aromáticos, Rho* y Rho,
respectivamente. Las fracciones contentivas de proteína según los registros de
absorbancia, fueron separadas por EGPA-SDS con la finalidad de determinar los
picos de elusión de las proteínas estándares y calcular los respectivos volúmenes de
elusión (Ve) de las mismas. La elución de la Rho marcada con biotína fue
monitoreada
por
el
procedimiento
de
detección
de
proteínas
biotiniladas
electrotransferidas a filtros de nitocelulosa desde las EGPA-SDS de cada una de las
fracciones eluídas de la columna. Esto, con la finalidad de poder determinar el Ve de
la Rho-biotína. La elusión de la Rho marcada con [3H]-NEM fue monitoreada por el
rastreo de la radioactividad de tritio [3H] de cada una de las fracciones eluídas de la
columna. Los coeficientes de partición (Kav), así como los pesos moleculares de las
muestras de Rho-biotína y la Rho-[3H]-NEM en condición monomérica, fueron
determinados y calculados de forma idéntica a la descrita en la sección 3.2.6.1.
56
3.2.14 Proteolisis con termolisina de las Rhos monoméricas o diméricas
entrecruzadas con sulfo-SMCC.
La Rho monomérica disociada en 10 mM DM (2 Pgs) y aislada por filtración en
gel a la misma concentración de detergente, fue sometida a entrecruzamiento con 5
mM del entrecruzador sulfo-SMCC en presencia de 10 mM fosfato de sodio (pH 7.2)
y 5 mM acetato de magnesio, por 1 h a 37 °C. La Rho monomérica entrecruzada fue
incubada con termolisina en proporción 20:1, en buffer termolisina >100 mM HEPES
pH 6.8 y 20 mM cloruro de Ca2+@, a temperatura ambiente por 16 h y en oscuridad. La
reacción de proteolisis fue detenida por la adición de buffer de muestra 5X al término
de la incubación.
El volumen total de reacción fue servido en geles de
poliacrilamida-SDS al 15 %. Los geles fueron teñidos con plata, para la visualización
de los fragmentos termolíticos generados en la digestión. Como control se realizaron
reacciones de proteolisis con termolisina de la Rho monomérica o dimérica no
entrecruzadas, de forma idéntica a la descrita anteriormente.
57
4. RESULTADOS.
4.1 PURIFICACIÓN DE LA RODOPSINA Y LA TRANSDUCINA.
4.1.1 Purificación de la Rho por afinidad a Concanavalina A.
Las membranas SEB fueron sometidas a solubilización con el detergente DM
siguiendo la metodología descrita en la sección 3.2.3.1, y el homogenato resultante
conteniendo las proteínas de membranas solubilizadas en 0.1 % DM, fue incubado
con una resina de Concanavalina A Sepharose 4B, para la purificación por afinidad
de la Rho nativa. En la Fig. 4.1 A, se muestra el gel de poliacrilamida-SDS teñido con
azul de Coomassie, en el cual fueron separadas cada una de las fracciones
correspondientes a los distintos pasos de la purificación de la Rho.
La Fig. 4.1 A (línea 1), presenta el perfil correspondiente a la fracción de
membranas de los SEB solubilizados a una concentración de 0.1 % de DM. Nótese
la presencia de una banda mayoritaria migrando con una masa molecular aparente
de ~ 37 kDa, correspondiente con el peso molecular esperado para la Rho. Esta
fracción fue sometida a incubación con la resina, a 4 °C durante toda noche para
favorecer la unión por afinidad del receptor a los ligandos de Con A unidos a la
Sepharosa. En la Fig. 4.1 A (línea 2), se muestra la elución de la fracción no unida a
la resina. Fue evidente la unión total de la Rho a la resina, dado que la banda de
peso molecular aparente de 37.000, no fue detectada en dicha fracción. Luego de
realizar los lavados respectivos de la resina en el buffer apropiado, y de haber
constatado que ninguna proteína quedaba libre en el sobrenadante de los mismos
(Fig. 4.1 A, líneas 3 y 4), se procedió a incubar a la resina conteniendo a la Rho
unida, con el respectivo buffer de elusión conteniendo 0.5 M de D-metilmanósido, el
cual despegó a la Rho de la Con A Sepharose por un mecanismo de competencia.
58
En las líneas 5-8 de la Fig. 4.1 A, se muestra el perfil electroforético de cada una de
las fracciones de elución de la resina con el D-metilmanósido. Nótese en las líneas 58, la aparición de la banda con masa molecular aparente de 37 kDa, eluída desde la
matriz de afinidad. Como era de esperarse, cantidades cada vez menores de la
proteína fueron obtenidas a medida que se realizó el recambio del buffer de elución
conteniendo al carbohidrato competidor a una concentración siempre constante de
0.5 %, cada vez. Luego del sometimiento de la resina a un número total de cinco
procedimientos de elusión, ninguna cantidad apreciable de la proteína de 37 kDa, fue
registrada en el último sobrenadante.
Para confirmar que la proteína con masa molecular aparente de 37 kDa
purificada por afinidad a Con A Sepharose, correspondía específicamente a la Rho,
la fracción representada en la línea 8 (Fig. 4.1 A), fue nuevamente sometida a EGPASDS, electrotransferida a filtros de nitrocelulosa y sometida a análisis por
inmunotinción usando el anticuerpo monoclonal anti-Rho (1D4). En la Fig. 4.1 B, se
muestra el resultado de la inmunotinción de la tira de nitrocelulosa con el anticuerpo,
revelada con los sustratos precipitables para la fosfatasa alcalina (NBT/BCIP).
Nótese en la Fig. 4.1 B, la aparición de una banda inmunoteñida con el anticuerpo,
igualmente migrando con una masa molecular aparente de 37 kDa, coincidente con
el peso de la proteína purificada por afinidad. Este resultado indicó que la proteína
purificada en efecto correspondía a la Rho bovina. Los espectros UV/Vis
característicos realizados sobre la Rho solubilizada en 0.1 % DM y purificada (Fig.
4.1, C), revelaron la ocurrencia de un pico máximo de absorción a 498.5 nm (flecha
indicando Rho), especifico para la Rho nativa (en oscuridad). La realización de un
nuevo espectro sobre la misma muestra, previamente sometida a 1 min de
iluminación intensa, resultó en la extinción del pico a 498.5 nm y la aparición de un
nuevo pico absorbiendo a 380 nm (flecha indicando a la Rho*), característico de la
Rho fotoactivada. Estos espectros finalmente confirmaron la purificación de la
proteína fotorreceptora Rho.
59
Fig. 4.1 Purificación de la Rodopsina. A) EGPA-SDS mostrando los pasos de la purificación de la Rho
por afinidad através de una columna de Con A Sepharosa 4B. Los SEB intactos fueron solubilizados con
1% DM. El homogenato de membranas fue diluido a una concentración de 0.1 % DM (línea 1). Línea 2,
fracción de proteínas de membrana no unidas a la Con A Sepharosa. Lineas 3 y 4, lavados de la resina
de Con A Sepharosa con buffer Rho. Lineas 5-8, elución de la Rho unida a la Con A Sepharosa con 0.5 M
de D-metil manosido. B) Inmunotinción de una fracción de Rho eluida de la Con A Sepharosa usando el
anticuerpo monoclonal 1D4. La flecha indica la detección inmunoespecifica de la Rho en esa fracción. C)
Espectros UV/Vis caracteristicos de una fracción eluida de la Con A Sepharosa en oscuridad (espectro en
azul oscuro con pico de absorbancia máxima a 498.5 nm), o en presencia de luz (espectro en azul claro,
pico de absorbancia máxima a 380 nm).
4.1.2 PURIFICACIÓN DE LA TRANSDUCINA.
60
Dado que la transducina (T) es una proteína, la cual es purificada
rutinariamente en el laboratorio de Química de Proteínas del Prof. José Bubis, la
misma fue gentilmente donada por la M.Sc. Deisy Perdomo, para los fines de la
realización de ensayos específicos de evaluación funcional de la Rho. En la Fig. 4.2,
se muestra el gel de poliacrilamida-SDS teñido con azul de Coomassie, representado
los perfiles electroforéticos correspondientes al pico de elución de la T de la columna
de DEAE-Sepharose.
Fig. 4.2 Purificación a homogeneidad de la Transducina heterotimerica. EGPA-SDS teñido con
azul de Coomassie mostrando el perfil electroforético de la elución de la T desde una columna de
DEAE-Sepharose con buffer C conteniendo 500 mM NaCl (lineas 1-9). Las líneas 2 y 3 representan las
fracciones conteniendo el pico de elución de la T, el cual correspondió al pico máximo de absorbancia a
280 nm. Las flechas señalan a la TD y la TE purificadas a homogeneidad.
4.2 ENTRECRUZAMIENTO QUÍMICO DE LA RODOPSINA
4.2.1 Entrecruzamiento covalente de la Rho embebida en las membranas de los
SEBLav.
61
Las reacciones de entrecruzamiento molecular covalente aportan información
preliminar importante acerca de las interacciones proteína-proteína. En este sentido,
y para evaluar las posibles interacciones Rho-Rho, se seleccionaron dos agentes
entrecruzadotes heterobifuncionales (sulfo-SMCC y MBS), los cuales contenían dos
grupos reactivos para residuos de cisternas (Cys) y lisinas (Lys), separados a una
distancia máxima medida en 11.6 y 9.9 Å, respectivamente (Hingorani y col., 1988;
Lee y Hoover, 1995; BiBernardo y Yagui, 2001).
El entrecruzamiento a partir de estos agentes puede ocurrir entre residuos de
Cys y Lys, ubicados entre dos monómeros de Rho separados a tales distancias
(entrecruzamiento intermolecular), o bien cuando dichos residuos están ubicados
dentro de una misma molécula de Rho (entrecruzamiento intramolecular). Las
reacciones de entrecruzamiento con sulfo-SMCC y MBS fueron inicialmente
conducidas a partir de las membranas de los SEBLav con la finalidad de obtener
información de las interacciones Rho-Rho, respetando las condiciones nativas de la
proteína embebida en la membrana. Las membranas de los SEBLav fueron incubadas
con ambos agentes en reacciones separadas. El tratamiento de las membranas con
5 mM de sulfo-SMCC o MBS, a 37 °C, resultó en un descenso de las especies de
Rho que migran a ~ 35 kDa, en geles de poliacrilamida-SDS, correspondientes a los
monómeros del fotorreceptor (R1). Este hecho fue concomitante con la formación
covalente de dímeros de Rho (R2), trímeros (R3) y formas oligoméricas (Rn) (ver
Fig. 4.3). Las especies Rn no fueron capaces de entrar al gel de apilamiento,
probablemente debido a la formación covalente de arreglos multiméricos de la Rho,
con un número variable de monómeros entrecruzados. En la Fig. 4.3, también se
reflejó como la formación de productos entrecruzados con sulfo-SMCC o MBS a
expensas de los monómeros de Rho fue ciertamente incompleta. De los ensayos
anteriores, es de interés destacar como una clara prevalencia de los dímeros
entrecruzados fue evidenciada. Como era de esperarse, la movilidad en EGPA-SDS
de la Rho control (no tratada con los entrecruzadores), no fue modificada en estos
ensayos.
62
Fig. 4.3 Entrecruzamiento de la Rho en membranas de los SEBLav con los reactivos bifuncionales
sulfo-SMCC y MBS. Las membranas SEBLav , fueron incubadas con 5 mM de Sulfo-SMCC (linea 2) o
MBS (linea 3) por 1 h a 37 °C. La linea 1 indica la muestra control conteniendo las membranas de los
SEBLav incubadas con el vehículo. Las reacciones fueron separadas por EGP-SDS y teñidas para
visualizar las proteínas con azul de coomassie. Las cantidad total de Rho cargada en los geles fue de 5
Pg/línea. R1, R2, R3, y Rn, corresponden a monómeros, dímeros, trímeros, y multímeros de R,
respectivamente. M, indica los marcadores de peso molecular.
4.2.2 Entrecruzamiento covalente de la Rho extraída y purificada en DM.
Si bien es cierto que las reacciones de entrecruzamiento químico de la Rho en
membranas, aportan información acerca de las posibles interacciones Rho-Rho en
su entorno nativo, estas reacciones en membrana, son en general, de interpretación
complicada. Esto es debido al hecho de que la Rho (al igual que las otras proteínas
de membrana), existe en una densidad lo suficientemente alta, estimada en a 60.000
por Pm2 con una densidad promedio de a 40.000 moléculas por Pm2 (Liang y col.,
2003). Las altas densidades reportadas para la Rho, podrían favorecer las colisiones
63
al azar de esta proteína, lo cual se traduciría a su vez en entrecruzamientos
accidentales por interacciones inespecíficas entre monómeros de Rho. Es por esto,
que el hallazgo de productos entrecruzados de Rho en membranas, podría reflejar
una asociación estable que ocurre naturalmente a ese nivel, pero sin embargo, no se
podría excluir la posibilidad de que existieran entrecruzamientos por colisiones de
corta duración entre monómeros de Rho en membrana. En este sentido, la
desintegración de las membranas en presencia de un detergente suave “no iónico”
(DM), disminuyó significativamente la concentración de proteínas, lo cual,
concomitantemente se tradujo en una reducción de la frecuencia de colisiones
aleatorias entre moléculas de Rho. Partiendo de una preparación de Rho solubilizada
y purificada a homogeneidad, mediante un procedimiento de cromatografía de
afinidad sobre Concanavalina A Sepharose en presencia de DM, se procedió a
realizar las respectivas reacciones de entrecruzamiento. El la Fig. 4.4, se muestran
los resultados de la incubación de la Rho purificada con 5 mM sulfo-SMCC o MBS.
De forma muy similar a la Rho entrecruzada en membranas de los SEBLav, en estos
ensayos aparecieron especies migrando con masas moleculares aparentes de
aproximadamente dos veces la masa esperada para un monómero de Rho (R2, ~ 75
kDa). Adicionalmente, también fueron formados otros arreglos supramoleculares (R3
y Rn), como resultado del tratamiento de la Rho purificada con los agentes
entrecruzadores. Nuevamente, aunque se observó la formación de especies R3 y Rn
en
presencia
de
los
entrecruzadores,
la
mayoría
de
los
productos
de
entrecruzamiento resultantes consistieron en especies diméricas de Rho (R2) (ver
Fig. 4.4)
64
M
1
2
3
Fig. 4.4 Entrecruzamiento de la Rodopsina purificada por cromatografía de afinidad a través de
Con A Sepharosa 4B con los reactivos bifuncionales sulfo-SMCC y MBS. Las muestras de Rho
purificada fueron incubadas con 5 mM de Sulfo-SMCC (linea 2) o MBS (linea 3) por 1 h a 37 °C. 1,
indica el control conteniendo la muestra de Rho solubilizada en DM e incubada con el vehículo. Las
reacciones fueron separadas por EGP-SDS y teñidas con plata para visualizar las proteínas. La
cantidad total de Rho cargada en los geles fue de 3 Pg/bolsillo. R1, R2, R3, y Rn, corresponden a
monómeros, dímeros, trímeros, y multímeros de R, respectivamente. M, indica los marcadores de peso
Agentes entrecruzadores homobifuncionales tipo bimaleimída tales como oPDM y p-PDM, capaces de entrecruzar residuos de Cys localizados a distancias no
mayores de 9 ó 12 Å, respectivamente (Hingorani y col., 1988; Green y col., 2001),
también fueron utilizados para evaluar las posibles interacciones Rho-Rho. En la Fig.
4.5 (A y B), se muestran los resultados de la incubación de la Rho purificada en
oscuridad (-) o en su estado fotolizado (+), con concentraciones incrementadas de
los entrecruzadores (2-8 mM). Similar a lo encontrado con sulfo-SMCC y MBS, los
agentes o-PDM y p-PDM, fueron capaces de entrecruzar a la Rho produciendo
especies
de
tipo
R2
en
su
estado
en
65
oscuridad.
Fig. 4.5 Entrecruzamiento de la Rho purificada con los reactivos bifuncionales o-PDM y p-PDM. Las
muestras de la Rho purificada fueron incubadas con concentraciones crecientes (2, 4 y 8 mM) de o-PDM o
p-PDM por 1 h a 37 °C, en oscuridad (-) o en presencia de luz (+). C indica los controles conteniendo las
muestras con el vehículo. Las reacciones fueron separadas por EGP-SDS y teñidas con plata para
visualizar las proteínas. La cantidad total de Rho cargada en los geles fue de 3 Pg/línea. R1, R2, R3, y Rn,
corresponden a monómeros, dímeros, trímeros, y multímeros de R, respectivamente.
En el caso de las bimaleimídas, resultó muy interesante el hecho de que se
observó una importante reducción de las especies monoméricas de Rho (R1), con
un concomitante aumento de las especies diméricas (R2), triméricas (R3) y de tipo
multimérico (Rn), específicamente en los casos en que la Rho* fue incubada con
concentraciones crecientes de o-PDM y p-PDM (Fig. 4.5, A y B). Estos resultados de
entrecruzamiento, corroboran por un lado, el hecho ampliamente conocido de la
ocurrencia de cambios conformacionales sobre la Rho una vez sometida a
iluminación. El cambio de conformación de la Rho hacia su forma Rho* por efecto de
la luz, expondría residuos de Cys entrecruzables con los agentes utilizados,
lográndose un entrecruzamiento estequiométrico de la Rho* a concentraciones de 8
66
mM de cada una de las bimaleimídas (Fig. 4.5, A y B). Por otra parte, estos
resultados nuevamente y en concordancia con los obtenidos por el uso de sulfoSMCC y MBS, sugieren la posible existencia de la Rho como entidades diméricas o
multiméricas en membranas y en su forma solubilizada.
4.2.3 Reacciones de entrecruzamiento de la Rho en función del tiempo.
En un esfuerzo por tratar de distinguir entre interacciones de Rho-Rho
estables y de ocurrencia natural, de aquellas transitorias por interacciones
inespecíficas, se procedió a realizar las reacciones de entrecruzamiento de la Rho
solubilizada en DM en función del tiempo, empleando los entrecruzadores sulfoSMCC, MBS y o-PDM, a una temperatura constante de 37 °C (Fig. 4.6 A, B y C
respectivamente). El estudio de estas reacciones de entrecruzamiento en función del
tiempo fue seguido por EGPA-SDS, los cuales fueron teñidos con plata. Como
resultado de estos estudios, en la Fig. 4.6 (A, B y C), se pudo notar como las
especies de ~ 75 kDa (R2), fueron formadas en proporción a una desaparición de las
especies de ~ 35 kDa, correspondientes a los monómeros de Rho (R1). Sin
embargo, en todos los casos las reacciones de entrecruzamiento en función del
tiempo fueron no estequiométricas, y una limitada formación de especies R2 fue
obtenida aún después de 1 h de incubación con los reactivos entrecruzadores. Estos
resultados pudieran ser interpretados de varias formas. En un sentido, estos
resultados podrían estar indicando una escasez de los residuos blancos para el
entrecruzador ubicados a las distancias apropiadas entre las moléculas de Rho
ínteractuantes. La ocurrencia de modificaciones monofuncionales dadas por la
interacción de un solo grupo funcional del entrecruzador con un residuo disponible en
la Rho, representa una posibilidad adicional, que contribuiría con un efecto de
dilución del reactivo entrecruzador, luego de que algunas moléculas hayan sido
primordialmente modificadas con el agente, una vez transcurrido un tiempo
pertinente de incubación. Es importante destacar que, a pesar de que la formación
de especies triméricas (R3) y multiméricas (Rn) de Rho no fue evidenciada en los
resultados mostrados en la Fig. 4.6 (A, B y C), dichas especies fueron claramente
67
evidentes cuando el mismo ensayo fue ejecutado en paralelo y analizado por
inmunotinción, revelado con el anticuerpo monoclonal 1D4.
Fig. 4.6 Reacciones de entrecruzamiento de la Rho purificada en función del tiempo. La Rho purificada
(1.28 PM) fue incubada en oscuridad con 5 mM de sulfo-SMCC (A), MBS (B) o p-PDM (C) a 37 °C. A los
intervalos de tiempo seleccionados, a una alícuota de la mezcla de reacción conteniendo 1.5 Pg de Rho total se
le añadió 20 mM de E-ME para detener la reacción. 60’-Cw y 60’-CDMSO, corresponden al punto de incubación de
60 min de la Rho con los vehículos, los cuales fueron agua (W) o dimetil sulfóxido (DMSO). La cantidad total de
1.5 Pg de Rho a cada tiempo de incubación fue cargada en el gel, sometida a EGPA-SDS y teñidas con plata. R1
y R2 = productos monoméricos y diméricos de la Rho, respectivamente.
Estos resultados son mostrados en la Fig. 4.7, correspondiente a la
inmunotinción con el anticuerpo 1D4 de la Rho sometida a una reacción de
entrecruzamiento en función del tiempo de incubación con el agente entrecruzador
MBS. Nótese, como las especies diméricas (R2), triméricas (R3) y multiméricas (Rn),
en adición a los monómeros (R1), fueron eficientemente inmunoteñidas con el
anticuerpo monoclonal 1D4, indicando su estabilización en las reacciones de
entrecruzamiento.
Interesantemente,
a
medida
que
tales
reacciones
de
entrecruzamiento en función del tiempo procedían, las especies de Rho en general,
no fueron eficientemente coloreadas por tinción con plata (ver Fig. 4.6), sugiriendo
esto que la incorporación de los reactivos bifuncionales, bien sea por modificación
monofuncional o por entrecruzamiento entre moléculas, impidió la apropiada tinción
de las proteínas. De forma interesante, en el transcurrir de las reacciones de
entrecruzamiento de la Rho en función del tiempo principalmente con los agentes
entrecruzadores MBS y o-PDM (ver Fig. 4.6, B y C), pudo ser notado el hallazgo de
68
monómeros de Rho exhibiendo masas moleculares aparentes de 38 – 40 kDa, mas
grandes que las esperadas para los monómeros de Rho en ausencia de los
entrecruzadores (R1 ~ 35 kDa).
Fig. 4.7 Inmunotinción de la reacción de cinética de entrecruzamiento en función del tiempo de la
Rho con el agente MBS. Las reacciones de entrecruzamiento de la Rho con 5 mM del agente MBS, en
función de los tiempos indicados, fueron detenidas a los tiempos especificados con 20 mM de E-ME. Las
reacciones fueron sometidas a EGPA-SDS, transferidas a filtros de nitrocelulosa, e inmunoteñidas usando
el anticuerpo monoclonal 1D4. Las membranas fueron reveladas con los sustratos precipitables para la
fosfatasa alcalina (NBT y BCIP). R1, R2, R3 y Rn = productos monoméricos, diméricos, triméricos y
multiméricos de la Rho, respectivamente.
Los ligeros incrementos en la masa molecular aparente de las especies R1
evidenciados en las reacciones de entrecruzamiento puntuales y en los
entrecruzamientos en función del tiempo, estarían indicando la formación de
productos entrecruzados intramolecularmente dentro de unidades monoméricas de
Rho o también una extensiva incorporación monofuncional de los compuestos
entrecruzadores dentro de la proteína por solo uno de los extremos funcionales de
los reactivos. Alternativamente, las ligeras variaciones del peso molecular de las
especies R1 en estas reacciones, pudieron ocurrir por una posible reducción de la
unión
del
SDS
a
la
proteína
69
entrecruzadas o modificadas con los entrecruzadores usados aquí, lo cual, reduciría
su migración en geles de poliacrilamida-SDS, por una reducción en su carga
negativa durante la corrida. La región de migración correspondiente a la especie R2
puede contener también dímeros formados por la combinación entre Rho nativa y/o
Rho entrecruzada intramolecularmente.
4.2.4 Entrecruzamiento de la Rho en función de su concentración.
El entrecruzamiento de la Rho en función de su concentración, también fue
utilizado como una herramienta para discernir las interacciones de Rho-Rho estables
y de ocurrencia natural, de aquellas transitorias por interacciones inespecíficas. En la
Fig. 4.8, se muestran los productos de entrecruzamiento obtenidos cuando
concentraciones incrementadas de la Rho en DM (1.28 – 20.5 PM) fueron incubadas
con una concentración fija de sulfo-SMCC (5 mM).
