Sistemas Dynal AllSet ™ y CombiSet ™ SSP

Instrucciones de Uso
Sistemas
+
Dynal AllSet ™ y
+
CombiSet ™ SSP
0088
INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
ÍNDICE
Página
PROPÓSITO DE USO …………………………………………………………………..……
3
RESUMEN Y EXPLICACIÓN …….........………………...…………………………..……
3
PRINCIPIOS DE LA METODOLOGÍA …………………………………...............………….. 3
REACTIVOS..........................................................…................………………………..… 4
Suministrados con el kit de tipaje…………………………………. ……………....
4
Conservación ….………...………………………………………………..…….
4
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES ……………………………………………………… 5
EQUIPO NECESARIO NO SUMINISTRADO POR DYNAL ……….…………………
5
PROCEDIMIENTO...........……………………………….....………….........…………………. 6
Recogida y Preparación de Muestras........................……………….............…. 6
Preparación de la Amplificación por PCR...…...................………...............….. 6
Amplificación por PCR................................…………………………..........….… 8
PCR mediante electroforesis en gel de agarosa …………………………..……. 9
LÍMITES DEL PROCEDIMIENTO ..................................................……........….....……. 10
DATOS ESPERADOS ….…………………………………………………….……………… 10
Control de Calidad…………………..........................……………….............…. 10
Test de Control Interno..…………………………………………………………. 10
Interpretación de los Resultados..................…....................………....…...… 11
Interpretación utilizando Dynal SSPTool™ ….…………………………………. 11
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS ................………..................…....……................
12
BIBLIOGRAFÍA ..................…………………….…........…………...….......…..........…...... 13
GARANTÍA …………………………………………………………………………….………. 14
MARCAS REGISTRADAS UTILIZADAS EN ESTE DOCUMENTO/PRODUCTO …...
14
PATENTES UTILIZADAS EN ESTE DOCUMENTO/PRODUCTO ….…...………….....
14
PARA CONTACTAR CON DYNAL....................................................................................15
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
Sólo para Diagnóstico In Vitro
PROPÓSITO DE USO
Determinación del tipo de Alelo HLA (Human Leukocyte Antigen, Antígeno Leucocitario Humano) de
Clase I o Clase II mediante ADN.
RESOLUCIÓN DE LOS TIPOS
Kits de Baja Resolución : El tipaje de los alelos se determinará a nivel genérico, o nivel de grupo alélico, lo
que en general concuerda con las especificidades definidas serológicamente.
Kits de Alta Resolución : O kits de subtipaje, proporcionan alta resolución o genotipado a nivel alélico.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
Casi todas las técnicas de tipaje de tejidos basadas en el ADN utilizan la técnica1 de PCR para
amplificar el locus HLA investigado. En la mayoría de estos métodos de tipaje de tejidos basados en el
ADN, la PCR se utiliza como un paso de preamplificación previo al tipaje para incrementar la cantidad
de ADN molde. El procedimiento de tipaje delete HLA requiere una postamplificación para discriminar
los distintos alelos. Al contrario que otros métodos basados en la PCR, la Metodología 2,3,4,5 SSP
utilizada por Dynal Biotech Ltd – AllSet+™ y CombiSet+™ SSP discrimina los diferentes alelos durante el
proceso de PCR. Esto reduce la duración del proceso de postamplificación a una simple determinación
por electroforesis en gel.
PRINCIPIOS DE LA METODOLOGÍA
El método Dynal SSP es una técnica basada en la PCR, que utiliza Cebadores Específicos de
Secuencia (Sequence Specific Primers, SSP), para un tipado de tejidos basada en el ADN.
Los productos Dynal SSP contienen un conjunto de mezclas de cebadores donde cada mezcla delete
contiene uno o más pares de cebadores específicos, es decir, el cebador específico del alelo y/o grupo
de alelos junto con un par delete control que hibrida con secuencias no alélicas de las muestras. El par
cebador control actúa como un control interno de la PCR para verificar la eficiencia de las
amplificaciones de la PCR.
Dynal SSP se basa en el principio por el cual un cebador que hibrida perfectamente resultará más
eficiente en la reacción de la PCR que otro que hibride con uno o varios errores en su extremo 3’. La
especificidad del sistema de tipaje es parte del paso de amplificación de la PCR, y el proceso de
postamplificación de las muestras queda reducido al mínimo.
