Tesis - Universidad de Colima

Universidad de Colima
MAESTRÍA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
CON ESPECIALIDAD EN FISIOLÓGIA
HOMEOSTASIS IÓNICA EN EL PROCESO DE MUERTE
CELULAR PROGRAMADA
TESIS
Que para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Fisiológicas
con Especialidad en Fisiología
PRESENTA
Q.F.B. Elva Yesenia Luna Martínez
ASESOR
Dra. Oxana Dobrovinskaia
COASESOR
Dr. Igor Pottosin
Colima, Col., febrero del 2003.
Este trabajo fue realizado en el laboratorio de Inmunología del
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas (CUIB) de la
Universidad de Colima. Agradezco el apoyo recibido por el Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) para llevar a cabo el
posgrado de la maestría en Ciencias Fisiológicas con Especialidad
en Fisiología.
AGRADECIMIENTOS
 A mi familia por su apoyo incondicional que me ha brindado siempre.
 A mis asesores la Dra. Oxana Dobrovinskaia y al Dr. Igor Pottosin por los
conocimientos y tiempo compartido durante la realización de este proyecto.
 A CONACYT por su apoyo económico para la realización de la maestría.
 A Juan Manuel Viveros Paredes por su cariño y comprensión.
 A mis amigos Angeles, Víctor y Leonardo por convivir y compartir conocimientos
durante el tiempo que me llevo realizar mis estudios.
ÍNDICE
Tablas y figuras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Introducción. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Objetivos . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Capitulo I. Homeostasis iónica en la fisiología normal de las células linfoides.
I.1.- Iones monovalentes en la fisiología celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
I.2.- El papel del calcio en la fisiología de las células linfoides . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Compartamentalización de Ca2+ en linfocitos y mecanismos del mantenimiento
de Ca2+ intracelular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
El calcio como un mensajero secundario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Oscilaciones de calcio: un mecanismo para especificar las señales. . . . . . . .18
I.3.- Regulación de volumen celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Iones que mantienen el volumen celular en un estado estable . . . . . . . . . . . .20
Osmolitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Mecanismo de regulación que incrementa el volumen celular (RVI ) . . . . . . .23
Mecanismo de regulación que disminuye el volumen celular (RVD) . . . . . . .24
Capitulo II. Muerte celular programada (apoptosis) y su impacto fisiológico.
II.1.- La apoptosis como un proceso fisiológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
II.2.- Fases de apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
II.3.- Estímulos apoptóticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
II.4.- Cascada de caspasas en el desarrollo de apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
II.5.- El Papel de la mitocondria en la apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
II.6.- La señal de calcio en el proceso de la muerte celular apoptótica . . . . . . . . . 35
Activación de enzimas dependientes de calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
El control de apoptosis dependiente de calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
II.7.- Los mecanismos de apoptosis en las células linfoides. . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
II.8.-Decremento del volumen durante apoptosis (AVD, apoptotic volume decrease)
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Capitulo III. Impacto de la homeostasis de iones monovalentes en el desarrollo de la
apoptosis.
III.1.- Dinámica de potasio durante la muerte celular apoptótica . . . . . . . . . . . . . 42
La cinética de K+ intracelular en los diferentes eventos durante la apoptosis. .
. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Activación de caspasas y endonuclesas dependientes de potasio . . . . . . . .47
El Control de apoptosis dependiente de potasio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
III.2.- Cambios en la actividad de canales iónicos durante la apoptosis . . . . . . . . 51
Discusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
TABLAS Y FIGURAS
Figura 1. Distribución de iones monovalentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Figura 2. Vías de señalización y regularización de Ca2+ en célula B . . . . . . . . . . . . 14
Figura 3. Ciclo de Ca2+ en mitocondria energizada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Figura 4. Mecanismos de regulación del volumen en célula de mamífero . . . . . . . . 23
Figura 5. Regulación del volumen en linfocitos en respuestas a estrés hipotónico . 24
Figura 6. Fases de Apoptosis y cascada de activación de caspasas . . . . . . . . . . . . 31
Figura 7. Mecanismos moleculares de la regulación mitocondrial durante apoptosis . . 34
Figura 8. Las vías de acción de calcio de apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Figura 9. Vías de Señalización de apoptosis del receptor CD95 . . . . . . . . . . . . . . . 38
Figura 10. Disminución del volumen apoptótico y posible enlace a apoptosis . . . . . 41
Figura 11. La salida de K+ celular en células apoptóticas es simultaneo con otros
eventos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Figura 12. Análisis del encogimiento celular durante apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Figura 13. Relación de la perdida de volumen celular y salida de K+ en células Jurkat
tratadas con anti-Fas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Figura 14. Relación del contenido de DNA y concentración de K+ en linfocitos Jurkat
tratadas con el anticuerpo anti-Fas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
Figura 15. La actividad de caspasas y nucleasas es restringida en células con bajo
K+ intracelular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Figura 16. Relación de la salida de K+, actividad de caspasas y endonucleasas en
apoptósis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Figura 17. Efecto de K+ en la actividad de caspasa-3 y activación de pro-caspasa-3
por dATP y citocromo c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Figura 18. Diferentes concentraciones de K+ extracelular inhiben el proceso de
apoptosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
Figura 19. Activación del canal ORCC en apoptosis inducida por el receptor CD95. 51
Figura 20. Inhibición de la muerte celular y cambios bioquímicos en células linfoides
tratadas con STS y TNF/CHX y bloqueadores de canales de K+ y Cl- . 52
1
Figura 21. Activación del canal K+ sensible a 4-Aminopiridina por radiación UV . . . 53
Figura 22. Inhibición del canal Kv1.3 en células Jurkat por estimulación del receptor
CD95 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
Figura 23. Actividad del canal de K+ (Kv1.3) en células Jurkat tratadas con
actinomicina D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 54
Figura 24. Análisis Western blot de las subunidades  y  de la ATPasa Na+-K+ en
apoptosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Figura 25. Esquema propuesto que muestra el papel de K+ en apoptosis. . . . . . . . 57
Figura 26. Diagrama esquemático que muestra el mecanismo propuesto que media
la AVD y la apoptosis del receptor CD95 en células Jurkat . . . . . . . . . . 59
Figura 27. Vías de señalización y mecanismos de transporte durante la apoptosis del
receptor CD95. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Figura 28. Regulación de volumen en linfocitos en respuesta a estrés hipotónico. . 62
Figura 29. Regulación de los mecanismos de transporte bajo apoptosis inducida por
CD95. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Tabla 1. Canales iónicos en linfocitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Tabla 2. Inductores de apoptosis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Tabla 3. Inhibidores de apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Tabla 4. Miembros de la familia de las caspasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Tabla 5. Proteínas que son procesadas por caspasas miembros de familia de las
caspasas durante la muerte celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Tabla 6. Correlación de los eventos durante la RVD y AVD en linfocitos . . . . . . . . . 63
Tabla 7. Eventos durante el proceso de apoptosis en diferentes células . . . . . . . . . 64
2
RESUMEN
La pérdida de volumen celular, es una de las características más generales
del proceso de apoptosis, ya que se presenta en los diferentes estímulos apoptóticos
que actúan a través de las distintas vías de señalización apoptóticas. Durante la
disminución del volumen apoptótico (AVD) se ha reportado una pérdida de iones K+,
dando como resultado una alteración en la homeostasis iónica. Con la finalidad de
determinar los mecanismos que llevan a la AVD, se analizaron la homeostasis iónica
y los mecanismos moleculares que ocurren durante el proceso de apoptosis en
linfocitos. Encontramos que a concentraciones fisiológicas de K+ intracelular y el
bloqueo de canales de Cl- o de K+ inhiben el encogimiento celular apoptótico
suprimiendo la muerte celular programada. Así como también, la AVD es un
promotor de apoptosis acoplado a la pérdida de K+ intracelular que participa en la
activación de caspasas y nucleasas. Finalmente, las vías de desarrollo de apoptosis
están conectadas a la AVD por medio de cascadas de señalización que activan
algunos mecanismos de transporte empleados en la regulación de volumen celular
normal.
3
Abstract
Cell shrinkage is a hallmark of apoptosis. It takes place
independent on
apoptotic stimuli and signal transduction pathways involved. Apoptotic volume
decrease (AVD) is known to be accompanied by an efflux of intracellular K+, resulting
in ion homeostasis changes. Analysis of ion homeostasis and molecular mechanisms,
occurring in lymphocytes undergoing apoptosis, was undertaken to reveal the
pathways leading to AVD. It appears that physiological concentrations of intracellular
K+ as well as blockage of Cl- and K+ ion channels prevent apoptotic cell shrinkage
and program cell death. AVD was concluded to promote apoptosis process being
coupled to K+ efflux, which in turn affects the activation of caspases and nucleases.
Finally, the apoptotic pathways were shown to be linked to AVD by means of signal
cascades and include some parts of regulatory volume decrease mechanisms.
4
INTRODUCCIÓN
La apoptosis o muerte celular programada es un proceso que ocurre en los
tejidos en condiciones fisiológicas normales, el cual es disparado por una variedad de
estímulos apoptóticos que activan diferentes vías de señalización apoptótica, y es
esencial en el desarrollo y homeostasis del sistema inmune. En respuesta a una
infección
se
requiere
de
un
incremento
en
el
número
de
linfocitos
y
subsecuentemente su eliminación por apoptosis después de la recuperación. Este
tipo de muerte, siempre es acompañado por encogimiento celular siendo uno de los
mecanismos que previene la liberación del contenido celular sin afectar otras células
ni provocar inflamación.
El encogimiento celular apoptótico precede a otros procesos de apoptosis
tales como la liberación de citocromo c, activación de caspasas y fragmentación de
DNA (Gómez-Angelats et al. 2000; Maeno et al. 2000). Durante la AVD ocurre una
pérdida de K+ intracelular (Bortner et al. 1997). Recientemente se ha demostrado que
la pérdida de iones monovalentes juega un papel primordial en apoptosis, es por eso,
que manteniendo las concentraciones fisiológicas de éstos iones se puede inhibir la
activación de caspasas y nucleasas, así como también, la muerte celular programada
(Thompson et al. 2001).
Existe la posibilidad de que la AVD utilice mecanismos similares que son
empleados en la regulación que disminuye el volumen celular (RVD) en respuesta a
un choque hipoosmótico (Gómez-Angelats et al. 2000). La RVD involucra la salida de
K+, Cl- y osmolitos orgánicos (Lang et al. 1998a; 1998b), al igual que en la AVD se ha
demostrado la pérdida de K+, Cl- y osmolitos orgánicos (Maeno et al. 2000). En
linfocitos T Jurkat Szabo y col. (1996 y 1998) han reportado la inhibición de canales
de potasio tipo-n dependientes de voltaje (Kv1.3) y la activación de un canal de cloro
rectificante saliente (ORCC) por la estimulación del receptor APO-1/Fas(CD95).
Mientras que en otros tipos celulares se ha mostrado la activación de canales de Cly K+ con distintos estímulos apoptóticos (Wang et al. 1999; Nietsch et al. 2000).
5
Cambios en las concentraciones iónicas intracelulares acompañan la AVD
modulando la actividad de caspasas y nucleasas, regulando así la progresión de
apoptosis (Hughes et al. 1997), lo que sugiere que el papel que juegan los iones es
más extenso que simplemente facilitar la pérdida del volumen celular. Por lo tanto, el
propósito de este trabajo monográfico es analizar los mecanismos responsables del
encogimiento celular apoptótico y su asociación con otros eventos durante el proceso
de muerte celular programada en linfocitos. Para llevar a cabo ésta investigación nos
hemos propuesto algunos objetivos que son los siguientes:
OBJETIVO GENERAL:
Analizar la homeostasis iónica y mecanismos moleculares que llevan a la
disminución del volumen apoptótico en linfocitos durante el proceso de muerte celular
programada.
OBJETIVOS PARTICULARES:
 Determinar si la disminución del volumen apoptótico es una característica
secundaria o es un promotor del proceso de apoptosis.
 Analizar la cinética de la pérdida de potasio y disminución de volumen en células
apoptóticas, relacionando otros eventos característicos de este proceso.
 Examinar si la pérdida de potasio es característica secundaria o es necesaria para
la activación y progresión de apoptosis.
 Revisar si las vías de muerte celular apoptótica están acopladas a la activación del
encogimiento celular.
 Analizar si los mecanismos de regulación de volumen celular normal son
empleados en el encogimiento celular apoptótico o la célula posee mecanismos
especiales que llevan a la disminución del volumen apoptótico.
6
CAPITULO I. HOMEOSTASIS IÓNICA EN LA FISIOLOGÍA NORMAL
DE LAS CÉLULAS LINFOIDES.
I.1.- Iones monovalentes en la fisiología celular.-
I.1.1. Gradientes de iones monovalentes a través de la membrana plasmática.
Las células animales mantienen concentraciones asimétricas de iones a través
de la membrana plasmática, en la Figura 1 se muestra la distribución de iones
monovalentes entre el lado extracelular e intracelular de la membrana.
Figura 1. Distribución de iones monovalentes.
La concentración de iones monovalentes en el lado interno (5-15mM de Na+, 140mM de K+, 5-15mM
de Cl-) y externo (145mM de Na+, 5mM de K+, 110mM de Cl-) de la membrana plasmática de una
célula de mamífero (a). En (b) se esquematiza los movimientos de iones monovalentes a través de la
membrana plasmática. La ATPasa Na+-K+ transporta 3Na+ hacia fuera y 2K+ hacia dentro de la célula,
por hidrólisis de trifosfato de adenosina (ATP). La difusión de Na+, K+ y Cl- a través de canales
transmembranales sigue sus gradientes electroquímicos. Em, potencial de membrana ( -70 mV).
7
a) ATPasa Na+-K+.
La generación y mantenimiento de los gradientes transmembranales de
+
+
+ +
concentración de Na y K se debe a la actividad de la ATPasa Na -K , la cual es una
proteína tetramérica integral de la membrana plasmática compuesta por dos
subunidades grandes  transmembranales y dos subunidades pequeñas . La
subunidad  contiene el sitio de unión para ATP y tres sitios para Na+ en la superficie
citoplasmática, y dos sitios de unión para K+ en la superficie externa. Es
reversiblemente fosforilada y desfosforilada durante el bombeo (Lingrel and
+
+
Kutzweiler, 1994). Para transportar Na y K a través de la membrana plasmática
utiliza la energía metabólica obtenida al catalizar el ATP en difosfato de adenosina
(ADP) y fosfato inorgánico, así por cada molécula de ATP hidrolizada bombea 3Na+
hacia el exterior y 2K+ al interior de la célula (100 moléculas de ATP pueden ser
hidrolizadas por cada molécula de ATPasa cada segundo), (Glynn, 1993). Una
tercera parte de la energía de una célula animal es consumida por ésta bomba. La
ATPasa es estimulada por el incremento de la concentración intracelular de Na+ y es
inhibida por hiperpolarización y ouabaina un inhibidor específico que compite con K
+
por el mismo sitio de unión en el lado externo de la ATPasa (Bortner et al., 2001).
b) Canales de K+ y generación de potencial de membrana.
El K+ es importante en procesos celulares, tales como el crecimiento celular
normal, la división celular, la síntesis de las proteínas y del ADN, la regulación del
volumen celular y en el estado ácido-base intracelular requieren de una
concentración elevada de K+ intracelular (De la Torre et al., 2002), así como también
enzimas que son activadas por bajo nivel de K+ como caspasas y nucleasas durante
el proceso de apoptosis (Gómez-Angelats et al., 2000).
El gradiente electroquímico de K+ conduce iones K+ hacia fuera de la célula,
guiando a un exceso de carga positiva en el lado extracelular creando una diferencia
de potencial eléctrico () con el lado interno negativo a través de la membrana
8
celular. El potencial de membrana celular conduce la salida de aniones tal como el
Cl-. Por tanto, el potencial de membrana esta determinado por la combinación
interactiva de la ATPasa Na+-K+ y los canales de K+.
Los canales de K+ en los linfocitos juegan un papel importante en el desarrollo
y mantenimiento de sus funciones, incluyendo regulación del volumen celular,  y
señalización de Ca2+ (ver revisión Cahalan et al., 2001). En linfocitos y timocitos se
puede encontrar tres tipos de canales dependientes de voltaje (Kv): n (normal), n’
(casi normal) y l (de gran conductancia y con distinto umbral de la activación), siendo
el más importante el canal Kv tipo n por que su conductancia iónica predomina en los
linfocitos en reposo (Tabla 1). Los canales Kv tipo n se inactivan y se recuperan de la
inactivación lentamente, los de tipo l se reactivan rápidamente y los de tipo n’ no
presentan inactivación (Lewis and Cahalan, 1988). Los canales Kv contribuyen en el
mantenimiento del potencial de membrana en reposo (-50 a -60 mV) de linfocitos T
humanos (ver Cahalan et al., 2001; Verheugen et al., 1995). Los linfocitos T
periféricos de ratón carecen de una tercera parte de canales KV, sin embargo el
potencial de la membrana se mantiene en el rango de -60 a -70mV debido a la
actividad de la ATPasa Na+-K+. Entonces, durante la diferenciación de linfocitos T de
ratón el mecanismo predominante de la generación del potencial de membrana se
cambia de la electrodifusión (dentro de timo, a través de canales de K+) a
electrogénico (células T periféricos, vía ATPasa Na+-K+) y regresa a la electrodifusión
en linfocitos periféricos activados (Ishida and Chused, 1993).
El otro grupo de canales de K+ son los activados por Ca2+ (KCa): de
conductancia intermedia (IKCa ) y pequeña (SKCa), ambos son activados por Ca2+ a
un nivel submicromolar (400 nM y están cerrados a 100 nM Ca2+), tienen diferente
sensibilidad farmacológica y se expresan diferencialmente en varios tipos de células
linfoides (Tabla 1). Normalmente, el número de canales IKCa por célula T humana
son 20 comparado a cientos de canales Kv (300-400/célula), incrementando los
canales IKCa después de la activación mitogena a 500/célula (Grissmer et al.,
1993). En cambio timocitos humanos y murinos en reposo expresan un número
mayor de canales KCa (200-300/célula), y también presentan un pequeño
incremento durante la activación (DeCoursey et al., 1984; Lewis and Cahalan, 1988).
9
Los canales KCa participan en la regulación del potencial (hiperpolarización) durante
la entrada de Ca2+ y oscilaciones de Ca2+ inducida por mitógenos (Grissmer et al.,
1992). Estos canales están activados a potenciales hasta -100 mV cuando los Kv
permanecen cerrados (DeCoursey et al., 1984).
c) Sistemas de transporte acoplados a Na+.
El flujo de sodio dentro de la célula es conducido por su gradiente
electroquímico. Este flujo puede ser acoplado a procesos de transporte de
compuestos de moléculas impermeables a través de la membrana plasmática como
glucosa, aminoácidos y otros nutrientes dentro de la célula. El transportador
Na+/glucosa importa una glucosa y dos iones Na+ hacia dentro de la célula, así como
el intercambiador Na+/Ca2+ que transporta tres iones Na+ bajo su gradiente
electroquímico y exporta Ca2+ contra su gradiente electroquímico (Lodish et al.,
1999). El gradiente de sodio es responsable de la osmolaridad de los líquidos
extracelulares y el mantenimiento del volumen celular (De la Torre et al., 2002).
-
d) Canales de Cl .
Los canales de cloro juegan un papel importante en la regulación del volumen
celular, estos son necesarios para regular el encogimiento o hinchamiento celular
acompañados por la entrada de Na+ o salida de K+ respectivamente, para mantener
la electroneutralidad (Lang et al., 2000b). En linfocitos T Jurkat se ha identificado un
canal de Cl- con rectificación hacia fuera activado por hinchamiento osmótico (Cl-SwellSwelling-activated Cl- channel, Tabla 1), el cual participa en el mecanismo de
regulación de volumen en linfocitos expuestos a condiciones hipoosmóticas (Lewis et
al., 1993). La tirosina cinasa P56Ick activa un canal de Cl- (ORCC- Outwardly
rectifying chloride channel, Tabla 1) en linfocitos Jurkat, así como también durante el
proceso de apoptosis inducida por el receptor CD95 (Szabo et al., 1996). Éstos dos
tipos de canales de Cl- son activados por la tirosina cinasa P56Ick y bloqueados por
DIDS. Entonces el hinchamiento celular y la cinasa P56Ick parecen activar el mismo
canal de Cl- en linfocitos, pero hasta el momento su estructura no es conocida.
10
Tabla 1. Canales iónicos en linfocitos.
Grupo/tipo
a
de Canal
Selectividad
+
De K (Kv)
+
K 
tipo:
+
n (Kv1.3) Rb 
+ 4
2,12
(12-18pS ) NH 4
Activación

