Proteoma

Proteómica
¿Qué es la Información Biológica?
Genoma -> Transcriptoma ->Proteoma
¿Qué es la Información Biológica?
Tres niveles básicos de información biológica:
Genoma: la información genética común a todas las
células del organismo.
Transcriptoma: la parte del genoma que se expresa en
una celúla en una etapa específica de su desarrollo.
Proteoma: las proteínas que interactuan para dar a la
célula su carácter individual.
Del GENOMA estático, único
al PROTEOMA dinámico, múltiple.
Desarrollo de la proteómica
Factores decisivos que condicionan la aparición de la
proteómica:
1. La secuenciación de genomas a gran escala y el
desarrollo de bases de datos de proteínas.
2. El desarrollo de técnicas de espectrometría de
masas (MS) para analizar proteínas y péptidos.
3. Los avances realizados para la separación de
proteínas mediante electroforesis bidimensional
(2D-PAGE) con la introducción de los gradientes de pH
inmovilizados (IPGs).
Desarrollo de la proteómica
• La proteómica requiere la implicación de diversas
disciplinas como:
• Biología molecular
• Bioquímica
• Microbiología
• Bioinformática
• La Bioinformática es de gran importancia ya que se
necesitan ordenadores de gran capacidad para
organizar la gran cantidad de información generada
en estas investigaciones.
Proteoma
El proteoma es el conjunto de proteínas
codificadas por un genoma, una célula o
un tejido.
Sin embargo, se desconoce la función
biológica de la mayoría de las proteínas
codificadas por los genomas.
El siguiente paso en la era post-genómica
debe ser el estudio funcional de estos genes.
La proteómica puede ayudar a establecer
una conexión entre las secuencias biológicas
y su comportamiento biológico.
La proteómica es el estudio a gran escala de
los productos génicos de un genoma, célula
o tejido mediante métodos bioquímicos, con
el fin de obtener una visión global e integrada
de los procesos celulares.
El proteoma es dinámico
• El proteoma de una célula es reflejo del medio
ambiente en que es estudiado.
• Como respuesta a estímulos externos e internos, las
proteínas pueden ser modificadas, translocadas,
sintetizadas o degradadas.
Proteómica – Áreas de estudio
Proteómica - Objetivo
• El principal objetivo de la proteómica no es sólo
identificar todas las proteínas en una célula, sino
también crear un mapa tridimensional completo de la
célula indicando la localización de las proteínas.
• Obtener el proteoma de una célula es como tomar
una fotografía de todas las proteínas en momento
determinado.
• Considerando todas las posibilidades un genoma
podría dar lugar a un número infinito de proteomas.
Proteómica - Objetivo
• Las proteínas, no los genes, son los responsables de
los fenotipos de las células.
• Es imposible determinar los mecanismos de
enfermedades, envejecimiento y los efectos del
ambiente únicamente estudiando el genoma.
• Sólo mediante el estudio de las proteínas se pueden
caracterizar las modificaciones proteicas e identificar
dianas de fármacos.
Proteómica – Tipos de estudios
• Proteómica de expresión: estudio cuantitativo de la
expresión de proteínas entre muestras que difieren en
alguna variable.
• Proteómica estructural o del mapa celular: estudio de
la localización subcelular de las proteínas y
caracterización de las interacciones proteína-proteína.
• Proteómica funcional: estudio y caracterización de un
grupo de proteínas determinado mediante diversas
aproximaciones proteómicas.
Proteómica de expresión
• El análisis del mRNA no es un reflejo directo del
contenido proteico de una célula.
• Comparación de la expresión del proteoma total o de
subproteomas entre diferentes muestras.
• La información obtenida puede permitir la
identificación de:
• Nuevas proteínas implicadas en transducción
de señales
• Proteínas específicas de una enfermedad
Proteómica estructural
• Se basa en aislamiento de orgánulos subcelulares o
complejos proteícos mediante purificación.
• Posteriormente se identifica sus componentes
mediante espectrometría de masas.
• La información obtenida puede permitir reconstruir la
architectura celular de las células (mapas de
interacción) y explicar como la expresión de ciertas
proteínas proporciona a una célula sus características
únicas.
Proteómica funcional
• En algunos casos, se aislan subproteomas específicos
mediante cromatografia de afinidad.
• Esto puede incluir el aislamiento de complejos proteicos o
el uso de ligandos proteicos para aislar tipos específicos
de proteínas para su posterior estudio y caracterización.
• Puede proporcionar información importante sobre:
• Señalización
• Mecanismos de la enfermedad
• Interacciones proteína-fármaco
Tecnología proteómica
Tecnología proteómica
• El desarrollo de la proteómica se debe en parte a los
avances importantes realizados en la tecnología de
proteínas.
• Sin embargo, la metodología disponible tiene sus
limitaciones y actualmente todavía no es posible
realizar muchos tipos de proteómica.
• Es necesario mejorar algunas de estas limitaciones y
desarrollar nuevas tecnologías para conseguir el
máximo partido.
