Identificación varietal y búsqueda de genes (segmentos de ADN)

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN
Identificación varietal y búsqueda de genes
(segmentos de ADN) asociados y/o
involucrados en la resistencia a
Colletotrichum fragariae en frutilla.
Tesis Doctoral
ING. AGR. MARÍA GABRIELA GARCÍA
-2013-
AUTORIDADES
RECTOR
CPN Juan Alberto Cerisola
VICERRECTORA
Dra. Alicia Bardón
SECRETARIA ACADÉMICA
Dra. Susana Maidana
DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Acreditado y Categorizado A ante la
Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)
Resolución nº: 615/07
Directora:
Dra. Mercedes Lizarralde de Grosso
Comité Académico:
Dra. Marta Inés Bühler
Dr. Atilio Pedro Castagnaro
Dr. Raúl Ricardo Raya
Dr. Alfredo Grau
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN
Facultad de Agronomia y Zootecnia.
Autoridades
Decano
Ing. Agr. José Ramón García
Vice Decano
Ing. Zoot. Mag. Héctor Rolando Navarro
Secretario Académico
Ing. Agr. Carlos Arnaldo Latina
Secretario de Posgrado e Investigación
Ing. Zoot. Oscar Rafael Wilde
Secretario Administrativo
Lic. Eduardo Guardia
Trabajo de Postgrado para la obtención del grado académico superior
de Doctora en Ciencias Biológicas
Ing. Agr. María Gabriela García
Tesista
Dr. Atilio P. Castagnaro
Director de tesis
Dr. Raúl Osvaldo Pedraza
Dr. Daniel Kirschbaum
Comisión de supervisión de Tesis
Este trabajo se realizó, en las primeras etapas, en las instalaciones del
Departamento de Bioquímica de la Nutrición del Instituto Superior de Investigaciones
Biológicas (INSIBIO) e Instituto de Química Biológica ―D
r. Bernabé Bloj‖ de la Facultad de
Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional de Tucumán (UNT). Y en la
ultima parte, en las instalaciones de la Sección Biotecnología de la Estación Experimental
Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC)- Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas (CONICET), Instituto de Tecnología Agroindustrial del Noroeste
Argentino (ITANOA).
En memoria a mis Padres
A mi papá por el ejemplo de vida que me enseño.
A mi mamá por enseñarme a no dejarme vencer nunca.
Dedicada a José Ignacio
AGRADECIMIENTOS
Con estas líneas quiero expresar mi más profundo agradecimiento a todas aquellas
personas que me han ayudado y acompañado en la realización de este trabajo y que han
compartido conmigo todos estos años y por la ayuda incondicional que me han prestado:
A mi director Dr. Atilio Castagnaro por su apoyo y enorme preocupación durante todo este
tiempo y por su valioso asesoramiento.
Al Dr. Juan Carlos Díaz Ricci, por su capacidad y experiencia para guiarme en ciertos
momentos.
A los integrantes de la Comisión de seguimiento el Dr. Daniel Kirschbaum y el Dr. Raúl
Pedraza que con paciencia y dedicación me guiaron, y por sus valiosos aportes realizados
durante este trabajo de Tesis.
A la Bioq. Marta Ontivero por ayudarme a dar los primeros pasos en el ―
mundo de las
técnicas moleculares‖, por su generosidad, por brindarme sus conocimientos y por su
gran colaboración en la corrección de la tesis.
Al Dr. Sergio Salazar por su amistad, su dedicación ilimitada y su gran ayuda en los
ensayos de aislamiento e infección. Un gran compañero!
A la Dra. Paula Filippone por brindarme desde un principio su amistad, por hacerme pasar
momentos felices en el laboratorio, y por su interés y su apoyo incondicional en mis
momentos difíciles. Y a la Lic. Mariela Salgado por su amistad, su paciencia y su buen
humor siempre.
Al Dr. Gustavo Martinez Zamora por enseñarme e instruirme, por su enorme colaboración
en los últimos experimentos especialmente en la técnica de RACE, por sus enseñanzas
en bioinformática y por su amistad.
A la Dra. Marta Arias, Botánica de la Facultad de Ciencias Naturales e Instituto Miguel
Lillo que me enseño y me ayudo con el análisis y evaluación de los descriptores de las
variedades de frutilla.
Al Dr. Bjorn Wellin por sus palabras y sugerencias, y por su importante compañía en la
sección.
A mis compañeros del grupo soja por ayudarme en todo momento. Al Dr. Gabriel Velicce
por su asesoramiento, su colaboración en la corrección de esta tesis y principalmente por
todos los consejos que me dio en este largo camino. Al Lic. Mariano Pardo por su valiosa
ayuda en la edición de todas las figuras y cuadros, y por la compaginación de la tesis. Y a
la Lic. Carla Rocha por su colaboración en la organización de la bibliografía.
A todos mis compañeros y amigos de la EEAOC Francisca Perera, Josefina Racedo,
Georgina Orce, Lorena Sendin, Lorena Romero, Carla Rocha, Aldo Noguera, Mariano
Pardo, Karina Dantur, Elena Díaz, Nora Paz, Alejandro Perea, Nancy Ruiz, Ivana Perez,
Lucas Contreras, María José Soria, Caro Caram, Giuliana Rojas, Sergio Diaz, Carlitos
Grellet, Nadia Chalfoun, Pia Di Peto, Ramón Enrique, Emilia Soria, Paulita Insaurralde,
Ana Cerviño, por su amistad y afecto que hizo que cada día sea mejor.
A los que fueron mis compañeros del laboratorio del INSIBIO: Gabriel Vellicce, Gustavo
Martínez, Mony Mamaní, Marta Arias, Mercedes Zavaleta, Luisa Rodríguez, Omar
Scaravaglio, Ursula Tonello, Cecilia Lemme, Augusto Bellomío, Carlos Minhak, Mónica
Delgado, Viviana Rapisarda, Ana Zenof, Paula Vincent, y Daniela Juárez, entre otros, los
cuales me acompañaron en mis inicios a introducirme en el mundo de la ciencia.
A mi esposo José Ignacio, porque siempre me dió fuerzas para seguir adelante y no
vencerme frente a las complicaciones. Por acompañarme al laboratorio los fines de
semana y feriados a terminar algunos experimentos. Por su paciencia y cariño,
principalmente en mis decepciones. Por su amor…
A mi familia, mis hermanas Elena y Cristina y a mis hermanos Pablo, Miguel, Juan,
Germán y Fredy, y a mis cuñados y cuñadas, que comprendieron mis ausencias
especialmente durante los años que duró la realización de este trabajo. Y especialmente a
mis sobrinos y sobrinas por brindarme su cariño y alegría.
A todas las personas que pasaron por el INSIBIO y por la EEAOC con las cuales compartí
algún momento durante el tiempo que trabajé en esta tesis.
A mis amigas del alma, gracias por justificar mis ausencias, alegrarse con mis logros, y
enseñarme el verdadero valor de la amistad.
Al departamento de Bioquímica de la Nutrición del Instituto Superior de Investigaciones
Biológicas (INSIBIO), por facilitarme el lugar de trabajo y los instrumentos para realizar las
primeras etapas de esta tesis.
A la Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC) por facilitarme las
instalaciones y los medios para concretar esta tesis.
A la Universidad Nacional de Tucumán (UNT), la Agencia Nacional de Promoción
Científica y Tecnológica (ANPCyT) y al Consejo Nacional de Investigación Científicas y
Tecnológicas (CONICET) quienes me brindaron el apoyo económico.
Y a todos a los que ya no me fue posible mencionar, pero que tienen un lugar en mi vida.
Muchas Gracias!!
Publicaciones y presentaciones a eventos científicos con relación al
tema de tesis.
Trabajos publicados
García M G, Ontivero M, Díaz Ricci JC y Castagnaro A. (2002). Morphological traits and
high resolution RAPD markers for the identification of the main strawberry varieties
cultivated in Argentina. Plant Breeding 121: 76-80.
Resúmenes y artículos cortos publicados en revistas o libros
- Castagnaro, A.; Ontivero, M.; Arias, M.; Vellicce, G.; Salazar, S.; Tonello, U.; Martínez Zamora, G.;
García, G.; Terada G.; Aprea A.; Camadro E. y Dìaz Ricci, J. ―
Conservación, caracterización y
utilización del germoplasma silvestre y cultivado de frutilla.‖ J .of Basic & Applied Genetics
(suppl.) XIV(2): 35. Abstract. (ISSN: BAG 1666-0390). 2001.
- García, María Gabriela; Ontivero, Marta; Díaz Ricci, Juan Carlos y Castagnaro, Atilio.
―M
arcadores RAPD de alta resolución para la identificación de las principales variedades
de frutilla (Fragaria ananassa) cultivadas en Argentina.‖ J. of Basic & Applied Genetics (suppl)
XIV (2): 121(abstract) (ISSN: BAG 1666-0390). 2001.
Trabajos presentados a Congresos
- García M. G., Ontivero M., Díaz Ricci J. C. y A. Castagnaro. ―M
arcadores RAPD de alta
resolución para la identificación de las principales variedades de frutilla (Fragaria
ananassa) cultivadas en Argentina‖. XXX° Congreso Argentino de Genética. IV Jornadas
Argentino Uruguayas de Genética‖. Mar del Plata, Argentina. (Septiembre 2001).
- Castagnaro, A., Ontivero, M., Arias, M., Vellicce, G., Salazar, S., Tonello, U., Martínez Zamora, G.,
García, G., Terada G., Aprea A., Camadro E. y J.C. Díaz Ricci. ―Sim
posio: Conservación y
Utilización de Recursos Genéticos‖. XXX Congreso Argentino de Genética. IV Jornadas
Argentino Uruguayas de Genética. Mar del Plata, Argentina. (16-19 Septiembre de 2001).
- Castagnaro A., Ontivero M., García M.G., Salazar S. y J.C. Díaz Ricci. ―U
tilización de
marcadores moleculares en el mejoramiento e identificación de cultivares de frutilla‖. XXV
Congreso Argentino de Horticultura. I Encuentro Virtual de las Ciencias Hortícolas. (3 - 6
de Diciembre de 2002).
- Díaz Ricci, J.C., Salazar, S.M., Arias, M.E., Ontivero, M., García, M.G., Tonello, U.,
Agüero, T, Camadro, E., Zembo, J.C. y Castagnaro, A.P. ―Ap
roximación Biotecnológica
integrada para la caracterización y uso de genes de defensa contra agentes patógenos en
enfermedades de la frutilla‖. IV Simposio de recursos genéticos para América latina y el
Caribe‖. (INTA UBA) Mar del Plata, Argentina. (10 – 14 de noviembre de 2003).
INDICE
PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES A EVENTOS CIENTIFICOS
RESUMEN
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
INTRODUCCIÓN GENERAL
1
1 La Frutilla: Características biológicas de la planta
1
1.1 Clasificación taxonómica y condiciones de crecimiento
1
1.2 Morfología de la planta de frutilla
2
2 La Frutilla: Aspectos generales de producción
4
2.1 Importancia del cultivo de frutilla en el mundo
4
2.2 Cultivo y comercialización de frutilla en Argentina
4
2.3 Tucumán como productor de frutilla
6
3 La Frutilla: principales variedades en Argentina.
8
3.1 Características de cada variedad
8
CAPÍTULO l: Caracterización molecular de cultivares de F. ananassa.
10
Introducción
10
ADN, marcadores moleculares y biología molecular
11
Marcadores moleculares de ADN en la mejora genética
12
Marcadores moleculares de ADN en Frutilla
14
Marcadores RAPD
15
Materiales y métodos
17
Material vegetal
17
Características morfológicas
17
Análisis molecular
17
Extraccion de ADN genómico
17
Caracterizacion por RAPD
18
Análisis de los datos
20
Resultados
22
Discusión
33
Conclusiones
34
CAPÍTULO ll: Caracterización fenotípica de cultivares de F. ananassa.
35
Introducción
35
La antracnosis
35
Ciclo de la enfermedad y epidemiologia
40
Materiales y métodos
42
Material vegetal
42
Condiciones de crecimiento
42
Material fúngico
42
Inoculación
43
Evaluación del grado de severidad de la enfermedad
44
Análisis de los datos
44
Resultados
46
Características morfológicas del aislado F7
46
Discusión
49
Conclusiones
49
CAPÍTULO lll: Búsqueda de marcadores moleculares asociados con genes que
aumenten la resistencia a C. fragariae en frutilla.
50
Introducción
50
Manejo integrado
50
Interacción planta–patógeno
51
Resistencia mediada por genes R
53
Estructura y función de los genes R
54
Utilización de los genes R
55
Genómica funcional
56
Análisis transcriptomico mediante cDNA-AFLP
58
Caracterización genómica por AFLP
59
Genes de defensa en F. ananassa.
60
Materiales y métodos
63
Material vegetal
63
Inoculación con el aislado F7
63
Extracción de ARN total
63
Técnica cDNA-AFLP
65
Amplificación por AFLP
67
Electroforesis en geles de poliacrilamida
69
Análisis de los datos
70
Aislamiento y reamplificación de TDF
70
Clonado de los TDF
70
Transformación de E. coli mediante electroporación
71
Purificación de plásmidos y verificación de insertos
72
Secuenciación
73
Análisis bioinformático de secuencias obtenidas
73
Análisis de expresión
74
Técnica RLM-RACE
74
Resultados
78
Técnica de cDNA-AFLP
78
Análisis de las secuencias
83
Discusión
96
Conclusiones
100
CAPÍTULO lV: Construcción de una población segregante para el carácter
resistencia/ susceptibilidad al aislado F7 de C. fragariae.
101
Introducción
101
Marcadores moleculares en el mapeo genético
102
Tipos de mapas
103
Uso de los mapas genéticos
103
Mapeo de genes de resistencia
104
Materiales y métodos
107
Resultados
108
Discusión
109
Conclusión
109
CONCLUSIONES FINALES
110
PROYECCIONES
110
BIBLIOGRAFIA
111
ABREVIATURAS
µl: microlitros
AFLP: polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados.
APS: Persulfato de amonio
ARNm: ARN mensajero.
Avr/Avr: gen/proteína de avirulencia.
BGA: Banco de Germoplasma Activo
CC: dominio ―coiled
-coil‖.
cDNA: ADN complementario
CTAB: bromuro de hexadecil trimetil amonio
DEPC: Dietilpirocarbonato
dNTP: desoxiribonucleótidos trifosfato.
DSR: índice de severidad de enfermedad
EDTA: ácido etilen diamino tetra acético.
EEAOC: Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres
EST: etiquetas de secuencias expresadas
ET: etileno.
ha: hectarea
HR: respuesta de hipersensibilidad.
INDEC: Instituto Nacional de Estadisticas y Censo
INTA: Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria.
ISR: resistencia sistémica inducida.
ISSR: secuencias simples repetidas internas
JA: ácido jasmónico.
LAR: resistencia local adquirida.
LRR: repeticiones ricas en leucina.
MAMP: patrón molecular asociado a microbios.
MAPK: MAP quinasa.
MAS: selección asistida por marcadores.
NBS: del Ingles ―N
ucleotide Binding Site‖
ng: nano gramos
nm: nanómetros
pb: pares de bases.
PCR: reacción en cadena de la polimerasa.
pmol: picomol
PR: proteínas relacionadas con la patogénesis.
PVP: polivinilpirrolidona
QTL: loci de características cuantitativas.
R/R: gen/proteína de resistencia.
RACE: amplificación rápida de los extremos del cDNA.
RAPD: polimorfismo de ADN amplificado al azar
RNAsa: ribonucleasa.
SA: ácido salicílico.
SAR: resistencia sistémica adquirida.
SENASA: Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
SSR: secuencias simples repetidas
TAE: Tris - Ácido acético – EDTA
TBE: Tris – Ácido bórico – EDTA
TEMED: N,N,N‘,N‘- Tetramethylenediamina
TIR: homólogo de Toll (Drosophila) e Interleuquina-1 (mamíferos).
TNL: proteínas de resistencia NBS-LRR con dominio TIR N-terminal.
Tris: trihidroximetilaminometano
UPOV: Union Internacional para la Proteccion de las Obtenciones Vegetales
WRKY: superfamilia de factores de trascripción que presentan la secuencia WRKYGQK.
X-GAL: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
Identificación varietal y búsqueda de genes (segmentos de ADN) asociados y/o
involucrados en la resistencia a Colletotrichum fragariae en frutilla.
RESUMEN
El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue caracterizar los genotipos más
usados en el Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla),
estimar la diversidad genética disponible e identificar regiones del genoma (genes y/ o
segmentos de ADN) de la frutilla que pudieran estar asociadas con la resistencia a
Colletotrichum fragariae, uno de los causantes de la antracnosis.
Utilizando la técnica RAPD se estimó la diversidad genética del Banco de
Germoplasma Activo del Pro-Frutilla, se genotiparon progenitores y se detectaron
variaciones genéticas entre accesiones de un mismo cultivar, lo que puede deberse a la
acumulación de mutaciones por multiplicación agámica independiente. También se
observaron entre estas accesiones diferencias fenotípicas respecto de su comportamiento
frente al aislado F7 de C. fragariae.
Un genotipo susceptible (Mendoza) y otro resistente (Salta) a C. fragariae, se
utilizaron para obtener una población de mapeo y para analizar su expresión génica
diferencial mediante la técnica cDNA-AFLP. Esto permitió identificar al menos 60 genes
que se expresaron específicamente en el genotipo (accesión) resistente. El producto de
expresión de uno de estos genes presentó homología con proteínas putativas de la clase
NBS-LRR, correspondientes a dos subclases (TIR y CC), que son proteínas de resistencia
del tipo R. El estudio de la expresión de este transcripto reveló una represión del mismo
en el genotipo suceptible luego de la infección con el aislado F7, mientras que no hubo
cambios significativos en la expresión relativa en el genotipo resistente. Este patrón de
expresión fue previamente informado para varios miembros de los genes R. Por la
importancia de estos genes R en la defensa vegetal, es necesario completar un estudio
más exhaustivo para entender los mecanismos que puedan estar involucrados en la
defensa de la frutilla contra C. fragariae.
El análisis bioinformático de los genes restantes arrojó los siguientes resultados: (i)
un grupo mostró homología con genes de plantas, fundamentalmente de Fragaria vesca,
que se expresaron ante estrés biótico y abiótico; (ii) tres genes presentaron similitud con
factores de transcripción y otro con un mensajero que aparece en Fragaria ananassa en
respuesta a ácido salicílico; y (iii) una pequeña fracción presentó homología con genes de
otros eucariotas a los cuales se le asignaron funciones diversas o no tienen función
putativa conocida.
Esta tesis puso en evidencia que la propagación agámica de frutilla, no controlada,
puede acumular mutaciones que modifiquen su genotipo y fenotipo agronómico. Además,
permitió profundizar en el conocimiento de la genética de la resistencia a patógenos, entre
lo que se destaca haber caracterizado un nuevo gen putativo de resistencia, lo que a su
vez abre interrogantes respecto de si la expresión diferencial de este gen puede ser la
responsable de que un genotipo sea o no resistente.
HIPOTESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis de trabajo
1. Usando las aproximaciones biotecnológicas moleculares adecuadas, no sólo es
posible estimar y analizar la diversidad genética en el Pro-Frutilla, sino que pueden
permitir detectar variaciones genéticas entre individuos propagados agámicamente
(clones), debidas estas últimas a la acumulación de mutaciones espontáneas que se
producen durante largos procesos de multiplicación clonal (agámica o asexual).
2. Estas variantes genéticas leves pueden o no verificarse a través de caracteres
fenotípicos, morfológicos y/ o agronómicos (como los descriptores de la UPOV), lo que
implica que pueden inclusive afectar el comportamiento frente a agentes patógenos como
los causantes de la enfermedad de la antracnosis.
3. En el caso de que las diferencias genéticas tengan una correspondencia con
cambios fenotípicos respecto de la resistencia/ susceptibilidad a un determinado patógeno
(como por ejemplo C. fragariae), utilizando estrategias genéticas y/ o métodos
moleculares apropiados, se pueden buscar marcadores moleculares asociados con la
resistencia y también genes que puedan de algún modo estar implicados en la misma.
Objetivos
El objetivo general de esta tesis doctoral fué llevar a cabo una profunda caracterización de
los progenitores (genotipos) mas usados en el Pro-Frutilla, estimar la diversidad genética
disponible e identificar regiones del genoma (genes y/ o segmentos de DNA) de la frutilla
que estén asociadas o involucradas en la resistencia a uno de los agentes etiológicos de
la enfermedad de la antracnosis: C. fragariae.
En cumplimiento de lo anterior nos hemos planteado los siguientes objetivos parciales:
1. Caracterización genotípica de cultivares y de accesiones del Banco de
Germoplasma Activo (BGA) del Pro-Frutilla, estimación y análisis de la diversidad
genética y su relación con la utilización de los descriptores o caracteres fenotípicos de la
UPOV.
2. Caracterización fenotípica de accesiones elegidas del BGA con respecto a su nivel
de resistencia/ susceptibilidad frente al aislado F7 de C. fragariae.
3. Construcción de una población lo más consanguínea posible donde esté
segregando el carácter de resistencia/ susceptibilidad al aislado F7, de tal forma de poder
a futuro mapear marcadores moleculares asociados con la resistencia.
4. Identificar transcriptos que se expresen diferencialmente en genotipos de frutilla
emparentados y con resistencia/ susceptibilidad contrastante frente al asilado F7 de C.
fragariae.
5. Estudio Bioinformático.
6. Validación de transcriptos y/ o marcadores.
INTRODUCCION GENERAL
1. La Frutilla: Características biológicas de la planta
1.1. Clasificación taxonómica y condiciones de Crecimiento.
La frutilla pertenece a la Familia Rosaceae, Subfamilia Rosoidea, Tribu Potentillea y
género Fragaria. Su nombre deriva del latín Fragans, relacionado con el aroma
característico que presentan sus frutos. El género Fragaria incluye 23 especies (Shualev y
col., 2008). La especie silvestre más común, Fragaria vesca, es un organismo diploide
con 14 cromosomas (2n=2x=14). Otras especies importantes son F. viridis Duchesne
también diploide, F. moschata Duch. hexaploide (2n=6x=42), F. chiloensis Duch.
Octoploide, F. ovalis Rhydb Octoploide y F. virginiana Duch. Octoploide.
Sin embargo, la especie más cultivada es Fragaria ananassa Duch., organismo octoploide
que cuenta con 56 cromosomas (2n=8x=56). Esta especie híbrida proviene del
cruzamiento entre F. virginiana Duch. de Estados Unidos destacada por su sabor, y F.
chiloensis (L.) Mill de Chile, destacada por su gran tamaño (Hancock, 1999). Se trata de
una especie herbácea perenne y estolonífera de bajo porte considerada un cultivo
hortícola, a pesar de que su producto comercial es una fruta. Otros autores la incluyen en
el grupo de las frutas finas o berries junto a especies como el arándano, la frambuesa y la
zarzamora (Kirschbaum y Hancock, 2000).
El cultivo de frutilla se ha extendido por casi todo el mundo debido a la disponibilidad de
variedades adaptadas a las distintas condiciones agroecológicas y a los modernos
sistemas agrícolas, promoviendo la producción de frutilla desde las regiones frías hasta
las regiones tropicales, pasando por las templadas y las subtropicales (Hancock y
Retamale, 1999). La frutilla se adapta bien a climas húmedos con temperatura media
anual entre 15 y 20ºC y con una mínima no inferior a los -6ºC y una máxima no mayor de
35ºC. Se cultiva en diferentes tipos de suelo, desde arcillosos a arenosos, y los más aptos
son los francos a franco-arenosos, de buena fertilidad y buen drenaje con pendiente para
evacuar el exceso de agua durante de altas precipitaciones. El rango óptimo de pH es de
5,5 a 7,0. La frutilla es sensible a la salinidad del suelo, por lo que la conductividad
eléctrica del extracto de saturación no debe superar 1 mmhos/cm. El requerimiento hídrico
mínimo es de 600 mm anuales. El agua de riego debe ser libre de sodio, cloro, boro y el
contenido total de sales no mayor de 400-600 ppm (Pritts y Handley, 1999).
1
1.2. Morfología de la planta de frutilla
Raíces: Son de aspecto fibroso, las que se originan de la corona (Figura 1) se denominan
primarias y responsables del soporte, las secundarias que se originan a partir de las
primarias son más delgadas y su función principal es la absorción de los nutrientes
(Strand, 1994). Las raíces pueden penetrar en el suelo hasta 0,80 m, pero generalmente
se encuentran en los primeros 0,40 m.
Tallo: La frutilla presenta un tallo de tamaño reducido pero engrosado denominado
―coron
a‖ (Figura 1). Entre cada hoja y la corona se forman las yemas auxiliares que dan
origen a estolones o ramas de la corona de acuerdo a las horas de luz y a la temperatura
del medioambiente. Inflorescencias pueden formarse solo a partir del meristema de cada
corona. Las ramas de la corona pueden a su vez producir raíces adventicias y aumentar
el número de frutos por planta (Strand, 1994; Hancock, 1999).
Hojas: Tienen pecíolos de longitud variable, son pinadas o palmeadas, generalmente
constituidas por tres folíolos de color verde intenso (Figura 1). Tienen estípulas en la base
de su pecíolo. Emergen de la corona ubicándose las hojas jóvenes cerca del centro y las
senescentes alrededor de la misma, en forma espiralada. Cuentan con un alto número de
estomas sobre el envés de cada folíolo, lo que aumenta su tasa de transpiración y por lo
tanto su sensibilidad a la falta de humedad (Strand, 1994; Hancock, 1999).
Estolón: Es un brote delgado, largo, rastrero, que se forma a partir de las yemas axilares
de las hojas situadas en la base de la corona (Figura 1). Su aparición es frecuentemente
promovida por altas temperaturas y foto-períodos prolongados. En el extremo del estolón
se forma una roseta de hojas con su propia corona que en contacto con el suelo emite
raíces, lo que origina una nueva planta con idénticos caracteres a los de la planta madre,
proceso conocido como propagación agámica. Hasta que la planta hija desarrolla su
sistema radicular, recibe agua y nutrientes de la planta madre por medio del sistema
vascular del estolón. Después de 2 a 3 semanas de emitir raíces, la planta hija es capaz
de sobrevivir por si mísma (Strand, 1994; Hancock, 1999).
2
e
f
b
c
g
d
a
Figura 1: Morfología de Fragaria x ananassa Duch. (a) Raíz, (b) Corona, (c) Hoja, (d) Estolón, (e) Flor, (f)
Fruto, (g) Planta hija.
Flor: La flor de la frutilla es de simetría actinomorfa (radial), pedunculada, con un grueso
receptáculo que se hipertrofia después de la fecundación junto con el ovario para
convertirse en fruto (en realidad, el fruto botánico es el aquenio, que tiene la apariencia de
una semilla). La flor perfecta está constituida por un cáliz, compuesto normalmente por
cinco sépalos, una corola compuesta por cinco pétalos generalmente blancos y
numerosos estambres insertos en el receptáculo que contiene además los pistilos
dispuestos en espiral sobre él. Las flores se originan a partir de inflorescencias de la
corona, inicial como una flor primaria bajo la cual se forman 2 flores secundarias y así
sucesivamente hasta incluso cuaternarias (Strand, 1994; Hancock, 1999).
Fruto: Los frutos son del tipo múltiple, cuyo receptáculo constituye la parte comestible.
Los aquenios son los frutos verdaderos, son secos indehiscentes, uniseminados, de 1 mm
de largo, que se encuentran en la superficie del receptáculo. Un fruto mediano suele tener
de 150 a 200 aquenios pudiendo llegar hasta 400 en los de gran tamaño. Después de la
fecundación, los óvulos al convertirse en aquenios regulan el engrosamiento del
receptáculo que finalmente constituirá la parte comestible del llamado fruto. El receptáculo
alcanza su madurez entre los 25 y 60 días luego de la polinización adquiriendo hasta 5 cm
de diámetro y distintas formas (Strand, 1994; Hancock, 1999). Su color puede ser rosado,
carmín, rojo o púrpura. El receptáculo presenta una gran variedad de sabores, aromas y
texturas que caracterizan a cada variedad.
3
2. La Frutilla: Aspectos generales de producción
2.1. Importancia del cultivo de frutilla en el mundo
El cultivo de la frutilla adquirió un elevado interés mundial debido a las propiedades
organolépticas tan especiales de su fruto y los diferentes beneficios que aporta a la salud
humana.
Se consume directamente en forma fresca, pero es ampliamente utilizado en la industria
en la elaboración de jaleas, salsas, conservas, congelados, yogures, bebidas y helados
(Branzanti, 1989). El consumo fresco ha demostrado tener efectos benéficos sobre
enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y otras enfermedades en humanos
como obesidad y cáncer (Maas y col., 1991; Zhang y col., 2008; da Silva Pinto y col.,
2010).
La producción de frutilla adquiere un creciente valor agregado debido a que la demanda
mundial ha impulsado su industrialización y exportación, empleando cada vez más
tecnología e insumos. Incluso el cultivo de frutilla demanda importante mano de obra tanto
para la producción y cosecha en el campo, como para el empaque de fruta fresca y para
la industria del congelado. Actualmente la producción de plantines de frutilla en viveros
constituye una actividad con creciente importancia económica.
La producción mundial de frutilla ha experimentado un aumento significativo en las dos
últimas décadas, alcanzando 5 millones de toneladas en el año 2012 (Zhang, 2012; FAO,
2012). El mayor productor mundial es China (2.000.000 t), siguiéndole EE.UU. (1.500.000
t) y luego España, Corea del Sur, Japón, Polonia, Turquía, Italia, Alemania y México con
producciones menores (Zhang, 2012: FAO 2012).
2.2. Cultivo y comercialización de frutilla en Argentina
Argentina es uno de los cuatro principales países productores de frutilla en América del
Sur, con una producción continua durante los doce meses del año. En la actualidad se
cultivan anualmente ~1.500 ha de frutilla y ~200 ha de viveros de frutilla. El rendimiento
promedio está en 30 t/ha, en un rango variable que va de 10 a 50 t/ha. La frutilla
producida se exporta como fruta congelada principalmente, y también como fruta fresca.
La exportación de fruta congelada alcanzó un máximo en el año 2006 de 16.727
toneladas, a partir del cual mostró una disminución anual llegando a llegando a 9.200
toneladas en el 2011 de acuerdo a datos de la EEAOC y el Instituto Nacional de
Estadísticas y Censo (INDEC, Rodriguez y col., 2012). Los principales destinos de la fruta
congelada exportada desde Argentina son Estados Unidos, China, Brasil y Canadá.
4
Figura 2: Principales destinos de la exportación argentina de frutilla congelada expresados en volumen
porcentual, Año 2011. Fuente: EEAOC con datos del INDEC, 2012.
En cuanto a la exportación de fruta fresca los volúmenes son bastante menores, solo se
realizan durante primavera y verano, y mostraron un aumento del 37% entre 2010 y 2011.
Durante el 2011 se exportaron 47 toneladas de frutilla como fruta fresca, principalmente
hacia Francia (Rodriguez y col., 2012).
Argentina por tener territorios en altas latitudes y contar con valles de altura frescos, se
destaca junto a Chile por sus ventajas competitivas para producir plantines de frutilla.
Según fuentes del sector privado, Argentina produce 40 millones de plantas. Típicamente
para la producción de fruta se utiliza una densidad de 50.000 a 80.000 plantas/ha. La
demanda estimada de plantines de frutilla anual para el país es aproximadamente de 50
millones. Viveros especializados nacionales suministran el 85% de esta cantidad,
mientras que el 15% restante es importado de Estados Unidos principalmente
(Kirschbaum y Hancock, 2000). Las zonas productoras de plantas están distribuidas en
las provincias de Santa Cruz, Chubut, Neuquén, Mendoza y Tucumán. Las plantas de
frutilla son comercialmente obtenidas por propagación vegetativa de plantas madres, lo
que requiere partir de material sano y realizar las labores de multiplicación con máximo
