Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Ciencias
Profesor patrocinante:
Dr. Juan Guillermo Cárcamo M.
Instituto de Bioquímica
Facultad de Ciencias
Universidad Austral de Chile
EFECTO DEL BENZOATO DE EMAMECTINA SOBRE LOS NIVELES DE
EXPRESIÓN Y ACTIVIDAD DE PROTEÍNAS DE METABOLIZACIÓN EN CÁLIGUS
(Caligus rogercresseyi) Y SU HUÉSPED TRUCHA ARCOIRIS (Oncorhynchus
mykiss).
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar
al Grado de Licenciado en
Ciencias Biológicas.
CLAUDIA ALEJANDRA BARRIENTOS MANSILLA
VALDIVIA – CHILE
2009
Por mi pequeño príncipe
Gracias hijo
AGRADECIMIENTOS
Agradezco sinceramente, en primer lugar, a mi profesor patrocinante Juan Guillermo
Cárcamo, por haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo de tesis en su
laboratorio, por estar siempre disponible ante las inquietudes y entregando el apoyo
constante que se necesita para lograr resultados rápidos.
También agradezco en forma muy especial a Marcelo, sin su ayuda no hubiera logrado
terminar este trabajo dentro de un semestre, agradezco su preocupación y apoyo
constante dentro del laboratorio y de lo que fue mi formación de pregrado. Y como no
agradecer al profesor José Núñez (el pepe) por todo lo que me enseñó y apoyó en
algún momento, inolvidables sus interesantes clases de biología integrativa.
Como no agradecer, los entretenidos momentos compartidos con los compañeros y
profes del laboratorio 6, a todos quienes fueron en algún momento un aporte, Cony,
Monse, Marcelo, Andrés, Sebastián, Lili, Jonathan, Gabriel, profe Wili, profe Claudia y
profe Rody, sólo por nombrar algunos.
Por último agradecer a mi familia, mi mamá y hnos, quienes siempre han estado desde
la distancia apoyándome en todo, quienes estuvieron durante toda esta etapa
involucrados en mi formación. A mi amigos Carmen, Belén, Anita, Cecilia, Marcelo y
Osvaldo por los inolvidables momentos vividos durante los años de carrera, por todas
las enseñanzas y consejos, gracias son inolvidables.
Este trabajo de tesis se realizó gracias a los aportes de los proyectos Fondecyt
1090422 y DID UACH.
I
INDICE DE CONTENIDOS
PÁG.
INDICE DE CONTENIDOS
I
INDICE DE FIGURAS
V
INDICE DE TABLAS
VII
1.- RESUMEN
1
SUMMARY
3
2.- INTRODUCCIÓN
4
2.1 Caligus rogercresseyi parásito de salmónidos, actual problemática en Chile.
4
2.2 Tratamientos autorizados en Chile contra la caligidosis.
8
2.2.1 Benzoato de Emamectina (EMB).
9
2.2.2 Deltametrina
10
2.3 Mecanismos involucrados en el desarrollo de resistencia a xenobióticos.
11
2.4 Biotransformación de xenobióticos: Fase I y Fase II
13
2.4.1 Enzimas del complejo Citocromo P450, Flavín monooxigenasa
(FMO) y Glutation S Transferasa (GST).
16
2.4.1.1. Citocromo P450 1A y 3A
17
2.4.1.2 Flavín monooxigenasa (FMO).
19
2.4.1.3 Glutation S Transferasa (GST).
20
2.5. Fenómeno Resistencia a Múltiples Drogas (MDR), asociación con los
21
procesos de biotransformación.
2.5.1. P- glicoproteína (P-gp).
22
II
2.5.2. MRP1
24
2.6 Hipótesis
26
2.7 Objetivo General
26
2.8 Objetivos Específicos
26
3.- MATERIAL Y MÉTODOS
28
3.1
Obtención de Especímenes
28
3.2
Aislamiento y cuantificación de RNA total
29
3.3
Síntesis de cDNA
30
3.4
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
30
3.5
Fraccionamiento de DNA en geles de agarosa
30
3.6
Cuantificación de bandas de PCR
32
3.7
Análisis de Western blot
32
3.7.1 Electroforesis en geles de poliacrilamida, electrotransferencia
33
e inmunotinción de electrotransferidos.
3.7.1.1 Separación de proteínas por SDS-PAGE
33
3.7.1.2 Preparación de geles de poliacrilamida al 12,5%
34
3.7.1.3 Electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa
34
3.7.1.4 Inmunorevelado de electrotransferidos
35
3.8
35
Ensayos de actividad enzimática
3.8.1 Actividad CYP1A en tejidos de Trucha Arcoiris
36
3.8.2 Actividad GST en tejidos de Trucha Arcoiris
37
3.9
39
Estadística
III
4.- RESULTADOS
40
4.1
40
Extracción de RNA desde Caligus rogercresseyi y tejidos de Oncorhynchus
mykiss con y sin tratamiento de Benzoato de Emamectina (EMB).
4.2
RT-PCR de enzimas CYP450 (CYP1A y CYP3A), FMO, GST y de
40
proteínas MDR (P-gp y MRP1) en tejidos de Oncorhynchus mykiss
y Caligus rogercresseyi.
4.2.1 Expresión de mRNA de Citocromo P450 1A (CYP1A)
41
4.2.2 Expresión de mRNA de Citocromo P450 3A (CYP3A)
41
4.2.3 Expresión de mRNA de Flavín monooxigenasa (FMO1)
43
4.2.4 Expresión de mRNA de Glutation S Transferasa (GST)
46
4.2.5 Expresión de mRNA de P-glicoproteína (P-gp)
48
4.2.6 Expresión de mRNA de MRP1
48
4.3
51
Expresión de la proteína FMO-1 en tejidos de trucha arcoiris y en
homogenizados de cáligus mediante western blot.
4.3.1 Expresión de GST en tejidos de trucha arcoiris.
53
4.3.2 Expresión de FMO-1 en Caligus rogercresseyi
53
4.3.3 Expresión de GST en tejidos de Oncorhynchus mykiss
53
4.4
53
Actividad Enzimática en tejidos de Oncorhynchus mykiss.
4.4.1 Actividad CYP1A en distintos tejidos de Oncorhynchus mykiss
56
4.4.1.1 Actividad CYP1A en Hígado de trucha arcoiris
56
4.4.1.2 Actividad CYP1A en Músculo de trucha arcoiris
58
4.4.1.3 Actividad CYP1A en Branquias de trucha arcoiris
58
4.4.2 Actividad GST en distintos tejidos de Oncorhynchus mykiss
61
IV
4.4.2.1 Actividad enzimática GST en Hígado de trucha arcoiris
61
4.4.2.2 Actividad enzimática GST en Músculo de trucha arcoiris
63
4.4.2.3 Actividad enzimática GST en Branquias de trucha arcoiris
63
5.- DISCUSIÓN
67
6.- BIBLIOGRAFÍA
77
V
INDICE DE FIGURAS
FIGURA 1
Estadíos de desarrollo del ciclo de vida de Caligus rogercresseyi
6
FIGURA 2
Metabolismo de un xenobiótico al ingresar a la célula
15
FIGURA 3
Modelo de transporte de la resistencia a multidrogas
23
FIGURA 4
Niveles de expresión de CYP1A en Oncorynchus mykiss
42
y Caligus rogercresseyi
FIGURA 5
Niveles de expresión de CYP3A en Oncorynchus mykiss
44
y Caligus rogercresseyi
FIGURA 6
Niveles de expresión de FMO-1 en Oncorynchus mykiss
45
y Caligus rogercresseyi
FIGURA 7
Niveles de expresión de Glutation S Transferasa en Oncorynchus
47
mykiss y Caligus rogercresseyi
FIGURA 8
Niveles de expresión de P-glicoproteína en Oncorynchus mykiss
49
y Caligus rogercresseyi
FIGURA 9
Niveles de expresión de MRP1 en Oncorynchus mykiss y Caligus
50
rogercresseyi
FIGURA 10 Expresión de FMO-1 en distintos tejidos de Oncorynchus mykiss
54
y en homogenizado de Caligus rogercresseyi
FIGURA 11 Expresión de GST en distintos tejidos de Oncorynchus mykiss.
55
FIGURA 12 Actividad CYP1A en Hígado de Oncorynchus mykiss
57
FIGURA 13 Actividad CYP1A en Branquias de Oncorynchus mykiss
59
FIGURA 14 Actividad CYP1A en Músculo de Oncorynchus mykiss
60
FIGURA 15 Actividad GST en Hígado de Oncorynchus mykiss
62
VI
FIGURA 16 Actividad GST en Branquias de Oncorynchus mykiss
64
FIGURA 17 Actividad GST en Músculo de Oncorynchus mykiss
65
VII
INDICE DE TABLAS
TABLA 1
Partidores para RT-PCR y tamaño del amplicón
31
TABLA 2
Resumen de los porcentajes de sobreexpresión medidos por RT-PCR,
de las enzimas que participan en el metabolismo de xenobióticos en
distintos tejidos de Oncorhynchus mykiss y en
Caligus rogercresseyi tratados con (EMB)
TABLA 3
homogenizados de
52
Resumen de las velocidades iniciales para las actividades enzimáticas
CYP1A y GST en distintos tejidos
condiciones basales
de
Oncorhynchus mykiss en
66
1
1.- RESUMEN
Caligus rogercresseyi es un copépodo ectoparásito de peces, que afecta principalmente
a los salmónidos en cultivo en Chile, se ha constituido en un parásito permanente para
esta industria, provocando millonarias pérdidas económicas. Las erosiones causadas
por este parásito en la piel, además de alterar la calidad de la carne de los peces,
constituyen la puerta de entrada para otros patógenos de gran impacto económico en
esta industria. Actualmente en nuestro país, los fármacos autorizados para el control de
cáligus son, Benzoato de Emamectina (EMB), el piretroide sintético, Deltametrina (DM)
y muy recientemente, Diflubenzuron. A partir del año 2006, esta parasitosis se mostró
particularmente resistente a los tratamientos convencionales con EMB y DM. Por tanto,
en esta tesis se evaluó la expresión de proteínas posiblemente asociadas a
mecanismos de resistencia farmacológica, mediante RT-PCR y Western blot, y además
se determinó la funcionalidad de algunas de ellas mediante ensayos enzimáticos. Las
proteínas evaluadas fueron CYP1A, CYP3A, Flavín monooxigenasa, Glutation S
Transferasa, y las proteínas MDRs, P-gp y MRP1, en homogenizados de especímenes
de Cáligus y en distintos tejidos de Trucha Arcoiris (Oncorhynchus mykiss), tales como
hígado, branquias y músculo, tanto en peces tratados con EMB y peces control. En las
muestras tratadas con EMB se evidenció una sobreexpresión de todas las proteínas
analizadas. Estos resultados sugieren que el fármaco se metabolizaría fuertemente en
el organismo del pez y posiblemente no llegaría en la dosis adecuada al parásito
Caligus rogercresseyi, haciendo que el tratamiento no sea completamente eficaz. Sin
duda, estos resultados permitirán profundizar en la identificación de los mecanismos
involucrados en la resistencia de Cáligus a los tratamientos farmacológicos y proponer
2
además estrategias para revertir esta resistencia y escoger terapias nuevas y efectivas
contra esta parasitosis.
3
SUMMARY
Caligus rogercresseyi is a copepod ectoparasite of fish, mainly affecting cultured
salmonids in Chile; the parasite has become permanent in this industry, causing
economic losses of millions of USD. The erosions caused by this parasite in the fish´s
skin, alter the quality of beef and fish health, and these erosions are the gateway to
other pathogens of great economic impact on the salmon industry. Currently in our
country the approved drugs for the control of caligus are, Emamectin Benzoate (EMB),
the synthetic pyrethroid, Deltamethrin (DM), and very recently, Diflubenzuron. Since
2006, this parasite has been particularly resistant to conventional treatment with EMB
and DM. Therefore, in this thesis we evaluated the expression of proteins potentially
associated with drug resistance mechanisms by RT-PCR and Western blot, also
determined the functionality of any of them by enzymatic assays. The proteins evaluated
were CYP1A, CYP3A, Flavin Monooxygenase, Glutathione S Transferase, and MDRs,
P-gp protein and MRP1, in homogenates of specimens of Caligus and in different
tissues of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), such as liver, gills and muscle, in
treated fish with EMB and control fish. The treated samples with EMB showed overexpression of all proteins analyzed. These results suggest that the drug may be strongly
metabolized by the fish and may not arrive at the proper dose at the parasite Caligus
rogercresseyi, making the treatment is not completely effective. Clearly, these results
will allow further work on identifying the mechanisms involved in resistance of caligus to
drug treatments and propose further strategies to reverse this resistance and to choose
new and effective therapies against this parasite.
4
2.- INTRODUCCIÓN
2.1.- Caligus rogercresseyi parásito de salmónidos, actual problemática en Chile.
Los piojos de mar (Copepoda, Caligidae) son las especies reportadas con mayor
frecuencia en peces cultivados en ambientes marinos del mundo (Krkrosek et al. 2005;
Eichner et al. 2008; Lees et al. 2008; Skugor et al. 2008). En Chile, existe una amplia
variedad de especies de copépodos descritos, incluso en peces marinos silvestres
(Stuardo and Fagetti, 1961). Sin embargo, se reconocen dos especies por su
significativo impacto económico, Caligus rogercresseyi (Boxshall and Bravo, 2000) y
Caligus teres (Wilson, 1905; Reyes and Bravo; 1983) (Bravo et al., 2008). El control de
las infecciones por piojos de mar ha sido uno de los principales problemas para la
industria salmonera desde 1982, cuando C. teres infestó al salmón Coho (Bravo et al.,
2008). El parásito dominante, que en los últimos años ha estado afectando
considerablemente a la industria de salmónidos (Grant, 2002), presentándose en un
99% de los centros de cultivo (González and Carvajal 2003) es Caligus royercresseyi.
Entre los especímenes de salmónidos más susceptibles a la infección por cáligus están
la trucha arcoiris Oncorhynchus mykiss y el salmón del Atlántico Salmo salar, mientras
que el salmón Coho Oncorhynchus kisutch es bastante menos infectado (González,
2005) causando millonarias pérdidas a dicho sector productivo.
