INMOVILIZACIÓN DE UNA ENZIMA β

INMOVILIZACIÓN DE UNA ENZIMA β-GLUCOSIDASA COMERCIAL
Arévalo-Villena M*, Romo-Sánchez S, Gil-Sánchez I, Ramírez HL y Briones-Pérez A
Facultad de Ciencias Químicas, Dpto Química Analítica y Tecnología de los Alimentos,
Laboratorio Biotecnología de Levaduras, Universidad de Castilla la Mancha, España
* María Arévalo Villena, Laboratorio de Biotecnología de Levaduras, Facultad de Ciencias
Químicas, UCLM, Av. Camilo José Cela, 13071, Ciudad Real. E-mail: [email protected]
Palabras clave:
biotecnología, quitosano, adsorción, reticulación, glutaraldehído
RESUMEN
En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances que se reflejan en el
desarrollo de aplicaciones para la obtención de productos en la industria química, alimentaria
y farmacéutica. El uso de enzimas en la industria es cada vez más frecuente debido a su alta
actividad catalítica, gran especificidad de sustrato, y condiciones adecuadas de temperatura
y presión atmosféricas. Sin embargo, su uso se encuentra limitado en procesos químicos
industriales debido a que la mayoría no son estables en las condiciones de trabajo.
La inmovilización de enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, y además
facilita su reutilización, lo que hace que su empleo en procesos biotecnológicos sea mucho
más rentable.
El objetivo de este estudio fue llevar a cabo el proceso de inmovilización de una enzima βglucosidásica comercial, utilizada actualmente en Enología para la liberación de aromas. Para
ello, los métodos de inmovilización estudiados fueron: adsorción y adsorciónentrecruzamiento (reticulación) utilizando en éste último como reactivo bifuncional el
glutaraldehído. Y el soporte al que se unía dicha enzima fue quitina-quitosano.
Tras optimizar los parámetros físico-químicos de unión enzima-soporte, se estudió la
influencia de los cambios de pH y temperatura, así como su estabilidad en el tiempo. Se
determinaron también las constantes cinéticas y en las enzimas inmovilizadas se vieron los
ciclos de reuso a los que se les puede someter.
Los resultados mostraron que tanto la enzima nativa como las inmovilizadas eran estables en
un amplio rango de pH y Tª, pero las últimas presentaron mejor estabilidad a lo largo del
tiempo. Por otra parte, conservaban por encima del 15% de actividad tras once usos
consecutivos.
INTRODUCCIÓN
En la actualidad el uso de enzimas es cada vez más común en numerosos procesos
industriales (Ranganathan SV et al., 2008; Idris A et al., 2008): en el análisis químico y
clínico (Yildiz HB et al., 2007), en el procesamiento de alimentos (Dizge N et al., 2008), en la
agricultura (Vallejo V et al., 2008) o en la biotecnología (Sasaki E et al, 2008). Así como su
uso en fármacos para la enzimoterapia de numerosas enfermedades (Khan AA and Alzohairy
MA, 2010). Son herramientas fundamentales en diversas áreas de la ciencia y la tecnología.
Sin embargo, su uso como catalizadores en procesos industriales a gran escala se ve
limitado por los altos costes de producción, baja estabilidad durante periodos prolongados de
almacenamiento, el descenso de su estabilidad con los cambios en el pH, temperatura o
conformacionales. Por otra parte, las enzimas son solubles y la recuperación de las mismas
para una posible reutilización no es económicamente rentable, por lo que los procesos
enzimáticos son costosos (Kotwal SM and Shankar V, 2009). Por estas razones los métodos
para la inmovilización de enzimas juegan un papel fundamental en el incremento de los
esfuerzos por reemplazar los procesos enzimáticos convencionales.
Dicha inmovilización es una estrategia empleada comúnmente para incrementar la
estabilidad de las mismas, permite su reutilización, facilita la separación de los productos
obtenidos por la reacción enzimática del medio de reacción y como resultado de su uso los
procesos enzimáticos son más económicos (Torabi SF, 2007).