Umbral de
activación
1,12
- 52± 8 mV
Farmacología








n'
12
(17pS )
l (Kv3.1)
2,12
(21-27pS )
+
De K (KCa)
tipo:
IKCa
4
(11pS )
SKCa
4
(5pS )
De Cl tipo:
Clswell
14
(25-28pS)


K 
+
Rb 
+
NH 4 >
+4
Cs
+

I SCN 
NO-3Br Cl- 
MeSO3 
acetato10
ORCC
15
(31pS)


TEA, 0.05-0.1mM

CTX, 3-4 nM
9
CTX-Glu, 33nM
8,9
TRAM-34,20nM
4
TEA, 40 mM



Kd=400nM
2+ 6
Ca i
Solución
hipoosmótica
10,14
extracelular
ICK 14
Cinasa P56

Cinasa P56


ICK 15






15
Apoptosis

2+
De Ca tipo:
CRAC
SWAC


Ca 
2+
Ba =
2+
Sr 
2+ 7
Mn
2+
2+ 11
Ca


Depleción
de
2+
almacén
Ca
(estimulación
del
receptor,
liberación, IP3,
2+
y
buffers Ca
7
Tapsigargina)
Solución
hipoosmótica
11
extracelular
9
Shk-Dap, 52pM
5
CTX,  1 nM
5
KTX, 3nM
4
NTX, 1-10nM
9
Correolido, 90nM
3
Quinina, 20M
3
4-AP, 0.15mM
2,4
TEA, 8-16mM
CTX,  5 nM
12
TEA, 100 mM



-
Umbral de
activación
12
- 40 mV
Umbral de acti12
vación - 10 mV
Kd=400nM
2+ 1, 4
Ca i
b






12
2
4,5
6
Apamina 1nM
9
UCL1648, 200pM
DIDS, 500 M
10
SITS, 89 M
Herbimicina A
14
10M
14
Distribución
Papel fisiológico

Linfocito
T huma1,5
no y
2
raton
Regulación del
potencial de
membrana y
volumen celular,
secreción de
interleucina-2 y
proliferación
celular.

Linfocito
12
T raton

Lintocito
2,12
T ratón
Linfocitos Regulación del
potencial de mem
TyB
1,4
brana y volumen
humanos
celular, modulación de la señal
de calcio y proli Linfocito
6
feración celular.
T Jurkat

Linfocitos
B yT
10
raton
 Linfocito
10, 14
T Jurkat

Regulación del
volumen celular
y proceso de
apoptosis.
DIDS, Glibencla-  Linfocito15
mida y IAA 100 T Jurkat
15
M
Herbimicina A
15
10M
2+
13
 Linfocito
Señalización de
Ca 4-5 M
7,13
2+
T
Jurkat
Ca y activación
0.3mM de iones
2+
(bloquea   Timocitos de Célula T.
Cd
11
2+
2+
raton
90%) y Ni o Co
7
(bloquea 50-60%)
11
La3+,58 nM
11
Gd3+,28 nM
La3+,2.4 M
11
Gd3+, 3.8 M
11