cuidado. Se utiliza la micropropagación in vitro, a partir de meristema de estolón,
realizando un número limitado de subcultivos para evitar la introducción de variaciones
somaclonales (Martínez Zamora y col., 2001). A partir de estas plantas madres se realizan
sucesivas multiplicaciones agámicas a campo por enraizamiento de estolones, hasta
obtener la primera generación clonal que es la que se comercializa. Si bien el cultivo de
frutilla se lleva a cabo en 9 provincias, actualmente la producción se concentra
principalmente en las provincias de Santa Fé, Tucumán, Corrientes y Buenos Aires. Esta
5
amplia distribución en la producción hace que exista fruta fresca disponible durante todo
el año (Cuadro 1).
Cuadro 1: Calendario de cosecha de frutilla en Argentina. (Fuente: Kirschbaum y Hancock 2000).
Región
Provincia
Norte
Tucumán
En
Fe
Mz
Ab
My
Jn
Jl
Ag
Se
Oc
No
Di
Salta-Jujuy
Corrientes – Misiones
Centro
Sta Fe (Coronda)
Bs As (Norte)
Sur
Bs As (Sur)
Río Negro – Neuquén
2.3. Tucumán como productor de frutilla
La provincia de Tucumán presenta zonas con excelentes condiciones agroecológicas para
el cultivo de la frutilla, destacándose tanto en la producción de fruta y de plantines (Pérez
y Mazzone, 2004). Aunque la producción de frutilla tiene un costo elevado, este sector
productivo ha experimentado un importante crecimiento desde la década de los 90 en
Tucumán. Inclusive se ha posicionado como la principal provincia productora de frutilla
congelada en la Argentina.
De acuerdo a datos presentados por Kirschbaum y col., (2012), Tucumán produce
alrededor de 14.000 toneladas de frutilla anuales con un rendimiento promedio de 31 t/ha
para el año 2011, aunque en algunos casos ha superado las 50 t/ha, destacándose como
un polo productor e industrializador de frutilla en Argentina. La producción, el comercio
interno y las exportaciones de frutilla se incrementaron en los últimos años impulsados
además por la incorporación de tecnología y el cumplimiento de normas (BPA, BPM,
HACCP, GlobalGap, trazabilidad) que aseguran la calidad y sanidad del producto. Una
importante parte de la producción de frutilla de Tucumán se destina al mercado externo.
Durante el año 2011 el volumen exportado por nuestra provincia ascendió a 5.781 t y
representó el 63% de la frutilla comercializada por el país en el exterior. Comparada con
el año 2010, la cantidad exportada representó un aumento del 2% (Rodriguez y col.,
2012).
Como se muestra en el Cuadro 1, en Tucumán se produce fruta prácticamente todo el año
en forma intensiva con las siguientes modalidades: la producción primicia que comprende
6
el período abril-agosto, la frutilla de estación que es cosechada de septiembre a
noviembre y la producción de verano que se realiza de diciembre a marzo.
La superficie de frutilla plantada en Tucumán comprende alrededor de 450 ha
(Kirschbaum y col., 2012) ubicadas principalmente en Lules, Famaillá, Monteros,
Chicligasta y Alberdi (Kirschbaum, 2009). La producción durante el verano proviene
principalmente de Tafí del Valle que cuenta con 25 ha plantadas, parte de esta superficie
se destina a la venta de plantines (Rodriguez y col., 2009).
De la frutilla producida en Tucumán un 50% se exporta como fruta congelada, el resto se
comercializa como fruta fresca en Tucumán y el resto del país. El mercado central de
Buenos Aires (MCBA) recibe la producción de frutilla proveniente principalmente de Santa
Fé, Tucumán y Corrientes siendo el período de septiembre y octubre el de mayor volumen
de fruta ingresada. Sin embargo Tucumán comienza a comercializar en forma importante
su producción desde junio y julio período en el cual adquiere alto valor económico por ser
fruta primicia.
Cuadro 2: Ingresos provinciales de frutilla al MCBA, expresados en toneladas. Años 2010 y 2011. Fuente:
Rodriguez y col., 2012.
Figura 3: se observan los ingresos de frutilla al MCBA en t (toneladas), según su origen, durante el año
2011. Fuente: Rodriguez y col., 2012.
7
Tucumán es la principal provincia exportadora de frutillas congeladas argentinas,
aportando entre un 70 y 90% del total exportado por el país por este concepto.
En el año 2008 el 80% de la frutilla exportada en Argentina fue producida en Tucumán,
según datos del SENASA. Las exportaciones de frutilla producida en nuestra provincia
fueron destinadas principalmente a Estados Unidos, y en menor proporción a China,
Chile, Canadá y Brasil.
3. La Frutilla: principales variedades en Argentina.
3.1. Características de cada variedad
Los cultivares de frutilla tienen diferente requerimiento de fotoperíodo y se los clasifica de
acuerdo a su respuesta a las horas de luz del día. El tipo de planta que responde al
fotoperíodo para florecer se la llama planta de día corto y las indiferentes a la longitud del
día son llamadas plantas neutras o reflorescientes (Brandán, 2009).
A continuación se mencionan algunas de las variedades más utilizadas en los últimos
años en nuestro país, las cuales forman parte del Banco de Germoplasma Activo (BGA;
Arias y col., 2006) y constituyen los principales progenitores del Pro-Frutilla (Castagnaro y
col., 2004).
„Pájaro‟: El fruto se destaca por su calidad: de buen sabor, de forma tronco cónica
regular, ligeramente alargado, color superficial rojo brillante e interior también coloreado.
Es una de las variedades de mayor aceptación en el mercado internacional. Escasa
resistencia al transporte. Susceptibilidad a la enfermedad de la antracnosis.
„Chandler‟: Tiene buen tamaño, es firme, cuneiforme, buen sabor y color rojo por dentro,
no tan regular como ‗Pájaro‘. En determinadas condiciones climáticas presenta una
maduración incompleta, quedando el ápice de la fruta de color verde o blanco.
„Camarosa‟: Variedad de día corto similar a ‗Chandler‘ pero con mayor productividad
total, y de frutos más grandes y más firmes. Presenta un fruto grande a veces deforme,
muy precoz, de color rojo brillante externamente, coloreado interiormente y de sabor de
calidad inferior al de ‗Pájaro‘, aunque de mayor firmeza.
„Milsei Tudla‟: Frutos grandes, cilíndricos, alargados, aquenios semi-hundidos, color rojo
brillante, aromáticos, buena aptitud para el transporte, dureza similar a ‗Chandler‘.
„Oso Grande‟: Su inconveniente es la tendencia del fruto al rajado. No obstante presenta
buena resistencia al transporte. De color rojo anaranjado, forma de cuña achatada, calibre
grueso y buen sabor.
8
„Rosa Linda‟: Frutas cónicas tamaño medio. Color rojo brillante por fuera e interior rojo
intenso, más firme que ‗Sweet Charlie‘, de buen sabor y aroma.
„Seascape‟: introducida en 1991 por la Universidad de California como una variedad de
día neutro superior a ‗Selva‘. Se destacan su sabor, alto rendimiento, gran tamaño de
frutos, firmeza, apariencia atractiva.
„Selva‟: Variedad de día neutro introducida en 1983 por la Universidad de California.
Cuneiforme, color rojo anaranjado que no se oscurece con el tiempo. Buen tamaño y muy
firme, no tiene muy buen sabor, es poco jugosa y de mucha dureza al final de la
temporada.
„Sweet Charlie‟: Variedad de día corto, fruta de tamaño medio, roja y de excelente sabor.
De menor potencial de rendimiento, pero altamente precoz y con la ventaja añadida de
presentar altos niveles de resistencia a la antracnosis.
Las variedades más comercializadas en la región norte y central de nuestro país son
‗Camarosa‘, ‗Chandler‘, ‗Sweet Charlie‘, ‗Pájaro‘ y Milsei Tudla‘. ‗Selva‘ y ‗Seascape‘ son
las más frecuentes en la región del sur del país. Mientras que los otros cultivares ‗Oso
Grande‘ y ‗RosaLinda‘ también son de importancia (Kirschbaum y Hancock, 2000).
9
CAPITULO l
Caracterización molecular de cultivares de F. ananassa.
INTRODUCCION
El cruzamiento de las especies Fragaria chiloensis L. con Fragaria virginiana Duch.
originó plantas de mejor rendimiento y grandes frutos de muy buena calidad. Estas han
sido clasificadas como Fragaria ananassa Duch, especie híbrida a partir de la cual se han
desarrollado las variedades de frutilla actualmente cultivadas. Thomas Knight en 1795
inició sus trabajos de mejoramiento a través de cruzamientos e hibridaciones utilizando
materiales de Estados Unidos de Norteamérica y obtuvo dos variedades conocidas como
‗Dowton‘ y ‗Eton‘. Estas investigaciones fueron el punto de partida para que,
posteriormente en Inglaterra en 1811 y 1814, se desarrolle el mejoramiento de la frutilla
bajo los auspicios de la "England´s Royal Horticultural Society", de la cual Thomas Knight
fue fundador y presidente durante un largo período. En 1834, en Estados Unidos de
Norteamérica se obtuvo la variedad comercial conocida como ‗Hooey‘, más resistente al
frío que las importadas de Inglaterra. Posteriormente Wilson en 1851 mediante sus
trabajos de fitomejoramiento transforma la producción de frutilla como cultivo de
importancia económica en todo el territorio de Estados Unidos de Norteamérica. A partir
del año 1900, la Universidad de California intensificó notablemente sus trabajos de
mejoramiento genético. En igual forma lo hicieron los países europeos y posteriormente
países de otros continentes.
En las últimas cinco décadas se ha hecho un progreso considerable en los programas de
mejoramiento genético de la frutilla. En la actualidad se estima que existen más de 500
variedades de frutillas cultivadas comercialmente en todo el mundo (Galletta y Maas,
1990).
Dentro de un programa de mejoramiento es necesario conocer la variabilidad genética del
germoplasma que se posee. La información de la diversidad genética es importante para
la comprensión de las fuentes de variación genética, la determinación de la forma en que
se mantiene la variación genética, cual es la tasa de cambio, etc. Esta información es
necesaria para predecir por ejemplo, cuánto tiempo puede durar una fuente de resistencia
y formular las estrategias de manejo y sobre todo para dirigir cruzamientos que maximicen
la diversidad y el potencial productivo.
Actualmente existe un gran número de colecciones de germoplasma que contienen
genotipos con un alto valor agronómico, susceptibles de ser usados en los programas de
10
mejoramiento genético. Sin embargo, en muchas ocasiones se cuenta con escasa
información de la diversidad genética de los progenitores de los programas de
mejoramiento, lo que impide su óptima utilización (Becerra y Paredes, 2000). Dentro de
las colecciones existen materiales ingresados como accesiones diferentes que en muchos
casos resultan ser un mismo genotipo pero recolectado de distinto lugar geográfico. En
ciertas ocasiones algunas accesiones pueden incluir distintos genotipos y esto puede
llevar a confusiones si se los considera como un único genotipo.
La caracterización de cultivares y accesiones es esencial en programas de mejoramiento.
Como se dijo, la valoración correcta de las relaciones genéticas entre los genotipos de un
banco de germoplasma puede ser una herramienta muy útil para dirigir los cruzamientos.
Antiguamente se evaluaba la diversidad en base a características fenotípicas que
generalmente estaban influenciados por el ambiente. Actualmente, la forma más certera,
rápida y economica de determinar los niveles de diversidad y estructura genética
intraespecífica es a través del uso de marcadores moleculares.
ADN, marcadores moleculares y biología molecular
A mediados del siglo XX Watson y Crick (1953) descubrieron la estructura del ADN, lo que
les permitió sentar las bases para descifrar el código genético y los mecanismos mediante
los cuales estos genes intervienen en la determinación de la totalidad de las
características visibles y no-visibles de un organismo y cómo éstos son transmitidas de
generación en generación. Alrededor del estudio del ADN se desencadenó, entonces, una
serie de nuevas áreas de investigación que en las últimas dos décadas se han fusionado
bajo la común denominación de biología molecular. Son innumerables las consecuencias
de este descubrimiento para el entendimiento de la evolución, la biología y la genética
aplicada al mejoramiento de cultivos. Como resultado de esto surgió el concepto de
marcadores moleculares cuyo uso cada día es mayor para caracterizar la variabilidad del
germoplasma de una especie. La variabilidad o polimorfismo de los marcadores puede ser
usada en diferentes estudios de diversidad genética en especies vegetales y su herencia
puede ser monitoreada. Los marcadores moleculares incluyen: 1) los marcadores
bioquímicos: detectan variaciones en las proteínas que pueden ser de reserva o
almacenamiento, y en las isoenzimas o aloenzimas que son formas diferentes de una
enzima que comparten una misma actividad catalítica y 2) marcadores de ADN: analizan
diferencias en las secuencias, que pueden ser inserciones, deleciones, sustituciones, etc.
y se manifiestan como polimorfismos. La mayoría de estos marcadores son heredados
genéticamente según las leyes de Mendel y al no estar influenciados por el ambiente, son
de mucha utilidad en el mejoramiento genético.
11
Las isoenzimas se definen como diferentes formas moleculares de una enzima que
poseen una actividad catalítica común, es decir actúan sobre el mismo sustrato y forman
los mismos productos. Ciertos cambios en la secuencia de ADN (mutaciones) que codifica
para estas enzimas pueden resultar en cambios de la composición de aminoácidos,
originando proteínas con la misma actividad biológica pero con diferente carga neta y por
lo tanto con diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. Estas diferencias,
visualizadas en geles de poliacrilamida, determinan patrones característicos de migración
electroforética de las formas iso-enzimáticas. Las isoenzimas han tenido un rol
prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura
genética, sistemática y biología evolutiva así, como en la descripción de germoplasma e
identificación de variedades. Su aplicación en la construcción de mapas se ha visto
limitada por el número de marcadores isoenzimáticos disponibles, en general menor a 50,
y por su reducido polimorfismo (2-4 alelos). Por otro lado, las formas isoenzimáticas
extraídas de hoja o raíz (no así las de semilla) presentan variaciones en relación a las
condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo cual afecta la
reproducibilidad de los zimogramas (Picca y col., 2004).
En cuanto a los marcadores de ADN, también denominados marcadores moleculares, se
definen como un segmento particular de ADN que es representativo de diferencias a nivel
genómico. Los marcadores moleculares pueden o no correlacionarse con la expresión
fenotípica de un carácter, pero ofrecen numerosas ventajas sobre aquellos basados en el
fenotipo, ya que son detectables en todos los tejidos, independientemente del estadio de
diferenciación, desarrollo o defensa de la planta y no son alterados por efectos
ambientales, pleiotrópicos o epistáticos.
Marcadores moleculares de ADN en la mejora genética.
El desarrollo de nuevas herramientas como los marcadores moleculares basados en el
ADN, ha potenciado los avances en la mejora genética. Los marcadores de ADN
identifican diferencias en la secuencia de los genes que determinan un carácter de
interés, o bien, diferencias entre segmentos de ADN que estan ligados a dichos genes. A
lo largo de los años, la selección fenotípica ha sido el método aplicado en los distintos
programas de mejoramiento. Esta metodología ha empleado la expresión fenotípica de
caracteres externos como fuente de información de la variabilidad existente como objetivo
y criterio de selección. Pero en general, una de las principales limitantes de la
caracterización fenotípica o morfológica tanto para la identificación varietal como para la
estimación de la diversidad genética, son por una parte, la influencia ambiental del
carácter a medir lo que conlleva a variaciones en la expresión que no son genéticas sino
12
causadas por diferencias ambientales y por otro lado, el relativamente reducido número
de caracteres morfológicos disponibles para medir, que no sean o lo sean en baja
magnitud, influenciados por el ambiente. Estos caracteres, que cambian poco con los
cambios ambientales, se llaman diagnosticos.
Con la identificación de marcadores de ADN asociados a loci que codifican tanto para
características cualitativas como para características cuantitativas, se plantea la
posibilidad de realizar una selección asistida por estos marcadores (―
Marker Asisted
Selection‖). Esta se basa en conjugar la variabilidad fenotípica y genotípica como fuente
de información de la variabilidad existente y en utilizar como criterio de selección la
variabilidad genética (marcadores moleculares de ADN) asociada a la característica de
estudio. Algunos marcadores moleculares de ADN al tener su origen en variaciones
individuales en la secuencia común de ADN, teóricamente cubren todo el genoma y
posibilitan su evaluación en estadios muy tempranos y a partir de muestras mínimas que
no destruyen el individuo. Los atributos ideales de un marcador molecular son:
 Polimorfismo.
 Amplia cobertura genomica.
 Herencia mendeliana.
 Insensibilidad a la influencia ambiental.
 Ausencia de efectos en el desarrollo de la planta.
 Simplicidad en la identificación y análisis.
 Codominancia.
 Posibilidad de detección en los primeros estadios del desarrollo de la planta.
Los marcadores moleculares se han utilizado en la mejora genética de plantas con el fin
de estimar las distancias genéticas entre poblaciones, variedades, líneas puras e híbridos
y para identificar y distinguir variedades, líneas puras e híbridos y proteger así los
derechos del obtentor vegetal en el registro de variedades protegidas. Los marcadores
moleculares de ADN permiten una distinción más precisa de genotipos que los
descriptores morfológicos requeridos hoy en día; sin embargo estos marcadores no han
sido todavía adoptados por los organismos oficiales encargados de la regulación de la
protección de variedades porque pueden ser alterados, pero son muy utiles para la
investigación y el desarrollo tecnológico, ya que permiten: establecer relaciones de
parentesco y localizar e identificar genes de efecto cualitativo y genes que afecten a
caracteres cuantitativos, investigar y entender las bases fisiológicas y genéticas de la
13
heterosis y la predicción del rendimiento de los híbridos, identificar factores genéticos
útiles en poblaciones o líneas divergentes, evaluar la introgresion de factores genéticos
deseados en líneas y poblaciones de mejora, potenciar los programas de selección
recurrentes que se basan en las respuestas fenotípicas, analizar las interacciones
genotipo – ambiente y monitorear la diversidad de los fondos genéticos (Stuber y col.,
1999; Sorrells, 1998).
Marcadores moleculares de ADN en Frutilla
En la frutilla cultivada se han utilizado principalmente cuatro tipos de marcadores
moleculares para estudiar la diversidad genética: AFLP (polimorfismos de longitud de
fragmentos
amplificados
o
“Amplified
Fragment
Length
Polymorphisms”),
SSR
(secuencias simples repetidas o ―Si
mple Sequence Repeats‖), ISSR (secuencias simples
repetidas internas o ―
Inter Simple Sequence Repeats‖) y RAPD (polimorfismo de ADN
amplificado al azar o ―
Random Amplifield Polymorphic DNA‖).
Los AFLP (Vos y col, 1995) fueron usados tanto para estudiar las relaciones genéticas
entre cultivares (Degani y col, 2001) como para la identificación de variedades y líneas
avanzadas de frutilla (Tyrka y col, 2002).
En el caso de los SSR (Smith y col., 1997) el primer informe sobre el desarrollo de SSR
en Fragaria spp fue de James y col., (2003) que diseñaron diez SSR a partir de
secuencias genómicas de F. vesca. Debido a las ventajas asociadas con SSR incluyendo
codominancia, multialelismo y las altas tasas de polimorfismo y reproducibilidad (Powell y
col, 1996; Zhu y col, 2000), el número de publicaciones de SSR en Fragaria spp fue
aumentando. Aproximadamente 250 pares de cebadores SSR derivados de Fragaria spp
están actualmente disponibles para estudios moleculares. Actualmente la mayoría de
estos cebadores SSR fueron desarrollados a partir de la frutilla cultivada, F. ananassa
(114) seguido de F. vesca (97), F. viridis (22) y F. viriginiana (4). Cada uno de los estudios
excepto dos, James y col., 2003 y Keniry y col., 2006, probaron la transferibilidad de los
SSR desarrollados para las otras especies y han demostrado altos niveles de
transferencia entre especies dentro de Fragaria spp. Los mayores niveles de amplificación
se observaron en la especie cultivada, F. ananassa (Bassil y col., 2006a; Bassil y col.,
2006b; Cipriani y Testolin, 2004; Hadonou y col., 2004; Lewers y col., 2005).
Los ISSR (Wolfe y col., 1998) fueron usados para la identificación de 30 variedades de
frutilla de distintos orígenes geográficos y genéticos (Arnau y col., 2003). También se
usaron los ISSR para compararlos con los RAPD y determinar las relaciones genéticas de
24 cultivares de un programa de mejoramiento del Instituto de Investigaciones de
14
fruticultura y floricultura de Polonia (Kuras y col., 2004), concluyendo que las relaciones
genéticas determinadas sobre la base del análisis de los productos polimórficos fue
generalmente similar para ambas técnicas.
La técnica de RAPD fue una de las más utilizadas para la caracterización de cultivares de
frutilla (Gidoni y col., 1994; Hancock y Callow, 1994; Levi y col., 1994; Parent y Pagé,
1995; Graham y col., 1996; Degani y col., 1998; Congiu y col., 2000), obteniendose la
amplificación de varios fragmentos de ADN para cada cultivar, lo que permitió disponer
con éxito de perfiles moleculares específicos a pesar de tratarse de un cultivo octoploide
(Graham y col., 1996). Los polimorfismos RAPD, por lo tanto, pueden considerarse
caracteres útiles para establecer las relaciones genéticas entre los cultivares.
Todos estos tipos de marcadores han sido efectivos para determinar diferencias genéticas
entre variedades, pero en forma complementaria y con un poder de discriminación
diferente entre ellos.
En Argentina, prácticamente y con anterioridad a esta tesis, la frutilla cultivada (Fragaria
ananassa) no ha sido estudiada utilizando marcadores moleculares.
Marcadores RAPD
El análisis genómico y genotípico a partir de marcadores RAPD fue descrito por primera
vez en 1990 por dos grupos independientes de investigadores (Welsh y McMilland, 1990,
Williams y col., 1990). Esta técnica se basa en la metodología de la reacción en cadena
de la polimerasa ―
PCR‖ (Williams y col., 1990) y tiene la capacidad para el reconocimiento
de muchos loci diferentes (Wolfe, 1985).
El análisis RAPD utiliza un único cebador, generalmente de 10 nucleótidos, para
amplificar secuencias al azar de un ADN genomico. Los polimorfismos detectados con la
técnica RAPD pueden originarse de cualquier cambio en la secuencia o sitio de unión del
cebador, mutación puntual, translocaciones, inversiones, deleciones etc., que impiden que
el cebador se una a la cadena e impida la amplificación del ADN molde en ese sitio. Esta
técnica que genera un gran número de marcadores no requiere del desarrollo de sondas
específicas para cada especie, ni tampoco del uso de sustancias radioactivas. Por esta
razón puede ser implementada en forma más rápida y con menos requerimientos de
equipamiento de laboratorio. Además, las cantidades necesarias de ADN molde son 100
veces inferiores a las usadas en otros marcadores moleculares como los AFLP.
Al igual que para el PCR, durante el análisis RAPD se producen una serie de reacciones
químicas en forma cíclica, cuya contribución relativa al proceso global varía entre los
15
ciclos iniciales, medios y finales (Ruano y col., 1991). Cada ciclo está compuesto por tres
fases que son definidas por cambios en la temperatura:
a) La desnaturalización del ADN o de los productos previamente sintetizados
mediante la incubación a altas temperaturas, lo que provoca la ruptura de los
puentes de hidrogeno y la separación de las dos cadenas, las cuales permanecen
separadas en solución hasta que la temperatura se reduce.
b) La unión del cebador a sitios de secuencia complementaria en las cadenas
disociadas, lo que se produce cuando la temperatura disminuye.
c) La síntesis de la doble cadena en una dirección específica (de 5‘ a 3‘) y a partir del
sitio de unión del cebador mediante la acción de una polimerasa y la presencia en
la solución de desoxinucleótidos libres y algunos elementos que actúan como
cofactores enzimaticos esenciales como el Magnesio y el Potasio. Esta fase se
produce a una temperatura de 72ºC, óptima para la Polimerasa de ADN llamada
Taq, porque fue purificada del micoorganismo Thermophilus aquaticus.
El RAPD se basa en la existencia de secuencias de ADN complementarias al cebador en
cadenas opuestas del ADN y en orientación opuesta dentro de una distancia de entre 200
y 2000pb que permita su amplificación. Cuando los tres pasos se repiten sucesivamente
(usualmente de 30 a 40 veces), en solo unas pocas horas se pueden obtener fragmentos
amplificados del orden de microgramos, luego de haber iniciado el proceso con
cantidades tan reducidas como 5ng de ADN de plantas (Becerra y col., 2007).
En el Banco de Germoplasma Activo del Programa Nacional de Mejoramiento Genético
de la Frutilla (Pro-Frutilla), se caracteriza el material disponible mediante caracteres
morfológicos pero consideramos necesaria una caracterizacion que permita identificar
variaciones en el ADN genómico y de ese modo poder estimar las relaciones y las
distancias genéticas entre distintos genotipos y accesiones. Asimismo consideramos que
la identificación de los cultivares de frutilla es esencial para evitar mezclas o errores y
proteger tanto los derechos de obtentor de los mejoradores, como brindar al agricultor
garantías en la pureza genética del germoplasma que compra en los viveros autorizados.
Teniendo en cuenta todos estos antecedentes y las ventajas que poseen los marcadores
RAPD, consideramos que estos serían los apropiados para llevar a cabo nuestro estudio
con las principales variedades de frutillas utilizadas en el país.
16
MATERIALES Y METODOS
Material vegetal
Se eligieron 6 cultivares de Fragaria ananassa Duch. (Cuadro 3) entre los más cultivados
en nuestro país: ‗Camarosa‘, ‗Chandler‘, ‗Sweet Charlie‘, ‗Selva‘, ‗Milsei Tudla‘ y tres
accesiones del cv Pájaro: ‗Pájaro Mendoza‘, ‗Pájaro Salta‘ y ‗Pájaro Corrientes‘, de
acuerdo a la provincia donde fueron multiplicados.
Cuadro 3: lista de los cultivares estudiados y sus progenitores correspondientes.
Nombre del cultivar
Chandler
Camarosa
Pájaro
Selva
Sweet Charlie
Milsei Tudla
Abreviación
Ch
CAM
PAJ
S
SCh
MT
Progenitores
‗Douglas‘ X ‗Cal 72.361-105‘
‗Douglas‘ X ‗Cal 85.218-605‘
‗Sequoia‘ X ‗Cal 63.7-101‘
‗Cal 70.3-177‘ X ‗Cal 71.98-605‘
‗FL 80-456‘ X ‗Pajaro‘
‗Parker‘ X ‗Chandler‘
Las plantas se obtuvieron en estadío de dormición de distintos viveros y fueron cultivadas
y multiplicadas en fitotron, bajo condiciones controladas, en las instalaciones del
Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla). Las plantas se
cultivaron en macetas con un sustrato compuesto por una mezcla de turba:perlita en
relación 3:1, esterilizado por tindalización. Se mantuvieron con un fotoperíodo de 16 hs de
luz, 70% HR y de 20ºC a 24ºC de temperatura y se regaron con agua destilada.
Características morfológicas
La evaluación morfológica (caracteres fenotípicos) del material vegetal se realizó
considerando los 41 descriptores establecidos para la frutilla cultivada (Cuadro 5 en
Resultados) por la UPOV (Unión Internacional para la Protección de las Obtenciones
Vegetales, 1995) y el Registro Nacional de la Propiedad de Cultivares y Registro Nacional
de Cultivares de Argentina. Estos descriptores son muy estables y varían poco con las
condiciones ambientales.
Se evaluaron 10 plantas de 10 a 12 meses de edad para cada genotipo. Todas las
determinaciones fueron realizadas con la colaboración de Investigadores de la Facultad
de Ciencias Naturales e Instituto Miguel Lillo.
Análisis Molecular
Extracción de ADN genómico
El ADN genómico se aisló a partir de las hojas jóvenes de todos los genotipos analizados
y según el protocolo publicado por Rogers y Bendich (1988). Se molieron 100 mg de hojas
17
jóvenes con nitrógeno liquido hasta obtener un polvo fino al cual se le agregó 1ml de
buffer de extracción: Tris-HCl 100 mM (pH 8), EDTA 50 mM pH 8, NaCl 500 mM, CTAB
10 mg/ml, PVP 20 mg/ml y β- mercaptoetanol 1%. La mezcla se homogenizó con ayuda
de vortex y se incubó a 65°C con agitación ocasional por 90 min. Cumplido el tiempo de
incubación, se retiraron los tubos y se dejaron enfriar a temperatura ambiente por 5 min,
se agregaron 500 μl de cloroformo-octanol (24:1) y se mezcló suavemente hasta obtener
una emulsión. Los tubos se centrifugaron durante 10 min a 7000 x g a temperatura
ambiente y al sobrenadante se le agregó igual volumen de alcohol isopropílico frío con el
objeto de precipitar el ADN. Se centrifugó a 5000 x g durante 5 min y se lavaron los
precipitados dos veces con etanol 70% para eliminar los restos de sales; se secaron y
resuspendieron en 50 μl de buffer TE (TrisHCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8).
Con las mismas muestras de tejido vegetal se repitieron las extracciones de ADN pero en
este caso con un Kit ―
Nucleon Phytopure‖ (Amersham Pharmacia Biotech, UK) según las
indicaciones del fabricante y se compararon los resultados obtenidos con ambas
metodologías. La concentración y calidad del ADN se evaluó mediante electroforesis
horizontal en gel de agarosa al 0,7% con buffer TBE 0,5X (Tris Borato 45 mM, EDTA 1
mM). Se sembró en el gel una mezcla de cada muestra que contenía: 1 µl de ADN, 2 µl
de buffer de carga 6X para agarosa [azul de bromofenol 0,25% (p/v), xilencianol 0,25%
(p/v) y glicerol en agua 30% (v/v)] y 9 μl de agua bidestilada estéril. Se realizó la
electroforesis a Voltaje constante (5 V/cm) durante 40 minutos y posteriormente se
sumergió el gel en una solución con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio durante 20-25 min,
luego se fotografió el gel bajo luz UV (260nm) en un transiluminador (Sambrook y col.,
1989). El ADN de buena calidad se observó como una banda compacta de alto peso
molecular sin signos de degradación. Las concentraciones de ADN fueron establecidas
por comparación con muestras de ADN estándar de concentración conocida. Se realizó la
dilución a una concentración de 10 ng/µl que fue utilizada como solución de trabajo para
las posteriores amplificaciones. Las muestras fueron conservadas a 4ºC hasta su