Separación de proteínas
Separación de proteínas
• La tecnología más utilizada para la separación y
aislamiento de proteínas es la electroforesis en geles
de poliacrilamida (PAGE).
• Introducida en 1970, es la técnica más eficaz para
resolver mezclas complejas de proteínas.
• Dos tipos de electroforesis en geles de poliacrilamida:
• Monodimensional (SDS-PAGE)
• Bidimensional (2D-PAGE)
Separación de proteínas – SDS-PAGE
• Para muchas aplicaciones proteómicas, la SDS-PAGE
es el método de elección para resolver mezclas de
proteínas.
• Las proteínas se separan de acuerdo a su masa y
como las proteínas son solubilizadas en dodecil sulfato
sódico (SDS), no suele haber problemas de
solubilización.
• Es una técnica sencilla, reproducible y permite la
separación de proteínas de 10-300 kDa.
Separación de proteínas – SDS-PAGE
• Una de las aplicaciones más comunes de la SDSPAGE es la caracterización de proteínas después de
algún tipo de purificación previa.
Separación de proteínas – 2D-PAGE
• Constituye actualmente el método más eficiente para la
separación de mezclas muy complejas de proteínas:
permite separar miles de proteínas en un único
experimento.
• Está basada en una separación de las proteínas en
función de la carga neta, seguida de una separación de
las proteínas en función de su masa molecular.
• La alta resolución de la técnica se debe a que las dos
separaciones se basan en parámetros diferentes.
Separación de proteínas – 2D-PAGE
• La separación de la primera dimensión se realiza
mediante isoelectroenfoque.
• En el isoelectroenfoque las proteínas son separadas en
un gradiente de pH hasta alcanzar una posición en la
que su carga es 0 (punto isoeléctrico).
• En la segunda dimensión, las proteínas son separadas
mediante SDS-PAGE.
• Permite separar las 4.000-5.000 proteínas de una
célula.
Campo eléctrico
5
5.5 5
6
7.5
5.5
8 76
8
5.5
7.5
7.5 7
5.5
5
5
5.5
6
7
7
6
7.5
7.5
7.5
8
8
5.5
5
pH
8
5.5
5
5
5.5
6
6
7
7.5
7.5
7.5
7
8
8
5.5
+
Campo eléctrico
5.5
7.5
6
MW
5.5
7.5
5
-
5
5.5
7
6
7
8
7.5
8
Separación de proteínas – 2D-PAGE
Separación de proteínas – 2D-PAGE
• La innovación clave ha sido el desarrollo de geles con
un gradiente de pH inmovilizado (IPG, immobilized pH
gradient).
• En los geles IPG, el gradiente de pH es generado por
las inmovilinas, y está co-polimerizado con la matriz de
acrilamida.
• Eliminación de los problemas de inestabilidad del
gradiente de pH y la baja capacidad de carga asociada
a los gradientes de pH preparados con anfolitos carrier.
Separación de proteínas – 2D-PAGE
• Los geles IPG permiten:
• Mejorar la resolución
• Mejorar la capacidad
• Aumentar la cantidad de proteínas cargadas
• La reproducibilidad conseguida con los geles IPG
permite la comparación de mapas proteicos entre
distintos laboratorios.
• Facilita el intercambio de información.
Separación de proteínas – Detección
• Técnicas tradicionales de detección de proteínas:
• Marcaje radioactivo
• Tinción con Azul de Coomassie
• Tinción con plata (mayor sensibilidad)
• Nuevas técnicas:
• Tinción de plata superficial
• Tinciones y marcajes fluorescentes
(Sypro-Ruby, Cy3, Cy5...)
• Las nuevas técnicas permiten el análisis posterior de
las muestras mediante espectrometría de masas.
Separación de proteínas – Aplicaciones 2D-PAGE
• La aplicación principal es la proteómica de expresión.
• La expresión de proteínas de dos muestras se puede
comparar de forma cualitativa y cuantitativa.
• La aparición o desaparición de manchas proporciona
información sobre la expresión diferencial de proteínas.
• La intensidad de las manchas permite conocer los
niveles de expresión.
Separación de proteínas – Aplicaciones 2D-PAGE
• Para realizar estos estudios de proteómica de
expresión se pueden utilizar:
• Organismos completos
• Líneas celulares
• Fluidos biológicos
• Comparación de tejidos normales con tejidos enfermos
(cancer, enfermedades cardiacas).
• Comparación de células tratadas con fármacos o
diferentes estímulos.
Separación de proteínas – Aplicaciones 2D-PAGE
Virus de la leucemia murina de Abelson (AMuLV)
Separación de proteínas – Aplicaciones 2D-PAGE
Secretoma de Pseudomonas syringae
Separación de proteínas – Aplicaciones 2D-PAGE
• Otra aplicación importante es la realización de mapas
de proteínas (proteómica del mapa celular) en:
• Microorganismos
• Orgánulos celulares
• Complejos de proteínas
• También se puede utilizar para caracterizar proteínas
en subproteomas, obtenidos mediante alguna forma de
purificación del proteoma.