Timocitos Señalización de
inmaduros Ca2+ en la
11
de ratón
regulación de
volumen.
11
a
CRAC (Calcium release-activated channels), canal activado por depleción de almacenes
intracelulares de calcio; SWAC (Ca+2-permeable nonselective cation channels), canal catiónico no
selectivo permeable a Ca2+.
b
TEA, tetraetilamonio; CTX, Carybdotoxina; 4-AP, 4-aminopiridina; NTX, Noxiustoxina; KTX,
Kaliotoxina; Shk-Dap, toxina Stichodactyla helianthus-Acido diaminopropionico; DIDS, diisotiocianato2-2 ácido stilbensulfonico; IAA, ácido indolacético.
Referencias de la Tabla 1:
1. Verheugen et al., 1995.
9. Cahalan et al., 2001.
2. DeCoursey et al., 1987.
10. Lewis et al., 1993.
3. DeCoursey et al., 1984.
11. Ross and Cahalan, 1995.
4. Grissmer et al., 1993.
12. Lewis and Cahalan, 1988.
5. Rader et al., 1996.
13. Kerschbaum and Cahalan, 1998.
6. Grissmer et al., 1992.
14. Lepple-Wienhues et al., 1998.
7. Premack et al., 1994.
15. Szabo et a l., 1998.
9. Wulff et al., 2000.
I.2.- El Papel del calcio en la fisiología de las células linfoides.-
I.2.1.
Compartamentalización
de
Ca2+
en
linfocitos
y
mecanismos
de
mantenimiento de Ca2+ intracelular.
La concentración del calcio intracelular en las células de mamífero en reposo
es muy baja (100-200 nM), mientras que la concentración extracelular (1-2 mM) y la
del retículo endoplásmico (RE, 100 M, Golovina and Blaustein 1997) es alta. Por lo
tanto, el gradiente de Ca2+ tiende a conducir Ca2+ dentro del citosol a través de los
canales de la membrana plasmática y la membrana del RE. Mediciones de Ca2+ libre
en mitocondrias (50-200 nM) han mostrado que su nivel normalmente esta más bajo
que en el citosol (Bernardi, 1999a,b), lo que restringe la liberación de Ca2+ en pocas
mitocondrias con un nivel de Ca2+ elevado.
La concentración de Ca2+ intracelular es regulada por el transporte de Ca2+
dentro y fuera del RE, así como también a través de la membrana plasmática entre la
célula y su ambiente (ver revisión de Berridge et al., 1998). Las vías de transporte de
12
Ca2+ a través de la membrana plasmática es por medio de una ATPasa-Ca2+, un
intercambiador Na+/Ca2+ y canales de Ca2+ que contribuyen a la modulación y
estabilización de la señal de Ca2+ (Figura 2). La ATPasa-Ca2+ tiene mayor afinidad
por los iones Ca2+ que el intercambiador Na+/Ca2+ (Balasubramanyan et al., 1994).
En linfocitos, la ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática proporciona el
mecanismo dominante para transportar Ca2+ aunque el intercambiador Na+/Ca2+
también contribuye (Donnadieu et al., 1992). El Ca2+ entra a la célula a través de
canales activados por depleción de almacenes intracelulares de Ca2+ (CRACcalcium release-activated channels, Tabla 1), que contribuyen a un aumento en la
concentración de Ca2+ intracelular necesaria para la activación de células T y la
expresión de genes (Lewis, 2001).
Los canales CRAC activados por la descarga de Ca2+ del RE interaccionan con
diferentes almacenes celulares. La mitocondria mantiene la actividad de canal CRAC
secuestrando el Ca2+ cerca del canal para prevenir su inactivación por la
acumulación de Ca2+ (Hoth et al., 2000). Estos canales pueden ser inhibidos por
esfingosina y ceramida a través de la estimulación de Fas en linfocitos T (LeppleWienhues et al.,1999). El número de canales CRAC expresados por célula T en
reposo es bajo (10-15 por célula), incrementándose durante la activación de las
células T a 150 canales por célula (Fomina et al., 2000). En linfocitos la señal de
Ca2+ depende principalmente de la entrada a través de canales CRAC conducida por
el potencial de membrana negativo. Así como también, la apertura de canales IKCa1
por el aumento inicial de Ca2+ citosólico y de canales Kv1.3 en respuesta a la
despolarización de la membrana para proporcionar mecanismos que aumenten la
entrada de iones de K+ y mantener el potencial de membrana para promover la
entrada de Ca2+ en el tiempo requerido para la nueva transcripción de genes
(Cahalan et al., 2001).
13
Figura 2. Vías de señalización y regulación de Ca2+ en célula B.
La señal de Ca2+ inducida por el receptor antígenico de la célula B (BCR, B-cell antigen
receptor) involucra la producción de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y la liberación de Ca2+ de almacenes
intracelulares, por la fosforilación y activación de fosfolipasa C gama (PLC-), la cual corta a
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) para generar IP3 y DAG (diacilglicerol). El IP3 libera Ca2+ del RE
por la activación de los receptores de IP3 (IP3R) y de rianodina (RyR). La descarga de RE lleva a la
entrada de Ca2+ por activación de canales CRAC a través de un mecanismo no conocido indicado por
la línea punteada. El mecanismo de activación del RyR1 de la célula B no es claro. El papel del IP3R y
del canal de Ca2+ tipo-L de la membrana plasmática no es claro, pero tienen la posibilidad de que
pueden mediar la entrada de Ca2+ indicado por líneas punteadas. El posible papel y localización del
receptor NAADP (fosfato dinucleótido adenina ácido nicotínico) en la célula B es especulativo, así
como también la identificación del canal de Ca2+ tipo-L como un receptor NAADP. La Anexina V es
mostrada como un posible canal de Ca2+. La señal de Ca2+ activa canales KCa y es sostenida por la
mitocondria que toma Ca2+ cerca de los canales CRAC para prevenir su inactivación y redistribuirlo a
otro sitio en la célula. El Ca2+ citosólico es regulado por la ATPasa-Ca2+ de la membrana plasmática
que transporta Ca2+ fuera de la célula por hidrólisis de ATP a ADP y un intercambiador Na+/ Ca2+, así
como también es transportado al RE por la ATPasa-Ca2+. Syk y Lyn son proteínas cinasas que
pueden regular la entrada de Ca2+. (ver revisión Grafton and Thwaite, 2001).
14
El transporte de Ca2+ entre el RE y el citoplasma es a través de una ATPasaCa2+ (bomba SERCA) y canales sensibles a inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) y a
rianodina (RyR), (Figura 2). El Ca2+ es almacenado en el RE por la bomba SERCA
que transporta Ca2+ contra su gradiente electroquímico dentro del lumen del RE,
usando la hidrólisis de ATP como fuente de energía (2 iones Ca2+ son transportados
por cada ATP hidrolizado) para la liberación de Ca2+ inducida por IP3 y controlar la
entrada de Ca2+ de canales CRAC (Lewis, 2001). Cuando la concentración de Ca2+
citosólico es elevada por la liberación de almacenes intracelulares la bomba SERCA
será activada (por el aumento de Ca2+ intracelular) y los canales de liberación de
Ca2+ del RE serán cerrados, así que cuando la concentración de Ca2+ citosólico ha
disminuido al nivel en reposo la bomba SERCA es inhibida (Mogami et al., 1998). El
inhibidor farmacológico específico de la bomba SERCA es la tapsigargina (1 M),
que descarga el almacén intracelular de Ca2+ y activa los canales CRAC en la
membrana plasmática (Hoth et al., 2000).
El IP3 disparan la liberación de Ca2+ del RE activando los IP3Rs. En
concentraciones bajas de Ca2+ citosolico la liberación de Ca2+ a través de IP3R es
acelerada, pero cuando la concentración de Ca2+ es alta (0.3 M) es inhibida. La
respuesta del IP3R puede ser regulada por fosforilación, varias proteínas accesorias,
Ca2+ y ATP, pero principalmente por Ca2+ (Ehrlich et al., 1994). En linfocitos B y T
existen los tres tipos de IP3R (IP3RI, IP3R2 y IP3R3), los cuales tienen diferente
afinidad a IP3 y sus propiedades de activación por Ca2+ (Grafto and Thwaite, 2001).
El IP3R3 es expresado en la membrana plasmática de las células B y T, su papel no
es claro pero puede funcionar como mediador de la entrada de Ca2+ como parte del
canal CRAC (Figura 2). Miyakawa y col. (1999) mostró que IP3R3 esta involucrado en
la generación de transientes de Ca2+ monofásicos seguidos de la ligación del BCR,
mientras que el IP3R1 y el IP3R2 están involucrados en la generación de oscilaciones
de Ca2+ con diferentes frecuencias.
Los RyRs también regulan la liberación de Ca2+ del RE, existen tres isoformas
de RyRs de las cuales los linfocitos B y T expresan RyR1 y RyR3, respectivamente
(Grafton and Thwaite, 2001). Los mecanismos que activan los RyRs en la célula B y
T son diferentes. Guse y col. (1999) mostraron la liberación de Ca2+ en célula T a
15
través de la acción del segundo mensajero ADP ribosa cíclico (cADPR, cyclic ADPribose) durante la respuesta mediada por el receptor antígenico de la célula T (TCR,
T-cell antigen receptor), donde el cADPR estimula las 3 isoformas de RyRs en
condiciones fisiológicas. Los RyRs se abren a concentraciones bajas de rianodina (
1M) y de Ca2+ (0.1-1.0 M), pero en concentraciones altas (Ca2+ 100 M y
rianodina 10 M) se cierran (Ehrlich et al., 1994). El mecanismo de liberación de
Ca2+ activado por Ca2+ (CICR, Ca2+-induced Ca2+ release) es una propiedad de los
RyRs que se encuentran abiertos de manera sostenida con una elevación de Ca2+
libre en el rango de concentraciones fisiológicas; la CICR también es efectuada por
los IP3Rs (Berridge et al., 1993).
Como ya hemos comentado, la mitocondria juega un papel importante en la
modulación de la señal de Ca2+ ya que secuestra temporalmente el Ca2+ para
controlar la actividad del canal CRAC y la señal de transmisión de Ca2+ (Hoth et al.,
2000). El Ca2+ en la mitocondria es transportado electroforeticamente, por medio de
un canal de Ca2+ conducido por el gradiente de protones generado a través de la
membrana mitocondrial interna que es mantenida por la cadena respiratoria de
transporte de electrones, la cual genera una diferencia de potencial eléctrico (~ -180
mV) a través de la membrana interna mitocondrial con el lado negativo en la matriz
(Rizzuto et al., 2000). Este gradiente significa que en equilibrio la concentración de
Ca2+ debería ser 6 ordenes más alta que la del citosol o 100 mM aproximadamente,
mientras que normalmente la mitocondria mantiene una concentración de 100 nM
(Bernardi, 1999a) o más bajo que en el citosol (~200 nM). Es por eso que la
mitocondria regula la concentración de Ca2+ citosólico y mitocondrial por medio de un
sistema complejo de transportadores iónicos en la membrana mitocondrial (Figura 3).
Los sistemas de transporte que regulan la entrada y salida de Ca2+ mitocondrial
requieren de energía en forma de gradiente electroquímico de H+, debido a: la
naturaleza electroforetica del transporte de Ca2+ en ambos canales de Ca2+ y Ram
(rapid uptake mode), a la estequiometría del intercambiador Na+/Ca2+, a la
dependencia de energía del intercambiador H+/Ca2+ y al requerimiento de salida de
H+ por la acción de los intercambiadores H+/Na+ y H+/Ca2+ (Bernardi, 1999a). Este
sistema de regulación de calcio funciona en un rango definido de concentración de
16
Ca2+, si el Ca2+ llega al nivel umbral (~1 M) se empieza a formar una sobrecarga de
Ca2+ (Crompton, 1999). Las mitocondrias resisten el aumento de Ca2+ hasta 10 M,
por ejemplo durante la depleción del RE el Ca2+ es absorbido por las mitocondrias
alcanzando su nivel de ~10 M en la matriz (Golovina y Blaustein, 1997). Una
sobrecarga de Ca2+ mitocondrial puede llevar a la permeabilidad de la membrana
interna mitocondrial, por medio de la apertura del poro de permeabilidad de transición
mitocondrial (MTP, permeability transition pore) entre las membranas mitocondriales
externa e interna, ésta es una vía de salida rápida de Ca2+ como se muestra en la
Figura 3.
Figura 3. Ciclo de Ca+2 en mitocondria energizada.
1, vía de entrada (canal de Ca2+, RaM). 2-5 vías de salida: intercambiador H+/Ca2+
independiente de Na+ (NICE, 2), intercambiador H+/Na+ (NHE, 3), intercambiador Na+/Ca2+
dependiente de Na+ (NCE, 4), y el poro de transición mitocondrial (MTP, 5) es una vía de salida rápida
de Ca2+. RaM, modo de toma rápida; , bomba H+; Em, potencial de membrana. (Rizzuto et al., 2000).
La apertura del MTP causa la pérdida del potencial transmembranal
mitocondrial y la disminución de la síntesis de ATP. El MTP es un complejo formado
por el canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC, voltaje-dependent anion
channel), el translocador nucleótido adenina (ANT, adenine nucleotide translator) y la
ciclofilina-D (Cyp-D, cyclophilina) entre las membranas mitocondriales externa e
17
interna, donde la salida de Ca2+ es compensada por el flujo de H+ y K+ o Na+ dentro
del MTP para llevar al cierre del MTP y restablecer la función de la mitocondria. El
inhibidor especifico del MTP es la ciclosporina A (Bernardi, 1999a). El umbral para
abrir el MTP en la población mitocondrial es heterogénea, ya que pequeñas
despolarizaciones en una población limitada de mitocondrias exhiben permeabilidad
de la membrana interna mitocondrial para mantener un rango del potencial de
membrana y llevar al cierre del poro. Por lo tanto, el MTP puede ser consecuencia de