utilización.
Caracterización por RAPD
Se utilizó la metodología publicada por Williams y col. (1990). Las reacciones de PCRRAPD se realizaron en un volumen final de 20 μl que contenían: 20 ng de ADN molde, 2
mM de MgCl2, 0,1mM de cada nucleótido, 0,2 μM de cebador, 1,5 U de Taq polimerasa
(Promega Corporation, Madison, WI, USA) y 2 μl de buffer Taq 10X (PROMEGA, WI,
USA). Se utilizaron 20 cebadores de 10 nucleótidos cada uno con una secuencia
18
conocida pero arbitraria, correspondientes a la Serie OPJ de la empresa ―Ope
ron
Tecnology‖, Inc., Alameda, California, USA (Cuadro 4).
Cuadro 4: secuencia de cebadores utilizados en la reacción de RAPD.
Serie
KIT J
Nombre
OPJ-01
OPJ-02
OPJ-03
OPJ-04
OPJ-05
OPJ-06
OPJ-07
OPJ-08
OPJ-09
OPJ-10
OPJ-11
OPJ-12
OPJ-13
OPJ-14
OPJ-15
OPJ-16
OPJ-17
OPJ-18
OPJ-19
OPJ-20
Secuencia
CCCGGCATAA
CCCGTTGGGA
TCTCCGCTTG
CCGAACACGG
CTCCATGGGG
TCGTTCCGCA
CCTCTCGACA
CATACCGTGG
TGAGCCTCAC
AAGCCCGAGG
ACTCCTGCGA
GTCCCGTGGT
CCACACTACC
CACCCGGATG
TGTAGCAGGG
CTGCTTAGGG
ACGCCAGTTC
TGGTCGCAGA
GGACACCACT
AAGCGGCCTC
La mezcla de reacción se amplificó en un termociclador MJ-Research PTC-100 con el
siguiente programa: una etapa inicial de desnaturalización del ADN a 94ºC durante 3
minutos, seguida de 45 ciclos de: 30 seg a 92ºC, 1 min a 35ºC y 2 min a 72ºC, para
finalizar con una incubación a 72ºC durante 5 min. Los experimentos de RAPD fueron
repetidos 4 veces para evitar falsos resultados y asegurar la reproducibilidad. En cada
experimento se incluyeron controles negativos (sin ADN).
Al finalizar la reacción, se separaron 15 μl del producto de amplificación para visualizarlos
mediante electroforesis horizontal, en geles de agarosa y los 5 μl restantes por medio de
electroforesis vertical, en geles de poliacrilamida.
Electroforesis en geles de agarosa: la electroforesis se realizó en geles de agarosa al
1,5% con buffer de corrida TBE 0,5X a 5 V/cm durante 1 hora. Se sembraron en el gel 18
µl de una mezcla que contenía: 15 µl del producto de la amplificación y 3 µl de buffer de
carga 6X. A continuación el gel de agarosa se tiñó con bromuro de etidio 0,5μg/ml durante
20 min y luego se observó bajo luz UV (260nm) en un transiluminador. El peso molecular
fue estimado por comparación con el marcador de peso molecular 100 Markers
(PROMEGA, WI, USA).
19
Electroforesis en geles de Poliacrilamida: las muestras se analizaron también en geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes preparados en buffer TBE estándar 0,5X,
con acrilamida:bis-acrilamida al 6% (19:1 acrilamida/bisacrilamida), urea 7M, TEMED
(N,N,N‘,N‘- tetramethylenediamina) 0,07% (v/v) y APS (persulfato de amonio) 0,07% (p/v).
Para esto se utilizó un equipo de electroforesis vertical ―Se
qui-Gen GT System‖ de BIORAD. Uno de los vidrios se trató con Repel Silane EC (Amersham Pharmacia Biotech)
para facilitar la separación del gel del vidrio después de la electroforesis. Paralelamente,
el otro vidrio fue tratado con Bind Silane (PROMEGA, WI, USA) para favorecer la unión
del gel al vidrio y permite realizar la tinción de plata del mismo. A 5 μl de cada reacción se
le agregaron 2 μl de buffer de carga (95% de formamida desionizada, 10 mM de EDTA pH
8, 1mg/ml de azul de bromofenol y 1mg/ml de xilencianol). Se desnaturalizaron durante 5
min a 95ºC y transfirieron rápidamente a hielo hasta sembrarlos. La electroforesis se llevó
a cabo en un buffer de corrida TBE 0,5X a temperatura constante de 48ºC y a 70W por
120min. La visualización de los fragmentos se realizó mediante tinción con nitrato de plata
usando el Kit ―Sil
ver Staining System‖ (PROMEGA Biotech USA) de acuerdo a las
indicaciones del fabricante que a continuación se detalla: fijación durante 20 minutos en
ácido acético 10%, tres lavados de 2 minutos cada uno con H2O bidestilada, tinción
durante 30 minutos en una solución conteniendo 0,1% de nitrato de plata y 0,06% de
formaldehído, lavado de 10 segundos con H2O bidestilada, revelado con una solución
compuesta por 0,03% de formaldehído, 0,4% de tiosulfato de sodio y 3% de carbonato de
sodio anhidro hasta visualización de las bandas (2 a 5 minutos), fijación final de 5 minutos
con acido acético 10%, seguida de un lavado con H2O bidestilada. El tamaño de las
bandas se estimó por comparación con un marcador de peso molecular estándar (100bp
DNA Ladder, PROMEGA).
Análisis de los datos
Se realizó un análisis de los datos obtenidos con los caracteres morfológicos y los
moleculares por separado y luego un análisis comparativo entre ambos tipos de datos.
El análisis estadístico de los datos se realizó con el programa informático NTSYS (Rohlf,
1993).
Para el análisis de los caracteres morfológicos se consideraron 6 cultivares, ya que las
tres accesiones del cultivar ‗Pájaro‘ poseen los mismos caracteres (descriptores). Se
asignó el número 1 al carácter presente y el numero 0 (cero) al ausente en cada uno de
los cultivares.
20
Con respecto a los caracteres moleculares (bandas RAPD), se consideraron 8 genotipos,
asumiendo que las 3 accesiones del cultivar ‗Pájaro‘ son diferentes. También se asignó el
número 1 a las bandas presentes y el 0 (cero) a las ausentes. Solo se registraron como
presentes a las bandas detectadas en al menos 3 de las 4 réplicas de cada genotipo.
Para el tratamiento de los datos se empleó la siguiente nomenclatura: NA, número de
caracteres (bandas) presentes en las muestras A y B; NB, número de caracteres
presentes en la muestra A y ausentes en la B; NC, número de caracteres presentes en la
muestra B y ausentes en la A. La similitud se calculó usando el coeficiente de Dice (S D)
(Crisci y López- Armengol, 1983), cuya fórmula es: SD= 2NA/ (2NA+NB+NC). El
Coeficiente de Dice (equivalente al de Nei y Li, 1979), otorga más peso a los caracteres
compartidos que a los no compartidos, y excluye como criterio de similitud la ausencia
compartida de bandas entre dos muestras. Este coeficiente ha sido recomendado para
evaluar similitudes genéticas cuando se usan marcadores RAPD. (Lamboy 1994). En
nuestro caso, hemos comprobado previamente que cuando se incluyen más de 50
caracteres en el análisis, se obtienen similares resultados empleando cualquier
coeficiente, como el de apareamiento simple o el de Jaccard.
El análisis de agrupamiento se realizó utilizando el método UPGMA (―
unweighted pair
group method with arithmetic mean‖), que es el más usado en ecología y sistemática.
(Crisci y López-Armengol, 1983)
21
RESULTADOS
Los datos morfológicos analizados en los 6 genotipos coincidieron con los datos de
referencia (descriptores) y se muestran en el cuadro 5.
Cuadro 5: Descriptores de Fragaria ananassa, se indica con signo (+) la presencia del carácter; y signo (-)
ausencia del carácter.
CARACTERES o DESCRIPTORES
001 Planta: Forma
1: Globoso
{Benton, Gorella}
2: Globosa Aplanada {Senga Sengana}
3: Aplanada
{Pantagruella}
002 Planta: Densidad
1:
2:
3: Abierta {Elista}
4:
5: Media
{Gorella}
6:
7: Densa
{Talisman}
8:
9:
003 Planta: Vigor
1:
2:
3: Débil
{Senga Precosa}
4:
5: Medio
{Gorella}
6:
7: Fuerte {Elsanta, Grande}
8:
9:
004 Hoja: Color de la cara superior
1: Verde-Amarillo {Tristar}
2: Verde-Claro {Aliso, Georg SoltwedeL}
3: Verde-Medio {Gorella}
4: Verde-Oscuro {Direktor Paul Wallbaum}
5: Verde-Azul {Mrak}
005 Hoja: Forma en seccion transversal
1: Fuertemente Concava {Senga Precosana}
2: Fuertemente Concava a ligeramente Concava
3: Ligeramente Concava {Hapil}
4: Ligeramente Concava a Plana
5: Plana {Georg SoltwedeL}
6: Plana a Ligeramente Convexa
7: Ligeramente Convexa {Domanil}
8: Ligeramente Convexa a Fuertemente Convexa
9: Fuertemente Convexa {Cambridge Favourite}
006 Hoja: Abolladuras
1: Ausentes o Muy Debil {Bemanil}
2:
3: Debil
{Marmion}
4:
5: Medio
{Precosa}
Variedades
Camarosa
Chandler
Milsei
Tudla
Sweet
Charlie
Pajaro
Selva
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
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+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
+
-
+
-
+
-
22
6:
7: Fuerte
{Marie France}
8:
9: Muy Fuerte {Jamil}
007 Hoja: Brillo
1:
+
2:
3: Debil
{Aptos,Bogota,Mrak}
4:
5: Medio
{Darestivale,Irvine}
6:
7: Fuerte {Sweet Delight, Tioga}
8:
9:
008 Foliolo Terminal: Relación Largo/Ancho
1: Mas Ancha que Larga
2: Tan Larga como Ancha
{Crusader}
3: Más Larga que Ancha {Montrose,Red Gauntlet}
+
4: Mucho más Larga que Ancha {Macherauchs
Frühernte}
009 Foliolo Terminal: Forma de la Base
1:
2:
3: Aguda
{Gorella,Regina}
+
4:
5: Obtusa {Senga Sengana}
6:
7: Redondeada {Crusader,Marie France}
8:
9:
010 Foliolo Terminal: Forma de las Incisiones del Margen
1: Aserrado {Garriguette,Tenira}
2: Crenado {Cambridge Favourite,Irvine}
+
011 Peciolo: Implantación de los Pelos
1: Para Arriba
{Elista,Georg Soltwedel}
2: Levemente para Arriba {Elsanta}
+
3: Perpendiculares {Cambridge Favourite}
012 Estipulas: Pigmentación Antocianica
0:
+
1: Ausente o Muy Debil {Elista}
2:
3: Débil
{Crusader}
4:
5: Medio
{Gorella}
6:
7: Fuerte
{Talisman}
8:
9: Muy Fuerte
{Royal Sovereign}
013 Estolones: Numero
1:
2:
3: Pocos
{Sans Rivale}
4:
5: Medio
{Gorella}
6:
7: Muchos {Cambridge Favourite}
+
-
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
23
8:
9:
014 Estolones: Pigmentación Antocianica
1: Ausente o Muy Debil {Tioga}
2:
3: Débil
{Tenira}
4:
5: Medio
{Gorella}
+
6:
7: Fuerte
{Royal Sovereign}
8:
9: Muy Fuerte
{Arking}
015 Estolones: Pubescencia
1:
2:
3: Debil
{Elista,Vigerla}
4:
5: Medio
{Cambridge Favourite}
6:
7: Fuerte {Grande}
+
8:
9:
016 Inflorescencia: Posición en Relación al Follaje
1: Debajo {Crusader}
+
2: A Nivel {Astino,Cambridge Favourite}
3: Arriba {Direktor Paul Wallbaum}
017 Flor: Tamaño
1:
2:
3: Pequeño {Redgauntlet}
4:
+
5: Medio
{Gorella}
6:
7: Grande {Domanil}
8:
9:
018 Flor: Tamaño del Cáliz en Relación a la Corola
0:
1: Mas Pequeño {Grande,Nordika}
2: Mismo Tamaño {Korona}
+
3: Mas Grande {Regina}
019 Flor: Separación de Pétalos(Solo Flores con 5 ó 6 Pétalos)
0:
1: Libres
{Talisman}
2: Se Tocan
{Regina}
+
3: Superpuestos {Senga Gigana}
020 Pétalo: Relación Largo / Ancho
0:
1: Mucho más Ancha que larga {Senga Gigana}
2: Mas Ancha que Larga
{Tioga}
+
3: Tan Ancha como Larga {Red Gauntlet}
4: Más Larga que Ancha
{Gorella}
5: Mucho más Larga que Ancha {Talisman}
021 Fruto: Relación Largo / Ancho
0:
1: Mucho más Ancho que Largo {Early Dawn}
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
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+
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+
-
+
-
+
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+
-
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-
+
+
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+
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+
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+
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+
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+
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+
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+
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-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
-
-
+
-
-
24
2: Ligeramente más Ancho que Largo {Elista}
3: Tan Largo como Ancho {Gorella,Merton Dawn}
4: Ligeramente más Largo que Ancho {Talisman}
+
+
5: Mucho más Largo que Ancho {Marie France}
022 Fruto: Tamaño
1: Muy Pequeño {Astino}
2:
3: Pequeño {Senga Precosana}
4:
5: Medio
{Senga Tigaiga}
6:
+
7: Grande
{Domanil}
+
8:
9: Muy Grande {Maxim}
023 Fruto: Forma más Frecuente o Predominante
1: Reniforme
{Early Dawn}
2: Aplanada
{Elista}
3: Redonda
{Grande}
4: Conica
{Gorella}
+
5: Bi-Conica
{Pantagruella}
+
6: Ovoide
{Macherauchs Frühernte}
7: Casi Cilindrica {Marie France}
8: Cuneiforme
{Georg Soltwedel}
9: Cordiforme
{Direktor Paul Wallbaum}
024 Fruto: Diferencia en Forma entre Frutos Primarios y Secundarios
0:
1: Nula o muy Poca {Cambridge Favourite,Vigerla}
+
2:
3: Poca
{Sengana}
4:
5: Moderada
{Gorella}
+
6:
7: Marcada
{Georg Soltwedel,Talisman}
8:
9: Muy Marcada
{Maxim}
025 Fruto: Zona sin Aquenios
0:
1: Ausente o Muy Angosta {Senga Sengana}
2:
3: Angosta
{Pandora}
4:
5: Medio
{Garriguette}
+
6:
+
7: Ancha
{Pantagruella}
8:
9: Muy Ancha
{Earliglo}
026 Fruto: Irregularidad de la Superficie
1: Ausente o Muy Debil {Valeta}
2: Debil
{Precosana}
+
+
3: Fuerte
{Red Gauntlet}
027 Fruto: Color
1: Amarillo Blanquecino {Weisse Ananas}
2: Naranja Claro
{Merton Dawn}
3: Naranja
{Cambridge Favourite}
4: Rojo Naranja
{Gorella}
+
5: Rojo
{Royal Sovereign}
-
+
+
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
-
+
25
6: Rojo Oscuro
{Senga Sengana}
7: Rojo Negro
{Honey Oya,Rubina}
028 Fruto: Uniformidad del Color
1: Desuniforme {Marie France}
2: Algo Uniforme {Tamella}
3: Uniforme
{Valeta}
+
029 Fruto: Brillo
1:
2:
3: Débil
{Bemanil}
4:
5: Medio
{Macherauchs Frühernte}
6:
7: Fuerte {Red Gauntlet}
+
8:
9:
030 Fruto: Implantación de Aquenios
1: Hundidos {Elista}
+
2: A Nivel {Regina}
3: Salientes {Rigensa}
031 Fruto: Inserción del Cáliz
0:
1: En Cubeta
{Aliso}
+
2: A Nivel {Cambridge Favourite,Talisman}
3: Saliente
{Regina}
032 Fruto: Disposición de los Sépalos
1: Abrazados o Entrelazados {Elvira}
2: Desplegados
{Framura}
3: Replegados o Apoyados {Bounty}
+
033 Fruto: Tamaño del Cáliz en Relación al Diámetro del Fruto
0:
1: Mucho más Pequeño
{Lumina}
2: Ligeramente más Pequeño {Senga Sengana}
3: Mismo Tamaño
{Tenira}
4: Ligeramente más Grande {Senga Precosa}
+
5: Mucho mas Grande {Cambridge Favourite}
034 Fruto: Adherencia del Cáliz
0:
1: Muy Débil {Confitura}
2:
3: Debil
{Precosa}
4:
5: Medio
{Sengana}
6:
7: Fuerte {Red Gauntlet}
8:
+
9: Muy Fuerte {Rainier}
035 Fruto: Firmeza
1: Muy Blanda {Marie France}
2:
3: Blanda {Grande}
4:
+
5: Medio
{Gorella}
6:
7: Firme
{Tigaiga}
8:
-
+
-
-
-
+
-
-
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
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+
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+
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+
+
-
+
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+
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-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
26
9: Muy Firme {Holiday}
036 Fruto: Color de la Pulpa
1: Blanquecina {Regina}
2: Rosa Palido {Direktor Paul Wallbaum,Precosa}
3: Rojo Naranja {Talisman}
4: Rojo Claro {Cambridge Favourite}
5: Rojo Medio {Elista}
+
+
6: Rojo Oscuro {Senga Tigaiga}
037 Fruto: Hueco Central
0:
+
1:Ausente
o muy Débilmente
Expresado
+
{Onebo,Geride}
2: Debilmente Expresado
{Agana,Douglas}
3: Fuertemente Expresado {Costina,Fiesta}
038 Fruto: Distribución de la Coloración Roja de la Pulpa
1: Solo Marginal
2: Solo Central
3: Marginal y Central
+
+
039 Época de Floración (50%de las Plantas con por lo menos 1 Flor)
1: Muy Temprana {Karina}
2:
3: Temprana {Pantagruella}
+
4:
+
5: Medio
{Cambridge Favourite}
6:
7: Tardia
{Tago}
8:
9: Muy Tardia {Pandora}
040 Época de Maduración (50%de las Plantas con Frutos Maduros)
1: Muy Temprana {Karina}
2:
3: Temprana {Pantagruella}
+
4:
+
5: Medio
{Cambridge Favourite}
6:
7: Tardia
{Tago}
8:
9: Muy Tardia {Pandora}
041 Reflorescencia
1: No Refloresciente {Cambridge Favourite}
+
+
2: Parcialmente Refloresciente {Red Gauntlet}
3: Refloresciente {Brighton}
4: Dia Neutro
{Florika}
-
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
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+
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-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
La calidad y cantidad de ADN obtenidos de la purificación con los dos métodos utilizados
fue similar. Se realizaron reacciones de RAPD, con las muestras obtenidas con los
distintos métodos de extracción, y se obtuvieron perfiles de amplificación similares para
ambos métodos en todas las muestras.
En este estudio se obtuvieron productos de amplificación con 16 de los 20 cebadores
utilizados. Los cuatro cebadores que no produjeron amplificación fueron: OPJ02, OPJ03,
OPJ08 y OPJ13. Con los cebadores OPJ15 y OPJ20 no se detectaron bandas
27
polimórficas entre los genotipos estudiados, mientras que el OPJ19 solo produjo
polimorfismos entre las tres accesiones del cultivar ‗Pájaro‘.
El análisis de los geles de agarosa mostró que únicamente el cebador OPJ14 permitió
amplificar una banda polimórfica para el cultivar ‗Selva‘ (Figura 4). Con el mismo cebador
se observó en el cultivar `Pájaro Corrientes‘ la ausencia de una banda que está presente
en las otras dos accesiones de ‗Pájaro‘ (Figura 4). En los perfiles de amplificación
obtenidos con los restantes cebadores no se observaron bandas polimórficas
reproducibles útiles para la identificación de las accesiones analizadas.
Figura 4: electroforesis en gel de agarosa mostrando perfiles de amplificación RAPD de los cultivares
analizados, obtenidos con el cebador OPJ14. M, marcador de PM para PCR 100bp ladder; 1, ‗Camarosa‘; 2,
‗Milsei Tudla‘; 3, ‗Pájaro Corrientes‘; 4, ‗Pájaro Mendoza‘; 5,‘Pájaro Salta‘; 6, ‗Selva‘; 7,‘Chandler‘; 8, ‗Sweet
Charlie‘. Las flechas señalan los marcadores diferenciales.
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, los mismos productos de amplificación
fueron separados por electroforesis en geles de poliacrilamida, con lo que se logró un
significativo incremento de la resolución (Figura 5).
28
Figura 5: Electroforesis en geles de poliacrilamida mostrando los perfiles de amplificación RAPD de los
cultivares analizados con los cebadores OPJ14 (a) y OPJ04 (b). M, marcador de peso molecular para PCR
100pb ladder. Gel (a).1, ‗Camarosa‘; 2, ‗Milsei Tudla‘; 3,‘Chandler‘; 4, ‗Pájaro Corrientes‘; 5, ‗Pájaro
Mendoza‘; 6, ‗Pájaro Salta‘; 7, ‗Selva‘; 8, ‗Sweet Charlie‘. Gel (b) 1, ‗Camarosa‘; 2,‘Chandler‘; 3, ‗Milsei
Tudla‘; 4,‘Sweet Charlie‘; 5, ‗Pájaro Corrientes‘; 6 ‗Pájaro Mendoza‘; 7 ‗Pájaro Salta‘; 8, ‗Selva‘. Las flechas
indican los marcadores diferenciales.
Se obtuvieron en promedio de 20 a 45 bandas por cebador. En total, con 16 cebadores se
amplificaron 550 bandas, de las cuales 120 fueron polimórficas. Entre estas últimas, 37
bandas obtenidas con 13 cebadores pueden considerarse marcadores específicos de
genotipo, fueron reproducibles y diferentes en tamaño con respecto a las bandas vecinas
(Figura 5 y Cuadro 6). Estos resultados demostraron que la técnica de RAPD combinada
con la electroforesis de alta resolución en geles de poliacrilamida, permitió identificar
marcadores específicos de cultivar y, como se observa en el cuadro 6, con solamente 3
cebadores pueden diferenciarse los 8 genotipos estudiados.
29
Cuadro 6: Bandas RAPD polimórficas que distinguen cada uno de los 8 genotipos analizados.
(1)
+, presencia de banda; - , ausencia de banda. CAM, ‗Camarosa‘; Ch, ‗Chandler‘; MT, ‗Milsei Tudla‘; SCh,
‗Sweet Charlie‘; PC, ‗Pájaro Corrientes‘; PM, ‗Pájaro Mendoza‘; PS ‗Pájaro Salta‘; S, ‗Selva‘,
(2)
Cebadores que discriminan cada uno de los 8 genotipos
Cebadores Tamaño de banda (pb)
La electroforesis en poliacrilamida permitió, además, comprobar diferencias entre las tres
accesiones del cultivar ‗Pájaro‘. Los polimorfismos fueron detectados con los cebadores
OPJ18, OPJ06, OPJ07, OPJ09, OPJ19 (Figura 6), y con OPJ10, OPJ14, OPJ17 y OPJ05.
Estos resultados demuestran que considerar solamente los caracteres morfológicos son
insuficientes para una correcta identificación de los cultivares.
30
Figura 6: Geles de poliacrilamida mostrando los perfiles de amplificación RAPD de las tres accesiones del
cultivar ‗Pájaro‘, obtenidas con los cebadores OPJ18 (a), OPJ06 (b), OPJ07 (c), OPJ09 (d) y OPJ19 (e). Las
muestras: 1, ‗Pájaro Corrientes‘; 2, ‗Pájaro Mendoza‘; 3, ‗Pájaro Salta‘. Las flechas señalan los marcadores
diferenciales.
El análisis de las similitudes genéticas mediante UPGMA, considerando todos los
caracteres genómicos detectados, es decir las bandas comunes y no comunes, se utilizó
para construir un fenograma que se muestra en la Figura 7. Se consideraron caracteres
comunes a las bandas presentes en todos los genotipos analizados.
Índice de DICE
Figura 7: Fenograma de similitudes genéticas generado con 550 caracteres RAPD. CAM: ‗Camarosa‘, PM:
‗Pájaro Mendoza‘, PS: ‗Pájaro Salta‘, PC: ‗Pájaro Corrientes‘, SCh: ‗Sweet Charlie‘, CH: ‗Chandler‘, S:
‗Selva‘, MT: ‗Milsei Tudla‘.
31
Los valores de distancia genética, calculados con el índice de Dice, variaron entre un
mínimo de 0.65 y un máximo de 0.78, indicando que estos cultivares están estrechamente
relacionados. De acuerdo con el fenograma, las accesiones Mendoza y Salta del cultivar
Pájaro son cercanas genéticamente. Sin embargo, la accesión Corrientes se mostró más
cercana al cultivar Camarosa que a las otras accesiones de Pájaro, que sería lo esperado.
A fin de evaluar si las relaciones genéticas basadas en los caracteres moleculares son
semejantes a las basadas en los caracteres morfológicos diferenciales (descriptores) que
se emplean para identificar los cultivares, se generaron dos fenogramas, uno con los
caracteres morfológicos y el otro con las bandas RAPD no comunes, o sea solo las
polimórficas entre los genotipos en estudio. Como puede observarse en la Figura 8, entre
ambos fenogramas hay diferencias significativas en el agrupamiento, indicando que los
datos morfológicos no se corresponden con los datos moleculares.
Índice de DICE
Índice de DICE
Figura 8: Fenogramas generados con caracteres morfológicos (a), y con los caracteres RAPD no comunes
(b). CAM, ‗Camarosa‘; Ch, ‗Chandler‘; MT, ‗Milsei Tudla‘; SCh, ‗Sweet Charlie‘; PC, ‗Pájaro Corrientes‘; PM,
‗Pájaro Mendoza‘; PS, ‗Pájaro Salta‘; S, ‗Selva‘.
Es interesante señalar que la topología del fenograma generado con los caracteres
moleculares polimórficos (no comunes) es diferente a la del fenograma obtenido con
todos los caracteres, comunes y no comunes. (Figura 7 y 8b)
Los resultados obtenidos en el análisis molecular permitieron, además de identificar los
cultivares correctamente, establecer sus relaciones genéticas y elegir los progenitores
para construir una población segregante que sera utilizada con posterioridad.
32
DISCUSION
En este estudio, la fidelidad de los marcadores RAPD se comprobó al no encontrar
diferencias en los loci amplificados en las mismas muestras provenientes de extracciones
de ADN independientes obtenidas, inclusive, con diferentes métodos. El uso de estos
marcadores moleculares ha sido fácil de implementar por su simplicidad, reproducibilidad,
ausencia de elementos radiactivos para el análisis y la gran cantidad de polimorfismos
que se obtuvieron al combinarlos con la alta resolución de los geles de poliacrilamida.
Aprovechando la versatilidad de la técnica de RAPD, en nuestro laboratorio ya se habían
desarrollado los primeros marcadores moleculares específicos de especies silvestres y
cultivadas de frutilla (Ontivero y col., 2000). Del mismo modo, pero usando electroforesis
de alta resolución, en el presente trabajo se generaron 37 marcadores genotípicos para la
identificación inequívoca de las 6 variedades de frutilla mas cultivadas en la Argentina.
Utilizando esta aproximación pudieron diferenciarse tres accesiones distintas del cultivar
Pájaro, que habían sido multiplicadas en forma independiente. Las diferencias observadas
a nivel genómico podrían explicarse en el hecho de que en Argentina este cultivar es de
uso libre y fue multiplicado clonalmente, mediante estolones o micropropagación, sin
necesidad de usar los clones originales. Los eventos repetidos de micropropagación
podrían haber generado las diferencias genómicas detectadas en el análisis molecular.
Estas mutaciones se conocen como variación somaclonal y se deben a cambios
espontaneos en la secuencia del ADN genómico que se fueron acumulando con los
sucesivos eventos de multiplicación.
La comparación de fenogramas, basados uno en caracteres morfológicos y el otro en
datos moleculares, mostró diferencias significativas en el agrupamiento de los cultivares.
Estas diferencias indicarían que las regiones del ADN examinadas con RAPD
corresponden a regiones que no se expresan en los caracteres fenotípicos considerados
por la UPOV como caracteres a evaluar para distinguir las variedades. Estos resultados
evidencian que los caracteres considerados por la UPOV no serían adecuados para
evaluar las relaciones genéticas entre los cultivares.
Apoyándonos en la genealogía de las variedades (Cuadro 3) podemos ver que mientras
Sweet Charlie es hija de Pajaro, en el fenograma de los caracteres RAPD aparecen muy
cercanos genéticamente y no así en el fenograma generado con los descriptores. Algo
semejante ocurre con Milsei Tudla, hija de Chandler las que aparecen cercanas
genéticamente cuando analizamos el agrupamiento con los caracteres RAPD y no en el
de los descriptores.
33
CONCLUSIONES
La técnica de RAPD convencional, utilizando geles de agarosa, no permitió detectar
bandas polimórficas útiles para la identificación de los cultivares de F. ananassa
analizados en el presente trabajo. En cambio, una modificación original implementada en
esta tesis condujo a aumentar la resolución en geles de poliacrilamida y de ese modo se
consiguió la identificación inequívoca de los cultivares y de las diferentes accesiones de
un mismo cultivar, empleando solamente tres cebadores.
Se demostró que los caracteres distintivos fenotípicos (descriptores) recomendados por la
UPOV para la identificación varietal no reflejan el parecido genético el cual se pone de
manifiesto a través del análisis de los marcadores moleculares obtenidos.
Se demostró que un mismo cultivar caracterizado a través de los descriptores de la
UPOV, puede presentar diferencias genéticas si el mismo se multiplica en forma
independiente sin recurrir siempre a plantas madres de pureza genética determinada.
En esta tesis se demostró la utilidad de los marcadores RAPD en el mejoramiento
genético de la frutilla, a través del establecimiento de distancias genéticas, de la
identificación varietal inequívoca, y de la posibilidad de asociar este tipo de marcadores
con caracteres de interés agronómico.
34
CAPITULO ll
Caracterización fenotípica de cultivares de F. ananassa.
INTRODUCCION
Las variedades de frutilla son comúnmente susceptibles a diversos factores abióticos y
bióticos que causan estrés al cultivo y reducen notablemente su producción y rendimiento.
Los principales causantes de estrés biótico en frutilla son un gran número de
enfermedades provocadas por hongos, bacterias, virus y micoplasmas, así como por
fitófagos diversos. Producen reducción del tamaño de la planta, mortalidad y por
consiguiente limitan la producción y calidad de la fruta (Howard y Albregts, 1984).
Al igual que otros cultivos, la frutilla es afectada por hongos de suelo desde sus primeras
fases de crecimiento. Existen numerosas enfermedades y plagas citadas para la región
del Noroeste argentino. De acuerdo a los datos del INTA (http://www.inta.gov.ar/famailla/
frutilla/info/prob_fitosanitarios.htm) las enfermedades más frecuentes en los cultivos de
frutilla en la provincia de Tucumán son:
a) Podredumbre de raíz y coronas: causadas por hongos de los géneros
Phytophthora (podredumbre de corona y corazón rojo), Rhizoctonia (podredumbre
negra de raíz) y Colletotrichum (antracnosis).
b) Enfermedades de hojas: mancha angular de la hoja (Xanthomonas fragariae),
mancha foliar (Gnomonia comari), viruela (Mycosphaerella fragariae o Ramularia),
quemadura
o
mancha
(Dendrophoma/Phomopsis
de
la
hoja
obscurans),
(Diplocarpon
oidio
earliana),
(Sphaerotheca
tizón
macularis),
antracnosis (Colletotrichum spp.).
c) Enfermedades de flores y frutos: podredumbre por moho gris (Botrytis cinerea),
oidio (Sphaerotheca macularis), antracnosis (Colletotrichum spp.) y podredumbre
poscosecha (Rhizopus spp., Mucor spp., Penicillum spp., Aspergillus spp.).
La antracnosis
La antracnosis de la frutilla causada por un complejo de hongos del género
Colletotrichum, es sin duda la enfermedad que afecta en mayor medida al cultivo (Howard
y col., 1992). Ataca prácticamente todos los órganos de la planta y provoca grandes
35
pérdidas tanto en la producción de fruta como de plantines, principalmente en regiones
agroclimáticas tropicales y subtropicales (Freeman y Katan, 1997).
Una epifitia de antracnosis en campos de producción de frutilla causó la pérdida de toda la
producción de fruta en Florida, EEUU (Howard y col., 1992), y provocó una reducción del
30% al 68% del rendimiento en el centro de Brasil (Henz y col., 1992). En Argentina se
consideraba una enfermedad secundaria hasta 1993, año en el que alcanzó proporciones
epidémicas en la provincia de Tucumán, siendo responsable de la llamada ―m
uerte de
plantas‖ que determinó la reducción del 50% de la superficie cultivada (Kirschbaum,
2000). Otro ejemplo, en la campaña 2005/2006 la producción de fruta de verano en Tafí
del Valle (Tucumán), debió abandonarse en amplias superficies, debido a la fuerte
incidencia de la antracnosis. Esto determinó que en esa localidad actualmente sólo se
esté cultivando un 25% de la superficie que se había destinado a la frutilla de verano (Dr.
Ing. Agr. Salazar, Com. Pers. 2007).
Esta enfermedad fue descripta por primera vez en 1931 por Brooks, quien utilizó el
término ―an
tracnosis‖ para describir los síntomas causados por la infección de
Colletotrichum fragariae en la frutilla considerando que éste era el único agente etiológico
responsable de la antracnosis de frutilla. Posteriormente este término fue ampliado para
incluir a todos los síntomas causados por hongos fitopatógenos pertenecientes al género
Colletotrichum que afectan distintos cultivos (Delp y Milholland, 1980; Smith y Black,
1990). Actualmente, tres especies de Colletotrichum han sido descriptas como agentes
etiológicos de la antracnosis: C. acutatum J.H. Simmonds (Teleomorfo Glomerella
acutata), C. fragariae Brooks y C. gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc. in Penz.
(teleomorfo Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk) (Smith y Black, 1986;
Smith y Black, 1990; Howard y col., 1992; Adaskaveg y Hartin, 1997; Ramallo y col., 2000;
Mónaco y col., 2000). La presencia de C. fragariae en nuestro país fue observada por
primera vez en el año 1974 en la provincia de Tucumán (Mena y col., 1974), mientras que
la existencia de las especies C. acutatum y C. gloeosporioides en la región Noroeste de la
Argentina fue informada por primera vez recien en el año 2000 (Ramallo y col., 2000;
Mónaco y col., 2000).
Estos hongos presentan dos estados: el imperfecto pertenece a la clase de los
Deuteromycetes y el perfecto a los Ascomycetes.
La clasificación taxonómica sistemática del patógeno en su estado imperfecto es la
siguiente:

Subdivisión: Deuteromycotina
36

Clase: Deuteromycetes

Subclase: Coelomycetidae

Orden: Melanconiales

Familia: Melanconiaceae

Género: Colletotrichum
El estado perfecto pertenece a:

Clase: Ascomycetes

Subclase: Euascomycetidae

Serie: Pirenomycetes

Orden: Diaporthales

Familia: Diaporthaceae

Género: Glomerella
La Clase Deuteromycetes recibe este nombre por la falta aparente de una fase sexual. La
Subclase presenta conidios que se forman en picnidios o acérvulas.
El estado perfecto muestra mayor complejidad de estructuras y fases reproductivas. La
Clase Ascomycetes tiene amplia distribución, encontrándose en una gran diversidad de
hábitats. Los distingue la producción de una estructura en forma de saco o bolsa, llamada
asco que contiene un número variable de esporas.
C. gloeosporioides es un hongo perfecto cuyo teleomorfo se conoce con el nombre de
Glomerella cingulata. Sin embargo, la diferencia (presencia o ausencia) en la fase sexual
no constituye por sí sola un criterio adecuado para la separación de estas especies, es
por esto que erróneamente se consideró durante muchos años que C. fragariae era
sinónimo de C. gloeosporioides (von Arx, 1970).
Colletotrichum acutatum fue descripto por primera vez en Australia y se distingue de C.
gloeosporioides por la morfología de sus conidios, ya que C. acutatum también presenta
un estado teleomórfico, conocido como Glomerella acutata (Guerber y Correll, 1997). A
partir de 1983 se demostró que Colletotrichum acutatum era responsable también de
causar antracnosis en la frutilla (Smith y Black, 1986). Durante 1980 y 1990 muchos
fitopatólogos estadounidenses reconocieron un importante aumento de C. acutatum en los
campos de frutilla, pero no quedó claro si el cambio se debió a una introducción reciente o
si el patógeno ya estaba presente antes y no había sido reconocido.
Las especies de Colletottricum pueden distinguirse por características morfológicas,
culturales y moleculares (Freeman y Katan, 1997; Simmonds, 1965; Smith y Black, 1990).
37
Smith y Black (1990) informaron que C. fragariae podría ser identificado por tener conidios
cilíndricos y colonias de color beige, oliva a grises oscuras. Los aislamientos de C.
gloeosporioides pueden ser diferenciados de otras especies por tener colonias de color
gris o gris-oliva, gris oscuro a verde oliva oscuro y conidios cilíndricos. Los aislamientos
de C. acutatum pueden ser identificados por color rosa, naranja, o colonias beige, cremarosa, o rosa y conidios fusiformes. La presencia o ausencia de setas se ha utilizado
también para ayudar en la identificación de especies de Colletotrichum (Gubler y Gunnell,
1991). Esta diversidad fenotípica responde a una diversidad genotípica dentro de cada
especie de hongo.
Sintomatología: La antracnosis es una enfermedad holonecrótica que ataca distintos
tejidos de la planta tales como coronas, hojas (pecíolos y foliolos), estolones, pedúnculos,
pedicelos, flores, frutos y raíces (Smith y Black, 1990; Howard y col., 1992; Freeman y
Katan, 1997), independientemente de la especie del hongo patógeno.
En estolones se describen manchas hundidas, firmes, oscuras y secas, bien delimitadas
que progresan rodeando al estolón (Figura 9 D), produciendo la marchitez y muerte de las
plantas hijas por colapso de los sistemas de conducción. Asimismo, el pecíolo
estrangulado por la lesión es capaz de provocar la muerte de la hoja (Figura 9 F). El
hongo puede invadir la corona desde el estolón o el pecíolo produciendo la podredumbre
de corona. Al realizar un corte longitudinal de las coronas de plantas infectadas, se
observa una podredumbre firme de color marrón rojiza, considerada uno de los signos
distintivos de la enfermedad (Figura 9 C). Las plantas con las coronas infectadas
exteriorizan importante reducción del crecimiento, incrementan el número de brotes
afectados y hojas secas de color castaño, finalmente se marchitan y mueren (Colombo,
2006).
La sintomatología en hojas puede considerarse la primera evidencia del hongo en viveros
y se visualiza como manchas de color negro (Howard y Albregts, 1984; Tanaka y col.,
1996), de aspecto oleoso y de un diámetro de 0,5 a 1,5 mm, generalmente en la cara
adaxial del foliolo (Figura 9 E).
El síntoma en flores se denomina tizón. Sobre el pedicelo se forma una lesión marrón
oscura que alcanza al cáliz (Figura 9 B) y se pueden observar masas de conidios densas
y gelatinosas de color naranja llamadas cirrus formadas por exudados del patógeno en los
pedicelos y flores infectadas (Ramallo, 2000).
La podredumbre de frutos causada por Colletotrichum spp., se da principalmente en frutos
maduros, donde se desarrollan manchas redondeadas, firmes y hundidas, de color
38
marrón o negro, las cuales pueden aumentar de tamaño hasta abarcar todo el fruto,
causando su momificación (Figura 9 A).
En la planta estos hongos pueden infectar muchos tejidos, pero sin duda las dos fases
económicamente devastadoras son pudrición de la corona y la pudrición de la fruta. La
podredumbre de la corona se suele asociar con C. fragariae y algunas veces con C.
gloeosporioides. La pudrición de la fruta por lo general es asociada con C. acutatum.
En función del genotipo de la planta y del patógeno, cuando se produce la infección, si
esta es severa puede llegar a matar la planta en pocos días. En general, si el inóculo está
presente, la enfermedad en los cultivares susceptibles se presenta en períodos cálidos y
lluviosos.
Figura 9: Sintomatología en diferentes órganos de la planta de frutilla. A) Podredumbre en frutos. B) Tizón
en flores. C) Podredumbre de corona. D) Lesiones provocando el estrangulamiento del estolón. E) Manchas
negras en hojas. F) Estrangulamiento en pecíolos. Fuente: Sergio M. Salazar (Universidad Nacional de
Tucumán) y Jack Kelly Clark (Universidad de California).
Dada la gran diversidad de patógenos tanto entre como dentro de especies hay una
coevolucion patógeno/planta en la que interfiere el hombre con el mejoramiento genético,
lo que resulta en que casi todas las variedades de frutilla son sensibles a la enfermedad
39
de la antracnosis. Así C. fragariae ataca generalmente estolones y otros órganos
vegetativos, mientras C. acutatum lo hace preferentemente en fruto y C. gloeosporioides
puede infectar cualquier tejido de la planta. Todo ello adiciona complejidad al patosistema
(Ramallo, 2000).
Ciclo de la enfermedad y epidemiología
Como pudo comprobarse que Colletotrichum puede permanecer viable en el suelo y en
hospederos alternativos de una estación a otra, se supone que este seria el origen del
inóculo que inicia la infección convirtiéndose en la fuente primaria de inóculo (Figura 10;
Freeman y col., 2001). Independientemente de la fuente de inóculo, la infección primaria
comienza cuando la parte aérea de la planta se pone en contacto con el patógeno. A
partir de allí, se produce un gran número de esporas sobre las lesiones, las cuales son
diseminadas por el viento y el agua constituyendo la fuente secundaria de infección
(Ntahimpera y col., 1997) (Figura 10). Períodos de 3 a 4 días de lluvia seguidos por alta
humedad ambiente son favorables para desencadenar la enfermedad (Madden y
Boudreau, 1997; Ntahimpera y col., 1997), a la vez que la máxima esporulación del
patógeno se consigue a una temperatura de 25ºC. Los períodos de mayor susceptibilidad
de las plantas de frutilla se corresponden con la producción de estolones en la etapa
vegetativa y con el incremento de la madurez de los frutos en la etapa reproductiva del
cultivo. De esta forma, los estolones jóvenes y el pecíolo de la hoja más joven,
constituyen las partes más susceptibles de la planta. Además, las flores abiertas y los
frutos maduros son más susceptibles que las yemas cerradas y los frutos verdes.
40
Figura 10: Ciclo hipotético de la enfermedad de la antracnosis en frutilla causada por Colletotrichum sp. A la
derecha se muestran los estados del ciclo de vida del patógeno. C: conidios. A: apresorio. IH: hifa infectiva.
En el marco del Programa Nacional de Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla)
en el laboratorio de Biotecnología Vegetal del INSIBIO (CONICET-UNT) se obtuvieron
aislados de las diferentes especies de Colletotrichum responsables de la antracnosis de la
frutilla en el Noroeste argentino. Los cultivares de frutilla mas utilizados en argentina, los
que a su vez son los principales progenitores del Pro-Frutilla, fueron desafiados con estos
genotipos (aislados) de Colletotrichum correspondientes a las tres especies mencionadas.
Para el trabajo experimental de la presente tesis doctoral y con el objetivo de discriminar
respuestas especificas, fue elegido uno de estos aislados, denominado F7, que
corresponde a la especie Colletotrichum fragariae; para investigar la interacción genotipo
de la planta con genotipo del patógeno, tendiente a la búsqueda de genes que puedan en
definitiva contribuir a implementar estrategias de manejo sostenible de la enfermedad.
41
MATERIALES Y METODOS
Material vegetal
Se utilizaron los mismos genotipos mencionados en el capítulo l: ‗Camarosa‘, ‗Chandler‘,
‗Sweet Charlie‘, ‗Selva‘, ‗Milsei Tudla‘ y ‗Pájaro‘. Este último cultivar representado por las 3
diferentes accesiones, ‗Pájaro Mendoza‘, ‗Pájaro Salta‘ y ‗Pájaro Corrientes‘ de acuerdo a
la provincia donde fue colectada.
Condiciones de crecimiento
Las plantas de frutilla (Fragaria ananassa Duch.), fueron colectadas en estadío de
dormición en Tafí del Valle de las instalaciones del vivero del Programa Nacional de
Mejoramiento Genético de la Frutilla (Pro-Frutilla) y mantenidas en invernadero.
Posteriormente este material fue propagado asexualmente por enraizamiento de
estolones en cámaras de cría. En todos los casos se utilizó sustrato esterilizado por
tindalización, mediante autoclavado, para asegurar la calidad fitosanitaria de las plantas.
De esta manera el material vegetal se mantuvo libre de contaminación fitopatógena y en
condiciones adecuadas para un buen crecimiento vegetativo. Las plantas se regaron con
agua destilada y todas las hojas senescentes fueron removidas periódicamente hasta 10
días antes de los experimentos de inoculación. Se seleccionaron 8 plantas de cada
genotipo por su tamaño: al menos 5 hojas totalmente expandidas, lo que bajo nuestras
condiciones se logra entre 14 y 16 semanas de cultivo.
Material fúngico
Se utilizó el aislado F7 de Colletotrichum fragariae, del cepario obtenido por nuestro
grupo. Este cepario contiene numerosos aislados de Colletotrichum sp. y fue construido a
partir de la colección de tejido enfermo de plantas de frutilla cultivadas en distintas
regiones productoras del Noroeste argentino (Salazar, 2009. Tesis Doctoral). El aislado
F7 fue obtenido a partir de una planta de la variedad Chandler, con frutos que mostraban
los síntomas característicos de antracnosis. Los frutos fueron recolectados directamente
del campo de una plantación de frutillas de la localidad de Famaillá, en la provincia de
Tucumán.
A partir de esta muestra se obtuvo un cultivo monospórico del hongo, el que se denominó
F7. Para ello, en condiciones de esterilidad, en cámara de flujo laminar (Casiba HL1,
Argentina), se raspó suavemente el micelio de la superficie de una colonia con una
espátula y el material así obtenido se resuspendió en 15 ml de agua destilada estéril. La
suspensión se filtró a través de gasa con la ayuda de una jeringa estéril para remover los
restos de micelio y se realizó el recuento de conidios en cámara de Newbawer. Se llevó a
42
una concentración de 1,5 x 106 conidios/ml con agua destilada estéril y se realizaron
diluciones sucesivas: 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. Se esparcieron 0,1 ml de cada dilución en
placas de Petri conteniendo 20 ml de medio Agar Papa Glucosado (APG) al 1,5% pH 6,6 6,8 (Hansen, 1926). Las placas se incubaron a 28ºC bajo luz blanca continua (2.000 lux)
para inducir la formación de conidios (Smith y Black, 1990). Cada 24hs se evaluó el
crecimiento en cada placa y al 5º día con la dilución 1:4 se detectó crecimiento de una
espora/conidio del hongo. A este punto de crecimiento del hongo se lo retiró, en
condiciones asépticas, y se lo transfirió a una nueva placa con medio APG que se incubó
en las condiciones mencionadas. La colonia desarrollada a partir de esta espora es la que
se multiplicó para realizar todos los experimentos de infección bajo condiciones
controladas.
Los cultivos se mantuvieron frescos realizando repiques de la colonia del hongo.
Pequeños trozos de micelio de la zona de avance del patógeno fueron transferidos a
medio APG fresco donde se incubaron por 15 días en iguales condiciones y
posteriormente fueron mantenidos a 4ºC.
Antes de realizar las inoculaciones a las plantas previamente seleccionadas, se
confirmaron las características culturales del aislado F7 mediante estudios de morfología
del hongo (medición del tamaño de los conidios, determinación de la forma de los
conidios) y se analizaron las características de crecimiento de las colonias.
Inoculación
Para la inoculación de cada genotipo se utilizaron cultivos frescos del aislado F7 a partir
del aislado monospórico de C. fragariae. La suspensión de conidios se realizó en agua
destilada estéril raspando el micelio de la superficie de la colonia y filtrando a través de
una gasa en una jeringa estéril. Se realizó el recuento de los conidios con cámara de
Newbawer y se llevó a una concentración de la suspensión a 1,5 x 10 6 conidios/ml con
agua destilada estéril conteniendo Tween 20 al 0,1% v/v (tensioactivo que mejora la
adhesión, disminuyendo la tensión superficial) lo que permite un mejor contacto de la
suspensión conidial con la superficie de la planta.
La metodología de inoculación utilizada fue optimizada por nuestro grupo de trabajo. La
pulverización se realizó sobre hojas y pecíolos hasta punto de goteo (Smith y Black,
1990), sin provocar heridas. Las plantas controles fueron pulverizadas con agua destilada
estéril y tensioactivo. Luego todas las plantas, pero en cámaras separadas para el caso
de los controles, se colocaron en cámaras húmedas (100% HR) en oscuridad a 30-32ºC
durante 48 horas para facilitar la germinación del hongo. Posteriormente, fueron
43
transferidas a cámaras de seguimiento con un fotoperíodo de 16 horas de luz, una HR del
70% y a una temperatura de 28-30ºC, donde permanecieron bajo observación durante 50
días para evaluar el desarrollo de los síntomas y el grado de severidad de la enfermedad.
Evaluación del grado de severidad de la enfermedad
Las plantas fueron evaluadas a los 9, 21, 30, 40 y 50 días posteriores a la inoculación.
Los síntomas fueron observados en los pecíolos de las tres hojas más jóvenes, totalmente
expandidas. La tasa de severidad de la enfermedad o Índice de Severidad de la
Enfermedad (ISE) (DSR del inglés, ―
Disease Severity Rating‖) fue establecida en una
escala de 1 a 5, basado en la evaluación de los síntomas según la escala de Delp y
Milholland, (1980) como a continuación se detallan:
Grado 1: pecíolos sanos, no se observan lesiones;
Grado 2: lesiones menores a 3 mm y superficiales a lo largo del pecíolo;
Grado 3: lesiones de 3 a 10 mm de coloración rojiza;
Grado 4: lesiones severas, con estrangulamiento del pecíolo o bien abarcando hasta un
50% de la longitud del mismo;
Grado 5: lesión muy severa, que abarca más del 50% del pecíolo y/o planta muerta.
En caso de encontrar diferentes grados de lesión en la misma planta, se consideró el
valor máximo al momento de la observación. Las plantas con un grado de severidad de la
enfermedad mayor a 2 fueron consideradas susceptibles.
Figura 11: Índice de Severidad de la Enfermedad (ISE) observados en pecíolos infectados por
Colletotrichum spp. Fuente: Delp y Millohand, 1980.
Análisis de los datos
El diseño experimental fue aleatorizado, con 4 repeticiones independientes para cada
genotipo y cada ensayo fue realizado tres veces en forma independiente. Los resultados
se analizaron mediante el programa Statistix versión 9 (Analytical Software, 1996). Para el
44
estudio de la medida de posición (media aritmética) utilizada para describir este lote de
datos, se usó la Prueba de las Mínimas Diferencias Significativas (LSD del inglés ―L
east
Significant Differences‖). Para estudiar la dispersión de los datos respecto a la media se
realizó el Análisis de la Varianza (ANOVA, Sokal y Rohlf 1995).
45
RESULTADOS
En una primera etapa y antes de realizar inoculaciones sobre los genotipos de frutilla en
estudio, se analizaron las caracteristicas culturales del hongo para compararlos con los
genotipos pertenecientes a las tres especies del cepario de nuestro grupo de trabajo.
Características morfológicas del aislado F7
Se midió el tamaño de los conidios, se determinó la forma de los conidios, y se
caracterizaron las colonias en cuanto a forma, aspecto, color y velocidad de crecimiento.
Se utilizó como referencia los datos publicados por Salazar (2009, tesis Doctoral).
A continuación se detallan los resultados obtenidos, los cuales coinciden con los de
referencia para la especie Colletotrichum fragariae:

Forma del Conidio: cilíndrico.

Tamaño del conidio: 11,0 x 4,1 µm (± 2,8 x 0,5 µm).

Forma de la colonia: regular.

Aspecto de la colonia: algodonosa.

Velocidad de crecimiento: 0,7 cm/día en medio de cultivo, con luz blanca continua y
28 ºC de temperatura.