La familia Caligidae posee 27 géneros, que reúnen cerca de 400 especies. Todos ellos
viven en agua salada, y regularmente se les encuentra parasitando peces teleósteos
5
(Kabata, 2003). La dieta de los piojos de mar depende de los estados de desarrollo,
pero consiste principalmente de mucus (Egidius, 1985), células epiteliales (Kabata,
1974) y sangre (Brandal et al., 1976). Las adaptaciones de Caligus rogercresseyi a la
vida parásita consideran: un cuerpo aplanado dorsoventralmente que le permiten
adherirse a su huésped presionando el cefalotórax en forma de escudo como una
ventosa sobre la piel del pez; presencia de un cono oral que funciona como un sifón;
modificación de la segunda antena y estructuras orales (maxilípedos), usados como
ganchos para sostenerse; y el desarrollo en los juveniles del copépodo (chalimus) de un
filamento rostral que lo fija al huésped. El ciclo de vida (Fig. 1) está compuesto por ocho
estados de desarrollo, tres planctónicos y cinco parasíticos. Los estados planctónicos
comprenden dos estados nauplius y un copepodito, y los estados parasíticos incluyen
cuatro estados chalimus, un juvenil y un adulto. El copepodito es el estadío infectante y
el de mayor importancia biológica, ya que sin éste no se produciría la metamorfosis y el
subsiguiente desarrollo del ciclo. La metamorfosis redunda en la producción de un
filamento frontal elaborado por la glándula del cemento que se encuentra en la parte
anterior del cefalotórax, muy cercano a la parte anterior de los ojos para la especie
Caligus elongatus (Piasecki and MacKinnon, 1992). Una vez producido este filamento
como respuesta al estímulo del hospedero, comienza a producirse la metamorfosis al
primer estadío parásito que habita sobre el pez, el chalimus I.
6
Figura 1. Estadíos de desarrollo del Ciclo de vida de Caligus rogercresseyi.
n1: Nauplius I n2: Nauplius 2 cop: Copepodito ch1: Chalimus I ch2: Chalimus II
ch3: Chalimus III ch4: Chalimus IV ( yaf: hembras juveniles y yam: machos juveniles)
af: Adulto (hembra) am: Adulto (macho ). Tomado de González y Carvajal, (2003).
7
La sobrevivencia de la fase larval de Caligus rogercresseyi en el plancton dura hasta 10
días nadando sin requerir alimento, ya que se alimentan del vitelo presente en su
cuerpo desde la fase huevo. No seleccionan entre peces nativos o salmónidos, pero sí
por zonas del pez, particularmente aletas y escamas de la región del vientre.
Este piojo es transmitido a los salmónidos según Carvajal et al. (1998) desde el róbalo
Eleginops maclovinus, el reservorio natural del parásito, también se ha reportado en el
pejerrey Odonthestes regia y en el lenguado de ojo chico Paralichthys microps, con
cargas parasitarias relativamente bajas, a diferencia de los salmones de cultivo, en
donde el parásito ha encontrado un hospedero ideal (Bravo et al. 2008). Cáligus ataca
la piel de su huésped y se alimenta del mucus, causando extensas lesiones en la
musculatura tales como erosiones y daños enzimáticos, causándole a su huésped
estrés, pérdida de apetito, debilitamiento general, pudiendo incluso ocasionar fallas
osmorregulatorias y una posterior muerte del pez (Pike and Wadsworth, 1999). Esta
enfermedad parasitaria puede causar importantes retrasos en el crecimiento de los
salmónidos (Moller and Anders, 1986) y una abrupta disminución en la calidad de la
carne. Los daños en la piel sirven como entrada para algunos patógenos tales como
Vibrio, Aeromonas, Streptococcus y Piscirickttsia salmonis y algunos virus (Wootten et
al., 1982), como el ISA (Anemia Infecciosa del Salmón), donde cáligus, pudiera actuar
como vector (Nylund et al., 1993; 1994). Cáligus es el parásito más importante de
salmónidos, por sus efectos negativos en sobrevivencia, crecimiento y aumento en la
susceptibilidad a infecciones resultando en un serio problema económico para la
acuicultura chilena (Bravo et al., 2008).
8
2.2.- Tratamientos autorizados en Chile contra la caligidosis.
Las estrategias de control que se aplican en la actualidad en las empresas salmoneras
del país para la infección por cáligus, se basan, principalmente, en el uso de
antiparasitarios. A la fecha se han registrado para el tratamiento contra este parásito,
los fármacos Benzoato de Emamectina (EMB, una avermectina), Deltametrina (un
piretroide sintético) (Caligus Control Plan Sernapesca 2007, Aquaculture unit,
Sernapesca-Chile) y durante el año 2009 por resolución del SAG (Servicio Agrícola
Ganadero), se autorizó el Diflubenzuron, un inhibidor de la síntesis de quitina que forma
la caparazón.
El Benzoato de Emamectina (EMB) en el 2000 fue aprobada por la autoridad oficial
chilena como única terapia para ser usada en el control de cáligus, usada como
tratamiento en la alimentación de los peces, fue por muchos años el primer y único
tratamiento convencional autorizado; por su eficacia contra todos los estadíos de
infección por piojos de mar (Stone et al., 2000). Luego, el 2007 el “Programa de Control
y Vigilancia de cáligus” autorizó el tratamiento de baño con piretroide sintético,
Deltametrina, debido a la resistencia provocada por Emamectina en cáligus, se optó por
la alternancia de ambos tratamientos, pero la respuesta observada no fue satisfactoria,
por lo tanto, en la actualidad Caligus rogercresseyi es un parásito muy resistente a
estos tratamientos.
En la actualidad, la industria nacional cuenta con otras alternativas de tratamiento, que
está siendo monitoreadas, entre ellas Cipermetrina (piretroide), Peróxido de Hidrógeno,
9
Teflubenzuron y Diflubenzuron, cada uno de ellos con distintas ventajas y limitantes. En
el caso del diflubenzuron (LepsidonTM) y teflubenzuron (CalicidaeTM), actúa sobre los
estadíos de desarrollo que realizan muda (chalimus y preadultos), ya que inhibe la
síntesis de quitina que forma la caparazón. En ausencia de quitina, la cutícula se vuelve
frágil y delgada, impidiendo que el parásito sobreviva a los rigores de la muda. Estos
productos han sido aprobados en Noruega, Escocia e Irlanda (Grant, 2002; Denholm et
al. 2002; Bravo et al. 2008).
2.2.1. Benzoato de Emamectina (EMB).
El Benzoato de Emamectina (EMB), es un tipo de lactona macrocíclica, que se
administra como aditivo alimenticio para el tratamiento contra piojos de mar (por
ejemplo en Lepeophtheirus salmonis y Caligus elongatus) de peces salmónidos
(Sevatdal et al., 2005). Es un derivado semi-sintético de avermectina, producido por
Streptomyces avermitilis (Roberts and Hutson, 1999). EMB representa uno de los
compuestos más usados y más efectivos para el control de las infecciones de piojos de
mar, elimina todos los estados parasíticos, por ejemplo chalimus, pre-adultos y adultos
incluyendo los estados de gravidez de las hembras (Stone et al. 2000).
Los medicamentos administrados en la alimentación suelen ser clínicamente más
efectivos, dado que el Benzoato de Emamectina puede ser absorbido por el intestino,
es distribuido y secretado en el mucus y consumido por el parásito. Se trata de un
antiparasitario que es muy bien absorbido y menos de un 10% es excretado por el pez.
La dosis que se utiliza es 50 μg de ingrediente activo por Kg de biomasa durante siete
10
días consecutivos (99% de eficacia; Schering-Plough Animal Health), protegiendo entre
10 y 12 semanas los sitios expuestos. El benzoato de emamectina está autorizado en
Escocia, Noruega, Irlanda y Chile. Es un tipo de avermectina semisintética, que actúa
sobre el sistema nervioso periférico, específicamente sobre los receptores GABA (ácido
gamma-aminobutírico). Este compuesto estimula la liberación de neurotransmisores
GABA desde las terminaciones nerviosas, los cuales, posteriormente, se van a unir en
sitios específicos de la membrana de células musculares, provocando un incremento en
el flujo de iones cloruro hacia la célula (Grant, 2002; Sevatdal et al., 2005), con una
consecuente hiperpolarización y eliminación de la señal de transducción, dando por
resultado una inhibición de los neurotransmisores (Grant, 2002). Cuando se administra
al pez, este rápidamente lo absorbe en el intestino debido a su naturaleza lipofílica y es
distribuido hacia áreas tales como piel y mucus (Kim-Kang et al., 2004; Sevatdal et al.,
2005), con la finalidad de ser consumido por el parásito, causándole efectos paralíticos
en la locomoción (Clark, 1994).
2.2.2 Deltametrina
Es una formulación líquida de piretroides sintéticos para uso tópico, se administra
mediante baños a una dosis de 5 μg de ingrediente activo por litro durante una hora.
Actúa contra los estados móviles y juveniles de los piojos de mar. Animales tratados
con piretroides no pueden ser consumidos por humanos hasta después de 24 horas de
tratamiento. Los piretroides están autorizados en Escocia, Irlanda, Noruega y Chile,
representan una gran clase de insecticidas ampliamente usados para el control de
pestes en animales y plantas. El modo de acción se cree que es debido principalmente
11
a la interferencia con los canales de sodio en la membrana del axón (Soderland and
Bloomquist, 1989). Se ha demostrado que en insectos los piretroides sintéticos se unen
a los canales de sodio, prolongando su apertura, causando inconciencia y muerte del
parásito.
2.3.- Mecanismos involucrados en el desarrollo de resistencia a xenobióticos.
El fenómeno resistencia está determinado por los sobrevivientes del tratamiento que
contribuyen con sus genes a las generaciones futuras. Los genes que transmiten
resistencia, probablemente, se incrementan repetidamente por mutación, pero en la
ausencia de exposición a algún químico o tóxico, estos genes permanecen en una muy
baja frecuencia en las poblaciones consideradas plagas (Denholm, 2002). Con la
exposición repetitiva a algún tratamiento empleado para su control, los individuos que
poseen estos genes son selectivamente favorecidos (Sevatdal, 2005) e incrementan en
frecuencia (Denholm and Rowland, 1992). Durante los primeros estados de selección,
el número de sobrevivientes resistentes puede ser tan pequeño que puede tener un
impacto imperceptible sobre la calidad del control, sin embargo, estos individuos
eventualmente alcanzan un nivel en el cual las dificultades de control se hacen
aparentes, porque están molecularmente capacitados para resistir el efecto del fármaco,
lo cual es heredado de generación en generación. La velocidad a la cual se incrementa
la resistencia, y el grado de resistencia que puede ser tolerado, depende de una serie
de factores interrelacionados, incluyendo la naturaleza del daño infringido por una
plaga, la potencia del mecanismo de resistencia, la frecuencia de uso del fármaco en
cuestión y la biología de la plaga (Denholm, 2002).
12
Actualmente, la resistencia se explica sobre la base de factores multidimensionales,
dependientes de la ecología, fisiología, bioquímica y genética de los parásitos, teniendo
en cuenta que todo esto varía con la especie, las poblaciones y la localización
geográfica. La cantidad de parásitos resistentes en las poblaciones depende del
volumen y la frecuencia de aplicación de los pesticidas que se han empleado contra
ellos y de las características inherentes de la especie involucrada. Un ejemplo son los
piojos, que poseen ciclos de vida cortos con abundante descendencia y rasgos
esenciales para el desarrollo de la resistencia (Denholm, 2002).
De todos los factores que pueden explicar la resistencia a algún fármaco, esta tesis está
enfocada en uno de los posibles mecanismos que pueden explicar la insensibilidad a
algún tipo de fármaco en particular, el cual se asocia a alteraciones en la actividad de
proteínas de metabolización, como el sistema Citocromo P-450, particularmente las
enzimas CYP1A, CYP3A, monooxigenasas, (Liu and Scout, 1995; Soderland and
Bloomquist, 1989) y Glutation S-Transferasa (Khambay and Jewess, 2005); y por otro
lado la sobreexpresión de algunos miembros de la familia ABC, particularmente
aquellos involucrados en el fenómeno Resistencia a Múltiples Drogas (MDR), tales
como P-glicoproteína (Pgp) y la proteína MRP1, miembro de la familia MRP (Proteínas
asociadas a resistencia a múltiples drogas), las cuales contribuirían a la aparición del
desarrollo de resistencia a las avermectinas según Didier and Loor (1995; 1996) y
Tribble et al, (2008). Por lo tanto, es esperable que una sobreexpresión de proteínas
CYP-450 y MDR o un incremento de sus actividades en el parásito y/o huésped puedan
promover la resistencia a los tratamientos con Benzoato de Emamectina (EMB).
13
Por ejemplo, Sevatdal (2005) reportó que tras la absorción sistémica de Benzoato de
Emamectina (EMB) en el parásito y huésped, las enzimas citocromo P-450 limitan
considerablemente la vida media y la bio-disponibilidad del antiparasitario, provocando
la inactivación metabólica. Así mismo, señala que los tratamientos repetitivos pueden
conducir a una selección de especímenes expresando altos contenidos de enzimas
metabolizadoras,
especialmente
de
monooxigenasas,
hecho
observado
en
Lepeophtheirus salmonis, especie de piojo de mar del hemisferio norte. Esto podría
ayudar a explicar el nuevo escenario que enfrenta la salmonicultura chilena, dado que
C. rogercresseyi disminuyó su sensibilidad a los tratamientos de Emamectina.
2.4.- Biotransformación de xenobióticos: Fase I y Fase II
Las enzimas de biotransformación en peces se expresan mayormente en tejidos como
hígado, también intestino, riñón, branquias y sistema olfatorio (Stegeman, 1989;
Smolowitz et al, 1992; Monod et al, 1994; Buhler and Wang-Buhler, 1998). Miranda et
al. (1989) encontró en hígado de trucha arcoiris isoformas constitutivas CYP2K1,
CYP2M1 Y CYP3A27, las mismas visualizadas en diferentes tejidos de trucha arcoiris
por Cok et al. (1998). Sin embargo, Bohne et al. (2007) considera a las isoformas
CYP1A, CYP3A y GST las principales enzimas involucradas en la biotransformación de
xenobióticos.
En general, al conjunto de procesos enzimáticos a los que se ven sometidos los
xenobióticos en el organismo para llevar a cabo su neutralización y eliminación se le
conoce como reacciones de biotransformación o de metabolización de xenobióticos
(Fig. 2). Aún cuando, estos procesos cumplen un rol clave en la detoxificación,
14
bioactivación y bioacumulación de xenobióticos en peces no han sido caracterizados,
como lo han sido en mamíferos (Nabb et al, 2006).
15
FASE I
R
FASE II
R-O
R
R-O-conjugado
GST
XENOBIÓTICO
CYP450
CÉLULA
Medio extracelular
Figura 2. Metabolismo de un xenobiótico al ingresar a la célula. El
xenobiótico es reconocido por la célula como una señal exógena
mediante diversos mecanismos de recepción y entra a la célula por
difusión pasiva o mediante transportadores activos. Una vez dentro
actúan las enzimas de la fase I (principalmente el sistema CYP450),
luego las enzimas de la fase II son las encargadas de la conjugación
de los metabolitos producidos por los primeros, entre las que se
encuentran por ejemplo la enzima GST, cuando la conjugación es con
GSH (Glutation reducido), formando productos más solubles en agua,
los cuales luego serán excretados desde la célula al medio
extracelular.