La determinación de los alelos consiste básicamente en valorar si la amplificación ha tenido o no lugar,
es decir, en la visualización y detección de la amplificación por electroforesis en gel de agarosa. La
técnica PCR-SSP proporciona un alto grado de resolución porque cada par iniciador identifica dos sitios
ligados, polimórficos y situados en cis. El método aporta alta sensibilidad, especificidad y
reproducibilidad.
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
REACTIVOS
Reactivos suministrados en todos los Kits Dynal AllSet+™SSP o CombiSet+™ SSP
Descripción
Elementos
1. Placas de PCR con Mezclas de
Iniciador SSP pre-alicuoteado y
liofolizado
Cada pocillo de la placa de PCR contiene una solución
de cebador SSP liofilizado, compuesta por cebadores
específicos de alelo y/o grupo, además de un par de
cebadores control que hibrida perfectamente con
secuencias no alélicas. El par iniciador control amplifica
un fragmento de un gen conservado presente en todas
las muestras.
2. Tapas de PCR
Tapas para sellar las placas de PCR
Nº de
reacciones de
PCR por test
3. Master Mix (el nº de viales
incluido en el kit depende del nº de
reacciones por test – ver tabla)
Nº de viales de
Master Mix incluidos
en el (todas de 1,8
ml)
1-9
1
10-20
2
21-40
3
41-95
4
96
5
Concentración 1 x lista para su uso. La Master Mix se
ha optimizado para ser utilizada con AmpliTaq® DNA
Polymerase (Roche Molecular Systems, Inc.)
Información sobre formulación disponible en
[email protected]
4. Instrucciones de Uso del
Producto / Folleto de Información
Específica sobre el Lote del
Producto
Instrucciones de Uso del Producto / Folleto de
Información Específica sobre el Lote del Producto
(ISLP)
5. Tabla de Interpretación
Tabla para determinar qué alelo o grupo de
alelos identifican las distintas mezclas.
Conservación
1. Las placas de PCR y el Master Mix deben conservarse entre 2-8˚C.
2. No congelar los reactivos
3. Si se conservan correctamente, estos reactivos y mezclas de cebadores serán estables hasta la
fecha de caducidad indicada en el Folleto de Información Específica sobre el Lote del Producto.
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Sólo para Diagnóstico In Vitro
Todos los trabajos realizado con Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP deben efectuarse conforme
a las normas de Buenas Prácticas de Laboratorio y ajustándose a las normas locales, como a
los estándar de la EFI (European Federation for Immunogenetics, Federación Europea de
Inmunogenética) o las normas CPA (Clinical Pathology Accreditation).
Advertencia: Riesgo Biológico. Maneje todas las muestras como potenciales transmisoras de
enfermedades. Cualquier manipulación debe efectuarse con guantes y protección adecuada.
Advertencia: Riesgo Biológico. En la preparación de las muestras deben utilizarse tubos con
tapa de rosca para evitar que la muestra se salga y prevenir cualquier posible contaminación.
Advertencia: Riesgo Biológico: Todas las muestras deben manejarse como potencialmente
infecciosas utilizando procedimientos de seguridad como los indicados en Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories6 (Bioseguridad en Laboratorios Microbiológicos y
Biomédicos) y en el Documento M29-T7 de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory
Standards, Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico). Limpie y desinfecte
cuidadosamente todas las superficies de trabajo con lejía al 1% (NaClO). Esterilice en
autoclave antes de su eliminación todo equipo o material que haya estado en contacto con
muestras clínicas.
Advertencia: Riesgo Biológico: El bromuro de etidio utilizado para teñir ADN es
potencialmente carcinógeno. Lleve siempre guantes de nitrilo cuando manipule geles teñidos y
bromuro de etidio.
Precaución: Lleve protección ocular anti-UV y no mire directamente a la fuente de luz UV con
los ojos desprotegidos al observar o fotografiar los geles.
Precaución: Las pipetas utilizadas para las manipulaciones post-PCR no deben usarse en la
preparación del material pre-PCR.
Precaución: Contaminación. Evite que se produzca una contaminación microbiana al tomar
alícuotas de los frascos de reactivos. Lleve siempre guantes para evitar el riesgo de
contaminación de la muestra. Se recomienda utilizar pipetas desechables estériles y puntas de
pipeta con filtro. No utilice reactivos con turbidez o contaminación bacteriana evidentes.
