leptospirosis

CAPÍTULO 2.1.9.
LEPTOSPIROSIS
RESUMEN
La leptospirosis es una enfermedad transmisible de los animales y de los humanos causada por
cualquiera de los miembros patógenos del género Leptospira. El diagnóstico de laboratorio de la
leptospirosis puede ser complejo e implica pruebas que se dividen en dos grupos. Uno de los
grupos de pruebas está diseñado para detectar los anticuerpos antileptospiras, el otro está
diseñado para poner en evidencia las leptospiras, antígenos de leptospiras o ácidos nucleicos de
leptospiras en tejidos animales o en fluidos corporales. El conjunto de pruebas concretas
seleccionadas depende del objetivo de la prueba (por ejemplo, los estudios de rebaños o el
diagnóstico en un animal aislado) y de las pruebas o de la experiencia de la que se disponga en la
zona.
Identificación del agente: El aislamiento y la detección de las leptospiras en:
a)
los órganos internos (como el hígado, el pulmón, el cerebro y el riñón) y en los fluidos
corporales (la sangre, la leche, los fluidos cerebroespinal, torácico y peritoneal) de los
animales infectados clínicamente proporciona un diagnóstico definitivo de la enfermedad
clínica aguda o, en el caso de un feto, de la infección crónica de la madre.
b)
el riñón, la orina o en el tracto genital de animales sin síntomas clínicos solo es un
diagnóstico de un estado de portador crónico.
El aislamiento de leptospiras a partir de material clínico y la identificación de los aislamientos
constituyen procesos de larga duración, y se realizan los laboratorios de referencia especializados.
El aislamiento seguido de la tipificación a partir de portadores renales es muy útil en los estudios
epidemiológicos para determinar qué serotipos están presentes en un grupo concreto de animales,
en una especie animal o en una región geográfica.
La demostración de la presencia de leptospiras mediante pruebas inmunoquímicas
(inmunofluorescencia e inmunohistoquímica) se adapta más a la mayoría de las condiciones de
laboratorio. Sin embargo, la eficacia de estas pruebas depende del número de microorganismos
que estén presentes en el tejido y carecen de la sensibilidad de un cultivo. A menos que se utilicen
reactivos especialmente elaborados, las pruebas inmunoquímicas no identifican el serotipo
infectante, y sus resultados deben interpretarse en conjunto con los resultados serológicos. Los
reactivos para inmunofluorescencia se elaboran mejor con sueros antileptospira con un título alto
de IgG, que no están disponibles comercialmente. El suero de conejo o los anticuerpos
monoclonales para la tipificación de leptospiras pueden utilizarse para las pruebas
inmunohistoquímicas y están disponibles en los laboratorios de referencia de leptospiras.
La presencia de material genético de leptospiras en los tejidos o en los fluidos corporales se puede
demostrar empleando diversas pruebas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
bien sea en tiempo real o en formatos clásicos. Los ensayos de la PCR son sensibles, pero los
procedimientos de control de calidad y el procesamiento de las muestras para la PCR son
cruciales y deben adecuarse al tejido, al fluido y a la especie que se esté analizando. Al igual que
ocurre con las pruebas inmunoquímicas, con las pruebas de la PCR no se identifica el serotipo
infectante.
Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas constituyen el medio más ampliamente utilizado
para el diagnóstico de la leptospirosis, y la prueba de aglutinación microscópica (MAT) es la
prueba serológica estándar. Los antígenos seleccionados para su utilización en la MAT deben
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Capítulo 2.1.9. — Leptospirosis
incluir las cepas representativas de los serogrupos que existen en la región concreta, además de
aquéllos que se sabe que persisten en otra región en la especie hospedadora objeto de estudio.
La MAT se utiliza principalmente para diagnosticar la enfermedad en individuos y en rebaños.
Como prueba en un animal individual, es muy útil para diagnosticar una infección aguda: el
incremento de cuatro veces en los títulos de anticuerpos en los sueros pareados de animales con
infección aguda o convalecientes constituye un diagnóstico claro. Para la obtención de información
útil, se deben examinar al menos diez animales o el 10% del rebaño, el que mayor sea, y
documentar el historial de vacunación de los animales.