1
Numerosas metodologías se han empleado en la inmovilización de enzimas, pero para su
clasificación se dividen en dos grandes grupos: métodos físicos y químicos. Los métodos
físicos se basan en interacciones no covalentes que se establecen entre la enzima y el
soporte. Los métodos químicos consisten en el establecimiento de enlaces covalentes entre
la enzima y el soporte (Cetinus S and Oztop H, 2000). El uso de glutaraldehído como
reactivo para activar la superficie de soportes y enlazar covalentemente enzimas a los
mismos es una estrategia de inmovilización en fase sólida ampliamente utilizada. Matrices
como agarosa, nylon, perlita y quitosano se han utilizado con buenos resultados para
inmovilizar enzimas después de ser activadas con glutaraldehído. La síntesis de nuevos
soportes para la aplicación de esta metodología a la inmovilización de enzimas tiene una
especial importancia para la tecnología enzimática.
El principal objetivo de este trabajo fue estudiar la inmovilización de una β-glucosidasa
sobre una matriz de quitina-quitosano. Además se vio la influencia que ejercía el proceso de
adsorción o de unión covalente sobre el complejo enzima-soporte.
MATERIAL Y MÉTODOS
Preparación del soporte quitina-quitosano
Un gramo de quitina (de carpacho de langosta, grado de desacetilacion del 10% y tamaño de
partícula de 30 µm) se dispersó en 10 ml de agua destilada, posteriormente se añadió
glutaraldehído hasta una concentración final del 5 % (v/v). La reacción se mantuvo a 25◦C /
4h bajo agitación y oscuridad. Se lavó con agua destilada hasta eliminar el aldehído y se
resuspendió en 20 ml de agua. La quitina activada se mezcló con una solución de quitosano
al 1% (m/v) preparado por desacetilación de la quitina (Kurita et al., 1977) (peso molecular
2.1x 104 y el grado de desacetilación = 90 %) y se mantuvo en agitación entre 4 y 6 h. Se
añadió NaBH4 al medio de reacción hasta una concentración de 200 mM manteniendo la
agitación durante 16 h.
Finalmente, el soporte se recuperó mediante centrifugación, se lavó varias veces con agua
destilada y se secó a vacío hasta ser utilizado en el proceso de inmovilización.
Optimización de los métodos de inmovilización utilizados
Los métodos de inmovilización utilizados fueron adsorción y adsorción-entrecruzamiento
(reticulación). La enzima a inmovilizar fue una β-glucosidasa comercial suministrada por
Lallemand. En primer lugar se optimizaron las condiciones de unión enzima-soporte.
Adsorción
Para éste método se utilizó una cantidad fija del soporte quitina-quitosano (10 mL 0.03
g/mL), y las cantidades tanto del buffer como de la enzima dependía de las condiciones
óptimas de inmovilización especificadas abajo. El volumen final de las reacciones fue de 40
mL.
pH óptimo: se fijó una concentración de enzima de 170 µg/mL y el rango de pHs estudiados
fue de 2.5 a 6.5 (Gómez L., 2006)
Concentración óptima de enzima: diferentes concentraciones de enzima fueron estudiadas
(8.5 µg/mL, 17 µg/mL, 42.5 µg/mL, 84 µg/mL, 127.5 µg/mL, 170 µg/mL, 340 µg/mL and
680 µg/mL) obteniendo un total de 8 reacciones de inmovilización. Todas ellas fueron
llevadas a cabo en el pH óptimo de unión.
Ambos ensayos se mantuvieron a 10 ºC durante 16 h.
Tiempo óptimo de unión: las reacciones se mantuvieron durante 20, 40, 60, 90, 120, 150,
180, 210 y 240 min a 10 ºC utilizando para ello los parámetros optimizados anteriormente
(pH y concentración óptima de enzima).
Reticulación
Se añadió glutaraldehído al 50 % (w/v) (suministrado por SIGMA) al sistema enzima-soporte
conseguido por adsorción a 5 concentraciones diferentes (de 0.125 % a 1.5 %) durante ½ h.
(Bernath FR and Venkatasubramanian K, 1986).
En todos los casos, tras la inmovilización, la suspensión se recuperó mediante centrifugación
y se lavó varias veces con el buffer utilizado durante los ensayos, chequeando el porcentaje
de proteína unida mediante cuantificación por Bradford de las aguas de lavado.
