Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial

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1
Enfermedad producida por un patógeno
Qué interesa determinar?
Detectar e identificar al patógeno
Tipificación y detección de una determinada variante
Identificación de cepas resistentes a drogas anti microbianas o antivirales
Detección en suero de anticuerpos anti patógeno
Cuantificación del patógeno
2
Como detectar aquellos genes que pueden
Identificación y tipificación de patógenos
Sondas, oligos específicos,
Antígenos específicos
Constituir factores de virulencia o
cuya actividad
es indispensable para la
supervivencia del patógeno
en el huésped.
Diagnóstico
Blanco para drogas
Genes indispensables para
su supervivencia in vitro
Condiciones
Genes cuyo producto
de lugar a la inducción
de una respuesta
inmune protectiva
Nuevas vacunas
3
Detección de genes diferenciales útiles para diagnóstico y/o de genes de
virulencia o útiles como blanco para drogas y/o de genes útiles para vacunas
Genes útiles para diagnóstico
Hibridación comparativa
DNA del patógeno
Corte con enzima de restricción
Clonado en un vector
DNA marcado
del patógeno
DNA marcado
del no patógeno
Contiene
secuencia específica
del patógeno
4
Secuencias repetitivas
Utiles en ensayo diagnóstico: diferenciación entre cepas por Rep-PCR
Detección de secuencias repetitivas: parásitos
Hibridación con DNA
marcado
de P. falsiparum
Colonias marcadas más
Intensamente (DNA repetitivo)
Identificación de elemento repetitivo específico
Hibridación con DNA marcado
de distintas especies
Biblioteca genómica con
ADN de Plasmodium falsiparum
Differential display genómico
RAPD-PCR sobre genoma
Comparación de perfil de bandas en geles (entre patógeno y no patógeno)
Extracción de bandas diferenciales
Clonado y secuenciación
5
Tester DNA with adapter 1Driver DNA (en exceso)
Tester DNA with adapter 2
Hibridacion sustractiva
(por supresión, SSH)
Construcción de biblioteca
Microarray
PCR c/ambos
primers
6
Genes de virulencia o necesarios para supervivencia en el huésped
Mutantes en distintos genes. Estudio de virulencia en
modelos animales
Mutaciones letales
Mutagénesis generalizada etiquetada
(STM: signature-tagged mutagenesis).
Ventajas y Limitaciones
Tag
PCR con dNTP marcados
Hibridación
7
Genes bacterianos que se expresan más dentro del huesped
Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial
IVET (tecnología de expresión ¨in vivo¨)
Expresión de genes determinados por RT-PCR competitiva y RT-PCR en tiempo real
Microarray
Differential display
Genes del huésped que se expresan durante la infección
Hibridación sustractiva por supresión de cDNA
8
IVET (tecnología de expresión in vivo) (ej. de técnicas de atrapamiento de promotores)
El procedimiento consiste en utilizar fragmentos de DNA genómico que se ligan a un vector que contiene un gen
metabólico esencial para su crecimiento in vivo, como puede ser por ejemplo egf (factor de crecimiento) y un
indicador, como es el caso de lacZ. La construcción se transfiere a una bacteria auxotrófica para el gen
metabólico. Las bacterias transformadas se utilizan para infectar animales o cultivos celulares, seguido de la
recuperación de las viables y del screening in vitro para la actividad del gen indicador.
1)
El patógeno requiere un factor de crecimiento esencial durante su
condiciones in vivo.
2)
Plásmido con el marcador de selección egf y el gen reporter lacZ.
3)
Clonado de fragmentos de ADN al azar río arriba de los genes
4)
5)
Transformación de la biblioteca de ADN en la bacteria patogénica
auxotrófica.