Ausencia de fase sexual.
Figura 12: micro fotografía de microscopio electrónico de conidios del aislado F7. Nótese la forma cilíndrica
con ambos extremos redondeados típicos del aislado F7.
Los aislados cultivados en medio APG sirvieron para describir la forma de las colonias y
aspecto de las mismas. En general el color del cirrus (masas de conidios) fue gris.
46
Figura 13: Aspecto y color de la colonia en el anverso y reverso de la placa, del aislado F7 de Colletotrichum
fragariae.
Para realizar las pruebas de patogenicidad de este hongo sobre diferentes genotipos de
frutilla, se siguió una metodología de inoculación bajo condiciones controladas optimizada
en nuestro laboratorio, que posibilita la valoración fenotípica certera del grado de
resistencia/susceptibilidad de las variedades de frutilla.
La pulverización con la suspensión de conidios fue efectiva para desencadenar la
enfermedad sobre los genotipos susceptibles de frutilla. Las lesiones pudieron
visualizarse a partir de las 72 horas posteriores a la inoculación. En ningún caso se
observaron síntomas en las plantas utilizadas como controles.
Se estimó el grado de resistencia/susceptibilidad de los distintos genotipos estudiados de
acuerdo a la sintomatología producida por el aislado F7 siguiendo la escala de DSR. Se
observó un amplio rango de variabilidad en la respuesta al patógeno, hubo una
distribución continua entre la máxima resistencia (DSR= 1,2) y la máxima susceptibilidad
(DSR= 5). Los genotipos Pájaro Mendoza, Chandler y Pájaro Corrientes se comportaron
como altamente susceptibles, mientras que los genotipos Pájaro Salta, Camarosa y Selva
presentaron altos niveles de resistencia (Cuadro 7).
Cuadro 7: valores promedio de DSR obtenidos al desafiar genotipos de frutilla con el aisaldo F7, a 50 días
posteriores a la inoculación.
Cultivar
Camarosa
Chandler
Milsei Tudla
Sweet Charlie
Selva
Pájaro Corrientes
Pájaro Salta
Pájaro Mendoza
DSR
1,2
5
4,2
3,5
1,4
5
1,2
5
Los valores promedio de DSR obtenidos a los 50 días pos-inoculación demostraron que
existe una interacción específica genotipo/patógeno: cada cultivar presentó diferentes
47
grados de resistencia/susceptibilidad frente al aislado F7. En el caso de las accesiones
del cultivar Pajaro, se debe resaltar que mientras dos accesiones se comportaron como
susceptibles (Pájaro Mendoza y Corrientes), la tercera tuvo una respuesta totalmente
opuesta (Pájaro Salta).
a) Pajaro Salta
b) Pajaro Mendoza
96hs post inoculación
c) Pajaro Salta
d) Pajaro Mendoza
21 días post inoculación
Figura 14: manifestación contrastante de los síntomas de dos accesiones del cultivar Pájaro a) P. Salta, la
flecha indica la falta de sintoma y b) P. Mendoza, la flecha indica el sintoma; ambas a 96 horas posteriores
a la inoculación con el aislado F7. Y c) P. Salta y d) P. Mendoza, ambas a 21 dias posteriores a la
inoculación con el aislado F7.
48
DISCUSIÓN
A través de inoculaciones bajo condiciones controladas pudo confirmarse que los
diferentes genotipos de frutilla respondieron en forma diferencial cuando se desafiaron
con el mismo genotipo patógeno (aislado F7), lo que pone de manifiesto que hay una
interaccion específica genotipo del hongo con genotipo de frutilla.
La respuesta defensiva diferencial de las tres accesiones del cultivar ‗Pajaro‘ en relación
al aislado F7 utilizado, muestra como cada genotipo identificado por métodos moleculares
(ver Capitulo l), presenta o puede presentar un fenotipo distinto y por tanto constituyen o
pueden constituir tres fuentes de resistencia distinta.
La manifestación de una respuesta contrastante en cuanto a resistencia en genotipos que
provienen de un mismo cultivar y que por lo tanto tienen un mayor parecido genético
relativo (ver figura 7 del Capitulo l), brinda una herramienta para identificar las regiones
genéticas que han cambiado respecto del cultivar o variedad original, bajo la hipotesis de
que esas zonas genómicas podrian estar involucradas en la interacción con hongos del
género Colletotrichum. Esto siempre a la luz de los resultados obtenidos, los cuales
indican que al menos uno de los genotipos de Pájaro presenta un comportamiento de
resistencia frente a la cepa F7 de Colletotrichum fragariae, lo que conduce a una
interacción claramente incompatible. Lo expresado abre la posibilidad de dilucidar los
mecanismos implicados en la respuesta de defensa, que tendrían gran interés académico
y biotecnológico.
CONCLUSIONES
Los ensayos de patogenicidad demostraron que los diferentes genotipos de frutilla
cultivada analizados, inclusive diferentes accesiones de un mismo cultivar que fue
multiplicado de manera independiente en tres lugares del país (Mendoza, Corrientes y
Salta), respondieron en forma diferencial al ser desafiados con un mismo aislado
patogénico. Como los tres genotipos de Pájaro están emparentados entre sí y manifiestan
un comportamiento distinto frente a un mismo aislado patogénico (F7), se puede plantear
la hipótesis de que la mayor resistencia de la accesión Pajaro Salta puede deberse a
cambios en las zonas genómicas relacionadas con la respuesta a C. fragariae.
49
CAPITULO lll
Búsqueda de marcadores moleculares asociados con genes que aumenten la
resistencia a C. fragariae en frutilla.
INTRODUCCIÓN
Los cultivos de frutilla continuamente son afectados por el complejo de hongos que
causan la antracnosis. Estos patógenos son capaces de colonizar y provocar daños
importantes en el cultivo, por lo que se destinan anualmente grandes cantidades de dinero
para su manejo, siendo la aplicación de fungicidas convencionales el método más
empleado. No obstante, los agroquímicos favorecen la selección de resistencia en las
poblaciones de los distintos patógenos en las áreas de cultivo y causan graves
alteraciones en el ambiente y en la calidad de vida de los aplicadores y consumidores.
También hay métodos alternativos para el manejo de la antracnosis y otras
enfermedades, los cuales están siendo incluidos en protocolos para el manejo integrado
de plagas y enfermedades, pero sin duda la mejor forma de manejar ésta y otras
enfermedades en cualquier cultivo, es la via genética usando genes que incrementen la
resistencia. Como reacción extrema a la agronomía convencional también surgió la
agricultura orgánica con una postura estricta hacia la eliminación de los plaguicidas,
fungicidas y fertilizantes sintéticos, sin proponer métodos alternativos que puedan
mantener una eficiencia productiva que no haga retroceder los rendimientos. Para
desarrollar tecnologías alternativas resulta muy importante aumentar el conocimiento
científico de la interacción planta-patógeno para poder exaservar, tecnológicamente, los
mecanismos de defensa naturales de las plantas.
Manejo integrado
En la actualidad existe un importante consenso mundial para promover, en general, la
agricultura sostenible o sustentable mediante el desarrollo de sistemas productivos
integradores de procedimientos agronómicos de bajo impacto ambiental (producción
integrada). En este marco, el control eficiente de las enfermedades de un cultivo requiere
combinar todas las estrategias de lucha disponibles, lo que se conoce como ―
manejo
integrado de plagas y enfermedades‖. Esta producción integrada es la obtención
económicamente viable de frutas de alta calidad, y en la cual se da prioridad al empleo de
los métodos ecológicamente más seguros para el control de enfermedades, minimizando
la utilización de agroquímicos de síntesis y sus efectos secundarios negativos. Propone
estrategias biológicas o de biocontrol para combatir las enfermedades de los cultivos.
50
Entre las diversas aproximaciones biológicas englobadas en el término biotecnología, se
incluye la utilización de variedades con resistencia incrementada (resultantes de mejora
genética convencional o asistida por marcadores moleculares), así como el empleo de
Agentes de Control Biológico (ACB). Estos ACB pueden actuar directamente sobre el
patógeno a través de parasitismo, predación, antibiosis o competición como es el caso de
los microorganismos antagonistas. También pueden ejercer una acción indirecta al
interactuar con la planta hospedera confiriéndole protección frente a la enfermedad
mediante la activación de mecanismos de defensa.
Como se dijo, el desarrollo de cultivares mas resistentes es otra opción para prevenir el
uso desmedido de agentes químicos y surge como la estrategia más rentable y a largo
plazo.
En ambos casos para lograr una u otra opción, es muy importante tener una mejor
comprensión de los mecanismos de defensa de las plantas contra la infección de un
patógeno. Por lo que es necesario avanzar en los conocimientos sobre los mecanismos
moleculares que intervienen en las interacciones planta-microorganismo.
Interacción planta–patógeno
Las plantas están continuamente en contacto con microorganismos patógenos, pero sólo
una pequeña proporción de ellos tienen la capacidad de invadir exitosamente la planta
causando enfermedad. Esto se debe principalmente a varias razones: i) la especie vegetal
involucrada en la interacción no presenta los requerimientos que necesita el patógeno y la
planta se considera no-hospedera (resistencia a nivel de especie o ―no
n-host resistance‖);
ii) existen barreras preformadas, estructuras o componentes tóxicos en diferentes tejidos
de la planta que impiden la entrada y el crecimiento del patógeno (Van Etten y col., 1994);
iii) mecanismos de defensa activos inducidos por el contacto con el patógeno tras el
reconocimiento planta–patógeno. En todos estos casos decimos que la interacción es
incompatible (hay resistencia) pero solo en el tercer caso el mecanismo de defensa
depende exclusivamente de respuestas inducidas para limitar el ataque del patógeno. La
enfermedad (interacción compatible) ocurrirá solo cuando las defensas preformadas de la
planta sean inadecuadas, las condiciones ambientales sean favorables para el patógeno
y/o si las respuestas activas de defensa no sean efectivas.
Entre los mecanismos o barreras generales encontramos las defensas estructurales como
cutículas cerosas y gruesas, tricomas, etc., compuestos antimicrobianos preformados y
producción de compuestos fenólicos (Dangl y Jones 2001, Nicholson y Hammerschmidt
1992) y/o de enzimas de defensa como las quitinasas y glucanasas (Bowles 1990).
51
En cuanto a los mecanismos de defensa inducibles las plantas tienen un sistema de
reconocimiento molecular del patógeno diferenciado en dos niveles (Jones y Dangl,
2006). En el primero, la planta reconoce moléculas comunes de diversas clases de
microorganismos, los MAMP (del inglés, ―
Microbe-Associated Molecular Patterns”) los
cuales son percibidos por receptores PRR (del inglés, ―
Pattern Recognition Receptors”).
Este tipo de resistencia se ha denominado defensa basal (Chisholm y col., 2006). Los
patógenos han desarrollado mecanismos para bloquear este primer nivel de defensa a
través de la introducción de factores proteicos denominados efectores. Las plantas a su
vez, han desarrollado un segundo nivel de defensa conocido como resistencia razaespecifica, en la cual las proteínas de resistencia (R) permiten el reconocimiento de los
efectores del patógeno. Cuando los efectores son reconocidos reciben el nombre de
proteínas de avirulencia (Avr) (Jones y Dangl, 2006). Las variedades de plantas que
posean la proteína R que reconozca la proteína Avr correspondiente de una raza de un
patógeno determinado presentarán este tipo de resistencia (resistencia monogénica o
cualitativa). El carácter monogénico de la resistencia raza-específica ha hecho que esta
sea la más estudiada, quizás también la más utilizada en el mejoramiento, pero al ser la
menos duradera, en la actualidad se busca otros tipos de resistencia.
Por otra parte, el ataque localizado de patógenos virulentos y avirulentos capaces de
producir lesiones necróticas puede resultar en la inducción de resistencia local (LAR:
Localized Acquired Resistance) o sistémica (SAR: Systemic Acquired Resistance) a un
ataque subsecuente del patógeno (Hammerschmidt y Becker 1997). La resistencia
sistémica adquirida, que es efectiva en sitios distantes del punto de infección, es una
respuesta de defensa activa y de amplio espectro asociada a una alta expresión de genes
que codifican proteínas de defensa, denominadas proteínas PR (Pathogen-Related)
(Alvarez y col. 1998, Hammerschmidt 1999b). En la mayoría de los casos, SAR es
igualmente efectiva contra hongos, bacterias, virus o nematodos, es decir es
independiente del organismo inductor (Ryals y col. 1996).
Se ha demostrado que la resistencia sistémica involucra diferentes vías de transducción
de señales. Algunas fitohormonas o reguladores de crecimiento regulan, además de
numerosos aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, la respuesta a diferentes tipos
de estrés. La resistencia sistémica inducida por patógenos está mediada por una ruta
asociada y dependiente de ácido salicílico (SA), y por una ruta independiente de SA,
ligada al ácido jasmónico (JA) y al etileno (Reymond y Farmer 1998; Thomma y col.
1999). Mientras la ruta dependiente de SA permite el desarrollo de la SAR y la expresión
de genes que codifican proteínas PR, la ruta ligada al JA y etileno conduce a la expresión
52
de genes que codifican proteínas denominadas defensinas, tioninas o proteínas
antimicrobianas (AMP), inhibidores de proteasas y otras proteínas PR no inducidas por
SA. Frecuentemente ambas rutas se entrecruzan y pueden inducir compuestos o
proteínas de defensa comunes. Dependiendo del patógeno que infecta, los tipos de
compuestos de defensa inducidos por la planta pueden variar predominando los inducidos
por la vía de SA o por la de JA y etileno.
Resistencia mediada por genes R
La resistencia a enfermedades en plantas depende a menudo de la capacidad de estas
de reconocer al patógeno y de provocar una activación rápida de los mecanismos de
defensa de la misma. La existencia de este proceso de reconocimiento específico ha sido
revelada por el análisis de interacciones planta-patógeno. La definición genética de esta
interacción se explica mediante la hipótesis de Flor obtenida tras su trabajo realizado de la
interacción entre el lino cultivado (Linum usitatissimum) y el hongo biotrófico Melampsora
lini (Flor, 1947). Flor demostró que la expresión o no de la resistencia de la planta, en un
reconocimiento específico planta-patógeno, está gobernada por la presencia de un gen de
resistencia dominante (R) en la planta, el producto del cual reconoce al producto de un
gen especifico de avirulencia dominante (Avr) del patógeno. Una pérdida o alteración de
algunos de los dos genes conducirá a la manifestación de la enfermedad. Este es el
denominado sistema gen a gen (Flor, 1971). El modelo fue desarrollado en una
interacción planta-hongo, sin embargo, también proporciona la base genética para la
mayoría de las resistencias activas en plantas contra patógenos tan diversos como
bacterias, hongos, virus, nematodos e insectos (Keen, 1990; Dangl, 1992).
Figura 15: Esquema que explica la hipótesis de la interacción gen a gen. Se muestran dos tipos de
respuesta: respuesta incompatible (I) o resistencia y respuesta compatible (C) o susceptibilidad, como
resultado de la interacción de los productos de un gen Avr y R en el patógeno y en el hospedero,
respectivamente.
53
El reconocimiento de la proteína Avr del patógeno por parte de la proteína R desencadena
una serie de eventos de transducción de señales que puede muchas veces provocar una
respuesta de hipersensibilidad (HR) seguida de muerte celular, lo que impide la dispersión
de la infección (Cullis 2004). Un evento que antecede a la HR es un estallido oxidativo
mediado por especies reactivas del oxígeno; también ocurre la activación de varias
proteínas quinasas, el flujo de iones y la expresión de genes que codifican proteínas con
actividad antimicrobiana (Martin y col., 2003). La resistencia específica monogénica contra
la mayoría de los patógenos biotróficos sigue este modelo gen-a-gen.
Estructura y función de los genes R
Desde que en 1993 se identificó el primer gen de resistencia en tomate, el Pto, mediante
una aproximación de clonaje posicional (Martin y col., 1993), se han identificado y clonado
un gran número de genes R que confieren resistencia frente a distintos patógenos. A
pesar del amplio rango taxonómico de hospederos vegetales y patógenos, los genes R
pueden agruparse principalmente en cinco clases según la presencia de dominios
estructurales conservados en las proteínas que codifican: i) proteínas intracelulares con
un sitio de unión a nucleótidos (NBS: ―
Nucleotide Binding Site‖) y un dominio de
repeticiones ricas en leucinas (LRR: ―Le
ucine Rich Repeats‖); ii) proteínas con LRR
extracelular, un único dominio transmembrana (TM) y un dominio citoplasmático; iii)
serina/treonina quinasas (STK) intracelulares; iv) proteínas LRR con un único TM y un
dominio de quinasa intracelular y finalmente, v) la clase RPW8 con un dominio TM aminoterminal y un dominio ―coiled
-coil‖ (CC) intracelular. En la Figura 16 se muestra una
representación esquemática de las clases más importantes de proteínas R.
La clase NBS-LRR incluye a la gran mayoría de los genes R. Son muy abundantes en las
especies vegetales y constituyen grupos que incluyen varios genes R diferentes.
54
Figura 16: Diferentes clases de proteínas de resistencia vegetales representadas por las proteínas: BS2 de
pimiento (resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria); Cf-2, 4, 5 y 9 de tomate (resistencia a
Cladosporium fulvum); L6 de lino (resistencia a roya, Melampsora lini); PBS1 de A. thaliana y Pto de tomate
(resistencia a Pseudomonas syringae); RPG1 de avena (resistencia a numerosas razas de Puccinia
graminis), RPM1 de A. thaliana (resistencia a Pseudomonas syringae pv maculicola); RPW8 de A. thaliana
(resistencia a los agentes causales de mildiu Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium lycopersisi);
RRS1-R de A. thaliana (resistencia a Ralstonia solanacearum); Ve1 y Ve2 de tomate (resistencia a
Verticillium dahliae y V.alboatrum); Pi-d2 de arroz (resistencia a Magnaporthe grisea); Xa21 de arroz
(resistencia a Xanthomonas oryzae pv oryzae) y la proteína de resistencia basal FLS2 de A. thaliana
(receptor de flagelina bacteriana).
Dominios y motivos: TIR: homólogo a los receptores Toll e Interleuquina-1, NBS o NBARC: dominio de
unión a nucleótidos, LRR: repeticiones ricas en leucina, CC: estructura de coiled coil, NLS: señal de
localización nuclear, WRKY: dominio ―
dedos de zinc‖ (unión a DNA), ESC: señal de endocitosis, PEST:
secuencia tipo Pro-Glu-Ser-Thr, LEC: dominio tipo lectina (unión a carbohidratos). Dominios 1-3: sin
homología con otras proteínas. Adaptado de Hammond-Kosack y Parker (2003).
Utilización de los genes R
La evolución de la interacción gen a gen tiene como consecuencia una diversidad de
genes R en diferentes individuos de una especie hospedante y una correspondiente
diversidad de genes de avirulencia en diferentes razas de patógenos (Staskawicz y col.,
1995). El estudio de la diversidad de genes R, y la organización genómica de los mismos,
han despertado el interés de diferentes investigadores, porque abre nuevas perspectivas
para el entendimiento de la evolución de los genes R y el desarrollo de estrategias
eficaces para el mejoramiento de la resistencia a las enfermedades.
55
Asimismo, los fito-mejoradores han estudiado durante más de un siglo la herencia de la
resistencia a enfermedades aplicando técnicas de mejoramiento clásico por introgresion
de genes R de individuos de especies silvestres en cultivares elite (Biffen, 1912). Estos
métodos utilizan la expresión fenotípica como manifestación de la variabilidad existente,
como objetivo y criterio de selección e implica largos períodos de tiempo: el desarrollo de
cultivares resistentes puede insumir hasta 15 o 20 años. Pero incluso luego de este
proceso laborioso y de largo plazo, los mejoradores han tenido que enfrentar numerosos
problemas como la escasa durabilidad y la ligación genética con caracteres indeseables
(Rommens y Kishore, 2000).
Las estrategias de mejoramiento para encontrar resistencia a las enfermedades fúngicas
se han basado en métodos convencionales y existen limitaciones en la celeridad y
precisión con que estas características útiles pueden ser identificadas, seleccionadas y
utilizadas en los programas de mejoramiento. Con el advenimiento de la biología
molecular y la capacidad para identificar, aislar y clonar genes, se estan desarrollando
nuevas tecnologías que contribuyan a hacer mas eficiente la mejora genetica.
La biotecnología abre muchas posibilidades en este campo, permitiendo que los procesos
sean más rápidos y confiables.
Genómica funcional
Desde principios de los años noventa se han empezado a implementar novedosas
tecnologías que posibilitan el análisis de los cambios en la expresión de varios genes a la
vez. Antes del uso de estas herramientas basadas en la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), solo se podía evaluar los cambios de expresión de uno o pocos genes
a la vez mediante ensayos de ―N
orthern blot‖ hibridando, por complementariedad de
nucleótidos, con sondas especificas para cada gen. Lamentablemente la gran cantidad y
complejidad de problemas superaba por lejos la capacidad de estas técnicas para
resolver las preguntas que surgían. El desarrollo de tecnologías para el estudio de la
expresión génica de una manera mas generalizada surgió con la capacidad de amplificar
in vitro segmentos de ADN, es decir con la técnica de PCR mencionada con anterioridad.
Una aproximación muy utilizada, es la tecnología de microarreglos de ADN (―
DNA
microarrays”), basada en la impresión de sondas (cientos o miles de ellas) en una placa
para que éstas detecten las moléculas de ADN o ARN complementarias y en función de
su numero relativo se puede estimar el nivel de expresión de varios genes a la vez. Sin
embargo esta técnologia necesita conocimiento previo de parte o la totalidad de la
secuencia del genoma del organismo a estudiar y ademas, es muy costosa. Por estas
razones se ha transformado en la opción elegida cuando se trata de estudiar cambios en
56
la expresión génica en organismos modelos clásicos (Banerjee y Zhang 2002, Reijans y
col., 2003).
Para investigar la expresión génica en organismos no modelos cuyos genomas no están
secuenciados, se han implementado aproximaciones menos costosas. Las más usadas
son: DDRT-PCR (―
Differential Display Reverse Transcription- PCR”), SAGE (―
Serial
Analysis of Gene Expression”) y cDNA-AFLP (cDNA- Amplified Fragment Length
Polymorphism).
Diversas
publicaciones
comparan
algunas
de
estas
técnicas
considerando los distintos factores que afectan a cada uno de los sistemas, tales como
reproducibilidad, sensibilidad, cantidad de muestra (ARN) a utilizar, equipamiento
necesario y costos. Por combinar robustez con la posibilidad de llevarla a cabo en un
laboratorio relativamente modesto, una de las mejores se considera al cDNA-AFLP,
técnica basada en la obtención, de fragmentos de restricción de ADN copia de
transcriptos, los cuales son posteriormente amplificados por PCR (Bachem y col., 1996,
1998).
El SAGE, método que proporciona datos cuantitativos concernientes a la expresión
génica, es costoso y muy laborioso cuando se deben comparar muchas muestras en
distintas condiciones, aunque no es necesario un conocimiento acabado del genoma del
organismo a estudiar (Kuhn, 2001). El cDNA-AFLP es mucho menos costoso y mediante
electroforesis en geles de secuenciación de los perfiles de expresión génica generados
mediante PCR, también permite un análisis cuantitativo con una lectura densitométrica de
las bandas.
El DDRT-PCR es un método que tampoco necesita una gran cantidad de información
previa, sin embargo tiene importantes limitaciones, tales como problemas de
reproducibilidad, dificultad para la detección de mensajeros muy escasos y generación de
falsos positivos (Bauer y col., 1994; Bachem y col., 1998). Estas debilidades del DDRTPCR han sido resueltas por el cDNA-AFLP utilizando cebadores específicos y condiciones
de alta restrictividad, haciendo asimismo posible la verificación de la identidad de una
banda de una manera simple y rápida. Además, el uso de oligonucleótidos oligo-dT para
la síntesis del cDNA permite la detección de casi todos los transcriptos en un sistema
biológico determinado, utilizando pequeñas cantidades de material de partida (Bachem y
col., 1998, Kuhn, 2001). Comparándola con la tecnología de microarreglos, el cDNA-AFLP
es una técnica muy útil por ser más reproducible, con las ventajas de tener un menor
costo y que no sea necesario tener un genoma previamente secuenciado, a pesar de que
tiene la desventaja de generar menos información (Donson y col., 2002, Reijans y col.,
2003).
57
Hay otros procedimientos que al momento de llevar a cabo la tarea experimental de esta
tesis eran más caros como las genotecas sustractivas o directamente no estaban
disponibles o al alcance de nuestro laboratorio, como la secuenciación masiva del
transcriptoma.
Por las razones expuestas, el cDNA-AFLP representa una buena opción para analizar en
forma global los transcriptos que se expresen diferencialmente en genotipos
emparentados de Fragaria ananassa y que tienen resistencia/susceptibilidad contrastante
frente al aislado F7 de Colletotrichum fragariae.
Análisis transcriptomico mediante cDNA-AFLP
La técnica está basada en la síntesis de un ADN complementario (cDNA), utilizando una
transcriptasa inversa, de cada ARN mensajero (mRNA) que se expresa en un momento
dado en un tejido determinado bajo un tratamiento específico. La identificación de los
cDNA se obtiene por secuenciación de los mismos. Así, estas secuencias de transcriptos
que se expresan (EST) nos permite conocer qué genes pueden estar involucrados en la
respuesta a un tratamiento específico y de este modo, identificar genes candidatos para el
mejoramiento genético, ya sea por transgénesis o por el uso de marcadores moleculares
asociados o ligados a genes de interés.
Esta técnica fue desarrollada y utilizada primero por Bachem y col. (1996) para estudiar la
expresión diferencial de los genes durante la formación del tubérculo en papa y desde
entonces fue usada para investigar la expresión de genes en diferentes sistemas
incluyendo humanos (Egert y col., 2006), animales (Fukuda y col., 1999; Vandeput y col.,
2005), plantas (Carmona y col., 2004; Durrant y col., 2000; Kemp y col., 2005; Diegoa y
col., 2006; Money y col., 1996; Simoes-Araujo y col., 2002; Yang y col., 2003) y
microorganismos (Decorosi y col., 2005; Dellagi y col., 2000; Qin y col., 2000).
Breyne y col. (2003) han mejorado y adaptado el procedimiento original de Bachem y col.
(1996) para realizar un análisis global de la expresión génica cuantitativa de todo un
genoma y discutieron sus ventajas sobre los microarreglos. La sensibilidad y especificidad
del método les permitió detectar genes débilmente expresados y distinguir entre
secuencias homólogas de genes en tabaco.
Esta aproximación también fue usada en plantas para estudiar genes involucrados en el
control de diversos procesos biológicos que van desde el desarrollo de la planta hasta la
respuesta a condiciones ambientales. Pero especialmente ha sido utilizada para la
identificación de secuencias inducidas durante un proceso infeccioso. Por ejemplo, en
plantas de yuca infectadas con Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) se ha
58
usado esta estrategia para identificar genes expresados diferencialmente (Santaella y col.,
2004), tambien fue aplicada para identificar y aislar genes específicamente expresados
después de la infección de Peronospora en Arabidopsis (Van der Biezen y col., 2000) y
después de la inoculación con Cladosporium en tabaco (Durrant y col., 2000). El método
también ha sido usado por Qin y col., (2000) para identificar factores de patogenicidad en
el nematodo de la papa Globodera rostochiensis.
En el caso de la frutilla esta técnica fue utilizada para estudiar los genes involucrados en
el desarrollo del fruto y su maduración (Balogh y col., 2004).
Caracterización genómica por AFLP
La metodología de cDNA-AFLP aprovecha el potencial de los AFLP (Vos y col., 1995)
para hacer marcas y caracterizar genomas, identificando poblaciones de mensajeros que
fueron convertidos en cDNA y pueden ser considerados como el genoma (transcriptoma)
especifico que se genera ante un estímulo o tratamiento.
Los marcadores AFLP “Amplified Fragment Length Polymorphisms” se desarrollaron a
mediados de la década de los noventa y se basan en la combinación de dos técnicas
usadas para la generación de marcadores moleculares: la digestión con enzimas de
restricción y la amplificación por PCR.
Los marcadores AFLP son fragmentos de ADN que proceden de la amplificación, usando
cebadores de secuencias especificas, de ADN genómico digerido con enzimas de
restricción (Vos y col., 1995, Karp y col., 1997, Matthes y col., 1998). Se considera que es
una técnica rápida y de costo medio. Consta básicamente de 4 pasos: 1) Digestión o corte
del ADN genómico con 2 enzimas de restricción, una de corte frecuente y otra de corte
poco frecuente. 2) Ligación de adaptadores de doble cadena, que se unen al extremo final
de los fragmentos de ADN generados, con el objetivo de obtener un ADN molde para la
amplificación. 3) Pre-amplificación con 2 cebadores complementarios a la secuencia de
los adaptadores, que permiten una amplificación consistente sin necesidad de un
conocimiento previo de las secuencias del genoma. 4) Amplificación de una parte de
estos fragmentos pre-amplificados, utilizando cebadores con nucleótidos selectivos que
reducen el número de fragmentos amplificados de manera de poder visualizarlos en una
electroforesis sencilla.
Los AFLP son marcadores dominantes lo cual significa que no se puede identificar al
individuo heterocigota en el caso de estudios de genética poblacional. Estos marcadores
AFLP pueden producir perfiles de complejidad variable de acuerdo al tipo de enzimas de
restricción y la longitud de los cebadores utilizados en el PCR. Son marcadores que
59
segregan de forma mendeliana y proporcionan un elevado número de polimorfismos
reproducibles en relativamente poco tiempo debido a la cantidad de loci detectados por
cada combinación de cebadores utilizados (Blanco M. y Valverde R., 2005).
Genes de defensa en F. ananassa.
En frutilla se conoce poco sobre los mecanismos moleculares involucrados en la
regulación de la expresión génica en las plantas resistentes a hongos patógenos.
Específicamente en el caso de la enfermedad de la antracnosis de la frutilla, hay algunos
estudios a nivel de transcriptoma, proteoma y vías de señalización de la defensa que nos
permiten tener algún entendimiento sobre los mecanismos de defensa de F. ananassa
frente a esta enfermedad.
A continuacion se comentan algunos estudios moleculares en relación a la antracnosis:
Guidarelli y col. (2011) obtuvieron perfiles comparativos de transcriptomas de frutos de
frutilla después de la infección con C. acutatum donde identificaron 44 transcriptos
modulados por C. acutatum, incluyendo los genes que codifican las proteínas necesarias
para las respuestas inducidas por patógenos específicos y metabolitos secundarios.
Martínez-Zamora y col., (2004) informaron por primera vez análogos a genes de
resistencia en frutilla. Identificaron distintos genes de resistencia del tipo NBS-LRR en F.
ananassa y en dos especies del mismo género relacionadas con la frutilla cultivada: F.
vesca y F. chiloensis.
Casado-Díaz y col., (2006) encontraron un gran número de genes de frutilla implicados en
la señalización, el control transcripcional y los mecanismos de defensa, así como muchos
genes de función desconocida que tienen una expresión alterada en respuesta a la