Separación de proteínas – Limitaciones 2D-PAGE
• Técnica muy laboriosa: requiere mucho tiempo (2 días)
y es difícil de automatizar.
• Análisis de una única muestra por gel 2D-PAGE.
• Limitada por el número y tipo de proteínas a resolver:
• Proteínas muy grandes o hidrofóbicas no entran
en el gel durante la primera dimensión.
• Proteínas muy ácidas (pIs < pH3) o muy básicas
(pIs> pH 10) no se resuelven muy bien.
• Limitada detección de proteínas poco abundantes.
Espectrometría de masas
Espectrometría de masas
• La espectrometría de masas (MS, mass spectrometry)
es una técnica clave para la identificación y
caracterización de proteínas en proyectos proteómicos.
• Otros procedimientos para la identificación y
caracterización de proteínas:
• Secuenciación del extremo N-terminal
• Detección con anticuerpos específicos
• Co-migración con proteínas conocidas
• Sobre-expresión y delección de genes
Espectrometría de masas
• Estos métodos son generalmente lentos, laboriosos o
caros. Por tanto, no resultan apropiados para su
utilización a gran escala.
• La MS se ha convertido en el método de elección para
la identificación de proteínas a gran escala debido a su
rapidez y elevada sensibilidad.
• La identificación de proteínas a gran escala es el
primer paso en el estudio del proteoma de distintos
organismos.
Espectrometría de masas
• Método analítico de alta procesividad para medir el
peso molecular (MW) de muestras proteicas mediante
medida de las masas de sus iones.
• Sólo requiere concentraciones picomolares.
• Precisión del 0.01% del MW total de la muestra:
• para una proteína de 40 kDa,
hay un error de 4 Da.
• Alta capacidad de procesamiento: 100 spots/día.
Espectrometría de masas
• La MS también permite la caracterización de
sustituciones de aminoácidos y modificaciones posttraduccionales (glicosilación y fosforilación).
• El análisis de proteínas mediante MS ha sido posible
gracias al desarrollo de métodos de ionización suave,
que permiten la formación de moléculas proteicas con
carga eléctrica (iones).
• Los métodos de ionización suave permiten convertir
biomoléculas grandes, polares y no volátiles en iones
en fase gaseosa.
Espectrometría de masas
• La MS permite la obtención de información estructural de
las proteínas (masas y secuencias de aminoácidos).
• Esta información se puede utilizar para identificar las
proteínas mediante busquedas en las bases de datos de
DNA y proteínas.
• La obtención de información de las proteínas mediante
MS se puede dividir en 3 etapas:
1. Preparación de la muestra.
2. Ionización de la muestra.
3. Análisis de masas de la muestra.
Espectrometría de masas
• La masa de una proteína no es suficiente para
identificarla.
• En el análisis MS, las proteínas deben ser convertidas
en péptidos, mediante proteolisis, con una proteasa
específica de secuencia, generalmente tripsina.
• Los componentes de un espectrómetro de masa son:
• Fuente de ionización
• Analizador(es) de masas
• Detector que mide la relación masa /carga (m/z)
de los iones en fase gaseosa
Espectrometría de masas
Espectrometría de masas
• Las muestras proteícas si están ionizadas se pueden
manipular facilmente en el espectrómetro de masas.
• La fuente de ionización, el analizador de masas y el
detector están en alto vacio para permitir el libre
movimiento de los iones.
• Separación en el analizador de masas y detección de
iones separados en base a la relación m/z.
• Formateo de las señales obtenidas y generación de un
espectro de masas.
Espectrometría de masas
Q1
+
Conversión a iones
en fase gaseosa
Fuente de iones
Detección de
los iones en
fase gaseosa
q2
Separación de los
iones por m/z
Analizador(es) de masas
3 componentes principales
Detector
TOF
Espectrometría de masas
Espectrometría de masas – Preparación muestra
• Introducción de la muestra en la fuente de ionización:
• Directa
• Mediante cromatografía:
• HPLC
• Electroforesis capilar
• Las muestras proteicas se cargan positivamente durante
la ionización.
Espectrometría de masas – Ionización muestra
• Conversión de los péptidos en iones en fase gaseosa
mediante técnicas de ionización suave.
• Tipos de fuente de ionización suave:
• Ionización/desorción con láser asistida con matriz
(MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)
para muestras en estado sólido.
• Ionización mediante electrospray (ESI, ElectroSpray
Ionization) para muestras en solución.
• Estas técnicas permiten la formación de iones sin una
perdida significativa de la integridad de la muestra.
Espectrometría de masas – Ionización muestra
• En el MALDI, la muestra sólida se mezcla con una matriz
de naturaleza orgánica sobre una placa metálica.
• La matriz está formada por moléculas que absorben una
pequeña cantidad de energía.
