complejo Mtb

TUBERCULOSIS
BOVINA.
EL AGENTE
Elías F. Rodríguez Ferri
Universidad de León
Antecedentes
• La TB ‘la reina de las
enfermedades’ y ‘la
enfermedad de los reyes’.
• Datos desde el neolítico
(4.000 AC): una TB espinal en
un esqueleto. También en
Egipto (en momias, 3.7001.000 AC)
• Los griegos la llamaron Tisis.
Después ‘consunción,
struma y scrófula’
• La ‘peste blanca’, referente
de la época romántica.
Alejandro Dumas: ‘La Dama
de las Camelias’
Víctimas de la TB en la Historia de la Enfermedad
•
•
•
•
•
L. Pasteur planteó la posible
implicación de un agente
infeccioso
J.A. Villemin (1868) demostró
experimentalmente la
transmisión inoculando pus de
un nódulo tuberculoso a un
conejo
R. Koch (18431910)(24/3/1882) a la Sociedad
de Fisiología de Berlín: ‘había
observado y aislado el
microorganismo que causaba
la TB en el hombre y en el
ganado bovino’
Lehmann y Neumann (1896):
Mycobacterium
Smith (1896): bacilo bovino →
M. tuberculosis tipo humano y
tipo bovino
El laboratorio
de Koch
en Wollenstein,
en 1872
Caracteres generales de las
micobacterias
• Bacilos delgados, rectos o
ligeramente curvados, a
veces ramificados, solos o
en pequeños grupos, G+,
(aunque se tiñen muy mal)
• Ácido-AlcoholResistentes, tiñen bien por
Ziehl-Neelsen: rojo sobre
fondo azul
• Técnicas fluorescentes:
Auramina o Auramina +
Rodamina B
AAR: formación de complejos con el ác. micólico
• Inmóviles, no esporulados, ni
capsulados, carecen de
fimbrias, no forman conidias
• Aerobios
• Patógenos y saprofitos
• C-G 62-72%
• Más de 50 especies. Los
agentes de la TB, lepra y
paratuberculosis
• Especie tipo: Mycobacterium
tuberculosis
• Micobacterias atípicas,
tuberculoides,
ocasionalmente pueden
causar enfermedad
CLASIFICACIÓN DE LAS
MICOBACTERIAS
*
* M. bovis subsp. caprae
(crecimiento lento y no cromógenas)
*
(MNT ó MOTT)
*M. avium, M. avium subsp. paratuberculosis, M. intracellulare, M. ulcerans
(crecimiento lento y no cromógenas)
• Pared celular fina (20 nm)
• La estructura de la pared celular
es inusual. Incluye 4 tipos de
polímeros:
–
–
–
–
Peptidoglicano
Arabinogalactano
Ácidos micólicos
Lipoarabinomanano
• Además se incluyen
lípidos de superficie
(micósidos, sulfolípidos,
etc.)
Estructuras
• Peptidoglicano:
– Similar al de otras bacterias
(cadenas de polisacáridos NAM + NAG- cruzadas con
cortos puentes peptídicos)
– Unido al arabinogalactano
por un único puente
diglicosil-fosforil que
contiene ramnosa y nacetilglucosamina.
Puente de unión al arabinogalactano:
diglicosil-fosforil con ramnosa y Nacetilglucosamina
: peptidoglicano
• Arabinogalactano:
– Construido a partir de un núcleo de
galactosa con ramificaciones de
arabinosa, ambas en forma furanosa
(anillos de 5 átomos)
– Las micobacterias son las únicas
contienen tanto galactofuranosa
como arabinofuranosa en la pared
– La galactofuranosa es muy rara en la
naturaleza (→ escaso conocimiento
de las rutas biosintéticas)
Puente de unión al peptidoglicano:
diglicosil-fosforil con ramnosa y Nacetilglucosamina
• Ácidos micólicos
– El componente principal de la
envoltura (hasta 60% del peso
seco de la pared)
– Hidrofóbicos, forman la cubierta
lipídica
– β-hidroxiácidos ramificados. En
posición α una cadena alifática
de 60-590 át C con interés
taxonómico.
– Uniones covalentes tipo éster a
una arabinosa al final del
arabinogalactano ramificado
– Factor de virulencia.