Fig. 4.8 Entrecruzamiento de la Rho purificada en función de su concentración. Las concentraciones
variables indicadas de Rho purificada, fueron incubadas con una concentración fija del entrecruzador sulfoSMCC (5 mM) por 1 h a temperatura ambiente. Una cantidad fija (13 PL) de cada punto de concentración de la
Rho conteniendo 0.65, 1.3, 2.6, 5.2, y 10 Pg de proteínas totales fueron cargados en el gel en los carriles de
izquierda a derecha. Estas muestras fueron separadas por EGP-SDS y teñidas con plata para visualizar las
proteínas. R1 y R2 = productos monoméricos y diméricos de la Rho, respectivamente.
70
En la Fig. 4.8, se puedo notar un incremento proporcional en la cantidad de especies
entrecruzadas de tipo R2, cuando alícuotas de 13 Pl de cada reacción fueron
cargadas en el gel. Sin embargo, cuando alícuotas de cada muestra, conteniendo la
misma cantidad de Rho (1.5 Pg) fueron cargadas en el gel y sometidas a EGPA-SDS,
fue claramente observado como en las reacciones de entrecruzamiento a diferentes
concentraciones de Rho, no se afectó la proporción de especies R2 a R1 (ver Fig.
4.9).
Fig. 4.9 Evaluación del efecto de la concentración de la Rho sobre el cociente de dímero a monómero
de la Rho entrecruzada con sulfo-SMCC. Las reacciones de entrecruzamiento a concentraciones
crecientes de la Rho en presencia de 5 mM sulfo-SMCC fueron llevadas a cabo por 1 h a temperatura
ambiente. Cantidades idénticas de la Rho de cada reacción (1.5 Pg) fueron cargadas en el gel, sometidas a
EGPA-SDS y las proteínas fueron teñidas con plata para su visualización. R1 y R2 = productos
monoméricos y diméricos de la Rho, respectivamente.
En este sentido, debido a que la misma cantidad de entrecruzados R2 fueron
formados a la concentración mas baja de Rho (1.28 PM) y a la mas alta (20.5 PM),
esto probablemente refleja una asociación estable y de ocurrencia natural entre
71
moléculas de Rho en estado nativo, mas que una interacción accidental por
colisiones aleatorias.
4.2.5
Entrecruzamiento
de
la
Rho
inducido
por
un
mecanismo
de
glutationilación.
La glutationilación de proteínas puede ocurrir cuando una cantidad
incrementada de glutatión oxidado (GSSH) es formado por la oxidación del glutatión
reducido (GSH) en presencia de diamida (ácido diazenedicarboxilico). En este
sentido, el GSSH es un reactivo capaz de promover reacciones de intercambio de
puentes de disulfuro entre su grupo thiol y los grupos thioles reactivos presentes en
la proteína, particularmente en residuos de Cys (Humphries y col., 2002). Las
reacciones de intercambio de disulfuro pueden promover la formación de puentes de
disulfuro intramoleculares (entrecruzamiento intramolecular), así como también la
formación de entrecruzamientos intermoleculares entre residuos de Cys cercanos y
accesibles entre dos proteínas interactuando activamente (entrecruzamiento
intermolecular). Para evaluar si la Rho y la Rho* son susceptibles a tales reacciones
de entrecruzamiento, estas proteínas solubilizadas en OTG fueron incubada con la
diamida y el GSH marcado con biotína (GSH-biotína), siguiendo las especificaciones
mencionadas en la sección 3.2.5.3 de Procedimientos experimentales. La separación
y visualización de las proteínas glutationiladas fue realizada como se describió en la
sección 3.2.5.3.2 referida también en los Procedimientos experimentales. En la Fig.
4.10, se muestra la membrana de nitrocelulosa en la cual la Rho* y la Rho modificas
con GSH-biotína fueron detectadas con avidína-HRP. En la Fig. 4.10 (líneas 1 y 3),
se presentan respectivamente, las reacciones de glutationilación de la Rho* y Rho,
corridas en condiciones reducidas (presencia de E-ME). Las líneas 4
y
6
representan la reacción de glutationilación de la Rho* y la Rho, separadas bajo
condiciones no reducidas (ausencia de E-ME). En la línea 4 y 6 se muestra como la
diamida y GSH fueron capaces de inducir la formación de disulfuros internos en los
monómeros de la Rho* y la Rho. Estos disulfuros internos promovieron cambios
estructurales en las moléculas, tal que favorecieron la adopción de una conformación
mas compacta en ambas formas del receptor, lo cual se tradujo en la aparición de
72
una banda difusa, para cada forma de Rho* o Rho (RGlu flecha en rojo), migrando con
una movilidad mucho mas rápida a aquella presentada por los monómeros R1 no
entrecruzados intramolecularmente (bandas migrando a ~ 35 kDa). Adicionalmente,
el tratamiento de las proteínas con diamida y GSH fue capaz de estabilizar los
dímeros nativos de Rho* y Rho, dado que fueron evidenciadas especies diméricas
R2 de ambas formas del receptor migrando a ~ 75 kDa (Fig. 4.10, líneas 4 y 6, flecha
en negro). Las bandas migrando ~ 75 kDa, correspondieron a dímeros
intermolecularmente entrecruzados de Rho* y Rho, estabilizados por los disulfuros
inducidos en la reacción de glutationilación.
Como se pudo evidenciar en los carriles 1 y 3 de la Fig. 4.10, el intercambio de
disulfuros inducido por la diamida y el GSH en la Rho* y la Rho, fue completamente
revertido en presencia del agente reductor E-ME, el cual es capaz de transformar el
medio oxidado de la reacción a un entorno completamente reducido. Nótese como en
presencia del agente reductor, sólo se evidenció la presencia de monómeros de Rho*
y Rho (Fig. 4.10, líneas 1 y 3). El paso de GSSH a GSH incapacita al gutatión para
la reacción de intercambio de disulfuros, eliminado las especies de migración más
rápida que los monómeros de la Rho* y la Rho, así como también los dímeros
intermolecularmente entrecruzados, migrando a ~ 75 kDa. En la Fig. 4.10 (líneas 2 y
5) se muestra la reacción de glutationilación de la subunidad catalítica de la proteína
quinas A (sC-PKA), utilizada como control interno positivo de la reacción. Nótese la
línea 5 como, de acuerdo a lo publicado por Humphries y col. (2002), esta subunidad
fue intramolecularmente entrecruzada, hecho evidenciado por la detección de
especies borrosas migrando ligeramente por debajo del peso molecular esperado
para esta proteína (~ 40 kDa). De igual manera en la línea 5, se pudo notar la
formación por glutationilación de especies diméricas (sC2), triméricas (sC3) y
oligoméricas (sCn). Estas reacciones fueron igualmente revertidas cuando las
muestras fueron corridas en condiciones reductoras.
73
Fig. 4.10 Ensayos de glutationilación de la Rho y la Rho*. La Rho purificada o la Rho* (7.5 PM) fue incubada
con 150 PM de diamida y 225 PM de GSH-biotína por 1 h a temp. ambiente. Las reacciones en su totalidad
fueron sometidas a EGPA-SDS en presencia de E-ME (líneas 1 y 3) o en ausencia del mismo (4 y 6). Las
electroforesis fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa y las proteínas glutationiladas con GSH-biotína
fueron detectadas con avidína-HRP. Las líneas 1 y 4 corresponden con la glutationilación de la Rho*. Las líneas
3 y 6 corresponden con la glutationilación de la Rho nativa. R1 representa a los monómeros de Rho* y Rho. R2
representa a las especies diméricas de Rho* y Rho entrecruzadas y estabilizadas por la glutationilación en
residuos de Cys. Las bandas señaladas con la flecha en rojo (R1Glu) indican la formación de disulfuros
intramoleculares de la Rho* y la Rho con una migración ligeramente más rápida que las especies R1. Las líneas
2 y 5 muestran al control positivo interno de la glutationilación de la subunidad catalítica de la PKA, corridas en
presencia o ausencia de E-ME, respectivamente. *sC1, *sC2, *sC3 y *sCn, representan la distintas especies
monoméricas, diméricas, triméricas y oligoméricas de la subunidad catalítica formadas por el establecimiento de
puentes de disulfuro intermoleculares e intramoleculares por efecto de la glutationilación de la proteína.
74
4.3 CARACTERIZACIÓN DE LOS PARAMETROS HIDRODINAMICOS DE LOS
COMPLEJOS FORMADOS ENTRE LA RODOPSINA Y LA RODOPSINA
FOTOACTIVADA CON EL DM.
4.3.1 Filtración en gel de la Rodopsina en presencia de DM.
Cuando la Rho solubilizada en 1.96 mM DM (Rho:DM), fue sometida a
cromatografía de exclusión molecular sobre una matriz de Sephacryl S-300 y en
oscuridad, esta proteína eluyó de la columna como un pico único y agudo de
especies de Rho:DM absorbiendo a 498.5 nm (ver Fig. 4.11, A). Como se muestra en
la misma figura, el monitoreo simultaneo de las mismas fracciones a 380 nm, no
evidenció la presencia de especies de Rho*:DM en dicho procedimiento
cromatográfico. La Fig. 4.11 B, muestra el perfil de elución de la Rho*:DM filtrada
igualmente en la misma columna de Sephacryl S-300, en presencia de luz. Nótese
como similar al caso de la cromatografía de la Rho:DM, la Rho*:DM eluyó en un pico
único y agudo, absorbiendo a 380 nm, sin presencia de especies de Rho
absorbiendo
a
498.5
nm.
Es
importante
señalar
que
en
estos
perfiles
cromatográficos, la relación de abs. 280 nm a 498.5 nm para la Rho:DM y la relación
280 nm a 380 nm para la Rho*:DM permaneció constante a través de los picos,
indicando esto la presencia de especies únicas de cada proteína. Adicionalmente,
estas separaciones fueron realizadas en presencia de proteínas estándares de peso
molecular conocido. Los picos de elución de los estándares de peso molecular están
también señalados en la Fig. 4.11. En estas separaciones se pudo apreciar como
ambos complejos eluyeron en las mismas posiciones indicadas en la Fig. 4.11 (A y
B).
75
Fig. 4.11 Filtración en gel de la Rho purificada (A) y la Rho* (B) sobre una columna de Sephacryl S300. La absorbancia fue medida a 498.5 nm (i) y 380 nm (). Los insertos muestran el perfil de elusión de la
Rho:DM (A) y Rho*:DM (B), seguidos por inmunotinción usando el anticuerpo monoclonal 1D4. La Rho:DM
eluyó entre las fracciones 38-43 y mostró su mayor pico en la fracción 40. La Rho*:DM eluyó entre las
fracciones 38-44 y su mayor pico fue en la fracción 41. Las flechas indican las posiciones de elusión de las
proteínas estándares que fueron usadas: E-amilasa (Am), alcohol deshidrogenasa (ADH), albúmina de suero
bovino dimérica (dBSA), ovoalbúmina (Ovo), quimiotripsinógeno A (Chy), ribonucleasa A (Rb), y citocrómo C
(CC).
En cuanto a la recuperación de las especies Rho:DM o Rho*:DM, posterior a su
filtración a través de la columna, es de interés resaltar que aproximadamente un 8590 % de la cantidad de cada complejo inicialmente sembrado en la columna, fue
recuperado en las fracciones colectadas. En efecto, después de la separación de la
Rho:DM en oscuridad, o bien de la Rho*:DM, en la luz, una capa rojiza o amarillenta
fue observada en el tope de la columna, propio de la retención a este nivel de la
columna, de los complejos en oscuridad o en luz, respectivamente. Esta observación
en cuanto a la recuperación de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM, sugirió la
formación de una pequeña proporción de complejos oligoméricos de las Rho y Rho*
76
solubilizadas en DM, las cuales fueron permanentemente absorbidas en le tope de la
resina, dado que su tamaño imposibilitó su penetración y filtración a través de esta.
Esta cantidad de complejos retenidos podría explicar la perdida final de un 10-15 %
de la proteína sembrada inicialmente.
4.3.2 Determinación del peso molecular de los complejos Rho:DM y Rho*:DM.
Los tamaños de los complejos de Rho:detergente en su estado nativo o
fotoactivado, fueron determinados empíricamente a través de la construcción de una
gráfica del valor de Kav de cada proteína estándar, versus el logaritmo del peso
molecular de cada uno (ver Fig. 4.12).
Fig. 4.12 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de los complejos Rho:DM y
Rho*:DM. Se muestra la curva de calibración entre el coeficiente de partición (Kav) de las proteínas estándares
de peso molecular conocido, señaladas en Procedimientos experimentales vs el Log del peso molecular de las
mismas Las posiciones de elución de los complejos de Rho:DM (Rho, ) y Rho*:DM (Rho*, i), fueron
determinados por EGPA-SDS e inmunotinción usando el anticuerpo monoclonal 1D4 y están indicados con
flechas.
La interpolación del coeficiente de partición (Kav) de los complejos de Rho:DM
y Rho*:DM en dicha gráfica, arrojó pesos moleculares de 128.000 y 126.000,
respectivamente. Dado que el procedimiento cromatográfico fue llevado a cabo en
presencia de 0.1 % DM (1.96 mM), fue evidente que la Rho se encontraba inserta
dentro de micelas del detergente, ya que se trabajó a concentraciones por encima de
77
su concentración micelar critica (0.18 mM). En este sentido, el peso molecular de una
micela de DM había sido calculado por Rosevear y col. (1980), como un valor de
aproximadamente 50.000. Conociendo el peso molecular de una micela y asumiendo
que la Rho y la Rho* se encontraban insertas en ellas, la masa molecular de la Rho
nativa y la Rho*, fue calculada por la sustracción del peso de la micela, al tamaño
total del complejo de proteína:detergente determinado por exclusión molecular. Esta
sustracción produjo pesos moleculares de 78 kDa y 76 kDa, respectivamente. Los
resultados aquí encontrados predicen que ambas conformaciones de la Rho son
diméricas en su estado nativo y fotoactivado.
Cuando se construyó la curva de calibración de (-log Kav)1/2 versus los radios
de Stokes (a) de cada proteína estándar (Fig. 4.13), la interpolación de los valores de
(-log Kav)1/2 calculados para cada uno de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM,
arrojó radios de Stokes de 4.18 y 4.15 nm, respectivamente (ver Fig. 4.18).
Fig. 4.13 Curva de calibración para la estimación de los radios de Stokes de los complejos de
Rho:DM y Rho*:DM. Se muestra la curva de calibración de los radios de Stokes (nm) de las proteínas
1/2
estándares indicados en Procedimientos experimentales vs el correspondiente (-log Kav) , determinados
por exclusión molecular. a, indica los radios de Stokes (nm).
78
4.3.3 Estimación del Volumen especifico parcial de los complejos Rho:DM.
El volumen específico parcial (Q2) depende principalmente de la composición química
del complejo proteína:dertegente y una buena aproximación de este valor viene dada
por la Ecuación 2,
Q2 = (QP + Qd . G) / (1 + G)
(Ec. 2)
En esa ecuación ˲P representa el volumen específico parcial de la proteína; ˲d es el
volumen específico parcial del detergente, y G es la proporción de detergente unido a
la proteína. El valor de QP fue calculado aplicando la Ecuación 3,
¦ ni.Mi. Qi/¦ ni.Mi
(Ec. 3)
En esa ecuación ni representa el numero de veces en que un residuo es repetido en
la secuencia primaria de la proteína, Mi es la masa molecular del residuo menos el
peso de una molécula de agua y Qi representa el volumen especifico parcial del
aminoácido. El valor de QP fue igual a 0.709 cm3/g para la Rho.
Para poder determinar el parámetro G, se procedió a medir la concentración
de detergente presente en la fracción Rho:DM luego de la cromatografía de
exclusión molecular en Sephacryl S-300, mediante el método de antrona de acuerdo
a lo descrito en Procedimientos experimentales. La cantidad de Rho en el pico de
elusión fue calculada en 5 Pg/50 PL de acuerdo al valor de absorbancia a 498.5 nm
de la fracción pico de la proteína luego de la cromatografía. La curva de calibración
de Abs620nm versus la concentración de DM de cada punto (0-100 Pg), permitió la
interpolación de los valores de Abs620nm de una fracción de la columna en la cual no
hubo elución de proteínas (fracción de detergente libre). De esta manera se calculó
que el buffer contenía 0.1017 Pg/50 PL de DM. La interpolación de la Abs620nm
medida sobre la fracción en la cual se identificó el pico de elución del complejo
Rho:DM, permitió calcular los Pgs totales de DM libre y unido a la Rho en dicha
fracción 0.1843 Pg/ 50 PL. Se ha podido conocer que la cantidad de moles de Man
presentes en un mol de Rho es de aproximadamente 10 moles. Por tal razón y dado
que el método de antrona es sensible para la detección de este carbohidrato, se
decidió realizar la medición de la Abs620nm de un control conteniendo el doble de la
cantidad de moles de Man presentes en la proteína, para de esta forma determinar si
79
dicha cantidad de Man presente en la proteína contribuía con el valor medido a esa
absorbancia especifica en la fracción pico de elución de la Rho. La interpolación de
los valores de Abs620nm de las muestras control conteniendo un exceso de dos veces
los moles de D-metilmanósido con respecto a los moles de Rho utilizados en la
determinación (20 moles de D-metilmanósido/mol de Rho), permitió conocer que los
residuos de Man presentes en la Rho no exhibieron ninguna contribución sobre la
Abs620nm medida en el pico de elución del complejo Rho:DM. En este sentido, se
garantizó que la Abs620nm medida en el pico de elución del complejo Rho:DM
reflejaba justamente la cantidad de detergente libre y unido a la Rho en la fracción
pico analizada. Cuando se realizó la sustracción de los Pgs de DM libre, y los Pgs de
D-metilmanósido de las muestras control conteniendo un exceso en moles de Dmetilmanósido, a los Pgs de DM totales presentes en el pico de elución del complejo
Rho:DM, se pudo conocer que el valor de G fue de 0.97 g de detergente/gr de
proteína, estando entonces en presencia de 1.97 g del complejo Rho:DM.
Conociendo el valor de G, se pudo calcular la masa molecular del motivo de proteína
contenido en el complejo de proteína-detergente asumiéndose la siguiente relación:
si 1.97 g del complejo Rho:DM, contienen 1 g de proteína, en 128.000 g del complejo
Rho:DM estimado por filtración en gel, se analizó cuantos g de proteína deberían
existir en el complejo. Esta relación resultó en que ~ 65.000 g de Rho/mol del
complejo Rho:DM estuvieron presentes, es decir, se evidenció un motivo dimérico de
Rho. Para el complejo de Rho*:DM un valor de 64.000 g de Rho/mol del complejo
Rho*:DM estuvieron presentes, indicando igualmente la existencia de un motivo
dimerico de Rho* en el complejo. Posteriormente, considerando un peso molecular
para la Rho de ~ 40.000, determinado de su estructura primaria y composición de
carbohidratos, se pudo conocer que el complejo proteína:detergente contenía 1.63
copias de Rho:DM. Un análisis similar estimó que 1.6 copias de Rho* estaban
contenidas por mol del complejo Rho*:DM. Estos resultados se constituyeron como
una prueba adicional y directa de que la Rho nativa o fotoactivada incluida en las
micelas de DM y eluída de una cromatografía en gel, se presenta como un dímero.
Una vez estimados los valores de QP y G, y usando los valores de Qd para el DM de
0.824 cm3/g, previamente publicados por Möller y le Maire (1993), pudo ser calculado
80
el volumen especifico parcial de los complejos proteína:detergente el cual fue igual a
0.765 cm3/g.
4.3.4 Sedimentación por ultracentrifugación analítica de la Rho y Rho*, en
gradientes de sacarosa y en presencia de DM.
El coeficiente de sedimentación (S) de los complejos Rho:DM y Rho*:DM, fue
medido por el sometimiento de la Rho nativa y la Rho fotoactivada a sedimentación
en gradientes continuos de 10 – 30 % de sacarosa, en un buffer conteniendo 0.1 %
DM (1.96 mM). Los gradientes fueron calibrados por la sedimentación en los mismos
de proteínas estándares con coeficientes de sedimentación (S) conocidos, la
migración de la Rho a través del gradiente fue seguida por EGPA-SDS e
inmunotinción usando el anticuerpo monoclonal 1D4 (Fig. 4.14).
Fig. 4.14 Inmunotinción de la Rho sedimentada por ultracentrifugación en gradientes lineales de
sacarosa. Se muestra el perfil de sedimentación del complejo Rho:DM a lo largo del gradiente continuo de
sacarosa del 10-30 %. Las fracciones colectadas desde la base del gradiente de sedimentación fueron corridas
en EGPA-SDS, transferidas a membranas de nitrocelulosa e inmunoteñidas con el anticuerpo monoclonal 1D4.
Las membranas muestran la elución de la Rho:DM desde las fracciones 1-11; 12-22; 23-33 y 34-44. Las
flechas negras sobre las fracciones 18 y 19 señalan el pico máximo de sedimentación de la Rho:DM en el
gradiente analizado. El pico señalado en dichas fracciones coincidió con el pico máximo de absorbancia a
498.5 nm (datos no mostrados). o Rho señala la banda mayoritaria de 35 kDa reconocida por el 1D4
correspondiente a la Rho.
De las inmunotinciones mostradas es importante destacar que el pico máximo
de migración de la Rho se identificó a nivel de las fracciones 18-19 (ver Fig. 4.14,
81
flechas negras). A partir de este hallazgo, se realizo el cálculo del volumen de
migración (Vm) de la Rho en el gradiente. Idénticos resultados fueron obtenidos
cuando se analizó la sedimentación de la Rho* en presencia de DM (datos no
mostrados). En las membranas inmunoteñidas mostradas en la Fig. 4.14, también se
pudo notar como una facción importante de la Rho originalmente sembrada en el
tope del gradiente, presentó un muy alto punto isopícnico evidenciado por su
sedimentación a nivel de la base del tubo de centrifuga correspondiente. Nótese
como hubo detección de Rho sedimentada incluso desde la primera fracción
colectada posterior a la perforación del tubo que contenía el gradiente sometido a
velocidad de sedimentación (ver Fig. 4.14). Este hallazgo indicó la existencia de
algunos oligómeros de Rho de orden superior aún después de su solubilización en
detergente. La misma observación fue evidenciada con la Rho* (datos no
mostrados). Sin embargo, la población global de Rho y Rho* se fraccionó y viajó
hasta su respectiva densidad de flotación en el gradiente de sacarosa, punto en el
cual ellas cesaron de moverse, correspondiente a las fracciones 18 y 19 colectadas
(ver Fig. 4.14).
El S para cada uno de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM fue determinado
por interpolación del volumen de migración de cada uno de los complejos
sedimentados en una curva de calibración construida a partir del S versus el volumen
de migración de las proteínas estándares (ver Fig. 4.15). El coeficiente de
sedimentación obtenido fue de 5.78 S para ambos complejo sde Rho y Rho* con DM.
82
Fig. 4.15 Curva de calibración para la determinación de los coeficientes de sedimentación de los complejos
Rho:DM y Rho*:DM. La calibración de los gradientes de sacarosa fue llevada a cabo con las proteínas estándar,
alcohol deshidrogenasa (7.4 S), una glicoproteína variante de superficie de T. evansi (VSG, 5.67 S) (Uzcanga y
col.. 2004), quimiotripsinógeno A (2.6 S) y ribonucleasa A (2.0 S). Como fue mostrado en la Fig. 4.19, las
posiciones de sedimentación de la Rho, () y la (Rho*, (i) fue determinado por inmunotinción de las fracciones
sedimentadas en el gradiente de sacarosa, previamente separadas en EGPA-SDS y transferidas a filtros de
nitrocelulosa. Las fechas indican la interpolación de los volúmenes de migración de cada complejo. S indica el
coeficiente de sedimentación (unidades Svedberg).