la despolarización o causarla.
La mitocondria funciona entonces de forma capacitiva almacenando Ca2+
temporalmente para mantener la señal de Ca2+ sostenida incluyendo la modulación
de su padrón temporal (duración y frecuencia de oscilaciones).
I.2.2. Calcio como un mensajero secundario.
El calcio es un segundo mensajero involucrado en procesos, tales como la
actividad enzimática (Grafton and Thwaite, 2001), la regulación del ciclo celular, la
expresión de diferentes genes, y la muerte por apoptosis (Berridge et al., 1998). En
linfocitos se observa una elevación de la concentración de Ca2+ intracelular en la
activación de células T y B (Lewis, 2001), en la expresión de genes (Negulescu et al.,
1994), y durante la muerte celular apoptótica (McConkey and Orrenius, 1994). La
elevación de Ca2+ se interpreta como señal en diferentes procesos celulares. El
aumento en la amplitud de la concentración de Ca2+ raramente excede de 1 M
mientras que la frecuencia puede variar ampliamente (Gunter et al., 1994).
I.2.3. Oscilaciones de calcio: un mecanismo para especificar las señales.
Las respuestas de Ca2+ pueden ser de tres tipos: de elevación sostenida,
transitoria y de oscilaciones periódicas. Las oscilaciones de Ca2+ pueden persistir
mientras los receptores están activados en la superficie celular. La frecuencia y
amplitud de las oscilaciones dependen de la concentración del ligando extracelular, y
puede ser una respuesta celular dependiente de la frecuencia. Las oscilaciones son
un modo de señal en las células, su frecuencia y amplitud contribuyen en la
18
regulación de la expresión de genes y diferenciación celular discriminando diferentes
vías de señal activadas por Ca2+ (Dolmetsch et al., 1998). Diferencias en amplitud y
cinética de la señal de calcio pueden predisponer distintas respuestas celulares
(Berridge et al., 1998), así como diferentes vías de activación sensibles a calcio de
varios reguladores transcripcionales (Dolmetsch et al., 1997). La señal de Ca2+
incrementa la eficacia y especifidad de la expresión de genes en la señalización de
linfocitos T (Lewis, 2001). En linfocitos las oscilaciones de Ca2+ son desestabilizadas
por inhibición simultanea de canales de Kv y KCa, pero son poco afectadas por el
bloqueo de un solo tipo de canal (Grissmer et al., 1992).
La regulación de estas respuestas no es clara, lo que si es conocido es que su
amplitud y frecuencia especifican las señales de Ca2+ para la expresión de genes. La
forma de éstas respuestas puede deberse al tipo de señal, de tejido celular, al
ligando y a los mecanismos de captura de Ca2+, por lo tanto, a la interacción de todos
estos mecanismos.
I.3.- Regulación de volumen celular.-
La regulación del volumen celular es una función acoplada a una variedad de
procesos fisiológicos como proliferación, diferenciación y muerte celular (Lang et
al.,1998b). El hinchamiento celular común se relaciona con un incremento en la
velocidad de proliferación, mientras que en células transformadas un hinchamiento
celular lleva a necrosis y un encogimiento celular es una de las señales de iniciación
de apoptosis (Lang et al., 1998a). Las células poseen una variedad de mecanismos
de regulación de volumen que permiten a la célula recuperar su volumen normal. por
medio de mecanismos de regulación rápida (transporte iónico a través de la
membrana celular) y lenta (producción de osmolitos y cambios en la expresión de
genes). Diferentes tipos de células utilizan distintos mecanismos de regulación de
volumen celular (O'Nell, 1999).
Los linfocitos para encontrar y reconocer los antígenos específicos migran
dentro del tejido, por ejemplo la microcirculación renal y espacio intestinal, donde
sufren grandes cambios de osmolaridad, por lo tanto poseen mecanismos de
19
regulación de volumen y sintetizan macromoléculas que cambian la osmolaridad
celular. Durante un estrés osmótico hipotónico la célula se hincha activando
mecanismos de regulación que disminuyen el volumen celular (RVD, regulatory
volume decrease), así mismo ante un estrés osmótico hipertónico la célula se encoge
y activa mecanismos de regulación que incrementan el volumen celular (RVI,
regulatory volume increase) para recuperar su volumen normal (Gómez-Angelats et
al.,2000).
I.3.1. Iones que mantienen el volumen celular en estado estable.
Las células contienen una alta concentración de solutos incluyendo moléculas
orgánicas cargadas negativamente (HCO3-, PO43-, proteínas, azucares, aminoácidos,
ácidos nucleicos, metabolitos que acarrean fosfato y grupos carboxilo, etc.), y es
balanceada por cationes intracelulares donde crean un gradiente osmótico que
tiende a meter agua dentro de la célula, este efecto es contrarrestado por un
gradiente osmótico extracelular opuesto debido a una alta concentración de Na+ y Cl(Lang et al., 1998b). La célula para compensar la acumulación de agua causada por
la presencia de osmolitos orgánicos no permeables, bombea iones inorgánicos fuera
de la célula, predominantemente Na+ y Cl-, por medio de la ATPasa Na+-K+
transporta Na+ hacia fuera contra su gradiente electroquímico y el Cl- es mantenido
fuera por el potencial de membrana. Por consiguiente, la liberación de Cl- acoplada a
la salida Na+ parece ser el principal mecanismo que mantiene el volumen celular
(Mongin and Orlov, 2001).
+ +
La inhibición de la ATPasa Na -K por ouabaina guía al hinchamiento celular,
así como también, la pérdida de los gradientes de Na+ y K+, la despolarización de la
membrana celular y la entrada de NaCl a la célula. En consecuencia la activación
de canales de Na+ despolariza la membrana celular y favorece la entrada de
Cl- causando hinchamiento celular por la acumulación de NaCl, y la activación
de canales de K+ ó Cl- favorecen la salida de KCl resultando encogimiento
celular (Waldegger, 1998).
20
I.3.2. Osmolitos.
Los osmolitos son moléculas designadas para crear osmolariadad intracelular
sin interferir con la función celular. Estos no solo reemplazan iones como especies
osmóticamente activas sino que también estabilizan macromoléculas, entonces
contrarrestan los efectos de desestabilización de iones inorgánicos como K+, Na+ y
Cl , así como de iones orgánicos (Lang et al., 1998b). En las células encogidas son
sintetizados o transportados pero durante hinchamiento celular pueden ser
rápidamente degradados o liberados. La generación de osmolitos es un proceso
lento que requiere de horas a días. Los más importantes son polialcoholes (sorbitol e
inositol),
aminoácidos
(taurina
y
aspastato)
y
metilaminas
(betaina
y
glicerofosforilcolina), (Lang et al., 1998a).
I.3.3. Mecanismos de regulación que incrementa el volumen celular (RVI).
La existencia de mecanismos de RVI permite a la célula recuperar su volumen
normal ante un estrés hipertónico. Estos mecanismos involucran la activación de
transportadores electroneutrales como el cotransportador Na+-K+-2Cl- (NKCC) y el
intercambiador Na+/H+ (Figura 4). El intercambiador Na+/H+ se acopla a la actividad
del intercambiador Cl /HCO3 para producir la entrada neta de NaCl y agua para
causar hinchamiento celular, así como la formación de CO2 el cual difunde dentro
de la célula para regenerar H+ y HCO3- (O'Neill, 1999). Para contrarrestar el
incremento del Na+ intracelular se activa la ATPasa Na+-K+ que intercambia Na+ por
K+ para mantener baja la concentración intracelular de Na+ y secundariamente una
baja concentración de Cl- (Gómez-Angelats et al.,2000).
21
Figura 4. Mecanismos de regulación del volumen en células de mamífero.
Las células mantienen el volumen celular a través de la modulación de transportadores y canales
iónicos de la membrana plasmática. Cuando las células son expuestas a un estrés hipertónico,
pierden agua y se encogen. La recuperación del volumen celular activa la RVI, activando el
cotransportador Na+-K+-2Cl- y el intercambiador Na+/H+ acoplados al intercambiador Cl-/HCO3-, así
como la estimulación de transportadores de osmolitos dependientes de Na+ (como aminoácidos).
Durante la RVI, la ATPasa Na+-K+ es activada y contribuye a la expulsión de Na+ y reemplazo de Na+ y
K+. En cambio cuando las células son expuestas a condiciones hipotónicas, se hinchan debido a un
incremento de agua en su contenido activando la RVD. Los mecanismos de RVD disparan la pérdida
de K+, Cl- y agua a través de la activación del intercambiador K+/H+ acoplado al intercambiador Cl/HCO3-, al cotransportador K+/Cl- o vía activación de canales de K+ y Cl-. La pérdida de aminoácidos
intracelulares también participa en la RVD. (Modificación de Gómez-Angelats, 2000).
22
I.3.4. Mecanismos de regulación que disminuye el volumen celular (RVD).
Las células expuestas a un ambiente hipotónico tienden a hincharse y activan
los mecanismos de la RVD, los cuales involucran la pérdida de K+ y Cl- por vías
separadas seguida por un movimiento de agua hacia fuera de la célula (Figura 4). Si
la concentración de Cl- intracelular es baja, la salida de Cl- es suplida por la liberación
de osmolitos a través de los mismos canales aniónicos (Lang et al., 1998a). La
liberación de KCl en la RVD es acompañada por la activación de los
intercambiadores K+/H+ y Cl-/HCO3-, donde el H+ y HCO3- entran a la célula
intercambiando KCl formando CO2 intracelular, el cual difunde hacia fuera de
la célula (O'Neill, 1999).
+
-
En los linfocitos la RVD implica la salida de K y Cl a través de canales Kv1.3
y Clswell (Tabla 1), respectivamente, que conducen agua hacia fuera y causan
encogimiento celular (Figura 5). En linfocitos humanos la liberación de taurina forma
parte de la RVD (Pasantes-Morales et al., 1991). Este mecanismo de RVD es
independiente de Ca2+ en una amplia variedad de tipos de células, en cambio en
timocitos inmaduros de ratón el mecanismo de RVD es dependiente de Ca2+ donde
los canales de KCa juegan un papel más significantivo que los canales Kv (Cahalan
et al., 2001). El canal catiónico no selectivo permeable a Ca2+ (SWAC, Ca+2permeable nonselective cation channels, Tabla 1), es activado por hinchamiento y es
expresado en timocitos inmaduros de ratón donde la regulación de volumen celular
esta mediada por Ca2+ (Ross and Cahalan, 1995).
23
Figura 5. Regulación del volumen en linfocitos en respuesta a estrés hipotónico.
Las células T maduras activan el mecanismo de RVD independiente de Ca2+ que diminuye el
volumen celular, abriendo canales Clswell para permitir la salida de iones Cl- de la célula. La apertura de
canales de Cl- despolarizan el potencial de membrana, abriendo indirectamente los canales Kv1.3 que
dejan salir iones K+ para conducir agua hacia el exterior y causar encogimiento celular. En cambio en
timocitos de ratón el hinchamiento osmótico activa un mecanismo de RVD dependiente de Ca2+,
donde los canales SWAC producen una señal de Ca2+ que activa canales KCa. En este mecanismo
los canales de KCa tienen más importancia que los canales Kv, donde los canales de Cl- proporcionan
un incremento de la salida aniónica como la hiperpolarización del potencial de membrana provee un
incremento de la fuerza impulsora para la pérdida de iones de Cl-. (Cahalan et al., 2001).
24
CAPITULO II. MUERTE CELULAR PROGRAMADA (APOPTOSIS)
Y SU IMPACTO FISIOLOGICO.
La apoptosis o muerte celular programada es un mecanismo que forma parte
de la vida de las células. Apoptosis del griego "caída de", comparable a las hojas de
los árboles o los pétalos de las flores que caen en otoño. Es una forma de
autodestrucción celular que requiere de la expresión de un programa endógeno
genético después de estimulación celular, que resulta en la eliminación de células sin
inducir una respuesta inflamatoria. Este mecanismo interviene tanto en procesos
fisiológicos normales así como en patologías.
II.1.- La apoptosis como un proceso fisiológico.-
La apoptosis es un proceso importante en una amplia variedad de sistemas
biológicos, tales como: el recambio de células para el desarrollo y homeostasis del
tejido normal para mantener los tipos celulares y el número de células en organismos
multicelulares representando el balance entre la proliferación y muerte celular, en el
desarrollo embrionario y la morfogénesis, así como también en la involución de
células privadas de factores de crecimiento (Schwartman and Cildlowski, 1993). En
los linfocitos es esencial para la función del sistema inmune, bajo una infección se
requiere de un incremento en el numero de linfocitos y de su la subsecuente
eliminación después de la recuperación. Por lo tanto, es responsable de la
homeostasis de las células inmunes y de la eliminación de células periféricas
(Scaffidi et al.,1999a).
La alteración de este proceso puede contribuir al desarrollo de enfermedades,
por defecto (neoplasias, desórdenes autoinmunes e infecciones vírales) o exceso