Precaución: Eliminación. Elimine los reactivos no utilizados y los desechos de acuerdo con las
regulaciones nacionales, federales, estatales y locales.
Existe una Hoja de Información sobre Seguridad del Material (MSDS, Material Safety Data
Sheet) que puede descargar en www.tissue-typing.com o solicitarla a su suministrador local de
productos Dynal. (Para ponerse en contacto con Dynal, dirigirse a la última página de este
prospecto)
EQUIPO NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO POR DYNAL BIOTECH:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Pipetas manuales (p.ej. Eppendorf, Gilson).
Puntas de pipeta con filtro desechables para las pipetas.
Mezclador Vortex.
Microcentrífuga.
Rejilla de almacenaje para placas de microtubos de PCR.
Perkin-Elmer GeneAmp® PCR system 9600 o 9700, o cualquier otro termociclador
homologado con especificaciones equivalentes.
Placa calentadora / microondas para el calentamiento de las soluciones de agarosa.
Aparato de Electroforesis (p.ej. ABgene Electro-Fast® Stretch 108 Complete, AB-0708).
Transiluminador UV.
Sistema de captación y documentación fotográfica del gel.
Polimerasa Recombinante Taq (Dynal recomienda AmpliTaq®).
Agarosa adecuada para electroforesis.
Bromuro de Etidio.
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
PROCEDIMIENTO
NOTA: Este procedimiento debe llevarse a cabo en dos áreas del laboratorio (Amplificación Pre-PCR y
Amplificación Post-PCR) como se indica en las siguientes instrucciones.
RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Precaución: Maneje todas las muestras como potenciales transmisoras de agentes infecciosos.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
NO SE RECOMIENDA EL USO DE SANGRE HEPARINIZADA8
El ADN puede extraerse de células humanas nucleadas mediante la técnica
preferida.
Para obtener una mejor amplificación por PCR-SSP y resultados óptimos de tipado,
utilice ADN altamente purificado (OD 260:280, relación 1.6-1.8).
La concentración final del ADN antes de la PCR-SSP debe ser de aproximadamente
50 ng/µl
El ADN extraído debe ser diluido en dH20
El ADN puede conservarse a una temperatura igual o inferior a -20˚C durante un
largo período de tiempo (> 1 año) sin que esto afecte negativamente a los resultados.
El ADN conservado a +4˚C durante un largo período de tiempo se degradará, dando
lugar a la aparición de más artefactos, p.ej. amplificaciones no específicas.
PREPARACIÓN DE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR (Efectuada en el área Pre-PCR)
Para efectuar una determinación simple, haga la siguiente mezcla para PCR. Consulte los volúmenes
necesarios en la tabla de la página siguiente (dependiendo del nº de reacciones de PCR por test)
•
•
•
Master Mix
Muestra de ADN (a 50 ng/µl)
ADN Polimerasa AmpliTaq® (a 5 .i.u./µl )
•
•
Mezcle bien
Añada 10 µl de la mezcla de PCR anterior a cada pocillo de la placa del kit Dynal AllSet+™ o
CombiSet+™ SSP
Ponga los tapones a los tubos de PCR y ciérrelos bien para asegurar que todos están totalmente
sellados. Se puede utilizar una herramienta específica de tapado. Se pueden utilizar también
hojas de sellado adhesivas compatibles con la PCR. Las muestras quedan así preparadas para
la amplificación por PCR
Conserve los reactivos sobrantes del kit a 2-8˚C.
•
•
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
Tabla de Cálculo para las Mezclas de PCR:
AND
Reacciones Solución
AmpliTaq®
muestra
PCR por MM (µl )
(µl )
(µl )
test
1
4
6
8
10
32
48
64
80
96
7,6
11,4
15,2
19,0
22,8
0,32
0,48
0,64
0,80
0,96
12
14
16
18
20
112
128
144
160
176
26,6
30,4
34,2
38,0
41,8
1,12
1,28
1,44
1,60
1,76
22
24
26
28
30
208
224
240
256
272
49,4
53,2
57,0
60,8
64,6
2,08
2,24
2,40
2,56
2,72
40
42
44
46
48
352
384
400
416
432
83.6
91,2
95,0
98,8
102,6
3,52
3,84
4,00
4,16
4,32
96
864
206,0
9,00
NOTA: Para obtener un número impar de reacciones de la PCR por test, que no aparece en la
tabla anterior, tome el siguiente número par (p.ej. si se trata de 13 reacciones de PCR por test,
consulte los cálculos para 14 reacciones de PCR).