• Tipos de matrices:
• Ácido 2,5-dihidroxido benzoico
• Ácido ciano-4-hidroxicinámico
• Cocristalización de la muestra y la matriz al evaporarse el
solvente.
Espectrometría de masas – Ionización muestra
• Esta preparación se somete a pulsos cortos de láser en
alto vacío que provoca que la absorción de energía por
parte de la matriz sea convertida en energía de excitación
y en transferencia de protones (H+) a la muestra
(ionización).
• El área irradiada se calienta dando lugar a la desorción de
los iones de fase sólida a gaseosa.
• Los iones en fase gaseosa son acelerados a través de
vacio por un campo eléctrico hacia el detector.
Espectrometría de masas – Ionización muestra
Espectrometría de masas – Ionización muestra
Espectrometría de masas – Ionización muestra
• En el ESI o electronebulización, vaporización de la
muestra en solución al pasarla a través de un capilar al
que se aplica una alta diferencia de potencial.
• Formación de un aerosol de gotas cargadas que pasan a
una zona de potencial más bajo, y son desolvatadas,
adquiriendo protones las moléculas de la muestra y dando
lugar a iones con carga múltiple.
• Nanoelectrospray: introducción de microcapilares de
borosilicato recubiertos de oro para la inyección de la
muestra en el espectrómetro.
Espectrometría de masas – Ionización muestra
Espectrometría de masas – Ionización muestra
Espectrometría de masas – Análisis muestra
• Separación de los iones en fase gaseosa según su m/z en
alto vacio en un analizador de masas.
• Tipos de analizadores de masas:
• Analizador de tiempo de vuelo (TOF,Time Of Flight)
• Analizador triple cuadrupolo
• Trampa iónica
• Fragmentación opcional de los iones peptídicos
seleccionados mediante:
• Descomposición metaestable (PSD)
• Disociación inducida por colisión (CID)
Espectrometría de masas – Análisis muestra
• Distintas combinaciones de fuentes de ionización y de
analizadores de masas. Las más utilizadas:
• MALDI-TOF: Fuente de MALDI acoplada a un
analizador TOF.
• Ionización ESI combinada con un analizador triple
cuadrupolo, con una trampa iónica o con un híbrido
cuadrupolo tiempo de vuelo (Q-TOF).
• Reciente desarrollado de otras combinaciones:
• Fuentes de MALDI acopladas a un analizador Q-TOF
• Dos analizadores TOF en tándem (MALDI-TOF-TOF)
Espectrometría de masas – Análisis muestra
• El analizador TOF es el que más frecuentemente se
asocia con fuentes de ionización MALDI.
• Aceleración de los iones en un campo eléctrico a la salida
de la fuente de ionización.
• La determinación del valor m/z de cada ión en el
analizador TOF se realiza mediante una medida muy
precisa del tiempo de vuelo en una región de alto vacio
desde la aceleración de los iones en la fuente hasta que
impactan en el detector.
Espectrometría de masas – Análisis muestra
Espectrometría de masas – Análisis muestra
Espectrometría de masas – Análisis muestra
Espectrometría de masas – Análisis muestra
Espectrometría de masas – Análisis muestra
• Finalmente, medida de las masas en un detector de
iones obteniendo un espectro de masas que refleja la
abundancia de los iones frente a su valor m/z.
Espectrometría de masas – Análisis muestra
Espectrometría de masas
VENTAJAS
• Extremadamente sensible.
• Precisión de medida de las masas de un átomo.
• En principio, la detección de un peptido relativamente corto,
permite la identificación inequívoca de una proteína.
PROBLEMAS
• La proteólisis con proteasas de algunas proteínas es difícil.
• Algunos peptidos son difíciles de ionizar.
• Debido a la alta sensibilidad del método, es difícil evitar las
contaminaciones.
Espectrometría de masas – MALDI-TOF
• Se considera un pilar de la proteómica:
• Tecnología robusta
• Cara
• Posibilidades de automatización
• Tiempo de análisis de cada muestra muy corto: permite
realizar análisis a gran escala.
• La principal ventaja reside en la posibilidad de realizar
análisis a gran escala de organismos con genomas
completamente secuenciados.
Espectrometría de masas – MALDI-TOF
• La MS MALDI-TOF tiene limitaciones:
• La ionización de los péptidos es selectiva y no es
cuantitativa.
• Si la cantidad de proteína en el gel es pequeña, el
número de péptidos observado puede ser bajo.
• Poca utilidad para analizar mezclas de proteínas.
• Requiere información adicional:
• Si no se dispone de la secuencia completa del
genoma
• Si se tiene poca cantidad de proteína
Espectrometría de masas – Aplicaciones
• Para la identificación de proteínas mediante MS se han
desarrollado dos estrategias:
• 1. Identificación mediante huella peptídica (PMF,
Peptide Mass Fingerprinting) o mapeo peptídico:
utilizando un espectrómetro tipo MALDI-TOF.