(SIDA, enfermedades neurodegenerativas, síndromes mielodisplásicos y daño
isquémico) de apoptosis (Carson and Ribeiro, 1993).
25
II.2.- Fases de apoptosis.La muerte celular apoptótica involucra tres fases (Figura 6): una fase de
iniciación en la cual se presentan estímulos a la célula, seguida por la fase donde la
célula queda comprometida a morir por activación de caspasas iniciadoras (caspasa8), y una tercera fase de ejecución en la que se observan cambios morfológicos en la
estructura celular (en el núcleo, membrana plasmática y mitocondria) con la
participación de una o varias proteasas en el control de apoptosis (Cohen, 1997). En
cada fase se presentan cambios bioquímicos que participan en la muerte celular.
Los cambios morfológicos que se observan en las células apoptóticas son la
condensación de la cromatina nuclear, fragmentación del núcleo, disminución del
volumen celular como consecuencia de la pérdida de agua, compactación de
organelos del citoplasma, pérdida del contacto con células adyacentes y formación
de burbujas en la membrana plasmática para la desintegración celular, llevando a la
formación de cuerpos apoptóticos que serán fagocitados por macrófagos sin liberar
el contenido celular al exterior y así evitar la inflamación (Schwartman and Cildlowski,
1993). Los macrófagos reconocen a los cuerpos apoptóticos por la exposición de
fosfatidilserina (fosfolipido de la superficie interna de la membrana plasmática que se
expresa en la capa externa durante apoptosis) en la superficie celular (Fadok et
al.,2001).
II.3.- Estímulos apoptóticos.-
Existe una gran variedad de estímulos intracelulares y extracelulares que
pueden inducir e inhibir apoptosis (Tablas 2 y 3), de algunos de los cuales se conoce
su mecanismo con profundidad. Durante el desarrollo celular aparecen dos tipos de
estímulos que disparan la apoptosis como mecanismo de prevención celular: los de
actividad fisiológica para la regulación de poblaciones celulares y los asociados al
daño celular para la eliminación de células dañadas o transformadas. De igual
manera, los agentes utilizados en tratamientos terapéuticos también causan daño
celular induciendo apoptosis. Estos estímulos representan un insulto molecular para
la célula, cada estímulo puede utilizar diferentes vías apoptóticas de activación y
26
señalización dependiendo del tipo celular, pero la respuesta es similar culminando en
muerte celular apoptótica (Scaffidi et al., 1998).
Tabla 2. Inductores de apoptosis. (Hidalgo and Vieiro, 1999).
Activadores
fisiologicos
1. Familia de TNF:
TNF
Fas-L
2. TGF-
3. Neurotransmisores:
Glutamina
Dopañina
N-Metil-D-aspartato
4. Ausencia de factores
de crecimiento.
5. Pérdida de fijación de
la matriz.
6. Calcio.
7. Glucocorticoides.
Inductores asociados al
Agentes asociados a
daño celular
terapias
1. Drogas
1. Shock térmico.
Quimioterapéutica:
2. Infección viral.
Cisplatin,
3. Toxinas bacterianas.
Doxorubicin,
4. Oncogenes: myc, EIA.
Pleomycin,
5. Supresores tumorales:
citosina,
p35.
arabinoside,
6. Linfocitos T citotóxicos.
metotrexate,
7. Agentes oxidantes.
vincristine.
8. Radicales libres.
9. Deprivación de nutrientes- 2. Radiación .
antimetabolitos.
3. Radiación UV.
Tabla 3. Inhibidores de apoptosis. (Hidalgo and Vieiro, 1999).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Fisiológicos
Factores de crecimiento.
Matriz extracelular.
CD-40-L.
Aminoácidos neutros.
Zinc.
Estrógenos.
Androgenos.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Genes virales
Agentes farmacológicos
1. Inhibidores
de
la
Adenavirus E1B.
Calpaina.
Baculovirus p35.
2. Inhibidores de la proteasa
Baculovirus IAP.
de Cisteinas.
Virus Vaccinia.
3. Promotores tumorales:
Virus Epstein-Barr
PMA
BHRF1, LMP-1
Fenobarbital
Virus Herpes 1 34.5
-hexaclorociclohexano.
Virus de la Fiebre Porcina
Africana.
Una de las principales vías fisiológicas que desencadena una cascada de
activación de apoptosis es el receptor Fas (CD95/Apo-1) que se une a su ligando
(Fas-L). Los receptores mejor caracterizados son el Fas y el TNF-R1 (PSS/CD120a,
factor necrótico tumoral), estos receptores de muerte se encuentran en la membrana
plasmática y poseen dominios muerte en la región citoplasmática que conducen a
apoptosis por unión con su ligando o anticuerpos agonistas específicos (Ashkenazi
and Dixit, 1998). Otra vía de apoptosis asociada a daño celular es la presencia o
27
ausencia de genes c-myc y p53 que activan la muerte celular apoptótica (Evan and
Littlewood, 1998). El c-myc es un protooncogen que en condiciones normales
codifica un factor de transcripción (proteína c-Myc) y promueve la proliferación
celular, pero a falta de factores de crecimiento c-Myc induce apoptosis. El p53 es un
oncosupresor que detiene el ciclo celular en la fase G1/S en células que presentan
daño en su ADN, el cual permite la reparación del ADN y si ese daño no puede ser
reparado, entonces conduce a la célula a apoptosis.
El control de apoptosis involucra agentes fisiológicos y nocivos que pueden
inhibir la vía de activación apoptótica para proteger a las células (Tabla 3). La familia
de las proteínas Bcl-2 actúan como reguladores de apoptosis en la prevención y
activación de la cascada apoptótica, regulando la liberación de factores proapoptóticos como citocromo c del compartimento intramitocondrial al citosol (Kluck et
al., 1997). Los miembros de estas proteínas están caracterizados por dominios
homólogos (BH1-BH4) conservados de Bcl-2, éstos se dividen en anti-apoptóticas
(Bcl-2 y Bcl-xL, con dominio BH4) y pro-apoptóticas (Bax, Bak, Bik y Bid, con dominio
BH3), los cuales se encuentran en la parte externa de la membrana mitocondrial (del
núcleo y retículo endoplasmico) y en el citosol, respectivamente (Hengartner, 2000).
II.4.- Cascada de caspasas en el desarrollo de apoptosis.-
Los cambios morfológicos que caracterizan a la muerte celular apoptótica son
causados por una familia de proteasas denominadas caspasas, que puede pensarse
que son los ejecutores centrales de la vía apoptótica. Se ha descrito una lista de
proteasas que se han agrupado en una familia de proteasas relacionadas con ICE
(enzima convertidora de IL-1) y CED-3, que tiene ahora más de 12 miembros a las
que llaman caspasas (proteasas cisteina-ácido aspártico, Tabla 4), por tratarse de
proteasas ácidas que tienen un residuo de cisteína en el sitio activo y que reconocen
un residuo de ácido aspártico en el sitio de corte (Van de Craen et al., 1997).
Todas las caspasas son sintetizadas como proenzimas inactivas de 30 a 50
KD, las cuales son activadas por proteolisis. Estas tienen tres dominios: uno dominio
terminal amino (NH2), una subunidad grande (20 KD, p20) que contiene el sitio
28
activo y una pequeña (10 KD, p10) importante para la actividad enzimática (Cohen,
1997). Las proenzimas para su maduración requieren de dos cortes: el primero corte
elimina un pro-dominio en el extremo NH2 y el segundo corte genera las dos
subunidades que conforman el sitio activo. La enzima ya madura es un
heterotetramero que contiene dos heterodimeros p20/p10 y dos sitios activos
(Hengartner, 2000). Las caspasas comparten similitudes en la secuencia de
aminoácidos, estructura y especificidad por el substrato, éstas se encuentran en el
citoplasma aunque se pueden localizar en la mitocondria. La caspasa-8 se encuentra
predominantemente en el espacio intramitocondrial, la cual puede ser liberada
durante apoptosis (Quin et al., 2001).
Tabla 4. Miembros de la familia de las caspasas. (Cohen, 1997).
Caspasas
1
2
3
4/11
5
6
7
8
9
10
12
Otros nombres
ICE
Nedd2, ICH-1
CPP32, Yama,
apopain
ICERELII,TX, ICH-2
ICErelIII, TY
Mch2
Mch3, ICELAP3, CMH-1
MACH, FLICE,
Mch5
ICE-LAP6, Mch6
Mch4
Sitio activo
Secuencia de corte
QACRG
QACRG
QACRG
WFKD  S; FEDD  A
DQQD  G; EESD  A
IETD  S
QACRG
QACRG
QACRG
QACRG
WRVD  S; LEED  A
WRVD  S; LEAD  S
DVVD  N; TEVD  A
IQAD  S
QACQG
VETD  S; LEMD  L
QACGG
QACQG
QACRG
DQLD  A
SQTD  V; IEAD  A
?
La activación de las caspasas desencadena una señal en cascada activando a
otras caspasas (Figura 6). Las cascadas de caspasas son sistemas de amplificación,
en los que un estímulo inicial activa una proenzima favoreciendo su maduración a
enzima activa, el grupo de enzimas activan un segundo grupo de proenzimas que
desencadenan una señal en cascada activando otras caspasas
(Ventura et al.,
1999). Las caspasas (1 y 11) cortan precursores para producir citocinas maduras, (8,
9 y 10) inician la propagación de señales apoptóticas, y (3, 6 y 7) ejecutan la
29
programación apoptótica a través de cortes de varias proteínas vitales (Cohen,
1997). Se han descrito tres mecanismos de activación de caspasas:
1. La activación por reclutamiento o agregación de moléculas, tal como la caspasa-8
que es el iniciador de caspasas en la vía del receptor muerte (Scaffidi, 1999a),
donde la activación de los dominios muerte del receptor Fas causa reclutamiento
de la pro-caspasa-8 y ésta se activa por autoprocesamiento. El modelo de
inducción por proximidad propone que la pro-caspasa-8 tiene baja actividad
proteasa intrínseca, pero es suficiente para permitir el corte de varias proenzimas
y activar otras (Muzio et al.,1998).
2. La activación de caspasas cascada arriba, ya sea por las mismas caspasas o por
la enzima granzima B por medio de un corte proteolítico en sitios de aspartato
para la activación autocatalítica (Thornberry et al.,1997).
3. La asociación con una subunidad reguladora, como la formación de un
apoptosoma por interacción del citocromo c con Apaf (factor activador de
apoptosis), permitiendo el reclutamiento de procaspasa-9 y activando la caspasa-9
por cambios conformacionales. El requerimiento clave para la activación de
caspasa-9 es la asociación con un cofactor de la proteína Apaf-1 (Cain et
al.,1999).
Las caspasas son de respuesta relativamente rápida, ya que preexisten en la
célula en forma de proenzimas y para su activación requieren de ciertas condiciones
fisiológicas, como la pérdida de K+ y encogimiento celular (ver la sección III.1.2 del
capitulo III).
Durante la apoptosis las caspasas inactivan y activan un gran número de
proteínas que protegen a las células vivas (Tabla 5), tal como los substratos de
estructura celular que pierden su función y las nucleasas que ganan su actividad
biológica en respuesta a señales pro-apoptóticas (Hengartner, 2000).
30
Figura 6. Fases de apoptosis y cascada de activación de caspasas.
La apoptosis involucra una fase de iniciación, de compromiso y de ejecución donde se presentan
estímulos seguidos por la activación de caspasas. El receptor CD95 y el receptor TNF interactúan con
proteínas intracelulares, dominios de interacción proteica denominados dominios muerte (DD, como
TRADD) y/o dominios efectores de muerte (DED, como FADD) y con la procaspasa-8. La caspasa-8
se activa por autoprocesamiento y puede activar a todas las caspasas conocidas por procesamiento
proteolítico. La caspasa-10 es activada por factores que dañan el DNA, y también es capaz de
procesar a todas las caspasas conocidas. Algunas caspasas, tal como caspasa-6 es capaz de cortar
la caspasa responsable de su formación. La caspasa-9 es activada a través de la liberación de
citocromo c mitocondrial y factores activadores de apoptosis (Apaf), que se asocian a la pro-caspasa 9
(Apaf3) para activar la caspasa-3. Las caspasas causan cambios en el núcleo, membrana plasmática
y mitocondria. Se muestran los inhibidores (Bcl-2, Bcl-XL, CrmA, FLIP y AIP) de la apoptosis y el punto
donde actúan(). , potencial de transmembrana mitocondrial; cyt-c, citocromo c. (Modificación de
Cohen, 1997).
31
Tabla 5. Proteínas que son procesadas por caspasas miembros de la familia de las
caspasas durante la muerte celular.
PROTEÍNASa
Estructurales
Actina
Fodrina
Gas 2
Láminas
Señalización
D4-GDI
FUNCIÓN
Componente del
citoesqueleto
“
“
Componente nuclear
Inhibición de proteínas G
LLGD/G
Proteína cinasa
PKC
Reguladores de
transcripción
RB
Ensamble de complejo
represor
SREBPs 1,2
Factores reguladores de
colesterol
Metabolismo de
ADN/ARN
Reparadora de ADN
DNA-PK
HnRNP C1 y C2 Empalme pre-ARNm
Reparadora de ADN
PARP
Empalme pre-ARNm
U1snRNP
Otras
Pro-IL-1B
ATPasa de Ca2+
Receptor IP3 -1
ICAD
a
Respuesta inmunológica
Transporta Ca2+
Liberación de Ca2+ de RE
Inhibe la degradación de
DNA nuclear
SECUENCIA CASPASA
DE CORTE
(S)b
REFERENCIA
LVVD/N
ELPD/G
?
SRVD/G
VIED/N
? 
Kayalar et al., 1996
?
?
6 
Vanags et al., 1996
Bramcolini et al., 1995
Greidinger et al., 1996
DELD/S
3 
Goldberg et al., 1996
DMQD/N
3 
Ghayur et al., 1996
DEAD/G
SEPD/S
DEPD/S
3 
An and Dou, 1996
3, 7 
Na et al., 1996
3 
Song et al., 1996
3, 7 
3, 7 
3 
Wang et al., 1996
Gu et al., 1995
Song et al., 1996
DEVD/N
DWVD/G
?
DEVD/G
DGPD/G
YVHD/A
DEID
DEVD
DEPD
DAVD
1
3
3
3




