Articulo Completo

Revista de Ciencias Agrarias y Tecnología de los Alimentos Vol. 24 – 2006
Trabajo de Investigación
TRANSFERRINA Y SU POSIBLE RELACIÓN CON PRODUCCIÓN DE
GONADOTROFINA CORIONICA EQUINA
Egle Villegas Castagnasso [1]1, Mariana Kienast, Pilar Peral García
RESUMEN: La gonadotrofina corionica equina (eGC) es una hormona
glicoproteica producida por las células del trofoblasto fetal que invaden el
endometrio uterino. La elevada actividad de esta hormona en la estimulación
del desarrollo folicular y su alta persistencia in vivo permite que sea usada
como agente estimulante en especies heterólogas. El objetivo del presente
estudio consistió en evaluar la posible asociación entre un marcador genético
y el nivel de eGC. Como marcador genético se seleccionó a la transferrina,
ya que por su función biológica está relacionada con el estado general del
animal y del endometrio en particular. El plantel en estudio estaba
compuesto por caballos mestizos, destinados a la producción de la hormona.
Los mismos fueron seleccionados para realizarse cruzamientos dirigidos
teniendo en cuenta el genotipo para el locus de las transferrinas, permitiendo
conocer el alelo obligado en la cría (dado por herencia paterna). El nivel de
hormona producido se calculó mediante el método de enzimoinmunoensayo
(EIE). Mientras que para la determinación de los alelos de transferrina se
empleó la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida según el
método PAGE . Una vez obtenida la información de las variantes que
presentaban los individuos para el locus de transferrina, se analizó la posible
asociación entre los marcadores genéticos y la producción de eGC, mediante
el método de ANOVA multifactorial. A partir de los resultados obtenidos,
pudieron elaborarse las siguientes conclusiones: 1) La transferrina evidenció
diferencias significativas tanto a nivel fenotípico, como en la
presencia/ausencia de los alelos F1 y H. La presencia del alelo F1 se
encontró asociado con una mayor producción de eGC. Por el contrario la
presencia del alelo H está relacionada con un menor nivel de producción de
la hormona. 2) En las yeguas homocigotas para transferrina, se encontró una
disminución de la producción de eGC, conforme avanzaba la edad del animal
analizado. Este hecho no se observó en las yeguas heterocigotas para el
mismo locus. 3) Los fenotipos homocigotas para el alelo F2 presentaron una
menor producción de la hormona que los individuos que portaban ese mismo
1
Dirección para correspondencia:
[1] Centro de Investigaciones en Genética Basica y Aplicada (CIGEBA). Facultad de Ciencias
Veterinarias.UNLP. 60 y 118 s/n. (1900) La Plata. Email: [email protected]
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alelo en combinación con D, H o R. A pesar del desarrollo conceptual y
metodológico de la mejora genética animal, la selección asistida por
marcadores es un área poco transitada en la actualidad. Por lo tanto, aunque
preliminar resulta un aporte original, teniendo en cuenta el escaso desarrollo
de este tipo de trabajos en equinos y más específicamente en el ámbito de la
producción.
Palabras clave: marcadores genéticos, transferrina, gonadotrofina corionica
equina.
Recibido: xx/xx /06
Aceptado: xx/xx/06
INTRODUCCIÓN
La mejora genética animal ha evolucionado de forma importante a lo largo de la
segunda mitad del siglo pasado. A esto han contribuido por una parte la aplicación
de las herramientas de estadística e informática, y por otro lado los avances
conceptuales y metodológicos de la genética cuantitativa. Todo ello, viene
acompañado por un adecuado sistema de identificación individual y la posibilidad
de realizar controles genealógicos, mediante marcadores genéticos, lo que ha
contribuido a mejorar considerablemente la precisión de las estimaciones de los
valores genéticos de los reproductores (1).
La mejora genética animal constituye uno de los pilares básicos de la producción
animal actual, ya que además de contribuir a un conocimiento más profundo de la
base genética en la que se asientan los caracteres productivos, permite un
adecuado control genealógico (2, 3, 4).
En este ámbito, definiremos a los marcadores genéticos como un carácter
cuantificable que permite detectar variantes que se presentan a nivel de la
secuencia del ácido desoxirribonucleico (ADN), ya sea estudiando los productos
de las secuencias codificantes o bien la variación hallada en el propio material
genético.
La relación entre marcadores genéticos y caracteres de producción, puede
estudiarse siguiendo distintas estrategias. Una de ellas es analizar genes que por
su función biológica podrían estar relacionados con la expresión de una
característica de interés.