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
DISPOSICIÓN DE LA PLACA
Asegúrese de que la orientación de la placa es correcta añadiendo la mezcla de iniciador en el pocillo
número uno (también identificado por medio del uso de un colorante azul), con el número de lote
escrito en el lateral.
e.g HLA-X
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
IGNORE CUALQUIER OTRO NÚMERO DE LA PLACA
PREPARACIÓN DE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR (Efectuada en el área Post-PCR)
1.
Coloque la placa de AllSet+™ o CombiSet+™ SSP en el termociclador.
Programe el termociclador según los parámetros siguientes:
Paso
Desnaturalización
10 ciclos
20 ciclos
Temperatura
(˚c)
96
96
65
Tiempo
(sec.)
120
15
60
96
61
72
10
50
30
Acción
Desnaturalización
Desnaturalización
Hibridación
Extensión
Desnaturalización
Hibridación
Extensión
Diríjase al manual del fabricante si se necesita información específica sobre el
termociclador.
2.
3.
Inicie el programa.
Cuando se ha completado el programa, retire las muestras del termociclador.
NOTA: No lleve el ADN amplificado a la zona de amplificación Pre-PCR.
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
UTILIZACIÓN DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Nota: Se recomienda utilizar el mismo tampón tanto para la confección del gel como para la
electroforesis, es decir, si se utiliza tampón TBE (Trisborato-EDTA) 0,5 x en el gel, utilice también
TBE 0,5 x como tampón de la electroforesis.
1.
Prepare un gel de agarosa al 2% (w/v) (ABgene MultiABgarose, AG-0100c) en tampón TBE
0,5 x.
a)
Disuelva la agarosa (2g/100 ml de tampón TBE 0,5 x) calentándola en el microondas
hasta que esté totalmente disuelta.
• Enfríelo a 60˚C.
• Añada bromuro de etidio hasta una concentración final del gel de 0,5 µg/ml.
b)
Cree un gel de 3-4 mm de espesor con pocillos de 3 mm de profundidad.
• Déjelo reposar al menos 15 minutos.
2.
a)
Transfiera el gel de agarosa a una unidad de electroforesis horizontal. El gel debe
cubrirse con TBE 0,5 x hasta una altura de entre 1-2 mm.
• Retire el peine con cuidado
• Cargue todo el producto de la PCR ordenada, directa y cuidadosamente sobre
el gel.
3.
Corra los geles en tampón TBE 0,5 x.
Corra los minigeles (un gel con menos de 1cm entre electrodos) durante 10 minutos a 15
V/cm y los geles más grandes durante 15 minutos a 10 V/cm.
Para calcular el voltaje, mida la distancia (en centímetros) entre los ELECTRODOS en el
baño de electroforesis (la longitud del gel NO ES IMPORTANTE).
4.
Examine el gel con luz UV y conserve la documentación fotográfica.
1.
El mismo tampón TBE 0,5 puede utilizarse varias veces, pero el resultado obtenido
será mejor con un tampón nuevo.
ATENCIÓN:
El Bromuro de Etidio es un potente agente mutágeno. Utilice guantes de
nitrilo y protección ocular cuando se manipulen geles o soluciones que
contengan Bromuro de Etidio.
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
LÍMITES DEL PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
Debido a la alta sensibilidad analítica de la PCR, debe tenerse especial cuidado de preservar la
pureza de los reactivos y las mezclas de amplificación. Asegúrese de que el trabajo en el
laboratorio se efectúa de manera unidireccional y que el amplicón de PCR no se lleva al área de
preparación de la PCR. La pureza de los reactivos se puede mantener únicamente por medio de
buenas prácticas de laboratorio, y el funcionamiento del test sólo se garantiza si se cumplen
estrictamente los procedimientos especificados en este prospecto.
