Fotosíntesis. Cadena del transporte de electrones en

Trabajo Práctico nº 9 : Fotosíntesis.
Cadena del transporte de electrones en cloroplastos de espinaca
# Integrantes:
Martínez, María Florencia
# Comisión: 2
# Objetivos:
- Visualizar el transporte de electrones cloroplástico bajo distintas condiciones de
incubación de un extracto crudo de hojas.
- Comprender el funcionamiento de las reacciones redox del transporte de electrones
fotosintético utilizando un aceptor artificial de electrones.
# Fundamento
Los cloroplastos catalizan el transporte de electrones dependiente de luz desde el agua hasta un
aceptor, el NADP+. Los componentes de la cadena de transporte de electrones fotosintéticos se
encuentran incluidos asimétricamente en la membrana tilacoide. Cada fotosistema en presencia de
luz reduce a su aceptor primario y oxida a su dador primario.
El PSII toma electrones del agua, la que es oxidada a O2 en el proceso denominado “fotólisis del
agua” y los cede a la plastoquinona. El PSI toma electrones de la plastocianina y los cede a la
ferredoxina. La ferredoxina es a su vez oxidada por la ferredoxina NADP+ oxidorreductasa para
reducir al NADP+. Los dos fotosistemas (PSII y PSI) están conectados en serie por el complejo de
citocromo b6-f.
La ferredoxina-NADP reductasa ( la enzima Terminal del transporte de electrones fotosintético)
puede reducir distintos aceptores artificiales de electrones como el metilviológeno y el ferricianuro de
potasio, además del NADP+. A su vez, el PSII también puede utilizar aceptores externos artificiales
de electrones, como el 2,6-dicloro fenol indofenol (DCPIP). Este último compuesto presenta la
ventaja de ser de color azul (a pH neutro) cuando está oxidado, mientras que es incoloro en la forma
reducida, lo que permite seguir espectrofotométricamente el curso de la reacción de reducción.
La atrazina compite con QB por el sitio en PSII.
1- Preparación de cloroplastos
Se lavaron 0,5g de hojas de espinaca con agua destilada. Luego se les quito las nervaduras, se las
secó y mortereó con 4 ml de buffer en frio. A continuación se filtró el homogenado y se lo dividió en
dos tubos eppendorf mantenidos en hielo. Se procedió con una centrifugación refrigerada, para luego
descartar el sobrenadante y resuspender el pellet (que contenia los cloroplastos) con buffer de
ruptura. Se conservaron los tubos en frío hasta su utilización
2- Visualización del transporte de electrones bajo distintas condiciones
Se prepararon 5 tubos de acuerdo al siguiente protocolo. Se mantuvieron todos los tubos con buena
iluminación, con excepción del 3 que se sometió a un periodo de oscuridad, para luego ser llevado a
la luz. Finalmente se medirá absorbancia a 600 nm (εDCPIPox= 21 mM-1 cm-1) llevando a cero con
H2O destilada, a tiempo 0, 5 y 10 minutos.