• Probablemente previenen del
ataque por proteínas catiónicas,
lisozima y radicales de oxígeno en
la vesícula fagocítica
• Inhiben la absorción de nutrientes
• Causan agregación bacteriana
• Contribuyen al crecimiento lento
LAM
• Lipoarabinomanano
(LAM)
– Un glicolípido al final de
la envoltura aunque está
anclado profundamente en
el peptidoglicano
– Estructura compleja
– Un núcleo de manosas
unidas a múltiples cadenas
laterales ramificadas de
arabinofuranosil-manosa
y una unidad de
fosfatidilinositol que
puede ser utilizada como
un puente de unión a otros
elementos de la envoltura
Otros Lípidos
de superficie
•
Micósidos:
–
–
•
•
•
Cera D: Ácido micólico + arabinogalactano y éste a 4
NAG/NAM, a los que se unen 2 cadenas de
tetrapéptidos. Una falsa cera. Propiedades adyuvantes
(adyuvante completo de Freund)
Factor Cordón: 6,6,dimicolil-trealosa (2 ácidos
micólicos unidos a trealosa). Asociado a la virulencia
(es leucotóxico: inhibe la succinato DH, provoca el
hinchamiento de las mitocondrias y separa los
ribosomas del RER).
Fosfolípidos: cardiolipina, fosfatidiletanolamina
y fosfatidilinositol manósidos. Implicados en la
formación de granulomas
Sulfolípidos: glicolípidos sulfatados (ácidos grasos
+ trealosa); ej., sulfolípido I. Asociados a la
virulencia (actúan como fagolisosomas)
SOD (superóxido dismutasa): neutraliza la
capacidad oxidante de los iones superóxido
Otros caracteres
•
•
•
•
•
Citoplasma con cuerpos
granulares
Mesosomas en membrana,
ocasionalmente muy largos y
estructura laminar
Fisión binaria
Ciclo de vida complejo,
incluye fragmentación y
formas cocoides; alargamiento
y bacilos
Formas defectivas sin pared
mediante lisozima, micobacteriofagos y cicloserina
El genoma
• El complejo Mtb posee un G+C del
65% y el genoma tiene un tamaño de
2,5-2,8 x 10/9 D
• Entre todas las especies existe alta
homología DNA-DNA
• Algunas secuencias se utilizan como
diana para su identificación previa
amplificación:
– Específicas del complejo Mtb: gen del
Ag MPB70, MPB64, del 38 kDa,
secuencias IS6110, 986 ó 987, 1081,
regiones espaciadoras (mtp40).
– Específicas del género Mycobacterium:
Ag 85 kDa, dnaJ, ARNr 16S.
• Las IS6110, 986 ó 987, son
virtualmente idénticas y han
sido ampliamente utilizadas
como marcador genético
para el estudio de Mtb,
debido a su variabilidad en
el número de copias y a su
capacidad para
desplazarse dentro del
genoma
• La mayoría de las cepas de
Mtb poseen de 6-20 copias
de este elemento
• Las cepas de M.bovis de bovino, BCG y
Mtb asiáticas solo llevan una copia de
IS6110 y por lo general en un mismo
lugar del genoma (en un locus de 1,9
kb), lo que limita su uso;
• Las cepas de cabras y de animales
salvajes y las de Mtb, llevan múltiples
copias → sugiere que varios
reservorios animales pueden tener
diferentes tipos de Mtb
• El complejo Mtb contiene, también, 5-6
copias de IS1081 y los diferentes
patrones dependen solamente del tamaño
de uno de los fragmentos
• Análisis mediante RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism)
necesita de al menos 3 enzimas y
electroforesis de elevada resolución
para apreciar las diferencias entre cepas
RFLP del DNA de Mb de 7 aislados
bovinos hibridados con la sonda
IS6110 (a). Gutierrez et al., 1995.
J. Clin. Microbiol. 33: 11, 2953-56
Otros elementos repetitivos
asociados con los polimorfismos
en el complejo Mtb
• MPTR (Major Polymorphic Tandem
Repeat), DR (Direct Repeat) y PGRS
(Polymorphic GC Rich Repeat).
• Estos elementos han sido utilizados como
sondas en Mtb y Mb
Polimorfismos en la región de repeticiones
directas (DR) o Espoligotipificación (Spacer
Oligonucleotide Typing)
•
Los DR son regiones de 36 pb separadas por
espaciadores de DNA de 35 a 41 pb.