La MAT tiene limitaciones en el diagnóstico de la infección crónica en los animales aislados y en el
diagnóstico de las infecciones endémicas de los rebaños. Los animales infectados pueden abortar
o ser portadores renales y genitales mostrando títulos de MAT por debajo del título mínimo
significativo ampliamente aceptado de 1/100 (dilución final).
Los enzimoinmunoensayos (ELISA) también pueden ser útiles para la detección de anticuerpos
contra las leptospiras. Se han elaborado numerosos ensayos que se utilizan principalmente para la
detección de infecciones recientes y para la selección de animales experimentales que se emplean
en los estudios de infección. Los animales que han sido vacunados frente al serotipo pertinente
pueden dar resultados positivos en algunos ELISA, dificultando de esta manera la interpretación de
los resultados.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Las vacunas para uso veterinario son
suspensiones de uno o más serotipos de Leptospira spp. inactivadas de tal forma que la actividad
inmunógena se conserva. Aunque se ha probado una gama de vacunas experimentales basadas
en extractos celulares, las vacunas comerciales son, con pocas excepciones, productos con
células completas. Las leptospiras se cultivan en medios de cultivo adecuados que contienen a
menudo suero o proteínas del suero. En caso de utilizarse, el suero y las proteínas del suero
deben retirarse de los productos finales. Las vacunas pueden contener adyuvantes adecuados.
A. INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es una enfermedad transmisible de los animales y del hombre producida por la infección con la
espiroqueta Leptospira. Todas las leptospiras patógenas se clasificaron anteriormente como miembros de la
especie Leptospira interrogans; sin embargo, el género ha sido reorganizado recientemente y las leptospiras
patógenas ahora se clasifican en 17 especies y cuatro genomoespecies de Leptospira (14, 61, 71, 105). Hay más
de 200 serotipos diferentes de leptospira reconocidas que se clasifican en 23 serogrupos (52, 98).
El uso, la interpretación y el valor de los procedimientos de diagnóstico de laboratorio para la leptospirosis varían
según la historia clínica del animal o del rebaño, la duración de la infección y el serotipo infectante. Debe
sospecharse de leptospirosis aguda en los siguientes casos: aparición repentina de agalactia (en el ganado
lechero adulto y ovino); ictericia y hemoglobinuria, especialmente en los animales jóvenes; meningitis; y fallo
renal agudo o ictericia en los perros. La leptospirosis crónica debe considerarse en los siguientes casos: aborto,
mortinatos, nacimiento de animales débiles (pueden ser prematuros); infertilidad; fallo renal crónico o hepatitis
crónica activa en los perros; y casos de oftalmia periódica en los caballos. La localización y la persistencia de
leptospiras en el riñón y en el tracto genital de los machos y las hembras son dos secuelas microbiológicas
crónicas importantes de la infección por leptospiras que presentan problemas de diagnóstico concretos. Los
animales infectados crónicamente pueden ser portadores durante toda la vida y servir de reservorios de la
infección para otros animales y para los humanos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
La demostración de la presencia de leptospiras en la sangre y la leche de los animales que muestran signos
clínicos que sugieren leptospirosis aguda tiene un valor diagnóstico. Sin embargo, el aislamiento a partir de la
sangre no es siempre satisfactorio, porque la bacteriemia es pasajera y no siempre se acompaña de síntomas
clínicos. Con frecuencia, los perros se tratan con antibióticos antes de tomar las muestras para analizar la
presencia de Leptospira, lo que después disminuye la probabilidad de identificar el agente en la sangre. También
tiene valor diagnóstico la detección de una infección generalizada por leptospira en una serie de órganos
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tomados en la necropsia. Sin embargo, si el animal vive lo suficiente o se le ha tratado con antibióticos, puede
resultar difícil la detección sistémica de microorganismos intactos; en estos casos la inmunohistoquímica puede
ser particularmente útil en la identificación del antígeno residual de leptospiras. La demostración de la presencia
de leptospiras en el tracto genital, los riñones o la orina solo debe interpretarse considerando en conjunto los
síntomas clínicos y los resultados serológicos, ya que puede que estos hallazgos solo indiquen que el animal era
portador.