Puede quedar en plasmido replicativo, o utilizar un plásmido suicida
y buscar el evento de recombinación en el cromosoma
egf
lacZ
pathogen
in vivo
2)
6)
Infección del ratón con la bacteria recombinante
Aislamiento de la bacteria patogénica del ratón.
in vitro
7)
Selección de colonias blancas (no hay actividad de β-galactosidasa)
8) Secuenciación del plásmido e
white colonies carry
in vivo induced promotors
9
10
IVET en humanos
Resolvasa
P
Res Suc
B
Res
Vector
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Genes bacterianos que se expresan más dentro del huesped
Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial
IVET (tecnología de expresión ¨in vivo¨)
Expresión de genes determinados por RT-PCR competitiva y RT-PCR en tiempo real
Microarray
Differential display
Genes del huésped que se expresan durante la infección
Hibridación sustractiva por supresión de cDNA
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Cuantificación de mRNA
Staphilococcus aureus es una bacteria que causa infecciones
en pacientes inmunocomprometidos (HIV) y en fibrosis
cística siendo la enfermedad pulmonar causada por esta
bacteria causa de muerte en estas afecciones. Un tratamiento
antibiótico no alcanza a veces para una clarificación del
sistema bronquial.
A
Tratamiento con DNasa
B
C
(control
sin reverse
Transcriptasa)
A
B
C
Clonado
PCR con sec promotor fago T7
Transcripción in vitro
[target]A
respecto a [target]B
[referencia]A
[referencia]B
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También por RT-PCR en tiempo real
Gen de referencia
Gen en estudio
(target)
[target]A
respecto a [target]B
[referencia]A
[referencia]B
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IL1-b A
Referencia B
Referencia A
IL1-b B
Numero de veces diferentemente expresado = (Cigen/Ciref)A = Coeficiente de Eficiencia –(ΔCtA-ΔCtB)
en A respecto a B
(Cigen/Ciref)B
= E –(ΔCtGen-ΔCtReferencia)
ΔCtA= Ct gen-Ct referencia en la condición A (in vivo)
C=Ci 2n
ΔCtB= Ct gen- Ct referencia en la condición B (in vitro)
C=Ci En
CCt=Ci 2Ct
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Genes bacterianos que se expresan más dentro del huesped
Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial
IVET (tecnología de expresión ¨in vivo¨)
Expresión de genes determinados por RT-PCR competitiva y RT-PCR en tiempo real
Microarray
Differential display
Genes del huésped que se expresan durante la infección
Hibridación sustractiva por supresión de cDNA
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Microarrays
ADN genómico
Plásmidos o productos de PCR
cADN
Oligonucleótidos (a partir de la información en base de datos)
Proteínas
Sonda / probe
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Material de soporte
Poroso: membrana de nylon o de nitrocelulosa
reutilizable
Macroarrays
Marcación isotópica
No poroso o liso: vidrio, plástico u oro
Mayor resolución de puntos, mayor número
Microarrays
Marcación con fluorescencia
Diana / target
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Inmovilización del ADN
Adsorción física aplicando vacío (sobre la NO2-celulosa)
Covalente (en microarray)
Modificación del ADN u oligonucleótido
Hay que activar la superficie y la sonda
Activación mediante grupos tiol, amino o biotina
Tratamiento previo con grupos amino,
o aldehído o estreptavidina
Capa uniforme de grupos reactivos
Molécula espaciadora
Adquiridos comercialmente
Activación de la sonda: introducción de grupo reactivo durante síntesis química (oligonucleótido)
o en la PCR utilizar un oligo derivatizado. O por reacción enzimática: en el 3´ un aminoalkyl dUTP
por acción de la deoxinucleotidil transferasa, o utilizando la T4 polinucleótido kinasa para introducir
en el 5´un grupo tiol a partir de la reacción con dATP que tiene el P en γ reemplazado con el grupo tiol
Deposición robotizada
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Síntesis in situ de oligonucleótidos
Grupo protector
Aplicación de la máscara
Máscara
Irradiación
Solución de nucleósidos
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Detección de diana o target
Directa
Indirecto
Diana marcada con:
Diana unida a biotina y detección con estreptavidina
conjugada a fluorcromo
Isotopo radioactivo: 33P. 125I (NO2celulosa)
Diana unida a digooxigenina y agregado de Ac
Anti-digooxogenina conjugado a fluorcrómo
Fluorcromo: Cy3, Cy5. Scanners especiales
2 muestras en el mismo array
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Análisis del RNA de la muestra
Identificar potenciales genes de virulencia para blanco para drogas o formulación de vacunas. Comparación del perfil de
Expresión del patógeno in vitro e in vivo (dificultoso).