• Son exclusivos del complejo Mtb
• Son polimórficos en tamaño y composición
• Los DRs más la secuencia espaciadora única
se denomina DVR (Direct Variable Repeat)
• Cuando se comparan regiones DR de varios
aislados se observa que el orden de los
espaciadores es aproximadamente el mismo,
pero se presentan recombinaciones
homólogas entre DRs próximos o distantes,
delecciones, duplicaciones e inserciones
asociadas a la transposición de la IS6110 que
se relacionan con la evolución
Delecciones genómicas (DRs y N-DR).
Pérdida de regiones genómicas en aislados
del complejo M. tuberculosis
•
•
•
•
El polimorfismo en varios aislados comprende
la ausencia o presencia de uno o más DVRs
Permite la tipificación: Espoligotipificación
(Spacer Oligonucleotide Typing): Kamerbeek
et al. 1997. J. Clin. Microbiol. 35:907-914
Detecta la presencia o ausencia de espaciadores de secuencia conocida en un aislado
El método: análisis de secuencias de
amplificación generadas por PCR en la región
DR.
– El primer contrasentido está marcado con
biotina: todas las cadenas sintetizadas están
marcadas
– Mediante hibridación del producto PCR
marcado con una membrana a la que se han
unido los 37 oligos derivados de los
espaciadores en Mtb y los 6 de Mb BCG, se
detectan los espaciadores individuales
•
Se puede calcular las relaciones filogenéticas
entre las cepas y puede aplicarse directamente
Dendograma
a muestras clínicas
que muestra las interrelaciones entre 41 espoligotipos identificados a partir de 224 aislados de Mb en Sudamérica y los 4 espoligotipos encontrados simultáneamente entre
aislados de Sudamérica y España
Zumárraga et al., 1999. J. Clin. Microbiol. 37 (2): 296-303
Dendograma que muestra las interrelaciones de 24 espoligotipos representativos identificados a
partir de 182 aislados de Mb procedentes de bovinos, ciervos, jabalíes, gatos y ovejas. Spb y spc
son los dos clusters identificados en los principales aislados de bovino y caprino
Aranaz et al., 1996. J.Clin. Microbiol.,34(11):2734-2740
Las micobacterias comparten la mayoría de los antígenos
ANTÍGENOS EN LAS
MICOBACTERIAS
BCG
Antígenos
Específicos
de TB
Micobacterias
Atípicas
Antígenos
Antígenos del complejo Mtb
•
•
•
•
Grupo I: comunes al género e incluso a
Nocardia y Corynebacterium (incluyen
proteínas, glicolípidos y polisacáridos de
la pared)
Grupo II: comunes a las especies de
crecimiento lento; inducen ri de base
celular y están presentes en los PPD
(reacciones cruzadas entre Ma y Mb)
Grupo III: comunes a todas las de
crecimiento rápido
Grupo IV: especie-específicos, por lo
general proteínas. Contribuyen a la
hipersensibilidad (daño tisular)
Ag 71 kDa (proteína de la familia hsp70)
Ag 65 kDa (inmunodominante)
Ag 60 kDa (en las PPD)
Ag 39 kDa ó Ag 5 (GP específico Mtb y Mb)
Ag 38 kDa o Ag b ó Ag Pab (lipoproteína, específica Mtb y Mb)
Ag 32 kDa, P32 ó Ag 85 A (estimulador de la ri de base celular)
Ag 30 kDa, MPB 59, Ag 85B,..
Ag 85 C (unión a fibronectina)
Ag 29,8 kDa (solo en Mb)
Ag 24 kDa o MPB 64
Ag22 kDa o MPB70, MPB80 ó P2
Ag 19 kDa
Ag 14 kDa
Ag 12 kDa
Cultivo. Procesado de muestras
• Complejo M. tuberculosis:
crecimiento lento (> 3 semanas)
• Transporte en una solución de
borato sódico (a tª ambiente
conserva y puede utilizarse para el
almacenamiento):
– a 23ºC se ha recuperado despues de
17 semanas
– a 4ºC después de 25 semanas
• Necesaria descontaminación de
las muestras clínicas (evitar
bacterias y hongos de crecimiento
rápido)
• Conveniencia de concentración
Heces, orina, esputos, jugo gástrico, escobillones y gasas, material de necropsia, etc
Descontaminación:
-NaOH 4% (15-30’ en
agitación, a 37ºC). Neutralización (sulfúrico o ClH)
-Cloruro de hexadecilpiridinio
(10ml a 10ml de homogeneizado) 30 ‘ en agitación
y 30’ a 4.000 rpm. Siembra
del pellet con hisopo
-preliminar con hipoclorito al
1:1000, 4-6h; principal con
NaOH al 2-4%, 10-30’ y neutralizar con ClH 2N. Centrifugar para concentrar y sembrar del pellet
Medios de cultivo
• Condiciones de
crecimiento:
– Aerobios
estrictos (algunas
cepas
microaerófilas:
identificación)
– 28-37ºC
– pH: 6-6,5
– Tiempo: 30-60 d
Crecimiento lento: tiempo de
replicación: 20 horas
pellet
Lowenstein (1930) y Jensen (1955):
huevo completo, asparragina, glicerol y sales minerales. M. bovis
Stonebrink (1957): piruvato sustituye a
glicerol. M. bovis. B-83 tiene menos
verde malaquita. Recupera más y más
rápido
Coletsos: asparragina, piruvato,
Glutamato Na, glicerol, verde de
Malaquita y huevo. M. bovis
Herrold (1931): glicerol, peptona y yema
De huevo. M. paratuberculosis
Coletsos
Colonias en Lowenstein-Jensen
Cultivos líquidos
• Precisan incorporar un
detergente (ej.Tween 80) para
neutralizar la naturaleza
hidrofóbica de los lípidos de
superficie. En caso contrario se
produce agregación y flotación:
forman una película semejante a
la que forman los hongos (Myco).