Cerretti et al., 1992
Paszty et al., 2002
Hirota et al., 1999
Enari et al., 1998
D4-DGDI, Inhibidor de disociación de GDP tipo 4; PKC, Proteína cinasa C; RB, Proteína de
retinoblastoma; SERBPs 1,2, Proteínas que unen elementos en respuestas esteroides; DNA-PK, Cinasa
de proteínas dependiente de ADN; HnRNP-C Ribonucleoproteína nuclear heterogénea de tipo C;
PARP, Poli ADP Ribosil Polimerasa; U1snRNP, Ribonucleoproteína nuclear pequeña; ICAD, caspaseactivated deoxyribonucleases inhibitor.
b
, activación; , inactivación.
Las caspasas son inhibidas por CrmA (modificador de la actividad de citosina
tipo A) que puede bloquear la muerte celular mediada por TNF o Fas para formar un
complejo estable con diferentes tipos de células, por las proteínas de la familia Bcl-2
32
que previenen la liberación de citocromo c de la mitocondria que es esencial para la
activación de caspasas y por la proteína p35. Así como también, por inhibidores de
proteínas apoptóticas (AIP) que bloquean vías apoptóticas y por inhibidores
sintéticos como fmk (fluoro metil cetona) un inhibidor especifico de cisteinil aspartil
proteasa (Cohen, 1997; Ventura et al.,1999).
II.5.- El Papel de la mitocondria en la apoptosis.La mitocondria juega un papel en la regulación de la vida y muerte celular. En
todos los modelos celulares participa en una importante señal de transducción
apoptótica, los eventos claves de apoptosis que están relacionados con las
mitocondrias son: la liberación de proteínas activadoras de caspasas (citocromo c y
AIF-flavoproteína
con
potente
actividad
apoptótica),
pérdida
del
potencial
transmembranal mitocondrial (m), disminución de los niveles de ATP y la
participación de las proteínas de la familia Bcl-2 (ver revisión de Green and Reed,
1998).
El mecanismo por el cual se lleva a cabo la liberación de citocromo c y
proteínas del espacio intramembranal mitocondrial durante la apoptosis ha sido un
punto de estudio, donde se han propuesto y comprobado dos modelos de liberación
(Figura 7; Degterev et al., 2001). Un modelo es la formación de un poro en la
membrana externa mitocondrial por las proteínas Bax ó Bak, que tienen la capacidad
de formar poros por la estructura similar de Bcl-XL (subunidad formadora de poros de
la toxina difteria y la bacteria colicina para el transporte de proteínas; Muchmore et
al.,1996). Estas proteínas pro-apoptóticas forman un poro selectivo para la liberación
de citocromo c que se ha demostrado en células Hela (Antonsson et al.,2001) y un
poro no selectivo formado por la modulación de las proteínas en la actividad del
canal VDAC permitiendo el paso del citocromo c y proteínas en células mamíferas
(Shimizu et al.,2001), sin causar un mayor efecto en la función mitocondrial para
mantener el nivel de ATP en las siguientes etapas de apoptosis. El segundo modelo
es la liberación de citocromo c y proteínas como resultado de la ruptura de la
membrana externa mitocondrial, debido a la apertura del PTP por la interacción de la
proteína Bax en sitios específicos del PTP causando pérdida m e hinchamiento de
33
la matriz mitocondrial con una eventual ruptura y permeabilización no selectiva de la
membrana externa mitocondrial. Se ha demostrado en complejos del PTP
reconstituidos en liposomas que exhiben una funcionalidad comparable con el PTP
presente en mitocondria intacta (Marzo et al.,1998).
Durante la apoptosis la liberación de citocromo c de la mitocondria es inhibida
por la presencia de Bcl-2 en este organelo (Kluck et al.,1997), así como también
inhibe la pérdida del m (Shimizu et al.,2000), ya que el citocromo c citosolico
predispone a la célula a morir por un mecanismo apoptótico rápido formando una
parte esencial en el apoptosoma activando la caspasa-9 para activar a otras
caspasas y ejecutar la muerte celular apoptótica (Cain et al.,1999).
Figura 7. Mecanismos moleculares de la regulación mitocondrial durante apoptosis.
La liberación de factores apoptogenicos (cyt-c y AIF) del espacio intramembranal mitocondrial es
llevada a cabo por dos modelos. (A) Las proteínas de la familia Bcl-2 proapoptóticas (Bax y Bak)
forman canales tetramericos, siendo activadas por factores que solo presentan el dominio BH3 (Bid,
Bad, Bim, etc.). Estas proteínas también modulan la actividad de canal aniónico dependiente de
voltaje (VDAC) formando un canal no selectivo. (B) Bax se une al complejo del poro de permeabilidad
de transición (PTP), y causa la apertura de éste poro, hinchamiento de la matriz mitocondrial y ruptura
de la membrana externa mitocondrial. Los canales son bloqueados por proteínas de la familia Bcl-2
anti-apoptóticas. (Modificación de Degterev et al.,2001).
34
El citocromo c funciona como un acarreador en la cadena respiratoria donde
se forma ATP, por lo tanto una pérdida del transporte electrónico disminuye la
producción de ATP. Durante apoptosis el ATP es requerido, esto puede ser
observado en las células SKW6.4 (tipo I) estimuladas por Fas donde las etapas de
apoptosis dependientes de ATP están por debajo de la activación de la caspasa-3
(condensación de cromatina y fragmentación nuclear), y en células Jurkat (tipo II)
donde los pasos dependientes de ATP inician en la activación de caspasa-9 (Eguchi
et al., 1999). Por lo tanto, el ATP intracelular es mantenido en los eventos finales de
apoptosis (activación de caspasas y fragmentación nuclear), y es un determinante en
la muerte celular (Nicotera et al.,1998). Así que la depleción intracelular de ATP guía
a necrosis pero con la suplementación de glucosa puede restaurar el ATP y pasar a
muerte apoptótica, siendo el ATP un switch entre apoptosis y necrosis (Leist et
al.,1999). Se han demostrado que el m y la producción de ATP son mantenidos
por el citocromo c liberado después de la permeabilización de la membrana externa
mitocondrial (Waterhouse et al.,2001).
II.6.- La Señal de calcio en el proceso de la muerte celular apoptótica.El Ca2+ citosolico puede regular el proceso de apoptosis, ya que una
sobrecarga de Ca2+ puede promover una vía de apoptosis, así como también se ha
demostrado que el Ca2+ puede bloquear apoptosis. Diferentes rutas intra- y
extracelulares usadas en la transducción de señales pueden aumentar la
concentración de Ca2+ citosolico para facilitar la entrada y salida de Ca2+ a través de
la membrana plasmática y almacenes intracelulares, respectivamente (Figura 8),
para promover un incremento de Ca2+ sostenido que actúe como una señal de
apoptosis.
Por consiguiente, una elevación de Ca2+ citosolico puede disparar la muerte
celular apoptótica por activación de enzimas dependientes de calcio o por una
sobrecarga de Ca2+ en la mitocondria como ya hemos revisado causando la apertura
del PTP y liberarando citocromo c que participa en la activación de caspasas.
Igualmente, la depleción de almacenes de Ca2+ puede disparar la apoptosis por la
liberación de enzimas que se localizan en el RE (DNasa I y proteasa NS(Nuclear
35
saffold)) durante la pérdida de Ca2+ involucradas en éste proceso (McConkey and
Orrenius, 1997), y por la activación de canales CRAC que aumentan el Ca2+
citosolico (ver Tabla 1 del capitulo I). La tapsigargina en células S49 causa apoptosis
al igual que la dexametasona donde se aprecia un aumento de Ca2+ intracelular
(Bian et al., 1997). En timocitos la apoptosis es disparada por un incremento de Ca2+
citosolico por la activación de la caspasa-3 (Shen et al., 2001).
II.6.1 Activación de enzimas dependientes de calcio.
El Ca2+ intracelular puede activar varias proteasas y endonucleasas que son
implicadas en el proceso de apoptosis. Las proteasas activadas por Ca2+ tales como
la calpaina (Chan and Mattson et al., 1999) y la proteasa NS (McConkey and
Orrenius, 1997) son activadas en timocitos durante apoptosis. Las endonucleasas
responsables de la degradación del DNA dependientes de Ca2+ durante la muerte
celular apoptótica son la nucleasa NUC18 en timocitos apoptóticos (Montague et al.,
1994) y la endonucleasa DNasa I (McConkey and Orrenius, 1997), además de otras
nucleasas que son activadas directamente
por
la caspasa-3 durante apoptosis
como CAD (Enari et al., 1998).
II.6.2 El Control de apoptosis dependiente de calcio.
La apoptosis puede ser bloqueada ante un incremento de Ca2+ citosolico y por
la presencia de quelantes de Ca2+. Se ha demostrado que la activación de la
caspasa-3 corta: el IP3R1 que se encuentra en los almacenes intracelulares (ver
sección I.2 del capitulo I) disminuyendo la actividad del canal IP3R1 y por
consiguiente la ICRAC (Hirota et al., 1999), y a la ATPasa-Ca2+ de la membrana
plasmática activada durante apoptosis inducida por estaurosporina en células Hela
ayudando a disminuir la concentración intracelular de Ca2+ (Pászty et al., 2002). En la
muerte celular apoptótica inducida por el receptor CD95 se bloquean los canales
CRAC y la entrada de Ca2+ a través de esfingomielasa y esfingolipidos, después de
36
60 minutos el Ca2+ citosolico no incrementa por lo que parece no ser un evento
temprano en la muerte celular inducida por CD95 (Lepple-wienhues et al., 1999).
Figura 8. Las vías de acción de calcio en apoptosis.
La unión de ligando a receptores o tratamiento con ionoforos de Ca2+ o tapsigargina incrementan el
Ca2+ citosolico para iniciar apoptosis. Los receptores están acoplados a vías de señalización por
proteínas G y/o proteínas tirosinas cinasas (PTKs) que activan varias isoenzimas fosfolipasas C, las
cuales guían a la producción de IP3 y DAG vía hidrólisis de PIP2. El IP3 causa liberación Ca2+ del RE y
la entrada de Ca2+ indirectamente a través de los canales CRAC de la membrana plasmática. El Ca2+
entra a mitocondria causando la apertura del MTP liberando citocromo c para la activación de
caspasas.
II.7.- Los mecanismos de apoptosis en las células linfoides.La apoptosis en los linfocitos es esencial en la función del sistema inmune
para garantizar la regulación del balance de linfocitos muertos y vivos. La decisión de
los linfocitos a pasar a apoptosis es disparada por la estimulación de los sistemas
receptor muerte/ligando, particularmente del receptor CD95 por la unión de su
ligando o anticuerpo agonista especifico (Figura 9). Este receptor contiene dominios
muerte (DD) en la región citoplasmática que se asocian con varias proteínas de
37
señalamiento, incluyendo la proteína de dominio muerte asociada a Fas
(FADD/MORT-1) y la caspasa-8 que juntos con el receptor forman el complejo de la
señal que induce la muerte (DISC, death-inducing signal complex) para
desencadenar la apoptosis (Ashkenazi and Dixit, 1998).
Figura 9. Vías de Señalización de apoptosis del receptor CD95.
La unión de ligando Fas (FasL) al receptor CD95 (RCD95) induce a la formación del complejo DISC
para desencadenar las vías de señalización que llevan a apoptosis. El RCD95 presenta dos vías que
operan independientemente una de otra (Scaffidi et al.,1998). (A) La vía independiente de mitocondria
(célula tipo I) activa otras caspasas como la capasa-3 que lleva a apoptosis. (B) La vía mitocondrial
(célula tipo II), la caspasa-8 media el corte de Bid (miembro de la familia pro-apoptótica Bcl-2) para
incrementar su actividad pro-apoptótica y resulta en su translocación a mitocondria donde promueve la
liberación de citocromo (cyt-c) para formar el apoptosoma y activar la casapasa-3, así como también
la liberación de caspasa-8. La actividad o activación de caspasa-3 es antagonizada por las proteínas
IAP, las cuales pueden ser inhibidas por la proteína Smac/DIABLO. Las proteínas de la familia Bcl-2
pro- y anti-apoptóticas bloquean la liberación de cyt-c y AIF. DD, dominio muerte; DED, dominio
efector muerte; m, potencial transmembranal mitocondrial. (Modificación de Hengartner, 2000).
38
La apoptosis de CD95 sigue dos vías de señalización (dependiente o
independiente de mitocondria) que dependen de la cantidad de caspasa-8 activada y
del tipo de célula (I o II), por ejemplo la apoptosis en la célula tipo II depende de
mitocondria y puede ser bloqueada por la presencia de Bcl-2 o Bcl-xL (Scaffidi et
al.,1998). Por lo tanto, el receptor CD95 y las proteínas Bcl-2 regulan diferentes vías
de apoptosis y distintas funciones fisiológicas en los linfocitos.
La modulación de apoptosis es diferente en las dos vías de CD95. En ambas
vías la activación de caspasa-8 puede ser inhibida directamente en el DISC por la
sobreexpresión de c-FLIP, pero en la vía dependiente de la mitocondria la proteína
cinasa C inhibe la apoptosis retardando el corte de Bid (Scaffidi et al.,1999b).
La apoptosis inducida por diferentes estímulos apoptóticos siguen distintas
rutas de activación de caspasas, tal como el RCD95 que requiere de la formación del
complejo DISC para desencadenar la muerte celular apoptótica, en cambio la
exposición a radiación UV necesita de la formación del apoptosoma para llevar a
apoptosis(Vu et al., 2001).
II.8.- Decremento del volumen durante apoptosis (AVD, apoptotic volume
decrease).-
Como hemos comentado anteriormente, el sentido biológico del proceso de
apoptosis es eliminar células dañadas o no deseadas sin afectar a otras estructuras
del tejido ni provocar el proceso de inflamación. Esto se logra por que la célula tiene
un mecanismo que previene la pérdida del contenido celular en el proceso de muerte
apoptótica. Realmente las características más comunes de apoptosis son: el
encogimiento celular acompañado por condensación de todos los organelos y la
expresión de marcadores específicos en la superficie de la célula reconocidos por
fagocitos. Como sabemos las rutas de señalización intracelular de los distintos tipos
celulares varían con los diferentes estímulos apoptóticos. Aquí es importante
acentuar, que todas las rutas del desarrollo de proceso de muerte programada
culminan en la AVD. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la apoptosis han
sido estudiados intensamente en las ultimas décadas, éste tema parece de ser el de
39
más alta prioridad pero hasta la fecha no se conocen los mecanismos exactos de
AVD.
Como hemos visto en él capitulo anterior el mecanismo de RVD incluye
cambios en la homeostasis iónica de la célula, así pues parece que en un punto de
las etapas del proceso de muerte celular apoptótica tiene características comunes
con la RVD entre éstas el cambio de la homeostasis iónica.
La AVD se debe a la salida de iones, principalmente K+ que es el cation
intracelular predomínate y probablemente el responsable de la pérdida del volumen
celular durante apoptosis, así como también la activación de canales de Cl- (Figura
10). Por lo tanto, dos eventos asociados han sido implicados en la regulación de
apoptosis la salida de K+ y Cl- intracelular y la salida de agua/encogimiento celular
(Yu et al., 2001).
Las preguntas en relación a la AVD por primera vez fueron postuladas por el
grupo de investigación de Cidlowski (Gómez-Angelats et al., 2000), que han sido
desarrolladas en varios estudios en los últimos años y son:
1. Si la pérdida de volumen celular es una característica secundaria pasiva del
proceso de muerte celular o es un promotor del proceso.
2. Como las vías de la muerte celular están acopladas a la activación del
encogimiento celular.
3. Donde el encogimiento celular utiliza los mecanismos de regulación de volumen
comúnmente empleadas en respuesta osmótica o posee mecanismos especiales
para el encogimiento apoptótico.
4. Que tan temprano se inicia la AVD en el desarrollo del proceso de la muerte
celular programada y si este evento es esencial solamente para la eliminación de
las células o juega un papel importante en la activación de otros mecanismos tales
como: la activación de caspasas y fragmentación de ADN.
Para encontrar las respuestas a estas preguntas se analizarán en el siguiente
capitulo III los mecanismos que participan en las diferentes etapas de apoptosis que
pueden llevar a AVD en los linfocitos.
40
Figura 10. Disminución del volumen apoptótico y posible enlace a apoptosis.
En la disminución del volumen apoptótico (A), hay salida de K+ acompañada por la salida de Cl-,
aniones orgánicos y agua, es un prerrequisito de la reducción del volumen celular. La ATPasa Na+-K+
y otros transportadores e intercambiadores iónicos probablemente también participan en el control del
volumen celular y en la homeostasis iónica. Se representan las concentraciones iónicas típicas. (B) un
modelo especulativo de la posible participación de tres eventos interrelacionados en el encogimiento
apoptótico. (-) representa eventos inhibitorios y la línea punteada representa relaciones indefinidas. El
disparo apoptótico puede activar canales de K+ y Cl-, guiando a la salida de K+ y Cl-. La disminución de
K+ o Cl- intracelulares o el volumen pueden independientemente promover apoptosis (Modificación de
Yu, 2001).
41
CAPITULO III. IMPACTO DE LA HOMEOSTASIS DE IONES
MONOVALENTES EN EL DESARROLLO DE LA APOPTOSIS.
Así como hemos visto, la apoptosis puede ser regulada por cambios en la
homeostasis iónica intracelular, por lo tanto, es importante analizar el papel que
juegan los iones monovalentes en las diferentes etapas de la apoptosis.
III.1.- Dinámica de potasio durante la muerte celular apoptótica.El K+ es el ion que se encuentra en mayor concentración intracelular (140
mM), pero durante el proceso de apoptosis hay pérdida de K+ intracelular
disminuyendo su concentración hasta niveles de 50 y 56 mM estimados en timocitos
tratados con dexametasona (Hughes et al., 1997) y en células Jurkat por
estimulación del RCD95 (Bortner et al., 1997) respectivamente, con el uso del
colorante fluorescente PBFI sensible a K+. Las mediciones desarrolladas en células
de linfoma CEM-C7A en apoptosis inducida por dexametasona también confirman la
pérdida de K+ (Benson et al., 1996).
III.1.1 La cinética de potasio intracelular con los diferentes eventos durante la
apoptosis.
La pérdida de K+ intracelular se lleva a cabo después de la primera hora de
iniciar la apoptosis (Figura 11). Éste evento es simultaneo a la externalización de la
fosfatidilserina, del encogimiento celular y de la pérdida del potencial de membrana