2
Determinación de la actividad β-glucosidasa
La mezcla de reacción consistió de 100 µl β-glucosidasa y 400 µl de 1% (w/v) D-(+)celobiosa en 50 mM del buffer citrato-fosfato (pH 5.5), ésta se incubó durante 30’ a 37 ºC.
La actividad β-glucosidasa tanto de la enzima nativa como de las inmovilizadas se determinó
mediante hidrólisis de la celobiosa y cuantificación espectofotométrica de la glucosa liberada
(Arévalo-Villena M et. al, 2006). Lo ensayos se realizaron por triplicado.
Una unidad de actividad enzimática (U) se definió como la cantidad de enzima requerida para
liberar un micromole de glucose por minuto bajo las condiciones del ensayo
Determinación de proteína liberada
Para conocer el porcentaje de proteína adsorbida en cada proceso de inmovilización se
cuantificó la proteína libre de cada agua de lavado comparándola con la total adicionada
mediante Bradford (Bradford MM, 1976) utilizando seroalbúmina bovina
Caracterización enzimológica de las enzimas libre e inmovilizadas
Se estudió el efecto de la temperatura, pH, estabilidad al almacenamiento y constantes
cinéticas tanto en la enzima nativa como en las inmovilizadas. Po rota parte se determine el
nùmero de reusos de las enzimas enmovilizadas
Estabilidad a los cambios de pH: tanto la enzima nativa como las inmovilizadas se incubaron
con celobiosa a 37 ºC, en un rango de pHs de 2.0 a 8.0, durante 30 min.
Estabilidad térmica: las enzimas se incubaron durante 10 min de 45 – 90 ºC en intervalos de
5 ºC. Las alícuotas se enfriaron rápidamente y se chequeó su actividad hidrolítica.
Estabilidad en el tiempo: las preparaciones se mantuvieron durante 3 meses a dos Tªs
diferentes (4 ºC y 28 ºC). La actividad β-glucosidasa se chequeó a intervalos regulares de
una semana, calculando así su actividad residual.
Propiedades cinéticas: Vmáx (µmol∙min-1∙mg-1) y la constante cinética Km (mM), se
determinaron mediante los gráficos de Michaelis-Menten, utilizando para ello un rango de
concentraciones de sustrato de 0.025 % a 1% y un método de regresión no lineal (ArévaloVillena M et. al., 2006).
Reusos de la β-glucosidasa inmovilizada: la enzima inmovilizada se utilizó repetidamente, en
ciclos consecutivos en los que cada 30’ se chequeaba la actividad. En todos los ensayos, la
actividad se chequeó mediante hidrólisis de celobiosa al 1 %. La actividad de la enzima
inmovilizada se expresó como porcentaje de su actividad residual con respecto al primer ciclo
de utilización.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Optimización de los métodos de inmovilización utilizados
Se utilizó un soporte (quitina-quitosano) y dos métodos de inmovilización diferentes
(adsorción y reticulación). Los parámetros que afectan a la actividad de la β-glucosidasa se
muestran en las tablas adjuntas. En la Tabla 1 se ve que el pH óptimo de unión fue 3.5. A
los 120’ de inmovilización se alcanzó un 100 % de actividad enzimática relativa (Tabla 2). Y
la mayor actividad se obtuvo con una concentración de 170 µg/mL de β-glucosidase (Tabla
3). Respecto, al entrecruzamiento con glutaraldehído la concentración optima del mismo
para esa unión fue de 0.25% (Tabla 4).
Tabla 1. pH óptimo de unión entre la enzima y el soporte quitina-quitosano
pH
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6.5
Actividad
relativa (%)
0
0
100
0
29.32
0
7.27
0
3
Tabla 2. Tiempo óptimo de unión entre la enzima y el soporte quitina-quitosano
Tiempo
formación
(min)
Actividad
relativa
(%)
20
40
60
90
120
150
180
210
240
11,73
42,86
12,76
44,39
100
69,90
22,96
36,22
0
Tabla 3. Concentración óptima de β-glucosidasa para la unión con el soporte
Cc enzima
(µg/mL)
Actividad
relativa
(%)
8.5
17
42.5
84
127.5
170
340
680
55,22
40,30
65,67
84,33
89,55
100
76,12
70,15
Respecto, al entrecruzamiento con glutaraldehído la concentración optima del mismo para
esa union fue de 0.25% (Tabla 4).
