SOP 905-04-0 Beta-Glu, Rev. B, english

RESOLUCIÓN OIV/OENO 340/2010
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD β-GLUCANASA (ß 1-3, ß1-6)EN LAS PREPARACIONES
ENZIMÁTICAS
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artículo 2, apartado 2 iv, del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se creó de la
Organización Internacional de la Viña y el Vino
Tras conocer los trabajos del grupo de expertos «Especificidad de los productos enológicos»,
DECIDE, a propuesta la Comisión II «Enología», completar el capítulo II del Código
Internacional de las Prácticas Enológicas con las técnicas de análisis y de control siguientes:
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ß-GLUCANASA (ß 1-3, ß 1-6)
EN LAS PREPARACIONES ENZIMÁTICAS
1. ÁMBITO DE APLICACIÓN
Materias primas
comerciales.
que
contengan
enzimas
con
actividad
β-glucanasa
y
preparaciones
2. FUNDAMENTO
El método de análisis se basa en la determinación cuantitativa de la glucosa liberada por la
enzima, cuya actividad se quiere medir, a partir de una solución patrón de glucano
Schizophyllum sp. común.
2.1 Definición de las unidades:
La unidad β-glucanasa (β-Glu-U) se define como la cantidad de azúcares reductores (en forma
de glucosa) que se liberan en condiciones de laboratorio con 1 gramo (o 1 mililitro) de enzima
por minuto.
2.2 Papel de la enzima
Durante el desarrollo de Botrytis cinerea sobre las uvas infectadas, lo que se conoce como
podredumbre gris o noble, el hongo excreta un β-1,3-glucano en el que cada tres unidades de
glucosa hay una glucosilada en β-1,6. (Fig. 1). Este glucano es muy similar al glucano
sintetizado por Schizophyllum sp. común.
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2.3 Fundamento de la medida
La actividad enzimática libera glucosa que, en medio básico, produce la reducción del ácido
3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico. El fenol aumenta la sensibilidad de la
reacción. El hidrogenosulfito de sodio fija la coloración.
3. MATERIAL
3.1 Espectrofotómetro y cubetas de 1 cm de paso óptico
3.2 Baño María 40°C, 100°C
3.3 Agitador magnético estándar
3.4 Agitador magnético múltiple, a 300 rpm
3.5 Recipientes de medida (matraces aforados, vasos de precipitados, matraces de
Erlenmeyer, etc.)
3.6 Becher
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3.7 Micropipetas
3.8 Cronómetro
3.9 Homogeneizador ultrasónico
3.10 Pehachímetro
4. REACTIVOS Y SUSTANCIAS
4.1 Sustrato
Disolución madre de glucano facilitada por la Universidad de Braunschweig1 y cuya
concentración de glucano ha sido determinada por dicha institución.
4.2 Sustancias puras
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.2.8
Ácido cítrico (monohidrato) (CAS N° 5949-29-1)
Hidróxido de sodio (CAS N° 1310-73-2)
Tartrato de sodio y de potasio (CAS N° 304-59-6)
Metabisulfito de sodio Na2O5S2 (CAS N° 7681-57-4)
Fenol (CAS N° 108-95-2)
Glucosa anhidra
Ácido 3,5-dinitro-2-hidroxibenzoico (3,5-dinitrosalicílico) (CAS N° 609-99-4)
Agua destilada
4.3 Disoluciones
4.3.1 Disolución de hidróxido de sodio 1 M
En un matraz aforado, disolver 4,0 g de hidróxido de sodio (4.2.2) con agua destilada (4.2.8) y
enrasar.
4.3.2 Disolución tampón de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/l
En un matraz aforado de 500 ml, disolver 21,0 g de ácido cítrico monohidratado (4.2.1) con
400 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio
(4.3.1) y enrasar con agua destilada (4.2.8).
4.3.3 Disolución tampón de citrato (pH 4,0), 0,1 mol/l
En un matraz aforado de 1000 ml, disolver 21,0 g de ácido cítrico monohidratado (4.2.1) con
900 ml de agua destilada (4.2.8). Ajustar el pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de
sodio (4.3.1) y enrasar con agua destilada (4.2.8).
4.3.4 Disolución valorante: reactivo de color ácido dinitrosalicílico (DNS) con fenol
Se prepara a partir de las disoluciones A, B y C siguientes:
4.3.4.1 Disolución A
Pesar 154,2 g de tartrato de sodio y de potasio (4.2.3) en un vaso de precipitados de 800 ml y
disolver totalmente en 500 ml de agua destilada (4.2.8). Añadir 9,7 g de hidróxido de sodio
(4.2.2).
4.3.4.2 Disolución B
En un vaso de precipitados de 2000 ml, disolver totalmente 5,3 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico
(4.2.7) en 500 ml de agua destilada (4.2.8). Los mejores resultados se obtienen con el
homogeneizador
ultrasónico.