16
Tradicionalmente estos procesos se han agrupado en dos fases. En la fase I los
xenobióticos son modificados mediante reacciones de oxidación, reducción o hidrólisis y
convertidos en productos más hidrosolubles gracias a la aparición de nuevos grupos
funcionales de carácter polar (hidroxilo, amino, carboxilo). En la fase II los xenobióticos,
o los metabolitos generados por las reacciones de la fase I, se combinan con moléculas
endógenas de carácter polar para formar productos de conjugación que son
rápidamente excretados. En general, las enzimas de la fase I son capaces de
transformar múltiples substratos y catalizar reacciones diferentes. Se trata de proteínas
catalíticas de naturaleza muy diversa entre las que se incluyen enzimas con actividad
monooxigenasa, como las pertenecientes al complejo citocromo P-450 o la flavín
monooxigenasa (FMO), entre otras. Y de ellas las del complejo citocromo P-450 son,
sin duda, las más destacadas de este grupo de enzimas y las que han sido más
ampliamente estudiadas (Donato, 2004) y participarían en la detoxificación de
xenobióticos en piojos marinos (Sevatdal et al, 2005).
2.4.1.- Enzimas del complejo Citocromo P450, Flavín monooxigenasa (FMO) y
Glutation S Transferasa (GST).
El citocromo P450 (CYP1, CYP2 y CYP3) y FMOs son las principales enzimas
responsable del metabolismo oxidativo de los xenobióticos en la fase I y UDPGT y GST
son representativas de los procesos de conjugación de la fase II. CYPs constituye una
superfamilia de proteínas que están presentes en procariontes y eucariontes
(Degtyarenko and Archakov, 1993; Honkakoski and Negishi, 2000; Doddapaneni et al,
2005). En peces se han descubierto múltiples formas de CYPs, predominantemente en
hígado, pero también en bajas concentraciones en otros tejidos como intestino (Buhler
17
and Wang-Buhler, 1998). Una de las características más significativas de los P450 que
metabolizan xenobióticos es su baja especificidad, lo que permite que sean capaces de
metabolizar un número casi ilimitado de substratos, principalmente a través de
reacciones de oxidación, pero también de reducción e hidrólisis. Las oxidaciones
catalizadas por el P450 son reacciones de monooxigenación dependientes de NADPH y
para las que utiliza oxigeno molecular. Como consecuencia de estas reacciones el P450
acelera la eliminación del organismo de gran número de fármacos y compuestos
tóxicos. En los peces, CYP1A, CYP3A, UDPGT y GST son las principales enzimas
involucradas en la biotransformación de xenobióticos (Bohne et al., 2007).
2.4.1.1. Citocromo P450 1A y 3A
Como enzimas de la fase I CYP1A y CYP3A están involucradas en la metabolización de
compuestos tanto exógenos como endógenos, transformando un compuesto en más
polar y soluble en agua (Bohne et al, 2007). El sistema CYP además de participar en el
metabolismo
de
sustratos
de
naturaleza
exógena
como
drogas,
pesticidas,
procarcinógenos, anestésicos, solventes orgánicos, entre muchos otros, también
participa en el metabolismo de sustratos endógenos de importancia biológica como
colesterol, ácidos biliares, hormonas esteroidales y ácidos grasos. En los mamíferos, el
CYP se encuentra presente en la mitocondria y en diversos tipos de membranas
celulares, siendo particularmente abundante en el retículo endoplásmico liso
(microsomas). En general los P-450s de eucariotas tienen un peso molecular que oscila
entre 50 y 60 kD. La denominación citocromo P450 proviene de la característica de que
esta hemoproteína en su forma reducida y unida a monóxido de carbono, presenta un
18
máximo de absorbancia a los 450 nm. Tanto CYP1A como CYP3A se han identificado
tanto a nivel de gen como de proteína y en cuanto a sus especificidades de sustratos
son similares a su contraparte mamífero (Stegeman and Hahn, 1994; Buhler and WangBuhler, 1998).
La Citocromo P4501A participa en la biotransformación de contaminantes orgánicos,
tales
como
hidrocarburos
aromáticos
policíclicos
planares
(PAHs),
bifenilos
policlorinados (PCBs) y dioxinas (Shaw, 2004), sustancias que se unen al receptor
hydrocarbon aryl (AhR), y causan la inducción de la enzima CYP1A. Una característica
principal de los genes CYP1A es la inducibilidad por xenobióticos (Ortiz-Delgado et al,
2008). Entre las enzimas más estudiadas en salmónidos está la CYP1A y su sustrato
etoxi-resorufina O-desetilasa (EROD). Su inducción es usada generalmente, para
monitorear la exposición a contaminantes de las poblaciones de peces, es considerada
un biomarcador. Una variedad de técnicas han sido aplicadas para estimar la inducción
de CYP1A en peces. A nivel de proteínas pueden ser medidas por determinación de la
actividad 7-etoxi-resorufina O-desetilasa (EROD) (Rees and Li, 2004). En cuanto a la
distribución tejido específica de CYP1A, la mayoría de los estudios sobre su inducción
en peces se han enfocado principalmente en el hígado, siendo desconocido el rol
comparativo que cumplen los diferentes órganos en el metabolismo a xenobióticos y en
la inducción de CYP1A y su actividad catalítica en tejidos extrahepáticos (Ortiz-Delgado
et al., 2008). CYP1A no es inducida específicamente por pesticidas, pero algunos
investigadores han encontrado relación entre los efectos estrogénicos de los pesticidas
19
sobre la vitelogénesis y maduración de oocytos y los efectos inductores del receptor
agonista aryl hidrocarbon (Rees et al, 2005).
Las enzimas CYP3A son muy activas en hidroxilaciones de esteroides, ácido biliar y en
oxidaciones de xenobióticos, además de ser descritas como la mayor enzima
catalizadora de hormonas progesterona y testosterona en peces (Shaw et al, 2004). Su
amplia especificidad de sustrato y mayor expresión en hígado e intestino, las convierte
en el grupo más importante de enzimas involucradas en el metabolismo de drogas
(Honkakoski and Negishi, 2000). El receptor X pregnano (PXR) en salmónidos estimula
la transcripción de CYP3A y otros genes involucrados en la detoxificación y eliminación
de químicos tóxicos. PXR es un receptor nuclear que actúa en la protección de los
organismos frente a estos químicos, PXR es activado por un amplio espectro de
xenobióticos lipofílicos incluyendo medicamentos con receta, hierbas, pesticidas,
disruptores endocrinos y otros contaminantes (Goodwin et al, 2002; Kliewer, 2003).
2.4.1.2. Flavín monooxigenasa
Es una familia de enzimas que se localiza en el retículo endoplásmico (Schlenk et al.
2004), de múltiples tejidos. Su función fisiológica es más bien desconocida, algunos
estudios han demostrado que estas enzimas son capaces de oxidar numerosos
compuestos endógenos y de la dieta, (Cashman, 1997) incorporando oxígeno molecular
a
compuestos
lipofílicos,
haciéndolos
más
solubles
y
rápida
su
excreción
(Eswaramoorthy et al., 2006). Desde el punto de vista toxicológico, FMOs juega un rol
importante en la toxicidad o inactivación de varios xenobióticos tales como pesticidas
(Schlenk, 1998; 2004). Como sustratos de FMO se reportan alcaloides, pesticidas y
20
compuestos farmacéuticos (Cashman, 1995). Al menos se han identificado cinco
isoformas (FMO1 a FMO5) en especies de vertebrados y se han caracterizado con
respecto a su especificad de sustrato (Schlenk, 2004). Estas isoformas difieren en la
distribución de tejidos, regulación y especificidad de sustrato (Cashman, 1995). Siendo
las branquias la mejor ruta de biotransformación para las oxidaciones mediadas por
FMO (Matzuo, 2008). La actividad de FMO es alterada, por ejemplo, por cambios en la
salinidad. El mecanismo por el cual la salinidad modula la actividad de FMOs aún no
está claro (El-Alfy and Schlenk, 2002)
2.4.1.3. Glutation S Transferasa.
Glutation S-Transferasa (GST) es una gran familia de enzimas del tipo citosólica que
juegan un rol central en la detoxificación celular de xenobióticos (Salinas and Wong,
1999; Enayati et al, 2005; Trute et al, 2007), utiliza los productos de las reacciones de la
fase I para formar grandes moléculas endógenas, importantes para la eliminación de
xenobióticos tóxicos (Bohne et al, 2007). GST cataliza la conjugación de compuestos
electrofílicos con el grupo tiol de glutation reducido (GSH), haciendo que los productos
resultantes sean más solubles en agua y excretables (Enayati et al, 2005). GSH cumple
un importante rol en una multitud de procesos bioquímicos y en desórdenes de la
homeostasis que están implicados en la etiología y progresión de un sinnúmero de
enfermedades. Se requiere para la regulación del ciclo celular, protección contra daño
oxidativo, detoxificación de metales reactivos y transporte de cisteína entre otros. Roles
adicionales importantes para este tripéptido incluye la regulación de la expresión de
genes, apoptosis y transporte de membrana tanto de moléculas endo y exógenas. Es
21
sintetizada intracelularmente por su precursor aminoacídico por las enzimas citosólicas
gama-glutamylcisteina sintetasa y GSH sintetasa que requieren de ATP (Ballatori et al.,
2004). Es un importante sustrato y cofactor en muchas reacciones del metabolismo de
drogas. Estas reacciones son enzimáticas e incluye la conjugación de electrófilos
catalizados por la GSHS-Transferasa (GST) (Lash, 2005). La expresión de GST en
peces no está extensamente caracterizada, como si en mamíferos (Trute et al. 2007) e
insectos (Nauen and Stumpf, 2002; Enayati et al, 2005).
2.5
Fenómeno Resistencia a Múltiples Drogas (MDR), asociación con los
procesos de biotransformación.
La resistencia a múltiples drogas se define como la extrusión de una gran variedad de
metabolitos y xenobióticos desde las células por un único transportador de proteínas de
membrana y está presente en bacterias, fungi, levaduras y mamíferos (Alvarez et al,
2006). Este fenómeno se debe a la actividad de varios miembros de la familia de
proteínas transportadoras ABC (ATP-binding cassette). Estas proteínas están presentes
en todas las células de todos los organismos y funcionan dependientes de ATP
(Cárcamo et al, 2009). De todos los mecanismos de resistencia, varios estudios indican
que lo más frecuente en términos de resistencia a avermectinas es la sobreexpresión
de transportadores multidrogas (Tribble et al, 2007),
como Pgp y proteínas MRP
(Tribble et al, 2008). Los modelos de transportes descritos para estas proteínas son
básicamente dos, principalmente aquel que transporta las moléculas conjugadas tras el
metabolismo de biotransformación desde el citoplasma y aquel que transporta
moléculas desde la membrana plasmática hacia el espacio extracelular (Fig. 3). Tribble
22
et al. (2008) identificaron y localizaron transportadores ABC en el piojo de mar del
hemisferio norte Lepeophtheirus salmonis.
2.5.1 P- glicoproteína (P-gp).
Es uno de los sistemas de transporte más relevantes (Zaja et al, 2007), producto del
gen ABCB1, conocido como MDR1, el cual ha sido caracterizado en varios parásitos
(Sangster et al, 1999; Kerboenf, 2003; Ardelli et al, 2005; Alvarez et al, 2006). Cumple
un importante rol en la absorción, distribución, metabolismo y excreción de muchas
drogas (Alvarez et al, 2006; Tribble et al, 2007; 2008). P-gp es una proteína de
transporte de 170 kDa y de 1280 aminoácidos, con dos lados simétricos conectados por
una corta región de unión. Cada lado está formado por seis hélices transmembranas
seguidos por un dominio de unión a nucleótidos, en el cual se hidroliza ATP para
energizar el transporte. Los sustratos de P-gp son moléculas orgánicas con una masa
molecular que va desde 200 a 1900 Da. Las lactonas macrocíclicas, especialmente las
avermectinas son buenos sustratos para el transportador P-gp (Pouliot et al, 1997;
Griffin et al, 2005), una up-regulación de esta proteína puede servir para eliminar a
avermectina desde el parásito, limitando la acumulación de una concentración tóxica en
los receptores (Tribble et al, 2007).
La característica común encontrada en los
sustratos de P-gp es la naturaleza amfipática o hidrofóbica de sus moléculas, cargadas
neutral o positivamente (Litman et al. 2001; Cárcamo et al, 2009). En mamíferos
23
Figura 3. Modelo de transporte de la resistencia a multidrogas. El
modelo A muestra un transportador tipo MRP1; el sustrato (moléculas
cargadas, círculos rojos) entra por sistemas de transportes específicos
o inespecíficos (cilindro B) o mediante flujo pasivo. Las moléculas
llegan al citoplasma y son conjugadas por ejemplo, con glutation (GSH)
por una glutation S transferasa (GST). Las moléculas conjugadas son
activamente extruidas desde el citosol por el transportador tipo MRP1
(A) mediante un proceso dependiente de ATP. El modelo C muestra al
transportador P-gp donde el el sustrato ((moléculas
moléculas anfipáticas
antipáticas o
anfipáticas
hidrofóbicas, círculos azules) ingresan principalmente por difusión,
luego las moléculas son extruidas desde la membrana plasmática por
el transportador P-gp (C), también en un proceso dependiente de ATP.
Tomado de Cárcamo et al. 2009.
24
P-gp se expresa altamente en la membrana canalicular de hepatocitos y en la
membrana apical del epitelio intestinal (Sturm et al, 2001; Cascorbi, 2006).
En los peces, P-gp puede ser inducida por exposición a compuestos tanto de origen
natural como antropogénicos (Gant et al., 1991; Fardel et al., 1996; Schrenk et al.,
1994). Bard et al (2002) reporta altos niveles de expresión de Pgp en tejidos de
hígado, intestino y riñón de peces intermareales. Tribble (2008) demostró la expresión
de P-gp en hígado, riñón e intestino de Salmo salar. Quienes cumplen un rol importante
en la exclusión transmembrana de avermectinas desde el sistema nervioso central del
huésped (Didier and Loor, 1995; 1996). Estudios dirigidos a inmunolocalización de Pgp
en teleósteos mostró que su distribución es muy parecida a la vista en mamíferos
(Hemmer et al, 1995).
2.5.2. MRP1
Es una proteína asociada a la resistencia multi-drogas, miembro de la superfamilia de
proteínas de transporte ABC (ATP binding cassette) y actúa como transportador celular
de exflujo, de una amplia variedad de sustratos, en particular de metabolitos de la fase I
y fase II, conjugados a diversos compuestos como glutation, glucurónidos y sulfatos.
MRP1 se localiza en la membrana basolateral de las células epiteliales y sus sustratos
son por lo tanto transportados a través del lado basolateral del epitelio. Es una proteína
de transporte de 190 kDa con 14 elementos transmembranas, se identificó por primera
vez en una línea celular resistente a Doxorubicina, que no expresaba P-gp. En
mamíferos, MRP1 se expresa en muchos tejidos, parece ser el miembro de la familia de
las MRPs más importante en cuanto a la defensa de xenobióticos (Zaja et al, 2008;
25
Fisher et al, 2009). MRP1 actúa principalmente como un cotransportador para aniones
orgánicos anfipáticos
y compuestos de diferente naturaleza y conjugados
principalmente al tripéptido aniónico Glutation (GSH).