El fallo en la demostración de la presencia de leptospiras en la orina de un animal no es suficiente para descartar
la posibilidad de que este sea portador renal crónico; solo indica que el animal no excretaba cantidades
detectables de leptospiras en el momento del examen. La toma de orina después del tratamiento de los animales
con un diurético aumenta las posibilidades de detectar el microorganismo (63). En los casos importantes en los
que estén implicados animales aislados (por ejemplo, la autorización para que un caballo semental vuelva a
utilizarse como reproductor), las pruebas negativas de muestras de orina de tres semanas consecutivas se
considera una buena demostración de que el animal no elimina leptospiras por la orina.
La demostración de las leptospiras en los fluidos corporales o en los órganos internos (normalmente en el riñón,
el hígado, el pulmón, el cerebro o en las glándulas adrenales) de fetos abortados o nacidos muertos tiene valor
diagnóstico de la leptospirosis crónica de la madre, y es una evidencia de la infección activa del feto.
El aislamiento de leptospiras por personal experimentado es el método más sensible de la demostración de su
presencia, siempre que no haya residuos de antibióticos, que no haya autolisis avanzada del tejido, que los
tejidos se manejen con rapidez para realizar cultivos después de su recogida y, en el caso de la orina, que tenga
un pH adecuado. Si los tejidos o los fluidos no se pueden enviar al laboratorio inmediatamente para la realización
de un cultivo de leptospiras, la muestra se conservará a 4-5°C para impedir el crecimiento excesivo de otras
bacterias y la autolisis de las muestras de tejido. Como medios de transporte para el envío de las muestras,
deben emplearse un medio de cultivo líquido o una solución al 1% de albúmina sérica bovina (BSA) con 5fluorouracilo a una concentración de 100–200 µg/ml.
El cultivo debe realizarse en un medio semisólido (0,1–0,2% agar) con BSA o bien con Tween 80 (por ejemplo,
medio Tween 80/BSA o EMJH) (44) o con BSA y una combinación de Tween 80 y Tween 40 (30). La
contaminación se puede controlar añadiendo una serie de agentes selectivos, por ejemplo, 5-fluorouracilo (48),
ácido nalidíxico (49), fosfomicina (64) y una mezcla de rifamicina, polimixina, neomicina, 5-fluorouracilo,
bacitracina y actidiona (1). Sin embargo, el uso de agentes selectivos puede reducir las posibilidades de
aislamiento cuando solo haya un número pequeño de leptospiras viables, y algunas cepas de leptospiras no
crecerán en los medios selectivos que contengan múltiples antibióticos. La adición de suero de conejo al 0,4–1%
a un cultivo semisólido aumenta las posibilidades de aislar serotipos de leptospiras exigentes.
Los cultivos deben incubarse a una temperatura de 29 ± 1°C al menos durante 16 semanas y, preferiblemente,
durante 26 semanas (30). El tiempo que se requiere para la detección de un cultivo positivo varía con el serotipo
de leptospira y el número de microorganismos presentes en la muestra. Los serotipos menos exigentes (por
ejemplo, Pomona y Grippotyphosa) pueden dar resultados positivos muy pronto, entre 7–10 días después de la
inoculación; otros serotipos (por ejemplo, Hardjo y Bratislava) pueden tardar mucho más tiempo. Los cultivos
deben examinarse con un microscopio de campo oscuro cada 1–2 semanas. Es importante utilizar una fuente
luminosa de 100 vatios y un microscopio de campo oscuro de buena calidad.
La presencia de leptospiras se puede demostrar también mediante una serie de técnicas de tinción
inmunoquímicas, por ejemplo, la inmunofluorescencia (10, 31) y diversas técnicas inmunohistoquímicas (5, 33,
79, 81, 99, 106). Estas técnicas son útiles para diagnosticar la infección en material patológico que es
inadecuado para la realización de cultivos o donde se requiere un diagnóstico rápido. Puesto que el éxito de
estas técnicas depende del número de microorganismos presentes, son menos apropiadas para diagnosticar el
estado de portador crónico, donde el número de microorganismos puede ser muy bajo o localizado. Las
leptospiras no se tiñen bien con los colorantes de anilina, y las técnicas de tinción argéntica carecen de
sensibilidad y especificidad, aunque constituyen un complemento útil para el diagnóstico histopatológico (7).