Identificación de los cambios en la expresión de los genes del patógeno debido a un compuesto
antimicrobiano, da idea del mecanismo de acción del compuesto.
Identificar los cambios en la expresión de los genes del patógeno debido a una mutación desconocida
Entender la respuesta del huésped a la infección con un patógeno. Cuales son los genes del huésped que se requieren
para sostener la infección viral. Identificar blanco para droga. También identificar mecanismos de resistencia al patógeno
que puedan ser potenciados
Macroarray
Normalización de los datos, determinar que genes se expresan diferencialmente y validación de los resultados
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Scatter plot
Comparación de dos hibridaciones
de la misma muestra
Determinación
de Cutoff
Comparación de hibridación de dos
muestras distintas
Cutoff
Análisis de cluster
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Macroarray (nitrocelulosa)
Varias replicas para cada gen en la misma nitro
distintas hibridaciones para cada muestra
Replicas biológicas
Normalización: restar el background y relacionar a controles que no varían
en las ≠ condiciones
Microarray (marca fluorescente)
Idem
Para cada spot determinar la intensidad de fluorescencia en
cada canal restado del background y normalizar respecto a
controles invariantes en las distintas condiciones ó respecto
al promedio de intensidades de todos los spots. Marcación
inversa
Determinar para cada spot la relación Cy3/cy5 normalizada
Imagen virtual
Se saca el promedio de intensidad para cada
gen en todas las replicas
Realizar el promedio de todas las relaciones obtenidas para
cada spot en todas las réplicas ( replica dentro del mismo
slide, ≠ slides, replicas biológicas..
Promedio de Intensidades para cada gen en cada muestra ± δ s
Relación de Promedios entre las dos muestras: excluír los que son menores a
Cutoff y los que la diferencia entre los valores de una condición y
otra no presenta un P≤ 0.05
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Extraer RNA total y separar el correspondiente al patógeno
Análisis del transcriptoma durante la infección
Separar patógeno y huésped y luego extraer RNA del patógeno
Infección con Neisseria meningitidis
Tratamiento con
EDTA y tripsina
Bacteria no
adherida
Centrifugación
a baja velocidad
Lisis diferencial de
Célula huésped
Extracción de
RNA usando el kit para
atrapar y descartar el
resto de RNA de la célula
huésped
Centrifugar
Descartar
sobrenadante
Pellet bacteriano
Extracción de
RNA usando el kit para
atrapar y descartar el
resto de RNA de la célula
huésped
Se sintetizan oligonucleótidos con un grupo
amino en el 5´
NH2-linker-5´oligo (3 oligos para cada ORF del
genoma del patógeno). Se unen a superficie activada
con grupos aldehído.
Cantidades iguales de RNA
Marcación: Transcripción reversa
Con Cy3-dUTP o Cy5-dUTP con primers específicos
para todas las secuencias presentes en el array. Se
podrían usar primers al azar
Mezcla
cDNA
Hibridación
array de oligonucleótidos
Normalización, cálculo de cantidades relativas promediando varias réplicas de los
valores correspondientes a los 3 oligos
Confirmación por RT-PCR en tiempo real
25
Validacion: RT-PCR en tiempo real, Northen blot
IL1-b A
Referencia B
Referencia A
IL1-b B
Numero de veces diferentemente expresado = Coeficiente de Eficiencia –(ΔCtA-ΔCtB)
ΔCtA= Ct gen-Ct referencia en la condición A
ΔCtB= Ct gen- Ct referencia en la condición B
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Genes bacterianos que se expresan más dentro del huesped
Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial
IVET (tecnología de expresión ¨in vivo¨)
Expresión de genes determinados por RT-PCR competitiva y RT-PCR en tiempo real
Microarray
Differential display
Genes del huésped que se expresan durante la infección
Hibridación sustractiva por supresión de cDNA
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Variacion de Transcriptoma del huésped frente a una infeccion: utilización de metodología de microarray
Estudio de variación de expresión de genes del huésped ante infección con el virus de la Influenza
Extraen RNA total, purifican mRNA por
afinidad y obtienen a partir del mismo
cDNA marcado con el marcador
fluorescente utilizando un oligodT como
primer
Dependiente de la replicación
2
Independiente de la replicación
1
28
Perfil de expresión de mRNA unido a polisomas
Expresión genómica vs proteómica
Niveles de mRNA no se corresponden con niveles de proteínas
Regulación transcripcional, estabilidad del mRNA, localización de mRNA, regulación
Traduccional, degradación de proteínas.