infección por C. acutatum. Informaron qué genes de resistencia del tipo LRR se
expresaban diferencialmente en las plantas de frutilla inoculadas con C. acutatum, con
distintos perfiles según el cultivar y el tejido vegetal estudiado.
Por otro lado, Yanlin y col. (2006) encontraron en plantas de frutillas infectadas con C.
fragariae altos niveles de expresión de dos genes de frutilla de β-1, 3 – glucanasa:
FaBG2-2 y FaBG2-3.
Recientemente se han realizado algunos estudios sobre cambios en la expresión de
proteínas en respuesta a este patógeno. Fang y col., (2012) identificaron 49 proteínas
expresadas diferencialmente en hojas infectadas con C. fragariae. También vieron que
aumentó la expresión de proteínas ya conocidas y otras nuevas sensibles a patógenos
cuyos patrones de expresión tienden a correlacionarse con cambios fisiológicos en las
60
hojas. Ellos examinaron los perfiles de transcripción de hojas de frutilla infectadas y no
infectadas, y confirmaron la inducción de β-1, 3 - glucanasas y proteínas del tipo de las
del choque térmico, de bajo peso molecular en respuesta a la infección por C. fragariae.
Se han encontrado diversos genes que codifican para proteínas PR en frutilla, aunque su
función exacta en las respuestas de defensa no ha sido demostrada. Genes tipo PR-1 no
se han descripto en frutilla, aunque hay un EST para PR-1 publicado en bases de datos
de secuencias nucleotídicas (GenBank ID: AB462752). Tres β-1,3-glucanasas, FaBG2-1,
FaBG2-2 y FaBG2-3, pertenecientes al grupo PR-2 han sido caracterizadas parcialmente
a partir de plantas de frutilla inoculadas con C. acutatum y C. fragariae (Shi y col., 2006).
Quitinasas del tipo II, pertenecientes al grupo PR-3 (FaChi2-1, FaChi2-2), fueron
identificadas y caracterizadas luego de la inoculación con dichos aislados fúngicos (Khan
y Shih, 2004). También se publicó la secuencia genómica de una quitinasa del tipo III
perteneciente al grupo PR-8 (Khan y col., 1999). Dos genes que codifican para proteínas
tipo osmotina, pertenecientes el grupo PR-5, fueron identificadas en frutilla (Wu y col.,
2001; Zhang y Shih, 2007). La expresión de FaOLP1 fue inducida en plantas inoculadas
con C. fragariae y C. acutatum (Zhang, 2006), mientras que FaOLP2 parece solo
responder a estreses abióticos (Zhang y Shih, 2007). Genes codificantes para proteínas
tipo taumatina, pertenecientes también a este grupo, fueron clonados y estudiados por
Casado-Díaz y col. (2006). Una proteína con actividad inhibidora de proteasas llamada
fitocistatina, ha sido identificada en frutilla (FaCPI-1). Esta proteína pertenece al grupo
PR-6 y participaría en la defensa contra insectos y microorganismos patógenos (Martínez
y col., 2005). Genes homólogos a proteínas del grupo PR-10 fueron informados en frutilla
porque se vieron inducidos en plantas de frutilla desafiadas con patógenos (Guidarelli y
col., 2011). Un gen tipo ribonucleasa perteneciente del grupo PR-10 fue identificado y
estudiado por Casado-Díaz y col., (2006). También se han clonado genes que codifican
para proteínas transportadoras de lípidos (Fxaltp1, FaLTP-1 a -5) pertenecientes al grupo
PR-14, que responden a estreses bióticos y abióticos (García-Olmedo y col., 1995;
Yubero-Serrano y col., 2003). Mehli y col. (2004) clonaron genes de proteínas inhibidoras
de poligalacturonasas en frutilla, que hidrolizan la pectina de la pared celular vegetal, las
cuales tendrían un rol fundamental en la defensa contra patógenos fúngicos como Botrytis
cinerea. Un factor de transcripción tipo WRKY identificado en frutilla (FaWRKY1) fue
inducido luego de la infección con C. acutatum, del tratamiento con elicitores de la
defensa y por daño mecánico (Encinas-Villarejo y col., 2009) sugiriendo su participación
en los mecanismos de defensa de frutilla.
61
Los recientes progresos realizados en el área de la genómica (secuenciación de genomas
enteros, desarrollo de colecciones de ESTs o ―
Expressed Sequence Tags”, análisis de
transcriptoma) hacen posible la identificación de un amplio ―
repertorio‖ de genes con
funciones muy diversas en plantas, especialmente en especies vegetales poco estudiadas
como es la frutilla. Hace tres años comenzó un proyecto de investigación genómica en
frutilla el cual incluye el desarrollo de una colección de ESTs. Como se dijo estos ESTs
son fragmentos cortos de ADN generados a partir de la secuenciación de uno o ambos
extremos de los clones de una genoteca de cDNA. Representan fragmentos de un gen
expresado bajo ciertas condiciones particulares (Rudd, 2003). Las secuencias generadas
son depositadas en bases de datos de genes de disposición pública (por ejemplo
GenBank) y representan el 90% de las secuencias disponibles en Fragaria. Los datos
fueron aportados a partir de la secuenciación del genoma de Fragaria vesca (una especie
relacionada a la frutilla cultivada). Se seleccionó a F. vesca (2n = 2x = 14) como una
referencia para el género, por tener un genoma pequeño y representar una puerta de
entrada a los estudios funcionales de genes dentro de la familia de las Rosáceas. La
secuenciación del genoma de F. vesca ssp. vesca accesion Hawaii 4 fue realizada con
una cobertura altísima, utilizando tecnología de segunda generación, ensamblado de novo
y luego anclado en el mapa de ligamiento genético en siete pseudocromosomas (Shulaev
y col., 2011).
Por otra parte, Folta y col. (2010) generaron numerosos ESTs a través de la
secuenciación masiva (pirosecuenciación) de muchos genes en una variedad de F.
ananassa, bajo diversos tratamientos. Los materiales vegetales se agruparon por tipo de
tejido y se secuenciaron grupos de cDNA. Se ensamblaron en más de 32.000 ―
contigs‖.
Los marcadores de pooles de tejido proporcionan un medio para evaluar el patrón de
expresión global para cualquier transcripto dado. Dentro de los ESTs que publicaron Folta
y col., (2010) encontraron similitudes con genes previamente implicados en la respuesta
de defensa tales como genes de resistencia, factores de transcripción de tipo WRKY,
quitinasas, peroxidasas y quinasas entre otros (López y col., 2004). Estos análisis
demuestran la importancia de la colección de ESTs como medio para identificar genes
candidatos implicados en resistencia a enfermedades, así como también en otras
características biológicas de interés agronómico o industrial.
Por lo expuesto y debido al comportamiento contrastante de dos accesiones del cv.
Pájaro en respuesta a inoculaciones con el aislado F7 causante de la enfermedad de la
antracnosis, se decidió investigar los genes que se expresan diferencialmente utilizando la
aproximación biotecnológica de cDNA-AFLP.
62
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron las 2 accesiones de la variedad Pájaro: ‗Salta‘ y ‗Mendoza‘, resistente y
susceptible respectivamente, para realizar inoculaciones con el aislado F7 de
Colletotrichum fragariae.
Las plantas se obtuvieron, propagaron y cultivaron bajo las condiciones descriptas en la
sección Materiales y Métodos del capítulo ll.
Inoculación con el aislado F7
Para las inoculaciones se siguió el mismo procedimiento descripto en la sección
Materiales y Métodos del capítulo ll.
Extracción de ARN total
Se cosecharon foliolos y peciolos de 4 plantas de cada una de las accesiones tanto
inoculadas como controles, a diferentes tiempos post-inoculación, obteniéndose 12
muestras de acuerdo al detalle del Cuadro 8. El material vegetal se congeló
inmediatamente con nitrógeno líquido, para luego realizar la extracción del ARN total.
Como controles se usaron plantas de ambas accesiones pulverizadas con agua destilada
estéril.
Cuadro 8: Denominación asignada a las muestras según el tiempo de tratamiento.
Momento
de
muestreo
Pájaro Salta
Pájaro Salta
Pájaro Mza
Pájaro Mza
Tratamiento
Control
Tratamiento
Control
24hs
Post
1
2
3
4
48hs
Post
5
6
7
8
96hs
Post
9
10
11
12
inoculación
inoculación
inoculación
Todo el material que se utilizó en las extracciones (tubos de polipropileno de 50ml, pipetas
de vidrio, etc) fue esterilizado 2 veces en autoclave, a una presión de 1 atmósfera y 121ºC
durante 20 minutos. Todas las soluciones fueron preparadas con agua bidestilada y
tratadas con DEPC al 0,1%, incubadas a 37ºC toda la noche y al día siguiente fueron
autoclavadas para inactivar este producto.
El ARN total se extrajo a partir de 2 g de tejido siguiendo el protocolo adaptado de
Iandolino y col., (2004) como a continuación se detalla:
63
El buffer de extracción [Tris-HCl 100mM (pH 8), EDTA 25mM (pH 8), CTAB 2% (p/v),
NaCl 2,5 M, PVP soluble 2% (p/v) y Spermidina 0,5gr/l] se precalentó a 65º C durante al
menos 30 minutos.
Antes de usar el buffer de extracción se agregó β-mercaptoetanol a una concentración
final del 2% y se mantuvo caliente hasta su uso.
 Se trituró el tejido vegetal con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y se
transfirió a un tubo de polipropileno de 50ml previamente enfriado.
 Se agregaron 8 ml de buffer de extracción previamente calentado por cada gramo
de tejido y se agitó vigorosamente.
 Se incubó por 30 minutos a 65ºC, agitando en vortex cada 5 minutos.
 Se centrifugó la muestra a 5000 x g por 10 minutos a 4ºC en rotor basculante.
 Se trasfirió el sobrenadante a un tubo estéril de 50 ml, mantenido en hielo.
 Se centrifugó a 5000 x g durante 10 minutos a 4ºC para remover restos del material
vegetal en suspensión.
 Se colocaron volúmenes iguales al de los sobrenadantes de una solución
cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Se mezcló suavemente por inversión durante
1 minuto.
 Se centrifugó a 5000 x g por 5 min a 4ºC.
 Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo estéril de 50ml.
 Se agregó un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), se mezcló
suavemente y se centrifugó a 5000 x g por 5 min a 4ºC.
 Se transfirió el sobrenadante a otro tubo y se agregó ¼ de volumen de Cloruro de
Litio 10M. Se mezcló suavemente y se dejó precipitando toda la noche a 4ºC.
 Se centrifugó a 5000 x g por 30 min a 4ºC.
 Se descartó el sobrenadante.
 Se lavó el precipitado una vez con 1 ml de de etanol 70% y se centrifugó de nuevo
a 5000 x g por 5 min a 4ºC. Se descartó el resto de etanol.
 El precipitado fue inmediatamente resuspendido en 50μl de agua bidestilada
tratada con DEPC al 0,1%. Una vez que se resuspendió completamente se
tomaron 2 alícuotas para análisis y el resto se guardó a -70ºC hasta su utilización.
64
Una alícuota de 4μl se usó para la cuantificación en espectrofotómetro; y la otra de
2μl se usó para una electroforesis en agarosa.
La cuantificación espectrofotométrica se realizó en cubetas de cuarzo, midiendo la
absorbancia a 230 nm, 260 nm y 280 nm. Con la alícuota de 4 μl de cada muestra se
diluyó hasta un volumen final de 500 μl con agua bidestilada estéril y la concentración se
calculó con la siguiente fórmula:
ARN [ng/μl] = A260 x Factor de Dilución x FC*
*FC es el factor de conversión (ng/μl) = 1 unidad de absorbancia es aproximadamente 40 ng/μl de ARN.
(Sambrook y col. 1989).
Asimismo, para medir la contaminación con carbohidratos y sales se calculó la relación
entre las absorbancias obtenidas a 260 nm y 230 nm, debiendo ser ésta superior a 2.
Para medir la contaminación con proteínas se hizo una relación entre las absorbancias a
260 nm y 280 nm, valores superiores a 1,8 se consideraron de apropiada pureza.
Para determinar la calidad del ARN total y la integridad de las bandas del ARN ribosomal,
se analizaron mediante electroforesis nativa en gel de agarosa al 1,2% con buffer TAE
(Tris–acetato 40mM y EDTA 1mM). La electroforesis se realizó a 100V en buffer TAE al
0,5X, colocando 2 μl de cada muestra de ARN adicionada con buffer de carga 1X [Azul de
bromofenol 0,25% (p/v), xilencianol 0,25% (p/v) y glicerol en agua 30% (v/v)] en un
volumen final de 10 μl. Todas las soluciones y el buffer de carga fueron previamente
tratados con DEPC. La visualización del ARN total en el gel se realizó mediante tinción
con 0,5 μg/ml de bromuro de etidio y luego se fotografió el gel expuesto a la luz UV
(260nm).
Para evitar una posible contaminación con ADN, se realizó un tratamiento con DNAsa I
(Invitrogen). De cada una de las muestras de ARN total extraídas, se colocaron 100 μg de
ARN total en un volumen de 85 μl de agua bidestilada estéril tratada con DEPC al 0,1%, y
se agregaron 10μl de buffer 10X ―D
NAse I reaction‖ y 5 μl (5 U) de la enzima DNAsa I. Se
incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente (25ºC aproximadamente) y luego se
inactivó la enzima DNAsa I por adición de 10 μl de EDTA 25 mM e incubación a 65ºC por
10 minutos. Posteriormente se colocó en hielo o se guardó a -20ºC hasta el momento de
realizar la purificación de ARNm.
Técnica cDNA-AFLP
Se utilizó el protocolo de Bachem y col., (1996 y 1998) con modificaciones específicas y
de acuerdo a Vos y col. (1995), que produjeron óptimos resultados para las muestras de
frutilla.
65
La purificación a gran escala de ARN mensajeros o ARN poliA a partir del ARN total (15mg de ARN total) se realizó con el Kit PolyATtract®mRNA Isolation Systems IV
(Promega), siguiendo las indicaciones del fabricante. Este sistema utiliza la tecnología de
las partículas magnéticas ―Prom
ega MagneSphere‖ que permite una purificación de los
ARN mensajeros (ARNm) sin contaminaciones con otros ácidos nucleicos. El sistema
utiliza un cebador oligo (dT) biotinilado para hibridar, con mucha eficacia en una solución,
con la región 3‘ poli(A), presente en la mayoría de los ARNm eucarióticos maduros. Los
híbridos son capturados y lavados con mucha astringencia usando estreptavidina
acoplada a partículas paramagnéticas, que permiten la separación magnética de los
ARNm.
El ARNm, estando aun unido a la estreptavidina acoplada a las partículas
paramagnéticas, se lo resuspendió añadiendo 100μl de agua bidestilada estéril tratada
con DEPC al 0,1% (libre de ribonucleasas).
Síntesis de la primera cadena de cDNA: se siguieron los pasos indicados por Bachem y
col. (1996). Se partió de 20 μl de la solución que contenía los ARNm unidos a las
estreptavidinas. A esto se le añadió 1μl del cebador oligo (dT)25 (100 ng/μl) y se incubó a
70ºC durante 5 minutos. Transcurrido ese tiempo, se colocó en hielo y se le agregaron 10
μl de una mezcla que contiene: 200 U de enzima transcriptasa reversa ―Su
perScript™ II‖
de Invitrogen, 6 μl de buffer 5X cDNA l de Invitrogen, 1 μl de dNTPs 25mM y 2 μl de
ditriotreitol (DTT) 100mM. Se incubó a 37ºC durante 1 hora y luego se colocó en hielo
para realizar los pasos siguientes.
Síntesis de la segunda cadena de cDNA: los 31μl de la reacción anterior se utilizaron para
la siguiente reacción. Primero se calentó a 95ºC e inmediatamente sobre hielo se añadió
119μl de la siguiente mezcla: 35 U de DNA Polimerasa I de Invitrogen, 3 U de RNAsa H
de Invitrogen, 25 μmoles de nucleótidos, 15μl de buffer 10X cDNAII (Tris-HCl 200 mM;
KCl 750 mM; (NH4)2SO4 100 mM; MgCl2 50 mM y DTT 10 mM) y se llevó a 150 μl finales
con agua bidestilada estéril. Esta reacción se incubó a 16ºC por 2 horas.
El cDNA fue cuantificado en espectrofotómetro tomando 10 μl de cada muestra sin
estreptavidinas como se describió anteriormente y la concentración se calculó con la
siguiente fórmula:
ADN [ng/μl] = A260 x Factor de Dilución x FC*
*FC es el factor de conversión (ng/μl) = 1 unidad de absorbancia es aproximadamente 50 ng/ μl de ADN de
doble cadena (Sambrook y col. 1989).
66
Amplificación por AFLP (“Amplified Fragment Length Polymorphisms”)
Se realizó la técnica de AFLP utilizando cDNA como molde. Se siguió el protocolo de
cDNA-AFLP publicado por Bachem y col. (1996 y 1998), con algunas modificaciones y
combinado con el protocolo de Vos y col. (1995) previamente optimizado en nuestro
laboratorio. También se modificaron las técnicas de revelado descriptas por Bachem y col.
(1998) y Vos y col. (1995), utilizándose nitrato de plata para visualizar los productos de
amplificación.
Digestión: se digirieron 3μg de cDNA, unido a las estreptavidinas acopladas a las
partículas paramagnéticas de cada una de las muestras con 2 enzimas de restricción:
MseI (diana de restricción: T↓TAA) y EcoRI (diana de restricción: G↓AATTC). El volumen
final de la digestión fue de 30 μl y contenía: 2,5 U de MseI, 2,5 U de EcoRI y buffer 1X RL
(Tris-HCl 50mM pH 7,5, acetato de magnesio 50 mM, acetato de potasio 250 mM, DTT 25
mM y Albúmina Bovina 250 ng/μl). Se incubó por 2 horas a 37ºC y a continuación se
inactivó las enzimas por incubación a 70ºC durante 15 minutos.
Ligación de adaptadores específicos: una vez digerido el cDNA se hizo la separación
magnética de los extremos que contienen las estreptavidinas acopladas a las partículas
paramagnéticas. Se colocó el tubo de reacción en el soporte magnético (―
Magnetic
Stand‖) que captura con un imán las partículas paramagnéticas y se saca la parte acuosa
que contiene los fragmentos de cDNA digeridos. Este paso mejora la calidad de la
amplificación final y evita la aparición de residuos de alto peso molecular en la
electroforesis (Bachem y col., 1996).
Los fragmentos de restricción se ligaron a los adaptadores específicos (Vos y col., 1995)
en los sitios creados por las enzimas de restricción.
A 15 μl de la digestión se le añadió 15 μl de una solución que contenía: 5 pmol del
adaptador EcoRI, 50 pmol del adaptador MseI, 0,6 U de T4 ADN ligasa y buffer 1X ADN
ligasa. Se incubó 2 horas a 20ºC y una vez finalizada la ligación se guardó a -20ºC hasta
su posterior utilización para la amplificación.
Amplificación pre-selectiva: se utilizaron cebadores con un nucleótido selectivo en la
posición 3‘ denominados cebadores +1 (Cuadro 9).
Cuadro 9: Secuencias de los cebadores MseI (+1) y EcoRI (+1). En negrita se indican los nucleótidos preselectivos:
67
El volumen final de la reacción fue de 20 μl con: 30 ng de cada cebador, 0,2 mM de cada
uno de los nucleótidos, 1,5 mM de MgCl2, 0.5 U de Taq polimerasa, 1X de buffer Taq
Polimerasa y 5 μl de la reacción de ligación. La amplificación se realizó en un
termociclador MJ Research modelo PTC-100 (MJ Research, Inc., Watertown, MA, USA) y
el programa utilizado fue el siguiente: 20 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a
94ºC, seguido de 1 min de hibridación a 56ºC y finalmente 1 min de extensión a 72ºC. Se
preparó una dilución 1/10 del producto de reacción y se guardó a 4ºC para usarla en la
siguiente amplificación.
Amplificación selectiva: para esta amplificación se utilizaron cebadores con tres
nucleótidos selectivos en el extremo 3‘ denominados cebadores +3 (Cuadro 10).
Cuadro 10: Secuencias de los cebadores EcoRI (+3) y MseI (+3) utilizados en la reacción de los AFLPs. En
negrita se indican los nucleótidos selectivos.
Con estos cebadores se organizaron 64 combinaciones posibles EcoRl +3/ Msel +3
designando a cada combinación con números corridos del 1 al 64, como se muestra en el
Cuadro 11.
68
Cuadro 11: combinaciones de cebadores utilizadas para la amplificación selectiva. Arriba corresponde a los
cebadores de Msel y al costado corresponde a los cebadores de EcoRl.
Msel
EcoRl
AGG
ACT
AGC
ACC
AAG
ACA
AAC
ACG
CTT CAT CAC CAA CTC CTA CAG CTG
1
9
17
25
33
41
49
57
2
10
18
26
34
42
50
58
3
11
19
27
35
43
51
59
4
12
20
28
36
44
52
60
5
13
21
29
37
45
53
61
6
14
22
30
38
46
54
62
7
15
23
31
39
47
55
63
8
16
24
32
40
48
56
64
Se utilizaron distintas diluciones de la reacción de pre-amplificación como molde para la
amplificación: 1/10, 1/20, 1/30, 1/50 y 1/60.
La amplificación se llevó a cabo con 2,5 µl de la dilución del producto de pre-amplificación
y se le agregó 7,5 µl de una solución que contenía: 1,5 mM de MgCl 2; 0,2 mM de cada
uno de los nucleótidos; 30 ng de cada cebador; 0,5 U de Taq polimerasa y 1X de buffer
Taq Polimerasa. El programa empleado para la amplificación fue: 1 ciclo de
desnaturalización a 94ºC, 30s; hibridación a 65ºC, 30s y extensión a 72ºC, 60s; seguido
por 12 ciclos en los que la temperatura de hibridación fue descendiendo desde 65ºC hasta
56ºC (0,7ºC por ciclo), temperatura que se mantuvo en los siguientes 22 ciclos. Las
reacciones de amplificación se llevaron a cabo en el mismo termociclador ya citado.
A fin de comprobar que las muestras estaban libres de contaminación con ADN se
amplificó una muestra sin el tratamiento de DNAsa, otra muestra con tratamiento de
DNAsa, y ambas muestras sin los pasos de síntesis de primera y segunda hebra, es decir
sin retrotranscribir, de manera que una amplificación final en cualquier muestra sería el
resultado de la presencia de ADN contaminante.
Electroforesis en geles de Poliacrilamida
Una vez finalizada la reacción de amplificación, los fragmentos obtenidos fueron
separados mediante electroforesis vertical en geles desnaturalizantes de poliacrilamida,
igual como se explicó en el Capitulo l. A los productos de la amplificación se les añadió
2,5 µl de buffer de carga y se desnaturalizaron durante 5 min a 95ºC. Inmediatamente se
colocaron en hielo y posteriormente se sembraron en el gel.
Anexo: Buffer de carga para acrilamida: 95% de formamida desionizada, 10mM de EDTA
pH 8, 0,01% de azul de bromofenol y 0,01% de xilencianol.
69
Los geles fueron revelados según el sistema descripto en el ―
Silver Staining System‖
(Promega, Biotech, EUA) ya explicado en el Capítulo l.
Análisis de los datos
Los perfiles de amplificación se analizaron visualmente. Se seleccionaron las bandas
presentes únicamente en las muestras codificadas como 1, 5 y 9 que corresponden a la
accesión resistente, inoculada con C. fragariae.
Para validar los resultados, se repitieron las amplificaciones con las combinaciones de
cebadores que produjeron bandas de interés, utilizando duplicados de extracciones
independientes de ARN. Una vez confirmada la banda diferencial o TDF (fragmento
derivado de transcripto) como lo sugiere Bachem y col. (1996), se lo codificó con números
y letras a cada uno.
Aislamiento y reamplificación de TDF
Las bandas seleccionadas se cortaron directamente del gel utilizando un bisturí estéril, se
colocaron en tubos eppendorf con 50 µl de buffer de elución (0,5 M de acetato de amonio
y 1mM de EDTA pH 8) y se incubaron a 37ºC durante toda la noche. Al día siguiente se
centrifugó a máxima velocidad durante 20 min, se tomó el sobrenadante que se transfirió
a un tubo estéril. Se le agregó 5% de su volumen de NaCl 5M y 2,5 volúmenes de etanol
absoluto frio. Se incubó a -20ºC durante 2 horas y posteriormente se centrifugó a máxima
velocidad durante 20 min a 4ºC. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó con
etanol 70%, se secó a 37ºC para eliminar restos de alcohol y se resuspendió en 20 µl de
agua bidestilada estéril. La reacción de reamplificación se realizó con 2,5 μL del ADN
eluído utilizando los cebadores específicos según la combinación correspondiente. Las
condiciones de PCR fueron: 30 ciclos de 94°C, 30 s; 56°C, 1 min y 72°C 1 min.
Para la purificación de los amplicones se utilizó el sistema comercial ―Ill
ustra
TM
GFX
TM
PCR DNA and Gel Band Purification kit‖. El producto obtenido luego fue analizado
mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% teñidos con 0,5 ug/ml de bromuro de
etidio.
Clonado de los TDF
Los productos amplificados se clonaron en dos tipos de vectores: i) pGEM-T Easy Vector
System de Promega (Madison, WI, EEUU) y ii) TOPO TA-pCR2.1 de Invitrogen (Carlsbad,
CA, EEUU) según disponibilidad. Para la ligación del fragmento amplificado por PCR al
vector seleccionado se siguieron las instrucciones del fabricante utilizando en cualquier
caso 3 μl del producto de PCR purificado.
70
El plásmido pCR2.1 TOPO (Invitrogen) utiliza el método denominado ―T
A cloning‖ que
permite la ligación directa entre el plásmido, que contiene extremos cohesivos los cuales
constan de una Desoxitimidina libre (3´-T), y los productos de la amplificación, a los
cuales la Taq polimerasa les ha adicionado una Desoxiadenosina formando también
extremos cohesivos (3´-A). La ligación se lleva a cabo por una topoisomerasa que se
encuentra unida al vector que liga a este último con los productos de amplificación. Este
plásmido confiere resistencia a ampicilina.
En el caso del plásmido pGEM-T Easy los vectores son linealizados con una única
timidina terminal (3´-T) en ambos extremos. Así quedan formados extremos cohesivos
con T sobresaliente en el sitio de inserción, lo que mejora en gran medida la eficiencia de
la ligación de los productos de PCR mediante la prevención de la recircularización del
vector y proporciona un extremo compatible para los productos de PCR generados por la
mayoría de las polimerasas termoestables. Los productos de PCR a su vez resultan con
una cola de adenina típica de la actividad transferasa terminal de la Taq polimerasa sin
actividad correctora de prueba. El sitio de clonación se encuentra en el marco del gen
lacZ, lo que permite la selección de plásmidos portadores del inserto mediante el análisis
del color de las colonias: blancas o azules cuando se cultivan en presencia de X-Gal. La
selección se realiza por la resistencia al antibiótico ampicilina que confiere este plásmido.
Para la transformación se utilizó la cepa de E. coli DH5α, cultivada en medio LB (Luria
Bertani: 10 g/l de peptona de carne, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl) que es
el medio utilizado por excelencia para el mantenimiento de E. coli recombinante en
procesos de microbiología molecular. Cuando se utilizan medios sólidos se usó como
agente solidificante agar-agar en una proporción de 15 g/l. Todos los medios fueron
esterilizados en autoclave a 121ºC durante 20 min. Se adicionaron 100 ug/ml del
antibiótico ampicilina Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO, EEUU). Se utilizó X-Gal a
concentraciones finales de 40 μg/ml como agente de selección. El agar-agar y el extracto
de levadura fueron de Britania S.A. (Argentina), y el X-Gal, la peptona y las sales
provienen de Merck (Darmstadt, Alemania).
Transformación de E. coli mediante electroporación.
A partir de una placa con cultivo fresco con la cepa de E. coli DH5α, se tomó una colonia
aislada y se cultivó en 5 ml de medio LB líquido suplementado con ácido nalidíxico 25
mg/l, con agitación (135 rpm), durante toda la noche a 37°C. Al día siguiente se inocularon
300 ml de medio LB con 3 ml del cultivo activo y se incubaron bajo las mismas
condiciones hasta alcanzar una densidad óptica de 0,5 a 600 nm (D.O. 600= 0,5). El cultivo
se incubó en hielo durante 30 minutos y después se centrifugó a 6.000 x g durante 15
71
minutos. Se eliminó el sobrenadante y se agregaron 300 ml de agua bidestilada fría y
estéril. Este procedimiento se repitió 1 vez mas y luego se realizó nuevamente pero con
un volumen de agua de 150 ml. Finalmente el precipitado se resuspendió en 600μl de
glicerol 10% frío y estéril, para posteriormente almacenar las células a -70ºC en alícuotas
de 40μl.
La transformación se realizó por electroporación, usando el equipo BIO RAD ―M
icroPulser
Electroporator‖, en cubetas de 0,2 cm (―
Gene Pulser ®/Micropulser cubetas de
electroporación‖) enfriadas en hielo. Se añadieron entre 0,5 a 4µl de la reacción de
ligación a 40µl de las células electrocompetentes (Dower y col., 1988). Se dio un pulso de
2,2kV durante 5 milisegundos (ms). Después de la electroporación las células se
transfirieron a 1ml de medio LB líquido y se incubaron a 37ºC durante 1 hora con suave
agitación. La selección de recombinantes se realizó sembrando 100 a 200μl del cultivo
bacteriano en placas de Petri con medio sólido LB (LB con 1,5% agar) suplementado con
el antibiótico de selección (ampicilina 100 μg/ml) y 1 μg del sustrato cromógeno X-Gal
para la selección por α complementación (el X-Gal es un sustrato cromogénico para la βgalactosidasa de modo que al ser hidrolizado forma precipitados azules). Las placas
fueron incubadas a 37ºC durante 12 horas, seleccionándose las colonias blancas.
El X-gal se diluyó en dimetilformamida a una concentración de 50 mg/ml y se mantuvo
protegido de la luz debido a su fotosensibilidad.
Purificación de plásmidos, y verificación de insertos
Dado que existe la posibilidad de obtener distintas secuencias en una misma banda
amplificada por PCR, de cada evento de ligación se seleccionaron entre 3 a 5 colonias
blancas por banda para su posterior análisis. Las colonias seleccionadas fueron reaisladas en placas de cultivo con ampicilina 100 μg/ml e incubadas durante 24 hs a 37ºC.
A partir de estas colonias se iniciaron cultivos en 5 a 10 ml de medio LB adicionados con
ampicilina (100 μg/ml) para luego purificar y analizar los plásmidos recombinantes.
La extracción del plásmido recombinante se realizo a partir de un cultivo que provenía de
una única colonia bacteriana cultivada durante toda la noche a 37ºC con agitación, en 5ml
o 10ml de medio LB y con el antibiótico correspondiente. Se utilizó el sistema ―M
iniprep
Kit‖ de Promega (―
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System‖) o de Invitrogen
(―
Pure Link TM Quick Plasmid Miniprep Kit‖) según disponibilidad.
Los plásmidos recombinantes se eluyeron en 100μl de agua bidestilada estéril y se
verificó la integridad y cantidad del ADN mediante electroforesis en geles de agarosa al
1% y se cuantificaron con espectrofotómetro.
72
La identificación de clones positivos (que tengan los insertos) se llevó a cabo por medio
de
la
técnica
de
PCR
usando
los
cebadores
universales
T3
(5´-
ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3´) y T7 (5´-TAATACGACTCACTATAGGG-3´) para el
caso
de
los
plásmidos
de
TOPO
TA
pCR2.1,
y
los
cebadores
SP6
(5´-
ATTTAGGTGACACTATAGAA-3`) y T7 para los plásmidos de pGEM-T Easy. La reacción
se realizó en un volumen final de 20 μl conteniendo 1X buffer de Taq polimerasa; 2 mM
MgCl2; 0,5 μM de cada cebador; 0,2 mM de cada dNTP; 1 U de Taq ADN polimerasa
(Fermentas) y aproximadamente 50 ng de ADN. Las condiciones de amplificación fueron:
desnaturalización inicial de 2 min a 95ºC, 30 ciclos de 30 s a 95ºC, 30 s a 52ºC y 1 min a
72ºC, seguidos por una extensión final de 5 min a 72ºC. Los productos de PCR fueron
separados por electroforesis en geles de agarosa 1,5% en buffer TAE 0,5X, teñidos con
bromuro de etidio y visualizados a través de luz UV. Los mismos cebadores usados para
la verificación de insertos fueron usados para secuenciar cada plásmido recombinantes
en ambas direcciones.
Secuenciación
Una vez verificada la presencia del inserto, los plásmidos recombinantes fueron enviados
a secuenciar en ambas direcciones con los cebadores: T3, T7 y SP6 .
La secuenciación de los fragmentos de ADN se realizó en el Servicio Interno de
Genotipificación y Secuenciación de ADN (SIGYSA) de INTA Castelar y se llevó a cabo
según el protocolo de Sanger y col., (1977) en un secuenciador ABI PRISM 377 (Perkin
Elmer).
Análisis bioinformático de secuencias obtenidas
El análisis de cada secuencia se realizó siguiendo el procedimiento descrito a
continuación:
i) Identificación y eliminación de la secuencia correspondiente al vector, empleando el
programa VecScreen (―N
ational Center for Biotechnology Information‖, NCBI).
ii) Identificación y eliminación de la secuencia correspondiente a los cebadores.
iii) Análisis de las secuencias de los clones de cada TDF para determinar su similitud
utilizando el software DNAman versión 5.2.2 (Lynnon Biosoft, Québec, Canadá).
iv) Comparación de las secuencias obtenidas con bases de datos del NCBI para
identificar homologías a nivel de aminoácidos utilizando el algoritmo Blast X, y a nivel de
secuencia nucleotídica con Blast N (Altschul y col, 1990).
73
v) Búsqueda de dominios conservados, en las proteínas de interés de función conocida,
utilizando el programa SMART 5 del servidor ―Eu
ropean Molecular Biology Laboratory‖,
EMBL (Letunic y col., 2006).
Análisis de Expresión
Para estudiar los niveles de expresión relativa de de los TDFs seleccionados o
promisorios, se realizó PCR en tiempo real (―R
eal Time PCR‖). Se utilizo un equipo Real