En el presente trabajo se analizaron yeguas y padrillos mestizos destinados a la
producción de Gonadotropina Coriónica Equina (eGC). En los mismos, se
determinaron las variantes alélicas que presentaban para el locus transferrina. Este
marcador fue seleccionado por tratarse de una proteína transportadora de hierro
que forma parte de numerosos procesos biológicos. Asimismo, se destaca su
relación con el grado de deterioro del endometrio, sitio de producción de la eGC.
Recordemos que la eGC es producida por células de origen trofoblástico que
invaden al endometrio uterino. Este hecho es importante porque el epitelio
endometrial debe glicosilarse para facilitar la adhesión en la zona donde se va a
producir la invasión de las células del cinturón coriónico. Por otra parte, se la ha
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aislado a la eGC de fluidos foliculares, sugiriendo su relación con el mecanismo
de maduración folicular (5).
Una vez obtenida la información de las variantes presentes en el locus
transferrina, se analizó la posible asociación entre los marcadores genéticos y la
producción de eGC, mediante el método de ANOVA multifactorial.
MATERIALES Y MÉTODOS
I- Población general: La población general está conformada por caballos mestizos
de la especie Equus caballus. Los mismos se encuentran en un campo de cría
ubicado en la localidad de Ayacucho, Provincia de Buenos Aires.
El total de los animales están destinados a la producción de eCG, sin que exista
selección previa de los mismos. La alimentación de la población se realiza por
pastoreo natural y el servicio de las yeguas es por monta natural a campo,
existiendo un control sanitario antes de cada período reproductivo.
Cabe destacar que las gestaciones no llegan a término ya que se producen abortos
a campo provocados por la extracción de la eCG. Por este motivo, la reposición de
los animales del plantel se realiza anualmente por la compra de individuos a
distintos establecimientos de la zona, sin priorizar ninguna característica de los
mismos, sólo confirmando el buen estado sanitario de los mismos.
II- Análisis de los cruzamientos seleccionados por los genotipos de Transferrina:
Se tomaron muestras de sangre entera de los animales que conformaban la
población muestral. Cada una de ellas fue centrifugada durante 10 minutos a 1000
rpm para permitir la extracción del sobrenadante. Una alícuota del mismo fue
sometida a migración en un campo electroforético en geles de poliacrilamida
según el método PAGE (7), lo que permitió la determinación de las variantes
alélicas.
La corrida se realizó en geles de poliacrilamida a miliamperaje fijo (45 mA) y
voltaje libre (entre 500 y 1000 V). El gel debió mantenerse refrigerado con un
sistema de enfriamiento que circuló a 2 - 4° C. Dicha corrida finalizó cuando la
banda de azul de bromofenol, agregado al Solución tampón del ánodo, recorrió
una distancia de 14 cm dentro del gradiente del 10% (aproximadamente 6 horas).
La determinación de las variantes de transferrina se realiza por tinción con
coloración para proteínas (0,4 gr de Coomassie Blue (brilliant blue), 50 ml de
ácido perclórico 70% y se completa el volumen hasta a un litro con agua
destilada), donde el gel de corrida se sumerge durante 12 horas.
La lectura de las bandas se realizó mediante la comparación de las muestras de
nuestro estudio con muestras conocidas pertenecientes a patrones reconocidos por
el Test de Comparación Internacional de la Sociedad Internacional de Genética
Animal (ISAG). Las variantes de cada sistema se identificaron según su distinta
movilidad electroforética, lo que permitió evidenciar el polimorfismo presente en
los individuos analizados.
Una vez determinadas las variantes alélicas para el locus transferrina en cada
animal del plantel en estudio, se pudieron seleccionar las yeguas y padrillos para
realizar una prueba piloto de selección asistida por marcadores. La elección de los
machos se basó en que sean homocigota, asegurando la presencia del alelo en la
cría (alelo obligado).
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Los individuos analizados estaban compuestas por 72 yeguas que fueron servidas
por 8 padrillos con genotipos homocigotas: DD, F2F2, RR y HH. De este modo,
se asegura la presencia certera del alelo en el feto (alelo obligado).
III- Medición del nivel de hormona producida: Las muestras de sangre se
extrajeron a intervalos regulares de cinco días, en las yeguas preñadas. Las
mismas se realizaron entre los días 40 y 120 de gestación, comenzando en la
misma fecha para todos los animales. Las sangrías fueron de 10 ml cada una y se
emplearon para controlar el nivel de hormona. El método empleado para la
medición del nivel de la hormona fue enzimoinmunoensayo (EIE) (8). Cuando ese
valor superó los 20 UI/ml, se le realizó un sangrado mayor para la extracción de la
hormona. Luego de esto las yeguas regresaron con el resto de la manada,
produciéndose abortos a campo.