4.3.4.1 Determinación de la masa molecular de la Rho y la Rho* en DM, a partir
de su coeficiente de sedimentación.
Para proteínas esféricas, la masa molecular de una especie puede ser
calculada desde una combinación del valor de radio de Stokes medido para esa
especie y su respectivo coeficiente de sedimentación a partir de la Ecuación 4:
M = 6SKNas
QP)
(Ec. 4)
En la Ec. 4, M es la masa molecular, a es el radio de Stokes, S es el coeficiente de
sedimentación, Qes el volumen específico parcial, K es la viscosidad del medio,
P
es
la densidad del medio y N es el Número de Avogadro. Usando esta aproximación,
fue construida una curva de calibración de M versus el radio de Stokes multiplicado
por el coeficiente de sedimentación (a X s), usando los valores publicados para las
proteínas estándares usadas en este análisis (ver Fig. 4.16). Nótese en la gráfica de
83
la Fig. 4.16, como la interpolación del producto de a X s del complejo Rho:DM (4.18
nm X 5.78 = 24.16) y del complejo Rho*:DM (4.15 nm X 5.78 = 23.99), arrojó valores
de peso molecular de 107.000 y 111.000 para cada complejo de proteína:
detergente, respectivamente. Nuevamente, considerando que las proteínas Rho y
Rho* se encontraban insertas en micelas del detergente, se procedió a realizar la
sustracción del peso molecular de la micela de DM al peso total estimado para cada
complejo.
Fig. 4.16 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de la Rho y Rho* sedimentada
por ultracentrifugación. A partir de los valores de coeficiente de sedimentación (S) y el radio de Stokes de
las proteínas estándares, se presenta la curva de calibración del peso molecular (PM) de los estándares vs. el
producto de a X S. La interpolación de los parámetros estimados para los complejos Rho:DM (Rho ) y
Rho*:DM (Rho* i), está señalada con flechas en la grafica.
La sustracción del peso de la micela de DM resultó en pesos moleculares para el
motivo de Rho igual a 57.000 y de 67.000 para el motivo de Rho*. En síntesis, pudo
notarse como la determinación del peso molecular de la Rho en estado nativo o
fotoactivado, fue consistente con un arreglo de estructura cuaternaria dimérica para
la proteína fotorreceptora. Estos resultados apoyan hallazgos previamente descritos
aquí, para una estructura dimérica de la Rho y Rho*, resultantes de la filtración
molecular en Sephacryl S-300 y del análisis de contenido de DM unido a la Rho o
Rho* mediante el método de antrona.
84
4.3.5 Determinación del coeficiente friccional (ƒ/ƒo) para los complejos Rho:DM
y Rho*:DM.
El coeficiente friccional de especies de proteínas se presenta como un
parámetro hidrodinámico adicional, el cual permite inferir de manera indirecta,
aspectos referentes a la forma y simetría de dichas entidades proteicas en solución.
Una estimación del coeficiente friccional puede ser obtenida cuando el coeficiente
friccional de las especies en estudio (ƒ), es comparado con aquel correspondiente a
una esfera compacta (ƒo) (Tanford, 1961; Bloomfield y col., 1967).
Cuando las masas moleculares fueron obtenidas por cromatografía de
filtración en gel, se procedió a realizar los cálculos de los cocientes fricciónales de los
complejos de Rho:DM y Rho*:DM, mediante la aplicación de la Ecuación 5:
ƒ/ƒo = a/(3˲M / 4SN)1/3
(Ec. 5)
La aplicación de la Ec. 5, arrojó un valor de ƒ/ƒo para el complejo Rho:DM de 1.56,
mientras que para el complejo Rho*:DM se obtuvo un valor de 1.58. Adicionalmente,
cuando los coeficientes fricciónales fueron calculados a partir de las masas
moleculares de los complejos Rho:DM y Rho*:DM, obtenidas por la metodología de
sedimentación por ultracentrifugación, un valor de ƒ/ƒo igual a 1.4, fue obtenido para
ambos complejos.
En cuanto al análisis de los valores de ƒ/ƒo encontrados aquí para los complejos
Rho:DM y Rho*:DM, es importante destacar que, los complejos de Rho en
detergente analizados en este estudio, exhibieron valores de coeficientes fricciónales
t a 1.4; muy similares a aquellos evidenciados para la mayoría de las proteínas de
membrana reportadas que han sido purificadas formando complejos con detergentes
(le Maire y Möller, 1981). Este hecho, validó los resultados aquí encontrados y al
mismo tiempo demostró que la Rho, presenta aspectos hidrodinámicos conservados
entre este tipo de proteínas integrales de membrana. En un análisis comparativo un
poco mas profundo, se pudo conocer que los valores de ƒ/ƒo obtenidos en este
estudio sugirieron una ligera asimetría en los complejos de Rho:DM y Rho*:DM, que
a su vez indicó que las conformaciones similares a la nativa de estas proteínas, se
ubicaron en un limite entre una conformación globular y moderadamente expandida.
85
4.4 INTEGRIDAD DE LOS COMPLEJOS DIMÉRICOS DE RHO EN DETERGENTE,
AISLADOS
POR
CROMATOGRAFÍA
DE
FILTRACIÓN
EN
GEL
Y
SEDIMENTACIÓN POR ULTRACENTRIFUGACIÓN.
4.4.1 Evaluación de la funcionalidad in vitro de los complejos diméricos de la
Rho contenidos por cromatografía de exclusión molecular y por
sedimentación a través de gradientes de sacarosa.
Una vez demostrada la condición dimérica de la Rho acomplejada con el
detergente DM, en condición nativa o fotoactivada, a partir de los procedimientos
descritos de filtración en gel o de sedimentación por ultracentrifugación, fue de
interés el demostrar que dichos complejos diméricos de Rho:DM y Rho*:DM, existían
como entidades estructurales y funcionalmente integras. El parámetro utilizado para
evaluar la integridad estructural de los complejos diméricos de Rho, consistió en la
realización de espectros UV/Vis en el rango de 250-650 nm de las fracciones
pertenecientes al pico de elución del complejo Rho:DM de la columna de Sephacryl
S-300 (fracciones 39 y 40) o del mismo complejo sedimentado por ultracentrifugación
(fracciones 18 y 19). En la Fig. 4.17, se muestran los espectros UV/Vis del complejo
Rho:DM aislado por filtración (FG) y de los mismos complejos sedimentados (S).
Fig. 4.17 Espectros de absorción UV/Vis de los complejos Rho:detergente obtenidos por
filtración en gel (FG) y sedimentación por ultracentrifugación (S). Los espectros fueron registrados
en la oscuridad (Rho) o después de 1 min de iluminación con un bombillo de filamento de 150-watt
(Rho*), para cada muestra de Rho obtenida por filtración en gel (FG) o sedimentación (S). Las flechas
indican los picos máximos de absorbancia correspondientes a la Rho en oscuridad, (498.5 nm) y en
presencia de luz, Rho* (380 nm).
86
Fue
evidente
que
cuando
los
complejos
fueron
evaluados
espectrofotometricamente en oscuridad, un único pico de especies de Rho
absorbiendo a la longitud característica de 498.5 nm, fue detectado en las muestras
de FG y S. La iluminación intensa de las muestras por 1 min para su posterior
registro espectrofotométrico, evidenció la extinción del pico de especies de Rho
nativa absorbiendo a 498.5 nm y la aparición de un nuevo pico absorbiendo a una
longitud de onda de 380 nm, correspondiente con la formación de la Rho*, por efecto
de la isomerización del retinal desde su forma 11-cis a la forma todo-trans, en ambos
casos (muestras tipo FG y S). Los espectros mostrados en la Fig. 4.17, comprobaron
directamente la ocurrencia del cambio conformacional característico sufrido por la
Rho por efecto de la luz. Más allá, estos resultados apuntaron hacia la idea de que la
conformación dimérica nativa de la Rho en el complejo micelar con el DM, no afectó
la integridad estructural de esta proteína. En este sentido, se demostró que la Rho en
arreglo dimérico nativo es capaz de sufrir el rearreglo estructural característico
requerido para la activación receptor por efecto de la luz.
Los complejos diméricos de Rho:DM aislados por FG o S, tambien fueron
analizados por su habilidad de catalizar la actividad de unión de [3H]GMP-pNp a la T
dependiente de la luz (ver Fig. 4.18). Nótese como los complejos de Rho:DM (FG) y
Rho:DM (S), fueron capaces de inducir la unión de [3H]GMP-pNp a la T, exhibiendo
un rango de actividad de ~ 60-75 % de aquel exhibido por muestras controles de Rho
provenientes de una purificación por afinidad a Concanavalina A Sepharosa 4B [RhoDM (con A)] o de Rho en membranas de los SEBLav. En los ensayos de Rho:DM y
Rho*:DM, asi como en los ensayos control (Rho:DM (Con A) y membranas de los
SEBLav), la cantidad de proteína fue constante y equivalente a 4 Pg/reacción.
87
Fig. 4.18 Ensayo de enlazamiento de [3H]GMPpNp de la T inducida por los complejos de Rho:detergente
obtenidos por filtración en gel (FG) y sedimentación por ultracentrifugación (S). Los complejos de Rho:DM
después de la filtración en gel (Rho-DM (FG)) o de la sedimentación (Rho-DM (S)), fueron incubados con T, bajo
3
iluminación intensa y en presencia de [ H]GMPpNp. La actividad de unión de la T al análogo no hidrolizable de
GTP fue ensayada por filtración en membranas Millipore. Los experimentos con Rho purificada por afinidad a
Con A Sepharosa (Rho-DM (Con A) ) y membranas SEB lavadas (SEBLav), fueron incluidos como controles. La
cantidad de Rho en cada una de las reacciones fue constante y equivalente a 4 Pg.
Otra vía para abordar la evaluación funcional de los complejos diméricos de
Rho:DM consistió en la realización de ensayos para evaluar la capacidad de la Rho
dimérica (FG) y la Rho dimérica (S) de estimular la actividad GTPasa intrínseca de la
T por efecto de la luz. En la Fig. 4.19, se muestra una gráfica en la cual se analiza la
estimulaión de la actividad GTPasa de la T, manifestada en pmoles de fósforo
inorgánico (Pi) bajo la forma de [32P] liberado al medio en función del tiempo (min).
Nótese como se pudo evidenciar un incremento lineal del [32P]-Pi liberado al medio
en la medida en que los tiempos de incubación de la T con los complejos Rho:DM
(FG o S) fue incrementada (0 – 10 min), en presencia de luz. Como era de
esperarse, cuando la misma reacción fue llevada a cabo en paralelo pero en
88
oscuridad, ninguna actividad GTPasa de la T fue evidenciada. Estos resultados
sugirieron que ambas muestras de Rho:DM en arreglo dimérico, fueron capaces de
estimular la actividad GTPasa de la T en presencia de luz.
Fig. 4.19 Estimulación de la actividad de GTPasa de la T dependiente de la luz. Los complejos de
Rho:DM después de la filtración en gel () o la sedimentación (i), fueron usados para inducir la actividad de
hidrolítica de [J32P]GTP de la T, dependiente de la luz. Los ensayos controles fueron ejecutados en la
oscuridad.
Finalmente, se midió la capacidad de la Rho:DM provenientes de FG o S de
servir como sustrato para la fosforilación llevada a cabo en este receptor por parte de
la rodopsina quinasa (RQ). En la Fig. 4.20, (I), se muestra la fuente original de RQ
(SEB) a partir de los cuales se obtuvo la fracción enriquecida de esta quinasa del
receptor.
89
Fig. 4.20 Ensayos de fosforilación de la Rho en los complejos Rho:detergente por la rodopsina quinasa. Se
muestra la autorradiografía de la fosforilación in vitro inducida por luz de la Rho:DM obtenida por FG o S, por parte
32
de la rodopsina quinasa (RQ). (I) membranas intactas de los SEB incubadas con [J- P]ATP en oscuridad (-) o en
32
presencia de luz (+). (II) fracción enriquecida de RQ incubada con [J- P]ATP en presencia de luz (+), idénticos
resultados fueron obtenidos en oscuridad (datos no incluidos). (III) los complejos de Rho:DM luego la filtración en
32
gel (GF) o sedimentación (S) fueron incubados con la fracción enriquecida de RQ y [J- P]ATP, en oscuridad (-) o
en presencia de luz (+). La flecha indica la migración de la Rho fosforilada.
Nótese como, en esa fracción de membranas intactas de los SEB incubadas con
una mezcla de fosforilación, se pudo notar la existencia de RQ endógena, la cual
pudo fosforilar (solo en presencia de luz) a la Rho embebida en dichas membranas
(banda fosforilada migrando con una masa molecular aparente de ~ 35 kDa). En la
Fig. 4.20 (II), se muestra la fracción enriquecida de RQ incubada con la mezcla de
fosforilación en presencia de luz. Nótese como dicha fracción fue completamente
carente de contaminación con moléculas de Rho. En la Fig. 4.20 (III), se muestran
los resultados de la incubación de los complejos de Rho:DM (FG o S) con la fracción
enriquecida de RQ, en presencia de la mezcla de fosforilación, en luz o en oscuridad.
Los resultados muestran como las muestras de Rho:DM de ambos orígenes fueron
susceptibles a fosforilación en presencia de luz, por parte de la RQ (flecha negra en
la base del panel derecho). Ninguna reacción de fosforilación de la Rho fue
90
evidenciada en oscuridad. Estos resultados sirvieron para evidenciar la integridad
estructural de la Rho en un arreglo dimérico dentro del complejo Rho:DM, dado que
las moléculas de Rho dentro del dicho arreglo presentaron sus colas C-terminales
libres y accesibles para la interacción con la RQ. Del mismo modo, se evidencio una
reacción de fosforilación del receptor que atendió a la regulación por luz del cambio
conformacional que debe experimentar la Rho para ser reconocida por la quinasa
especifica (RQ).
Tomando en consideración todos los resultados de la evaluación de la integridad
estructural y funcional de la Rho dimérica en los complejos Rho:DM, se puedo
confirmar que la Rho en tal arreglo nativo, exhibe propiedades funcionales intactas
una vez aislada por filtración en gel o sedimentación por ultracentrifugación. Estos
hallazgos permiten extrapolar dicha condición dimérica in vitro, a la adoptada por la
proteína en sus membranas nativas in vivo, ya que bajo este arreglo podría mantener
su capacidad señalizante en la cascada visual.
4.5 INTENTOS DE RENATURALIZACIÓN DE LOS DIMEROS DE RHO A PARTIR
DE OPSINAS MARCADAS QUIMICAMENTE CON NHS-biotína o [J-32P].
Dado que los abordajes bioquímicos descritos hasta ahora evidenciaron la
existencia de la Rho y la Rho* como entidades diméricas nativas, se planteó la
obtención de una prueba adicional para demostrar tal arreglo cuaternario. En este
sentido, se requirió de la generación de poblaciones separadas de Rhos marcadas
diferencialmente con NHS-biotína y [J-32P]. La desnaturalización en detergente de
estas Rho marcadas generaría las opsinas marcadas diferencialmente, las cuales
serían el punto de partida para promover la renaturalización de los dímeros Rho. En
este sentido, la incubación de una mezcla de las opsinas marcadas diferencialmente
y el 11-cis-retinal (en oscuridad), debería permitir la reformación de dímeros
conteniendo Rhos marcadas con biotína y
[J-32P]. Una vez obtenidas las Rho
diméricas renaturalizadas, se procedería a realizar la precipitación de un complejo
conteniendo ambas marcas, es decir, al precipitar a la Rho-biotína del complejo, por
su afinidad a esteptavidina-agarosa, se esperaría co-precipitar en conjunto a la Rho-
91
[J-32P] en el mismo complejo dimérico. En la siguiente sección se describen los
resultados de la generación de opsinas marcadas diferencialmente y los intentos de
co-precipitación de las Rho marcadas diferencialmente.
4.5.1 Resultados del marcaje diferencial de la Rho con NHS-biotína o con [J32
P].
La Rho en las membranas SEBLav fue sometida a marcaje con el reactivo
NHS-biotína, siguiendo las condiciones experimentales definidas en la sección
3.2.8.1 de Procedimientos experimentales. La Rho-biotína inserta en membranas fue
sometida a EGPA-SDS y las electroforesis fueron transferidas a filtros de
nitrocelulosa. Iguales cantidades de membranas SEBLav no tratadas con NHS-biotína
fueron incluidas como control negativo de la reacción de marcaje. En la Fig. 4.21 (A),
se muestra el resultado de la detección por luminometría de las especies de la Rho
marcada con biotína y reveladas con el sustrato quimioluminiscente (Supersignal)
para la avidína-HRP.
Fig. 4.21 Marcaje con biotína
de las membranas SEBLav. A)
muestra la placa de rayos X con
el resultado de la detección por
luminometría
de
los
SEB
biotinilados. La membrana de
nitrocelulosa conteniendo a los
SEBLav marcados con biotína fue
revelada con avidína-HRP y el
sustrato quimioluminiscente para
la
peroxidasa.
Los
SEB
biotinilados (línea 1); SEB no
tratados con biotína (línea 2). B)
La misma membrana utilizada
para la detección de proteínas
biotiladas por luminometría, se
utilizó para la inmunotinción de la
Rho en los SEB biotinilados,
usando en anticuerpo monoclonal
1D4. En B se demuestra la
presencia de la Rho en las
muestras de los SEB tratadas y
no tratadas con biotína
92
Nótese la aparición de una banda reactiva de proteína biotinilada migrando
con una masa molecular aparente de ~ 35 kDa (Fig. 4.21 A, línea 1). Este resultado
evidenció la presencia de la marca de biotína concentrada en una única especie de
proteína a nivel de las membranas de los SEBLav. Como era de esperarse, ninguna
proteína biotinilada fue detectada a nivel de la línea 2 (Fig. 4.21, A) sembrada con las
membranas SEBLav no tratadas con NHS-biotína. Sin embargo, cuando la misma
membrana utilizada para el análisis por luminometría fue sometida a inmunotinción
utilizando el anticuerpo monoclonal 1D4, se pudo evidenciar como ambas muestras
de membranas de los SEBLav presentaron especies inmunoreactívas con el
anticuerpo monoclonal anti-rodopsina (ver Fig. 4.21 B, líneas 1 y 2). Nótese, como
las bandas inmunoreactívas al anticuerpo fueron detectadas migrando a ~ 35 kDa,
coincidente con la banda biotinilada evidenciada el la Fig. 4.21 A. Este resultado
indicó que la banda detectada por luminometría correspondía a la Rho-biotinilada
luego del marcaje.
Por otra parte se realizó el marcaje de la Rho en membranas de los SEB
intactas con [J-32P], siguiendo las condiciones experimentales definidas en la sección
3.2.8.2 de Procedimientos experimentales. Este procedimiento fue llevado a cabo en
una reacción de fosforilación endógena de las membranas intactas incubadas con la
mezcla de fosforilación y en presencia de luz. En la Fig. 4.22, se muestra el análisis
por autorradiografía en placas de rayos X, de una alícuota de la reacción de
fosforilación, separada por EGPA-SDS y electrotrasferida a un filtro de nitrocelulosa,
el cual fue expuesto a la película autorradiográfica por 12 h a -80 °C. Nótese en la
Fig. 4.22, la detección de una banda fosforilada mayoritaria migrando con una masa
molecular aparente de ~ 35 kda, representando a la especie de Rho* y fosforilada
(R1) presente en las membranas SEB. Bandas fosforiladas adicionales fueron
detectadas migrando a ~ 75 KDa y 105 kDa, probablemente correspondientes a
especies, diméricas (R2), y triméricas (R3) de este fotorreceptor en presencia de luz,
respectivamente.
93
32
Fig. 4.22 Marcaje con [J- P]ATP de
las membranas intactas de los
SEB. La autorradiografía muestra el
resultado
de
la
reacción
de
fosforilación
endógena
de
las
membranas
intactas de los SEB
incubadas con [J-32P]ATP y en
presencia de luz. R1, R2, R3, indican
la
aparición
de
especies
monoméricas, diméricas y trimeritas
fosforiladas, respectivamente.
4.5.2 Generación de la mezcla de opsinas desnaturalizadas marcadas
diferencialmente.
Las rodopsinas marcadas diferencialmente con biotína o
[J-32P], aun
embebidas en las membranas, fueron mezcladas en proporción molar 1:1, para
generar una mezcla de membranas híbridas, las cuales fueron sometidas a un
procedimiento de blanqueo (remoción del retinal unido a la Rho), con hidroxilamina
en presencia de luz. La mezcla de membranas conteniendo opsinas híbridas
marcadas con biotína o
[J-32P], fue sometida a solubilización en condiciones
agresivas con SDS al 0.1 %, para de esta forma garantizar la desnaturalización
completa de las moléculas de opsinas marcadas diferencialmente.
La mezcla de opsinas marcadas diferencialmente y desnaturalizadas fueron
sometidas a cromatografía de filtración en gel sobre una resina de Sephadex G-15
previamente equilibrada en Buffer Rho, con el fin de reducir al máximo la cantidad de
detergente presente en el medio de solubilización. La elución de las opsinas
solubilizadas
y
filtradas
desde
la
Sephadex
G-15,
fue
seguida
94
espectrofotometricamente a 280 nm y el perfil de elución se muestra en la Fig. 4.23
A. Nótese que, en concordancia con el bajo rango de exclusión de la matriz
empleada, las opsinas marcadas eluyeron de forma temprana, evidenciado por la
aparición
de un pico único y agudo de proteínas (opsinas), ubicado muy
puntualmente a nivel de las fracciones 6 y 7 (flechas negras, en el cromatograma de
la Fig. 4.23 A). Dado que la mezcla cromatografiada y parcialmente desprovista de
SDS contenía las dos poblaciones de opsinas, se realizó la detección en simultaneo
de ambas marcas en las fracciones eluídas de la Sephadex G-15. En la Fig. 4.23 B,
se muestra el resultado de la tinción con sustrato precipitable para la avidína-HRP
(diaminobenzidína), de una membrana de nitrocelulosa conteniendo las proteínas de
las fracciones 5-13.
Fig. 4.23 Filtración molecular en Sephadex G-15 de la mezcla de opsinas desnaturalizadas marcadas
32
diferencialmente con biotína o [J- P]ATP. A) Registro espectrofotométrico a 280 nm de las fracciones eluídas
de la columna de Sephadex G-15 conteniendo la mezcla de opsinas desnaturalizadas y diferencialmente
marcadas. La flecha indica el pico máximo de elusión de la mezcla de proteínas marcadas (fracciones 6 y 7). B)
Las fracciones eluídas fueron sometidas a detección de proteínas biotiniladas en membranas de nitrocelulosa. La
flecha indica la presencia de opsina biotinilada en las fracciones 6 y 7. C) la membrana utilizada para la
detección de proteínas biotiniladas, fue expuesta a una placa de autorradiografía por 12 h a -70 °C, para la
detección del pico máximo de elución de las opsinas fosforiladas, el cual también correspondió a las fracciones 6
y 7.
95
Nótese como, en concordancia con el registro espectrofotométrico a 280 nm, la
fracción opsina-biotína de la mezcla, eluyó casi totalmente en las fracciones 6 y 7.
Por otra parte, cuando las mismas fracciones fueron analizadas por EGPA-SDS,
transferidas a filtros de nitrocelulosa y expuestas a placas de rayos X, se logró
visualizar las bandas de opsinas fosforiladas con >J-32P]. Nótese en la Fig. 4.23 C,
como nuevamente las fracciones 6 y 7 contenían el pico de opsinas fosforiladas.
Evidentemente estos resultados indicaron que como se esperaba, las opsinas
diferencialmente marcadas y con iguales pesos co-eluyeron en la cromatografía de
exclusión realizada sobre la Sephadex G-15, ahora en ausencia del detergente SDS.
4.5.3 Intento de renaturalización de las opsinas marcadas diferencialmente con
biotína o [J-32P] en presencia de 11-cis-retinal.