Los ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se emplean en la actualidad en algunos
laboratorios de diagnóstico y en la mayoría de los laboratorios de referencia para la detección de leptospiras en
tejidos y fluidos corporales. Se han descrito diferentes juegos de cebadores para la realización de ensayos de la
PCR (3, 6, 13, 37, 39, 44, 50, 51, 54, 59, 60, 66, 84, 93, 97, 103), con algunos cebadores específicos para el
género Leptospira y otros diseñados para identificar solamente las especies patógenas. Estos ensayos no sirven
para identificar el serotipo infectante, aunque algunos juegos de cebadores pueden permitir la identificación de
especie o de serotipo si se secuencian los amplicones de la PCR. Este análisis adicional no es un método de
diagnóstico rutinario. Muchos de los cebadores se han diseñado y evaluado para emplearlos en los humanos en
vez de en animales y se carece de un acuerdo generalizado respecto a los cebadores de la PCR que se deben
utilizar para las pruebas con muestras animales. Por tanto, cada laboratorio es responsable de la validación
particular de la prueba usada para el tejido, el líquido y la especie analizada. Los ensayos de PCR pueden ser
bastante sensibles, pero la carencia de especificidad (es decir, resultados positivos falsos) puede representar un
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Capítulo 2.1.9. — Leptospirosis
problema. La presencia en las muestras clínicas de inhibidores de la amplificación puede originar falsos
negativos, especialmente en muestras de animales alteradas por la contaminación con heces o autolisis. El
control de calidad de los ensayos de PCR utilizados para el diagnóstico de la leptospirosis requiere una atención
especial en lo que se refiere al diseño y al volumen de trabajo del laboratorio para prevenir la contaminación de
los materiales y al uso de muestras control apropiadas (29, 57). Además, el procesamiento de la muestra para
PCR es decisivo y debe ser adecuado para el tejido, el fluido y la especie que se esté analizando. Un
procedimiento para la preparación de las muestras de orina para PCR en el que se emplean perlas magnéticas
recubiertas de anticuerpos antileptospira implica un aumento en la detección de leptospiras patógenas en la orina
(88).
La identificación de los aislamientos de leptospiras es un cometido de los laboratorios de referencia
especializados. Para realizar una identificación completa, debe utilizarse una combinación de procedimientos que
determinen: 1) si el aislamiento es un patógeno o un saprofito; 2) la especie de Leptospira a la que pertenece el
aislamiento y 3) el serogrupo y el serotipo del aislamiento. Un cultivo puro de leptospiras puede identificarse
como perteneciente a una especie patógena o saprofita mediante pruebas diferentes como la capacidad de
infectar animales, la resistencia relativa a la 8-azaguanina, la actividad lipasa, la tolerancia a la sal y a la
temperatura (46, 47), la amplificación del ADNr de 23S mediante PCR (102) y el contenido de G+C del ADN (46).
Se han identificado nuevas especies de leptospiras basándose en el análisis de hibridación de ADN–ADN (14,
71, 105). En estos análisis se utilizó, en la mayoría de los casos, la cepa tipo para cada serotipo; para unos
cuantos serotipos se han examinado también los aislamientos clínicos para determinar las designaciones de
nuevas especies. Los diferentes aislamientos pertenecientes a un único serotipo normalmente pertenecen a la
misma especie, pero este no siempre es el caso. La identificación de especies a partir de aislamientos de campo
todavía es engorrosa, pero puede hacerse mediante el análisis de secuencias del ADNr de 16S o mediante el
análisis genético de los genes de ARN ribosómico de 16S o 23S (17, 53, 61, 68, 70, 100, 101), por secuenciación
de varios loci génicos (4, 77), mediante la secuenciación del gen que codifica la subunidad B de la ADN girasa
(82), o por PCR usando cebadores ompL1 que son específicos de especie (73).