4.3.4.3 Disolución C
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Prof. Dr. Udo Rau, Technical University Braunschweig, Department of Biochemistry and Biotechnology
Spielmannstr. 7, 38106 Braunschweig - Germany
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En un vaso de precipitados de 100 ml, disolver 4,2 g de fenol (4.2.5) en 50 ml de agua
destilada (4.2.8). Añadir 1 g de hidróxido de sodio (4.2.2) y, una vez disuelto totalmente,
4,2 g de bisulfito de sodio (4.2.4) y volver a mezclar.
4.3.4.4 Disolución de glucosa al 0,3 %
Poner 300 mg de glucosa (4.2.6) en un matraz aforado de 100 ml, disolver en agua destilada
(4.2.8) y enrasar.
4.3.4.5 Reactivo DNS con fenol
Mezclar las disoluciones A y C con la B en un vaso de precipitados de 2000 ml y tapar con
papel de aluminio.
Antes de utilizar, conservar al resguardo de la luz durante al menos 3 días.
Trasvasar el reactivo a un frasco de vidrio ambar.
Puede conservarse durante un mes en un lugar oscuro y a una temperatura de entre 15 °C y
20 °C.
Cada vez que se vuelve a preparar un reactivo y antes de cada medición, deberá realizarse
hay que realizar un calibrado antes de proceder al análisis de la enzima.
Antes de cada uso, se han de añadir 3 ml de glucosa al 0,3 % (4.3.3.4) a 200 ml del reactivo
DNS con fenol.
4.3.5 Glucano en disolución al 0,1 %, pH 4,0
Pesar la cantidad exacta de disolución madre de glucano (4.1) necesaria para obtener una
concentración final de 1 g/l.
La disolución final de sustrato debe contener un 50 % de solución tampón de citrato (pH 4,0),
0,2 mol/l (4.3.2).
Para obtener 100 ml de disolución a partir de una disolución madre de glucano (4.1) que
contenga 5,2 g/l, se toman 19,2 g y se pesan en un vaso de precipitados de 100 ml. Se
añaden 50 ml de la solución tampón de citrato (pH 4,0), 0,2 mol/l. Para obtener una mezcla
homogénea, se remueve durante al menos 15 minutos. Una vez la disolución esté bien
homogeneizada, se ajusta el pH a 4,0 con una solución molar de hidróxido de sodio (4.3.1).
Posteriormente, se transfiere la disolución a un matraz aforado de 100 ml y se enrasar con
agua destilada (4.2.8).
Las disoluciones madres de glucano se almacenan a temperatura ambiente. Si se utiliza una
nueva disolución madre de glucano, se ha de determinar el factor de sustrato (Gf o factor de
glucano) mediante la enzima estándar. El factor Gf resulta indispensable para comparar los
resultados obtenidos con disoluciones madres distintas. El factor Gf se calcula a partir de una
fórmula con los valores medidos teniendo en cuenta que la actividad enzimática estándar es de
10000 β-Glu U/g (véase el apartado correspondiente al cálculo de la actividad enzimática).
4.4 Preparaciones enzimáticas
4.4.1 Disolución enzimática estándar de glucanasa:
Se disuelven 0,5 g de la preparación enximática estandar de glucanasa en 25 ml de la
disolución tampón de citrato (pH 4,0; 0,1 mol/l) (4.3.3) y se enrasa a 100 ml con agua
destilada (4.2.8).
4.4.2 Para el resto de preparaciones enzimáticas:
Se toma 1 ml de la preparación enzimática, o 0,5 g si se trata de una preparación sólida en
polvo o granulado. Se disuelve en 25 ml de la disolución tampón de citrato (pH 4,0; 0,1 mol/l)
(4.3.3) y se enrasa a 100 ml con agua destilada (4.2.8). Si los valores de absorción son
demasiado altos o demasiado bajos (intervalo de absorbancia 0.1-0.6), deberá realizarse una
dilución adecuada. La disolución de enzimas deberá contener un 25 % de disolución tampón de
citrato (4.3.3).
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5. PROCEDIMIENTO
5.1 Blanco de reactivo
En un matraz aforado de 50 ml, añadir 7 ml de reactivo DNS con fenol (4.3.4) a 3 ml de agua
destilada (4.2.8) y calentar durante 10 minutos en un baño María en ebullición. Enfriar el
matraz durante 5 minutos en hielo. Introducirlo después en el baño María a 20 °C y añadir
agua destilada (4.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10
minutos a 20 °C.
5.2 Curva de calibrado de la glucosa (con reactivo DNS con fenol)
Disolver 2,00 g de glucosa (4.2.6) en un matraz aforado de 200 ml y enrasar con agua
destilada (4.2.8). A partir de esta disolución, preparar la serie de disoluciones siguiente:
N.°
1
2
3
4
5
6
7
V solución patrón /
100 ml
2 ml
5 ml
10 ml
15 ml
20 ml
30 ml
40 ml
glucosa/100 ml
20 mg
50 mg
100 mg
150 mg
200 mg
300 mg
400 mg
glucosa (µg) en la muestra
(0,5 ml)
100 µg
250 µg
500 µg
750 µg
1000 µg
1500 µg
2000 µg
Pipetear 0,5 ml de cada disolución de la serie y ponerlos en matraces aforados de 50 ml.