Para la obtención de posibles dímeros de Rho nativa conformados de una
combinación estequiométrica 1:1 de monómeros de Rho-biotína / Rho-[J-32P], se
planteó la renaturalización de dichas opsinas mezcladas a su estado de Rho nativa
en oscuridad, usando al cromóforo 11-cis-retinal. Para ello se procedió a precipitar a
las opsinas con acetona fría, siguiendo la metodología descrita en la sección 3.2.9.4.
El sobrenadante de opinas resultante fue resuspendido en Buffer Rho + 0.1 % DM, e
incubado por 48 h a 37 °C, en oscuridad y agitación constante, en presencia de un
exceso del retinal de ~ tres veces la cantidad de opsinas presentes. Posterior a la
incubación de las opsinas con el retinal, se procedió a la realización de un espectro
UV/Vis en el rango de 250-650 nm, para verificar la reformación de las Rho híbridas
a su condición nativa en oscuridad. De este procedimiento, se esperaba la
reformación de varios tipos de dímeros de Rho marcados, es decir: dímeros
homogéneos de Rho-biotína (R2, tipo biotína), dímeros homogéneos de Rho-[J-32P]
(R2, tipo [J-32P]) y los dímeros híbridos de interés para la reacción de co-precipitación
con Steptavidina-agarosa
(Rho-biotína/Rho-[J-32P]. El espectro UV/vis registrado
sobre la mezcla de opsinas sometida a renaturalización, no evidencio la aparición de
especies reformadas de Rho nativa absorbiendo a 498.5 nm (datos no mostrados). El
espectro UV/Vis registrado, únicamente evidencio la aparición de dos picos, uno a
379.5 nm, correspondiente con la absorbancia del 11-cis-retinal adicionado en
96
exceso para el proceso de renaturalización. El segundo pico fue detectado a 280 nm,
correspondiente con la presencia de opsinas en la mezcla absorbiendo a esa
longitud de onda. Con estos resultados, fue evidente que la proteína no pudo ser
renaturalizada luego del tratamiento con SDS. Adicionalmente, es oportuno señalar
que la renaturalización de este tipo de proteínas integrales de membrana pudieran
requerir de la presencia de lípidos en el medio de renaturalización.
Dado que no se consiguió la reformación de la Rho nativa a partir de
incubación de sus precursores en oscuridad (opsina + 11-cis-retinal), se descartó la
realización del procedimiento final de co-precipitación del dímero híbrido (Rhobiotína/Rho-[J-32P]), a partir de la unión por afinidad de su porción Rho-biotína a una
matriz de Steptavidina-agarosa.
4.6
EFECTOS
DEL
ENTRECRUZAMIENTO
QUÍMICO
SOBRE
LA
FUNCIONALIDAD DE LA RODOPSINA.
4.6.1 Fotoisomerización del retinal unido la Rho control o entrecruzada con
sulfo-SMCC en función del tiempo.
La propensidad de la Rho a sufrir entrecruzamiento químico con los agentes
sulfo-SMCC, MBS, o-PDM, p-PDM y su susceptibilidad para la inducción de la
formación de enlaces de disulforo por glutationilación en presencia de diamida y
GSH, resultó en una prueba preliminar de la capacidad de este receptor para existir
como entidades diméricas o multiméricas en su estado nativo. En este sentido, el
evento químico de intercalación y unión covalente de un reactivo entrecruzador entre
dos aminoácidos apropiados, espacialmente ubicados a las distancias adecuadas
entre dos moléculas de Rho que se encuentren interactuando en estadio nativo, o
bien entre residuos ubicados dentro de la misma proteína; podría ejercer interesantes
efectos de tipo constrictivo para el proceso de captación de un fotón de luz y la
subsiguiente activación del receptor por la conocida isomerización del retinal unido
covalentemente a la Lys296 (11-cis-retinal) (Dratz y Hargrave, 1983). Para medir
estos efectos, las membranas SEBLav fueron tratadas en oscuridad con 5 mM del
agente entrecruzador sulfo-SMCC. Las rodopsinas entrecruzadas (Rho-SMCC),
97
fueron selectivamente solubilizadas en presencia del detergente OTG y sometidas a
un estudio espectrofotométrico para evaluar la fotoisomerización del retinal unido, en
función de tiempos variables de iluminación. En la Fig. 4.24, se muestra la cinética de
fotoisomerización del retinal unido a la Rho control (no tratada con el entrecruzador).
Fig. 4.24 Fotoisomerización del retinal unido a la Rho no entrecruzada. La Rho fue solubilizada
desde las membranas SEBLav con el detergente OTG. La proteína purificada fue sometida a periodos
variables y sumativos de iluminación intensa. Tiempo de iluminación cero (Rho nativa) (espectro en azul);
5 seg de iluminación (espectro en negro); 20 seg de iluminación (espectro en verde); 45 seg de
iluminación (espectro en rojo); 60 seg de iluminación (espectro en fucsia). La flecha en azul señala el pico
máximo de absorción de la Rho en oscuridad (498.5 nm). La flecha en rojo indica la formación de
especies de Rho* como producto del cambio conformacional sufrido por luz de la proteína fotorreceptora.
La flecha en el medio de ambos picos máximos de absorbancia representa al punto de inflexión común
para todos los espectros a tiempos variables de isomerización.
El espectro UV/Vis realizado a tiempo de iluminación cero, mostró claramente
la aparición de un pico a 498.5 nm, correspondiente a la Rho en estado nativo
(cabeza de flecha en azul). La irradiación inicial de la muestra de Rho con luz intensa
(5 seg de iluminación), permitió evidenciar el inició el proceso de isomerización,
claramente visualizado en el espectro por una reducción esperada del pico de 498.5
nm, concomitante con la aparición de un pico de especies absorbiendo a la longitud
de onda de 380 nm, correspondiente con la formación de cantidades moderadas de
la especie metarodopsina II o Rho* (cabeza de flecha en negro). Nótese en la Fig.
98
4.24, como a medida que se realizaron los periodos sumativos de iluminación intensa
de la muestra de Rho control [20 seg (cabeza de flecha en verde), 45 seg (cabeza de
flecha en rojo), 60 seg (cabeza de flecha en fucsia) y 1 min (rojo)], se evidenció una
desaparición progresiva del pico a 498.5 nm, traduciéndose en un incremento del
pico a 380 nm (formación de las especies de Rho* a expensas de la Rho nativa). Es
importante destacar que para la población de Rho control, la cinética de
fotoisomerización del retinal unido, fue enteramente completada al minuto de
irradiación intensa de la muestra, es decir, se notó una completa desaparición de la
Rho nativa (absorbiendo a 498.5 nm), al minuto de iluminación, correspondiéndose
esto con una completa formación de Rho* (absorbiendo a 380 nm) a ese mismo
tiempo. En la Fig. 4.24, también se pudo notar como la progresión de la Rho a Rho*
fue un proceso casi directo y rápido, en el cual, no se evidenció la aparición visible en
los espectros, de ninguno de los fotointermediarios del fotorreceptor, formados entre
los estados absorbiendo a 498.5 nm y 380 nm. Esto se infiere por la presencia de un
punto de inflexión casi idéntico para todos los espectros en el rango de Abs de ~ 450
– 470 nm (ver Fig. 4.24).
En cuanto a la Rho-sulfoSMCC, en la Fig. 4.25, se muestran solo dos
espectros UV/Vis. El primer espectro corresponde al tiempo de iluminación cero. Allí
se muestra claramente la aparición de un pico a 498.5 nm, correspondiente a la
Rho–SMCC en estado nativo (Rho-Sulfo-SMCC). El sometimiento de esta fracción al
primer periodo de iluminación intensa (5 seg), promovió la formación de un
precipitado turbio que opaleció la solución de proteína entrecruzada a ser medida
espectrofotometricamente.
Sin
tenerse
detalles
de
la
ocurrencia
de
esta
precipitación, es probable que la presencia de un exceso del entrecruzador y el
hecho de que la reacción fuera realizada en presencia de OTG a pH 5.0 y a 4°C,
pudieran haber afectado directamente la solubilización del entrecruzador en el medio
de la reacción. Considerando la ocurrencia de dicho precipitado en el medio de la
reacción, luego de la iluminación intensa de una nueva fracción de Rho-SMCC por
un tiempo de 1 min, la muestra fue centrifugada y la fracción sobrenadante fue
99
inmediatamente sometida a un espectro UV/Vis a 4°C. El espectro es mostrado en la
Fig. 4.25 (Rho*-Sulfo-SMCC)
Fig. 4.25 Fotoisomerización del retinal unido a la Rho entrecruzada con sulfo-SMCC. La Rho
embebida en membranas de los SEBLav fue entrecruzada con 5 mM sulfo-SMCC y posteriormente
solubilizada y purificada en presencia del detergente OTG. La Rho-sulfoSMCC fue sometida a un espectro
UV/Vis a tiempo cero de iluminación. La flecha en negro muestra el pico máximo de absorción a 498.5
(Rho-sulfo-SMCC). El espectro identificado como Rho*-sulfo-SMCC, corresponde a la fotoisomerización del
retinal unido a la Rho-sulfoSMCC luego de un periodo de 1 min de iluminación intensa y posterior
centrifugación de la fracción de Rho solubilizada e iluminada. La flecha en rojo indica el bloqueo del
cambio conformacional de la Rho iluminada con la aparición de un pico máximo de absorbancia a 470 nm,
correspondiente al fotointermediario (BSI o a la Meta I ), estabilizado por la reacción de la Rho con el
sulfo-SMCC.
Un espectro completamente alterado fue obtenido a partir de la Rho-SMCC
iluminada. El espectro señalado con la flecha roja en la Fig. 4.25, indicó directamente
varias cosas. En primer lugar y a diferencia de la Rho control, se pudo notar como la
Rho*-sulfoSMCC presentó una incapacidad evidente para progresar desde su estado
nativo a la forma Meta II. Luego de un minuto de iluminación, no se detectó en el
espectro la formación de ninguna especie absorbiendo a 380 nm (Rho*-SMCC). Sin
embargo fueron obtenidas evidencias claras del inicio de la fotoisomerización del
retinal unido a la Rho-SMCC, ya que se pudo detectar una reducción importante de
estas especies absorbiendo a 498.5 nm. Interesantemente, también pudo ser notado
a partir del espectro de la Rho-SMCC luego de 1 min de iluminación, que el
entrecruzamiento de la proteína retiene la progresión del cambio conformacional de
la Rho-SMCC en una especie fotointermediaria que absorbe a ~ 470 nm (indicado
100
con flecha). Estos resultados apuntaron a la ocurrencia de posibles eventos de
entrecruzamiento intermolecular de dímeros nativos de Rho, o bien la ocurrencia de
entrecruzamientos intramoleculares ó modificaciones monofuncionales, ambos
eventos al nivel de los monómeros de Rho. En cualquiera de los casos, la presencia
del entrecruzador estaría ejerciendo un efecto de bloqueo para el movimiento y
rotación de las hélices transmembranales del receptor, necesario para la ocurrencia
del cambio conformacional inducido por la luz.
Dado que la absorbancia a 280 nm de la Rho-sulfoSMCC (tiempo cero de
iluminación) y de la Rho*-sulfoSMCC (60 seg de iluminación), no varió a pesar de la
formación del precipitado en la mezcla de reacción a las condiciones del ensayo, se
pudo deducir que el precipitado evidenciado y descrito al inicio de estos resultados,
no correspondía a la Rho entrecruzada e iluminada. Evidentemente, las condiciones
de pH, y la temperatura incidieron desfavorablemente en la solubilización del exceso
del entrecruzador que no interaccionó con la proteína.
Basado en los resultados anteriores, se decidió visualizar en geles de
poliacrilamida-SDS a la fracción Rho-SMCC, para determinar si la reacción de
entrecruzamiento de la Rho fue de tipo estequiométrico, o si la fracción se
encontraba compuesta de una mezcla de especies diméricas de Rho entrecruzada
(R2)
y
monómeros
modificados
monofuncionalmente
o
entrecruzados
intramolecularmente con el agente entrecruzador. Estas posibilidades eran
completamente factibles y en cualquier caso aportarían información del por que, esta
fracción fue incapaz de sufrir el cambio conformacional característico desde la Rho a
la Rho*.
En la Fig. 4.26, se muestra el gel de poliacrilamida-SDS teñido con plata, en el
cual se evidencia la presencia de especies diméricas (R2) de Rho-SMCC, migrando
a ~ 75 kDa (Fig. 4.26, línea 1). De igual manera y en la misma fracción fueron
evidenciadas especies de Rho monomérica (R1), migrando a ~ 35 kDa (Fig. 4.26,
línea 1). Nótese como en la línea 1, también se evidenció una ligera variación del
peso molecular de las especies R1 en presencia del agente sulfo-SMCC, en
comparación a la migración de las mismas especies en ausencia de entrecruzador
(Fig. 4.26, línea 2). Este hecho fue muy similar a lo observado en las reacciones de
101
cinética de entrecruzamiento en función del tiempo de la Rho tratada con agentes
entrecruzadores (sección 4.2.3). La ligera variación en el peso molecular de las
especies R1 en presencia de sulfo-SMCC, sugirió la existencia de monómeros
modificados monofuncionalmente o entrecruzados intramolecularmente.
Fig. 4.26 Evaluación por EGPA-SDS de la
Rho
entrecruzada
con
sulfo-SMCC
restringida para el cambio conformacional
dependiente de la luz. Se muestra el
resultado de la reacción de entrecruzamiento
con sulfo-SMCC de la Rho embebida en
membranas de los SEBLav, y su posterior
purificación con OTG. Los SEBLav control
incubados con buffer de entrecruzamiento
(ausencia de sulfo-SMCC), o bien incubados
con 5 mM de sulfo-SMCC, son mostrados en
las líneas 1 y 2, respectivamente. Las líneas
3 y 4 representan al producto de la
solubilización y purificación de la Rho desde
las membranas SEBLav(control) y las
entrecruzadas
con
sulfo-SMCC,
respectivamente. Las proteínas separadas
en EGPA-SDS fueron visualizadas por
tinción con plata. R1 y R2 = productos
monoméricos y diméricos de la Rho,
respectivamente.
1
2
3
4
Como era de esperarse, la Rho proveniente de membranas SEBLav “no
tratadas” con el entrecruzador, resultó en especies de tipo R1 exclusivamente (Fig.
4.26, línea 2).
En este sentido, aunque se pudo evidenciar que la reacción de
entrecruzamiento fue de tipo no estequiométrico, la presencia de especies de RhoSMCC
diméricas
(R2)
y
monómeros
(R1)
modificados
o
entrecruzados
intramolecularmente con el entrecruzador, permitirían explicar la incapacidad de la
fracción Rho-SMCC de sufrir el cambio conformacional característico de Rho a Rho*
en presencia de luz.
102
4.7 Protección de las Cys y Lys involucrados en el entrecruzamiento químico
de la Rho con sulfo-SMCC, mediante modificadores sitio-específicos
Para las reacciones de modificación sitio-especifica de los residuos de Cys y
Lys tentativamente involucrados en las reacciones de entrecruzamiento químico de la
Rho con el agente sulfo-SMCC y los demás agentes entrecruzadotes bifuncionales
usados aquí, fueron seleccionados los siguientes modificadores: 1) para la
modificación de Cys con un grado considerable de especificidad, se selecciono al
modificador N-etilmaleimida (Gregory, 1955; Leslie, 1965; Gorin y col., 1990). Esta
maleimida es capaz de reaccionar con los grupos sulfidrílos de estos residuos
mediante una reacción de adición nucleofílica (Lundblad, 2005). 2) La modificación
sitio-específica de residuos ácidos tipo Lys se realizó con los compuestos anhídrido
acético (AA) y fenil-isotiocianato (Pit C), los cuales tiene la capacidad de reaccionar
con el grupo amino de la Lys en su forma desprotonada (Lundblad, 2005). Las
reacciones de modificación fueron llevadas a cabo en dos pasos: en una primera
etapa se realizó la pre-incubación de la Rho (1.28 PM) con 5 mM de los agentes
modificadores específicos por separado (NEM, Pit C y AA), bajo las condiciones
señaladas en la sección de Procedimientos Experimentales. Luego de que la
reacción de modificación monofuncional tuviera lugar, se procedió a incubar cada
mezcla de reacción con el agente entrecruzador sulfo-SMCC. En la Fig. 4.27, se
muestra el gel de poliacrilamida-SDS teñido con plata resultante de estas reacciones.
Nótese como la pre-incubación de la Rho con NEM, inhibió la reacción posterior de
entrecruzamiento bifuncional con el agente sulfo-SMCC (ver línea 5). Al comparar
este resultado con aquel obtenido de la Rho entrecruzada directamente con sulfoSMCC (línea 3), se pudo notar que la cantidad de la forma dimérica (R2) observada
en la línea 5, fue despreciable. Similarmente, cuando la Rho fue pre-incubada con el
agente modificador de residuos de Lys (Pit C) y posteriormente sometida a reacción
de entrecruzamiento bifuncional con sulfo-SMCC (línea 8), se pudo notar como
nuevamente se inhibió la formación de especies R2 de Rho-sulfoSMCC, tomando
nuevamente como punto de referencia a la Rho directamente tratada con el
entrecruzador (línea 3). Estos resultados sugirieron claramente que los reactivos
NEM y Pit C tienen la capacidad intrínseca de modificar químicamente y de forma
103
especifica a los residuos de Cys y Lys respectivamente, involucrados en la reacción
de entrecruzamiento bifuncional con el agente sulfo-SMCC que los compromete.
Fig. 4.27 Modificaciones químicas de residuos de Cys y Lys involucrados en las reacciones de
entrecruzamiento con el sulfo-SMCC. La Rho purificada en OTG (1.28 PM), fue pre-incubada con los
modificadores N-etilmaleimida (NEM) para la modificación de residuos de Cys, o con fenil-isotiocianato (Pit C) o
anhídrido acetico (AA), para la modificación de residuos de Lys, por 1 h a 37 °C. Los modificadores estuvieron a
una concentración de 5 mM. Las Rho modificadas fueron incubadas con 5 mM sulfo-SMCC, por 1 h a 37 °C. Las
reacciones fueron cargadas en su totalidad para la EGPA-SDS. Las proteínas separadas fueron visualizadas por
tinción con plata. La Rho pre-incubada con NEM, Pit C, y AA y posteriormente sometidas a entrecruzamiento con
sulfo-SMCC (líneas 5, 8 y 9), respectivamente. Rho pre-incubada simultáneamente con NEM y AA o NEM y Pit
C, y posteriormente incubadas con sulfo-SMCC (líneas 10 y 11), respectivamente. Como controles de migración
de la Rho no tratada, se muestra a la Rho purificada en OTG (línea 1) y la Rho en buffer de reacción (línea 2).
Como controles de la reacción de modificación, se presenta a la Rho incubada con NEM, Pit C o AA (líneas 4, 6
y 7, respectivamente). Control de entrecruzamiento, Rho incubada con el sulfo- SMCC (línea 3). M, estándares
de peso molecular. R1 y R2 = productos monoméricos y diméricos de la Rho entrecruzada, respectivamente. Las
cabezas de flecha en negro, representan dímeros entrecruzados. Las cabezas de flecha en rojo, representan la
presencia de dímeros en los controles.
Esto, en función de que, posterior a la reacción de modificación de cada
residuo por separado, ningún entrecruzamiento aparente en la Rho modificada fue
evidente. Contrariamente a lo evidenciado con el modificador de Lys, Pit C, el
reactivo AA fue incapaz de modificar los residuos de Lys que están directamente
involucrados en las reacciones de entrecruzamiento con sulfo-SMCC. Esto, fue
evidente dado que, posterior a la pre-incubación de la Rho con el AA, y su ulterior
incubación con el entrecruzador (línea 9), fue observada la aparición de especies R2
de las Rho-SMCC entrecruzadas (cabeza de flecha en negro, línea 9): Estas
104
especies R2 fueron de movilidad y cantidad muy similar a las formadas en el control
de Rho tratada únicamente con sulfo-SMCC (línea 3). Controles para la reacción de
modificación de Rho con cada agente por separado fueron llevados a cabo y son
mostradas en las líneas: 4, 6, y 7 (ver leyenda de la Fig. 4.27). La comparación de la
migración de las especies R1 correspondientes a los monómeros de Rho control
[incubada en agua o buffer fosfato 10 mM (pH 7.2)], (líneas 1 y 2), con las especies
R1 evidenciadas en los controles de modificación (líneas 4, 6, y 7), evidenció una
muy ligera variación del peso molecular de las especies modificadas en los residuos
de Cys y Lys, las cuales se mostraron como especies R1 de movilidad ligeramente
mas retardada. Este hecho sugirió adicionalmente y de forma indirecta que la Rho
fue efectivamente modificada por cada uno de los agentes. Las reacciones control de
modificación y la Rho control en agua o en buffer, mostraron la pre-existencia de una
pequeña cantidad de dímeros migrando a ~ 75 kDa (Líneas 1 y 2, cabeza de flecha
en rojo), en una región de migración muy próxima a las especies R2 de Rho-SMCC,
pero en menor concentración a las especies R2 correspondientes a la Rho-SMCC.
Finalmente, en la Fig. 4.27 (línea 11), se muestra el resultado del pre-tratamiento de
la Rho con los agentes modificadores NEM y Pit C en simultáneo, y su posterior
incubación con el entrecruzador sulfo-SMCC. Nótese como la combinación de las
dos reacciones de modificación monofuncionales realizadas simultáneamente,
efectivamente permite el bloqueo de ambos residuos activamente involucrados en la
reacción de entrecruzamiento de dímeros de Rho, lo cual inhibió la intercalación del
reactivo entrecruzador por ocupación de los residuos de Cys y Lys involucrados en
dicha reacción. Esto fue evidente por una ausencia de especies R2 de Rho-SMCC
en la región esperada (línea 11). El pre-tratamiento en simultáneo de la Rho con
NEM y AA, y su posterior incubación con sulfo-SMCC, como era de esperarse, no
inhibió la reacción de entrecruzamiento de la Rho (línea 10). Nótese como las
especies R2 de Rho-SMCC fueron formadas. Esto probablemente fue debido a que
el AA fue incapaz de modificar al menos las Lys involucradas en la reacción de
entrecruzamiento químico, no pudiendo ejercer el efecto de bloqueo de las mismas,
previo a la reacción de estas con el sulfo-SMCC.
105
4.8 Medición de la actividad de unión de GMPpNp de la T por la Rho
entrecruzada con sulfo-SMCC.
Una fracción de Rho-SMCC obtenida de forma idéntica a aquella utilizada para
la medición de los espectros UV/Vis, fue tomada para la ejecución de los ensayos de
unión de [3H]GMP-pNp, a la T activada por Rho en presencia de luz. Brevemente, las
membranas SEBLav fueron tratadas con 5 mM del entrecruzador sulfo-SMCC y
posteriormente solubilizadas en presencia del detergente OTG. En la Fig. 4.28, se
muestra una gráfica de la actividad de unión en cpm de [3H]GMP-pNp a la T
heterotrimérica activada bien sea por la Rho control “no tratada” con el entrecruzador
(barra identificada como Rho) o por la Rho-SMCC. De este ensayo fue evidente que,
el tratamiento de la Rho con el agente entrecruzador sulfo-SMCC, resultó en una
pérdida total de la capacidad de la proteína entrecruzada para activar la capacidad
de unión de [3H]GMP-pNp a la T heterotrimérica en presencia de luz. A partir de los
datos presentados en la Fig. 4.28, la normalización de un total 6.500 cpm de
[3H]GMP-pNp unido a la T, lo cual representó el 100 % de actividad inducida por el
control, puso en evidencia que la Rho-sulfoSMCC activó dicha capacidad de unión
de [3H]GMP-pNp a la T, en escasamente un 2.3 %, es decir, el entrecruzamiento de
la Rho con sulfo-SMCC provocó la perdida de un 97.3 % de su capacidad para
inducir el intercambio de nucleótidos de guanina de la T dependiente de la luz. Estos
resultados estuvieron en plena concordancia con hallazgos previamente presentados
aquí, en los cuales fue demostrado que la Rho-sulfoSMCC presenta una incapacidad
notoria para sufrir un adecuado cambio conformacional en presencia de la luz, como
consecuencia de una incompleta isomerización del retinal unido. Adicionalmente
estos resultados apuntan a la probabilidad cierta de que modificaciones
monofuncionales o entrecruzamientos intramoleculares tienen lugar durante las
reacciones de entrecruzamiento de la Rho con el agente sulfo-SMCC.