Después del descubrimiento del rol de los transportadores ABC de exflujo en
mamíferos, se propuso que un mecanismo similar puede estar presente en organismos
acuáticos. La presencia de P-gp y MRP y su rol se ha demostrado en más de cuarenta
especies acuáticas (Loncar et al, 2010).
Los principales sitios de expresión de proteínas de transporte según Loncar et al (2010),
son los tejidos involucrados en la absorción (pulmón, intestino), metabolismo y
eliminación (hígado, riñón) y barreras (barrera hematoencefálica, hematotesticular y
placenta).
Este trabajo de tesis propone que el incremento en las actividades funcionales de las
proteínas CYP450 y MDR en el parásito y/o su huésped podrían promover la resistencia
al Benzoato de Emamectina, haciéndose por tanto necesario establecer expresión y
actividad de las proteínas del sistema CYP450, FMOs y GST tanto en Caligus
rogercresseyi como en su huésped trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss).
26
2.6. HIPOTESIS
De acuerdo a los antecedentes antes mencionados se pondrán a prueba las
predicciones de la siguiente hipótesis de trabajo:
“La expresión y actividad de las proteínas del sistema Citocromo P-450, FMO,
GST y de las proteínas de resistencia a drogas P-gp y MRP1, tanto en Caligus
rogercresseyi como en su huésped Oncorhynchus mykiss, se ven afectadas por
los tratamientos con Benzoato de Emamectina”.
2.7 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la expresión y actividad de las enzimas metabolizadoras de la fase I (CYP1A,
CYP3A y FMO) y fase II de la biotransformación (GST), y proteínas MDR (P-gp y
MRP1) en cáligus (Caligus rogercresseyi) y en el huésped Trucha arcoiris
(Oncorhynchus mykiss).
2.8 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.- Determinar los niveles de expresión del mRNA de las enzimas Citocromo P-450
CYP1A y CYP3A, FMO, GST y de las proteínas P-gp y MRP1 en homogenizados de
Caligus rogercresseyi y en diferentes tejidos de Oncorhynchus mykiss (hígado,
branquias y músculo) sin y con tratamiento con Benzoato de Emamectina, mediante
RT-PCR.
27
2.- Detectar la expresión de las proteínas FMO y GST en homogenizados de Caligus
rogercresseyi y en diferentes tejidos de Oncorhynchus mykiss con y sin tratamiento con
Benzoato de Emamectina, mediante Western blot.
3.- Evaluar actividad enzimática de Citocromo P450 1A y GST en diferentes tejidos de
Oncorhynchus mykiss con y sin tratamiento con Benzoato de Emamectina, mediante
ensayos fluorimétricos.
28
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1 Obtención de Especímenes
Se utilizaron especímenes de Cáligus adultos (Caligus rogercresseyi) y de Trucha
arcoiris
(Oncorhynchus mykiss), los cuales fueron recolectados desde diversas
empresas de la X Región de los Lagos. Los pesos promedios de los especímenes de
trucha arcoiris fluctuaron entre 1 y 2 kilos, todos correspondían a truchas de agua
salada. Ambos grupos de especímenes (trucha arcoiris y cáligus) fueron obtenidos sin
tratamiento de antiparasitario (grupo control) y otros tratados con Benzoato de
Emamectina (EMB). Los cáligus adultos fueron removidos con pinzas desde
especímenes de trucha arcoiris y sumergidos en RNA safer (OMEGA), posteriormente
llevados en hielo al laboratorio de Patología Molecular y Bioquímica Farmacológica de
la Universidad Austral de Chile, para ser almacenados a -20ºC. Diferentes tejidos de
trucha arcoiris (hígado, branquias y músculo) fueron sumergidos en RNA safer para
extracciones de RNA, y luego en el laboratorio almacenados a -20ºC, un segundo set
de tejidos fue sumergido en buffer de extracción con inhibidores generales de
proteasas, transportado en hielo hasta el laboratorio y almacenado a -80ºC para análisis
de Western blot y un tercer set se sumergió en tampón de PBS Tritón 0.1X,
transportado en nitrógeno líquido (-196ºC) y almacenado a -80ºC para ensayos de
actividad enzimática.
29
3.2 Aislamiento y cuantificación de RNA total.
El RNA total de cáligus y de trucha se aisló desde aproximadamente 200 mg de tejido
utilizando solución de Chomczynski con fenol. Se procedió a homogenizar en 1 mL de
Chomczynski los trozos de tejidos en hielo con homogenizador mecánico (IKA®),
posteriormente se agregó 0,2 mL de cloroformo por cada mL de solución de
Chomczynski, se mezcló en vortex por 15 segundos y se dejó reposar por 3 minutos a
temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 12.000 g x 15 minutos a 4°C, se
separó la fase acuosa superior y se precipitó el RNA con 0,5 mL de alcohol isopropílico,
se mezcló y se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifugaron
las muestras a 12.000 g x 15 minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante y se lavó el
RNA con alcohol etílico 75°. La suspensión se centrifugó a 7.500 g x 5 minutos a 4°C.
Luego se eliminó el sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente; a
continuación el RNA se resuspendió en 30 μl de agua libre de nucleasas y se guardó a 80°C.
La
calidad
e
integridad
del
RNA
se
visualizó
mediante
análisis
espectrofotométricos (OD260/280), para lo cual se midió la absorbancia de las muestras
de RNA, diluidas 250 veces en agua estéril. La concentración aproximada de la muestra
se calculó utilizando la relación que dice que 1 unidad de absorbancia a 260 nm
equivale a 40 μg/mL de RNA. La concentración final de la solución de RNA se obtuvo al
multiplicar el valor de absorbancia obtenido por el factor de dilución de cada muestra y
por 40 μg/mL.
30
3.3 Síntesis de cDNA
La síntesis de la primera banda de cDNA se realizó por transcripción reversa del RNA.
La reacción se llevó a cabo en 20 μl de volumen que contenía: buffer de transcripción
reversa 1X (50 mM Tris-HCl pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl2), 2 μg de RNA total,
0.5mM de cada dNTP, 10 mM DTT , 40 U inhibidor de RNAsa, 200 U de Transcriptasa
reversa Superscript II (Invitrogen) y 0.5 μg oligo dT15. La mezcla de transcripción se
incubó a 42ºC por 1 hora. Posteriormente, la enzima se inactivó a 72ºC por 15 min.
3.4 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Se llevó a cabo en un volumen total de 15 μl, conteniendo 1 μl de cDNA, 7.5 μl Taq
polimerasa Green Master Mix (Promega) y 10uM de partidores específicos para cáligus
y trucha arcoiris. Los partidores específicos se detallan en la tabla1. Las muestras se
incubaron por 3 min. a 94ºC, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30
segundos a 55-64ºC (dependiendo de la temperatura de alineamiento de los
partidores), 30 segundos a 72ºC y extensión final a 72ºC por 10 minutos.
3.5 Fraccionamiento de DNA en geles de agarosa
Para separar los fragmentos de DNA se utilizó geles al 2% de agarosa en tampón TAE
1X. Las corridas electroforéticas del DNA se realizaron en tampón TAE 1X y a un voltaje
5V/cm. Finalizada la electroforesis, se procedió a teñir el gel con Bromuro de etidio
(Winkler) (1 μg/mL en tampón TAE 1X), para visualizar los fragmentos de DNA con luz
UV en el gel. Para estimar los tamaños de los fragmentos de DNA separados en el gel
31
Tabla 1: Partidores para RT-PCR y tamaño del amplicón.
Gen
B-actina
CYP1A
CYP3A
FMO-1
GST
P-gp
hMRP1
MRP1
Partidor Forward (5`a 3`)
GCCGGGTTCGCTGGAGATGA
AGTGCTGATGGCACAGAACTCAA
ACTAGAGAGGGTCGCCAAGA
GCAGTCCCGCTGGGTCACAC
AGCTGCTCCCAGCTGATCC
ACGTGCGCTCCCTGAACGTG
AGGTCAAGCTTTCCGTGTACTG
GCGTGACCAGGACAGCGACC
Partidor Reverse (5`a 3`)
Tamaño producto
(pb)
GCGTGGGCAGAGCGTAACC
AGCTGACAGCGCTTGTGCTT
TACTGAACCGCTCTGGTTTG
TCCCTGGGCCGGTGATACGG
CAAACCACGGCCACATCATGTAATC
GCGTTGGCCTCCCTAGCAGC
GGACTTTCGTGTGCTCCTGA
TCAATGGGCGCCACCCACAC
467
218
146
287
240
151
174
291
Tabla 1: Resumen de partidores diseñados para PCR convencional. CYP1A y
CYP3A fueron diseñados de acuerdo a la secuencias publicadas por otros
autores. En tanto, FMO-1 (GenBank nº acceso EFO63736.1), GST (GenBank nº
acceso BTO74035.1), P-gp (GenBank nº acceso AY863423.3) y MRP1 (GenBank
nº NM 001168330.1) se diseñaron de acuerdo a las secuencias disponibles en
Gen Bank. Se diseñaron con el programa Primer 3. Tanto la secuencia como los
partidores Forward y Reverse, fueron analizados por el programa in sílico PCR,
con el objetivo de chequear la amplificación del producto.
32
de agarosa, se utilizaron estándares de 100 pares de base como tamaño molecular
(Promega) que se corrieron en la misma electroforesis paralelamente con el DNA.
3.6 Cuantificación de bandas de PCR
Las síntesis de cDNA para cada tejido de Trucha arcoiris y cáligus se realizaron por
triplicado, para luego tener las amplificaciones por PCR de las proteínas por triplicado.
Para las cuantificaciones se usaron otras figuras con bandas sin saturación, en las
cuales se cargaron 3 μL de cada reacción en los geles de agarosa. Las fotografías PCR
presentadas en las figuras corresponden a lo más representativo de sus respectivas
cuantificaciones, las cuales se obtuvieron con 5 μL de muestra. La cuantificación de los
productos obtenidos se realizó mediante el programa GelPro 32, y los gráficos se
realizaron mediante el programa SigmaPlot 11.
3.7 Análisis de Western blot.
Para la extracción de proteínas se utilizaron aproximadamente 300 mg de los distintos
tejidos de trucha arcoiris (hígado, branquias y músculo) y de especímenes de cáligus,
los cuales fueron sonicados durante 5-10 seg en hielo en 1 mL de buffer RIPA [Tris-HCl
50 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM; Nonidet P-40 1%; EDTA 1 mM; EGTA 1 mM],
suplementado con una mezcla de inhibidores (Sigma) y PMFS (400 mM) (Winkler).
Luego se centrifugaron a 12.000 RPM por 5 min. a 4ºC, se colectó el sobrenadante y se
guardó a -20ºC para su uso posterior.
33
La concentración de proteínas totales se midió en 10 μL de cada extracto, según el
método de Bradford (1976), a una longitud de onda de 595 nm. Como blanco se utilizó
10 μL de tampón RIPA más 1 mL del reactivo de Bradford.
Las proteínas fueron separadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al
12,5% con dodecil sulfato de sodio y β-mercaptoetanol (SDS- PAGE), el cual será
descrito posteriormente.
3.7.1
Electroforesis
en
geles
de
poliacrilamida,
electrotransferencia
e
inmunotinción.
3.7.1.1 Separación de proteínas por SDS-PAGE
Todas las electroforesis se realizaron según el método de Laemli (1970) con algunas
modificaciones. Cada una de las muestras se mantuvo a -20ºC en igual volumen de
tampón de muestra 2x [Tris 0,06 M; glicerol 10% p/v; 2-mercaptoetanol 0,5 % v/v y SDS
4.6 % p/v] (Winkler), utilizándose en cada caso, un volumen de muestra
correspondiente a la cantidad de proteínas necesaria para cada ensayo. Las muestras y
el estándar preteñido de proteínas de masa molecular: 175, 80, 58, 46, 30, 25, 17 y 7
kDa (BioLabs) fueron hervidas por 3 min, enfriadas y colocadas en los respectivos
surcos del gel. Los minigeles (ancho 100 mm, alto 65 mm y espesor 1,5 mm) fueron
preparados y montados en placas de vidrio con espaciadores de teflón. La corrida
electroforética se realizó en tampón Tris 0,02 M, glicina 0,05 M y SDS 0,1%. Una vez
cargadas las muestras, las proteínas fueron separadas a un voltaje constante de 135 V
por aproximadamente 2 h y 30 min.
34
3.7.1.2 Preparación de geles de poliacrilamida al 12,5%.
Gel separador (12,5 %): Tampón inferior (Tris-HCl 1,5 M pH 8,3; SDS 0,4%) 2,0 mL;
solución de acrilamida al 29% (acrilamida 29% y bisacrilamida 1%) 3,2 mL; agua
destilada 2,8 mL; persulfato de amonio al 10% 30 μL y Temed 10 μL.
Gel espaciador: Tampón superior (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; SDS 0,4%) 1,3 mL; solución
de acrilamida al 30% 0,65 mL; agua destilada 3,05 mL; persulfato de amonio al 10% 60
μL y Temed 7 μL.
3.7.1.3 Electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa.
La transferencia se llevó a cabo utilizando el método de Towbin et al., (1979) con
algunas modificaciones. Una vez hecha la electroforesis se colocó sobre el gel una
membrana de nitrocelulosa (Biorad) que fue equilibrada en tampón de transferencia
[Tris 0,02 M, glicina 0,15 M, y metanol al 20%] por al menos 5 min. Estando la
membrana sobre el gel, se cubrieron con papel filtro y esponja por ambos lados, los que
habían sido previamente humedecidos en tampón de transferencia. Luego se colocaron
en una cámara de electrotransferencia, orientando la membrana hacia el polo positivo
del circuito. La transferencia se realizó a 400 mA por 1 h y 30 minutos en hielo usando
el tampón antes mencionado. Una vez terminado este proceso, la membrana fue
separada del gel y secada durante 30 min para su posterior incubación con los
anticuerpos respectivos. Cada gel fue lavado con agua destilada para luego teñir las
proteínas con azul de Coomasie (Winkler) por 20 min. El colorante no unido a las
proteínas se eliminó lavando el gel con agua destilada. Este procedimiento tuvo por
35
objeto verificar una migración homogénea de las proteínas y la eficiencia de su
transferencia a la membrana de nitrocelulosa.
3.7.1.4 Inmunodetección de membranas.
Cada membrana de nitrocelulosa se dejó secar por 10 min a temperatura ambiente,
para luego incubarlas con los respectivos anticuerpos en PBS 1X conteniendo Tween20 (Winkler) al 1% y BSA 3%. Se utilizaron anticuerpos policlonales rabbit anti- FMO-1
humana (Santa Cruz) a una dilución de 1:250 y anti-GSTs-1 humana (Santa Cruz) a
una dilución de 1:250. La incubación con cada anticuerpo fue por toda la noche a
temperatura ambiente y agitación constante. Luego las membranas fueron lavadas con
PBS 1X conteniendo Tween-20 durante 20 minutos con cambios cada 5 min. Como
segundo anticuerpo se utilizó un goat anti-rabbit conjugado a peroxidasa a una dilución
de 1:2500 por 1 hora a temperatura ambiente en agitación constante. Posteriormente,
las membranas fueron lavadas con PBS1X-Tween 20 al 1% durante 20 min con
cambios cada 5 min. Las bandas inmunoreactivas se visualizaron utilizando solución de
revelado Diaminobenzidina (DAB 0,2% (p/v) y H2O2 0.007% (v/v) en PBS; Sigma) como
sustrato de la peroxidasa por 15 minutos, la reacción se detuvo sumergiendo la
membrana en agua.
