Técnicas de diagnóstico molecular

TEMA IV. TECNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR
1.− OBTENCION Y PREPARACION DE ACIDOS NUCLEICOS.
El análisis genético se puede hacer desde cualquier célula nucleada. Para estudiar el ARN debemos estudiar
las células implicadas en esta función.
P.C.R. (Reacción en cadena de la polimerasa)
Esta técnica permite la amplificación directa de un gen o fragmento de ADN, o de ARN desde su ADN
complementario. Es una técnica completamente automatizable, se puede desarrollar en pocas horas y permite
amplificar el marcial geneático hasta 100 millones de veces. Nos permite analizar el ADN de 1 sola célula.
Se basa en la aplicación práctica de 3 principios
• −Desnaturalización. Significa separar sus 2 hebras. Esto se hace calentando el ADN hasta 90−95ºC.
• −Hibridación. Añadimos un fragmento de oligonucleotidos complementarios a un fragmento del
ADN.
Fase de templado
• −Elongación. Utilización de una ADN−polimerasa termoestable (resistente a altas Tª)
Ingredientes:
• Los 4 desoxinucleotidos.
• Oligonucleotidos de la etapa de templado. Estos oligonucleotidos actúan como cebadores de la
ADN−polimerasa.
Cada uno de los oligonucleotidos ha de ser complementario a cada uno de los extremos 3' de cada una de las 2
cadenas de ADN.
La síntesis de ADN se desarrolla dirección 3'−5'
• ADN−polimerasa termoestable (TAQ−polimerasa)
Los 3 conceptos, desnaturalización, hibridación y elongación se desarrollan de forma cíclica, en unos aparatos
llamados termocicladores.
Se produce un crecimiento exponencial del ADN que tenemos de partida. En cada ciclo se duplica el ADN.
A los ciclos hay que añadir una etapa previa (desnaturalización mantenida en el tiempo) que sirve para
inactivar proteasas y nucleasas y una etapa final (elongación mantenida para que todas las elongaciones se
completen.
APLICACIONES DE LA PCR
• Diagnostico de enfermedades monogénicas. Requisito, tener tipificada la enfermedad a nivel
molecular para diseñar los cebadores. También se diagnostican los portadores.
• Estudio de cambios en el genoma de enfermedades neoplásicas.
1
• Clonación celular de fragmentos de ADN.
• Uso en medicina legal y forense. Determina la huella genética.
• En enfermedades infecciosas.
ESTUDIO DE POLIMORFISMO
Polimorfismo: La existencia simultanea en una población de genomas, con distintos alelos para un locus
determinado.
Locus: Lugar que ocupa un gen en el ADN.
Alelo: Una de los posibles secuencias nucleotípicas que usan un mismo locus.
Si el polimorfismo afecta a una región codificante se habla de polimorfismo génico, si por el contrario afecta
una región no codificante hablamos de polimorfismo genético.
El polimorfismo génico es el que causa enfermedades
El polimorfismo genético determina la huella genética o la paternidad.
TECNICAS PARA IDENTIFICAR POLIMORFISMOS
• RFLP. Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (génicos y genéticos)
RFLP identifica las dianas de restricción para una determinada enzima de restricción. Si una enzima
determinada no actúa en todas las dianas, hay una diana de restricción alterada/mutada.
TECNICA DE HIBRIDACION SOUTHERN (SOUTHERN−BLOT)
Electroforesis.− técnica de selección de biomoléculas en función a su carga por la aplicación de una corriente
eléctrica.
Para la electroforesis se pone la muestra e soluciones de azarosas, polímetro poroso. Tras obtener el gel de
azarosa tonel ADN migrado, según su tamaño, se le añade un agente alcalino para su desnaturalización
química.
Luego hay que traspasar el contenido de ADN del gel de agarosa unas membranas de nylon o nitrocelulosa,
esto se hace por capilaridad.
El gel de azarosa se pone sobre una base liquida, arriba de la membrana de nylon y encima papel, que absorbe
el liquido que arrastra las muestras de ADN hasta la membrana de nylon.
La hibridación se realiza por una sonda que es una secuencia corta de ac nucleicos de secuencia conocida,
complementaria a la región que queremos estudiar y esta marcada para facilitar su identificación.
Al revelar la placa vemos donde se ha acoplado la sonda.
CASO PRÁCTICO. DIAGNOSTICO DE ANEMIA FALCIFORME.
Esta enfermedad se produce por una mutación en el gran que codifica una cadena de −globulina. Se
localizan 2 puntos de corte para la MST−II en el gen. Tenemos 2 fragmentos, uno de 1´2 Kb y otro de 0´2 Kb.
En el gen mutado solo hay un fragmento de 1´4 Kb ya que desaparece una enzima de restricción.
2
Unimos las sondas que se unen al 1º fragmento y al 2º.
• Si al unir la 1ª sonda detectaremos 1 sola migración de 1´2 Kb. Este individuo es homocigótico
sano.(1)
• Si detectamos 2 migraciones, una de 1´2 Kb y otra de 0´2 Kb el individuo es heterocigótico,
portador.(2)
• Si detectamos 1 sola migración de 1´4 Kb (1´2+0´2) el individuo es homocigótico para el gen mutado,
enfermo.(3)
123
• VNTR. Numero variable de tendems repetidos o minisatélites.
En determinadas zonas aparece enzimas no codificantes de secuencias repetidas que se heredan por leyes
mendelianas.
Se puede usar hibridación southern o PCR. Sirve para la determinación de la paternidad o identificación de
sospechosos en medicina legal y forense.
Tras aplicar PCR no habría que aplicar enzimas de restricción ya que el tamaño lo da el nº de repeticiones.
3