El serogrupo de las cepas pertenecientes a Leptospira puede diferenciarse mediante reacciones de aglutinación
cruzada (28). La diferenciación posterior del serotipo se realiza tradicionalmente mediante la absorción por
aglutinación cruzada, aunque para la mayor parte de los aislamientos esto se realiza ahora utilizando métodos
que requieren menos tiempo como son: el análisis del factor (28), los anticuerpos monoclonales (MAbs) (89, 90),
el análisis con las endonucleasas de restricción (43, 56, 91, 92), y diversas estrategias con PCR (17, 21, 26, 38,
61, 69, 70, 72, 75, 77, 78, 82, 83, 107, 108). Sin embargo, las pruebas basadas en la genética puede que no den
siempre los mismos resultados que la prueba de la absorción por aglutinación cruzada.
2.
Pruebas serológicas
Las pruebas serológicas constituyen el procedimiento de laboratorio utilizado con más frecuencia para confirmar
el diagnóstico clínico, para determinar la prevalencia en el rebaño y para realizar los estudios epidemiológicos.
Los anticuerpos de las leptospiras aparecen a los pocos días del comienzo de la enfermedad y persisten durante
semanas o meses y, en algunos casos, años. Desafortunadamente, los títulos de anticuerpos puede que
desciendan hasta niveles indetectables mientras los animales permanecen infectados crónicamente. Para
superar este problema, se necesitan métodos sensibles que detecten el microorganismo en la orina o en el tracto
genital de portadores crónicos.
Se ha descrito una amplia variedad de pruebas serológicas que muestran grados variables de especificidad de
serogrupo y de serotipo. La prueba de la aglutinación microscópica (MAT) y el enzimoinmunoensayo (ELISA)
contribuyen al diagnóstico veterinario.
a)
Prueba de aglutinación microscópica
La prueba MAT en la que se emplean antígenos vivos es la prueba serológica más ampliamente utilizada.
Constituye la prueba de referencia frente a la que se evalúan todas las otras pruebas serológicas y se utiliza
en las comprobaciones para la importación/exportación. Para obtener una sensibilidad óptima deben
emplearse antígenos representativos de todos los serogrupos conocidos que existen en la región en la que
se han encontrado los animales y, preferiblemente, cepas que representen a todos los serogrupos
conocidos. La presencia de un serogrupo normalmente viene indicada por la reacción frecuente en la
selección serológica pero solo puede identificarse definitivamente por el aislamiento de un serotipo
procedente de animales afectados clínicamente. Se puede mejorar la sensibilidad de la prueba utilizando
aislamientos locales en vez de cepas de referencia, pero las cepas de referencia ayudan en la
interpretación de los resultados entre los laboratorios.
La especificidad de la MAT es buena; normalmente los anticuerpos frente a otras bacterias no dan reacción
cruzada con Leptospira de manera significativa. Sin embargo, existen reacciones serológicas cruzadas
significativas entre serotipos y serogrupos de Leptospira y es probable que un animal infectado con un
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serotipo tenga anticuerpos frente al serotipo infectante que dé una reacción cruzada con otros serotipos
(normalmente a un nivel más bajo) en la MAT. Por tanto, la serología no puede utilizarse para identificar
definitivamente la identidad del serotipo infectante en una infección individual o en un brote, y requiere el
aislamiento del agente. Sin embargo, en áreas donde los serotipos de Leptospira presentes se han descrito
bien mediante estudios de aislamiento, el examen serológico de los animales infectados puede sugerir,
aunque no definitivamente identificar, el serotipo infectante. Además, los animales que han sido vacunados
contra la leptospirosis pueden tener anticuerpos frente a los serotipos presentes en la vacuna utilizada. Por
tanto, es especialmente importante considerar el historial de vacunación de los animales objeto de estudio.
Los dos métodos para la realización de la prueba se han descrito detalladamente (36,62).
Las estirpes seleccionadas deben cultivarse en Tween 80 BSA o en otro medio adecuado a 29 ± 1°C y el
cultivo debe tener al menos 4 días, pero no más de 8. Como antígenos se usan cultivos con densidades
aproximadas a 2 × 108 leptospiras por ml. La densidad del cultivo puede estimarse contando directamente
las células en una cámara de recuento de bacterias en un microscopio de campo oscuro. Alternativamente,
la densidad celular se puede establecer midiendo la transmitancia en un espectrofotómetro con filtro a
400 nm o por nefelometría. Si se emplean métodos indirectos, se debería correlacionar el número de
células bacterianas con las lecturas del instrumento específico empleado. El número de antígenos que se
utilizan es determinado, y se puede realizar una selección con una dilución del suero de 1/50 (o una dilución
de inicio diferente basada en el objetivo de la prueba). A cada pocillo se añade un volumen de cada
antígeno, igual al volumen del suero diluido, para hacer una dilución final del suero de 1/100 en la prueba
de selección. Las placas de microtitulación se incuban a 29 ± 1°C durante 2–4 horas, y se examinan
mediante microscopía de campo oscuro.