3.8 Ensayos de actividad enzimática.
Con el objetivo de evaluar los niveles de actividad de las enzimas CYP1A y GST en
distintos tejidos del huésped trucha arcoiris (hígado, branquia y músculo), se procedió a
36
medirlas sólo en tejidos en condición control, con algunas modificaciones en los
protocolos descritos para otras especies.
3.8.1 Actividad CYP1A en tejidos de Trucha Arcoiris.
La actividad de CYP1A se midió usando el método 7-etoxi-resorufina O-desetilasa
(EROD) (Nabb, 2006). Se realizaron tres determinaciones para cada uno de los tejidos
a analizar de Trucha Arcoiris (hígado, branquias y músculo) en condición control. Para
determinar los tiempos requeridos para medir en velocidad inicial se pesaron entre 90 y
100 mg de tejido, homogenizado en un tubo Eppendorf, con 1 mL de CaHBSS 1X pH
7,8 (Gibco) mediante sonicado en hielo, para luego centrifugar a 10.000 rpm durante 5
minutos a 4ºC. Posteriormente, se tomó el sobrenadante (1 mL) y se colocó dentro de
un tubo falcon de 15 mL, más 2 mL de CaHBSS 1X pH 7,8, para completar el volumen
de la cubeta de medición del espectrofluorímetro (Perkin Elmer LS 55), luego el tubo
falcon con la muestra se incubó unos 5 minutos aproximadamente en el baño
termorregulado a 30º C, para trabajar siempre en las mismas condiciones de
temperatura. Paralelamente, se preparó la mezcla del sustrato 7ER (Sigma) 6,25 uM,
con dicoumarol 10 uM (Sigma) y NADPH 1mM (Sigma) en un tubo Eppendorf y se
incubó también a 30ºC por 5 minutos. Trascurrido el tiempo de incubación se procedió
agregar en la cubeta de medición, los 3 mL de muestra más 120 uL de la mezcla de
sustrato, para dar inicio a la medición de la curva cinética de dicha reacción, mediante
la emisión de fluorescencia. Las longitudes de onda de excitación y emisión para medir
la formación de resofurina fueron de 560 y 590 nm, respectivamente.
37
Una vez realizadas las cinéticas en triplicado para cada tejido, se procede a calcular el
valor promedio de los puntos máximos, aquel punto en el que no hay disponibilidad de
sustrato, para así poder calcular el intervalo de tiempo en el cual se ha consumido
menos del 5% del sustrato, y así hacer las determinaciones siguientes bajo ese
intervalo de tiempo, para luego calcular la pendiente, la que corresponde entonces a la
velocidad inicial de cada reacción.
Para la obtención de curvas en velocidad inicial se precedió a medirlas con menor
cantidad de tejido en triplicado, se recomienda hacer diluciones seriadas y hacer las
respectivas mediciones sin variar los volúmenes de sustrato de la misma forma que se
mencionó anteriormente. Finalmente, con el programa SigmaPlot 11 se calculó el valor
de la pendiente de la curva que corresponde a la velocidad inicial, aplicando regresión
lineal a la recta.
3.8.2 Actividad GST en tejidos de Trucha Arcoiris.
Para los ensayos de actividad de Glutation S-transferasa (GST), se usó el método del
monoclorobimano (MCB) como sustrato (Nauen y Stumpf, 2002), con algunas
modificaciones en los volúmenes de extracto de muestra utilizado. El ensayo utilizó
MCB (monoclorobimano ; Sigma), el cual se caracteriza por ser una forma fluorescente
que reacciona con la glutation (GSH), reacción catalizada por GST, formando un aducto
GSH-MCB, los niveles de fluorescencia son proporcionales al contenido de GST
presente en la reacción. Esta reacción se midió en cubeta de cuarzo de 3 ml en el
espectrofluorímetro Perkin Elmer (LS 55), adaptado con baño termorregulado. Todas
las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo a 30º C. Se realizaron tres
38
determinaciones para cada tejido en condición control (sin tratamiento con
antiparasitario). Para obtener las cinéticas de reacción completas, se pesaron
cantidades máximas de tejido, las que fluctuaron entre 80 y 180 mg de cada uno de los
tejidos. Estos tejidos fueron homogenizados con 1 mL de tampón Hepes 50 mM pH 7,0
mediante sonicado en hielo, luego centrifugados a 10.000 rpm por 5 minutos a 4ºC.
Posteriormente, se tomó 1 mL del sobrenadante (extracto enzimático) y se depositaron
en la cubeta de medición, completando los 3 mL con tampón Hepes 50 mM pH 7,0,
luego, se agregó a la cubeta 150 uL de sustrato GSH (Glutation reducido en tampón
HEPES) más 20 uL de monoclorobimano, todo previamente incubado a 30ºC. El nivel
de GST en las muestras se detectó midiendo la fluorescencia a 390 nm de excitación y
460 nm de emisión.
Una vez realizadas las cinéticas en triplicado para cada tejido, se procede a obtener el
valor promedio de los puntos máximos, aquel punto en el que no hay disponibilidad de
sustrato, para así poder calcular el intervalo de tiempo en el cual se ha consumido
menos del 5% del sustrato, y así hacer determinaciones siguientes bajo ese intervalo
para calcular la velocidad inicial de cada reacción.
Para la obtención de curvas en velocidad inicial (bajo el 5% de unidades de
fluorescencia totales), se precede a medir con menor cantidad de tejido, se recomienda
hacer diluciones seriadas y hacer las respectivas mediciones sin variar los volúmenes
de sustrato de la misma forma que se mencionó anteriormente. Finalmente, con el
programa SigmaPlot 11 se calculó el valor de la pendiente de la curva, correspondiente
a la velocidad inicial, aplicando regresión lineal a la recta.
39
3.9 Estadística: Los resultados son presentados como la media aritmética ± la
desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SigmaPlot
11. Las diferencias entre el grupo control y el grupo expuesto se analizaron usando ttest. Un nivel de probabilidad de P< 0.05 fue considerado significativo. Análisis de
regresión linear se aplicaron a las rectas, para evaluar la actividad catalítica CYP1A y
GST.
40
4. RESULTADOS
4.1 Extracción de RNA desde Caligus rogercresseyi y tejidos de Oncorhynchus
mykiss con y sin tratamiento con Benzoato de Emamectina (EMB).
Se realizó extracción de RNA total desde especímenes en estado adulto de Cáligus,
extraídos desde la piel de especímenes de Trucha arcoiris provenientes de diversas
empresas de la Décima región de los Lagos. Se extrajo RNA desde aproximadamente
200 mg de muestra de especímenes de cáligus. La concentración de RNA fue de 2,5
μg/μL.
La extracción de RNA total desde diversos tejidos de Trucha arcoiris (Hígado, Branquia
y Músculo), se realizó siguiendo el mismo protocolo usado para Cáligus, con solución
de
Chomszynski
con
fenol,
detallado
en
la
sección
3.2.
Se
procesaron
aproximadamente 200 mg de cada tejido para la extracción del RNA total. La
concentración de RNA en los tejidos fluctuó entre 1,8 y 2,9 μg/μL.
4.2 RT-PCR para las enzimas CYP1A y CYP3A, FMO, GST y para las proteínas Pgp y MRP1, en tejidos de Oncorhynchus mykiss y Caligus rogercresseyi.
Con el fin de visualizar el efecto del Benzoato de Emamectina sobre los niveles de
expresión
de
los
mRNA
de
enzimas
involucradas
en
el
metabolismo
de
biotransformación de diferentes tejidos de trucha arcoiris y de cáligus, se utilizaron
partidores específicos detallados en la tabla 1 de Material y Métodos, además se utilizó
41
β-actina como gen constitutivo para todas las amplificaciones por RT-PCR, ya que este
no debiera ser afectado por los tratamientos con antiparasitario.
4.2.1 Expresión de mRNA de Citocromo P450 1A (CYP1A).
La expresión de los transcritos por RT-PCR para CYP1A en diversos tejidos de Trucha
Arcoiris (hígado, branquias y músculo) y Cáligus se expone en la Fig. 4. Para la
amplificación de CYP1A se obtiene un producto de tamaño esperado de 218 pares de
bases en cada uno de los tejidos analizados de Trucha arcoiris y en cáligus. Así mismo,
para β-actina se obtiene un producto esperado de 467 pares de bases (Fig. 4 A). En
cuanto a los niveles de expresión de mRNA, los resultados que se presentan a
continuación en la Fig.4 B sobre el efecto del Benzoato de Emamectina sobre la
expresión de las proteínas
metabolizadoras antes descritas en distintos tejidos de
trucha arcoiris y en cáligus están expresados como porcentaje del control más su
respectiva desviación estándar. La expresión de CYP1A en hígado de trucha arcoiris
tratadas con EMB aumentó a un 893% (Fig. 4 B). Por su parte, CYP1A en branquias de
trucha arcoiris tratadas con EMB aumentó a un 166%. Para tejido de músculo de trucha
arcoiris tratados con EMB la expresión de CYP1A aumentó en un 298,5 %. En tanto, en
cáligus tratado con EMB la expresión de CYP1A aumentó en un 585 %.
4.2.2 Expresión de mRNA de Citocromo P450 3A (CYP3A).
En la Figura 5 se presentan los resultados de CYP3A involucrada dentro del
metabolismo a xenobióticos, se expone la expresión de los mRNA en diferentes tejidos
de truchas arcoiris tratadas con EMB mediante RT-PCR. CYP3A proporciona un
42
A)
Branquias
Hígado
1
2
3
1
Músculo
2
1
3
Cáligus
2
3
1
2
3
Exprresión mRNA
(% d
del control)
B)
1200
*
1000
200
*
150
800
600
*
500
*
400
1000
*
800
300
600
200
400
100
200
100
400
50
200
0
control
EMB
0
0
control
EMB
control
EMB
0
control
EMB
Figura 4. Niveles de expresión mRNA de CYP1A en diferentes tejidos de
Oncorhynchus mykiss
y Caligus rogercresseyi con y sin tratamiento con
benzoato de emamectina (EMB). A) Los productos de PCR obtenidos desde cDNA
total de hígado, branquia, músculo y homogenizado de cáligus fueron fraccionados
por electroforesis
l t f
i en gell de
d agarosa all 2% teñidos
t ñid con Bromuro
B
d Etidio.
de
Etidi Carriles
C il 1:
1
Estándar de peso molecular de 100 pb. Carriles 2: Control positivo β-actina (467 pb) y
CYP1A (218 pb) del tejido sin tratamiento. Carriles 3: Control positivo β-actina (467
pb) y CYP1A (218 pb) del tejido tratado con EMB. B) Cuantificación de los productos
amplificados en la fig. A, para lo cual se utilizaron figuras de electroforesis en donde
se cargó menor cantidad de producto de PCR, con el fin de obtener señales no
saturadas, resultados expresados como la media (n=3) ± la desviación estándar. * P
< 0,05 respecto al control.
43
producto de amplificación de tamaño esperado de 146 pares de bases en cada uno de
los tejidos analizados de Trucha arcoiris. El control de carga β-actina amplificó un
producto esperado de 467 pares de base (Fig.5 A). Los niveles de expresión de mRNA,
se presentan a continuación en la Fig.5 B. El efecto del Benzoato de Emamectina
(EMB) sobre la expresión de las proteínas metabolizadoras antes descritas en distintos
tejidos de trucha arcoiris están expresados como porcentaje del control más su
respectiva desviación estándar. La expresión de CYP3A en hígado de trucha arcoiris
tuvo un leve aumento a 184,8 % con respecto al control. En cuanto a su expresión en
branquias de trucha arcoiris el aumento fue un 264 % con respecto al control. En
músculo de trucha arcoiris la expresión de CYP3A con respecto al control aumentó a un
237,5 %. Por otra parte, no se visualizó la expresión de CYP3A en cáligus, se
analizaron todos los posibles factores, como temperatura de annealing, diversas
extracciones de RNA, diferentes síntesis de cDNA y controles positivos, pero no se
logró evidenciar amplificación.
4.2.3 Expresión de mRNA de Flavín monooxigenasa (FMO1)
En la Fig. 6 A se puede apreciar el amplicón resultante de 287 pb, tanto en hígado,
branquia, músculo y en cáligus el cual se ajusta perfectamente al tamaño esperado. βactina amplificó un producto esperado de 467 pares de base (Fig.6 A). Los niveles de
expresión de mRNA, se presentan a continuación en la fig.6 B, el efecto del Benzoato
de Emamectina (EMB) sobre la expresión de las proteínas
metabolizadoras antes
descritas en distintos tejidos de trucha arcoiris y en cáligus están expresados como
porcentaje del control más su respectiva desviación estándar. La expresión de FMO-1
44
A)
Branquia
Hígado
1
2
3
1
2
Músculo
3
1
2
3
Exp
presión mRNA
(%
% del control)
B)
300
500
250
400
*
350
300
250
200
300
200
200
150
150
100
50
100
0
0
100
50
0
control
EMB
control
EMB
0
control
EMB
Figura 5. Niveles de expresión mRNA de CYP3A en diferentes tejidos de
Oncorhynchus mykiss con y sin tratamiento de benzoato de emamectina
(EMB). A) Los productos PCR de cDNA total de hígado, branquia, músculo y
homogenizado de cáligus fueron fraccionados por electroforesis en gel de agarosa
al 2% teñidos con Bromuro de Etidio. Carriles 1: Estándar con peso molecular de
100 pb. Carriles 2:Control positivo β-actina (467 pb) y CYP3A (146 pb) del tejido
sin tratamiento. Carriles 3:Control positivo β-actina (467 pb) y CYP3A (146 pb) del
tejido tratado con EMB. No es posible apreciar el producto esperado de CYP3A en
cáligus
áli
ya que este
t no se expresó.
ó B) Cuantificación
C
tifi
ió de
d los
l
productos
d t
amplificados en la fig. A, para lo cual se utilizaron figuras de electroforesis en
donde se cargó menor cantidad de producto de PCR, con el fin de obtener
señales no saturadas, resultados expresados como la media (n=3) ± la desviación
estándar. * P < 0,05 respecto al control.