Time PCR System 7500 (Applied Biosystems) con iQ SYBR Green Supermix (BIORAD).
Los cDNAs molde fueron los mismos que se utilizaron para la técnica de cDNA-AFLP y
corresponden al primer tiempo de muestreo (24hs post inoculación).
Se utilizaron los siguientes cebadores específicos:
GAPDH Fw: 5‘-GCCGAGGAGCTGCTCAGA-3‘
GAPDH Rv: 5‘-GAACTTTTCCAACAGCCTTTGC-3‘
Actina Fw: 5‘CCCAGAAGAGCACCCAGTTC-3‘
Actina Rv: 5‘-CACGATTAGCCTTGGGATTCA-3‘
11C Fw: 5‘- AGGCGGTGCCGTAAGCT-3‘
11C Rv: 5‘-CATCCTTCTATCCGCAAGGT-3‘
FaPR1 Fw: 5‘- TGCTAATTCACATTATGGCG -3‘
FaPR1 Rv: 5‘-GTTAGAGTTGTAATTATAGTAGG-3‘
Se realizaron curvas standard con cada par de cebadores para determinar la eficiencia de
cada reacción, utilizando diferentes diluciones del cDNA correspondiente a Pájaro Salta
tratado (infectado con F7).
Las reacciones se llevaron a cabo en 20 µl de volumen final, utilizando 10ul de la master
mix (iQ Sybr Green Supermix) y 0,25 µM de cada uno de los cebadores y 50 ng de molde.
El programa de amplificación fue el siguiente: 94ºC, 30 segundos; 58ºC, 30 segundos y
72ºC, 30 segundos repetido por 34 ciclos. La temperatura de annealing de 58ºC se uso
para todos los cebadores
Técnica RLM-RACE.
Para obtener en el futuro la secuencia completa del ADN complementario (cDNA)
correspondiente a un TDF con homología a un gen de resistencia se realizaron las
primeras etapas de la técnica RLM-RACE (del inglés ―R
NA Ligase-Mediated Rapid
Amplification of cDNA Ends‖) (Frohman y col. 1988). Se realizó una nueva extracción de
ARN total de la variedad Pájaro accesión Salta, inoculada con el aislado F7 bajo las
condiciones de inoculación anteriormente descriptas (M y M Capitulo ll). La muestra se
74
tomó 24hs post inoculación, momento en el que se encontró el TDF en estudio y este
ARN se utilizó como material de partida para realizar una genoteca de RACE.
La técnica RACE es un procedimiento usual para la clonación de la secuencia completa
de un cDNA a partir de una secuencia parcial del mensajero conocida previamente,
utilizando la reacción de PCR. El RACE puede emplearse para la clonación de la región 5‘
y/o 3‘ del cDNA completo. La estrategia consiste en añadir una secuencia molde extra
(secuencia específica) a los extremos de los cDNA que se desean clonar, para luego
amplificar esos extremos del cDNA empleando dos cebadores: uno específico de la
secuencia extra y otro dirigido a una secuencia determinada del cDNA que se desea
aislar. Existen protocolos que usan varias secuencias contenidas en los TDF para realizar
amplificaciones sucesivas con cebadores internos (cebadores anidados o ―n
ested
primers‖) y aumentar así la especificidad.
En base a la secuencia del TDF seleccionado se diseñaron los siguientes cebadores
específicos para RACE:
NBARC-3': 5'-AATCCCACTGCCGCGCACATCTTC-3'
NBARC-3'NESTED: 5'-GCGGTGCCGTAAGCTGAGGTGTT-3'
NBARC-5': 5'-GGAGGCCTTGTGATGGAATTGGGAT-3'
NBARC-5'NESTED: 5'-GGGAAGTCCGCCTGAAAGCCGCAT-3'
El diseño de estos cebadores específicos (GSP, del ingles ―
Gene-Specific Primers‖), que
ceban hacia el extremo 5‘ y 3‘ del fragmento del gen de interés, se llevó a cabo mediante
el programa DNAMAN versión 5.2.2 (Lynnon Biosoft, Québec, Canadá) siguiendo los
siguientes criterios:
-Alta temperatura de hibridación (>72ºC) lo que se consiguió mediante la longitud de los
cebadores (entre 23 a 25 nucleótidos) y el alto contenido en GC (50-70%). Estas altas
temperaturas aumentan la especificidad y permiten el uso de la técnica de ―t
ouch down‖
(Don y col. 1991) que implica temperaturas de hibridación decrecientes para asegurar
máxima complementaridad de los cebadores.
-Bajo contenido de GC hacia el extremo 3‘ (no más de 2 residuos de G o C en las últimas
4 bases) para minimizar extensión de regiones inespecíficas por la ADN polimerasa.
-Ausencia
de
auto-complementariedad
dentro
del
cebador
y
ausencia
de
complementariedad con los cebadores GeneRacer usados.
En el presente trabajo se utilizó el sistema GeneRacer de Invitrogen, basado en una
técnica que emplea la ARN ligasa, siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente,
75
la tecnología del sistema GeneRacer se basa en el tratamiento del ARNm de partida con
una fosfatasa (CIP) que elimina los grupos fosfato presentes en el extremo 5‘ de los
mensajeros que estarían parcialmente degradados, de modo que sólo aquellos con
secuencia completa y protegidos por el casquete o estructura ―CAP
‖ puedan continuar con
el protocolo de clonado.
Después, el ARNm se trata con una pirofosfatasa (TAP) que elimina este ―C
AP‖ del
ARNm íntegro dejando un grupo fosfato en posición 5‘ al cual se le puede ligar (usando
una T4 ARN ligasa) un oligonucleótido de ARN con una secuencia específica que servirá
para el proceso de amplificación propio de la técnica RACE.
Para la síntesis de la primera hebra de cDNA se usan como molde 4 μg del ARNm así
tratado, usando un oligo poli-dT con una secuencia específica en su extremo 5‘
(GeneRacer Oligo dT, 5′- GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)243′), que servirá para generar el 3‘-RACE.
La retrotranscripción se realizó con la enzima SuperScript III Reverse Transcriptase
(Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
76
De esta manera se obtiene una genoteca constituida por las primeras hebras de los cDNA
con sitios de hibridación de los cebadores GeneRacer para el extremo 5‘ y 3‘.
Posteriormente se continúa con reacciones de amplificación por PCR para cada extremo,
como se muestra en el esquema:
Esquema de amplificación de los extremos 5‘ y 3‘:
Extremo 5‘:
Extremo 3‘:
Finalmente las bandas amplificadas son clonadas y enviadas a secuenciar. Las
secuencias obtenidas deben ser ensambladas de manera que la secuencia de los
cebadores coincida tal como estaba posicionado en el fragmento de partida.
77
RESULTADOS
Con el fin de identificar genes involucrados en la resistencia a Colletotrichum fragariae en
frutilla, se utilizó la técnica del cDNA-AFLP sobre material resistente y susceptible
inoculado con el hongo. Las bandas polimórficas, generadas del cDNA como material de
inicio, se denominaron TDF (fragmentos derivados de transcriptos) como sugirió Bachem
y col (1996).
Técnica de cDNA-AFLP
En primer lugar se llevó a cabo una optimización de la técnica de cDNA-AFLP. Se
ajustaron las condiciones en base a los perfiles amplificados con las siguientes
combinaciones de cebadores elegidas al azar: combinación 6, 23, 27, 45, y 50 (Cuadro 11
en Mat y Met). Se eligieron las condiciones que produjeron mayor número de bandas y
con menor cantidad de bandas monomórficas (correspondientes a genes expresados
constitutivamente). Una vez ajustadas las condiciones de amplificación, se utilizaron las
64 combinaciones de cebadores disponibles en nuestro laboratorio para el análisis y
comparación de los perfiles resultantes para cada tiempo de muestreo que estuvo
representado por 4 muestras correspondientes a los siguientes individuos: i) resistentes
inoculados, ii) resistentes controles, iii) susceptibles inoculados y iv) susceptibles
controles. Los 4 tipos de muestras analizadas nos permitieron discriminar los transcriptos
provenientes del patógeno.
Los fragmentos amplificados presentaron un tamaño estimado comprendido entre 100 y
600 pares de bases aproximadamente y la cantidad de éstos fue relativamente
equivalente en la totalidad de las combinaciones de cebadores utilizadas (Figura 17). Las
muestras controles de contaminación de ADN no amplificaron en ningún caso.
78
600bp
100bp
(A)
(B)
Figura 17: perfiles de amplificación obtenidos con la técnica de cDNA-AFLP en muestras de frutilla
inoculadas con C. fragariae. (A) Combinación Nº2 y (B) Combinación Nº9. Los números de cada calle
corresponden a las diferentes muestras de los tratamientos descriptos en M y M de este capítulo (ver
Cuadro 8) y (-) es el control negativo.
En cada una de las amplificaciones de cada combinación de cebadores se identificaron
bandas diferenciales presentes únicamente en las muestras de individuos resistentes
inoculados y ausentes en las restantes muestras, considerando un mismo tiempo de
muestreo. Se identificaron 67 bandas diferenciales, denominadas TDF, con 20
combinaciones de cebadores.
Para validar los resultados, se repitieron las amplificaciones con las 20 combinaciones de
cebadores utilizando duplicados de extracciones de ARN. En la mayoría de los casos se
confirmaron los resultados obtenidos previamente con excepción en las combinaciones nº
16, 39 y 48, que no produjeron los TDF esperados. Las 7 bandas que no fueron
amplificadas en la réplica experimental, se cortaron del gel y se guardaron a -20ºC para
posteriores
análisis.
Así,
finalmente
quedaron
60
TDFs
amplificados
con
17
combinaciones como se muestra en el Cuadro 12.
79
Figura 18: perfiles de amplificación obtenidos con la técnica del cDNA-AFLP en muestras de frutilla (con
duplicados) inoculadas con C. fragariae. Combinación Nº4. Los números corresponden a las diferentes
muestras de los tratamientos descriptos en M y M de este Capítulo (ver Cuadro 8).
Cuadro 12: Distribución de los 60 TDF finalmente obtenidos según el momento de muestreo.
80
Los 60 TDFs fueron cuidadosamente cortados del gel de poliacrilamida y posteriormente
purificados (Figura 19).
Figura 19: geles de poliacrilamida mostrando antes (flecha azul) y después (flecha rosa) de extraer las
bandas del gel. A: Combinación Nº24 y B: Combinación Nº46. Los números corresponden a las diferentes
muestras de los tratamientos descriptos en M y M de este Capítulo (ver Cuadro 8).
El ADN purificado se utilizó como molde para la re-amplificación por PCR con el objetivo
de incrementar la cantidad del producto amplificado y facilitar el clonado del fragmento en
estudio.
Figura 20: gel de agarosa con las re-amplificaciones de algunos TDFs. En cada carril se observa el código
con el que se denominaron a cada TDF. M: marcador de peso molecular ‗100 Marker‘ (Fermentas).
81
En algunos casos la re-amplificación fue débil o no se obtuvo una banda nítida y en esos
casos no se pudo continuar con el clonado y secuenciación del TDF, por lo que 8 bandas
fueron descartadas del análisis subsiguiente (se muestran resaltados en color rosa en el
Cuadro 13).
Cuadro 13: Denominación de los TDF extraídos del gel, según la combinación de cebadores y resultado de
la re-amplificación con el tamaño aproximado en pares de bases. Los TDF resaltados en color rosa no reamplificaron y los resaltados en azul no pudieron clonarse.
Nº Combinacion
1
2
4
11
14
17
22
Nombre del
TDF
Tamaño aprox
(pb)
11 A
11 B
11 C
51 A
51 B
51 C
91 A
12 A
54 A
54 B
94 A
94 B
14
511 A
511 B
511 B´
511 C
511 D
511 E
511 F
114
514A1
514A2
117
517 A
517 A1
517 B
517 C
517 E
917 A
917 B
122B1
122B2
122C
690
590
430
200
150
--
230
--
110
100
120
80
80
270
220
220
200
150
130
110
200
200
200
--
250
200
180
150
120
200
100
150
130
120
Nº Combinacion
24
38
40
42
44
45
46
47
52
53
Nombre del
TDF
Tamaño aprox
(pb)
524
938 A
938 B
938 C
140 A
140 A´
140 B
142 A
142 B
144 A
144 B
144 C
544 A
544 B
944
545 C1
545 C2
545 D
545 E1
545 E2
146 A
146 B
546 A
546 B
946
147 B
147 B1
152 A
152 B
152 C
553 A
553 B
280
--
100
200
200
---
170
150
280
280
160
280
300
150
150
100
80
80
80
160
---
280
150
150
210
150
200
280
170
180
En una primera instancia se intentó secuenciar directamente los fragmentos reamplificados, pero debido al tamaño reducido de los fragmentos y a la heterogeneidad de
secuencias, los resultados obtenidos no se pudieron analizar. Los fragmentos reamplificados fueron entonces clonados con el kit Topo TA (Invitrogen) o pGEM-T Easy
(Promega) y utilizados para transformar E. coli. Por cada fragmento clonado se eligieron
entre 3 y 5 clones positivos (colonias blancas) para la purificación de ADN plasmidico y
82
posterior secuenciación. Del total de TDFs re-amplificados hubo 4 (resaltados en color
azul Cuadro 13) que no pudieron clonarse.
Análisis de las secuencias
Los resultados de la secuenciación y de las comparaciones con las bases de datos se
resumen en los Cuadros 14, 15 y 16. A los TDFs se les asignaron funciones putativas en
base a las homologías encontradas en las comparaciones con bases de datos de genes y
proteínas realizadas por Blast N y Blast X, respectivamente. Los datos obtenidos que
presentaron un valor de E (―
E-value‖) menor a 10-5 se encuentran resumidos en los
Cuadros 14, 15 y 16. El valor de E refleja el valor esperado que representa el número de
diferentes alineamientos con resultados equivalentes que se espera que ocurra en una
búsqueda de base de datos por casualidad. Cuanto más bajo sea el valor E, la puntuación
y el alineamiento es más significativo y por tanto, más posibilidades tiene de representar
una homología real (menos probable es que el alineamiento se deba únicamente al azar).
Un valor de E menor a 10-5 se considera un umbral estadísticamente apropiado de
elección de homólogos.
83
Cuadro 14: resultado de los análisis bio-informáticos de los TDFs, encontrados 24hs post inoculación, clonados y secuenciados. Se indica la ID del clon, tamaño
esperado, análisis de los clones del mismo TDF y homología obtenida.
TDF
24hs
postinoc
11A
Tamaño
esperado
690bp
Clon
Comparación de los clones
G10
Secuencias idénticas de 64pb
integradas solo por cebadores en
tándem.
Sin datos
Secuencia de 64pb integrada solo
por cebadores en tándem.
------------------
------------------
------------------
Sin similitud
Disease resistance protein
RPP1-like protein R8. gb|ACJ64862.
Secuencias idénticas de 587pb.
Sin similitud
Proteínas de la super-familia
de las DUF547, de función
desconocida. Posiblemente
transportadores de
electrones.
G18
Secuencia de 277pb integrada solo
por cebadores en tándem.
-----------------
-----------------
G40
G41
G42
G43
G44
Secuencias idénticas de 190pb.
Sin similitud
Retrotransposon protein,
putative, unclassified.
gb|ABA91244
Secuencia de 173pb integrada solo
por cebadores en tándem.
Secuencias idénticas de 307pb
integrada solo por cebadores en
tándem.
------------------
-------------------
Secuencias idénticas de 134pb.
ESTs relacionados a la
vernalización.
B3 domain-containing
transcription factor VRN1
(Vernalization1)-like.
Secuencias idénticas de 121pb.
ESTs muy variados algunos
de plantas por sequia y
Sin similitud
G14
Secuencias idénticas de 436pb.
G16
114
590bp
200bp
G17
G59
122B1
150pb
122B2
130pb
122C
120pb
Homologia
------------------
G15
11B
Especie
-------------------
G13
430bp
Homologia
Blast X
-------------------
G11
G12
11C
Blast N
G60
G61
G62
G63
G64
G65
G66
Especie
Arabidopsis
thaliana.
Oryza sativa
Japonica
Group
84
TDF
24hs
postinoc
144A
144B
Tamaño
esperado
280pb
280pb
Clon
160pb
147B
150pb
210pb
A1R
Sin similitud
A3R
A5R
B22
B24
C21
C22
C23
B3
B10
B6
B16
B20
146A
Homologia
patógenos, también de
ratón, humano, etc:
B15
147B1
Blast N
G67
B25
144C
Comparación de los clones
160pb
X22
152A
150pb
A12
A5N
A9
A5
152B
200pb
B6
Tienen secuencias distintas
Sin datos
Tienen secuencias distintas
Secuencias idénticas de 138pb.
Secuencia de 163pb integrada solo
por cebadores en tándem.
Sin datos
Secuencia de 185pb y cebadores
en tándem.
Secuencia de 274pb integrada solo
por cebadores en tándem.
Secuencia de 297pb integrada solo
por cebadores en tándem.
Secuencia de 142pb y cebadores
en tándem.
Blast X
Especie
Homologia
Identidad con proteínas de
bacterias
Factores de transcripción
(BRCA1 associated protein
and ERF034).
Sin similitud
------------Sin similitud
Factores de transcripción
(BRCA1 associated protein
and ERF034).
Sin similitud
Sin similitud
---------------Sin similitud
Sin similitud
Sin similitud
Sin similitud
----------------
----------------
---------------C3HC4 type RING zinc
finger protein genes
EST: Draught stressed
-gb|EX676385.1
---------------Fragaria
vesca
Especie
Ricinus
communis y
Glycine max
Ricinus
communis y
Glycine max
C3HC4 type RING zinc finger
proteins.
-------------------
-------------------
-------------------
-------------------
EST: Salt stressed
Fragaria
vesca
Sin similitud
Secuencias idénticas de 205pb.
EST: Salt and heat stressed
-gb|EX685240.1
Fragaria
vesca
Sin similitud
Secuencias idénticas de 178pb.
Gamma-tubulin complex
component 4-like gene.
Malus
domestica
Gamma-tubulin complex
component 4-like protein.
85
TDF
24hs
postinoc
Tamaño
esperado
Clon
Comparación de los clones
B8
B16
C25
C28
152C
280pb
C30
Sin datos
Sin datos
Secuencia de 241pb
A24
140A
200pb
Tienen secuencias distintas
A1
A22
142A
170pb
A9
150pb
B16
B25
Homologia
-EST: Gamma-tubulin
complex component 4
homolog emb|CAB62542.1|
Mdfrs3139E20.g1
------------------------------------Protease Do-like 9-like gene.
ESTs: i)Infestans-challenged
potato leaf, compatible
reaction
gb|BI433912.1
ii)Royal Gala partially
senescing leaf
gb|CN874900.1
ESTs:
i) Royal Gala partially
senescing leaf
-gb|CN873975.1
ii) Phakopsora pachyrhizi
infected soybean leaf tissue
13-15 days post inoculation.
-gb|EH219416.1
Glycyl-tRNA synthetase
gene.
EST: Salt and heat stressed
-gb|EX685643.1
Blast X
Especie
Secuencias idénticas de 142pb.
Secuencia de 128pb.
Sin datos
Peptidyl-prolyl cis-trans
isomerase-like 2-protein
ESTs relacionados con
estrés abiótico
gb|FC065080.1
Sin similitud
-------------------
Homologia
Especie
------------------------------------i) Solanum
tuberosum.
Protease Do-like 9-like.
ii) Malus x
domestica
i) Malus x
domestica
ii) Glycine
max
Fragaria
vesca.
Sin similitud
A10
142B
Blast N
Sin similitud
Glycyl-tRNA synthetase.
Sin similitud
Vitis vinifera
Peptidyl-prolyl cis-trans
isomerase-like protein
Sin similitud
-------------------
86
Cuadro 15: resultado de los análisis bio informáticos de los TDFs, encontrados 48hs post
esperado, análisis de los clones del mismo TDF y homología obtenida.
TDF
Blast N
48hs
Tamaño
Clon Comparación de los clones
postesperado
Homologia
inoc
G4
EST: Salt and heat
Secuencias idénticas de
G5
51A
200pb
stressed.
205pb.
-gb|EX687312.1
G6
G7
Secuencias idénticas de
EST: Drought, cold and
G8
51B
150pb
128pb y cebadores en
high light stress.
tándem.
G9
-gb|GT313452.1
1
Secuencias idénticas de
EST: knotted-like
524
280pb
2
236pb y cebadores en
homeobox KNOX5 mRNA.
tándem.
10
54B
100pb
511A
270pb
511B
220pb
511B´
220pb
511C
200pb
22
27
3
8
9
2
4
10
12
13
14
511E
130pb
Especie
Fragaria
vesca
Homologia
Especie
Sin similitud
Ipomopsis
aggregata
Sin similitud
Fragaria
vesca
Sin similitud
Sin similitud
Sin similitud
Secuencias idénticas de
261pb.
Sin similitud
Hypothetical protein
P20439 1494
ZP_09235171.1
Pseudoalteromonas sp.
Secuencias idénticas de
188pb.
Sin similitud
NADH dehydrogenase
subunit 5 gb|ADZ24966.1
Spirometra
erinaceieuropaei
Secuencias idénticas de
191pb.
Sin similitud
Sin similitud
Secuencias idénticas de
148pb y cebadores en
tándem.
Sin similitud
Putative aminopeptidase
APM1.
Secuencias idénticas de
135pb y cebadores en
tándem.
Sin similitud
Sin similitud
14
Secuencia de 191pb
integrada solo por cebadores
en tándem.
-------------
----------------
3
Secuencias idénticas de
ESTs
13
14
4
150pb
Blast X
Secuencias idénticas de
118pb.
22
511D
inoculación, clonados y secuenciados. Se indica la ID del clon, tamaño
18
i)
Sin similitud
87
TDF
48hs
postinoc
Tamaño
esperado
Clon
Comparación de los clones
6
117pb y cebadores en
tándem.
7
4
511F
110pb
545C1
150pb
545C2
100pb
545D
80pb
545E1
80pb
545E2
80pb
5
12
22
6
1
2
4
G68
G69
G70
G23
G24
10
11
12
16
G28
G27
15
G29
26
G30
517A
Homologia
i) Sugarcane red rot
infected mature stem
-gb|EC324540.1
ii) Pathogen-infected
compatible 1 (PIC1)
-gb|BM322632.1
Blast X
Especie
Homologia
Especie
Sorghum bicolor
Saccharum
hybrid
cultivar Co
1148
ii) Sorghum
bicolor
Secuencias idénticas de
99pb.
Sin similitud
Hypothetical protein
SORBIDRAFT_06g002025
-gb|EES10450.1
Secuencias idénticas de
133pb.
Sin similitud
Sin similitud
Sin similitud
Sin similitud
-----------------ESTs 'Yellow Wonder'
obtenidos de yemas
florales -gb|DV438457.1
------------------
Secuencias idénticas de
87pb.
Sin datos
Secuencias idénticas de
70pb.
Fragaria
vesca
Sin similitud
Secuencias idénticas de
61pb.
Sin similitud
Sin similitud
Secuencias idénticas de
61pb.
Sin similitud
Sin similitud
Secuencias idénticas de
255pb.
EST: Cold-stressed
- gb|DY670790.1
Fragaria
vesca
i) Fragaria
vesca
Secuencia distinta de 110pb
ESTs: i) Salt and heat
stressed
-gb|EX683333.1
ii) Drought stressed
-gb|EX675373.1
iii) Cold-stressed
250pb
27
Blast N
ii) Fragaria
vesca
Interferon-related
developmental regulator 1like GENE ID: 100266897LOC100266897
Vitis vinifera
Putative quinoneoxidoreductase homolog,
chloroplastic-like.
GENE ID: 100263927
LOC100263927
Vitis vinifera
88
TDF
48hs
postinoc
Tamaño
esperado
Clon
G49
517A1
200pb
G50
G51
G31
517B
180pb
G32
34
G52
517C
150pb
G53
G54
Comparación de los clones
Secuencias idénticas de
203pb integrada solo por
cebadores en tándem.
Secuencia de 31pb y
cebadores en tándem.
Secuencia de 121pb
integrada solo por cebadores
en tándem.
Secuencias idénticas de
160pb y cebadores en
tándem.
Blast N
Homologia
Especie
- gb|DY668868.1
iv) Gene putative quinoneoxidoreductase homolog,
chloroplastic-like XM_003634792
iii) Fragaria
vesca
EST: KHO15 KHO-Wheatseptoria tritici.
-gb|JK818514.2
Sin similitud
Secuencias idénticas de
138pb integrada solo por
cebadores en tándem.
------------------
-------------
Secuencia de 161pb y
cebadores en tándem.
Sin similitud
Sin datos
-----------------------
Retrotransposon protein,
putative, Ty1-copia
subclass
----------------
Secuencias idénticas de
115pb y cebadores en
tándem.
Sin similitud
Sin similitud
Sin similitud
200pb
G55
Secuencia de 62pb y
cebadores en tándem.
Sin similitud
G56
Secuencia de 68pb y
cebadores en tándem.
EST: Strawberry Flowers;
early buds to senescent
-gb|GO578060.1
Secuencias idénticas de
232pb integrada solo por
cebadores en tándem.
-------------------
G58
Sin similitud
Sin similitud
514A1
G57
Triticum
aestivum
------------------
120pb
Especie
---------------
---------------
517E
200pb
Homologia
iv)Vitis
vinifera
---------------
G46
G45
G47
G48
514A2
Blast X
Fragaria x
ananassa
Sin similitud
-----------------
89
TDF
48hs
postinoc
Tamaño
esperado
Clon
Comparación de los clones
544A
280pb
A13R
A14R
A20R
Secuencias idénticas de
255pb.
B14
Secuencia distinta de 198pb
544B
300pb
B44
Sin similitud
Secuencias idénticas de
293pb.
S-adenosylmethioninedependent
methyltransferase genes.
EST: Cold-stressed
seedlings
-gb|DY675141.1
Fragaria
vesca
S-adenosylmethioninedependent
methyltransferase
Secuencias idénticas de
270pb.
EST:
i) Heat stressed
-gb|EX671327.1
ii) Cold-stressed
-gb|DY675688.1
iii) Heat stressed
-gb|EX672445.1
Fragaria
vesca
Glycine rich protein.
-gb|AFH57278.1
Secuencias idénticas de
165pb.
60S ribosomal protein L11.
60S ribosomal protein L11.
Sin datos
---------------------
----------------
B66
553A
170
553B
180
A14
A15
B1
B5
Homologia
Fragaria x
ananassa
B15‘
280
EST: Salt and heat
stressed
-gb|EX685663.1
EST: Strawberry 24h after
treatment with salicylic acid
FA_SEa0016A12r
Especie
Sin similitud
B20
546B
Homologia
Blast X
Fragaria
vesca
B15
B16
Blast N
Especie
Gossypium hirsutum
90
Cuadro 16: resultado de los análisis bio informáticos de los TDFs, encontrados 96hs post inoculación, clonados y secuenciados. Se indica la ID del clon, tamaño
esperado, análisis de los clones del mismo TDF y homología obtenida.
TDF
Blast N
Blast X
96hs
Tamaño
Clon Comparación de los clones
postesperado
Homologia
Especie
Homologia
Especie
inoc
G1
91A
230pb
G2
G3
G33
917A
200pb
Secuencia distinta de 196pb
Sin similitud
Secuencias idénticas formadas
por 2 regiones: sec 1 de 43pb y
sec 2 de 46pb. Y cebadores en
tándem.
sec 1
EST: Drought stressed.
-gb|EX678773.1
sec 2 Sin similitud.
Secuencia de 76pb y cebadores
en tándem.
Sin similitud
100pb
150pb
946
150pb
Sin similitud
Sin similitud
-Calcium-dependent
phospholipid-binding
copine-like protein
NP_568944.1
-Copine-like protein
gb|AAM62570.1
-Calcium-dependent
phospholipid-binding
copine-like
gb|AED97535.1
---------------------Calcium-dependent
phospholipid-binding
copine-like protein
-NP_568944
Copine-like protein
-gb|AAM62570
Calcium-dependent
phospholipid-binding
copine-like
-gb|AED97535
20
Secuencia distinta de 196pb
G34
Sin datos
-------------------
Secuencias idénticas de 106pb.
Sin similitud
Secuencias idénticas de 154pb.
Sin similitud
Sin similitud
Secuencias idénticas de 151pb.
Sin similitud
Sin similitud
21
G36
944
Fragaria vesca
Gene protein BON 3·(BONZAI 3)like (GENE ID: 100250185
LOC100250185)
XM_003633302.1
G35
917B
Sin similitud
M3
M4
M8
G1
G3
Vitis vinifera
Arabidopsis
thaliana
Arabidopsis
thaliana
91
TDF
96hs
postinoc
Tamaño
esperado
Clon
Comparación de los clones
Blast N
Homologia
Blast X
Especie
Homologia
Especie
G4
C5
938C
200pb
C21
938B
100pb
B24
B55
Secuencias idénticas de 44pb
integrada solo por cebadores en
tándem.
----------------------
Secuencias idénticas de 73pb.
EST: Salt and heat stressed.
-gb|EX687423.1
------------------
Fragaria vesca
Sin similitud
92
Como se observa en el Cuadro 14 uno de los TDF, el denominado 11C, presentó
homología con una proteína de resistencia del tipo R de Arabidopsis thaliana. Esta
información sugiere que el fragmento 11C correspondería a un gen que codifica para una
proteína implicada en la respuesta de defensa. De hecho, al analizar la secuencia de
aminoácidos deducida de este fragmento con el programa SMART se identificaron 4 sitios
que responden a repeticiones LRR (Leucine Rich Repeats) en los residuos 12, 33, 76 y
100. Las proteínas que pertenecen a la clase NBS-LRR se dividen en dos subclases: i)
TIR (―
Toll Interleukin‖) y ii) CC (―
coiled coil‖). No se pudo determinar a qué subclase
pertenece el TDF11C ya que la secuencia obtenida no abarcó esas regiones del gen. Por
otro lado, no se encontró similitud a nivel de ADN con secuencias de las bases de datos,
probablemente debido a que la región secuenciada corresponde a la zona LRR, que es
muy poco conservada y no permite alcanzar un valor de E significativo.
Con el fin de analizar la presencia de la secuencia genómica del TDF y evaluar su
expresión en los genotipos resistente y susceptible, se diseñaron 2 pares de cebadores
específicos a partir de distintas regiones del fragmento.
1º par de cebadores:
FNL-1F: 5‘ CTGCGAAAGCACCAGTCTAA 3‘
FNL-1R: 5‘ TTATTATGGGCTCTCTCTCCG 3‘
2º par de cebadores:
FNL-2F: 5‘GTGATGGAATTGGGATGGAC 3‘
FNL-2R: 5‘CATCGACGCGACGTTATATG 3‘
Figura 21: Secuencia del TDF 11C y ubicación de los cebadores sobre la secuencia de dicho gen.
93
Con estos cebadores se realizó una amplificación por PCR usando como molde tanto
ADN genómico como cDNA de los genotipos resistente y susceptible. En ambos casos se
amplificó un fragmento de unos 313 pb con los cebadores FNL-1 (Figura 22) y 177 pb con
los cebadores FNL-2 (no mostrado). Esto demuestra que el gen correspondiente al TDF
11C estaría en ambos genotipos, que no habría intrones entre estos cebadores y que la
diferencia, si la hubiera, debería buscarse en el nivel de expresión entre ambos genotipos
de frutilla.
P. Salta
M
ADN
cDNA
P. Mza.
ADN
cDNA
Figura 22: Presencia del gen correspondiente al TDF 11C en ADN genómico y cDNA de los genotipos
Pájaro Salta y Pájaro Mendoza, verificada mediante amplificación por PCR con los cebadores FNL-1. M:
marcador de peso molecular 100 pb (Genbiotech).
Con el objeto de comparar los niveles de expresión del TDF 11C en el genotipo resistente
y susceptible, se utilizó la técnica de PCR en tiempo real. Se cuantificó, además, la
expresión del gen FaPR1, marcador de la ruta del ácido salicílico (Kawano y col., 2004;
An y Mou, 2011) y por lo tanto de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR). Para normalizar
los niveles de ARNm, se refirieron a los niveles de expresión de dos genes constitutivos
("housekeeping") de la GAPDH (GenBank acc.: AB363963) y de la Actina (GenBank acc.:
AB116565). Los resultados obtenidos se observan en la Figura 23: la expresión basal, sin
infección, del gen correspondiente al TDF 11C fue menor en Pájaro Salta (resistente) que
en Pájaro Mendoza (susceptible), Figura 23 A. Sin embargo, se observó que la
inoculación con el hongo provocó una represión significativa de la expresion relativa del
gen TDF 11C en el genotipo susceptible (Pájaro Mendoza) mientras que en Pájaro Salta
no provocó cambios significativos. Por otro lado, la inoculación con el hongo provocó la
sobre-expresión del gen FaPR1 en la accesión resistente y la represión en la accesión
Pajaro Mendoza susceptible (Figura 23 C y B).
94
Figura 23: expresión relativa de los genes 11C y FaPR1. A: expresión constitutiva del gen correspondiente
al TDF 11C en los genotipos susceptible (Pájaro Mendoza) y resistente (Pájaro Salta) al patógeno
Colletotrichum fragariae F7. B: expresión relativa de los genes 11C y FaPR1 en condiciones sin infección
(control) y con infección con F7 en la accesión Pájaro Medoza. C: expresión relativa de los genes 11C y
FaPR1 en condiciones sin infección (control) y con infección con F7 en la accesión Pájaro Salta. Los valores
de expresión fueron normalizados en relación con la del gen de referencia GAPDH. Los valores de
expresión normalizados en relación a la del gen de la Actina tuvieron niveles similares (no mostrados).
Estos resultados demuestran expresión diferencial entre los genotipos resistente y
susceptible, lo que nos llevó a iniciar la caracterización de la secuencia completa del
transcripto (cDNA) y estudiar la secuencia de este gen en ambos genotipos de frutilla. Por
estos motivos, se realizó una genoteca de cDNA de la accesión resistente 24 hs post
inoculación y se la conserva a -70ºc para su posterior análisis con la técnica RLM-RACE
(―
RNA Ligase-Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends‖) de manera que en un futuro
se pueda conocer la secuencia completa del transcripto correspondiente al TDF 11C.
95
DISCUSIÓN
Con el objetivo de profundizar el conocimiento de la interacción entre dos genotipos de
frutilla, altamente emparentados, con respuesta diferencial frente a un aislado (genotipo)
de uno de los hongos causantes de la antracnosis, se usó la técnica de cDNA-AFLP para
identificar y clonar genes que se expresaron diferencialmente en esa interaccion plantapatógeno. Con este propósito se analizaron cuatro muestras de hojas provenientes de dos
genotipos: i) resistente sin inocular, ii) resistente inoculado, iii) susceptible sin inocular y
iv) susceptible inoculado. Esto permitió identificar transcriptos expresados sólo en la
muestra de los individuos resistente inoculados y evitar falsos positivos derivados de los
transcriptos del patógeno. Se identificaron 60 seceuncias de genes que se expresaron
específicamente en el genotipo resistente inoculado con el hongo. Estos resultados
demostraron que la aproximación utilizada permitió capturar genes de interés en un cultivo
altamente poliploide y del que su genoma aún no esta secuenciado.
Los primeros transcriptos interesantes de analizar fueron dos TDFs (917A y 917B) que
presentaron homología con proteínas similares a copina. Esta familia de proteínas,
recientemente identificada, posee dominios de unión a fosfolípidos, dependientes de
calcio, evolutivamente conservada, presente en una amplia gama de organismos como
protozoos, plantas, nematodos, y mamíferos. Sin embargo, su función biológica y
bioquímica no se esclareció aún. El TDF 917A presentó similitud con el gen BON3
(BONZAI 3) de Arabidopsis, que codifica una proteína copina. El gen BON3 tiene dos
homólogos en Arabidopsis: BON1 y BON2 (Yang y col. 2006b). Los trabajos de Li y col.,
(2009) demostraron que los genes BON1 y BON3 en Arabidopsis actúan como
reguladores negativos de varios genes R que intervienen en las respuestas de defensa y
muerte celular.
Otros dos TDF (144A y 144B) mostraron identidad con factores de transcripción como
BRCA1 de Ricinus communis y ERF 034 de Glycine max; que se caracterizan por poseer
un dominio dedos de zinc (―
zinc finger‖) de unión a ADN para regular la transcripción
génica. La proteína BRCA1, forma parte del sistema de detección y reparación de los