IV- Análisis estadístico de los datos obtenidos: La comparación de la media de
producción alcanzada se realizó en cada variable por análisis de varianza
multifactorial. Las variables estudiadas fueron:
- En el caso particular de las yeguas, el genotipo de las transferrinas se lo analizó
clasificando a las yeguas en homocigotas y heterocigotas y por presencia/ausencia
de cada alelo.
- En el caso del feto se evaluó la presencia/ausencia del alelo obligado.
- En los cruzamientos se analizó el número de alelos compartidos por yegua y
padrillo.
RESULTADOS
La comparación entre las medias de producción de los grupos formados por las
distintas edades de las yeguas, no mostró diferencias significativas (p=0,77).
Al clasificar a las yeguas por el genotipo en homocigotas y heterocigotas, y
comparando la media de producción de eGC, no se encontraron diferencias
significativas (p=0,18).
La comparación de las medias de producción de hormona y los distintos alelos
presentes en la yegua (agrupados por presencia/ausencia), marcó diferencias
significativas para el alelo H (p=0,007). Las yeguas que portaban el alelo
presentaban una media menor (873,49 UI) en comparación con el grupo de yeguas
que no presentaban dicho alelo (1250,47 UI).
Las interacciones entre los distintos alelos presentes en yeguas y en padrillos
evidenció que solamente los cruzamientos donde las yeguas portaban el alelo H y
cuyo feto era portador del alelo D, presentaban una producción significativamente
mayor (p< 0,05) que el resto de las interacciones evaluadas. En la tabla 1 se
resumen los valores medios de producción obtenidos de la interacción entre estos
alelos.
Los padrillos que formaron parte de esta prueba piloto, presentaron los siguientes
genotipos DD, F2F2, RR y HH. De este modo los alelos obligados en la cría
fueron: D, F2, R y H. Al comparar las medias de producción de los grupos
formados por el alelo obligado del feto, no se hallaron diferencias significativas
(p=0,42).
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Tabla 1- Valores de media de producción, expresadas en UI, marcando la
interacción de alelos de yegua y feto que presentaron diferencias
significativas (p<0,05).
Presencia del alelo
D en yegua
Ausencia de alelo D
en yegua
Presencia de alelo H
en feto
921.9 U.I
623.714 U.I
Ausencia de alelo H
en feto
532.333 U.I
559.172 U.I
DISCUSIÓN
La relación significativa entre determinados genotipos de transferrina y el nivel de
hormona producida se debería a la predisposición diferencial para el deterioro
endometrial de los distintos genotipos de la transferrina.
En la prueba piloto, donde los cruzamientos fueron seleccionados, no se
encontraron diferencias significativas entre las medias de producción de los
diferentes genotipos del locus transferrina analizados. Esto podría deberse a la
baja representatividad numérica alcanzada por cada genotipo.
El alelo F1 presentó diferencias significativas en la media de producción de las
yeguas que portaban este alelo en una o dos copias con respecto a las que no lo
tenían. Las yeguas con una o dos copias de F1 produjeron mayor cantidad de
hormona que aquellas yeguas que no presenta el alelo. Estos resultados fueron
coincidentes con los obtenidos en las pruebas a posteriori realizadas a nivel
genotípico, ya que en le grupo de mayor producción se encontraban los genotipos
F1F1 y F1F2 se encontraron en el grupo de mayor producción. Los restantes
genotipos que contaban con el alelo F1 (F1F3 y F1H) se ubicaron en el segundo
grupo más productivo, confirmando la buena producción de hormona lograda por
los animales portadores del alelo F1. A pesar de que no se conoce en la actualidad
la diferencia potencial que presenta esta variante alélica con respecto a las
restantes, se podría pensar en un efecto dominante de la misma. La capacidad de
transportar hierro de la mayoría de las variantes de transferrina o combinaciones
de alelos es aun desconocida.
El alelo H de transferrina presentó diferencias significativas con respecto a la
media de producción. Las yeguas portadoras de una o dos copias de H exhibían
menor producción que aquellas que no lo presentaban. Estos datos pueden estar
relacionados con estudios previos donde se destaca la relación entre la presencia
del alelo H con una menor concentración de transferrina en suero y menor nivel
de hierro general, en comparación con los animales que no portan este alelo (10).