mitocontrial que inician entre la primera y segunda hora después del estímulo
apoptótico. El inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk (benziloxicarbonil-Val-Ala-Aspfluorometil cetona) inhibe el iniciador de caspasas en la apoptosis inducida por el
receptor CD95, en cambio con diferente estímulo no hay inhibición de todos los
procesos apoptóticos por que están por arriba o independiente de la actividad de
42
caspazas. Esto indica que la pérdida de K+ intracelular es dependiente de la actividad
de caspasas en la vía del RCD95 (Thompson et al., 2001).
La aplicación de un inhibidor de caspasas puede bloquear diferentes eventos
apoptóticos o la muerte celular apoptótica dependiendo del tipo de célula y agente
apoptótico usado (Bortner and Cidlowski, 1999). Esto muestra que diferentes
estímulos utilizan distintas vías de activación de caspasas que llevan a la apoptotisis
(ver capitulo II).
Figura 11. La salida de K+ celular en células apoptóticas es simultaneo con otros eventos.
Células Jurkat control (A y D) y tratadas anticuerpo anti-Fas (50 ng/ml: B y E) o Epoptoside (50 M: C
y F). La pérdida de K+ intracelular () inicia entre 1-2 horas después del estimulo apoptótico, al igual la
externalización de fosfatidilserina (), el encogimiento celular () y la pérdida del potencial de
membrana mitocondrial (, m). La apoptosis muestra una dependencia del tiempo, donde empieza
más rápido en la inducción por CD95. Los experimentos también se desarrollan en presencia de zVAD.fmk (20 M, D-F). El eje derecho de las x despliega el cell-pellet [86Rb+] como razón del control
(KR). (Thompson et al., 2001).
43
La salida de K+ intracelular contribuye al encogimiento celular ya que durante
un cambio osmótico hay salida de agua como consecuencia de la pérdida de iones
de K+. El encogimiento celular apoptótico es una de las características principales de
apoptosis, se inicia una hora después del estimulo apoptótico (Figura 12; Maeno et
al., 2000; Thompson et al., 2001), manteniendo su volumen constante durante 45
minutos (Lang et al. 1998c). La AVD es acompañada por la salida de K+ intracelular
(Figura 13), donde solo células encogidas exhiben degradación de DNA y pérdida de
K+ (Figura 14). Así mismo, Maeno y col. (2000) demostraron en diferentes modelos
que la AVD ocurre antes de la liberación de citocromo c, activación de caspasas,
degradación de DNA y de la muerte celular. Por lo tanto, la AVD es un elemento
necesario para el desarrollo del proceso de apoptosis.
Figura 12. Análisis del encogimiento celular durante apoptosis.
Células Jurkat tratadas con anticuerpo anti-Fas (20 ng/ml) y radiación UV (60 mJ/cm2) . A, Después
de 10 horas tratamiento, las células fueron analizadas por citometría de flujo (Forward scatter es
proporcional al tamaño celular). La línea amarilla fue situada como el control para distinguir las
poblaciones normales y encogidas. B, células encogidas tratadas con radiación UV y normales,
análisis morfológico por microscopía de contraste de fase. C, células expuestas a anticuerpo anti-Fas
y radiación UV en los tiempos indicados analizadas por citometría de flujo. (Vu et al., 2001).
44
Tamaño celular
Concentración K+
Figura 13. Relación de la pérdida de volumen celular y salida de K+ en células Jurkat
tratadas con anti-Fas.
Las células tratadas con 10 ng/ml del anticuerpo anti-Fas por 4, 8 y 12 horas, mostraron un
encogimiento celular en la disminución del tamaño celular (Forward scattering light) lo que indica un
incremento en la densidad celular (side scattering light). La concentración de K+ intracelular
(fluorescencia de PBFI-K+) disminuyo al aumentar el encogimiento celular. (Bortner and Cidlowski,
1999).
Una pérdida de Na+ intracelular también es observada en tiempos tardíos (5
hrs.) en células Jurkat encogidas tratadas con anti-Fas con el uso del indicador
fluorescente SBFI-AM sensible a Na+ (Bortner et al., 1997). La salida de Na+ y K+ no
solo tiene importancia en la pérdida de volumen sino también en la activación de
efectores muerte durante apoptosis.
45
Figura 14. Relación del contenido de DNA y concentración de K+ en linfocitos Jurkat tratadas
con el anticuerpo anti-Fas.
Células tratadas con 10 ng/ml del anticuerpo anti-Fas por 5 horas. A, análisis de DNA y tamaño
celular. Las células control que exhiben un contenido de DNA normal y células tratadas con el
anticuerpo anti-Fas muestran un incremento en el número de células que contiene DNA degradado y
dos poblaciones de células: una con tamaño normal (control, color verde) y otra encogidas (color rojo).
B, análisis de fluorescencia de PBFI-AM (K+) en células Jukat control y tratadas con anti-Fas que
mostraron una fluorescencia de PBFI-AM o disminución del contenido de K+ en la población encogida
de las células tratadas anti-Fas. El histograma muestra el número de células de fluorescencia de
PBFI-AM que mostró un incremento del 30% de células que tienen pérdida de K+. (Bortner et al.,
1997).
46
III.1.2 Activación de caspasas y endonucleasas dependientes de potasio.
Durante el proceso de apoptosis la concentración de K+ intracelular es
esencial para la activación de caspasas y nucleasas, se ha demostrado que solo
células con pérdida de K+ exhiben actividad de caspasas y fragmentación de DNA
(Figura 15). En timocitos la activación de caspasas y la fragmentación de DNA inician
a las 2 y 4 horas después del estímulo apoptótico (Figura 16), respectivamente, así
como tambien en las células U937 (Maeno et al.,2000) y células Jurkat (Vu et al.,
2001). Esto demuestra que el mecanismo de activación de caspasas y nucleasas
depende fuertemente de la concentración de iones intracelulares.
Figura 15. La actividad de caspasas y nucleasas es restringida en células con bajo K+ intracelular.
Los timocitos fueron tratados con 1M de dexametasona por 2 horas. A, muestra la distribución del
tamaño de los timocitos en dos distintas subpoblaciones. B, fluorescencia de PBFI-AM asociada con
las subpoblaciones normal y encogida. C, histograma de DNA que muestra el contenido de DNA de
las subpoblaciones de tamaño normal y encogido. D, Actividad de caspasa-3 extraída de timocitos de
tamaño normal y encogidos. (Hughes et al., 1997).
47
Figura 16. Relación de la salida de K+, actividad de caspasas y endonucleasas en apoptosis.
En Timocitos tratados con dexametasona (1M) la concentración de K+ intracelular disminuye de
manera dependiente del tiempo (A), así como también la actividad de caspasas (B) y la fragmentación
del DNA (C) incrementa. La disminución de los niveles de K+ intracelular inicia después de las 2 horas
de aplicar el estimulo apoptótico como la activación de caspasas y nucleasas. La medición intracelular
de K+ se realizo por citometría de flujo y fluorescencia PBFI sensible a K+. (Hughes et a.,l 1997).
III.1.3 El Control de apoptosis dependiente de potasio.
La concentración de K+ ha sido propuesta para regular la muerte celular
apoptótica. Hughes y col. (1997) mostraron que una concentración elevada de K+
extracelular (rango de 40 a 200 mM) suprime la degradación de DNA en una manera
dependiente de dosis en timocitos expuestos a dexametasona, también analizaron el
efecto de K+ en la activación de pro-caspasa-3 y caspasa-3 madura en timocitos
(Figura 17), donde demostraron que el K+ no tiene efecto en la actividad de la
proteasa activa pero si en la activación de la pro-caspasa-3. Esto muestra que los
48
niveles de K+ encontrados en las células son suficientes para inhibir la activación de
caspasas y nucleasas.
Figura 17. Efecto de K+ en la actividad de caspasa-3 y activación de pro-caspasa-3 por dATP y
citocromo c.
Extractos citoplasmáticos de timocitos in vivo tratados 4 hrs. con dexametasona (A), fueron expuestos
en diferentes concentraciones de K+ para analizar la actividad de la Caspasa-3. B, extractos
citoplasmáticos control incubados 1 hr. con dATP (1mM), citocromo c (10 mg/ml) y distintas
concentraciones de KCl. C, extractos control activados igual a B con la inclusión de 2.5 ml
35S-
caspasa-3. D, extractos control y tratados por 1 hr. con dATP y citocormo c fueron analizados para la
actividad de la proteasa activa en ausencia y presencia de 150 mM de KCl. (Hughes et al., 1997).
49
Como mencionamos en el capitulo II la formación y activación del complejo
apoptosoma depende de citocromo c, se ha mostrado que a concentraciones
normales de K+ intracelular se inhibe completamente la formación del apoptosoma
debido a que el K+ antagoniza la unión de citocromo c a Apaf-1, pero esta inhibición
es bloqueada por altos niveles de citocromo c (Cain et al., 2001). La concentración
de citocromo c en una célula apoptótica puede ser en el rango de 5 a 150 M
(Waterhouse et al., 2001), esto demuestra que las concentraciones citosolicas de
citocromo c durante apoptosis son capaces de inhibir el efecto de K+ permitiendo la
formación del apoptosoma y activación de caspasas debido a que la concentración
de K+ intracelular durante apoptosis se encuentra disminuida. Por consiguiente,
concentraciones fisiológicas de K+ intracelular o niveles altos de K+ extracelular
inhiben el proceso de apoptosis en células Jurkat (Figura 18).
Figura 18. Diferentes concentraciones de K+ extracelular inhiben el proceso de apoptosis.
Células Jurkat control () y tratadas anticuerpo anti-Fas (50 ng/ml: ) o Etoposide (50 M:). La
apoptosis empieza a disminuir a una concentración de 90 mM de K+, pero es completamente inhibida
a concentraciones fisiológicas (Thompson et al., 2001).
Por lo tanto, la activación de la maquinaria apoptótica ocurre después de la
pérdida de K+ intracelular y encogimiento celular. Siendo el ambiente iónico normal
de la célula un mecanismo de seguridad contra la muerte celular apoptótica
previniendo la activación de caspasas y nucleasas.
50
III.2.- Cambios en la actividad de canales iónicos durante la apoptosis.Varios canales iónicos al igual que transportadores han sido involucrados en el
proceso de apoptosis en linfocitos. Como ya hemos comentado, durante el
encogimiento celular apoptótico hay pérdida de K+ intracelular, los mecanismos
responsables podrían ser: la inhibición de la ATPasa Na+-K+ y la activación de
canales de K+ (Kv, KCa o ambos dependiendo del tipo celular), como el K+ sale de la
célula por su gradiente electroquímico para mantener la salida de K+ se requiere de
la salida de Cl- resultando en la liberación de KCl y agua. Así pues, se puede esperar
la activación de canales de Cl- durante el proceso de apoptosis. Se ha reportado la
activación del canal ORCC (Tabla 1 del capitulo I) en células Jurkat tratadas con antiFas que contribuye al AVD (Szabo et al., 1998), donde la actividad del canal depende
de su fosforilación por tirosina cinasa P56lck vía ceramida (Figura 19).
Figura 19 Activación del canal ORCC en apoptosis inducida por el receptor CD95.
En A se muestra la activación de ORCC en células Jurkat antes (a) y después (b) de la estimulación
del receptor CD95. B: Herbimicina A (inhibidor de cinasa P56lck) inhibe la actividad de ORCC en la
estimulación del receptor CD95 (a) y en presencia de herbimicina A el canal puede ser activado por
despolarización (b). C: La adición de P56lck purificada activa (b) y la subsiguiente adición del
anticuerpo antifosfotirosina parcialmente inhibe el canal ORCC (c). a, antes de la adición de P56lck;
V(pip), potencial de pipeta. (Szabo et al., 1996).
51
La salida de K+ intracelular ha sido mostrada en una serie de experimentos,
por tanto se ha demostrado que la inhibición de la pérdida de K+ previene la
activación de la muerte celular programada. Maeno y col. (2000) estudiaron en
diferentes tejidos celulares que el bloqueo farmacológico de los canales de K+ y de
Cl- reguladores del volumen celular inhiben los eventos apoptóticos, tal como en
células linfoides U937 (Figura 20). De igual manera, la apoptosis también fue inhibida
por un bloqueador del canal de K+ en timocitos (TEA, Dallaporta et al., 1999) y en
células leucemias (4-AP, Wang et al., 1999) con diferentes estímulos. En células
Jurkat tratadas con anti-Fas la fragmentación de DNA fue parcialmente suprimida por
un bloqueador del canal de Cl- (glibenclamida, IAA o DPC), (Szabo et al., 1998). Así
pues, la inhibición de estos canales por la acción de bloqueadores específicos
confirma su participación en el proceso de apoptosis (Maeno et al., 2000).
Figura 20. Inhibición de la muerte celular y cambios bioquímicos en células linfoides tratadas
con STS y TNF/CHX y bloqueadores de canales de K+ y Cl-.
Activación de caspasa-3 (A) y fragmentación de DNA (B) inducida por 1 g de estaurosporina (STS) y
0.1 g/ml de TNF/CHX y su prevención con tratamiento de bloqueadores del canal de Cl- [0.5 mM
DIDS y 0.5 mM NPPB (5-nitro-2-3-fenilpropilsmonio-benzoato)] y de K+ (5 mM de Ba2+) en células
U937. C, viabilidad de células control () y apoptóticas tratadas con STS 4 horas por en ausencia ()
o presencia de DIDS () y quinina 0.5 mM ( , bloqueador de canal de K+), evaluada por la exclusión
de azul de tripano. (Maeno et al., 2000)
52
En otros modelos se ha demostrado la activación de canales de K+ durante el
proceso de apoptosis, en células mieloblasticas de leucemia tratadas con radiación
UV se activa el canal de K+ en un tiempo de 5-10 minutos (Figura 21) y en células de
hígado de rata estimuladas con TNF la activación de ambos canales de K+ y Cl(Nietsch et al., 2000). Mientras que en células Jurkat se han reportado datos
contradictorios respecto al canal de K+, donde Szabo y col. (1996) reportan la
inhibición del canal Kv1.3 en tiempos tempranos (5 minutos) por estimulación del
receptor CD95 (Figura 22), y Bock y col. (2002) muestran que la actividad del canal
Kv1.3 no cambia en etapas tempranas pero si aumenta en tiempos prolongados (16
horas) durante la apoptosis inducida por actinomicina D (Figura 23).
Figura 21. Activación del canal de K+ sensible a 4-Aminopiridina por radiación UV.
A, Efecto de la radiación UV en la corriente de K+ sensible a 4-aminopiridina (4-AP). Las corrientes en
la configuración de célula completa fueron activadas por la exposición de las células mieloblasticas a
radiación UV e inhibidas en presencia de 4-AP. El potencial de membrana fue despolarizado de 60mV a +80mV en incrementos de 20mV. B, Relación corriente-voltaje de la corriente de K+ sensible a
4-AP activada por la luz UV. (Wang et al., 1999).
53
Figura 22 Inhibición del canal Kv1.3 en células Jurkat por estimulación del receptor CD95.
Los trazos muestran la corriente del canal Kv1.3 en control y después de la estimulación del receptor
CD95 (a) durante pulsos de voltaje de 300 ms de un potencial holding de -70 mV a +70 mV en pasos
de 20 mV. En (b) la curva corriente voltaje control () y en presencia de anti-Fas (). (Szabo et al.,
1996).
Figura 23. Actividad del canal de K+ (Kv1.3) en células Jurkat tratadas con actinomicina D.
Corrientes del canal Kv1.3 control (A) y después de 16 horas de tratamiento con actinomicina D (100
ng/ml) (B). La actividad del canal Kv1.3 no es alterada en pocos minutos o después de algunas horas
en células Jurkat tratadas con actinomicina D, pero después de 16 horas de tratamiento si resulta una
marcada activación (C). Las corrientes en la configuración célula completa fueron extraídas por la
aplicación de un pulso de voltaje de +70mV de 300ms de duración cada 45 segundos. (Bock et al.,
2002)
54
Estudios realizados durante apoptosis inducida por el receptor CD95 en
células Jurkat han reportado la inhibición del intercambiador Na+/H+ a través de un
mecanismo que depende directamente o indirectamente en la activación de la cinasa
P56lck, éste efecto contribuye a la acidificación, fragmentación de DNA y
encogimiento celular durante apoptosis (Lang et al., 2000a). Así como también, el
bloqueo de la entrada de Ca2+ a través de canales CRAC en linfocitos por medio de
la activación del ácido esfingomielinico y liberación de ceramida (Lepple-wienhues et
al., 1999). La inhibición de CRAC requiere de la expresión del ácido esfingomielinico
y suprime señales de activación en los linfocitos dependientes de Ca2+, como la
síntesis de interleucina-2. Bortner y col. (2001) demostraron que durante la apoptosis
inducida por anti-Fas en células Jurkat hay una despolarización temprana de la
membrana plasmática con el uso del indicador DIBAC4(3) siendo un evento
temprano de la apoptosis, al igual la inhibición de la ATPasa Na+-K+ (Figura 24) y un
incremento de Na+ intracelular que aumentan la despolarización.
A
B
Figura 24. Análisis Western blot de las subunidades  y  de la ATPasa Na+-K+ en apoptosis
En la figura A se muestran células Jurkat tratadas en presencia y ausencia de 50 ng/ml de anticuerpo
anti-Fas en diferentes tiempos. Los extractos de proteínas fueron preparados y examinados en
electroforesis de gel de poliacrilamida. Los geles fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa y
examinados por la expresión de las subunidades 
y  de la ATPasa Na+-K+. Se observa una
temprana disminución en la subunidad  con el corte especifico de la subunidad  de la ATPasa Na+K+. B, examinación de células individuales despolarizadas y no despolarizadas que revelan la
disminución de la subunidad  de la ATPasa Na+-K+ en la población de células despolarizadas.
(Bortner et al., 2001).
55
DISCUSIONES
Como hemos revisado el proceso de apoptosis es acompañado de cambios en
la homeostasis iónica intracelular durante las diferentes etapas del proceso. La salida
de iones (principalmente K+ y Cl-) y agua hacia fuera de la célula llevan al
encogimiento celular apoptótico que se presenta en todas las rutas del desarrollo de
muerte celular programada independientemente del estímulo apoptótico, siendo uno
de los mecanismos que previene la liberación del contenido celular sin afectar a otras
células ni provocar inflamación.
El encogimiento celular apoptótico inicia una hora después del estímulo
apoptótico en los linfocitos Jurkat manteniendo su volumen celular constante durante
45 minutos. Se ha reportado que los diferentes eventos apoptóticos (pérdida de K+