• 2. Identificación mediante fragmentación de péptidos
obteniendo la secuencia total o parcial de aminoácidos
(secuencia peptídica o etiqueta de secuencia): utilizando
un espectrómetro de masas en tándem (MS/MS).
Espectrometría de masas – Huella peptídica
• Herramienta para la identificación a gran escala de
proteínas presentes en las bases de datos.
• La PMF de una determinada proteína es un conjunto de
péptidos generados mediante la digestión con una
proteasa específica.
• Normalmente digestión de la proteína con tripsina:
rotura específica por lisinas (K) y argininas (R), sino
están unidas por prolina.
Espectrometría de masas – Huella peptídica
Espectrometría de masas – Huella peptídica
• Espectro de masas obtenido en un MALDI-TOF de la
digestión de una proteína con tripsina
Espectrometría de masas – Huella peptídica
• Las masas peptídicas experimentales de una proteína
desconocida son comparadas con las masas peptídicas
teóricas de proteínas presentes en bases de datos.
• Diversos algoritmos disponibles en Internet para realizar
este análisis: PEPSEA, PROFOUND, MS-FIT....
• La identificación correcta de la proteína requiere que las
masas de un gran número de péptidos coincidan con las
masas teóricas de los péptidos y que cubran parte de la
secuencia de la proteína en la base de datos.
Espectrometría de masas – Huella peptídica
Espectrometría de masas – Huella peptídica
VENTAJAS
• Rapidez en el análisis.
• Análisis y busqueda en la base de datos pueden
automatizarse completamente.
•
•
•
•
PROBLEMAS
La secuencia proteíca tiene que estar en la base de datos.
Escasa eficacia en grandes bases de datos de DNA sin
anotar o sin traducir (como el genoma humano).
No funciona bien con mezclas de proteínas.
Sensible a las modificaciones post-traduccionales.
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
• Los espectrómetros de masas en tándem (MS/MS)
permiten la determinación de la secuencia de aminoácidos.
• Fragmentación de un péptido específico en péptidos más
pequeños que pueden utilizarse para deducir la secuencia
proteica.
• Estrategia utilizada para la identificación de:
• Proteínas sin anotar en las bases de datos.
• Ambiguedades en MS MALDI-TOF.
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
• La triple cuadrupolo es la MS/MS más utilizada para
obtener secuencias proteícas.
• En el primer espectrofotómetro (MS1-modo MS), todos los
iones en un rango m/z se transmiten por Q1 y Q2 para el
análisis de masas en Q3: Selección de un ión de interés.
• En el segundo espectrofotómetro (MS2-modo MS/MS):
• Q1 separa el ión de interés.
• Q2 fragmenta el ión de interes en una cámara de
colisión CID con un gas inerte (nitrógeno o argon).
• Q3 mide la m/z de los productos de disociación.
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
• El ión de interés interacciona con el gas de colisión y
tiene lugar la fragmentación del esqueleto peptídico.
• Debido a que la ruptura del enlace peptídico puede
ocurrir en múltiples sitios se ha creado una nomenclatura
para indicar los tipos de iones generados:
• ión b, el ión mantiene el extremo N del péptido.
• ión y, el ión mantiene el extremo C del péptido.
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
• Los espectros de fragmentación MS/MS proporcionan
información de las diferencias de masas entre dos iones
consecutivos del mismo tipo (iones de la serie y o b).
• Las diferencias entre dos iones consecutivos del mismo
tipo (y o b) corresponderían a la perdida de un residuo
de aminoácido en el péptido.
• Estos espectros proporcionan información sobre la
identidad y posición del aminoácido en el péptido,
permitiendo determinar la secuencia de aminoácidos.
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
Amino Acid
3 Letter Code
Single Letter Code
Residue Mass
Monoisotopic
Average
Glycine
Gly
G
57.02147
57.052
Alanine
Ala
A
71.03712
71.079
Serine
Ser
S
87.03203
87.078
Proline
Pro
P
97.05277
97.117
Valine
Val
V
99.06842
99.133
Threonine
Thr
T
101.04768
101.105
Cysteine
Cys
C
103.00919
103.144
Isoleucine
Ile
I
113.08407
113.160
Leucine
Leu
L
113.08407
113.160
Asparagine
Asn
N
114.04293
114.104
Aspartic Acid
Asp
D
115.02695
115.089
Glutamine
Gln
Q
128.05858
128.131
Lysine
Lys
K
128.09497
128.174
Glutamic Acid
Glu
E
129.04260
129.116
Methionine
Met
M
131.04049
131.198
Histidine
His
H
137.05891
137.142
Phenylalanine
Phe
F
147.06842
147.177
Arginine
Arg
R
156.10112
156.188
Tyrosine
Tyr
Y
163.06333
163.170
Tryptophan
Try
W
186.07932
186.213
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
• Si la fragmentación es de buena calidad, se puede
obtener la secuencia completa del péptido. Otras veces
sólo se obtiene una secuenciación parcial del péptido.