De este modo los animales que presenten esta variante tendrían menor capacidad
de defensa ante agentes que deterioran el endometrio.
Los estudios realizados teniendo en cuenta al alelo F2 evidenciaron que las
combinaciones de este alelo con las variantes D, H y R tenían una media de
producción mayor que la que presentaban los individuos homocigotas para este
mismo alelo. En los caballos de trote y de paseo se reportó que la variante F2 de
transferrina, en combinación con los alelos D, H o R, proveen una mejor defensa
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contra las infecciones uterinas que aquellos individuos que poseen al alelo F2 en
homocigosis (11).
Los restantes alelos de transferrina hallados en esta muestra, no presentaron
diferencias significativas entre las medias de producción en los análisis
estadísticos realizados.
CONCLUSIONES
Los datos obtenidos en este trabajo preliminar permiten destacar una asociación
significativa entre la presencia del alelo F1 del locus transferrina y con mayor
producción de eGC. Por el contrario la presencia del alelo H está relacionada con
un menor nivel de producción de la hormona.
El presente estudio conlleva conclusiones preliminares que deberán corroborarse
estudiando un numero mayor de individuos, como así también incorporar otros
marcadores que amplíen el espectro de marcadores que puedan estar relacionados
con la producción de Gonadotrofina Corionica Equina. Este hecho permitirá
contribuir a contar con una batería de información que podrá ser empleada en
planes de selección asistida por marcadores genéticos (MAS).
BIBLIOGRAFÍA
1. San Primitivo Tirados, F. 2001.La mejora genética animal en la segunda
mitad del siglo XX. Arch. Zootec .50: 517-546.
2. Georges, M; D. Nielsen, M; Mackinnon, A.; Mishra, R; Okimoto, AT.;
Pasquino, LS Sargeant, A ; Sorensen, MR; Steele, X; Zhao, JE Womack
and I Hoeschele. 1995. Mapping quantitative trait loci controlling milk
production by exploiting progeny testing . Genetics , 139: 907-920.
3. Crawford, AM.2001. A review of QTL experiments in sheep. Proc. Assoc.
Advmt. Anim. Breed. Genet. , 14: 33-38.
4. Grisart, B W; Coppieters, F; Farnir, L; Karim, C; Ford, P; Berzi, N;
Cambisano, M; Mni, S; Reid, P; Simon, R; Spelman, M; Georges and R.
Snell.2002. Positional Candidate Cloning of a QTL in Dairy Cattle:
Identification of a Missense Mutation in the Bovine DGAT1 Gene with
Major Effect on Milk Yield and Composition. Genome Res., 12: 222-231.
5. Briggs, DA; Sharp, D; Miller, D and Gosden, RG.1999. Transferrin in the
developing follicle: evidence for de-novo expression by granulosa cells.
Molecular Human Reproduction. Vol. 5, N°12: 1107-1114.
6. Gahne, B; Juneja, R K and J Grolmus .1977. Horizontal polyacrylamide
gel electrophoresis for the simultaneous phenotyping of transferrins,
albumins and post-albumin in the blood plasma of cattle. Anim. Blood
Grps. and Biochem. Genet .9: 37-40.
7. Juneja, RK.; Gahne, B and Sandberg, K.1978. Genetic polymorphism at
the vitamin binding protein and another postalbumin protein in horse
serum. Animal Grps. Iochem.Genet. 9: 29–36.
ISSN 1668-1940
6
Revista de Ciencias Agrarias y Tecnología de los Alimentos Vol. 24 – 2006
8. Lecompte, F and Combamus, Y.1992. Enzime Immunoassay (EIA) for
Equine chorionic gonadotropin/pregnant mare serum gonadotropin
(Ecg/PMSG). J. of Immunoassay 13 (4) : 483-493.
9. Ek, N.1981. Antigen-antibody crossed electrophoretics studies and
quantitative comparisons of serum transferrin types in horses. Acta Vet.
Scand. 22: 246-259.
10. Yokohama , M; Mogi, K. and Hosoda, T.1982. Relationship between
serum iron and transferrin concentration in light breed horses. Jap., J
Zootech. Sci. 53: 766-772.
11. Weitkamp, L.; Kenney, L.; Bailey, R.; Mac Cluer, J.; Brown, J.;
Blanchard, T.; Sertich, P.; Love, C. y Hunt, P. 1991. Pathological changes
of the mare endometrium and genotypes for transferring and ELA. J.
Reprod. Fert. Suppl . 44: 275-282
http://www.uca.edu.ar/esp/sec-fagrarias/esp/page.php?subsec=revista
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