106
3
Fig. 4.28 Activación dependiente de la luz de la actividad de unión de [ H]GMPpNp de la T por la Rho
entrecruzada con sulfo-SMCC. La Rho control y la Rho-sulfoSMCC, fueron incubadas con la T, bajo
3
iluminación y en presencia de [ H]GMPpNp. La actividad de unión del análogo no hidrolizable fue ensayada
por filtración en membranas Millipore de acuerdo a lo descrito en Procedimientos experimentales. Los
experimentos realizados con la Rho no entrecruzada purificada en OTG representan el control de 100 % de
3
actividad de unión de [ H]GMPpNP a la T. Rho-sulfo-SMCC, representa la actividad de unión de la Rho
entrecruzada con el sulfo-SMCC.
107
4.9 EFECTO DE LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE DM in vitro SOBRE LA
ESTRUCTURA CUATERNARIA DIMÉRICA DE LA RODOPSINA.
4.9.1 Disociación de los dímeros nativos de Rho a altas concentraciones de
detergente.
Dado que, bajo las condiciones bioquímicas experimentales utilizadas en esta
investigación, en todos los casos se evidenció la ocurrencia de la Rho nativa o
fotoactivada en arreglo dimérico constitutivo, se planteo la necesidad de poder forzar
el aislamiento del fotorreceptor en una condición monomérica in vitro, con miras a la
estandarización de la técnica para el aislamiento de monómeros de Rho con miras a
la realización de ensayos de entrecruzamiento intramolecular de los mismos y la
realización subsiguiente de proteolisis parciales con termolisina. Para el posible
aislamiento de especies monoméricas de la Rho, se hizo uso de la metodología
planteada por Jastrzebska y col. (2004). En este sentido se procedió a realizar el
marcaje de la Rho embebida en membranas de los SEBLav utilizando NSH-biotina o
el modificador de residuos de cisteína N-etilmaleimida marcado radiactivamente con
tritio ([3H]-NEM). La Rho marcada con biotína (Rho-biotína) o marcada con [3H]-NEM
(Rho-[3H]-NEM), presente en las membranas SEBLav, fue sometida a solubilización
en presencia de altas concentraciones de DM (10 % = 19.6 mM). Cada población de
Rho marcada diferencialmente y por separado, fue sometida a procedimientos de
cromatografía de filtración en gel en una columna de Sephacryl S-300, previamente
equilibrada en buffer de elución conteniendo 10 mM DM. Una vez equilibrada la
columna se realizó la elución de la Rho-biotína y Rho-[3H]-NEM corridas por
separado. Dichas eluciones fueron seguidas espectrofotometricamente a 498.5 nm, y
los perfiles de elución son mostrados en la Fig. 4.29 (A y B), respectivamente.
Nótese como el pico de elución de la Rho-biotína se ubicó a nivel de las fracciones
41-43 (flecha en negro, perfil A), mientras que la Rho-[3H]-NEM, eluyó en las
fracciones 57-59 (flecha en negro, perfil B). Adicionalmente, el pico de elución de las
especies de Rho-biotína, fue monitoreado por técnicas específicas para la detección
de proteínas biotiniladas transferidas a membranas de nitrocelulosa (Fig. 4.30).
108
3
Fig. 4.29 Cromatograma de la filtración en gel de las Rho-biotína y Rho-[ H]NEM. Rho-biotína y
3
Rho-[ H]NEM, fueron solubilizadas en 20 mM DM y cromatografiadas por separado en una columna de
Sephacryl S-300 en presencia de 10 mM DM. El seguimiento de la elución desde la Sephacryl S-300 de
3
la Rho-biotína y la Rho-[ H]NEM, fue realizado a 498.5 nm (A y B, respectivamente).Las flechas indican
3
el pico máximo de elución de la Rho-biotína (A, fracciones 41-43) y para la Rho-[ H]NEM (B, fracciones
57-59).
109
Fig. 4.30 Detección de la Rho-biotína eluída de la Sephacryl S-300 en presencia de 10 mM DM. Las
fracciones que registraron el pico de absorbancia a 498.5 nm (36-46), fueron sometidas a EGPA-SDS,
transferidas a filtros de nitrocelulosa y reveladas con avidína-HRP y diaminobenzidína. La flecha indica la
detección de la Rho-biotína migrando con masa molecular aparente de 35 kDa. El circulo en negro señala
las fracciones con mayor detección de Rho biotinilada (pico de elución en fracciones 41-43).
La elución de la Rho-[3H]-NEM, se siguió por el contaje de la radioactividad
dependiente del tritio presente en el reactivo modificador de Cys unido a la Rho. La
grafica de radioactividad de tritio (cpm) versus el numero de fracción, es mostrado en
la Fig. 4.31. Nótese como la detección física del pico de elución de cada especie de
Rho marcada diferencialmente, coincidió con el registro espectrofotométrico a 498.5
nm. La detección del pico de elución de cada especie sirvió para el calculo de los
respectivos volúmenes de elución (Ve) de la Rho-biotína y la Rho-[3H]-NEM.
110
3
Fig. 4.31 Registro de la radioactividad de [ H]NEM (cpm) incorporada a la Rho eluída de la Sephacryl
S-300 en presencia de 10 mM DM. Una alícuota de 30 PL de las fracciones que registraron el pico de
absorbancia a 498.5 nm (50-63), fueron mezcladas con liquido de centelleo y analizadas en un contador de
3
centelleo liquido. La gráfica muestra la incorporación de [ H]NEM a la Rho en cpm vs. el numero de fracción.
La flecha indica el pico máximo de radioactividad de tritio correspondiente con el pico de elución de la Rho3
[ H]NEM (fracciones 57-59).
A partir del Ve de cada especie de Rho marcada, se calculó el coeficiente de
partición (Kav) de las mismas. Posteriormente y usando una curva de calibración del
Kav versus el Log del peso molecular de los estándares de calibración, se procedió a
calcular empíricamente los tamaños de las Rho-biotína y la Rho-[3H]-NEM por
interpolación de los valores de Kav de estas proteínas acomplejadas con el
detergente. Dado que las Rho marcadas diferencialmente estuvieron en presencia de
altas concentraciones de DM (por encima de la CMC), era de esperarse que dicha
proteína estuviera inserta dentro de micelas del detergente. En este sentido la masa
molecular resultante luego de la sustracción del peso molecular de una micela de DM
fue de 34.608 Da para la Rho-biotína y de 45.500 Da para la Rho-[3H]-NEM (ver Fig.
4.32, A y B).
111
Como se pudo ser notar, la solubilización y separación por filtración en gel de las
Rho marcadas diferencialmente, a altas concentraciones de DM, se constituyeron en
condiciones experimentales capaces de forzar la separación in vitro de los arreglos
diméricos nativos de la Rho, obteniéndose especies
que exhibieron pesos
moleculares promedios en el rango de 40.000. Estos pesos de Rho monomérica,
coincidieron con el peso molecular estimado para este fotorreceptor calculado a partir
de su secuencia primaria y considerando la composición de carbohidratos
adicionados post-trasduccionalmente al extremo N-terminal.
Fig. 4.32 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de los complejos Rho3
biotína:DM- y Rho-[ H]NEM:DM eludios de la Sephacryl S-300 en presencia de 10 mM DM. Se
muestra la curva de calibración entre el coeficiente de partición (Kav) de las proteínas estándares de peso
molecular conocido, señaladas en Procedimientos experimentales vs el Log del peso molecular de las
mismas, separadas en presencia de 10 mM DM. Las posiciones de elución de los complejos de Rho3
biotína:DM () (A) y Rho-[ H]NEM:DM (i) (B), fueron determinados como se muestra en las Fig. 4.30 y
4.31.
112
4.10 PROTEOLISIS CON TERMOLISINA DE LA RHO EN CONDICIÓN DIMÉRICA
O MONOMÉRICA.
La Rho nativa puede ser cortada en dos fragmentos grandes por efecto de la acción
endoproteolítica de la termolisina (Saari, 1974). Los fragmentos termolíticos
resultantes de la digestión del fotorreceptor fueron descritos como dos péptidos
denominados: F1, el cual comprende comprendiendo la extensión desde la Met1 a la
Ser240 (~ 26 kDa) y el F2 desde la Ala241 a la Pro327 (~12 kDa) (Hargrave, 1982). En
función de conocer si dicho patrón termolítico variaba cuando la Rho era disociada a
una condición monomérica por efecto de su aislamiento por filtración molecular en
gel en presencia de 10 mM DM, se procedió a realizar las reacciones de proteolisis
con termolisina de la Rho monomérica. Para la reacción de proteolisis se uso un
cociente
de Rho:termolisina de 20:1, a temperatura ambiente por 16 h. Como
control, se realizó en paralelo la reacción de proteolisis con termolisina de la Rho
dimérica nativa (aislada por filtración molecular en gel en presencia de 2 mM DM). La
Rho en su condición nativa debería generar los fragmentos termolíticos esperados
tipo F1 y F2 publicados por Hargrave (1982). En la Fig. 4.33 se muestra el gel de
poliacrilamida-SDS al 15 % teñido con plata, resultante de la electroforesis de las
reacciones de proteolisis. En las líneas 1 y 2, se muestra el perfil electroforético de
las fracciones de la Rho monomérica y la Rho dimérica aisladas por filtración en gel
usando una resina de Sephacryl S-300, en presencia de 10 mM o 2 mM DM,
respectivamente. Nótese como en concordancia con lo descrito en la sección 4.7.1,
la cromatografía de exclusión molecular de la Rho en presencia de 10 mM DM,
efectivamente logró disociar la condición oligomérica del receptor a un estado
monomérico artificial. Esto fue visualizado por la ausencia en la fracción de Rho
monomérica (línea 1) de especies de tipo dimérica (R2) o triméricas (R3) señaladas
con las flechas respectivas, las cuales estuvieron presentes en la fracción de Rho
dimérica (línea 2). Cuando la Rho monomérica o dimérica fue sometida a proteolisis
con termolisina (líneas 3 y 4, respectivamente), se pudo notar como la Rho
monomérica a diferencia de la Rho dimérica, fue solo parcialmente digerida por la
termolisina, generando un polipéptido de ~ 25 kDa. Este fragmento es coincidente
113
con el fragmento termolítico F1 publicado por Hargrave (1982) (ver Fig. 4.33, F1
señalado con la flecha roja). Sin embargo, nótese como una importante cantidad de
Rho monomérica fue resistente a la proteolisis. Contrariamente, la banda de 35 kDa
(R1) de la fracción dimérica fue completamente digerida durante la reacción. Este
hecho fue evidente al comparar la banda R1 de la línea 2 (Rho dimérica sin
termolisina), con la banda R1 de la línea 4 (Rho dimérica proteolisada). Por otra
parte, el arreglo oligomérico nativo de la Rho presente en la fracción dimérica,
protegió a los monómeros que conformaban tales arreglos, ya que ninguna variación
en dichas bandas (R2 y R3) fue evidenciada después de la reacción (ver líneas 2 y
4). Finalmente, a pesar de no haberse visualizado el fragmento termolítico F2 (~ 12
kDa), ni en la proteolisis de la Rho monomérica ni en la de la Rho dimérica, se infiere
que dicho fragmento fue evidentemente formado ya que en ambas fracciones ocurrió
la reacción de proteolisis, generándose el fragmento F1 de ~ 25 kDa. Este hecho
podría ser explicado por la escasa cantidad formada del fragmento F2 luego de la
proteolisis, o bien por la digestión secundaria del mismo vez generado en la reacción
del primer corte.
Fig. 4.33. Proteolisis con
termolisina de la Rho
monomérica o dimérica.
Gel de poliacrilamida-SDS
al 15 % teñido con plata
de las reacciones de
proteolisis
con
termonilsina de la Rho (2
Pgs). Las líneas 1 y 2
representan a la Rho
monomérica y dimérica en
ausencia de termolisisma,
respectivamente.
Las
líneas 3 y 4, representan a
la Rho monomérica y
dimérica incubadas por 16
h a temperatura ambiente,
con la termolisina a una
proporción
de
20:1
Rho:termolisina. R1, R2
y R3 = monómeros,
dímeros y trímeros. F1 =
fragmento termolítico. M =
marcadores
de
peso
molecular.
114
4.10.1 PROTEOLISIS CON TERMOLISINA DE LA RHO MONOMÉRICA O
DIMÉRICA ENTRECRUZADA CON sulfo-SMCC.
Dada la posibilidad de poder disponer de poblaciones uniformes de Rho
monomérica o dimérica en dependencia de la concentración de DM a las cuales son
sometidas en una filtración molecular en Sephacril S-300 (10 mM o 2 mM
respectivamente), era de interés el confirmar a través de una reacción de proteolisis
con termolisina, si los monómeros artificiales disociados en detergente (10 mM DM),
o los monómeros conformando un arreglo dimérico u oligomérico eran susceptibles a
una reacción de entrecruzamiento intramolecular. En este sentido, las fracciones de
Rho monomérica y dimérica fueron sometidas a una reacción de entrecruzamiento
químico utilizando el agente sulfo-SMCC a una concentración de 5 mM, por 1h a 37
°C. Una vez entrecruzadas las muestras, fueron sometidas a proteolisis con
termolisina a un cociente 20:1, a 37 °C por 16 h. En la Fig. 4.34 se muestra como la
incubación de la Rho monomérica con sulfo-SMCC (previo a la reacción de
proteolisis), efectivamente inhibió la reacción de proteolisis. En efecto, nótese como
ningún fragmento termolítico tipo F1 fue formado a expensas de la banda de 35 kDa
(R1) de la Rho monomérica (ver línea 3). El entrecruzamiento de la Rho dimérica
evidenció como era de esperarse, la estabilización covalente por entrecruzamiento
intermolecular de las especies diméricas (R2) y en mayor proporción de aquellas
especies oligoméricas del receptor (Rn). Nótese en la línea 4 la agregación por
entrecruzamiento intermolecular de los oligómeros de Rho dimérica, en comparación
con la apariencia de estas especies en la fracción de Rho dimérica no entrecruzada
(línea 2). La Rho dimérica entrecruzada, similar a la Rho monomérica entrecruzada,
la presencia del entrecruzador protegió a la proteína de la reacción de proteolisis con
termolisina (ausencia de fragmentos termolíticos que debieron aparecer al nivel
señalado por la flecha roja) (ver Fig. 4.34, línea 4). La banda borrosa de la Rho
monomérica entrecruzada pudiera explicarse por la incapacidad de la Rho
entrecruzada para sufrir una adecuada tinción con plata (comparar la Fig. 4.6 (B) y
4.7).
115
La ausencia de fragmentos proteolíticos en la Rho monomérica incubada con el
entrecruzador (línea 3), se constituyó en una evidencia confirmatoria adicional de que
efectivamente el agente entrecruzador sulfo-SMCC tiene la capacidad de entrecruzar
a la Rho intrarmolecularmente al intercalarse covalentemente entre aminoácidos de
Cys y Lys ubicados a la distancia apropiada dentro de un monómero disociado de la
Rho, o bien dentro de un monómero conformando un dímero o un oligómero. Esto
fue evidente al notar que los monómeros disociados parecieran no ser susceptibles a
proteolisis una vez que son entrecruzados. En la sección 4.10 se demostró como la
Rho monomérica no entrecruzada, es parcialmente susceptible a proteolisis con
termolisina generando un fragmento tipo F1.
Fig. 4.34 Proteolisis con termolisina de la Rho monomérica o dimérica entrecruzadas
con sulfo-SMCC. Gel de poliacrilamida-SDS al 15 % teñido con plata de las reacciones de
proteolisis con termonilsina de la Rho (2 Pgs) entrecruzada con 5 mM sulfo-SMCC. Las líneas
1 y 2 representan a la Rho monomérica y dimérica en ausencia del agente entrecruzador,
respectivamente. Las líneas 3 y 4, representan a la Rho monomérica y dimérica entrecruzadas
con sulfo-SMCC (5mM) y posteriormente incubadas por 16 h a temperatura ambiente, con
termolisina a una proporción de 20:1 Rho:termolisina. R1, R2 y Rn = monómeros, dímeros y
oligómeros de Rho. La flecha en rojo indica la ausencia del fragmento termolítico F1 esperado
de la reacción de proteolisis. M = marcadores de peso molecular.
116
5. DISCUSIÓN
Los estudios de fotoblanqueo y
fotodicroísmo rápido inducido por flash,
realizados por Liebman y Entine (1974), Cone (1972), Poo y Cone (1974), Wey y col.
(1981), que sugirieron una propiedad de rápida difusión lateral y rotacional para la
Rho y por tanto infundieron un carácter monomérico para esta proteína; son hoy por
hoy altamente cuestionables. Esto en función de la existencia en las membranas de
los SEB, de zonas altamente heterogéneas en cuanto al contenido de lípidos y
proteínas como lo son las balsas lipídicas, inicialmente reportadas en esas
membranas por Seno y col (2001), Nair y col. (2002). Esta heterogeneidad de
membranas, actualmente reconocida también en membranas de los SEB, pondría en
fuerte cuestionamiento el hecho asumido de que la población total de rodopsinas
densamente empacadas en sus membranas nativas, presenten constantes uniformes
de rápida difusión lateral y rotacional, hipotéticamente correspondientes a
poblaciones homogéneas de monómeros. Al mismo tiempo, hacen inferir que
pudieran existir poblaciones de rodopsinas en las membranas de los SEB con otras
cinéticas de difusión lateral y rotacional. En efecto se ha demostrado que
aproximadamente un cuarto de las moléculas de Rho son inmóviles en la membrana
de los discos, y que su movilidad difiere dependiendo de su localización axial en los
discos en los cuales ellas se encuentran insertadas (Wey y col., 1981). Considerando
lo anterior, es fácil inferir que las constantes de difusión lateral y rotacional rápidas
medidas, pudieron haber representado un promedio de esta propiedad para el total
de las poblaciones de Rho existiendo en la membrana con movilidades variantes,
bien sea por la heterogeneidad de las membranas donde estaban insertas o bien por
presentar distintos tipos de arreglo supramolecular (monoméricos, diméricos u
oligoméricos). En síntesis, las inferencias anteriormente discutidas, con base en el
análisis y reinterpretación de la data existente, ponen en evidencia que un arreglo de
tipo monomérico uniforme para la Rho en membranas SEB, basado en sus
movilidades, no podría ser asumido como un arreglo de distribución regular y
uniforme.
117
Interesantemente, resultados muy opuestos a las concepciones clásicas de
Rho en arreglo monomérico fueron publicados recientemente por Fotiadis y col.
(2004) y Liang y col. (2003). Estos estudios, realizados por MFA mostraron la
existencia de Rho distribuida en líneas de dímeros, a su vez organizados en arreglo
paracristalíno en membranas de los discos de los SEB múridos, tanto en membranas
convencionales como en las balsas lipídicas (ver introducción). Sin embargo, estos
resultados fueron altamente controversiales por oponerse a publicaciones muy
tempranas de la existencia de Rho monomérica aleatoriamente dispersa a lo largo de
la membrana de los discos de los SEB, y dispuesta de forma inespecífica, carente de
algún ordenamiento especial (Chabre, 1975); Blasie y Worthington, 1969). Más aun,
existen otros trabajos realizados sobre las membranas de los discos SEB a través de
ME, que señalaban que la Rho exhibía como un monómero, por evidenciarse en
tales membranas un patrón disperso, densamente empacado, y no ordenado (Chen y
Hubbell, 1975; Roof y Hauser, 1982). La polémica planteada entre resultados tan
contradictorios (Chabre y col., 2003), fue atribuida en principio a una posible
segregación de lípidos y proteínas en las membranas de los SEB, artificialmente
inducida por las temperaturas a las cuales fueron preparadas las muestras para la
MFA. Esta argumentación fue revertida cuando resultados idénticos fueron obtenidos
por la ejecución de la MFA sobre muestras preparadas a temperatura ambiente
(Fotiadis y col., 2004; Liang y col., 2003). Adicionalmente, arreglos paracristalinos de
la Rho fueron obtenidos a través de ME en membranas fotorreceptoras de
Drosophila (Suzuki y col., 1993) y en las membranas de los SEB bovinos (Kajimura y
col., 2000). Sin conocerse los detalles técnicos para explicar hallazgos tan
controversiales en cuanto al real arreglo supramolecular de la Rho inserta en las
membranas de los SEB, resulta obvio que hasta este momento no se había podido
conocer de forma inambigua, si la Rho presenta solo estructura terciaria o posee
estructura cuaternaria.
Por el análisis de las propiedades hidrodinámicas de la Rho y la Rho* bovina
solubilizadas en DM, en la presente tesis doctoral se ha podido elucidar la estructura
cuaternaria nativa de estas especies. Los resultados productos de esta investigación
son consistentes con una estructura dimérica para ambas conformaciones de la
118
proteína fotorreceptora y están en acuerdo con los resultados previamente
publicados por Fotiadis y col. (2004) y Liang y col. (2003). La cromatografía de
exclusión molecular demostró que la Rho y la Rho* tienen pesos moleculares de
78.000 y 76.000, respectivamente, lo cual es aproximadamente el doble del tamaño
observado por EGPA-SDS bajo condiciones desnaturalizantes. Por otra parte, fueron
determinados radios de Stokes de 4.18 y 4.15 nm para la Rho y la Rho*.
Adicionalmente, ambas conformaciones de la Rho mostraron coeficientes de
sedimentación de 5.78 S y radios fricciónales de alrededor de 1.4-1.6, los cuales
fueron calculados para los complejos de la Rho:DM y Rho*:DM. Un peso molecular
ligeramente mas bajo (~ 60.000), fue estimado al asumir una forma globular y
compacta para los complejos de proteína-detergente. Sin embargo, un modelo más
real para muchas macromoléculas biológicas sería los elipsoides de revolución
(prolatos y elipsoides oblatos), ya que la mayoría de las macromoléculas biológicas
no son esféricas. La incorrecta concepción de que la Rho es de forma globular,
podría contar para la pequeña discrepancia obtenida cuando los pesos moleculares
fueron determinados por ultracentrifugación. En este sentido, los elipsoides
presentan coeficientes fricciónales más grandes que aquellos esperados para las
esferas. Dado que el volumen de una molécula es proporcional al peso molecular de
la misma, ha sido publicado que a mas derivación de una molécula de una esfera,
un coeficiente friccional más grande debería ser obtenido. El valor de ƒ/ƒo
determinado para los complejos de Rho:DM en oscuridad o en luz, se corresponden
con macromoléculas que tiene forma de elipsoides prolatos con un radio axial de
10:1 o bien una forma de elipsoide oblato con un radio axial de alrededor de 12:1
(Cantor y Schimmel, 1980). En efecto, la estructura cristalina de la Rho (Packzewski
y col., 2000; Teller y col., 2001; Okada y Palczewski, 2001), muestran que la proteína
tiene una forma elipsoidal. Las dimensiones del elipsoide son ~48 Å de ancho, y ~ 35
Å de grosor en el plano de la membrana. Los análisis por ME de preparaciones
conteniendo arreglos cristalinos también han mostrado que las moléculas de Rho
tienen dimensiones planares de alrededor de 28 X 39-41 Å y están a ~ 63-64 Å en
altura con respecto a la membrana (Sherltler
y Hargrave, 2000). Todos estos
119
resultados son consistentes con la forma asimétrica deducida aquí para la proteína
fotorreceptora.