45
A)
Branquia
Hígado
1
2
3
1
2
Músculo
3
1
2
Cáligus
3
1
2
3
Expresión mRNA
(% del control)
B))
600
6000
500
5000
400
4000
200
300
3000
150
400
200
2000
100
200
100
1000
50
0
0
0
1400
*
1200
1000
800
600
control
EMB
control
EMB
***
control
300
250
0
EMB
control
EMB
Figura 6. Niveles de expresión mRNA de FMO-1 en diferentes tejidos de
Oncorhynchus mykiss
y Caligus rogercresseyi con y sin tratamiento de
benzoato de emamectina (EMB). A) Los productos PCR de cDNA total de hígado,
branquia,
músculo
y
homogenizado
de
cáligus
fueron
fraccionados
por
electroforesis en gel de agarosa al 2% teñidos con Bromuro de Etidio. Carriles 1:
Estándar con peso molecular de 100 pb. Carriles 2:Control positivo β-actina (467
pb) y FMO-1 (287 pb) del tejido sin tratamiento. Carriles 3:Control positivo β-actina
(467 pb) y FMO-1 (287 pb) del tejido tratado con EMB. B) Cuantificación de los
productos amplificados en la fig. A, para lo cual se utilizaron figuras de
electroforesis en donde se cargó menor cantidad de producto de PCR, con el fin de
obtener señales no saturadas, los resultados están expresados como la media
(n=3) ± la desviación estándar. * P < 0,05 y *** P < 0,001 respecto al control.
46
en hígado de trucha arcoiris aumentó a un 1.021% con respecto al control. En cuanto a
su expresión en branquias de trucha arcoiris tuvo un aumento a 344,5 % con respecto
al control. En músculo de trucha arcoiris la expresión de FMO-1 con respecto al control
aumentó a un 5.183,3%, y por su parte, la expresión en cáligus aumentó a 193%.
4.2.4 Expresión de mRNA de Glutation S-Transferasa (GST)
En la Figura 7 se presentan los resultados de GST involucrada dentro de la fase II del
metabolismo a xenobióticos, se expone la expresión de los mRNA en diferentes tejidos
de truchas arcoiris y en cáligus con y sin EMB mediante RT-PCR. GST proporciona un
producto de amplificación de tamaño esperado de 240 pares de bases en cada uno de
los tejidos analizados de Trucha arcoiris y en cáligus. El control de carga β-actina
amplificó un producto esperado de 467 pares de base (Fig.7 A). Los niveles de
expresión de mRNA, se presentan a continuación en la Fig.7 B. El efecto del Benzoato
de Emamectina (EMB) sobre la expresión de las proteínas metabolizadoras antes
descritas en distintos tejidos de trucha arcoiris y en cáligus están expresados como
porcentaje del control más su respectiva desviación estándar. La expresión de GST en
hígado de trucha arcoiris tuvo un leve aumento a 171,1 % con respecto al control. En
cuanto a su expresión en branquias de trucha arcoiris aumentó a 202,3 % con respecto
al control. En músculo de trucha arcoiris la expresión de GST con respecto al control
aumentó a un 125,6 %. Por otra parte, la expresión de GST en cáligus, aumentó a un
214,3 %.
47
A)
1
Músculo
Branquia
Hígado
2
1
3
2
3
1
2
Cáligus
3
1
2
Exp
presión mRNA
(%
% del control)
B)
250
*
200
250
150
150
100
100
50
50
0
0
1
control
***
200
2
EMB
control
EMB
160
140
120
100
80
60
40
20
0
*
300
*
250
200
150
100
50
0
control
EMB
control
EMB
Figura 7. Niveles de expresión mRNA de GST en diferentes tejidos de
Oncorhynchus mykiss
y Caligus rogercresseyi con y sin tratamiento de
benzoato de emamectina (EMB). A) Los productos PCR de cDNA total de hígado,
branquia, músculo y homogenizado de cáligus fueron fraccionados por electroforesis
en gel de agarosa al 2% teñidos con Bromuro de Etidio. Carriles 1: Estándar con
peso molecular de 100 pb. Carriles 2:Control positivo β-actina (467 pb) y GST (240
pb) del tejido sin tratamiento. Carriles 3:Control positivo β-actina (467 pb) y GST
(240 pb) del tejido tratado con EMB. B) Cuantificación de los productos amplificados
en la fig.
fig A,
A para lo cual se utilizaron figuras de electroforesis en donde se cargó
menor cantidad de producto de PCR, con el fin de obtener señales no saturadas, los
resultados están expresados como la media (n=3) ± la desviación estándar. * P <
0,05 y *** P < 0,001 respecto al control.
3
48
4.2.5 Expresión de mRNA de P-glicoproteína (P-gp)
La expresión de los transcritos por RT-PCR para P-gp en diversos tejidos de Trucha
Arcoiris y Cáligus se exponen en la Fig. 8A. P-gp proporciona un producto de
amplificación de tamaño esperado de 151 pares de bases en cada uno de los tejidos
analizados de Trucha arcoiris y en cáligus. Además, como gen constitutivo y a la vez
como control de carga se amplificó el partidor del gen B-actina de 467 pares de base de
producto esperado (Fig.8 A). En cuanto a los niveles de expresión de mRNA, los
resultados que se presentan a continuación en la Fig.8 B sobre el efecto del Benzoato
de Emamectina sobre la expresión de las proteínas metabolizadoras antes descritas en
distintos tejidos de trucha arcoiris y en cáligus están expresados como porcentaje del
control más su respectiva desviación estándar. La expresión de P-gp en hígado de
trucha arcoiris tratadas con EMB aumentó en un 120,9 %. Por su parte, P-gp en
branquias de trucha arcoiris tratadas con EMB aumentó en un 189,1 %. Para tejido de
músculo de trucha arcoiris tratados con EMB la expresión de P-gp aumentó en un 296,5
%. En tanto, en cáligus tratado con EMB la expresión de P-gp aumentó en un 162,7 %.
4.2.6 Expresión de mRNA de MRP1
En la Figura 9 se presentan los resultados de MRP1, proteína transportadora que
cumple un importante rol en la detoxificación de xenobióticos; se expone la expresión
de los mRNA en diferentes tejidos de truchas arcoiris tratadas con EMB y en cáligus
mediante RT-PCR. El partidor MRP1 de humano proporciona un producto de
amplificación de tamaño esperado de 174 pares de bases en hígado y branquias de
Trucha arcoiris y en cáligus. Por otra parte el partidor MRP1 de trucha arcoiris
49
A)
Branquia
Hígado
1
2
3
1
2
Músculo
3
1
2
Cáligus
1
3
2
3
E
Expresión
mRNA
(% del control)
B)
140
*
120
100
300
500
250
400
200
80
300
150
60
40
100
20
50
0
control
EMB
0
200
100
control
EMB
0
control
EMB
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
control
EMB
Figura 8. Niveles de expresión mRNA de P-gp en diferentes tejidos de
Oncorhynchus mykiss
y Caligus rogercresseyi con y sin tratamiento de
benzoato de emamectina (EMB). Los productos PCR de cDNA total de hígado,
branquia, músculo y homogenizado de cáligus fueron fraccionados por
electroforesis en gel de agarosa al 2% teñidos con Bromuro de Etidio. Carriles 1:
Estándar con peso molecular de 100 pb. Carriles 2:Control positivo β-actina (467
pb) y P-gp (151 pb) del tejido sin tratamiento. Carriles 3:Control positivo β-actina
(467 pb) y P-gp (151 pb) del tejido tratado con EMB. B) Cuantificación de los
productos amplificados
p
p
en la fig.
g A,, p
para lo cual se utilizaron figuras
g
de
electroforesis en donde se cargó menor cantidad de producto de PCR, con el fin
de obtener señales no saturadas, los resultados están expresados como la media
(n=3) ± la desviación estándar. * P < 0,05 respecto al control.
50
A)
1
2
Músculo
Branquia
Hígado
3
1
2
1
3
2
Caligus
3
1
2
3
Exp
presión mRNA
(%
% del control)
B)
600
*
500
800
*
600
400
200
200
800
150
600
100
400
200
100
0
250
1200
1000
400
300
1400
50
200
0
control
EMB
control
EMB
0
control
EMB
0
control
EMB
Figura 9. Niveles de expresión mRNA de MRP1 en diferentes tejidos de
Oncorhynchus mykiss
y Caligus rogercresseyi con y sin tratamiento de
benzoato de emamectina (EMB). A) Los productos PCR de cDNA total de
hígado, branquia, músculo y homogenizado de cáligus fueron fraccionados por
electroforesis en gel de agarosa al 2% teñidos con Bromuro de Etidio. Carriles 1:
E tá d con peso molecular
Estándar
l
l de
d 100 pb.
b Carriles
C il 2:Control
2 C t l positivo
iti β-actina
β ti (467
pb) y MRP1 (174 pb) del tejido sin tratamiento. Carriles 3:Control positivo β-actina
(467 pb) y MRP1 (174 pb) del tejido tratado con EMB. El producto fraccionado en
el tejido músculo en el carril 3 corresponde a MRP1 de 291 pb. B) Cuantificación
de los productos amplificados en la fig. A, para lo cual se utilizaron figuras de
electroforesis en donde se cargó menor cantidad de producto de PCR, con el fin
de obtener señales no saturadas, resultados están expresados como la media
(n=3) ± la desviación estándar. * P < 0,05 respecto al control.
51
proporcionó un producto de 291 pares de bases para músculo de trucha arcoiris. El
control de carga β-actina amplificó un producto esperado de 467 pares de base (Fig.9
A). Los niveles de expresión de mRNA, se presentan a continuación en la fig.9 B, el
efecto del Benzoato de Emamectina (EMB) sobre la expresión de las proteínas
metabolizadoras antes descritas en distintos tejidos de trucha arcoiris y en cáligus están
expresados como porcentaje del control más su respectiva desviación estándar. La
expresión de hMRP1 en hígado de trucha arcoiris tuvo un leve aumentó a 363,3 % con
respecto al control. En cuanto a su expresión en branquias de trucha arcoiris aumentó a
525,7 % con respecto al control. En músculo de trucha arcoiris la expresión de MRP1
con respecto al control aumentó a 979,7 %. Por otra parte, la expresión de hMRP1 en
cáligus, aumentó a 145,7 %. Los resultados de porcentajes de sobreexpresión se
resumen en la Tabla 2.
4.3 Expresión de la proteína FMO-1 y GST en tejidos de trucha arcoiris y en
homogenizados de cáligus mediante western blot.
Con los anticuerpos anti-FMO-1 y anti-GST se evaluó la presencia de las proteínas
FMO-1 y GST en distintos órganos de trucha arcoiris y en cáligus. Para ello, utilizando
extractos de los diferentes órganos, se realizó una electroforesis en gel de
poliacrilamida al 12,5% en condiciones denaturantes, luego las proteínas se
transfirieron y las membranas se incubaron con sus respectivos anticuerpos.
52
ENZIMA
HÍGADO
%
p
sobreexpresión
BRANQUIA
%
p
sobreexpresión
CYP1A
893±182,8
0,002
166±18
CYP3A
FMO-1
GST
P-gp
MRP1
184,8±80,6
1021,3±213,4
171,1±30,6
120,9±5,6
363,3±116,1
0,142
0,002
0,016
0,003
0,017
264±137,3
344,5±193,6
202,3±1,5
189,1±87,1
525,7±203,5
MÚSCULO
%
p
sobreexpresión
0,003
298,5±119,3
CÁLIGUS
%
0,045
0,107
237,5±82,2
0,044
0,094 4.672,7±476,2 <0,001
125,6±10,1
<0,001
0,012
0,151
296,5±165,7
0,109
979,7±322,7
0,022
0,009
585±216,3
0,018
s.e.
193±84,7
214,3±37,7
162,7±5,4
145,7±63,6
0,13
0,006
<0,001
0,281
s.e.: sin expresión
Tabla 2. Resumen de los porcentajes de sobreexpresión medidos por RT-PCR, de las
enzimas que participan en el metabolismo de xenobióticos en distintos tejidos de
Oncorhynchus mykiss y en homogenizado de Caligus rogercresseyi tratados con
Benzoato de Emamectina (EMB). Los resultados están expresados como la media ± la
desviación estándar de tres réplicas y el porcentaje de sobreexpresión es con respecto al
control. p < 0,005
p
sobreexpresión
53
4.3.1 Expresión de FMO-1 en tejidos de Oncorhynchus mykiss.
En la Fig.10 A se aprecian las bandas inmunoreactivas para los tejidos de Trucha
arcoiris, de 53 kDa para hígado, una banda un poco mayor a la de hígado para branquia
de aproximadamente 54-55 kDa y en músculo se detectó una banda de
aproximadamente 60 kDa, reconocidas por el anticuerpo comercial anti-FMO de
humano.
4.3.2 Expresión de FMO-1 en Caligus rogercresseyi.
La Fig. 10 B muestra la expresión de la proteína FMO-1 en cáligus, una banda de 53
kDa, que coincide con el peso molecular reconocido por el anticuerpo anti-FMO.
4.3.3 Expresión de GST en tejidos de Oncorhynchus mykiss.
En la Fig. 11 se presentan las bandas de 25 kDa en hígado, branquias y músculo de
Trucha arcoiris, correspondientes al peso molecular reconocido por el anticuerpo antiGST.
4.4 Actividad Enzimática en tejidos de Oncorhynchus mykiss.
Con la finalidad de detectar la funcionalidad de las enzimas CYP1A y GST, se midió la
actividad catalítica de estas, en los distintos tejidos de Trucha arcoiris (hígado,
branquias y músculo), mediante la emisión de fluorescencia de los respectivos
productos formados. Los resultados se expresan en velocidad inicial (Unidades de
Fluorescencia relativa / seg.), correspondiente al valor de la pendiente de la curva del
intervalo de tiempo en el cual se ha consumido menos del 5% del sustrato.
54
A)
Hígado Branquia Músculo KDa
60
FMO-1
53
B)
Cáligus
FMO-1
KDa
53
Figura 10. Expresión de FMO-1 en distintos tejidos de Oncorynchus
mykiss y en homogenizado de Caligus rogercresseyi. Por medio de SDS
PAGE all 12,5
12 5 % se separaron 80 ug de
d proteínas
í
d los
de
l
tejidos:
jid
hí d
hígado,
branquia, músculo (A) y homogenizado de cáligus (B) luego, fueron transferidas
a membrana de nitrocelulosa y entonces incubadas con el anticuerpo antiFMO1, las cuales fueron detectados utilizando diaminobenzidina como sustrato
de la peroxidasa.
55
Hígado Branquia Músculo
GST
KDa
25
Figura 11. Expresión de GST en distintos tejidos de Oncorynchus
mykiss. Por medio de SDS PAGE al 12,5 % se separaron 80 ug de proteínas
de los tejidos: hígado, branquias y músculo, luego fueron transferidas a
membrana de nitrocelulosa y entonces incubadas con el anticuerpo anti-GST,
l cuales
las
l fueron
f
d t t d utilizando
detectados
tili
d diaminobenzidina
di i b
idi como sustrato
t t de
d la
l
peroxidasa.
56
4.4.1 Actividad CYP1A en tejidos de Oncorhynchus mykiss.
CYP1A tiene actividad 7 etoxi-resorufina-O-desetilasa (EROD), la cual se ha
establecido como un buen biomarcador en peces (Stegeman and Hahn, 1994), la
finalidad de su medición es poder detectar la funcionalidad en condición basal de la
enzima CYP1A tras detectar la expresión del mRNA en hígado, branquias y músculo de
trucha arcoiris.