29
Otras aplicaciones de la metodología de microarray
Investigación
Diagnóstico
Comparación de ADN/ARN de distintas cepas, ejemplo: patógeno vs
no patógeno e identificación de posibles sondas para diagnóstico.
Detección de patógenos en una muestra y genotipificación del
patógeno hallado.
Array de secuencias específicas de distintos patógenos o de distintas
variantes de un determinado patógeno e hibridación con ADN
proveniente de muestra de enfermo previamente amplificado por PCR
o multiplex PCR.
30
Hibridación genómica comparativa por la metodología de microarray
Con el conocimiento del genoma de una de las especies es util para comparación con genomas bacterianos no secuenciados
Array con productos de PCR a partir del conocimiento del genoma completo
2 cepas distintas
Extracción de ADN
Marcación con aminoallyl-dUTP , dNTP, random primers y klenow
Unión a Cy3 y Cy5
ADN genómico
Hibridación con mezcla
(hibridación competitiva)
De la cepa cuyo genoma se
conoce
Cepa con
la que se
quiere comparar
Cepa cuyo
genoma está
spoteado
Escaneo de fluorescencia
Construcción de la imagen
Spot amarillo: igual pegada de cada uno de los dos ADN marcados
Spot rojo o verde : potencial deleción o repetitividad del gen, respectivamente
Mycobacterium: a) diferencia entre M. tuberculosis y distintas cepas de BCG y de M. bovis virulenta: diagnóstico para diferenciar infección por
M. tuberculosis y M. bovis, b) discriminación de inmunización por vacunación de inmunización por infección, c) deducción de causas de la pérdida
de efectividad de las vacunas actuales.
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Otras aplicaciones de la metodología de microarray
Investigación
Diagnóstico
Comparación de ADN/ARN de distintas cepas, ejemplo: patógeno vs
no patógeno e identificación de posibles sondas para diagnóstico.
Detección de patógenos en una muestra y genotipificación del
patógeno hallado.
Array de secuencias específicas de distintos patógenos o de distintas
variantes de un determinado patógeno e hibridación con ADN
proveniente de muestra de enfermo previamente amplificado por PCR
o multiplex PCR.
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Genotipificación del virus de la Influenza
Se arma una grilla de 8x8 con cADN obtenido por RT-PCR
a partir de RNA de distintos virus. Oligo con grupo reactivo
Amino. Superficie activada con grupos aldehído.
Se hibrida con cADN de la cepa a ensayar marcado, obtenido por
RT-PCR utilizando Cy3-dCTP.
Multiplex RT-PCR sobre aislamientos
Discriminación entre los distintos subtipos posibles en la reacción de RT-PCR.
Uso de microarray para detectar cual fue el amplicón obtenido.