Los resultados encontrados y publicados de esta investigación, fueron
criticados por Chabre y le Maire, (2005), específicamente por la estrategia de
sustracción del peso molecular de la micela de DM (50.000) (Rosesevear y col.,
1980), al peso molecular total de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM, para obtener
un peso molecular de 78.000 y 76.000 para la Rho y Rho* diméricas aisladas por
exclusión molecular, respectivamente. Estos autores criticaron el uso de esta
estrategia para determinar el tamaño de una proteína de membrana como lo es Rho,
indicando que la masa de detergente unido a la proteína no es necesariamente
equivalente a la masa estimada para la micela de detergente. En este sentido se
adujo que, para proteínas con uno o pocos segmentos transmembranales Dhelicoídales, el tamaño de la micela de detergente puede ser equivalente a la
cantidad de detergente unido (Robinson y Tanford, 1975; le Maire y col., 2000), pero
para proteínas mas grandes conteniendo 7-11 segmentos transmembrana, el peso
molecular de la micela pudiera ser distinto al peso estándar publicado para la misma,
estimado por Rosevear y col. (1980), siendo entonces mayor la cantidad de
detergente unido a estas proteínas grandes (le Maire y col., 2000). Esto permite
inferir que la unión de detergente a una proteína de membrana estaría
proporcionalmente relacionada con el tamaño de sus sectores hidrofóbicos. Sin
embargo, resultados contradictorios en este sentido fueron encontrados cuando se
revisó por ejemplo, la unión del detergente DM a la proteína de membrana Ca+2ATPasa, por procedimientos de exclusión molecular en condiciones ligeramente por
encima o por debajo de la concentración micelar critica del DM. Möller y le Maire
(1993), reportaron una unión de detergente de 0.9 g/g de la proteína Ca+2-ATPasa,
en su forma monomérica, bajo condiciones ligeramente por encima de la CMC del
detergente. No obstante, cuando el procedimiento se llevó a cabo a concentraciones
ligeramente por debajo de la CMC y solo existían formas oligoméricas de la Ca+2ATPasa, a penas 0.4-0.5 g de detergente se unieron por g de la proteína oligomérica.
Es decir, cuando la proteína se encontraba en su forma oligomérica, unió menor
cantidad de detergente en comparación con la cantidad de detergente unido a la
120
proteína en su forma monomérica, a altas concentraciones del detergente.
Esto
comportamiento se aleja de la premisa de que, a mayor peso de la proteína, mayor
seria la extensión de la superficie hidrofóbica y por tanto, se debería esperar una
mayor cantidad de detergente unido a la misma. Por otra parte, del trabajo de Möller
y le Maire (1993), citado por Chabre y le Maire, (2005), para oponerse a la
estimación de 0.97 g detergente unido / g de Rho reportada aquí, se ha podido inferir
que el uso de un detergente a concentraciones por debajo de la CMC, lo hace
ineficiente para delipidar completamente a las proteínas de membrana, reduciendo la
cantidad de detergente unido a las mismas. Esto se traduciría en una menor cantidad
de detergente unido al dímero con respecto a un monómero. En este sentido se
adujo que para la Rho, debería esperarse una unión de detergente 1.3 g / g de
proteína. Sin embargo la medición hecha por el método de antrona resultó en 0.97 g /
g de Rho dimérica, muy similar a lo evidenciado previamente para la Ca+2-ATPasa. A
favor de los resultados de este estudio, para la Rho se trabajo a una concentración
de DM muy por encima de la CMC (1.92 mM), anulándose la probabilidad de que la
Rho no hubiera estado bien solubilizada y delipidada al momento de su filtración por
la Sephacryl S-300. De esta forma era imposible incurrir en una subestimación de la
cantidad real de detergente unido a un dímero de Rho y por demás, quedó
rechazada la hipótesis de que el valor medido de detergente unido correspondiera a
un dímero artificialmente agregado por ineficiente solubilización con el detergente. El
valor de 1.3 g de detergente / g de Rho que debería esperarse según Chabre y le
Maire (2005), fue medido y sería valido para detergentes tipo polioxietilen-glicol
(Triton X-100 y C12E6). Este valor tan alto, fue sugerido como posible para el
complejo Rho:DM por Chabre y le Maire (2005), por una extrapolación de la unión de
los detergentes polioxietilen-glicol a la Rho y a otras proteínas integrales de
membrana. Sin embargo, no existen estudios referenciales en los cuales se haya
cuantificado la unión de DM (detergente no iónico) a la Rho. Por tal razón, resultaría
inadecuado el extrapolar los valores de unión de detergentes polioxietilen-glicol a la
Rho, con los encontrados aquí, referidos a la unión del DM al fotorreceptor
solubilizado. En todo caso, los resultados surgidos de esta investigación tuvieron un
soporte científico dada la idoneidad del método de antrona (Plummer, 1978), para
121
medir cuantitativa y directamente carbohidratos tipo maltósido presentes en una
muestra.
El análisis en defensa de los resultados presentados aquí demostró tener valor
per se ya que la sustracción empírica del peso de la micela al peso de los complejos
Rho:DM, arrojó resultados coincidentes con una condición dimérica de la Rho nativa.
Similarmente, cuando se hizo la estimación la cantidad en g de detergente unidos / g
de Rho en los complejos Rho:DM (método de antrona), se demostró igualmente su
organización dimérica. En síntesis, se pudo confirmar que para el caso de la Rho, el
peso de la micela es equivalente a la cantidad de detergente unido.
Otra critica importante a los resultados aquí presentados, realizada por Chabre
y le Maire, (2005) tuvo que ver con el hecho de que los radios de Stokes publicados
aquí (4.18 nm y 4.15 nm) para la Rho y Rho* respectivamente, son muy bajos. Los
radios de Stokes obtenidos por el análisis de la Ca+2-ATPasa en C12E6, son de 5.5
nm (Champeil y col., 2000). Para la Rho monomérica en Triton X-100 y C12E6, se
estimaron en 4.8 nm (Le Maire y col., 1986). En este sentido, se adujo que seria poco
probable que radios de Stokes más bajos que los valores anteriormente citados,
correspondan a dímeros de Rho. Según Chabre y le Maire (2005), los valores
encontrados en este trabajo de tesis apuntarían más bien a monómeros de Rho
(Chabre y le Maire, 2005). La diferencia entre los valores encontrados aquí y los
medidos por Le Maire y col. (1986), pudiera obedecer a los diferentes tipos de
detergentes utilizados en los dos estudios. En este sentido, pudieran existir
discrepancias en la unión de detergentes tipo polioxietilen-glicol con respecto al DM,
para una proteína dada. Adicionalmente, Le Maire y col. (1986), realizaron la
calibración de sus columnas con proteínas insolubles en agua. En este trabajo las
calibraciones fueron hechas con proteínas hidrosolubles. Este hecho pudo influir
directamente en la estimación de los coeficientes de partición (Kav) de los estándares
y de la Rho, y por ende reflejarse en tales diferencias en los radios de Stokes. Sin
embargo, a pesar de la idoneidad de realizar calibraciones con proteínas insolubles
para la estimación del tamaño de proteínas de membrana, estas determinaciones
pudieran contener un error implícito. Este error seria consistente con el hecho
supuesto de una unión no uniforme del detergente a cada proteína estándar de
122
calibración. Este hecho pudiera afectar al tamaño de cada proteína estándar,
incidiendo finalmente en la calibración de la columna. Por tanto, el tamaño final
estimado para la proteína problema, estaría sujeto a variables experimentales no
controladas durante la calibración. Este no sería el caso cuando se calibran las
columnas con proteínas hidrosolubles, que por tal condición no requieren de unirse ni
en mayor ni en menor grado al detergente. En este sentido, el peso de las proteínas
estándares sería invariable, independientemente del sistema de detergente utilizado
para el procedimiento cromatográfico. En efecto, el análisis de los complejos aislados
de Rho:DM y Rho*:DM por el método de antrona, el cual directamente mide el
detergente unido, sin contemplar el modo de separación y la elución de los mismos
en la Sephacryl S-300, indicó la presencia de dímeros de Rho en el complejo
proteína detergente.
Al indagar mas acerca de los resultados de una Rho supuestamente
monomérica en C12E8 en estudios de filtración en gel, y con un radio de Stokes de
4.8 nm (Le Maire y col., 1986), es importante destacar algo que no fue mencionado
por Chabre y le Maire (2005). Los monómeros aislados en C12E8, fueron incapaces
de recombinarse con el 11-cis-retinal y renaturalizarse a su condición de Rho nativa
posterior a su fotoactivación. Este comportamiento indicó que la Rho solubilizada en
ese detergente perdió interacciones proteína-proteína y por ende estados
conformacionales nativos importantes, que le impidieron su renaturalización a su
estado nativo en oscuridad. En este sentido, se ha argumentado que el estado
monomérico de esas especies de Rho no podría representar el estado y ordenación
nativa de la proteína fotorreceptora (McCaslin y Tanford, 1981). Por esta razón, los
estudios de la organización de la Rho por filtración en gel, utilizando detergentes tipo
polioxietilen-glicol, carecen de toda validez para extrapolar los resultados obtenidos
de Rho en una condición monomérica, al estado nativo de esta proteína en las
membranas de los SEB.
Los pesos moleculares de la Rho y la Rho*, estimados en 51.000 y 61.000
respectivamente, por técnicas de sedimentación por ultracentifugación en gradientes
de sacarosa, fueron también criticados por Chabre y le Maire (2005). Estos autores
123
indicaron que el valor del coeficiente de sedimentación de 5.78 S para los complejos
de Rho:DM y Rho:DM son “sin sentido” y falsos ya que “la
utilización de
ultracentrifugaciones en gradientes de sacarosa para la medición de coeficientes de
sedimentación de proteínas de membrana, debe ser aplicada con gran precaución”.
Sin embargo, pareciera que este comentario surgió a raíz de la incredulidad de que
la interpolación del producto de los radios de Stokes y el coeficiente de
sedimentación de los complejos de Rho en detergente, en una curva de calibración
estándar de masa (M) versus el radio de Stokes (a) multiplicado por en coeficiente de
sedimentación (S) (a : 5resultara en los pesos diméricos indicados para la Rho
en DM. En efecto, dicha calibración y los resultados de la misma fueron realizados, y
son mostrados en la Fig. 4.16 de este trabajo. Con base en tal calibración, se
obtuvieron pesos para los complejos Rho:DM y Rho*:DM iguales a 107.000 y
111.000, respectivamente. Al sustraer el peso molecular de la micela (50.000), se
obtuvieron pesos moleculares de 57.000 y 61.000 para la Rho y la Rho*,
respectivamente. Al relacionar los valores de radios de Stokes de 4.18 nm (Rho) y
4.15 nm (Rho*), con el coeficiente de sedimentación de 5.78 S para ambos
complejos (Siegel y Monty, 1966), y encontrar valores de peso molecular
equivalentes a dímeros de Rho, se aportó credibilidad per se, a los resultados
encontrados en este trabajo, dejando sin efecto la critica realizada por Chabre y le
Maire (2005). Los críticos a los resultados presentados aquí, sugirieron la invalidez
de los mismos ya que en el presente trabajo, no se hizo referencia al trabajos previos
realizados por Le Maire y col. (1986), en los cuales, se argumentó la existencia de
Rho monomérica con un radio de Stokes de 4.8 nm. En respuesta a esta critica, se
argumenta la no-inclusión de dicho trabajo, dado que estos autores usaron un
detergente inadecuado para la solubilización y caracterización hidrodinámica de la
Rho, como lo fue el C12E8. Como se indicó arriba, este detergente afecta fuertemente
la estructura y conformación nativa de la proteína, razón por la cual, los resultados
obtenidos referentes a la existencia de la Rho como un monomérica, no pueden
reflejar la condición nativa de la proteína inserta en las membranas.
Finalmente y para complementar la defensa de los resultados de la
caracterización hidrodinámica de la Rho realizada aquí, curiosamente en el trabajo
124
de Chabre y le Maire (2005), no se hizo referencia a un trabajo de sedimentación de
la Rho en colato de sodio o C12E8 realizado por McCaslin y Tanford (1981). Estos
autores reportaron muy claramente que la Rho en colato de sodio, sedimentó con
pesos moleculares bien definidos y equivalentes a dímeros u oligómeros de tipo
trimérico. En sustento de este hallazgo, dichos trímeros aislados en colato de sodio,
mantuvieron su habilidad para recombinarse y renaturalizarse con el 11-cis-retinal,
desde su estado fotoactivado a su estado nativo. Considerando lo anterior, se ha
podido conocer que el colato de sodio es un detergente aniónico medio, el cual, no
presenta regiones fuertemente lipofílicas ni absolutamente hidrofílicas, razón por la
cual es capaz de solubilizar a la Rho sin alterar las interacciones intracatenarias e
interproteícas importantes para mantener su estructura terciaria y cuaternaria nativas
de la Rho. En contraste a esta condición, el detergente C12E8, es un detergente no
iónico, que sin embargo, pareciera interactuar fuertemente con las porciones
hidrofóbicas de la proteína. Esta interacción ha demostrado alterar directamente las
interacciones proteína-proteína, distorsionando la estructura nativa del fotorreceptor
(MacCaslin y Tanford, 1981). En este sentido, se indicó que el estado oligomérico de
la proteína en colato de sodio representaría muy bien al estado nativo de la Rho en
los discos de membrana de los SEB (McCaslin y Tanford, 1981). El hallazgo de una
estructura cuaternaria oligomérica para la Rho en el trabajo de McCaslin y Tanford
(1981), fue mas allá sustentado por el hecho de que, otros datos biofísicos y
bioquímicos de la Rho solubilizada en colato no relacionados a su agregación y
sedimentación, habían indicado que la Rho solubilizada en este detergente mantenía
una conformación que era equivalente a la de la Rho unida a las membranas de los
SEB, y al mismo tiempo diferente a la de la Rho solubilizada en detergentes en los
cuales, el receptor pierde su capacidad de recombinarse con el 11-cis-retinal. Dado
que los resultados presentados aquí coinciden con los hallazgos de la Rho
solubilizada
en
colato
(McCaslin
y
Tanford,
1981),
se
puede
afirmar
responsablemente que la Rho y la Rho* solubilizadas en DM, presentan una
estructura cuaternaria de tipo dimérica. Al analizar las estructuras de los detergentes
tipo sales biliares como el colato de sodio (C24H39O5Na) y el DM (C24H46O11), ambos
presentan cadenas alkiladas largas y similares en su porción hidrofóbica, lo cual,
125
pudieran contar para explicar la solubilización no agresiva de las proteínas integrales
de membrana como la Rho, sin alterar directamente la estructura nativa de la
proteína. Estos detergentes al presentar un a porción hidrocarbonada tan larga, se
verían a interactuar de una forma mas controlada con las secciones hidrofóbicas de
la proteína, sin distorsionar su estructura. Contrariamente, el C12E8 presenta una
extensión hidrocarbonada de menor extensión, razón por la cual su interacción con
la Rho pudiera ser más extensa, favoreciendo su completa solubilización, pero
exhibiendo un efecto perturbador de la estructura nativa de la proteína de tipo
irreversible. En síntesis, lo resultados de la existencia de la Rho dimérica solubilizada
en DM (presentados aquí), no pudieron ser rebatidos con los argumentos basados en
hallazgos de una Rho en arreglo monomérico solubilizada C12E8, citados por los
proponentes del modelo de la Rho en arreglo monomérico (Chabre y le Maire 2005).
El patrón de entrecruzamiento para varias preparaciones de la Rho en
membranas de los SEB, mostró una predominancia para la formación de dímeros
entrecruzados con una disminución progresiva de los productos de entrecruzamiento
dimérico, a partir de los cuales, se formaron especies tipo triméricas y oligoméricas
de orden superior. Este patrón podría resultar de un ensamblaje oligomérico nativo
de la Rho en las membranas, o alternativamente del entrecruzamiento complejo
producto de las colisiones aleatorias entre monómeros de la Rho. Dado que la Rho
estaba embebida en la membrana de los discos de los SEB, la proteína es libre para
rotar y difundir en el plano de la bicapa lipídica, experimentando un frecuencia de
colisión entre moléculas de 105 y 106 / seg (Cone, (1972; Poo y Cone, 1974). Sin
embargo, ha sido publicado que a concentraciones de proteína por debajo de 10 PM,
los entrecruzamientos intermoleculares accidentales entre moléculas de proteínas
separadas serían eliminados una vez que la solución de proteína es mezclada con el
agente entrecruzador (Davies y Stark, 1970). En este sentido, lo que se observaría,
serían productos resultantes de la suma de entrecruzamientos intra-oligoméricos de
un número fijo de polipéptidos de los cuales esta compuesta la proteína.
Adicionalmente, la solubilización de las membranas con detergentes, disminuye
significativamente la concentración efectiva de proteínas, con una reducción
concomitante en las frecuencias de colisión transitoria entre las moléculas de Rho.
126
En este sentido, todos los experimentos de entrecruzamientos de la Rho en
membranas de los SEBLav o solubilizada en DM realizados en este trabajo, fueron
conducidos a concentraciones de proteína de 1.28 PM, anulando la probabilidad de
que existieran colisiones accidentales entre las moléculas del receptor. Cuando
concentraciones incrementadas de la Rho (1.28-20.5 PM) fueron incubadas con
concentraciones fijas de los reactivos bifuncionales, no se alteró la proporción de los
productos del entrecruzamiento. Estos hallazgos implicaron fuertemente que los
productos de entrecruzamiento obtenidos aquí probablemente reflejaban una
asociación estable entre las moléculas de Rho nativa, mas que una interacción
aleatoria, y sugirieron una estructura dimérica/oligomérica para la proteína
fotorreceptora. Los modelos semi-empíricos para el arreglo empaquetado de las
moléculas de Rho derivados de los datos topográficos de la MFA (Fotiadis y col.,
2004; Liang y col., 2003) y la estructura cristalina de la Rho (Palczewski y col., 2000;
Okada y col., 2002), sugieren que la interfase intradímero comprende contactos entre
las hélices H-IV y H-V. Adicionalmente, muchos de los residuos ínteractuantes están
localizados en las asas citoplasmáticas entre las hélices H-III y H-IV, y sobre la
región C-terminal. Además, otros sitios de interacción están también localizados
dentro de la membrana. El entrecruzamiento ocurre sobre cualquier par de residuos
localizados en esas interfases intradiméricas y contarían para la formación de los
productos entrecruzados de la Rho dimérica.
Algunos trímeros y oligómeros de orden superior de la Rho entrecruzados
fueron obtenidos en este trabajo, por el uso de varios agentes entrecruzadores
bifuncionales. Estos resultados fueron en cierta forma sorpresivos dado que si la Rho
formaba dímeros específicos, entonces la interfase de una molécula debería
consecuentemente estar ya ocupada, impidiendo la formación de productos
entrecruzados oligoméricos. Sin embargo, las evidencias obtenidas desde estudios
de MFA, soportados por ME, revelaron distintas líneas de dímeros de la Rho en
arreglo paracristalíno en las membranas nativas de los discos de los SEB (Fotiadis y
col., 2003; Liang y col., 2003). Los contactos entre los dímeros son creados
enteramente por las asas intracelulares entre las hélices H-V y H-VI de un monómero
en un dímero, con el asa entre las hélices H-I y H-II y los residuos C-terminales
127
desde el mismo monómero en el dímero adyacente. Los contactos entre las líneas de
dímeros son mantenidos a través de residuos hidrofóbicos desde la hélice H-I, en el
lado extracelular. Por estos argumentos, la formación de trímeros y oligómeros
entrecruzados puede ser fácilmente explicada por la existencia de estas varias
interfases de interacción entre los dímeros y entre las líneas de dímeros.
Interesantemente, una pequeña proporción de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM
fueron fuertemente absorbidos en el tope de la resina de Sephacril S-300.
Adicionalmente, una facción mínima cantidad de los complejos Rho:DM y Rho*:DM
(~ 10 %), sedimentaron en la base de los tubos de centrifuga durante la
ultracentrifugación isopícnica sobre los gradientes de sacarosa del 10-30 %. Estos
resultados sugirieron la existencia de algunos oligómeros de la Rho aún en presencia
de DM, lo cual probablemente contó para la aparición de productos con altos pesos
moleculares obtenidos desde el entrecruzamiento de los complejos Rho:DM y
Rho*:DM. En el caso de la Rho* solubilizada, un aumento de las especies diméricas,
trimeritas y multiméricas de la Rho fue aparente, lo cual fue consistente con la
reactividad adicional de los grupos sulfidrílos previamente reportada para la Rho*
(Fung y Hubbell, 1978) y con los cambios conformacionales producidos en la Rho
luego de su iluminación (Farrens y col., 1996; Sheik y col., 1996; Fritze y col., 2003;
Abdulaev y col., 1998).
Chabre y le Maire (2005), hicieron una critica no sustentada en los datos
resultantes de los ensayos de entrecruzamiento químico de la Rho en membranas
SEB o solubilizada en DM; publicados aquí. Estos investigadores, sugirieron que la
formación de productos entrecruzados diméricos, triméricos y oligoméricos de la
Rho solubilizada en DM, obedecían a que estos ensayos fueron realizados cuando la
Rho había sido supuestamente solubilizada a una concentración de DM por debajo
de la CMC, o incluso en ausencia de detergente. Es decir, supuestamente, las bajas
concentraciones del detergente favorecieron la agregación inespecífica de la proteína
en solución, y como consecuencia, los dímeros, trímeros y oligómeros encontrados
en este trabajo, habrían sido artificialmente inducidos. En este sentido, es oportuno
señalar que, la CMC del detergente ha sido medida en 0.18 mM. Los ensayos de
entrecruzamiento de la Rho presentados aquí fueron realizados cuando esta proteína
128
fue solubilizada en 1.96 mM DM (10.8 veces por encima de la CMC del detergente).
En consecuencia, en esta investigación se garantizó que los productos de
entrecruzamiento estuvieron muy lejos de representar agregaciones tipo inespecífica
de la Rho incompletamente solubilizada. Más complejo aún, la solubilización del
receptor en detergente y la ejecución de los ensayos de entrecruzamiento a
concentraciones inferiores a 10 PM (1.28 PM), sirvió para reducir la probabilidad de
que los productos entrecruzados resultarán de colisiones accidentales y aleatorias
entre monómeros, flotando libremente en solución.
Adicionalmente, Chabre y le Maire (2005), argumentaron que los productos del
entrecruzamientos de la Rho en membrana presentados aquí, serían de esperarse
dado que la Rho en su medio ambiente de membranas presenta una concentración y
un empaquetamiento muy alto. En este sentido, la simple difusión en dos
dimensiones de la proteína dentro del plano de la membrana durante los 30 min
incubación con el entrecruzador, podría conducir a un entrecruzamiento por colisión
aleatoria de los monómeros”. Esta afirmación, extraída del articulo de Chabre y le
Maire (2005), es indudablemente cierta. Sin embargo, y basado en todo lo expuesto
en esta discusión referente a los entrecruzamientos y las densidades de la Rho, la
afirmación de que la Rho pudiera existir como una proteína dimérica/oligomérica no
surgió de los ensayos de entrecruzamiento en membranas. Por lo contrario, en este
trabajo se dio énfasis a los resultados de entrecruzamiento de la Rho solubilizada y a
concentraciones a las cuales las probabilidades de colisión aleatoria y accidental
entre monómeros en solución serían improbables (Davies y Stark, 1970). En un
análisis aun más profundo y como fue indicado arríba, la posibilidad de que los
productos entrecruzados de Rho correspondieran a la estabilización de interacciones
aleatorias e inespecíficas del fotorreceptor, fue excluida con las reacciones de
entrecruzamiento de la Rho en función del tiempo y de la concentración del receptor.
En estos abordajes, no se evidenció variación alguna de la proporción dímero:
monómero, aún a altas concentraciones de la proteína fotorreceptora. Este hallazgo
indicó que las interacciones Rho-Rho eran estables y naturales y que no
incrementaban por el hecho de existir mayor densidad de proteínas en el medio.
129
Estos argumentos nuevamente dejan sin efecto las criticas realizadas por los
defensores de una disposición monomérica para la Rho.