Los Tests Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ se han desarrollado utilizando sólo muestras de sangre
entera no heparinizada o muestras de ADN purificado. No se ha evaluado el funcionamiento con
otro tipo de muestras.
Las muestras de ADN proporcionan el molde para el proceso de amplificación por PCR, y su
calidad en términos de pureza y concentración debe estar inscrita en el rango establecido por
este procedimiento.
Con este producto puede utilizarse cualquier termociclador homologado cuyas especificaciones
sean equivalentes a las de una Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 9600 o 9700.
Asegúrese de que todos los instrumentos y equipos estén calibrados según las
recomendaciones del fabricante.
DATOS ESPERADOS
Control de Calidad
El Control de Calidad y la actualización de los productos para tipaje tisular basados en ADN son muy
importantes. Los oligonucleótidos sintetizados tienen que ser ampliamente probados frente a ADN
procedentes de líneas celulares conocidos. Las soluciones de cebador tienen que probarse tanto frente
a ADN positivos como negativos con secuencias altamente similares.
El procedimiento de control de calidad es el siguiente:
• Test del cebador sintetizado frente a un conjunto de ADN procedentes de líneas celulares
conocidas bien caracterizadas.
• Test de las soluciones de cebador específico frente a un conjunto de ADN positivos y negativos
• Test del equipo de SSP completo.
• Test del producto final.
Control Positivo Interno de la PCR
El par de iniciación control9 se incluye para verificar la eficiencia de la reacción de PCR. Su presencia
confirma que la falta de una amplificación específica en una reacción determinada es debida
efectivamente a la ausencia de ese polimorfismo en la muestra de ADN, y no debida a un fallo de la
amplificación por PCR.
Debido a las diferentes concentraciones y temperaturas de hibridación de los pares de cebadores
específicos comparados con el par de cebadores de control interno:
- La intensidad de la banda de control disminuye a menudo en presencia de una amplificación
específica y
- Los cebadores de control interno son más sensibles a las condiciones de PCR no óptimas y
pueden utilizarse para controlar la eficiencia de la PCR.
La amplificación fallida de los fragmentos de control interno en las calles sin amplificación específica
debe considerarse como señal de un sistema no óptimo. Diríjase a la sección de resolución de
problemas para ver las posibles razones de ello y las soluciones para corregirlo.
En el Folleto de información del producto específica para cada lote e incluido en cada kit, podrá
encontrar datos concretos relacionados con el Control positivo interno.
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Los alelos se asignan como consecuencia de la amplificación de un producto de PCR específico. Una
amplificación específica en una calle determinada indica que la muestra de ADN contiene el alelo, o un
alelo en un grupo de alelos, definidos por el par iniciador en esa reacción de PCR. La tabla de
interpretación suministrada con cada lote de producto puede ser utilizada para asignar qué alelos o grupo
de alelos identifican las respectivas soluciones de cebadores.
En muchos pero no en todos los Kits SSP Dynal AllSet+™ o CombiSet+™, cada alelo o grupo de alelos
se amplifica por medio de más de una solución de cebadores. Es importante verificar que todas las
demás soluciones de cebadores que deberían ser positivas por portar ese alelo o grupo de alelos son
efectivamente positivas.
Aunque los alelos se asignan como consecuencia de la amplificación de un producto de PCR, los tamaños
relativos de los productos de PCR pueden ser de ayuda a la hora de interpretar la determinación del SSP.
Los tamaños aproximados de los productos de PCR específicos pueden utilizarse con el fin de distinguir
una amplificación verdaderamente positiva de:
- artefactos por dimerización de iniciadores (primer dimers)
- arrastre desde de pocillos adyacentes
- amplificaciones no específicas
En la tabla de interpretación suministrada con cada Kit Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP se facilita la
secuencia de los tres nucleótidos terminales, lo que determina la especificidad del extremo 3’ de ambos
iniciadores, directo e inverso.
•
•
En los productos de HLA Clase I se proporciona la posición del nucleótido en el 2º, 3º y 4º exón
de hibridación del extremo 3’ de los iniciadores.
En los Kits AllSet+™ Clase II HLA SSP se proporciona la posición del codón correspondiente al
extremo 3’ de los iniciadores.
Si se dispone de la secuencia de un nuevo alelo que no está incluido en la tabla de interpretación, la
información sobre la secuencia del iniciador puede ser utilizada para descubrir el patrón de
amplificación del nuevo alelo. En este caso, contactar con el Departamento de Servicio Técnico vía email: [email protected] o por fax: +44 151 346 1223.