4.4.1.1 Actividad CYP1A en Hígado de trucha arcoiris
Para calcular la velocidad inicial de la actividad catalítica EROD en hígado de trucha
arcoiris se procedió, en primer lugar, a medir la emisión de la fluorescencia de dicha
reacción, explicada con detalle en la sección 3.8.1, con una gran cantidad de tejido para
obtener cinéticas de consumo casi total del sustrato (Fig.12A), correspondiente a 100
mg de hígado, las reacciones fueron realizadas en triplicado. El promedio obtenido de
los puntos máximos, de los delta de fluorescencia, punto en el cual ya no hay
disponibilidad de sustrato, fue de 2,1 UFT (Unidades de Fluorescencia Total). A cuyo
valor de delta de fluorescencia total se le calculó el 5%, que corresponde al intervalo de
tiempo en el cual se ha consumido menos del 5 % del sustrato. Para luego, hacer
mediciones dentro de ese intervalo en triplicado, con menos cantidad de tejido, para
calcular la pendiente de dichas curvas, que corresponde al valor de velocidad inicial. El
triplicado de reacciones subsiguientes, se realizaron con 0,01 ug de tejido de hígado
(mediante diluciones seriadas), porque con esta cantidad de tejido se lograron
mediciones bajo 0,11 UF correspondiente al 5% del valor estimado como máximo. El
valor promedio de la pendiente para esta reacción correspondiente a
A)
ejido
Unidades de Fluorescencia Totales /mg te
mg tejido
UFT/m
57
15,0
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
B)
Unidades de Fluorescencia relativa/ug tejido
UFR/ug tejido
Tiempo (seg)
0,205
0,200
0,195
0,190
0,185
Vo=5,07 UFR/ug/seg
r2
2 =0,73
0 73
0,180
0
50
100
150
200
250
Tiempo (seg)
Figura 12. Actividad CYP1A en Hígado de Oncorynchus mykiss. A) Cinética de
conversión del 100% del sustrato 7ER (7-etoxi resorufina O-desetilasa) a resorufina,
de la actividad catalítica de CYP1A en homogenizado de hígado de Trucha Arcoiris.
La curva representa la media de 3 experimentos, en UFT/mg de tejido versus tiempo
(seg). B) Velocidad inicial de la actividad CYP1A en homogenizado de hígado,
representa la media de n=3, en UFR/ug de tejido versus tiempo (seg).
58
la velocidad inicial fue de 5,07 Unidades Fluorescencia Relativa / μg de tejido / seg.,
cuya regresión lineal aplicada a la recta otorgó un r2 de 0,73 (Fig. 12B).
4.4.1.2 Actividad CYP1A en Branquias de trucha arcoiris
Con 90 mg de tejido de branquias se obtuvieron las cinéticas de consumo casi total del
sustrato (Fig. 13A) en triplicado, el promedio de los puntos máximos de los deltas de
fluorescencia fue de 1,07 Unidades de Fluorescencia Total (UFT). Con 0,01 μg de
raspado de filamentos branquiales se lograron mediciones en triplicado para obtener
curvas bajo 0,05 UF, correspondiente al 5% del valor máximo. El valor promedio de la
pendiente para esta reacción correspondiente a la velocidad inicial fue de 8,44
Unidades Fluorescencia Relativa / μg de tejido / seg., cuya regresión lineal aplicada a la
recta otorgó un r2 de 0,80 (Fig. 13B).
4.4.1.3 Actividad CYP1A en Músculo de trucha arcoiris
Con 100 mg de músculo de trucha arcoiris se obtuvieron las cinéticas de consumo casi
total del sustrato (Fig. 14A) en triplicado, el promedio de los puntos máximos de los
deltas de fluorescencia fue de 0,62 Unidades de Fluorescencia Total (UFT). Con 0,01
μg de tejido de músculo se lograron mediciones en triplicado para obtener curvas bajo
0,03 UF, correspondiente al 5% del valor estimado como máximo. El valor promedio de
la pendiente para esta reacción, correspondiente a la velocidad inicial fue de 4,24
Unidades Fluorescencia Relativa / μg de tejido / seg., cuya regresión lineal aplicada a la
recta otorgó un r2 de 0,59 (Fig. 14B).
B)
Unidades
s de Fluorescencia Relativa /ug tejido
o
UFR/ug tejido
A)
Unidades de Fluore
escencia Totales/mg tejido
t
UFT
T/mg tejido
59
,
4,0
3,8
3,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Tiempo (seg)
0,250
0,245
0,240
0,235
0,230
Vo=8,44 UFR/ug/seg
r2
2 =0,80
0 80
0,225
0,220
0
50
100
150
200
250
Tiempo (seg)
Figura 13. Actividad CYP1A en Branquia de Oncorynchus mykiss. A) Cinética de
conversión del 100% del sustrato 7ER (7-etoxi resorufina O-desetilasa) a resorufina,
de la actividad catalítica de CYP1A en homogenizado de branquia de Trucha Arcoiris.
La curva representa la media de n=3, en UFT/mg de tejido versus tiempo (seg). B)
Velocidad inicial de la actividad CYP1A en homogenizado de branquia, representa la
media de n=3, en UFR/ug de tejido versus tiempo (seg).
A)
Unidades de Fluoresc
U
cencia Totales /mg tejjido
UFT/m
mg tejido
60
2,3
23
2,2
2,1
2,0
19
1,9
1,8
1,7
1,6
0
500
1000 1500 2000 2500 3000 3500
B)
Unidades d
de Fluorescencia relattiva /ug tejido
UFR/ug tejido
Tiempo (seg)
0,196
0,194
0,192
0,190
0,188
0,186
0,184
0,182
Vo=4,24
V
4 24 UFR/
UFR/ug/seg
/
r2 =0,59
0,180
0,178
0
50
100
150
200
250
Tiempo (seg)
Figura 14. Actividad CYP1A en Músculo de Oncorynchus mykiss. A) Cinética de
conversión casi total del sustrato 7ER (7-etoxi resorufina O-desetilasa) a resorufina, de
la actividad catalítica de CYP1A en homogenizado de músculo de Trucha Arcoiris. La
curva representa la media de n=3, en UFT/mg de tejido versus tiempo (seg). B)
Velocidad inicial de la actividad CYP1A en homogenizado de músculo, representa la
media de n=3, en UFR/ug de tejido versus tiempo (seg).
61
4.4.2 Actividad Glutation S Transferasa en tejidos de Oncorhynchus mykiss
Tras haber obtenido la expresión del mRNA y de la proteína Glutation S transferasa en
hígado, branquias y en músculo de trucha arcoiris se procedió medir la actividad
catalítica de esta proteína, en los tejidos antes mencionados, mediante el método del
Monoclorobimano como sustrato, descrito por Nauen and Stumpf, (2002) con algunas
modificaciones.
4.4.2.1 Actividad de GST en Hígado de trucha arcoiris
Para la medición de la actividad catalítica en velocidad inicial de GST en hígado de
trucha arcoiris, se procedió, en primer lugar, a medir la emisión total de la fluorescencia
en las condiciones de reacción, explicada con detalle en Material y Métodos. Con 80 mg
de tejido de hígado se obtuvieron cinéticas de consumo casi total del sustrato (Fig.
15A), las reacciones fueron realizadas en triplicado. El promedio obtenido de los puntos
máximos de dichos delta de fluorescencia fue de 311,4 UFT (Unidades de
Fluorescencia Total). A cuyo valor de fluorescencia estimado como máximo, se le
calculó el 5%, para obtener el intervalo de tiempo, en el cual se ha consumido menos
del 5% del sustrato. Por lo tanto, con 0,01 μg de tejido de hígado (mediante diluciones
seriadas), se lograron mediciones bajo 15 UF correspondiente al 5% del valor máximo.
El valor promedio de la pendiente para esta reacción correspondiente a la velocidad
inicial fue de 0,044 Unidades Fluorescencia Relativa / μg de tejido / seg., cuya regresión
lineal aplicada a la recta otorgó un r2 de 0,99 (Fig. 15B).
A)
ejido
Unidades de Fluoresc
U
cencia Totales / mg te
UF
FT/mg
62
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
500
1000 1500 2000 2500 3000 3500
B)
Unidades
s de Fluorescencia re
elativa /ug tejido
UFR/ug
Tiempo (seg)
88
87
86
85
84
83
Vo=0,044 UFR/ug/seg
r2 =0,99
0,99
82
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (seg)
Figura 15. Actividad GST en Hígado de Oncorynchus mykiss. A) Cinética de
conversión del 100% del sustrato Glutation a GSH-MCB, catalizado por GST en
homogenizado de hígado de Trucha Arcoiris. La curva representa la media de 3
experimentos, en UFT/mg de tejido versus tiempo (seg). B) Velocidad inicial de la
actividad GST en homogenizado de hígado,
hígado representa la media de 3 experimentos,
experimentos
en UFR/ug de tejido versus tiempo (seg).
63
4.4.2.2 Actividad de GST en Branquias de trucha arcoiris
Con 180 mg de tejido de branquias de trucha arcoiris se obtuvieron las cinéticas de
consumo casi total del sustrato (Fig. 16A), la reacción se llevó a cabo en triplicado, el
promedio de los puntos máximos de los delta de fluorescencia fue de 111 Unidades de
Fluorescencia Total (UFT). Con 0,01 μg de raspado de filamentos branquiales se
lograron mediciones en triplicado para obtener curvas bajo 5,6 UF, correspondiente al
5% del valor estimado como máximo. El valor promedio de la pendiente para esta
reacción correspondiente a la velocidad inicial fue de 0,050 Unidades Fluorescencia
Relativa / μg de tejido / seg., cuya regresión lineal aplicada a la recta otorgó un r2 de
0,99 (Fig. 16B).
4.4.2.3 Actividad de GST en Músculo de trucha arcoiris
Con 72 mg de tejido de músculo de trucha arcoiris se obtuvieron cinéticas de consumo
casi total del sustrato (Fig. 17A), en triplicado, el promedio de los puntos máximos de
los deltas de fluorescencia fue de 511 unidades de fluorescencia total. Con 0,01 μg de
músculo se lograron mediciones en triplicado para obtener curvas bajo 25,55 UFT,
correspondiente al 5% del valor máximo. El valor promedio de la pendiente para esta
reacción correspondiente a la velocidad inicial fue de 0,042 Unidades Fluorescencia
Relativas / ug de tejido / seg., cuya regresión lineal aplicada a la recta otorgó un r2 de
0,99 (Fig. 17B).
En la Tabla 3 se resumen las velocidades iniciales tanto para CYP1A y GST en los
tejidos hígado, branquias y músculo de Trucha arcoiris.
Unidades de Fluores
scencia Totales / mg tejido
UFT/mg
U
64
160
140
120
100
80
80
60
40
20
0
500
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Unidades de Fluorescencia relativa /ug tejido
UFR/ug
Tiempo (seg)
40
39
38
37
36
35
Vo=0,050 UFR/ug/seg
r2
2 =0,99
0 99
34
33
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (seg)
Figura 16. Actividad GST en Branquias de Oncorynchus mykiss. A) Cinética de
conversión casi total del sustrato Glutation a GSH-MCB, catalizado por GST en
homogenizado de branquias de Trucha Arcoiris. La curva representa la media de 3
experimentos, en UFT/mg de tejido versus tiempo (seg). B) Velocidad inicial de la
actividad GST en homogenizado de branquias,
branquias representa la media de 3
experimentos, en UFR/ug de tejido versus tiempo (seg).
A)
ejido
Unidades de Fluoresc
U
cencia Totales / mg te
UF
FT/mg
65
600
500
400
300
200
100
0
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
B)
Unidades d
de Fluorescencia rela
ativa/ug tejido
UFR/ug
Tiempo (seg)
86
85
84
83
82
81
Vo=0,042
,
UFR/ug/seg
g g
r2 =0,99
80
0
20
40
60
80
100
120
Tiempo (seg)
Figura 17. Actividad GST en Músculo de Oncorynchus mykiss. A) Cinética de
conversión del 100% del sustrato Glutation a GSH-MCB, catalizado por GST en
homogenizado de Músculo de Trucha Arcoiris. La curva representa la media de 3
experimentos, en UFT/mg de tejido versus tiempo (seg). B) Velocidad inicial de la
actividad
i id d GST en homogenizado
h
i d de
d músculo,
ú
l representa la
l media
di de
d 3 experimentos,
i
en
UFR/ug de tejido versus tiempo (seg).
66
TEJIDO
Velocidad inicial
CYP1A (UFR/ug/seg)
TEJIDO
Velocidad inicial
GST (UFR/ug/seg)
Hígado
V0= 5,07 (r2= 0,73)
Hígado
V0= 0,044 (r2= 0,99)
Branquias
V0= 8,44 (r2= 0,80)
Branquias
V0= 0,050 (r2= 0,99)
Músculo
V0= 4,24 (r2= 0,59)
Músculo
V0= 0,042 (r2= 0,99)
Tabla 3. Resumen de las velocidades iniciales de las actividades
enzimáticas
CYP1A
y
GST
en
distintos
tejidos
de
Oncorhynchus mykiss en condiciones basales. Los valores son presentados
como la media (n = 3) y corresponde a la velocidad inicial de cada reacción (V0=
Unidades de Fluorescencia Relativa /ug de tejido / seg), calculada bajo el
intervalo de tiempo, en el cual se consumió menos del 5% del sustrato para cada
actividad. r2: coeficiente de correlación
67
5.- DISCUSIÓN
Un gran número de estudios han reportado la inducción de las enzimas del complejo
Citocromo P450 y de las proteínas MDR por contaminantes ambientales en peces
intermareales (por ejemplo, Stegeman and Lech, 1991; Bard et al., 2002; Rees et al.,
2003; Rees and Li, 2004; Rees et al, 2005; Abrahamson et al, 2007; Bohne et al, 2007;
Mortensen and Arukwe, 2007; Olsvik et al, 2007; Matzuo et al, 2008; Zaja et al., 2008;
Fischer et al., 2009; Loncar et al., 2010), siendo escasos los estudios referentes a la
inducción por Benzoato de Emamectina (EMB), específicamente en piojos de mar y
salmónidos (por ejemplo, Armstrong et al, 2000; Sevatdal et al, 2005; Tribble, 2007;
Lees et al, 2008; Olsvik et al, 2008). La mayoría de estos estudios se han enfocado
principalmente en el hígado, se desconoce un análisis comparativo de los roles de los
diferentes tejidos extrahepáticos en el metabolismo a xenobióticos. Sevatdal et al (2005)
mediante auto radiografía en salmón del Atlántico, demostró que el Benzoato de
Emamectina se distribuye a todos los órganos, en mayor cantidad a órganos excretores,
como hígado y riñón, también encontró altas concentraciones en músculo y mucus del
pez, debido a estos antecedentes se eligieron analizar tejidos como
branquias y
músculo, además de hígado de Trucha arcoiris, como primer paso de análisis,
quedando para un próximo estudio la posibilidad de analizar otros órganos, como por
ejemplo riñón e intestino.