• La información sobre la secuencia de aminoácidos
parcial, masa del péptido, y la localización exacta de los
aminoácidos puede permitir la identificación de la
proteína en las bases de datos (etiqueta de secuencia).
• Diversas herramientas bioinformáticas para la
interpretación de la fragmentación de un péptido
(PEPSEA, SEQUEST, PERFRAG, MS-TAG y MASCOT).
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
• La secuenciación peptídica de novo es la estrategia de
elección para identificación de proteínas en organismos
que no están secuenciados.
• El objetivo es obtener múltiples secuencias de los
péptidos de una proteína mediante MS/MS, y realizar
busquedas de homologías frente a proteínas presentes
en bases de datos.
• Aunque la proteína de interés pueda no ser identificada o
desconocida, la información de la secuencia proteíca
puede ser utilizada para clonar el gen correspondiente.
Espectrometría de masas – Secuencia peptídica
VENTAJAS
• Mayor especificidad para la identificación de proteínas que
la PMF.
• Compatible con mezclas de proteínas.
PROBLEMAS
• Dificultad en la automatización del proceso.
• Falta de flexibilidad en los programas informáticos para la
busqueda de etiquetas de secuencia.
Nuevas tecnologías
Nuevas tecnologías
• Nuevos desarrollos de tecnologías proteómicas sin llevar
a cabo la separación en PAGE:
• Cromatografía multidimensional
• Etiquetado de péptidos con diferentes reactivos:
técnica ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags)
• Electroforesis capilar acoplada a MS
• Microarrays de Proteínas
• Técnicas complementarias a las descritas previamente.
• También desarrollo de mejoras en la 2D-PAGE.
Nuevas tecnologías – Cromatografía multidimensional
• Aproximación multidimensional utilizando cromatografía
líquida bidimensional:
• columna de intercambio iónico (separación por carga).
• columna de fase reversa (separación por hidrofobicidad).
• Seguida de análisis de los péptidos mediante MS
(MudPIT: Multidimensional protein identification technology).
• La conjunción de cromatografía multidimensional y MS es la
manera más adecuada para automatizar la investigación del
proteoma.
Nuevas tecnologías – Cromatografía multidimensional
• Esto ha originado la técnica LC-MS/MS
(Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry).
• Requiere la digestión previa de las proteínas con una
proteasa.
• Este método permite la separación de cientos de proteínas
en un solo experimento.
Nuevas tecnologías – Técnica ICAT
• ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags): Técnica aplicada al
estudio del perfil de expresión diferencial de proteínas
entre dos muestras proteicas (proteómica de expresión).
• Las dos muestras son marcadas con el reactivo de ICAT
ligero o pesado (hidrógeno o deuterio): difieren en la
masa (8 Da) debido a la composición de isótopos.
• El reactivo ICAT se une a las cisteínas mediante un
grupo tiol y contiene biotina para facilitar la purificación
mediante cromatografía de afinidad.
Nuevas tecnologías – Técnica ICAT
Nuevas tecnologías – Técnica ICAT
• Posteriormente, las dos muestras marcadas se mezclan
y se digieren con tripsina.
• Separación de los péptidos marcados con ICAT en una
columna de afinidad y análisis mediante MS.
• La intensidad relativa de los péptidos de cada muestra
indica la abundancia de la proteína en las muestras.
• La fragmentación del péptido mediante MS/MS permite
determinar la secuencia de aminoácidos y conduce a la
identificación de la proteína.
Nuevas tecnologías – Técnica ICAT
Nuevas tecnologías – Técnica ICAT
VENTAJAS
• Permite realizar en el mismo análisis:
• Identificación de las proteínas.
• Comparación de los niveles de expresión.
• Eliminación de la 2D-PAGE para cuantificar las proteínas.
PROBLEMAS
• Utiliza proteínas conteniendo cisteina (presente en la mayor
parte de proteínas).
• Baja sensibilidad para proteínas poco abundantes.
Microarrays de proteínas
Microarrays de proteínas
• La determinación de la cantidad de mRNA no
proporciona información suficiente sobre las proteínas
que se traducen a partir de esta molécula.
• Las proteínas sufren toda una serie de modificaciones
post-traduccionales a lo largo de su proceso de síntesis:
• Procesamientos proteolíticos.
• Glicosilaciones.
• Formación de complejos proteicos.
• Por otra parte, las proteínas han de plegarse
correctamente para ser totalmente funcionales.
Microarrays de proteínas
• Para completar el estudio de las funciones de las
proteínas se ha de recurrir a la información contenida en
el proteoma.
• Las proteínas de interés en un proteoma pueden ser
expresadas masivamente, purificadas, depositadas e
inmovilizadas de manera individual, ordenada e
independiente sobre un soporte sólido.
• Permiten realizar el análisis a gran escala de:
• Perfiles de expresión diferencial de proteínas.
• Interacciones proteína-proteína (interactoma).