Genotipoficación de subtipos de HPV: PCR única sobre secuencias consenso y discriminación
posterior de subtipo por hibridación específica en microarray
33
Detección de antígenos inmunodominantes para vacunas y para diagnóstico
1)
Bibliotecas de expresión
+ Suero pacientes
Inmunodetección
Phage display: Streptococcus-proteasa de IgA1
Selección por afinidad los fagos que poseen los
epitopes buscados
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2) Proteómica
+ Suero pacientes
Marcadores para diagnóstico
Espectrometría
de Masa
Identificación de la proteína
Clonado del gen
Sobre-expresión en sistema heterólogo
Comparación entre proteomas
(patógeno vs no patógeno)
Que el antígeno no sea reconocido por suero de pacientes afectados con
otra enfermedad
Determinar especificidad para diagnóstico de los Acs generados
Proteínas candidatas
Inmunizar y determinar capacidad protectiva de los Acs generados
Mutagenizar el gen codificante y ver importancia en virulencia (candidato
como blanco de drogas)
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•Búsqueda en el genoma y análisis comparativo de genomas
•1995: Haemophilus influenzae (primer genoma secuenciado)
•Actualmente: alrededor de 1500 genomas completos de bacterias y 3000 de virus
Genes que se encuentren en cepa patógena y no en no patógena
Alineamiento de genes y búsqueda de polimorfismos para tipificación por PCR o PCR en tiempo real
Secuencias comunes conservadas entre las distintas cepas patógenas para vacunas.
Genes que se encuentran en patógenos y no en genoma de huésped.
Genes homólogos a aquellos que en otros patógenos se conocen como genes de virulencia o como blanco
para drogas. Genes necesarios para adaptación a nicho intracelular (genes regulatorios, genes que codifican para proteínas
de adhesión, proteasas, proteínas secretadas, genes de resistencia o que permitan escapar de los mecanismos de defensa del
huésped y de tolerancia a stress).
Genes que codifiquen para caminos metabólicos fundamentales para el crecimiento del patógeno
(síntesis de pared, síntesis de ácidos nucleicos, proteínas, síntesis de ácidos grasos).
Genes que comparten el mismo mecanismo regulatorio que otros genes de virulencia conocidos.
Búsqueda en plásmidos o cromosoma de islas de patogenicidad (presencia de integrasas, transposasas,
Secuencias de inserción, distinto porcentaje de GC).
Genes que codifiquen para proteínas con conocidos motivos estructurales. Por ejemplo proteínas
con motivos asociados a transporte (proteínas de superficie) y pueden ser buenos candidatos
para vacunas.
Se investiga si son inmuógenos protectivos (Vaccinología reversa).
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Vaccinología reversa
ó varias proteínas de
manera de abarcar las distintas
cepas patógenas posibles
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Enfermedad producida por un patógeno
Qué interesa determinar?
Detectar e identificar al patógeno
Tipificación y detección de una determinada variante
Testeo de susceptibilidad a drogas anti microbianas
Detección en suero de anticuerpos anti patógeno
Cuantificación del patógeno
Identificación de genes marcadores útiles para diagnóstico
Identificación de genes de virulencia
Detección de potenciales blanco para drogas
Detección de potenciales genes útiles para vacunas
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SARS: síndrome respiratorio agudo severo
Muestras: aspirados nasofaríngeos, esputo, suero, materia fecal, biopsias
Investigación microbiológica y molecular para virus y bacterias conocidas por producir enfermedades
pulmonares: yersinia, micoplasma, clamidia, legionella, rickettsia, virus de la influenza A y B,
parainfluenza, adenovirus, etc.
1) técnicas de cultivo bacteriano específicas
2) propagación en líneas celulares in vitro para virus
3) inoculación en ratones
4) detección de patógenos conocidos por reacción Ag-Ac. IFA, ELISA.
5) Detección en suero de Acs anti patógenos conocidos
6) PCR, RT-PCR con primers específicos para patógenos conocidos.
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Propagación in vitro en cultivo de células
Efecto citopático
Microscopía electrónica
Presencia de partículas virales con morfología
comparable a coronavirus.
Utilización como antígenos para
Detectar anticuerpos en suero de
Pacientes. IFA
RT-PCR
Con oligos con secuencias
al azar (comparando células
infectadas con no infectadas)
Con oligos diseñados sobre
secuencias conservadas en
distintos coronavirus
Secuenciación y diseño de oligos
específicos.
40
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