La enzima CYP1A es la más estudiada de las enzimas del complejo citocromo P-450,
utilizada
como
biomarcador
de
contaminantes
ambientales
en
peces.
Más
específicamente metaboliza sustancias químicas como hidrocarburos aromáticos
68
policíclicos (PAH), aminas aromáticas, dioxinas, entre otras, pero no se reporta que
algún antiparasitario cause la inducción de CYP1A.
Este estudio tuvo como finalidad determinar el efecto provocado por el Benzoato de
Emamectina, una de las drogas más efectivas administradas contra infecciones de
piojos de mar, en distintos tejidos, para tener referencia de los niveles de expresión de
las proteínas participantes en el metabolismo de xenobióticos. En los tres tejidos
analizados de trucha arcoiris y en cáligus el mRNA de CYP1A aumentó su expresión en
los tejidos tratados con Benzoato de Emamectina (EMB), con respecto a los controles.
Hígado de trucha arcoiris expuesta a EMB fue el órgano en el que más se sobreexpresó
el transcrito de esta enzima, con respecto a los demás tejidos. Olsvik et al (2007) señala
que la alta inducción que experimenta CYP1A en ciertos órganos de peces expuestos y
la baja expresión de mRNA CYP1A basal, nos indica que CYP1A no es constitutivo de
muchos tejidos. Estas sobreexpresiones pueden explicarse por algún metabolito que se
genera durante la metabolización del fármaco benzoato de emamectina, que sea
sustrato para CYP1A. Al respecto, Heasook et al. (2004) hace referencia de los
principales metabolitos del Benzoato de Emamectina producidos en peces, tales como
productos N-demetilados (9-14%), otro pocos son residuos polares non-avermectina
(menos del 5% del total).
En general, el nivel constitutivo de CYP1A en peces es bajo, pero varios factores, tanto
exógenos como endógenos, pueden afectar la expresión de CYP1A en peces (Goksoyr,
1995). Olsvik et al (2008) es uno de los pocos que reporta la inducción de CYP1A por
69
EMB mediante estudios transcripcionales en Salmo salar. La mayoría de los estudios
reporta altos niveles de inducción de esta enzima, muy utilizada además como
biomarcador en monitoreos ambientales; por ejemplo Rees and Li (2004) observaron
altos niveles de inducción de CYP1A, mediante análisis de transcritos, en tres géneros
de salmónidos, Rees et al (2003; 2005) demostraron que CYP1A es inducible por bnaftoflavona (bNF) en tejidos de trucha arcoiris (como branquias, riñón, hígado y
cerebro), y en juveniles de salmón del Atlántico (mediante biopsias de branquias).
Olsvik et al. (2007) mediante hibridación in situ (ISH) estudió la transcripción espacial
del mRNA CYP1A en hígado de Salmo salar tras inyección intraperitoneal de bNF,
concluyendo que la transcripción fue mayor en la sección media del hígado en
comparación a las partes distal y proximal del órgano. Además, la ISH sugiere que la
transcripción de CYP1A ocurre principalmente en células hepatocitos vecinas a vasos
sanguíneos.
En cuanto a la caracterización de CYP3A, esta ha sido investigada extensamente en
mamíferos, debido al importante rol en el metabolismo de xenobióticos y de esteroides
(Lee and Buhler, 2002), es muy poco lo que se sabe sobre inducibilidad de la enzima
CYP3A en peces (James et al, 2005). Estas son reguladas durante la maduración
sexual, (por lo que respecta a los machos, estos muestran mayores niveles proteicos
que las hembras) metabolizando sustratos endógenos como la testosterona y la
progesterona (Jonsson et al, 2006). El estudio de CYP3A de trucha arcoiris comenzó
con la purificación de esta enzima (LMC5 P450), en los estudios de Miranda et al.
(1989), la cual mostró actividad catalítica contra testosterona y progesterona. CYP3A es
70
probablemente la más importante de todas las enzimas metabolizadoras de fármacos,
altamente documentada para mamíferos su expresión en el epitelio intestinal y en el
hígado. No existen estudios sobre el efecto del Benzoato de Emamectina en CYP3A de
trucha arcoiris, pero si en cuanto a inducción por otros compuestos exógenos, por
ejemplo, Bohne et al (2007) demostraron que la etoxiquina (EQ) a altas concentraciones
induce la expresión del mRNA de CYP3A en Salmo salar. En Hernández et al. (2008) la
actividad catalítica para CYP3A en hígado (BFCOD) del pez Tinca tinca se vió
incrementada tras 10 días y disminuida tras 70 días de ensayo, pero a una
concentración baja de Deltametrina (DM). Hegelund et al (2004) reportaron que el
fungicida Ketoconazol, detectado en el ambiente acuático, induce la expresión tanto de
CYP1A y CYP3A en trucha arcoiris. No obstante, en este estudio tanto la expresión
basal como la inducida por benzoato de emamectina, fueron relativamente débiles en
los tres tejidos de trucha arcoiris estudiados, pero muy similares los porcentajes de
sobreexpresión entre ellos. Siendo que Celander et al (1989) han sugerido que las
CYP3A se expresan principalmente en peces. Liu et al (2008) estudiaron la expresión
del mRNA de CYP3A en el pez Gobiocypris rarus, señalando que precisamente, en
músculo la expresión de CYP3A es relativamente débil en comparación a otros tejidos.
Se detectó la expresión del mRNA de FMO-1 en los tres tejidos analizados de trucha
arcoiris y en cáligus, tanto a niveles basales como tratados con Benzoato de
Emamectina. Claramente se observó una mayor expresión en los tejidos tratados con
antiparasitario, principalmente, en hígado y músculo. Además, fue posible detectar la
expresión de FMO-1 mediante western blot en los tres tejidos de trucha (hígado,
71
branquias y músculo) y en cáligus en condición basal, datos que quedarán como
referencias para posteriores estudios en tejidos tratados con EMB. Importante destacar
la detección en músculo de una banda de un peso molecular diferente al esperado, de
aproximadamente 60 kDa distinto al detectado en hígado (53 kDa) y en branquia (55
kDa aproximadamente). Variaciones como las encontradas en este estudio, han sido
reportadas con respecto a FMO, que señalan expresión diferenciada según tejido, tipo
celular, o entre especies de peces, pero no se ha estudiado en profundidad dichos
mecanismos en peces, como sí en humanos. Por ejemplo, Schlenk et al. (2004) detectó
una proteína de 60kDa con anticuerpos antiFMO1 en microsomas de hígado de trucha
arcoiris, reportándose una nueva isoforma de FMO para hígado de trucha, no
coincidiendo con estudios previos de Schlenk and Buhler (1993) en distintos tejidos de
trucha, en donde se reconocieron FMO entre 56-60 kDa, reconocidas por anti-pig liver
FMO1. Variantes de splicing de genes de FMO se han identificado recientemente en
humanos y muestran tener propiedades catalíticas únicas, además que la expresión de
FMO no es uniforme en las especies de peces (Schlenk, 1998). En algunos casos este
proceso alternativo puede ocurrir en un tipo celular en respuesta a distintas señales de
desarrollo o medio ambiente. Sólo en tejidos de humanos como hígado, riñón y cerebro
se ha reportado splicing alternativo de FMOs (Lattard et al., 2004).
En cuanto a la actividad de FMO, Schlenk (1998) expone, que ha sido mayormente
observada en numerosas especies de invertebrados, pero las expresiones de proteínas
o de transcritos no se han identificado con especial atención. Quedando abierta la
posibilidad de profundizar más con respecto a esta enzima, ya que además se sugiere
72
que FMOs cumple un posible rol osmoregulatorio, especialmente en especies
euryhalinos de peces. Coincidentes con los resultados de Larsen and Schlenk (2001),
quienes
demostraron
que
la
expresión
y
la
actividad
de
FMO
aumentó
significativamente en órganos osmoregulatorios expuestos a alta salinidad (branquias,
riñón e intestino) de juveniles y adultos de trucha arcoiris, cambios no significativos se
observaron en hígado y corazón. Rodríguez-Fuentes et al (2008) señalan que las
condiciones hipersalinas modulan significativamente la expresión de FMO y que el
cortisol juega un importante rol en la aclimatación al agua salada de salmónidos,
demostrando que el cortisol aumentó significativamente la expresión de hFMO en
hepatocitos tratados con NaCl, pero el RT-PCR de cDNA de branquias no produjo el
amplicón encontrado en hepatocitos, sugiriendo una expresión específica de hFMO en
tejido. La existencia de transcriptos de hFMO en hígado y no en branquias es
consistente con los resultados reportados para mamíferos sobre expresión tejidoespecífico de FMO, lo cual puede indicar que esta enzima tenga propiedad funcional
única. En este estudio, la expresión del transcrito de FMO en los tejidos de trucha
arcoiris tratadas con EMB, es de consideración, sin dejar de ignorar que todas las
muestras se recolectaron de Truchas de agua salada, pero deja en claro una posible
inducción de FMO por metabolitos del antiparasitario EMB, en contraste a lo expuesto
en la literatura con respecto a que FMO no es inducible por sustratos exógenos.
Con respecto, a la expresión del transcrito y de la proteína GST, se pudo determinar en
los tres tejidos de trucha arcoiris (hígado, branquias y músculo), sobreexpresándose en
los tejidos tratados con benzoato de emamectina el mRNA de GST. Se detectó la
73
enzima GST mediante western blot en los tejidos antes mencionados, una isoforma de
25 kDa, con el anticuerpo anti-GST. El único reporte que existe sobre el efecto del
benzoato de emamectina en GST de salmónidos es el de Olsvik et al. (2008), quien
demostró que GST (específicamente la clase π) es inducible por Benzoato de
Emamectina en salmón del Atlántico y que esta puede conjugarse a glutation. No
obstante, su metabolito no ha sido descrito en peces. En Pérez (1998) la aplicación
intraperitoneal de diferentes dosis de PCBs (Arochlor) a Trucha arcoiris, permitió
constatar la existencia de un proceso de inducción enzimática de GST, localizado
fundamentalmente en las formas citosólicas de hígado.
La actividad catalítica, medida en la velocidad inicial para los tres tejidos de trucha
arcoiris (hígado, branquias y músculo) en condición control, fueron muy similares sin
grandes variaciones entre ellas. Otros estudios catalíticos de GSTs, han demostrado
que la GST citosólica en salmón Coho fue activada ante el sustrato 1-chloro-2,4dinitrobenzeno. Pero no así, ante los pesticidas methyl parathion o atrazina, es decir,
tiene una limitada capacidad para conjugarse a sustratos toxicológicos tales como
pesticidas y compuestos endógenos asociados al estrés oxidativo celular (Trute et al.,
2007).
En cuanto al efecto del benzoato de emamectina sobre P-gp, se determinó sólo la
expresión del mRNA, en los tejidos a analizar de trucha y en cáligus, tanto a nivel basal
como en condición de tratamiento, observándose una pequeña variación en la
expresión, aumentó la expresión en los tejidos expuestos, pero una sobreexpresión no
74
muy significativa en comparación a lo obtenido para otras enzimas en los mismos
tejidos. En cultivos primarios de epidermis de trucha arcoiris se estudió la presencia de
esta proteína, siendo previamente detectada en tejidos normales de teleósteos
involucrados en funciones de secreción y absorción (Shuilleabhain et al, 2005) y Tribble
et al. (2007) mediante análisis de western blot e inmunolocalización detectó P-gp en
tres tejidos de Salmo salar (intestino, riñón e hígado) e hizo el primer reporte sobre la
sobreexpresión de P-gp por el benzoato de emamectina (EMB) en piojo de hemisferio
norte (Lepeophtheirus salmonis). Señalando que P-gp reduce la eficacia de esta lactona
macrocíclica, disminuyendo la captación celular de la droga, reduciendo así su
concentración en los receptores. Por lo tanto, enfatizó que EMB es un buen sustrato
para el transportador Pgp, cuya expresión se ha documentado como responsable del
desarrollo de resistencia en otras especies de invertebrados.
Tribble et al. (2008) enfatiza que la expresión de P-gp en el piojo de mar del hemisferio
norte no significa que estos sean resistentes a EMB, pero si demuestra que cáligus
presenta uno de los mecanismos de sobreexpresión, documentado como responsable
del desarrollo de resistencia en otras especies de invertebrados.
Similarmente, para MRP1 se determinó sólo la expresión del mRNA tanto en tejidos de
trucha control como tratados con antiparasitario, y en cáligus, observándose a
diferencia de P-gp una mayor sobreexpresión de esta proteína transportadora en los
tejidos tratados, mientras que en cáligus ambos niveles fueron muy similares, no
existiendo una mayor variación. Cabe señalar la débil expresión basal de MRP1 en los
75
tejidos analizados, observación que es coincidente con lo observado por Loncar et al,
(2010), que menciona que a pesar del importante rol de MRP1 en la protección de
células en mamíferos frente a toxinas químicas, se encontró una baja expresión basal
de MRP1 en tejidos de Trucha arcoiris (hígado, cerebro, gónadas, riñón, branquias e
intestino) mediante análisis de mRNA; especialmente en branquias la expresión fue
extremadamente baja.
En conclusión, se analizó el efecto provocado por el antiparasitario Benzoato de
Emamectina (EMB) en proteínas que participan en el metabolismo de drogas, fase I
(CYP1A, CYP3A y FMO), fase II (GST) y fase III (denominada así por algunos autores)
(P-gp y MRP1), mediante la expresión de sus transcritos para todas las proteínas,
expresión mediante western blot sólo para FMO y GST y determinación de la
funcionalidad de las enzimas CYP1A y GST, mediante la obtención de la velocidad
inicial de dichas reacciones en tejidos en condición basal.
Resultados que en general, indican que todas las proteínas analizadas en este estudio
experimentaron un efecto de sobreexpresión en los distintos tejidos de trucha arcoiris,
ante el tratamiento con Benzoato de Emamectina administrado vía oral. Mediante la
metabolización de dicho fármaco, es probable que se activen una serie de factores de
transcripción que inducen a dichas proteínas a sobreexpresarse, posteriormente tal vez,
ocurre la extrusión desde la célula del metabolito conjugado, por alguna proteína de
transporte, que podría ser MRP1, involucrada en la resistencia a drogas, con posterior
excreción del fármaco, siendo lógico pensar que el fármaco no llega en la dosis
76
suficiente al parásito Caligus rogercresseyi, sino que se metaboliza en el organismo del
pez. Lo cual sería una alternativa a considerar. Ya que no se observó una importante
sobreexpresión del transportador P-gp en Caligus rogercresseyi, que hubiese explicado
la resistencia al benzoato de emamectina, mediante la extrusión de este fármaco desde
la membrana plasmática, sin permitir su ingreso a la célula.
Queda de manifiesto, la necesidad de seguir explorando dicha problemática, potenciar
el análisis tanto del complejo Citocromo P450 como de las proteínas de resistencia a
drogas, que en su integración podrían entregarnos una clara explicación de lo que
estaría sucediendo a nivel celular y sistémico, tanto en el huésped como en el parásito,
y así revertir el problema de la resistencia a los antiparasitarios en la caligidosis.
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