Microarrays de proteínas
• Una mezcla compleja (lisado celular o suero) se pasa
sobre el microarray para permitir la unión a su
correspondiente proteína diana.
• Principal limitación técnica:
• Dificultad para detectar e identificar proteínas de
modo específico, en comparación con los
microarrays de DNA, que no poseen esta
limitación.
Microarrays de proteínas – Diseño
• Factores de relevancia en el diseño de
microarrays de proteínas:
1- Naturaleza del soporte sólido.
2- Proteínas a inmovilizar.
3- Método de inmovilización.
4- Formato del microarray.
5- Agente de captura (en microarrays de
detección).
6- Método de detección.
Microarrays de proteínas – Diseño
Microarrays de proteínas – Diseño
• Desarrollo técnicamente complicado debido a la
complejidad y diversidad estructural de las proteínas.
• Las proteínas no tienen una estructura homogénea ni un
patrón de unión específico, sino que cada proteína posee
unas características bioquímicas particulares.
• No existe una técnica equivalente a la PCR capaz de
amplificar la cantidad de proteína en una muestra.
• Dificultades técnicas en la adquisición y unión estable de
proteínas a las superficies.
Microarrays de proteínas – Soporte
• Características de un soporte ideal:
1- Estabilidad química
2- Buena morfología de los puntos o spots.
3- Mínimas uniones no específicas.
4- Baja señal de fondo.
5- Alto ratio superficie/volumen.
6- Compatibilidad con los distintos sistemas
de detección.
7- Baja autofluorescencia.
Microarrays de proteínas – Soporte
• La elección del soporte condicionará el formato final del
microarray así como el método de detección preferible.
• La carga de las proteínas es muy variable, lo que ha
provocado que se realicen grandes esfuerzos en la
estandarización de materiales de soporte adecuados
para cada tipo de microarray.
• Los soportes porosos (membranas de nitrocelulosa,
nylon o fluoruro de polivinilo) son más adecuados para la
inmovilización de proteínas que los soportes lisos.
Microarrays de proteínas – Soporte
• Los soportes porosos poseen una mayor superficie y en
consecuencia una mayor capacidad de unión.
• Nueva generación de química de superficies de
membrana y de vidrio ofrecen una variedad de
superficies de soporte:
• No requieren el empleo de agentes bloqueantes
(eliminación del ruido de fondo).
• Introducción de elementos funcionales (PEG,
polietilenglicol) que previenen el contacto directo
de la proteína con la superficie.
Microarrays de proteínas – Soporte
Microarrays de proteínas – Inmovilización
• Moléculas de naturaleza proteica inmovilizadas a gran
escala sobre el soporte sólido:
• Enzimas
• Péptidos
• Anticuerpos
• Antígenos
• Alérgenos
• Pequeñas moléculas sintéticas
• Las proteínas se immovilizan a la superficie utilizando
uniones covalentes, linkers o moléculas de afinidad.
Microarrays de proteínas – Inmovilización
Microarrays de proteínas – Inmovilización
• Moléculas adaptadoras de afinidad que favorecen la
inmovilización de las proteínas:
• Proteínas:
• Biotina, unión a estreptavidina
• Proteína G, unión a anticuerpo Fc
• Proteína A, unión a anticuerpo Fc
• GST, unión a anti-GST
• MBP, unión a anti-MBP
• TRX, unión a anti-TRX
• GFP, unión a anti-GFP
• Poliaminoácidos (poli-histidina, poli-lisina o poli-cisteina)
• Polipéptidos
Microarrays de proteínas – Inmovilización
• Las moléculas de afinidad ancladas en la superficie del
microarray mantienen unidas las proteínas por medio de
una segunda molécula adaptadora.
Microarrays de proteínas – Inmovilización
• La inmovilización de las proteínas sobre el soporte puede
hacerse mediante diversas técnicas:
• Impresión por contacto
• Impresión sin contacto
• Litografía
• Formatos de microarrays muy variados:
• Arrays planos.
• CD de centrifugación.
• Microcanales.
• 3D sobre superficie de silicio.
Microarrays de proteínas – Formatos
• El formato de array plano es el más extendido y
comercializado por numerosas empresas.
• Formatos alternativos encaminados a disminuir la
cantidad de muestra y reactivos necesarios basados en:
• Miniaturización
• Tecnologías de microfluídica
• Permiten el procesamiento de alta densidad de proteínas
a escala nanométrica.
Microarrays de proteínas – Formatos
• CD de centrifugación: el giro del CD
hace que la fuerza centífuga dirija la
muestra a través de microcanales.
• Microcanales: plataforma minituarizada
para el procesamiento en paralelo de
alta densidad de muestras.
• 3D sobre superficie de silicio: permite la
orientación de los anticuerpos gracias
a su estructura de pilares.