Interpretación utilizando Dynal SSPTool™
Dynal SSPTool™ es un programa informático especialmente diseñado para ayudar en la interpretación
de los resultados. Cada tabla de interpretación de un lote específico de cada kit individual AllSet+™ y
CombiSet+™ SSP está registrada en la base de datos del programa. La base de datos se actualiza
continuamente cada vez que se distribuyen nuevos lotes de producto.
Para cualquier duda e información sobre la introducción de resultados y el uso del programa
informático, consulte la sección de ayuda del SSPTool™.
Para hacer el pedido de una copia gratuita de Dynal SSPTool™ (código de producto 990.80), póngase
en contacto con el representante local de Dynal Biotech.
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INSTRUCCIONES DE USO
Kits Dynal AllSet+™ y CombiSet+™ SSP
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS
PROBLEMA
No existe amplificación
(ni de los fragmentos de
control interno ni
amplificación específica)
“
“
RAZÓN
Poca cantidad de ADN
El ADN contiene inhibidores de la PCR, p.ej. proteínas, etanol
(provenientes del proceso de precipitación).
El ADN se ha extraído de sangre heparinizada
“
El ADN se ha disuelto en un tampón que contiene EDTA
Fallo eventual de
amplificación
Si los tapones de los tubos de PCR no están bien cerrados se
puede producir evaporación y, subsecuentemente, un fallo de
amplificación
“
Error al cargar el gel
“
“
“
Señal débil de los
fragmentos de control
interno
“
“
“
“
Amplificación no
específica (ladders or
smears)
Señales de amplificación
cada vez más débiles
con el tiempo
“
Uso de pipetas no calibradas
Error al pipetear
La muestra de ADN, la Taq polimerasa o las premezclas de PCR
no han sido mezcladas correctamente antes de usarlas
“
Bandas indistinguibles y
borrosas
“
Las muestras con
amplicón no se pueden
cargar correctamente
Compruebe que se ha cargado el número correcto de pocillos y que
cada uno contiene aproximadamente el mismo volumen de mezcla
de PCR
Calibre de forma rutinaria todas las pipetas según las instrucciones
del fabricante
Pipetee con cuidado
Mezcle brevemente por medio del vortex antes de usarlas
Compruebe la concentración del ADN y ajustela a 50 ng/µl
Temperatura de hibridación demasiado alta, el termociclador no
está bien calibrado
Calibre el termociclador y compruebe el programa para PCR. Una
termocicladora que se utiliza habitualmente para PCR-SSP debe
calibrarse cada 6 meses.
La cantidad de la ADN polimerasa termoestable es muy pequeña
Utilice más enzima en las reacciones de PCR
La calidad de la ADN polimerasa termoestable es baja
Utilice Amplitaq® de Perkin-Elmer
ADN impuro
(Algunas mezclas de iniciador tienen una alta tendencia a dar
amplificaciones no específicas, consulte las notas al pie en cada
tabla de especificidad)
Todos los fragmentos más grandes que el fragmento de control
interno pueden descartarse
Compruebe la calidad del ADN
Repita la extracción del ADN
La ausencia de ADN también puede causar smears
La solución de bromuro de etidio para la tinción del gel de agarosa
es antigua
Prepare una nueva solución de bromuro de etidio para mejorar la
tinción del gel.
Una de las lámparas UV está rota
Compruebe el funcionamiento del equipo de luz UV.
Calibre el termociclador y compruebe el programa para PCR. Un
termociclador que se utiliza habitualmente para PCR-SSP debe
calibrarse cada 6 meses.
Use guantes, puntas de pipeta con filtro, utilice zonas diferentes para
pre y postPCR. Manipule las muestras correctamente durante todo
el proceso. Compruebe la existencia de contaminación utilizando los
iniciadores de control de contaminación de Dynal (código de
producto 990.05)
Compruebe la calidad del ADN. Repita la extracción del ADN con
soluciones recientes.
Calibre el termociclador y compruebe el programa para PCR. Un
termociclador que se utiliza habitualmente para PCR-SSP debe
calibrarse cada 6 meses.
Compruebe que el número de lote del producto coincide con el de la
tabla de interpretación utilizada.