daños del ADN. El dominio dedos de zinc RING es un tipo de dedo de zinc que contiene
un motivo caracterizado por la secuencia de aminoácidos Cys3HisCys4 (C3HC4) capaz
de unir cationes de zinc. Este dominio proteico es un dominio rico en cisteína que
contiene entre 40 y 60 aminoácidos y coordina dos iones de zinc (Haas y col. 2002;
Sasaki y col. 2002; Alexandrov y col. 2006). El acrónimo "RING" proviene de sus siglas en
inglés "Really Interesting New Gene" y fue definido como un nuevo dominio por Freemont
y col. (1991). Estos dominios han sido encontrados en proteínas implicadas en diversas
96
vías de transducción de señales y vías reguladoras de respuestas (Saurin y col. 1996;
Joazeiro y col. 1999; Freemont 2000; Vij y Tyagi 2006). En plantas, se identificaron y
caracterizaron diversas proteínas del tipo RING, entre las que podemos destacar: CaKR1,
en Capsicum annuum involucradas en las respuestas al frío y la salinidad (Seong y col.
2007) y XERICO en Arabidopsis thaliana que confiere tolerancia a sequía (Ko y col. 2006)
y otras que están involucradas en el desarrollo de semillas, fotorespiración, etc.
El TDF 147B1 arrojó homología con genes y proteínas del tipo C3HC4 dedos zinc RING.
Las estructuras de dedos de zinc RING unen simultáneamente enzimas de ubiquitinación
y sus correspondientes sustratos, actuando así como ubiquitin-ligasas. La ubiquitinación
marca la proteína sustrato para su degradación. Se ha descrito que proteínas que
contienen dedos de zinc están involucradas en transcripción, traducción, tráfico de ARN
mensajeros, organización del citoesqueleto, en el desarrollo epitelial, la adhesión celular,
en el plegamiento de proteínas, en el reordenamiento de la cromatina y con bio-sensores
de zinc (García, 2006; Laity y col., 2001).
Un grupo de 14 TDFs mostró similitud con distintos ESTs de Fragaria vesca. Esta especie
constituye el pariente más cercano con genoma diploide, pequeño y que ha sido
secuenciado, representando una puerta de entrada a los estudios funcionales de genes
dentro de las Rosáceas (Shulaev y col., 2011). La mayoría de los EST anotados se
expresaron en situaciones de estrés biótico y/o abiótico.
Dos TDFs mostraron homología con ESTs obtenidos de Fragaria ananassa, el TDF 544B
con un EST inducido en respuesta al tratamiento con el ácido salicílico y el TDF 514A2
con un EST relacionado con la senescencia o muerte temprana de yemas florales.
El TDF 524 tuvo homología con genes Knotted y homeobox (Knox), estos conforman una
familia de genes de plantas que se dividen en: i) Clase I, Knox que se expresan en
meristemas de brotes, y en algunos casos (con notables excepciones) en primordios
laterales y ii) Clase II, tienen patrones de expresión más diversos. La pérdida y ganancia
de mutaciones funcionales en su secuencia demostraron que los genes Knox son
importantes reguladores de la función meristemática. Todavía no se les designó una
función relacionada con la respuesta defensiva en plantas.
El TDF 122B2 mostró homología con genes relacionados a la vernalización, como el gen
Vernalization1 (VRN1) de cereales de clima templado, que se activa transcripcionalmente
por frío prolongado durante el invierno (vernalización) para promover la floración. Al igual
que para otros TDF, aún se desconoce que rol cumpliría en la respuesta defensiva contra
patógenos.
97
En esta Tesis se identificaron además, un grupo de transcriptos que no mostraron
similitud con secuencias publicadas y que posiblemente estarían involucrados en la
respuesta de defensa a C. fragariae. La información obtenida en este trabajo se suma a la
de varios estudios que se han realizado para aumentar la cobertura del transcriptoma en
Fragaria spp, que incluyeron la evaluación de transcriptos relacionados al estrés en
plántulas de F. vesca en desarrollo (Shulaev y col., 2011) y la pirosecuenciación con
diversos tratamientos de distintos tejidos de F. ananassa (Folta y col., 2010). Los
mensajeros identificados en este trabajo podrían contribuir al conocimiento del
transcriptoma de Fragaria spp y favorecer el desarrollo de herramientas genómicas útiles
en escenarios del mejoramiento de esta especie, ya que permitirán identificar marcadores
funcionales para selección asistida por marcadores. Por otra parte, aportan datos al banco
de ESTs de frutilla, que pueden ser útiles para la transcriptómica comparativa entre
frutillas cultivadas, sus ancestros diploides, y la familia Rosaceae en general.
Finalmente, otro de los fragmentos identificados y que fue elegido para profundizar su
caracterización, fue el TDF 11C, debido a que su secuencia traducida mostró homología
con proteínas putativas de resistencia de la clase NBS-LRR, del tipo R y podría jugar un
rol importante en la respuesta de defensa. Se estudio la presencia de su secuencia en el
genoma y sus niveles de expresión en los genotipos resistente y susceptible. Se detectó
la presencia del gen en ambos genotipos y se observó una expresión relativa basal o
constitutiva diferencial entre el genotipo susceptible y el genotipo resistente (Figura 23 A).
En cuanto a la expresión después de la inoculación con el hongo, en el genotipo
susceptible se observó una disminución significativa de la expresión (represión). Por el
contrario, en el genotipo resistente no hubo cambios significativos en los niveles de
expresión del transcripto 11C (Figura 23 C). Estos resultados ratifican la naturaleza
diferencial del transcripto 11C detectado inicialmente por cDNA-AFLP como banda
presente en el genotipo resistente y ausente en el susceptible después de la inoculación
con el hongo F7. Estos resultados apoyan la hipótesis de que el TDF 11C correspondería
a un gen de resistencia ―R
‖. Está ampliamente reportado en la bibliografía que los genes
de resistencia tipo ―R‖ poseen expresión constitutiva muy baja debido a que codifican para
proteínas de gran tamaño lo que implica importantes gastos metabólicos para la planta,
de manera que mantiene una mínima expresión del gen, pero suficiente para defenderse
del ataque del hongo (Meyer y col. 2009). La represión de la expresión de TDF11C en el
genotipo susceptible inducida por la infección con el aislado F7 de C. fragariae podría
atribuirse a algún efector fúngico que bloquee, secuencia arriba ("upstream"), la cadena
de transducción de señales que regula la expresión del gen de resistencia y como
consecuencia de este bloqueo la planta desarrolló una interacción compatible. Por su
98
parte, el genotipo resistente no mostró tal represión en la expresión de TDF 11C, lo que
mantendría la funcionalidad del gen para evitar la enfermedad y desencadenar una
respuesta de tipo incompatible. Estos resultados nos llevan a pensar en el TDF 11C como
gen candidato de la resistencia a este aislado fúngico. Información respecto de las
diferencias en la secuencia nucleotídica del gen y/o sus regiones promotoras entre los
genotipos resistente y susceptible permitirá valorar la región responsable de la expresión
diferencial y en consecuencia de la regulación de la expresión. Sin embargo, no se
descarta la posibilidad de que otras regiones en trans puedan ser las responsables de la
expresión diferencial y por lo tanto de la resistencia a F7. Se destaca la importancia de
estos resultados, los cuales pueden contribuir a esclarecer los mecanismos de defensa de
F. ananassa frente a C. fragariae y quizás también a implementar biotecnologías para el
manejo de la enfermedad de la antracnosis.
Un hecho interesante es que las accesiones en estudio corresponden al mismo cultivar y
por lo tanto se considera que las diferencias a nivel de secuencia serían muy bajas. Sin
embargo, no podemos obviar que fueron sujetas a multiplicación in-vitro durante muchos
años siguiendo los protocolos recomendados por Boxus (1974), sin evaluar la estabilidad
genética. Probablemente el uso de medios de cultivos con altos contenidos de hormonas
del tipo citoquininas, auxinas y giberelinas, junto a un extenso número de multiplicaciones,
provocaron la proliferación de brotes adventicios (derivados de callos). Las células en esta
situación se ven sometidas a un gran estrés que desencadena la aparición de mutaciones
conocidas con el nombre de variaciones somaclonales que pueden ser las responsables
del fenotipo alterado que se ha observado en estas plantas. Años después se ajustaron
procedimientos para multiplicar la frutilla a través de yemas axilares (Boxus 1987, Boxus
1992, López Aranda y col. 1994) que poseen un origen multicelular sin pasar por la etapa
de callo, por lo que poseen mayor estabilidad genética. En nuestro caso, podriamos
especular que como consecuencia de variaciones somaclonales se projujeron cambios
beneficiosos en este cultivar, que derivaron en un genotipo con alto interés agronómico
(Pajaro accesión Salta) resistente al aislado F7 de C. fragariae. Estos resultados apoyan
la hipótesis de que las mutaciones espontaneas afectaron la susceptibilidad de la planta
de frutilla frente a C. fragariae a través de modificaciones de una característica
íntimamente ligada al locus del transcripto 11C o en la cadena de transducción de señales
en la que interviene este factor.
99
CONCLUSIONES
Se utilizó con éxito la técnica de cDNA-AFLP para identificar y aislar transcritos que se
expresan diferencialmente en genotipos de frutilla con distintos niveles de resistencia a C.
fragariae.
Con las secuencias obtenidas, el análisis bioinformático de homologías en banco de
genes arrojó los siguientes resultados:
(i) un grupo de TDF mostraron homología con genes de plantas, fundamentalmente de
Fragaria vesca, que se expresan frente a estrés biótico y abiótico.
(ii) Tres genes mostraron similitud con factores de transcripción, mientras que otro
presentó similitud con un mensajero de Fragaria ananassa inducido por ácido salicílico.
(iii) Una pequeña fracción presentó homología con genes de otros eucariotas a los cuales
se le asignaron funciones diversas o no tienen función putativa conocida.
La expresión de uno de los transcriptos (TDF 11C), que por su homología con genes de
resistencia tipo R fue elegido para profundizar su caracterización, es reprimida por el
patógeno en el genotipo de frutilla susceptible, lo que implicaría que el gen que lo codifica
tiene un rol en la defensa de la frutilla.
100
CAPITULO lV
Construcción
de
una
población
segregante
para
el
carácter
resistencia/
susceptibilidad al aislado F7 de C. fragariae.
INTRODUCCIÓN
Una de las formas de buscar genes útiles para el mejoramiento, es el análisis de
expresión visto en el capitulo anterior. Otra posibilidad es a través del mapeo genómico y
es lo que nos propusimos hacer en este capítulo.
La incidencia de la enfermedad de la antracnosis sobre la frutilla se puede disminuir con
un adecuado manejo del cultivo, utilizando prácticas culturales en conjunto con los
tratamientos químicos (Freeman y col., 1997). Pero el uso desmedido de agroquímicos
tiene un alto impacto en el ecosistema, en la salud del trabajador rural, contamina las
aguas y genera residuos tóxicos en los alimentos. Además, promueve la aparición de
cepas de hongos resistentes a los fungicidas y produce la eliminación de los enemigos
naturales de las plagas de insectos y microbios. El exceso de residuos de fungicidas en la
fruta puede causar serios inconvenientes a la hora de comercializarla porque no cumple
con los estándares de calidad exigidos por los mercados importadores.
Por lo tanto, el desarrollo de cultivares resistentes o tolerantes es la medida más efectiva
para el control de esta enfermedad. La obtención de resistencia se logra mediante la
combinación del mejoramiento genético clásico y selección asistida por marcadores
moleculares (MAS), esto implica la identificación y mapeo de genes de resistencia y loci
de caracteres de interés.
En la mayoría de los programas de mejoramiento, las especies silvestres son usadas para
transferir caracteres específicos deseables a las especies cultivadas y para acrecentar la
diversidad genética de estas últimas (Rajendran, 1990). En ciertos casos los genotipos
salvajes están física y genéticamente lejanos de los cultivados, dificultando el proceso de
mejora ya que se necesitan de un gran número de generaciones de retrocruzamiento para
incorporar la resistencia. Además en el caso de la frutilla las diferencias en la ploidia con
las especies silvestres relacionadas resulta una barrera para obtener una numerosa
progenie interespecifica.
De todos modos, con los programas de mejoramiento genético tradicional se pueden
obtener cultivares con resistencia incrementada. Y en este caso, los marcadores
moleculares ligados a genes de resistencia pueden ser muy útiles para ayudar a
101
seleccionar los cultivares más resistentes (selección asistida por marcadores), reduciendo
el tiempo que insumen las diferentes etapas de la selección clonal, reemplazando los
tradicionales marcadores morfológicos o fenotípicos, en especial cuando la expresión de
esta característica es ambiental, inestable o difícil de observar.
Marcadores moleculares en el mapeo genético
Los marcadores genéticos representan las diferencias que existen entre individuos o
especies. Generalmente no representan a genes blanco y la mayoría no afecta el fenotipo
de la característica de interés, pero actúan como señales o marcas ya que se encuentran
cerca o ligados a los genes que controlan la característica (Collard y col., 2005).
Los marcadores inicialmente se utilizaron en el mapeo genético para determinar el orden
de los genes a lo largo de los cromosomas. Sturtevant (1913) desarrolló el primer mapa
genético con caracteres morfológicos ligados al sexo en Drosophila melanogaster Meigen.
Posteriormente, Sax (1923) determinó el ligamiento genético entre caracteres cualitativos
(color y tamaño de la semilla) en poroto. Los beneficios potenciales de la utilización de
marcadores vinculada a los genes en programas de mejoramiento han sido evidentes
durante muchos años. Con el advenimiento de los marcadores genéticos basados en
ADN en la década de los setenta la situación cambió para investigadores y mejoradores,
ya que a partir de esa época se identificaron gran número de marcadores dispersos en el
genoma de varias especies como el tomate (Paterson y col., 1988), arroz (Kurata y col.,
1994, Van Deynze y col., 1995; Devos y Gale, 1997), maíz (Dufour y col., 1996), trigo
(Blanco y col., 1998), soja (Yu y col., 1994), alfalfa (Kiss y col., 1993), manzana (Hemmat
y col., 1994) y en muchas otras plantas cultivadas.
Un requisito básico para cualquier programa de mejoramiento basado en la selección
asistida por marcadores (MAS) es contar con un adecuado número de marcadores
polimórficos. Actualmente existe una gran variedad de marcadores moleculares
disponibles, que se pueden utilizar en diversas aplicaciones como: en investigación
vegetal básica, en mejoramiento, caracterización y conservación de germoplasma;
identificacion de genes; introgresión asistida de alelos favorables y protección de
variedades comerciales (Henry, 2001).
Los marcadores moleculares más usados para mapeo son:
 RFLP: ―R
estriction Fragment Length Polymorphism‖ (Botstein y col., 1980).
 RAPD: ―R
andom Amplified Polymorphic DNA‖ (Williams y col., 1990).
 SCAR: ―Se
quence-Characterized Amplified Region‖ (Williams y col., 1991).
102
 SSR: ―Sim
ple Sequence Repeat‖ o microsatélites (Hearne y col., 1992).
 CAPS: ―C
leaved Amplified Polymorphic Sequences‖ (Lyamichev y col., 1993).
 STS: ―Se
quence-Tagged Sites‖ (Fukuoka y col., 1994).
 AFLP: ―A
mplified Fragment Length Polymorphism‖ (Vos y col., 1995).
 ALP: ―A
mplicon Length Polymorphisms‖ (Ghareyazie y col., 1995).
ter-Simple Sequence Repeats‖ (Wolfe y col., 1998).
 ISSR: ―In
 SNP: ―Sin
gle Nucleotide Polymorphism‖ (Buetow y col., 1999).
El progreso de algunas técnicas en genética molecular ha facilitado la identificación de
marcadores ligados a un carácter mediante la utilización de marcadores moleculares que
permitan detectar un número elevado de loci con un número limitado de cebadores.
Precisamente Michelmore y col. (1991) desarrollaron una estrategia de análisis de
mezclas de ADN (―
bulked segregant analysis‖: BSA) en lechuga, Lactuca sativa L., para
identificar fragmentos de ADN amplificados al azar (RAPD) ligados a genes de resistencia
a enfermedades. El BSA permitió la comparación de dos muestras de mezclas de ADN
obtenidos de la misma población, pero de fenotipos contrastante para el carácter de
interés. Los fragmentos polimórficos de ADN fueron detectados como bandas únicas, en
geles de agarosa o acrilamida según la técnica utilizada, presentes en una mezcla de
ADN y no en la mezcla de ADN del otro fenotipo (Michelmore y col., 1991).
Tipos de mapas
Una de las herramientas que utilizan los programas de mejoramiento genéticos para la
ubicación y disección de genes de interés es el desarrollo de mapas genéticos. Existen 2
tipos de mapas, los mapas de ligamiento molecular que están formados por marcadores
de ADN ubicados en posiciones relativas unos de otros, basándose en grupos de
ligamientos genéticos; y los mapas físicos, que consisten en fragmentos genómicos
clonados y secuenciados, ordenados linealmente como se encuentran en el cromosoma
del organismo considerado (Blanco M y Valverde R., 2005).
Uso de los mapas genéticos
Caracterizar la estructura del genoma de una especie: conocer el ordenamiento de los
genes en el genoma, identificar sitios de alta y baja tasa de entrecruzamiento, identificar
reordenamientos cromosómicos ocurridos al comparar los mapas genéticos de especies
relacionadas.
103
Predecir la probabilidad de ocurrencia de determinados gametos y por lo tanto de
determinados genotipos.
Realizar selección indirecta cuando un gen de interés está completamente ligado a un
marcador o gen de fácil evaluación.
Agrupar a los individuos según su arreglo genotípico (tipificación genotípica) identificando
los individuos recombinantes.
Mapeo de genes de resistencia
Los mapas genéticos y los marcadores moleculares son herramientas importantes que
sirven para identificar genes de interés. Como los marcadores existen en un número
elevado, se puede construir mapas genéticos de alta densidad que son la base para llevar
a cabo programas de mejora asistida por marcadores (MAS). En los mapas genéticos se
pueden localizar genes de interés como: resistencia a enfermedades, tolerancia a
estreses abióticos, características agronómicas o del fruto, etc.
La resistencia a enfermedades representa un desafío diferente a los caracteres
agronómicos, pues la interacción planta-patógeno está en constante co-evolución. Así, el
mejorador se topa con diferentes razas de un patógeno o la presencia de varios genes de
resistencia en la planta. La selección indirecta de genes específicos de razas ofrece una
alternativa viable para asegurar que las combinaciones de genes favorables estén
presentes en las nuevas líneas mejoradas (Kelly y Miklas, 1998). Hay marcadores que al
estar fuertemente ligados a genes de resistencia específica a razas individuales del
patógeno, permiten guiar la selección indirecta eficaz de genes de resistencia.
Hay estudios, como los de Faleiro y col, (2003), que encontraron que las plantas poseen
muchos genes específicos de raza para hongos patógenos que son mapeados en pocos
loci y que estos loci pueden estar constituidos por genes aislados, por genes ligados y
organizados en forma secuencial o por genes que contienen diferentes alelos. El número
de genes R, así como el mapeo de dichos genes han sido determinados para diferentes
patosistemas (Pryor y Ellis, 1993). Por ejemplo en el poroto común (Phaseolus vulgaris L.)
con el desarrollo de los marcadores moleculares, los estudios dirigidos al mapeo de
diferentes genes R, han aumentado considerablemente en los últimos años (Kelly y
Miklas, 1998). Se han desarrollado alrededor de 15 mapas de ligamiento en poblaciones
generadas a partir de diferentes cruzas, y han localizado genes mayores ligados o
asociados con resistencia a enfermedades, en poroto, tales como el gen ligado a
resistencia a virus del mosaico común (BCMV) (Blair y col., 2007a, b), al tizón común
(Park y col., 1999), a mancha angular de la hoja (Namayanja y col., 2006), a moho blanco
104
(Kolkman y Kelly, 2003), a la antracnosis (Vallejos y col., 2001), a roya (Park y col., 2003).
Estos mapas han permitido que los mejoradores entiendan la herencia de la resistencia
de las características en cuestión (McClean y col., 2004).
En el caso del melón, se han desarrollado marcadores moleculares ligados al gen de
resistencia Fom-2, que confiere resistencia a las razas 0 y1 de Fusarium oxysporum f.sp
melonis (Zheng y col., 1999; Wang y col, 2000) con una población de mapeo.
Actualmente ya se han utilizado mapas genéticos en numerosas plantas cultivadas y en
plantas silvestres relacionadas, para identificar marcadores ligados a genes de resistencia
a enfermedades como por ejemplo en tomate (Martin y col., 1991), lechuga (Paran y col.,
1991), arroz (Yoshimura y col., 1995), trigo (Botstein y col., 1980), maíz (Simcox y col.,
1993), sorgo (Oh y col., 1994), cebada (Kilian y col., 1994; Penner y col., 1995; Borovkova
y col., 1995; Graner y col., 1996), soja (Yu y col., 1994), papa (MeKsem y col., 1995).
En el caso de las especies de la familia Roseaceae, se publicaron algunos trabajos en
frutilla y frambuesa donde se han encontrado marcadores asociados con la resistencia a
Colletotrichum (Lerceteau- Köhler y col., 2005, Smith y col., 1987). Se identificaron genes
de resistencia en frambuesa y marcadores moleculares asociados con el gen Rca 2 que
otorga la resistencia a un grupo de patogenicidad de Colletotrichum acutatum, que causa
la antracnosis. Otros trabajos realizados en Fragaria ananassa con poblaciones
segregantes como los de Van de Weg y col., (1993), demostraron que la resistencia al
patógeno Phytophtora fragariae tiene una herencia monogénica y se comporta de acuerdo
a un sistema gen a gen. También Gupton y Smith, (1991) estudiaron genes de defensa en
la frutilla cultivada y demostraron que la resistencia a C. acutatum y C. fragariae estaría
dada también por la acción de un gen mayor, pero no descartaron efectos epistáticos.
En cuanto al mapeo dentro del género Fragaria, podemos citar el trabajo de tesis doctoral
del Dr. Bonet Gigante (2010) en la Universidad de Barcelona, que desarrolló un mapa
genómico con la especie diploide F. vesca. Con el objetivo de localizar nuevos loci
responsables de las principales características agronómicas de la frutilla, desarrollaron
nuevos marcadores moleculares que contribuyen a mejorar el mapa genético de
referencia del género. También confeccionó un mapa físico del género, pero su máximo
esfuerzo fue la localización de posibles genes candidatos para la calidad del fruto.
El primer mapa de ligamiento del genoma de la frutilla diploide fue desarrollado por Davis
y Yu (1997) con izoenzimas. Al mismo tiempo se publicaba el ligamiento entre
marcadores RAPD y un carácter de interés en la frutilla cultivada usando BSA de
individuos resistentes y susceptibles a Phytophthora fragariae (Haymes y col., 1997).
105
Estos últimos autores identificaron 7 marcadores RAPD ligados al locus Rpf1, que es una
de las fuentes principales de resistencia genética a la pudrición roja de la corona y raíz,
causada por el hongo de suelo P. fragariae. En el primer mapa basado en estudios de
asociación en Fragaria ananassa (Sugimoto y col., 2005) se identificaron dos marcadores
RAPD ligados al locus EV (―
everbearing‖) en la frutilla octoploide.
La técnica de AFLP fue aplicada por primera vez en Fragaria ananassa por LerceteauKöhler y col. (2003) durante la construcción del primer mapa de ligamiento público de la
frutilla cultivada y subsecuentemente en estudios relacionados (Weebadde y col., 2008;
Rousseau-Gueutin y col., 2008; Sargent y col., 2009b, Ontivero y col., 2011).
Lerceteau-Köhler y col., en 2005 estudiaron la herencia de la resistencia a uno de los
agentes causantes de la antracnosis, Colletotrichum acutatum, en 43 cultivares de frutilla.
Ellos obtuvieron 2 marcadores SCAR, derivados de AFLP, muy ligados al gen Rca2.
A pesar de estos estudios, en este cultivo se han desarrollado pocas poblaciones de
mapeo y específicamente en lo que se refiere al mapeo de genes de resistencia a la
antracnosis en frutilla hay escasa información.
Por lo tanto si se dispone de una población segregante para el carácter de resistencia a
este patógeno se podrán desarrollar marcadores que nos permitan determinar la
presencia del/los gen/es deseado/s. Y como estos marcadores no están influenciados por
el ambiente, permitirán una selección más rápida y confiable que los procesos de
selección tradicional en el mejoramiento. Por todo lo explicado se decidió desarrollar una
población segregante los más consanguínea posible donde este segregando el carácter
resistencia/susceptibilidad a C. fragariae.
106
MATERIALES Y METODOS
Para la obtención de progenie segregante para el carácter de resistencia al aislado F7 de
C. fragariae se realizaron cruzas recíprocas entre la accesión Mendoza (susceptible) del
cultivar Pajaro con la accesión Salta (resistente) del mismo cultivar. Los cruzamientos se
realizaron mediante una técnica optimizada en nuestro grupo que garantiza la obtención
de progenie híbrida. Para ello se utilizaron flores cerradas de los genotipos que actuaron
como progenitores femeninos y flores completamente abiertas para los progenitores
masculinos. Se eligieron los pimpollos de mayor tamaño de plantas cultivadas en
invernadero pertenecientes al cultivar seleccionado como progenitor femenino y se
procedió a la eliminación de las piezas florales externas (sépalos y pétalos) con ayuda de
una pinza y una tijera de punta fina, posteriormente se cortaron los estambres (castración)
y se taparon con copos de algodón para evitar la polinización con polen extraño. Al tercer
día posterior a la castración, se fecundaron las mismas con polen de plantas del cultivar
seleccionado como progenitor masculino. Luego de la polinización se cubrieron las flores
con algodón. A los siete días se destaparon las mismas y se evaluó el resultado de los
cruzamientos. En los casos positivos, se cosecharon los frutos a la madurez
aproximadamente 30 días después de la polinización. Los aquenios más turgentes fueron
seleccionados para ser escarificados y posteriormente sembrados.
La escarificación de los aquenios se realizó por inmersión en ácido sulfúrico concentrado
durante 1 min y a continuación se lavaron de 8 a 10 veces con agua destilada estéril.
Finalmente los aquenios híbridos se sembraron en tierra estéril en bandejas ‗speedlings‘ y
se mantuvieron a 25ºC y 16 horas de luz diarias en un fitotrón.
Transcurrido un periodo aproximado de tres meses, las plántulas obtenidas fueron
transplantadas a macetas de 1litro, con el mismo sustrato que se detalló en los capítulos
anteriores. Se cultivaron en las mismas condiciones controladas durante 30 días y
posteriormente se trasladaron a invernadero para un óptimo desarrollo vegetativo e
inducción de estolones para su multiplicación. Esta población será utilizada en futuros
proyectos, a través de multiplicación vegetativa.
107
RESULTADOS
Sobre la base de la información obtenida en los experimentos donde se evaluó la
resistencia/susceptibilidad de los genotipos del Banco de Germoplasma del Pro-Frutilla
frente al aislado F7 de Colletotrichum fragariae, se diseñaron cruzamientos para obtener
poblaciones segregantes que posibilitaran investigar el control genético de la resistencia
en frutilla. Para seleccionar dichos progenitores también se tuvieron en cuenta sus
relaciones genéticas, lo que fue analizado en el capítulo l de la presente Tesis.
Se generaron 2 poblaciones segregantes:
Población código Nº196 donde el cultivar Pájaro Mendoza fue el progenitor femenino y el
progenitor masculino fue el cultivar Pájaro Salta. Se obtuvieron 130 aquenios.
Población código Nº197 es el cruzamiento reciproco al anterior donde Pájaro Salta fue el
progenitor femenino. De este cruzamiento se obtuvieron 115 aquenios.
Las poblaciones segregantes generadas en este caso equivalen a una F2 debido a la
naturaleza altamente heterocigota de la especie.
De la población Nº196, se obtuvieron 104 plantas, pero de estas sobrevivieron a las
condiciones de invernadero solo 40 genotipos.
En el caso de la población Nº197 se obtuvieron 115 aquenios, de los cuales sólo 50
germinaron.
Se realizaron nuevos cruzamientos, en ambos sentidos, para obtener poblaciones con
mayor número de individuos, cuyos frutos se están por cosechar.
108
DISCUSIÓN
El mejoramiento a través de la generación de recombinantes genéticas entre fuentes de
resistencia de genotipos muy cercanos podría representar una solución estable a la
mejora de cultivares con resistencia incrementada. Antes de desarrollar una población de
mapeo para localizar genes o marcadores asociados a la resistencia es necesario realizar
un ―sc
reening‖ de las variedades o genotipos disponibles para determinar cuáles son
resistentes o susceptibles a la enfermedad en estudio, en nuestro caso la antracnosis.
Este análisis fenotípico fue realizado dentro de los primeros objetivos de esta tesis
concluyendo que dos genotipos muy cercanos genéticamente tuvieron respuestas
contrastantes a la infección con el aislado F7 de C. fragariae. Por tal motivo se
seleccionaron estos genotipos genéticamente cercanos y con resistencia contrastante al
aislado F7 de Colletotrichum fragariae para generar las poblaciones de estudio. Así,
analizando la progenie de una cruza entre progenitores resistente y susceptible se
podrían encontrar marcadores asociados a la resistencia.
Como en frutilla hay pocos estudios de mapeo genético, especialmente relacionados a
genes de resistencia a la antracnosis, esta población permitiría el desarrollo de
herramientas moleculares que contribuirán al conocimiento de los mecanismos
moleculares implicados en los procesos biológicos de la defensa de este cultivo y esto
tendría mayor relevancia en la mejora de las variedades comerciales actuales.
CONCLUSIONES
Quedaron formadas dos poblaciones segregantes derivadas de los cruzamientos
recíprocos de Pájaro Salta con Pájaro Mendoza para futuros estudios de mapeo y
selección asistida por marcadores.
109
CONCLUSIONES FINALES
I.
El genotipado con RAPD permitió caracterizar 3 accesiones del cultivar Pájaro
como genotipos distintos.
II.
Estas diferencias en los perfiles genotípicos, posiblemente por acumulación de
mutaciones durante la multiplicación clonal, no se reflejaron en los descriptores
recomendados por la UPOV para la identificación varietal.
III.
Dos de estos genotipos muy parecidos genéticamente presentaron una respuesta
diferencial frente a la inoculación con Colletotrichum fragariae.
IV.
El análisis transcriptómico por cDNA-AFLP permitió identificar 60 transcriptos con
secuencias homólogas a proteínas con función putativa conocida.
V.
Uno de estos genes (TDF 11C) que se corresponde con un gen de resistencia tipo
R, es reprimido por el patógeno en el genotipo susceptible, lo que indica que tiene
una función en la respuesta de defensa.
PROYECCIONES
Para profundizar con los estudios básicos sobre cómo las plantas se defienden de sus
patógenos y si fuera posible también para mapear genes de resistencia que puedan ser
usados en el mejoramiento genético de la frutilla, se obtuvieron dos poblaciones donde
esta segregando la resistencia, por cruzamiento entre los progenitores cosanguíneos con
comportamiento diferencial frente a C. fragariae.
El clonado del TDF 11C en el genotipo resistente y en el susceptible permitiría conocer la
región del gen responsable de la expresión diferencial, y también se podría inferir como
está regulada su expresión.
110
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