Microarrays de proteínas – Detección
• Métodos libres de marcaje previo de las proteínas díana,
evitando modificar su actividad:
• Espectrometría de masas (MS)
• Resonancia de plasmones superficiales
(SPR, Surface Plasmon Resonance)
• Métodos de marcaje empleando sondas marcadas con
diferentes técnicas:
• Métodos de detección directa, se utiliza una sonda
marcada compatible con el sustrato.
• Métodos de detección indirecta, se marca
directamente la proteína de interés.
Microarrays de proteínas – Detección
• Resonancia de plasmones superficiales (SPR): técnica
basada en fenómenos ópticos que tiene lugar sobre la
superficie de un metal.
• Detecta cambios de concentración de la masa del chip
debidos a la unión de un ligando a la proteína
inmovilizada.
Microarrays de proteínas – Detección
• En función del método de marcaje, la técnica de
detección empleada será diferente:
• Detección cromogénica
• Detección por quimioluminiscencia
• Detección por fluorescencia
• Detección por desintegración radioactiva
• Los cromógenos son sustratos para reacciones
enzimáticas que generan productos coloreados.
Los más empleados:
• Peroxidasa
• Fosfatasa alcalina
Microarrays de proteínas – Detección
• La emisión de luz por quimioluminiscencia se produce
por los productos de una reacción química en la que
participa la enzima luciferasa.
• Los fluoróforos (fluoresceína, rodamina, focobiliproteínas,
acridinas y cianinas) absorben fotones de luz de una
fuente externa (láser) provocando la excitación de los
electrones de la molécula y la emisión de luz en una
longitud de onda mayor a la de la luz incidente.
• La detección por desintegración radioactiva se basa en la
incorporación de 32P en proteínas, DNA y RNA.
Microarrays de proteínas – Limitaciones
• Esenciales para la investigación básica y aplicada.
• La disponibilidad o producción masiva de proteínas
individuales es la etapa más costosa de esta tecnología.
• Retos tecnológicos pendientes que hagan accesible la
utilización de esta herramienta a un gran número de
investigadores:
• Problemas de detección de la interacción.
• Problemas de estabilidad de las proteínas
inmovilizadas.
Microarrays de proteínas – Aplicaciones
• Alto potencial de aplicaciones en:
• Identificación de fármacos
• Identificación de dianas potenciales para fármacos
• Diagnóstico clínico
• Clasificación en función de la aplicación:
1- Microarrays de detección de proteínas
2- Microarrays de función o interacción de proteínas
3- Microarrays de screening inverso de proteínas
Microarrays de proteínas – Tipos
1- Microarrays de detección de proteínas
• Permiten la identificación y cuantificación de proteínas.
• Herramientas muy útiles de diagnóstico.
• Se basan en la captura de proteínas por medio de
moléculas de diversa naturaleza (agentes de captura)
que permanecen ancladas a la superficie del microarray.
• Diferentes agentes de captura:
• Anticuerpos, Affibodies y Aptámeros
Microarrays de proteínas – Tipos
• Anticuerpos: proteínas altamente
específicas producidas por el
sistema inmune.
• Affibodies: moléculas que
mimetizan las funciones de los
anticuerpos.
• Aptámeros: moléculas de DNA o
RNA capaces de unirse a otra
molécula específica (proteína o
ligando).
Microarrays de proteínas – Tipos
2- Microarrays de función o interacción de proteínas
• Permiten el estudio simultaneo de diferentes interacciones.
• Las aplicaciones comerciales centradas en estudios de
interacción proteína–proteína y enzima-sustrato.
Microarrays de proteínas – Tipos
3- Microarrays de screening inverso de proteínas
• Inmovilización de lisados celulares que representan todo el
repertorio de proteínas celulares en un determinado estadio
celular.
• Principal ventaja: las muestras inmovilizadas no requieren
un paso previo de desnaturalización ni marcaje.
• Las proteínas capturadas pueden ser identificadas mediante
MS o bien mediante anticuerpos específicos.
Microarrays de proteínas – Tipos
• Permiten realizar un screening de todos los anticuerpos
presentes en el suero de un paciente en busca de una
determinada proteína diana.
• Enorme potencial en la identificación de biomarcadores
en análisis proteómicos.
Retos de la proteómica
Retos de la proteómica
• Todavía no es posible estudiar las proteínas a un nivel
similar al de los ácidos nucleicos. En contraste con el
estudio del DNA, presenta una serie de retos:
• No hay un equivalente a la PCR para proteínas, así que
el análisis de proteínas poco abundantes es complejo.
• En estudios de interacción de proteínas, las
conformaciones nativas de las proteínas deben
mantenerse para obtener resultados significativos.
Retos de la proteómica
• Gran interés en la mejora y desarrollo de estrategias que
faciliten el estudio de las proteínas y de los proteomas.
• Enorme potencial de la proteómica en combinación con
otras aproximaciones genómicas para comprender mejor
como funcionan los sistemas biológicos complejos.
• La posibilidad de estudiar sistemas biológicos complejos
en su totalidad proporcionará respuestas que no pueden
obtenerse del estudio de proteínas individuales o grupos
de proteínas.