Compruebe que todas las amplificaciones específicas son de
tamaño correcto o si un artefacto (arrastre, primer-dimer) ha sido
interpretado como una amplificación
Repita el tipaje. Si es posible reproducir el nuevo patrón de
amplificación, contacte con el representante local de Dynal Biotech
para información sobre el patrón de amplificación de estos alelos.
Utilice el tampón TBE recomendado.
Córralo a menor voltaje
Utilice peines finos (4x1 mm)
Utilice el tampón recomendado TBE 0,5 x tanto para el gel como
para el tampón de electroforesis.
Pipetear correctamente
Pueden ser causados por contaminación
“
Repita la extracción del ADN y disuelva el ADN en agua estéril
Asegúrese de que todos los tapones están bien cerrados
Utilice herramienta específica de tapado
Poca cantidad de ADN
Falsos positivos en las
amplificaciones
Patrones de
amplificación extraños
Compruebe la calidad del ADN. Siga exactamente los pasos del
método de extracción recomendado por el fabricante.
Pruebe algún método alternativo de extracción del ADN
Extraiga el ADN de nuevo
Utilice sangre no heparinizada, intente tratamiento con heparinasa (
Ver Ref. 8)
Compruebe la calidad del ADN. Repita la extracción del ADN con
soluciones recientes.
Temperatura de hibridación demasiado alta, el termociclador no
está bien calibrado
“
Compruebe que el volumen y la concentración del ADN utilizado son
correctos.
ADN impuro
Falsos negativos en las
amplificaciones
“
SOLUCIÓN
ADN Impuro
Temperatura de hibridación demasiado baja, el termociclador no
está bien calibrado
Se ha utilizado una tabla de interpretación equivocada
El modelo de amplificación contiene un falso positivo
Alelo nuevo que no aparece en la tabla de interpretación
Puede que el tampón esté caliente
El peine utilizado tiene las ranuras demasiado anchas
Se han utilizado tampones diferentes
El tampón de electroforesis es incompatible con el amplicón de PCR.
Presencia de burbujas de aire en la pipeta
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BIBLIOGRAFÍA
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que constan sobre los viales y el etiquetado externo, hasta su fecha de caducidad. Esta garantía limita la
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Dynal Biotech, o devolverle, a elección de Dynal Biotech, el precio de la compra en efectivo.
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Dynal® es una marca registrada de DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norway
AllSet™ y AllSet+™ son marcas registradas de DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norway
DynaMix™ es una marca registrada de DYNAL BIOTECH Ltd., U.K.
CombiSet™ y CombiSet+™ son marcas registradas de DYNAL BIOTECH., U.K.
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AmpliTaq® es una marca registrada de Roche Molecular Systems, Inc. USA.
Electro-Fast® es una marca registrada de Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene®)
GeneAmp® es una marca registrada de Roche Molecular Systems, Inc. USA
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* Los productos Dynal SSP se venden bajo licencia de ZENECA Ltd. ARMS™ al amparo de la Patente Europea
Nº 0332435 y con la correspondiente patente mundial. ARMS™ es una marca registrada de ZENECA Ltd.
** Este producto es adecuado para su utilización en el proceso de Reacción en Cadena de la Polimerasa
(“PCR”) cuyas patentes pertenecen a Roche Molecular Systems Inc. y F. Hoffmann-La Roche Ltd (“Roche”).
La licencia para la utilización de estas patentes de uso de la técnica de PCR no está incluida implícita ni
explícitamente en la compra de este producto. Para más información sobre la obtención de licencias para el
uso del proceso de PCR en los Estados Unidos, póngase en contacto con el Director de Licencias de Roche
Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, o fuera de los Estados Unidos con
el Gerente de Licencias de PCR en F. Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basilea, Suiza.
Fabricado por Dynal Biotech Ltd., U.K.
Desarrollado por Dynal Biotech Ltd., U.K.
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PO Box 114 Smestad,
N-0309, Oslo, Norway
Tel: +47 2206 1000
Fax: +47 22 50 70 15
E-mail: [email protected]
Internet: http://www.dynalbiotech.com
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Bramfelder Chaussee 41
22177 Hamburg, Germany
Tel: +49 40 36 15 73-0
Fax: +49 40 36 15 73-30
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