intracelular, AVD, externalización de fosfatidilserina y la pérdida del potencial de
membrana mitocondrial) son simultáneos una hora después del estímulo apoptótico
en células Jurkat (Figura 11, Thompson et al., 2001), así como también, la
correlación entre la AVD y la pérdida de K+ intracelular (Figura 13, Bortner and
Cidlowski,1999), y en este mismo tiempo se ha observado la activación de caspasas
(Vu et al., 2001). Para responder a la pregunta si son eventos simultáneos e
independientes o relacionados se han realizado experimentos con inhibidores
específicos de las caspasas. El inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk inhibe la apoptosis
inducida por el receptor CD95 (Thompson et al., 2001) y a la caspasa-8 iniciadora en
células Jurkat tratadas con ligando Fas bloqueando completamente el desarrollo de
apoptosis, la disminución de volumen y la pérdida de K+ intracelular (Vu et al., 2001).
Por otro lado, se conoce que la pérdida de K+ forma un ambiente favorable para la
activación de caspasas efectoras 1 y 3 involucradas en la apoptosis inducida por Fas
en células linfoides (Hughes et al., 1997; Thompson et al., 2001). Así, podemos
proponer el siguiente esquema del papel de K+ en el desarrollo del proceso de
apoptosis inducida por Fas (Figura 25), donde la caspasa-8 se activa por un proceso
autocatalítico y no ocupa la disminución de la concentración intracelular de K+, pero
la señal de la caspasa-8 así como la amplificación de la señal y la activación de la
cascada de caspasas si requieren de la formación de un ambiente intracelular
56
favorable y de la salida de K+. En este caso para la salida de K+ se puede esperar la
activación de canales de K+ en las fases más tardías.
Figura 25. Esquema propuesto que muestra el papel de K+ en apoptosis. Un estímulo
específico activa la caspasa-8 por autoprocesamiento. La caspasa-8 lleva a la disminución de la
concentración de K+ intracelular ([K+]i), la cual funciona como un proceso de retroalimentación positiva
debido a que la baja [K+]i acelera la activación de la caspasa-8 y –3. La caspasa-3 participa en la
activación de cascada de casapasas, en el corte de substratos apoptóticos y podría pensarse que
tomará como substrato apoptótico los canales de K+. Así la baja [K+]i, el encogimiento celular y el corte
de substratos apoptóticos llevan a la muerte celular apoptótica.
La activación de la caspasa-9 es observada durante la apoptosis inducida por
la luz UV en células linfoides pero la activación de la caspasa-8 no (Vu et al., 2001),
en este caso el inhibidor de caspasas no inhibe la disminución de volumen ni la
pérdida de K+. Por lo tanto, las caspasas involucradas en el proceso de la muerte
inducida por luz UV requieren de la disminución de K+, con esto se puede esperar la
activación de los canales de K+ en las etapas tempranas de apoptosis después del
tratamiento con radiación. Encontramos solo un articulo dedicado al estudio de la
actividad de los canales de K+ en células mieloblasticas de leucemia tratadas con luz
UV, donde se muestra la activación del canal de K+ al minuto después del estímulo
(Wang et al., 1999; Figura 21 del capitulo III). En otro estudio realizado en las células
Jurkat demostraron la inhibición del canal Kv1.3 en tiempos tempranos después de
tratamiento con el ligando Fas (Szabo et al., 1996), pero realizando un análisis
detallado de este trabajo reveló que la inhibición del canal Kv1.3 se observa en un
57
rango no fisiológico en la curva corriente-voltaje (Figura 22 del capitulo III) y la
fosforilación de este canal para su inhibición no fue posible por la falta de ATP en la
solución pipeta. Además tomando en cuenta la activación de los canales de Cl(ORCC; Szabo et al.,1998) en los primeros 5 minutos después del estímulo
apoptótico se esperaría también la salida de K+: La activación de los canales de Clresulta en la despolarización de la membrana plasmática y debe llevar a la activación
de los canales Kv1.3. Otro hecho a favor de una posible activación de los canales de
K+ es la disminución de la concentración de K+ intracelular en este mismo modelo
(Vu et al., 2001; Bortner et al., 1997; Bortner and Cidlowski, 1999). Así, se puede
pronosticar la activación de los canales Kv1.3 en tiempos más tardíos o posiblemente
de canales KCa tomando en cuenta el papel de Ca2+ en proceso de apoptosis y
presencia de KCa en células Jurkat. Hasta el momento el estudio de Szabo y col.
(1996) es el único dedicado a estudios del canal Kv1.3 en las células Jurkat tratadas
con el ligando Fas. Por otro lado, la activación del canal Kv1.3 fue mostrada en
células Jurkat en tiempos tardíos después del tratamiento con actinomicina D (Bock
et al., 2002; Figura 23 del capitulo III), así como también analizaron células T
deficientes del canal Kv1.3 (CTLL-2) donde no observaron fragmentación de ADN,
liberación de citocromo c y pérdida de potencial de la membrana mitocondrial en
respuesta a actinomicina D. Estas mismas células transfectadas con el canal Kv1.3
desarrollaron apoptosis con todas sus características correspondientes. Todos estos
hechos nos muestran el papel central del canal Kv1.3 en el proceso de apoptosis.
También en otros modelos se ha demostrado la activación de canales de Cl- y
K+. En células de hígado de rata la apoptosis inducida por el RTNF activa canales de
K+ y Cl- entre los 5-10 minutos (Nietsch et al., 2000). La muerte celular apoptótica en
células vasculares de músculo liso (Krick et al., 2001; 2002) y neuronas (Yu et al.,
1997) esta mediada por la activación de los canales de K+. En las células linfoides la
apoptosis puede ser inhibida por el bloqueo de canales de Cl- y K+ previniendo la
AVD, la activación de caspasa-3 y degradación de DNA en varios tipos celulares con
diferentes estímulos apoptóticos (Maeno et al., 2000, Figura 20 del capitulo III).
Otro mecanismo posible de la disminución de la concentración de K+
intracelular es la inhibición de la actividad de la ATPasa Na+-K+ que fue mostrada 1
58
hora después de tratamiento con ligando Fas en células Jurkat (Bortner et al., 2001).
El mecanismo de inhibición de la ATPasa Na+-K+ puede ser la disminución de la
síntesis de ATP por cambios apoptóticas en mitocondrias. También se puede
proponer que la ATPasa Na+-K+ sirve como substrato para las caspasas activadas,
como ha sido demostrado en el caso de la ATPasa de Ca2+ (Paszty et al., 2002) y del
receptor de IP3 (Hirota et al., 1999) como substratos para la caspasa-3. Este
mecanismo puede involucrarse también en la regulación de la actividad de canales
iónicos aunque todavía no hay estudios dedicados a este tema.
En base a lo analizado podemos proponer el siguiente esquema del desarrollo
de apoptosis inducida por la interacción del ligando Fas con su receptor (Figura 26).
Así pues, la diferencia en la activación o inhibición de los canales de K+ y Cl- es
dependiente del tipo celular y estímulo apoptótico, donde la distribución de canales y
vías de señalización que llevan a la muerte celular programada son distintas.
Figura 26. Diagrama esquemático que muestra el mecanismo propuesto que media la AVD y la
apoptosis del receptor CD95 en células Jurkat.
La estimulación del receptor CD95 activa la tirosina cinasa p56Lck vía ceramida para activar los
canales de Cl-, así como también se activan los canales de K+ por una vía desconocida lo que lleva a
la salida de KCl junto con el agua para llevar al encogimiento apoptótico. La inhibición del
intercambiador K+/H+ (IK+/H+) y la liberación del osmolito tambien contribuyen al encogimiento celular.
La pérdida K+ favorece la activación de las caspasas. El encogimiento celular y el corte de substratos
apoptóticos llevan a apoptosis.
59
Por lo tanto, la activación de las caspasas y nucleasas ocurre solamente en
células encogidas con bajo K+ intracelular. Así como también concentraciones
fisiológicas de K+ intracelular o una elevada concentración de K+ extracelular
(140mM) suprimen completamente la apoptosis inducida por diferentes estímulos
previniendo la perdida de K+ intracelular, la perturbación mitocondrial y la activación
de las caspasas (Thompson et al., 2001).
Como comentamos en el capitulo II todas las rutas del desarrollo de apoptosis
culminan en la disminución del volumen celular independientemente del tipo celular y
estímulo apoptótico. Las vías de señalización que sigue el proceso de apoptosis
involucran una amplia variedad de moléculas de señalización, que desencadenan
cascadas de señalización que llevan a los cambios bioquímicos y morfológicos
característicos de la apoptosis (Figura 27).
Figura 27. Vías de señalización y mecanismos de transporte durante la apoptosis del receptor CD95.
La estimulación del receptor CD95 activa la tirosina cinasa p56Lck vía ceramida que activa los canales
de Cl- e inhibe el intercambiador K+/H+ y la entrada de Ca2+. La vía de activación de canal de K+ no es
conocida. La inhibición de la ATPasa Na+-K+ en respuesta a una despolarización temprana de la
membrana plasmática. La ceramida y la cinasa PAK2 estimulan la cinana JNK. La cinasa PAK2 es
cortada por la caspasa-3 y JNK fosforila la proteína Bcl-2 promoviendo la muerte celular. La activación
de los canales aniónicos permeables a HCO3- y la inhibición del intercambiador Na+/H+ contribuyen a
la acidificación citosolica que llevan a la fragmentación de DNA y al encogimiento celular junto con la
liberación del osmolito (Modificación de Lang et al., 2000a).
60
En las vías apoptóticas participan procesos de transporte a través de la
membrana plasmática, tales como los canales de K+, los canales aniónicos y los
mecanismos de liberación de osmolitos que contribuyen a la disminución del volumen
celular y llevan a la alteración del ambiente celular (acidificación y pérdida de K+),
permitiendo la activación de las caspasas y nucleasas dando como resultado la
muerte celular. Los mecanismos que pueden contribuir al efecto protector del
encogimiento celular son la acumulación de osmolitos, la inhibición de tirosina cinasa
p56Lck y la activación del intercambiador Na+/H+ con la subsecuente alcalinización
(Lang et al., 2000a). Por lo tanto, las rutas de muerte celular apoptótica están
acopladas a la activación del encogimiento celular.
Además existe la posibilidad de que los mecanismos de regulación del
volumen celular normal participen en el proceso de apoptosis facilitando la AVD,
llevando al encogimiento celular apoptótico por la activación de los canales de Cl- y
K+ reguladores del volumen (Maeno et al., 2000). Para confirmar este argumento
revisamos si los mecanismos de regulación del volumen celular normal son utilizados
durante la muerte celular apoptótica o cuenta con mecanismos especiales.
Como revisamos en el capitulo I los linfocitos poseen mecanismos de
regulación del volumen celular en condiciones normales, ya que ellos están
expuestos a cambios osmóticos durante su migración dentro del tejido para encontrar
y reconocer antígenos específicos. Por lo tanto, durante un hinchamiento osmótico la
célula utiliza el mecanismo de la RVD para disminuir y recuperar el volumen celular
normal (Figura 28). La RVD involucra la salida de K+ (canal Kv1.3) y Cl- (canal Clswell)
por vías separadas para mantener la electroneutralidad seguida de un movimiento de
agua y liberación de osmolitos (taurina) hacia fuera de la célula, donde el factor
primario que controla la regulación del volumen celular en todas las células son los
iones. En la AVD también es acompañada por la liberación de Cl- (canal ORCC) y K+
(Bortner and Cidlowski, 1999; Thompson et al., 2001; Vu et al., 2001), hay liberación
del osmolito taurina (Lang et al., 1998c), se inhibe el intercambiador Na+/H+ (Lang et
al., 2000a) y se inactiva la ATPasa Na+-K+ (Bortner et al., 2001), (Figura 29).
61
Figura 28. Regulación del volumen en los linfocitos en respuesta a estrés hipotónico.
Las células T maduras activan el mecanismo de la RVD que diminuye el volumen celular abriendo los
canales de Cl- (Clswell) para permitir la salida de iones Cl- de la célula. La apertura de canales Clswell
despolarizan el potencial de membrana y abren indirectamente los canales Kv1.3 que dejan salir iones
K+ para conducir agua hacia el exterior y causar el encogimiento celular. (Cahalan et al., 2001).
Figura 29. Regulación de los mecanismos de transporte bajo apoptosis inducida por CD95.
La estimulación del receptor CD95 en las células Jurkat activa la tirosina cinasa p56Lck vía ceramida
que activa canales de Cl- e inhibe el intercambiador Na+/H+. Durante apoptosis se ha demostrado una
despolarización temprana, un incremento de Na+ intracelular y la inactivación de la ATPasa Na+-K+. La
activación de canales de K+ y de Cl- llevan a la pérdida de KCl junto con la salida de agua y taurina
contribuyen a la AVD. La inhibición del intercambiador Na+/H+ y la liberación de bicarbonato
contribuyen a la acidificación.
62
En los linfocitos T Jurkat parece activarse el mismo canal de Cl- durante el
hinchamiento celular y el proceso de apoptosis, por las características biofísicas y
farmacológicas del canal de Cl- (Tabla 1 del capitulo I), además son activados por la
misma tirosina cinasa P56Ick pero hasta el momento su estructura no es conocida.
Entonces comparando los mecanismos de transporte empleados en la RVD y
la AVD (Tabla 6), se observa que se activan algunos de los mecanismos de
transporte para disminuir el volumen celular, tales como la liberación de K+, Cl-,
taurina y agua. Además durante un estrés hipotónico el tiempo que tarda el
mecanismo de RVD en activarse y recuperar el volumen normal de la célula es de 13
min. (Lepple-Wienhues et al., 1998), mientras que la AVD inicia una hora después
del estímulo apoptótico lo cual nos indica que durante la apoptosis se desencadenan
procesos que van a llevar a la activación de mecanismos de transporte de la RVD
para facilitar la AVD. Así como también, activando otros mecanismos que impiden a
la célula recuperar el volumen normal (la entrada de Cl- y Na+) y que van a llevar a la
muerte celular apoptótica. Lo que hasta el momento no se conoce es la vía de
señalización que activa el canal de K+ para liberar K+, pero lo que sí ha sido
demostrado es la liberación de K+ durante apoptosis y su acoplamiento con el
encogimiento celular.
Tabla 6. Correlación de los eventos durante la RVD y la AVD en linfocitos
Evento
canal Clcanal K+
Intercambiador Na+/H+
Liberación de HCO3ATPasa Na+-K+
Liberación de osmolito
Salida de H2O
↑, activación; ↓, inhibición.
RVD
↑
↑
↓
↓
↑
↑
↑
AVD
↑
↑
↓
↑
↓
↑
↑
La mayoría de trabajos en linfocitos se han realizado es en células Jurkat,
donde se observa la serie de procesos que se activan o inhiben durante las
diferentes etapas de apoptosis para llevar la muerte celular apoptótica (Tabla 7), pero
también se ha analizado en otros modelos. Como podemos ver durante la primera
63
hora después de tratamiento apoptótico se observa los cambios en la actividad de los
canales iónicos (respuesta rápida), la inhibición de la ATPasa Na+-K+, la liberación de
osmolitos y la despolarización de la membrana plasmática. Estos eventos llevan a la
pérdida de K+, a la AVD y a la activación de caspasas. Al mismo tiempo también se
ha observado el bloqueo de la pérdida de K+ y la AVD por los inhibidores específicos
de las caspasas en varios modelos apoptóticos en linfocitos (Vu et al., 2001).
Tabla 7. Eventos durante el proceso de apoptosis en diferentes células.
Modelo
Células
Jukart
Procesos
*
Inactivación de canal Kv1.3
Activación de canal ORCC
Liberación de taurina
Despolarización de célula
Inhibición de la ATPasa Na+K+
Inhibición de canales CRAC
Tiempo
5 min.
5 min.
45 min.
1 h.
1 h.
1 h.
AVD y activación de caspasas 1-2 hrs.
Pérdida de K+, AVD, Ext. 1-2hrs.
fosfatidilserina y pérdida m
Incremento de Na+ intracelular
2 h.
Inhibición del intercambiador
Na+/H+
Pérdida de Na+ y K+
Activación del canal Kv1.3
4 hrs.
5 hrs.
16 hrs.
Pérdida de K+, degradación 2 hrs.
de DNA y
Actividad de
caspasas
Células.
Fragmentación de DNA
4 hrs.
Hela,U937 Liberación de citocromo C
5.5 hrs.
PCl2
5-10
Células de Activación de canales de K+ y
min.
hígado de Cl
ratón
Células
Activación de canal de K+ 1 min.
Mieloblas- activado por voltaje
ticas
Timocitos
Estímulo
Fas
Fas
Fas
Fas
Referencia
Szabo et al., 1996
Szabo et al., 1998
Lang et al., 1998
Bortner et al.,
2001
Fas
Bortner et al.,
2001
Fas
Lepple-Wienhues
et al., 1999
Fas y UV Vu et al., 2001
Fas y
Thompson et al.,
Etoposide 2001
Fas
Bortner et al.,
2001
Fas
Lang et al., 2000
Fas
Actinomici
-na D
Dexametasona
Bortner et al.,
1997 Bock et al.,
2002
Hughes et al.
1997
Estauros- Maeno et al.
porina
2000.
TNF
TNF
Nietsch et al.,
2000
Radiación Lang et al., 1999
UV
* Ver detalles en discusión.
64
CONCLUSIONES
La pérdida de K+ es un promotor del proceso de apoptosis y contribuye al
encogimiento celular apoptótico.
El bloqueo de canales de Cl- y K+ previene la AVD, así como también la
muerte celular apoptótica.
La concentración fisiológica de potasio intracelular inhibe el proceso de
apoptosis.
La pérdida de K+ es necesaria para la activación de otros mecanismos
(actividad de nucleasas y caspasas) y la progresión del proceso de la muerte
celular programada.
La AVD emplea algunos mecanismos de transporte de la RVD para disminuir
su volumen celular impidiendo a la célula recuperar el volumen celular normal.
65
PERSPECTIVAS
Investigar que vía de señalización activa el canal de K+ durante el proceso de
apoptosis en linfocitos.
Realizar mediciones de corriente de K+ (canal Kv1.3) en tiempos tempranos y
tardíos durante apoptosis.
Estudiar la participación de los canales KCa en el proceso de apoptosis y realizar
las mediciones de Ca2+ intracelular en linfocitos tratados con varios estímulos
apoptóticos.
Investigar el papel de ATPasa Na+-K+ en apoptosis de células linfoides.
Analizar si los canales y transportadores involucrados en la regulación del
volumen celular pueden servir como sustrato para caspasas activadas.
66
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