Tabla 4. Inmovilización β-glucosidasa-quitina-quitosano mediante reticulación con diferentes
concentraciones de glutaraldehído (0.125 a 1.5 % (v/v))
Cc glutaraldehído (%) (v/v)
Actividad relativa (%)
0.125
0.25
0.5
1
1.5
60,75
100
0,00
33,64
0,00
Caracterización enzimológica de las enzimas libre e inmovilizadas
Estabilidad a los cambios de pH: la influencia de los valores de pH de las enzimas libre e
inmovilizadas se estudió en un rango de pHs de 2.0 a 8.0. En la Figura 1 se observa cómo
fuera del rango de pH, de 4.0 a 6.0 la actividad cayó rápidamente. Resultados similares se
encontraron en otros estudios (Gómez L et al., 2008; Fan G et. al., 2011).
Figura 1. Estabilidad de β-glucosidasa libre e inmovilizada frente a cambios de pH
Estabilidad térmica: La actividad de las enzimas fue directamente proporcional al aumento
de la Tª, hasta los 70 ºC (inmovilizada por adsorción) y 75ºC (inmovilizada por reticulación y
libre) donde mostraron su máximo valor. Temperaturas superiores presentaron una caída
drástica de la actividad (Figura 2).
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Figura 2. Resistencia de β–glucosidasa libre e inmovilizada a un intervalo de Tªs de 45 a 90 ºC
Estabilidad en el tiempo: La Figura 3 muestra la estabilidad de las 3 enzimas a las dos Tªs
de almacenamiento (4 y 28 ºC). Se observa cómo son estales a lo largo del tiempo e oncluso
presentan un aumento de la actividad después de los 65 días. Por otra parte, la enzima libre,
en la misma dosis que la empleada para las inmovilizaciones no presentó, prácticamente
actividad.
Figura 3. Estabilidad en el tiempo de β–glucosidasa libre e inmovilizada a dos Tªs diferentes. (A) Enzima
nativa a 28 ºC; (B) Inmovilizada por adsorción a 28 ºC; (C) Inmovilizada por reticulación a 28 ºC; (D)
Enzima nativa a 4 ºC; (E) Inmovilizada por adsorción a 4 ºC; (F) Inmovilizada por reticulación a 4 ºC.
Constantes cinéticas: En la Tabla 5 se muestran los valores de Km y Vmáx de las enzimas
nativa e inmovilizadas. La constante cinética, Km de las inmovilizadas fue similar a la enzima
libre, con pequeñas diferencias debidas posiblemente a cambios conformacionales en la
estructura enzimática producidas durante la inmovilización. Por ésta misma razón, Vmáx en la
β-glucosidasa inmovilizada fue más pequeña que en la nativa. Generalmente, la
inmovilización impide que la enzima penetre en el sustrato tan rápidamente como en la
enzima libre, y por tanto, aumenta la valor de Km. (Su E et. al, 2010)
Tabla 5. Valores de Km y Vmáx de las tres enzimas estudiadas
β-glucosidasa libre
Inmovilizada por adsorción
Inmovilizada por reticulación
Km
Vmáx
0,18
3,6
0,2
3,36
0,21
3,48
5
Reusos de la β-glucosidasa inmovilizada: Como se muestra en la Figura 4, las enzimas
mantuvieron un 21 % de actividad tras 7 usos, siendo la inmovilizada por reticulación la que
mejores resultados presentó.
Figura 4. Reusabilidad de las enzimas inmovilizadas
CONCLUSIONES
El presente trabajo muestra las ventajas que ofrece la inmovilización de enzimas
comerciales. Las beta glucosidasas inmovilizadas tuvieron una capacidad hidrolítica mayor
que la libre a la misma concentración. Con respecto a las características bioquímicas, la
nativa resultó ser también estable en las condiciones probadas. Sin embargo, el gol del
presente trabajo lo marcan la estabilidad en el tiempo durante periodso de almacenamiento
y el número de reusos, que permitiría utilizar la misma enzima hasta 7 veces consecutivas
con los consiguientes beneficios económicos en cualquier proceso biotecnológico
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