• En medios líquidos M.
tuberculosis y M. bovis virulentas
forman cordones al microscopio
Identificación tradicional
•
Velocidad de crecimiento,
producción de pigmentos,
morfología de las colonias y
pruebas bioquímicas:
– producción de niacina,
reducción de los nitratos,
hidrólisis del Tween 80,
crecimiento en presencia de
hidracida del ácido 2
tiofenocarboxílico (TCH),
relaciones con el oxígeno,
susceptibilidad a la
pirazinamida, actividad
arilsulfatasa y ureasa
•
Especie
M. tuberculosis
M. africanum
Biovar
TCH
N03
O2
PZA
Humana clásica
Humana asiática
R
S
+
+
Aer
Aer
S
S
I
II
S
S
+
Mic
Mic
S
S
Clásica
BCG
S
S
-
Mic
Aer
R
R
Inconvenientes:
– lentitud (puede hasta 3 m),
– precisa de suficiente
crecimiento
– precisa de reactivos
peligrosos (bromuro de
cianógeno, para la niacina)
M. bovis
Alternativas RÁPIDAS al cultivo
e identificación
• Aislamiento
– Bactec 460: método
radiométrico (15 d)
– Bactec 9000:
método fluorimetrico
(15,6 d)
– Septi-Check: medio
bifásico (23 d)
• Identificación:
– HPLC: cultivo + horas
– BACTEC-NAP: 3.5 d
– Biología Molecular:
• Sondas marcadas:
sondas Accuprobe
(cultivo + 1h)
• PCR: múltiples
sistemas en función
de la secuencia diana
y primers utilizados
Caracteres de interés
epidemiológico
•
Muy sensible al Calor:
– 70ºC 5’ en leche (una referencia)
•
Resistente a los ácidos, álcalis y muchos
desinfectantes químicos (utilidad en la
descontaminación de muestras)
– Puede eliminarse mediante una solución débil de lejía en
agua (1:9)
– Fenol al 2% o formol al 3% 3 h son muy eficaces.
– Fenol al 5% muy eficaz con/sin materia orgánica
– Glutaraldehido al 2%, muy eficaz
– Etanol al 80% (10 ‘ o menos): desinfección de piel y
materiales de uso clínico. Con materia orgánica se reduce
– Acetona y tintura de yodo: rápidamente
– Oxido de etileno: moderadamente eficaz
– Derivados de amonio cuaternario, clorhexidina y
yodóforos: relativa o totalmente ineficaces
– Yoduros de amonio cuaternario: muy eficaces
•
M. tuberculosis y M. bovis no se
multiplican en el medio ambiente pero
sobreviven varios meses en el suelo o
estiércol bovino
– Resistentes a la desecación. Si se protegen
de la luz solar sobreviven semanas o
meses
– Se destruyen rápido por la luz solar o
radiaciones UV (4-10 veces más sensibles
que E.coli)
– Duffield et al (1985) en suelos inoculados:
M. bovis sobrevivió 4 s en suelos húmedos
y heces, 80% de sombra y oscuridad
– En UK se ha demostrado la prevalencia en
el ambiente de muchas explotaciones
endémicas de TB (PCR y RT-PCR)
(Courtenay et al., 2005)
– M. bovis BCG permanece viable en suelo
más de 15 meses. Niveles significativos de
DNA y RNA (PCR y RT-PCR) permanecen
en el campo, lo que indica la presencia de
células viables como un reservorio
ambiental de la infección, que posee
riesgo para el ganado (Young et al., 2005)
*Mtb y Mb poseen 190
proteínas reguladoras de
rutas metabólicas la
mayoría de las cuales están
conservadas en ambas
especies, mientras que Map
posee 235
*Map sobrevive más
tiempo que el resto fuera
del hospe- dador como
consecuencia de la
posibilidad de expansionar
su amplio repertorio de
genes reguladores
(Whittington et al., 2004, 2005).