La formación de dímeros entrecruzados intermolecularmente de la Rho fue
siempre incompleta más que estequiométrica. Sin embargo, diversos factores
pueden haber influenciado la formación de productos entrecruzados. Estos incluyen
la disponibilidad de los residuos de aminoácidos apropiados en las proteínas, la
especificidad química de los entrecruzadores bifuncionales, y las condiciones de la
reacción. Los resultados negativos en los experimentos de entrecruzamiento
químico, no demuestran conclusivamente que dos componentes proteicos no estén
en cerrada interacción uno con el otro. Una falta de productos entrecruzados puede
ser el resultado de la inadecuada disposición de los grupos reactivos en las cadenas
de polipéptido adyacentes. En adición a lo anterior, la reacción de cada uno de los
grupos funcionales de los reactivos entrecruzadores con los aminoácidos blanco de
la proteína, es una competencia entre la formación de los productos deseados y la
posibilidad de hidrólisis de los reactivos. Por ejemplo, ha sido publicado que los dos
anillos reactivos de la maleimída de las bismaleimídas tales como o-PDM y p-PDM,
son hidrolizados mucho mas rápido que el anillo simple de maleimída del análogo
monofuncional N-etilmaleimída. La rápida hidrólisis de un anillo de la bismaleimída
puede reflejarse en una baja reactividad de este reactivo hacia las Cys y Lys. Por
tanto esta hidrólisis puede limitar la extensión del entrecruzamiento de la proteína por
la bismaleimída. En consecuencia, cualquiera de estos factores individualmente o en
combinación podría generar una incompleta formación de productos entrecruzados
de la Rho en la unidad dimérica.
La modificación de Cys con el reactivo N-etilmaleimída o de Lys con fenilisotiocianato, por separado o en conjunto desde las interfases de interacción entre
las dos rodopsinas de un dímero o entre cadenas polipeptídicas constantes dentro de
los monómeros del mismo dímero, evidenció la incapacidad del entrecruzador de
intercalarse en la estructura de la proteína. Este hecho sería fácil de explicar ya que
la ocupación previa de estos residuos por los modificadores químico-específicos,
inhabilitaría a los mismos como blanco para las reacciones de entrecruzamiento. En
este sentido, las reacciones de protección de residuos de Cys y Lys, fueron
130
empleadas en este estudio como una herramienta para demostrar que efectivamente
los productos de entrecruzamiento de la Rho, fueron formados por la interacción
especifica de Cys y Lys, accesibles al entrecruzador sulfo-SMCC. En efecto este
comportamiento fue el evidenciado en los resultaos de modificación química
presentados y analizados en este trabajo. Estos resultados sugirieron que los
reactivos N-etilmaleimída y fenil-isotiocinato fueron específicos para modificar
justamente aquellos residuos involucrados en las reacciones de entrecruzamiento, lo
cual no fue el caso del modificador de Lys, anhídrido acético, el cual a pesar de
modificar estos residuos, no modificó aquellos residuos de Lys directamente
involucrados en la reacción con el sulfo-SMCC. Las pre-incubaciones en presencia
de NEM y el AA, no lograron prevenir la reacción de entrecruzamiento.
En este trabajo se evidenció que las reacciones de entrecruzamiento
intermolecular con sulfo-SMCC fueron no estequiométricas y, que los monómeros
que forman a los dímeros nativos de la Rho incubada con el entrecruzador sulfoSMCC, fueron incapaces de activar el intercambio de nucleótidos de G de la T en
presencia de la luz. De acuerdo con esto, el entrecruzador pudiera estar ejerciendo
un efecto de modificación monofuncional o bien una reacción de entrecruzamiento
intramolecular. Sin embargo, las modificaciones químicas de la Rho con reactivos
sulfidrílo-específicos (Ortiz y Bubis, 2001) o con reactivos modificadores de Lys
(Bubis y col., 1995), no afectan la funcionalidad de la proteína fotorreceptora en
cuanto a su reconocimiento y unión a la proteína G, T o bien sobre su capacidad de
inducir la unión de nucleótidos de guanina de la T, ambas dependientes de la luz. Si
el
entrecruzador
hubiera
ejercido
únicamente
un
efecto
de
modificación
monofuncional de los residuos de Cys y Lys, la proteína incubada con el
entrecruzador debería haber presentado una funcionalidad intacta, lo cual no fu el
caso. Los resultados presentados aquí indirectamente sugieren que los monómeros
conformando tales arreglos supramoleculares de la Rho, son susceptibles a
reacciones de entrecruzamiento intramolecular, dado que, si el entrecruzador hubiera
ejercido únicamente un efecto de modificación monofuncional de los residuos de Cys
y Lys, la proteína incubada con el entrecruzador debería haber presentado una
funcionalidad intacta, lo cual no fu el caso, ya que la Rho dimérica no estabilizada por
131
el entrecruzador fue incapaz de activar a la transducina. Este análisis permite inferir
que la Rho incubada con el sulfo-SMCC es susceptible a sufrir reacciones de
entrecruzamiento intramolecular e intermolecular.
En este trabajo se demostró la existencia de la Rho bajo un arreglo
cuaternario de tipo dimérico por efecto del entrecruzamiento químico con varios
agentes bifuncionales. Un dímero de Rho en solución y en presencia de un
entrecruzador, estaría sometido a varios tipos de reacciones de entrecruzamiento.
Uno de ellos tiene que ver con la intercalación del agente entrecruzador en posibles
interfases
de
interacción
entre
dos
moléculas
de
Rho
(entrecruzamiento
intramolecular). Por otra parte, y como fue analizado arriba, cuando dicha reacción
de entrecruzamiento fue no estequiométrica, el reactivo entrecruzador se intercaló
intramolecularmente en la estructura de la Rho (entrecruzamiento intramolecular).
Las especies diméricas así como los monómeros de Rho entrecruzados fueron las
especies esperadas luego de las reacciones de entrecruzamiento. Los resultados
presentados aquí claramente demostraron que las especies de Rho entrecruzadas
fueron incapaces de sufrir el cambio conformacional en presencia de luz (Farrens y
col., 1996; Sheik y col., 1996; Fritze y col., 2003; Abdulaev y col., 1998). Este hecho
fue notorio cuando las Rho entrecruzadas con el agente sulfo-SMCC fueron
incapaces de progresar hacia la forma fotolizada activa del receptor, evidenciado por
la detención del espectro UV/Vis a nivel de un fotointermediario absorbiendo a ~ 470
nm. En cuanto a la interpretación de estos efectos sobre la funcionalidad del
receptor, es pertinente señalar lo siguiente: dado que muchos de los residuos
interactuantes están localizados en las asas citoplasmáticas entre las H-III y H-IV, y
sobre la región C-terminal, sería factible proponer que la intercalación del
entrecruzador en cualquiera de estas regiones, bloqueó el proceso de isomerización
del retinal por estabilización covalente e inmovilización de estas regiones, y por lo
tanto se logró la estabilización de una especie fotointermediaria de absorbancia
máxima a 470 nm. Esto seria fácil de explicar con el conocimiento previo existente de
que la activación del receptor se basa en un fenómeno de movimiento y rotación
parcial de las hélices H-III y H-VI, por efecto de la isomerización del retinal desde su
forma 11-cis a todo-trans (Farrens y col., 1996; Sheik y col., 1996). La presencia del
132
entrecruzador entre las hélices H-III y H-IV en un mismo monómero, o bien entre las
hélices de la interfase de interacción H-IV y H-V entre monómeros de un mismo
dímero, se traduciría en efectos equivalentes a una inmovilización de dichas regiones
o regiones vecinas mediado por el entrecruzador bifuncional. El proceso de
isomerización del retinal ha sido ampliamente estudiado y caracterizado. En este
sentido, los diversos picos de absorción de la Rho desde su estado basal (Rho Ȝ
500 nm) hasta su estado fotolizado Rho* (MII Ȝ
max
max
380 nm ), representa una
colección de estados de energía solapados. A este respecto, la estructura de polieno
extendida de este cromóforo, determina las propiedades de absorción en el visible,
fundamentando la existencia de todos los fotointermediarios identificados en la
transición desde Rho a Rho*. Los fotointermediarios no son más que el producto de
las estructuras de resonancia del retinal unido a la opsina (Rando, 1996). El
fotointermediario de 470 nm que se logró estabilizar pudiera corresponder al
fotointermediario desplazado hacia el azul, comúnmente conocido como el Blue
Shifted Intermediary (BSI) o a la metarodopsina I (Meta I), ambos señalados con un
circulo amarillo en la Fig. 5.1 (Menon y col., 2001). El “congelamiento” por
entrecruzamiento con sulfo-SMCC del fotointermediario BSI o de la Meta I, hace un
gran aporte para futuras caracterizaciones de este fotointermediario, haciéndolo
permanentemente disponible para estudios estructurales, los cuales no serian
posibles sin su estabilización, ya que estos intermediarios se caracterizan por
presentar vidas medias extremadamente pequeñas. Nótese en la figura 5.1, como los
tiempos estimados de vida media de ambos fotointermediarios a sido medida en
nanosegundos (BSI) o microsegundos (Meta I). Estas cortas vidas medias en
fracciones de segundos requeridos para la progresión de un fotointermediario al
sigueinte, estarían en concordancia con la velocidad requerida para la activación del
receptor y ocurrencia de la cascada de señalización visual. En cuanto a lo poco que
se ha podido conocer de estos fotointermediarios, ambos se caracterizan por
presentar su base de Schiff imina en su forma protonada, a pesar del evento de
tautomerización del 11-cis-retinal unido hacia su forma todo-trans. Este hecho se ha
propuesto es debido a la estabilización de la base de Schiff imina por su contraión, el
residuo Glu113 (Sakmar y col., 1989). El entrecruzador sulfo-SMCC, detuvo el cambio
133
conformacional de la proteína justo antes del del evento que promueve la formación
de la metarodopsina II (meta II), en la cual ocurre la desprotonación de la base de
Schiff imina y la consecuente protonación del Glu113 (Lewis y Kliger, 2000).
Fig.5.1. Fotociclo de la Rodopsina. La fotoisomerización ocurre en una escala de tiempo ultra rápida formándose
en primer lugar la fotorodopsina (570 nm) a los fentosegundos (fs) de la absorción del foton de luz. El pigmento
fotolizado progresa hacia los intermediarios espectrales Batho, BSI, lumi, metaI, meta II, meta III, cada uno
caracterizado por registrar las absorbancias máximas a las longitudes de onda indicadas en la Fig.Cada valor de
longitud de onda máxima a la cual absorben los fotointermediarios esquematizados surge de la relajación gradual
de la proteína alrededor del 11-trans-retinal. Los cambios en las interacciones cromoforo-proteín generan los
distintos picos de absorbancia máxima a una longitud de onda especifica. La base de Schiff imina protonada
permanece hasta el fotointermediario Meta I. Esta condición cambia cuando se forma la meta II, el único
fotointermediario capaz de catalizar el intercambio de nucleótidos de guanina de la T. Tomado de Menom y col.
(2001).
La glutationilación de proteínas ha sido descrita como un mecanismo para
promover reacciones de intercambio de disulfuro tendientes a generar “in vivo” la
formación
de
puentes
de
disulfuro
intramoleculares
(entrecruzamiento
intramolecular), entre residuos de Cys cercanos dentro de una misma proteína, así
como también la formación de entrecruzamientos intermoleculares entre residuos de
Cys cercanos y accesibles desde dos proteínas interactuando activamente
(entrecruzamiento intermolecular). Ha sido descrito que estas reacciones ocurren
dentro de la célula cuando el glutatión reducido (GSH), normalmente alto en la célula,
134
es cambiado a su forma de glutatión oxidado (GSSH). Bajo esas condiciones, la
formación de intercambio de disulfuros entre los grupos thioles de las proteínas y el
GSSH puede ocurrir (Eaton y col., 2002; Ghezzi y col., 2002; Fretelli y col., 2002).
Dado que en el medio ambiente celular la oxidación irreversible de cisternas a
cisteínas sulfínicas y ácidos sulfónicos es completamente inconveniente para los
procesos metabólicos, se ha publicado que la glutationilación reversible de tales
cisteínas, puede servir como una vía de protección y prevención de tales oxidaciones
irreversibles de las Cys en proteínas claves para la célula (Barret y col., 1999;
Chrestensen y col., 2000). Adicionalmente,
se ha podido conocer que la
glutationilación reversible de grupos thioles en las proteínas, puede conducir a la
alteración de sus funciones habituales. En efecto, este proceso logra inhibir a una
gran cantidad de enzimas incluyendo fosfatasas y quinasas tales como la fosfatasa
1B (Barret y col., 1999), la proteína fosfatasa 2A, (Rao y Clayton, 2002), y la proteína
quinasa dependiente de AMPc (PKA) (Humphries y col., 2002) entre otras. Tales
estudios han sugerido que la glutationilación reversible de proteínas puede ser un
mecanismo común de regulación celular, quizás por actuar como un mecanismo
redox (oxido-reductor) sensor de oxido nítrico o de especies reactivas de oxigeno
generados durante procesos celulares normales (Sullivan y col., 2000; Wang y col.,
2001). Los ensayos para el sondeo preliminar de esta propiedad sobre el
fotorreceptor visual Rho en estado nativo y fotoactivado, realizados en este estudio,
indicaron que la Rho solubilizada en detergente no esta exenta de sufrir una
glutationilación de grupos thioles de sus Cys en condiciones “in vitro”. La
glutationilación de la Rho y la Rho* fueron evidentes por la aparición de productos
diméricos (R2) de Rho y Rho* en presencia de GSH y Diamida, bajo condiciones no
reductoras en geles de poliacrilamida-SDS. Adicionalmente, también fueron
detectados
productos
monoméricos
de
ambas
rodopsinas
glutationilados
intramolecularmente, los cuales evidenciaron una movilidad más rápida, con pesos
moleculares ligeramente inferiores a los publicados para monómeros de Rho en
geles de poliacrilamida-SDS. Este hecho sugirió la ocurrencia de intercambio de
disulfuros entre residuos de Cys ubicados en cadenas polipeptídicas muy próximas
dentro de una misma molécula de Rho o bien entre tales residuos ubicados en dos
135
rodopsinas interactuando en un dímero. Estos resultados se convirtieron en una
prueba adicional para demostrar que en efecto y bajo condiciones nativas, la Rho y la
Rho* se encuentran interactuando en una estructura cuaternaria de tipo dimérica.
A pesar de no haberse realizado las pruebas funcionales de la Rho
glutationilada para evaluar su habilidad de promover el intercambio de nucleótidos de
guanina de la T y de promoción de la actividad de GTPasa intrínseca de la proteína
G, la inducción a la formación de enlaces de disulfuro intradímero o interdímero en
presencia de diamida y GSH pudiera comprometer la progresión del cambio
conformacional de la proteína. De un total de 10 residuos de Cys presentes en la
estructura primaria de la Rho, dos residuos estarían comprometidos en un enlace de
disulfuro, imprescindible para el correcto plegamiento y expresión del fotorreceptor
en la membrana (Cys110 y la Cys187) (Hargrave y col., 1983). Otros dos residuos
adicionales de Cys (Cys322 y la Cys323), estarían comprometidos en una
palmitoilación descrita por Ovchinnikov y col. (1988) y Papac y col. (1992). El resto
de los residuos de Cys de la Rho ubicados a las distancias apropiadas, serían los
blancos para la reacción de intercambio de disulfuros inducido por glutationilación
evidenciada en este trabajo. La ubicación de tales residuos de Cys enlazando por
puentes de disulfuro a las hélices comprometidas en el fenómeno de cambio
conformacional de la proteína inducido por la luz (hélices H-III y H-VI), podría
teóricamente generar efectos inhibitorios similares a los observados por el
entrecruzamiento intramolecular de la Rho con sulfo-SMCC. Este planteamiento
sería coherente con la función de regulación del tipo “inhibición reversible” por efecto
de la glutationilación de proteínas en su medio ambiente celular. Sin embargo, los
ensayos de funcionalidad de la Rho glutationilada se hacen imprescindibles para
confirmar tal hipótesis.
Los esfuerzos por tratar de evaluar la capacidad intrínseca de la Rho de ser
renaturalizada
a su estado dimérico a partir de las opsinas desnaturalizadas y
marcadas diferencialmente con biotína o [J-32P], fueron evidentemente infructíferos.
En este sentido, este abordaje fue claramente afectado por el hecho de haber
solubilizado y desnaturalizado a las opsinas marcadas diferencialmente en presencia
de un detergente fuertemente iónico como lo es el dodecil-sulfato de sodio (SDS). La
136
unión de este detergente a la secuencia aminoacídica primaria de las opsinas,
disrrumpio completa e irreversiblemente la estructura terciaria de la proteína,
evidenciándose así la incapacidad de la opsina de replegarse y recombinarse con el
11-cis-retinal para su renaturalización completa. Si bien es cierto que la
renaturalización de la opsina por recombinación con el cromóforo en su forma 11-cis
en oscuridad, es un proceso completamente factible y publicado, el mismo ha sido
conseguido solo cuando la proteína fotorreceptora es previamente solubilizada desde
las membranas con detergentes que no afecten la estructura terciaria de la proteína
ni la conformación nativa de la cadena polipeptídica (detergentes no iónicos). Tal ha
sido el caso, previamente comentado arriba de la solubilización y renaturalización
con 11-cis-retinal de opsinas provenientes de rodopsinas solubilizadas en colato de
sodio (McCaslin y Tanford, 1981). Estos autores indicaron que la Rho solubilizada en
este detergente refleja y mantiene una estructura y conformación nativa igual a la de
la proteína inserta en membranas. Por esta razón la proteína solubilizada presentaría
la estructura y conformación que determina la correcta interacción del retinal en el
bocillo de unión para el mismo, mantenido aun intacto en la opsina estructurada
solubilizada. Es evidente que abordajes como el pretendido en este trabajo,
requerirían de la implementación de detergentes como el colato de sodio para lograr
un proceso de solubilización que permita la posterior renaturalización de las opsinas
marcadas diferencialmente, evitándose así la desnaturalización de la estructura de
las opsinas de interés. Adicionalmente, pudiera ser importante la presencia de lípidos
durante el proceso de la renaturalización de la Rho. Quizás al ejecutar este abordaje
de la forma descrita arriba, pudiera conseguirse exitosamente la renaturalización de
dímeros de opsinas híbridos conteniendo un monómero marcado con biotína y el otro
consecuentemente marcado con el fosfato gamma ([J-32P]) del ATP. La reformación
de este tipo de heterodímero de Rho renaturalizado, permitiría cumplir con el objetivo
final no conseguido en este trabajo de co-precipitar en un mismo complejo dimérico a
la Rho marcada con [J-32P], al precipitar a la Rho del mismo dímero con una resina
de stevtavidina-agarosa. A este respecto, es importante destacar que uno de los
objetivos de este trabajo fue demostrar la posibilidad de “forzar” la obtención de
rodopsinas monoméricas a partir del efecto de altas concentraciones de DM ( ! 3 mM
137
DM), publicado por Jastrzebska y col. (2004). Como fue evidenciado, en este trabajo
se logró el aislamiento de monómeros de Rho, a partir de la solubilización con 20 mM
DM de las membranas SEBLav previamente marcadas con NHS-biotína o [3H]-NEM, y
cromatografiadas en Sephacril S-300 a 10 mM DM. En efecto, con este
procedimiento se pudo evidenciar la obtención monómeros de Rho-biotína con masa
molecular de 34.6 kDa y monómeros de Rho-[3H]-NEM con una masa equivalente a
45.5 kDa. Estos resultados son completamente coincidentes con lo publicado por
Jastrzebska y col. (2004). La obtención de estos monómeros de Rho marcados
diferencialmente pudiera representar el comienzo de una estrategia basada en la
reversión de tal condición monomérica a altas concentraciones de DM, a una
condición dimérica nativa por dilución de la cantidad de detergente en la mezcla de
las rodopsinas marcadas diferencialmente y en proporción molar 1:1. La reducción
de la concentración del detergente a ~ 2 mM, en una mezcla equimolar de ambas
especies de Rho marcadas, podría favorecer la re-formación de dimeros híbridos de
Rho (heterodímeros de Rho-biotína/Rho-[3H]-NEM). Sobre estos heterodímeros sería
factible realizar los ensayos de co-precipitación con stevtavidina-agarosa de la Rho[3H]-NEM que se encuentre interactuando con la Rho-biotína. Estos resultados
servirían como una prueba adicional de tipo bioquímico para complementar los
resultados obtenidos aquí, que señalaron la estructura cuaternaria dimérica de la
Rho nativa. Las opciones presentadas anteriormente resultan en abordajes
interesantes a futuro para evaluar el estado oligomérico nativo de la Rho solubilizada
en detergente.
Las reacciones de proteolisis con termolisina de la Rho monomérica
entrecruzada
con
sulfo-SMCC,
permitieron
sugerir
de
forma
indirecta
la
susceptibilidad de esta proteína para sufrir reacciones de entrecruzamiento
intramolecular. Esto fue inferido por la ausencia de fragmentos termolíticos F1 luego
de la incubación de la Rho-sulfo-SMCC con la termolisina. Sin embargo, luego del
entrecruzamiento intramolecular o intermolecular de la Rho, fueron evidentes los
problemas para la tinción con plata de la Rho entrecruzada. En este sentido, la novisualización de fragmentos termolíticos F1 en la Fig. 4.34 (línea 3), podría ser
debida a una resistencia de los monómeros de Rho a la reacción de proteolisis, como
138
fue referido en los resultados. Sin embargo, con los resultados presentados aquí, no
se puede descartar que la reacción de proteolisis haya tenido lugar, pero
considerando el problema evidente de tinción de las Rho entrecruzadas, quizás no
fue posible o evidente la aparición de los mismos en el gel teñido con plata a pesar
de que pudieran haberse formado >Fig. 4.34 (línea 3)@. En tal caso, se requiere de la
repetición de estos ensayos de proteolisis de la Rho monomérica entrecruzada con
sulfo-SMCC y visualizar las reacciones en una EGPA-SDS teñido con plata.
Paralelamente debe realizarse una inmunotinción de las mismas reacciones con el
monoclonal 1D4. Esto permitiría descartar si realmente la Rho monomérica
entrecruzada siguió intacta posterior a la proteolisis, o si por el contrario, la reacción
de digestión fue productiva. Esto podría servir para descartar los referidos problemas
evidentes de la tinción con plata de la Rho entrecruzada.
La presencia del entrecruzador intercalado intramolecularmente en la estructura de la
Rho monomérica, pudiera de alguna manera resultar en una posible estabilización
covalente de los fragmentos termolíticos de la Rho. Esta hipotesis sería factible en el
caso de que el entrecruzador se encuentre interactuando en residuos de Cys y Lys a
cada lado del sitio de digestión de la proteína con la termolisina. Esto se traduciría en
una limitante para el reconocimiento de los fragmentos termolíticos en EGPA-SDS ya
que a pesar de haberse producido los mismo, el entrecruzador pudiera estar
enlazándolos covalentemente de forma tal que antes y después de la digestión, solo
se observaría la banda de 35 kDa, similar al peso aparente de un monómero. Dado
que esto fue lo observado en los resultados reportados en la Fig. 4.34, fue de interés
encontrar una explicación a estos resultados. A partir de un análisis computacional
usando el software Rasmol (versión 2.7.1.1), realizado sobre la estructura cristalina
de la Rho bovina depositada en el banco de datos de proteína, bajo el identificador
1U19, se analizaron las distancias moleculares entre las 10 Cys y 10 Lys existentes
en la estructura primaria de la Rho bovina, con la finalidad de identificar aquellos
residuos que se ubicaran a las distancias apropiadas para permitir la intercalación del
sulfo-SMCC a nivel intramolecular. A nivel de la asa citoplasmática IC-III,
específicamente en el final citoplasmático de la hélice H-VI, existen dos residuos de
lisina (Lys245 y Lys
248).