Agregados
Tubo
(ml)
1
2
3*
4
5
Buffer de
5
5
5
5
5
Ruptura
Atrazina (6
------------0,05
mM)
NH4Cl (0,3 M)
DCPIP (10
mM)
Cloroplastos
Luz
---0,15
---0,15
---0,15
0,16
0,15
---0,15
---+
0,01
+
0,01
-
0,01
+
0,01
+
# Resultados:
Tubos
Buffer de
ruptura
(ml)
Atrazina
6mM(ml)
NH4Cl
0,3M (ml)
DCPIP
10mM (ml)
Cloroplastos
(ml)
Volumen
Final
(ml)
1
5
0,15
5,15
2
5
0,15
0,01
5,16
3*
5
0,15
0,01
5,16
4
5
0,16
0,15
0,01
5,32
5
5
0,05
0,15
0,01
5,21
* Tubo que se expondrá a un periodo de oscuridad (Tubo 3osc) y luego a la luz (Tubo 3luz)
Abs 600nm
t=0
t=5
t=10
Tubo 1
0,568
0,456
0,138
Tubo 2
0,568
0,413
0,048
Tubo 3osc
0,588
0,153
----
Tubo 3luz
---0,153
0,098
Tubo 4
0,560
0,072
0,018
Tubo 5
0,563
0,147
0,144
Velocidad
(ΔAbs/min)
Vt
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3osc
Tubo 3luz
Tubo 4
Tubo 5
-0,043
-0,052
-0,087
-0,011
-0,054
-0,042
Moles DCPIPox
(nmoles/min)
Ct
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3osc
Tubo 3luz
Tubo 4
Tubo 5
10,5
12,8
21,4
2,7
13,7
10,4
Flujo de e(nmoles/min)
Ft
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3osc
Tubo 3luz
Tubo 4
Tubo 5
21
25,6
42,8
5,4
27,4
20,8
# Cálculos:
Cálculo de la velocidad:
Se realizó un cálculo de regresión lineal con Y= Abs y X=t para cada tubo; la pendiente de esta recta
representa la velocidad (Vt). Ejemplo para tubo 1:
Y  A  B.X
Tubo
1
2
3osc
3luz
4
5
Abs  0,602  0,043t
Ecuación de la recta de regresión lineal
Abs = 0,602 – 0,043.t
Abs = 0,603 – 0,052.t
Abs = 0,588 – 0,087.t
Abs = 0,153 – 0,011.t
Abs = 0,489 – 0,054.t
Abs = 0,494 – 0,042.t
Cálculo de la concentración de DCPIPox, ejemplo para tubo 1 (Ct)
C 
Abs  0,043 Abs / min

 2,048 .10  3 mM / min
1
1
 .b
21mM cm .1cm
1000ml -----------2,048.10-3 mmoles DCPIPox/min
5,15 ml -------- x = 1,05 .10-5 mmoles DCPIPox/min
= 10,5 nmoles DCPIPox/min
Cálculo del flujo de electrones, ejemplo para tubo 1 (Ft)
1nmol DCPIPox/min ------- 2 nmol e-/min
10,5 nmoles DCPIPox/min ------ x= 21 nmoles de e-/min
# Cuestionario
1- Graficar Absorbancia a 600 nm en función del tiempo para cada tubo
2- Compare los resultados obtenidos para los tubos 2 y 4 ¿Qué puede concluir sobre el estado
de los cloroplastos?
- El tubo 2 muestra el flujo de electrones en condiciones normales. Por otra parte, el tubo 4 posee
NH4Cl. Éste es un ácido débil que puede atravesar la membrana de los cloroplastos y transportar
protones disipando el gradiente: se comporta como un desacoplante. Debido a la presencia del
desacoplante en el tubo 4 hay mayor flujo de electrones que en el tubo 2. De esta observación
se puede concluir que los cloroplastos estaban en buen estado al realizar el experimento, es
decir, no estaban desacoplados.
3 – En cada tubo analice la velocidad de transporte de electrones según los diferentes
compuestos presentes en el medio de reacción.
- El tubo 1 no contenía cloroplastos por lo que no debería observarse flujo de electrones. Los
resultados obtenidos no concuerdan con esto y pueden deberse a un error en la preparación del
tubo.
- En el tubo 5 se agregó atrazina, un inhibidor del fotosistema 2, y se observa, de acuerdo con lo
esperado, que el flujo de electrones disminuye hasta hacerse prácticamente nulo.
4- Compare el transporte de electrones en presencia y ausencia de luz en el tubo 3
- En el tubo 3 se analizó el flujo de electrones en ausencia (Tubo 3osc) y presencia (Tubo 3luz) de
luz. En ausencia de luz el flujo de electrones debería ser nulo, mientras que al exponer los
cloroplastos a la luz, se debería observar flujo de electrones. Debido a un error en la
experimentación, los resultados obtenidos no concuerdan con lo esperado.