• Reservorios silvestres (OIE):
– En UK e Irlanda, el tejón, corzo,
gamo y ciervo
– En España: gamos, ciervos, jabalíes y
lince
– En USA: venados de cola blanca,
coyote, zorro rojo, mapache, oso negro
y lince rojo
– En Canadá: bisonte y ciervo
– En Uganda: búfalos
– En Sudáfrica: kudúes, zambos, leones,
leopardos y onzas
– En Zambia: lichís rojos
– En Hawai: suidos salvajes
Factores de virulencia de Mtb
•
•
•
El trabajo con Mtb es difícil en los
estudios de virulencia: lento
crecimiento y escaso
conocimiento de su genética
En los últimos años gran avance:
secuenciado el genoma de Mtb (2
cepas), Mb, Ml y Map (Reddy Marri
et al., 2006), así como
parcialmente el de otras 14
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lpr
oks.cgi)
La clave de su conocimiento está
en la entrada y supervivencia
dentro de los macrófagos
CR3
?
Mtb
– En relación con la entrada: sobre
la superficie de los macrófagos se
sitúan los receptores CR3 y CR4
que unen Mtb
– No se conoce nada de los
ligandos de Mtb
CR4
Macrófago
Factores de virulencia
-Componentes de la pared celular: Ag85 (fbpA,B,C1 y C2:
transferencia de micolatos, unión a fibronectina),LAM, mmpL
(prot. transmembrana:1-13)
-Factores de internalización: operones mce (1,2,3,y 4: entrada en células de mamífero): diferencias de expresión
-Factores de supervivencia: lipF, plcABC, hierro
-Factores de persistencia: icl, lueD (auxotrofos)
-Factores de resistencia al hospedador: narG, katG, sodC
-Activadores transcripcionales: sigAF (resistencia drogas),
mprAB
En conjunto, estos compuestos
previenen la destrucción por
lisosomas o macrófagos
•
Factores de virulencia (Mtb)
– Factor Cordon: – glicolípido (trealosa
6’,6’ dimicolato) que es responsable
del crecimiento serpenteante (en
forma de cordón o filamento) de Mtb
en el que los bacilos crecen en forma
cerrada y ordenada
• Es tóxico para los leucocitos,
antiquimotáctico, interfiere con la
función mitocondrial en los ratones
y juega un papel importante en el
desarrollo de las lesiones
granulomatosas
– Capacidad de adquisición de
hierro: requerido para la supervivencia en el interior de los fagocitos
– Sulfolípidos: previenen la fusión
fagosoma-lisosoma y hacen que los
bacilos no estén expuestos a las
enzimas lisosómicas (importante en
la supervivencia intracelular)
Mycobacterias
• Dos factores adicionales
se responsabilizan de la
persistencia en los
macrófagos (Flynn y Chan,
2003):
– 1) prevención del
IL-6, IL-10,
reconocimiento de los
macrófagos infectados por
TGF-β
las células T CD4+ por
inhibición del procesado y
presentación a cargo del
MHC II: debido a la
producción de IL-6 por los
macrófagos infectados
– 2) evadiendo la acción del
NO y de los intermediarios
nitrogenados reactivos
(RNIs): debido a la
producción de IL-10 y TGF-β
por los macrófagos
infectados
Secuencia de la infección con Mycobacterium bovis
Los bacilos son inhalados como gotitas.
En los pulmones son fagocitados por los macrófagos alveolares
e inducen una respuesta proinflamatoria localizada que conduce
al reclutamiento de mononucleares desde los vasos próximos
Estas células construyen un granuloma o tubérculo formado por un centro
de macrófagos infectados rodeado de células gigantes y más macrófagos
con una cubierta de linfocitos (fase de contención).
Rotura de la fase de contención y liberación de
bacilos viables: fase de contagio