Añadir 7 ml del reactivo DNS con fenol (4.3.4) y 2,5 ml de agua destilada (4.2.8). Calentar los
matraces durante 10 minutos exactos en un baño María en ebullición. Enfriar durante 5
minutos en un baño de hielo. Introducir los matraces en un baño María a 20 °C y añadir agua
destilada (4.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a
20 °C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia de las disoluciones à 515 nm de
longitud de onda respecto al blanco (que contiene sólo reactivo).
Representar en una gráfica la cantidad de glucosa en cada disolución de la serie frente a los
valores de absorción a 515 nm (Fig. 2).
La curva de calibrado se debe elaborar el mismo día, antes de cada análisis de la enzima.
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Figura 2
5.3 Determinación del blanco de las enzimas
Pipetear 0,5 ml de las disoluciones enzimáticas (4.4.1 o 4.4.2) y ponerlos en matraces
aforados de 50 ml. Añadir 7 ml del reactivo DNS con fenol (4.3.4). Mezclar con esmero y
añadir 2,5 ml de la disolución de sustrato (4.3.5). Mezclar bien agitando los matraces con la
mano. Calentarlos en un baño María en ebullición durante 10 minutos exactos. Enfriar los
matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un baño María a 20 °C. Añadir agua
destilada (4.2.8) por debajo de la línea de enrase. Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a
20 °C. Con un espectrofotómetro, medir la absorbancia de las disoluciones à 515 nm de
longitud de onda respecto al blanco (que contiene sólo reactivo).
5.4 Medida de la actividad de las preparaciones enzimáticas
Para cada muestra, disponer 10 ml de sustrato (4.3.5) en un matraz de Erlenmeyer y calentar
durante 5 minutos en un baño María a 40 °C. Para homogeneizar las muestras se ha de utilizar
un agitador magnético múltiple a 300 rpm.
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Transcurridos 5 minutos, se añaden 2 ml de las disoluciones enzimáticas (4.4.1 o 4.4.2) al
primer matraz e inmediatamente después se pone en marcha un cronómetro.
A continuación, añadir las disoluciones enzimáticas restantes a los demás matraces espaciando
las adiciones 30 segundos.
Agitar las muestras a 300 rpm a lo largo de toda la reacción.
Tras exactamente 15 minutos, se pipetean 3 ml de la primera mezcla y se transfieren a un
matraz aforado de 50 ml con 7 ml de reactivo DNS con fenol (4.3.4). Repetir la operación con
todas las mezclas, dejando transcurrir 30 segundos entre cada transferencia.
Calentar en un baño María en ebullición durante 10 minutos exactos, respetando los 30
segundos de diferencia entre muestra y muestra.
Enfriar los matraces durante 5 minutos en hielo e introducirlos en un baño María a 20 °C.
Añadir agua destilada (4.2.8) por debajo de la línea de enrase.
Enrasar una vez transcurridos 10 minutos a 20 °C. Con un espectrofotómetro, medir la
absorbancia de las disoluciones à 515 nm de longitud de onda respecto al blanco (que contiene
sólo reactivo).
La diferencia de absorbancia entre el blanco de las enzimas y el valor obtenido tras la reacción
debe estar entre 0,1 y 0,6 unidades.
Si los valores quedan por encima del intervalo de la curva de calibrado, repetir el experimento
realizando diluciones que se adapten a las enzimas.
Para cada muestra, proporcionar la medida del blanco de la enzima y los dos valores obtenidos
al medir por duplicado la absorbancia tras la reacción. Estos dos valores han de ser cercanos.
6. Cálculos
Para calcular la actividad se utiliza la media. La actividad enzimática de una preparación
enzimática se calcula con la fórmula siguiente:
Actividad β-Glu-U por gramo o mililitro = (G × 200)/(15 × E) × 1/Gf
Nkat/g o ml = (Activité β-Glu-Unité/g o ml) X (1000/60)
G es la cantidad de azúcares reductores liberados, es decir, la media de los azúcares
reductores liberados (que se calcula a partir de los dos valores de absorbancia obtenidos tras
la reacción) menos el blanco (expresado en microgramos de glucosa a partir de la curva de
calibrado).
E es la cantidad (en gramos o mililitros) de enzima diluida en 100 ml
200 corresponde al factor de dilución
15 corresponde al tiempo de reacción
Gf es el factor de glucano ( a calcular)
Ejemplo:
Enzima
Enzima estándar
β-glucanasa
de
Penicillium
funiculosum
Valor
medido
1
2
0,621 0,618
0,417
0,416
Blanco
(enzima)
E
Glucosa
(µg)
0,415
0,503
662
β-Glu-U por
gramo
o
miligramo
10325
0,023
1
1249
9799
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Cálculo del Gf :
1 realizar la medición con el primer sustrato y la enzima estándar (Valor 1)
2 realizar la medición con el nuevo sustrato y la enzima estándar (Valor 2)
Cálculo : Valor 1 / Valor 2
7. Bibliografía
Bertrand A. Determination de l'activite β-glucanase de Botrytis des preparations enzymatiques
OIV FV 1263
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