Adicionalmente, en el final citoplasmático de la H-III existe un
139
residuo de cisteína (Cys140). Los finales citoplasmáticos de las hélices H-III y H-VI se
encuentran interaccionando cuando la Rho esta en su estado nativo (oscuridad), lo
cual fue demostrado por Sheick y col. (1986 y Farrens y col. (1986). Considerando tal
proximidad entre los finales citoplasmáticos de estas hélices y que el agente sulfoSMCC tiene grupos reactivos para Cys y Lys, ubicados a distancias no mayores de
11.6 Å, es importante destacar que la existencia de una Cys140 en el final
citoplasmático de la H-III y de las Lys245 y Lys248 en el final citoplasmático de la H-VI,
pudieran hacerlos blancos reactivos para el entrecruzador. El sitio de corte de la Rho
por la termolisina fue identificado por Saari (1974) al nivel de la Ser240. La Ser240 se
encuentra entre los residuos blanco tentativos para la reacción de entrecruzamiento
con el sulfo-SMCC (Cys140, Lys245 y Lys248). En este punto era importante determinar
cuales de los residuos señalados como blancos tentativos de entrecruzamiento para
el sulfo-SMCC, presentaban la disposición espacial mas apropiada. En la Fig. 5.2
(A), se muestra la estructura cristalina de la Rho bovina procesada con el Software
Rasmol) (estructura en diagrama de cintas presentado en color gris). En esta
representación tridimensional de la Rho se resaltan los residuos de Cys140 (rojo),
Lys245 (verde) y Lys248 (amarillo), todos mostrados en diagrama de bolas y barras.
Cuando se analizó la distancia molecular entre la Cys140 (en la hélice H-III) y la Lys245
(en la hélice H-VI), usando el comando específico en Rasmol, se pudo conocer que
ambos residuos están separados a una distancia de 15.2 Å (ver Fig. 5.2, B). Dado
que el entrecruzador sulfo-SMCC enlaza residuos a distancias de 11.6 Å, sería
probable que el agente estuviera intercalándose entre estos residuos, ya que la
disposición de las hélices transmembranales no es rígida y permitirían la
intercalación del entrecruzador.
Adicionalmente, cuando se analizó la distancia
molecular entre la Cys140 y la Lys248, se pudo conocer que dichos residuos están
separados por una distancia de 11.98 Å (ver Fig. 5.2, C). A esta distancia, también
sería factible que el sulfo-SMCC estuviera intercalándose entre los mismos. En
ambos casos, la intercalación del sulfo-SMCC y la posterior reacción de proteolisis
con termolisina de la proteína entrecruzada, pudiera haber favorecido que: aunque
la proteolisis haya tenido lugar en la Ser240, los fragmentos no hayan podido ser
liberados, dado que el entrecruzador estaría manteniéndolos unidos. Este análisis
140
confirmó la hipótesis planteada en referencia a que la ausencia de fragmentos
termolíticos de la Rho monomérica entrecruzada intramolecularmente con el sulfoSMCC, es debida a que el sulfo-SMCC se intercala en residuos de Cys140 y Lys245 o
Lys248 ubicados a ambos lados del sitio de corte la termolisina (Ser240). Esto se
traduciría en una falta de visualización de los fragmentos termolíticos generados
luego de la proteolisis. El entrecruzador mantiene unidos covalentemente a ambos
fragmentos termoliticos F1 y F2.
Fig. 5.2 Análisis de las distancias moleculares de residuos de Cys y Lys de la Rho propuestos como
blancos de acción para el entrecruzador sulfo-SMCC. A) Diagrama de cintas de la Rho bovina presentando los
residuos de Cys140 (rojo), Lys245 (verde) y Lys248 (amarillo), resaltados en diagrama bolas y barras utilizando el
Software para análisis y visualización de macromoléculas Rasmol. B) Análisis en Rasmol, de la distancia
molecular entre la Cys140 y la Lys245. La línea amarilla uniendo los átomos de azufre (S) de la cisteína y el
nitrógeno amino (N) de la lisina, representa la distancia molecular entre ambos aminoácidos (15.2 Å). C) Análisis de
la distancias molecular entre la Cys140 y la Lys248. La línea amarilla representa la distancia molecular entre ambos
aminoácidos (11.98 Å).
141
Adicionalmente, la ocurrencia de una probable reacción de entrecruzamiento
intramolecular de la Rho con sulfo-SMCC, al nivel de la Cys140 y la Lys245 o Lys248,
propuesta con base en las distancias moleculares obtenidas desde el análisis con el
programa Rasmol, pudiera servir para explicar inhabilidad de la proteína
fotorreceptora de sufrir el cambio conformacional característico en presencia de luz.
Esto sería explicado por el bloqueo del movimiento y rotación de las hélices H-III y HVI (entrecruzadas desde los residuos Cys140 y Lys245 o Lys248), responsables de
generar la conformación adecuada de la Rho* para activar a la T, en un proceso
impulsado por la isomerización del retinal unido. En este punto, es importante
discernir cual de las dos Lys en la hélice H-VI (Lys245 o Lys248), sería el blanco más
adecuado para la reacción con el agente sulfo-SMC en conjunto con la Cys140. En la
Fig. 5.3 (A), se muestra el modelado de la estructura cristalina de la Rho enfocada
en la zona molecular conteniendo los aminoácidos propuestos para la reacción de
entrecruzamiento intramolecular (Cys140 - Lys245 y Lys248), coloreados en rojo, verde y
amarillo, respectivamente (ver Fig. 5.3). Esta Fig. muestra a los átomos de interés y
la zona circundante a las Cys y Lys propuestas, presentada en un diagrama de bolas
y barras, para así visualizar el entorno molecular que rodea a cada uno de los
residuos propuestos (esferas y barras en blanco). Según esta representación ambos
residuos de Lys serían blancos factibles para la reacción con el entrecruzador unido
a la Cys140. Sin embargo, como se muestra en la Fig. 5.3 (B), al representar los
átomos de la zona de interés usando un diagrama de espacios llenos, se pudo notar
como la disponibilidad o acceso del agente entrecruzador para la reacción con la
Cys140 (rojo) y la Lys248 (amarillo), es mayor, en comparación a la accesibilidad que
presenta el residuo de Lys245 (verde) con respecto a al de reacción con la Cys140. A
partir de este análisis, fue evidente que una reacción de entrecruzamiento
intramolecular de la Rho con el agente sulfo-SMCC intercalado entre los residuos
Cys140 y Lys245, sería muy poco probable dada dicha Lys se encuentra muy profunda
en la estructura de la proteína con respecto a la Cys140, lo cual se traduce en un
importante impedimento estérico alrededor de la Lys245 para interaccionar con el
grupo succinimidilo del agente entrecruzador. Contrariamente, la Lys248, se encuentra
más expuesta al plano de la Cys140 de forma tal que, con muy bajo impedimento
142
estérico, dicha Lys248 pudiera fácilmente interactuar con el entrecruzador, al mismo
tiempo que el agente se une covalentemente a la Cys140. Este análisis, señaló
directamente al aminoácido Lys248, como el blanco más probable de reacción para el
agente sulfo-SMCC con la Rho, vía interacción en paralelo con la Cys140.
Fig. 5.3 Análisis de disponibilidad espacial de los residuos de Lys245 o la Lys248 para la reacción en
conjunto con el sulfo-SMCC interaccionando con la Cys140. A) Diagrama de bolas y barras representando la
zona molecular circundante a los residuos de Cys140 (rojo) y Lys245 (verde) o Lys248 (amarillo), tentativamente
comprometidos en la reacción de entrecruzamiento de la Rho con el sulfo-SMCC. B) Diagrama de espacios llenos
representando la zona molecular circundante a los residuos de Cys140 (rojo) y Lys245 (verde) o Lys248 (amarillo) y
la disposición más apropiada y accesible de la Lys248 con respecto a la Cys140 para la interacción con el sulfoSMCC. La Lys245 (verde), se encuentra insertada muy profundo en la estructura de la proteína de forma que se
encuentra limitada estéricamente para la interacción con el sulfo-SMCC unido covalentemente a la Cys140.
Los resultados del entrecruzamiento de la Rho presentados aquí, y los efectos
de tal condición en cuanto a inhabilidad de la Rho para progresar a la Meta II,
parecieran también apoyar los estudios de constricciones al cambio conformacional
de la Rho realizados por Sheick y col. (1986) y Farrens y col. (1986).
En este
143
sentido, Sheick y col. (1986) construyeron rodopsinas mutantes conteniendo sitios de
acoplamientos para iones metálicos (incorporación de His a nivel de los finales
citoplasmáticos de las hélices H-III y H-VI). El acoplamiento de ioniones metálicos
entre las His más próximas incorporadas en tales hélices, inhabilitó a las rodopsinas
mutantes de sufrir el apropiado cambio conformacional, dado que los iones metálicos
acoplados ejercieron un efecto constrictivo al movimiento de las hélices
mencionadas. Por otra parte, Farrens y col. (1986), lograron también inhibir el cambio
conformacional característico de la Rho en luz, a través la inducción de enlaces de
disulfuro entre residuos de Cys incorporados en los finales citoplasmáticos de las
hélices H-III y H-VI. Estos estudios permitieron conocer el que el movimiento y
rotación de dichas hélices, es clave para la ocurrencia del cambio conformacional de
la Rho, hacía la forma Meta II, en presencia de luz. El posible entrecruzamiento de la
Rho con sulfo-SMCC en los residuos propuestos arriba, también presentes al nivel
de los finales citoplasmáticos de las H-III y H-VI, podría explicar la detención del
cambio conformacional del fotorreceptor entrecruzado, justo en el fotointermediario
de ~ 470 nm, y consecuentemente podría contar para explicar la perdida de la
funcionalidad de la Rho entrecruzada, reportada en este trabajo.
El concepto de la oligomerización en presencia o ausencia de ligandos ha sido
aceptado generalmente para muchos GPCR. Este fenómeno se cree afecta procesos
tales como: tráfico de los GPCR, señalización y propiedades farmacológicas. Basado
en la existencia de ciertas secuencias claves, los GPCR pueden ser agrupados en
familias distintas y diversas. La Rho pertenece como se dijo anteriormente a la clase
A (también conocida como GPCRs similares a la Rho), y diversos miembros de esta
familia han mostrado su propiedad de homo-oligomerizar (George y col., 2002). La
Rho en concordancia con data revisada, no sería una excepción, como se indicó por
los resultados presentados en esta investigación, los cuales aportan fuertes
evidencias para apoyar su estado dimérico. Por otra parte, muchos pares de GPCRs
de la clase A han mostrado formar heterómeros (George y col., 2002), exhibiendo
características funcionales noveles distintas de aquellas mostradas por los
homodímeros de los receptores. Cuando los GPCRs son activados, el re-arreglo de
los oligómeros y el agrupamiento de los mismos, inicia un mecanismo novedoso de
144
intercomunicación de dichos complejos oligoméricos asistida por los componentes de
la membrana plasmática y de esta forma el anclaje de las proteínas sería posible
(Franco y col., 2003).
Un modelo simple de interacción Rho-T no es compatible con el tamaño de la
superficie citoplasmática de la Rho, la cual es muy pequeña para anclar a la TD y la
TEJ. Adicionalmente dicho modelo de interacción tampoco es compatible con la
cooperatividad para esta interacción, la cual exhibe un coeficiente de Hill de ~ 2
(Wessling-Resnick y Jonson, 1987). El empaquetamiento de las moléculas de Rho
como dímeros aportaría una plataforma que puede fácilmente acomodar ambas
unidades funcionales de la T (Marshall, 2001; Arimoto y col., 2001), y es consistente
con los estudios cinéticos del intercambio de nucleótidos de guanina catalizado por la
Rho (Wessling-Resnick y Jonson, 1987), así como también con los estudios de unión
entre la Rho y la T (Wessling-Resnick y Jonson, 1987; Willardson y col., 1993), los
cuales demostraron una regulación alostérica de la interacción de la T con la Rho*.
En concordancia con lo anterior Fillipek y col. (2004), realizaron estudios de modelaje
molecular y simulaciones de tipo computacional de un dímero de Rho interactuando
con la T. En tales estudios se apuntó que una sola molécula de Rho en el dímero es
necesaria para la interacción y activación de la TD en el ensamblaje heterotrimérico,
mientras que la segunda molécula de Rho en el dímero permanecería inactiva,
cumpliendo funciones de proteína andamio para el resto de las subunidades de la T
(TEJ). Esto fue explicado así: el primer evento de esta reacción estaría relacionado
con un movimiento de la H-VI ocurrido durante la activación por luz de la primera Rho
del dímero, la cual adaptaría una cavidad profunda a nivel citoplasmático. Dado que
esta hélice no esta involucrada en la interfase de dimerización, su movimiento no
afectaría la conformación de la segunda R (inactiva). El segundo evento del
acoplamiento, se refiriere a la penetración profunda de una cavidad formada en la
región citoplasmática de la primera R activada, por parte de la región C-terminal
helical de TĮ. Esta región esta dispuesta perpendicular a la superficie citoplasmática
de la Rho. El último evento en esta reacción de engranaje vendría dado por la
adaptación complementaria de la hélice N-terminal larga de la TĮ con el resto de una
segunda cavidad ubicada en una superficie de adaptación existente sobre la cara
145
citoplasmática del segundo monómero de R (inactivo) en el dímero. Bajo la
concepción de la existencia de la Rho como un dímero, se ha asumido que
extensivos contactos son establecidos entre la subunidad D de la T y la Rho dimérica
Adicionalmente, estas interacciones primarias, conducirían al establecimiento de
otras interacciones estabilizantes entre la segunda Rho (inactiva) con el complejo
TEJ, las cuales han sido medidas y especificadas en cuanto a los aminoácidos que
interaccionan de cada una de las proteínas en el complejo de transición (Filipek y
col., 2004 y Liang y col., 2003). En este contexto, se ha podido conocer que la TE
hace contactos con un numero de cuatro monómeros de Rho y estas interacciones
de tipo estabilizantes son perdidas al momento de la disociación de la T, para la
entrada de una siguiente molécula de T heterotrimérica. La necesidad de una
superficie citoplasmática acorde con un modelo dimérico para la interacción con la T,
y la detección de ensamblajes pentaméricos de transición conformados por dímeros
del receptor BLT1 y un trímero de proteína G soportan firmemente la estequiometría
2:1para la producción de complejos de receptor tipo GPCR:proteína G, activamente
señalizantes (Park y col., 2004).
La aplicación del método de traza evolutiva sobre 113 secuencias alineadas
de subunidades D de las proteínas G, resultó en la identificación de dos sitios
funcionales (Dean y col., 2001). Un sitio largo, bien definido para la interacción y
unión de los complejos EJ de las proteínas reguladoras de la señalización por
proteínas G (RGS), y proteínas efectoras similares a la adenilil ciclasa. El otro sitio
funcional se extendió desde el dominio de GTPasa o dominio similar a ras, sobre el
dominio helical. Este ultimo sitio funcional tiene el tamaño correcto y las propiedades
electrostáticas para la unión con un dímero de GPCR (Dean y col., 2001). Estas
predicciones teóricas pueden ser extrapoladas a la TD y son consistentes con la
estructura cuaternaria dimérica reportada en este trabajo para la Rho. Argumentos a
favor de una estructura dimérica para la Rho también son recogidos a partir de
estudios estructurales de otras proteínas que normalmente deben interactuar con la
Rho en la cascada de señalización visual a parte de la T. La arrestína visual (Arr1) es
otra proteína de unión a la Rho. Se ha podido conocer que esta proteína tiene una
estructura bipartita de dos dominios en E-sandwich estructuralmente homólogos,
146
cada uno conformado de siete cadenas de hojas E. Estos dominios se encuentran
formando por dos surcos putativos de unión para la Rho (Granzón y col., 1998;
Schubert y col., 1999). El arreglo de cargas positivas de la superficie citoplasmática
del dímero de Rho haría un acoplamiento perfecto con las cargas negativas sobre la
Arr1 (Liang y col., 2003). En este sentido, sería muy probable que un monómero de
Arr1 tenga también la capacidad de unirse a un dímero de Rho. Finalmente la
estructura cristal de la quinasa del receptor acoplado a proteína G (GRK2), también
tiene un arreglo estructuralmente acorde con las estructuras oligoméricas de los
GPCRs (Lodowski y col., 2003).
Los resultados surgidos desde EGPA-SDS y ultracentrifugación analítica
también han sugerido la presencia de estados oligoméricos de la T y sus
subunidades (Baehr y col., 1982). A partir de reacciones de entrecruzamiento
químico usando maleimídas bifuncionales, se ha logrado estabilizar covalentemente
a los oligómeros de la T (Millan y Bubis, 2002), así como también a partir del
entrecruzamiento inducido por 1-etil 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida. Estos
estudios aportaron evidencias físicas de la existencia de estos oligómeros bajo
condiciones nativas (Kosoy y col., 2003). Además, ha sido publicado que la TD
forma enlaces de disulfuro espontáneamente en la ausencia de agentes reductores
(Wessling-Resnick y Jonson, 1989). Esta condición produce una inactivación total de
la holoenzíma una vez reconstituida con el complejo TEJ nativo (Bubis y col., 1995).
Adicionalmente, las formas oligoméricas de la TD fueron las especies predominantes
cuando reactivos entrecruzadores fotoactivados específicos fueron empleados
(Villancourt y col., 1990). La co-operatividad reportada para la interacción de la Rho
con la T, es entonces muy compatible con estos hallazgos de la existencia de TD
oligomerica (Arimoto y col., 2001; Wessling-Resnick y Jonson, 1987; Min y col.,
2000). En este mismo orden de ideas, Mixon y col. (1995), describieron la estructura
tridimensional de la GiD1, la cual es un isotipo de la subunidad D de la Gi. Estos
investigadores mostraron que la subunidad D forma extensivos contactos de tipo
cuaternario con las subunidades D vecinas en capa del cristal publicado. Se ha
podido conocer a partir de este trabajo que las subunidades D están organizadas en
un arreglo de “cabeza a cola” en el oligómero, tal que cada subunidad esta
147
relacionada con la siguiente por una rotación en tornillo de dos pliegues que
posicionarían al NH2 terminal desde el dominio similar a ras o dominio de GTPasa de
una subunidad, dentro del dominio D-helical de la subunidad adyacente (Mixon y col.
(1995). En un medio ambiente de membranas donde la concentración de
macromoléculas es alta, las cinéticas de interacción entre el receptor y la proteína G
es probablemente de tipo difusión-limitada. Evidentemente, la formación de dímeros
y oligómeros de Rho solventaría estas limitaciones permitiendo que las moléculas de
T interactúen con cúmulos localmente concentrados de dímeros de Rho. Por otra
parte, la formación de complejos multiméricos de T, podría también permitir la
interacción de los dímeros de Rho con los cúmulos de subunidades TD. Ambos
fenómenos facilitarían y explicarían la amplificación de la respuesta a la luz.
Este trabajo doctoral presentó evidencias bioquímicas claras e in ambiguas de
la existencia de la Rho y la Rho* arregladas en una organización supramolecular
nativa de tipo dimérica, en su estado solubilizado en n-dodecil E-D-maltósido.
Similarmente, en este trabajo se sugirió la existencia del fotorreceptor visual
embebido en membranas de los discos de los SEB, con un arreglo nativo de tipo
dimérico/oligomérico. La Rho y la Rho* presentaron pesos moleculares de 78.000 y
76.000 medidos por técnicas de filtración molecular en gel, respectivamente para
cada especie. Pesos de 57.000 y 61.000 fueron estimados para la Rho y la Rho* por
procedimientos
de
sedimentación
por
ultracentrifugación.
Estos
pesos
correspondieron con aproximadamente el doble del peso molecular estimado para la
proteína fotorreceptora, deducido a partir de su estructura aminoacídica primaria y
sus respectivas modificaciones post-trasduccionales de tipo glicosilación N-terminal.
148
6. CONCLUSIONES.
x
La aplicación de procedimientos de filtración en gel sobre una resina de
Sephacryl S-300, evidenció que la Rho y la Rho* presentan pesos moleculares de
78.000 y 76.000, respectivamente. Los procedimientos de sedimentación en
gradientes lineales de sacarosa del 10-30% rindieron pesos de 57.000 y 61.000,
para la Rho y la Rho*, respectivamente.
Estos resultados claramente
demostraron la ocurrencia de una estructura cuaternaria dimérica nativa para la
Rho en ambas conformaciones, solubilizada en n-dodecil E-D-maltósido.
x
La medición de un contenido de detergente de 0.97 g/g de proteína en los
complejos de Rho:DM y Rho*:DM, aislados por cromatografía de exclusión
molecular, permitió conocer que el motivo de Rho y Rho* dentro de esos
complejos esta compuesto de 1.63 copias y 1.6 copias de cada especie,
respectivamente. Adicionalmente, tal contenido de detergente en los complejos
Rho:DM resultó en un volúmen específico parcial calculado para el complejo de
0.765 cm3/gr.
x
En el presente trabajo se determinó que la Rho en arreglo cuaternario dimérico
nativo es completamente funcional luego de su solubilización, purificación y
sometimiento a procedimientos de filtración en gel y sedimentación por
ultracentrifugación. Esto fue evidenciado por tres criterios importantes: (i) su
capacidad de exhibir espectros de absorción UV/Vis característicos, (ii) su
capacidad de fotoactivar a la transducina, y (iii) su habilidad de servir como
sustrato para la rodopsina quinasa.
x
A partir de los ensayos de entrecruzamiento con agentes entrecruzadotes
bifuncionales, y de la inducción de la formación de puentes de disulfuro a través
de un mecanismo de glutationilación, se logró sugerir una organización
supramolecular nativa de tipo dimérica/oligomérica, para la Rho y Rho* embebida
en membranas de los SEB y en estado solubilizado.
149
x
Basado en los resultados obtenidos por el entrecruzamiento químico de la Rho
con agentes bifuncionales, se pudo inferir que dos moléculas de Rho
interactuando en un dímero, se encuentran separadas espacialmente a distancias
no mayores de 9 a 12 Å, distancias a las cuales es posible la formación de
entrecruzados intermoleculares, de acuerdo a la química de los agentes utilizados
en este estudio.
x
Por medio de técnicas de entrecruzamiento químico utilizando el agente
bifuncional sulfo-SMCC, se logró la estabilización o congelamiento de un
fotointermediario de la Rho. Este fotointermediario estabilizado absorbe a la
longitud de onda de 470 nm y pudiera corresponder por homología de longitudes
de onda con los fotointermediarios publicados dentro del fotociclo de la Rho:
“fotointermediario desplazado hacia el azul” o Blue Shifted intermediary (BSI), o
bien con la forma Meta I. La detención del ciclo de fotoisomerización del retinal
unido a la Rho en el fotointermediario de 470 nm por entrecruzamiento con el
sulfo-SMCC, se tradujo en una incapacidad de la Rho para fotoactivar a la
transducina en presencia de luz. Este efecto inhibitorio sobre la Rho entrecruzada
dependió del bloqueo del cambio conformacional del receptor, dependiente de la
luz.
x
Los dímeros de Rho pueden ser disociados artificialmente a un estado
monomérico inducido por efecto de las altas concentraciones de n-dodecil E-Dmaltósido (entre 10 y 20 mM). Los pesos de la Rho monomérica correspondieron
a 34.6 kDa para la Rho-biotína y 45.5 kDa para la Rho-[3H]-NEM.
x
La ausencia de fragmentos termoliticos de la Rho esperados por la digestión con
termolisina de la Rho monomérica entrecruzada con el agente bifuncional sulfoSMCC, permitió confirmar la susceptibilidad de la Rho de ser entrecruzada
intramolecularmente con el mencionado entrecruzador.
150
x
Por el análisis computacional de las distancias moleculares de los residuos de
Cys y Lys en la estructura cristalina de la Rho bovina usando el Software Rasmol
se identificaron los posibles blancos de acción para el sulfo-SMCC en la
estructura de la proteína (Cys140 y Lys248).
151
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8. ANEXO I