El título de punto final se define como la dilución de suero que muestra un 50% de aglutinación, dejando
libres un 50% de las células en comparación con un cultivo control diluido 1/2 en tampón fosfato salino. El
resultado de la prueba puede indicarse como el punto final de la dilución del suero (por ejemplo, como
1/100 o 1/400) o como un título que es el inverso de la dilución del punto final del suero (por ejemplo, 100 o
400). Muchos laboratorios realizan una prueba de selección a una dilución final del suero de 1/100 y
después vuelven a probar el suero con títulos de ≥100 para determinar un punto final mediante diluciones
dobles del suero, empezando con 1/100 hasta 1/12,800 o mayor.
La identidad de los antígenos es un factor crucial al realizar la MAT. Los antígenos deben evaluarse
respecto a su identidad utilizando sueros hiperinmunes de conejo, MAbs, o un método molecular que
confirme los pases a lo largo del tiempo, preferiblemente cada vez que se realiza la prueba, pero al menos
dos veces al año. El suero de conejo hiperinmune para este fin puede prepararse utilizando un protocolo
como el ofrecido por la Subcomisión de Taxonomía de Leptospira (45). Brevemente, se seleccionan conejos
sanos con un peso entre 3–4 kg que no tengan anticuerpos antileptospiras detectables. A cada conejo se le
administra una inoculación intravenosa de un cultivo vivo que haya crecido bien o de un cultivo clonado y
tratado con formalina con una densidad aproximada de 2 × 108 leptospiras/ml en una vena marginal de la
oreja. El cultivo debe hacerse en medio Tween 80 BSA o en otro medio apropiado. Se administran cinco
inoculaciones de 1, 2, 4, 6 y 6 ml a intervalos de 7 días. Una semana después de la última inoculaión, se
determina el título del anticuerpo homólogo mediante la MAT. Si el título es ≥1/12.800, se anestesia el
conejo y se sangra mediante punción cardiaca 7 días más tarde (es decir, 14 días después de la inyección
final). Si el título es <1/12.800, se administra otra inoculación de 6 ml de cultivo; 7 días después de esta se
determina de nuevo el título homólogo. El procedimiento debe repetirse con otro conejo a no ser que el
título sea ≥1/12.800. Para la preparación de cada antisuero se utilizan dos conejos. Si los títulos son
satisfactorios en ambos conejos, los sueros se pueden mezclar. Para mantener la potencia es preferible
liofilizar el antisuero en volúmenes de 2 ml y conservarlo a 2–5°C. Alternativamente, el suero se puede
conservar en volúmenes de 2 ml a –20°. Todas las inoculaciones a los animales deben ser aprobadas y
realizadas conforme a las normas establecidas para el bienestar animal. Se pueden considerar otros
protocolos de inmunización basados en el uso del antisuero concreto.
Debe comprobarse de forma regular la pureza de los antígenos utilizados en la MAT mediante el cultivo en
agar sangre y en caldo de tioglicolato. Los cultivos base de antígenos se pueden almacenar a –70°C o a
–80°C o en nitrógeno líquido. Puede que después de la liofilización haya una tasa de supervivencia baja de
leptospiras. El pase repetido de antígenos en medio de cultivo da lugar a una pérdida de antigenicidad. En
este caso, se debe hacer un nuevo cultivo líquido a partir del cultivo base.
Como prueba en un animal aislado, la MAT es muy útil en el diagnóstico de la infección aguda; tiene valor
diagnóstico la demostración de un aumento de cuatro veces en los títulos de anticuerpos en muestras de
pares de sueros procedentes de animales enfermos agudos y convalecientes. Además, un diagnóstico de
leptospirosis puede basarse en el hallazgo de títulos muy elevados en un animal con un cuadro clínico bien
definido. La prueba tiene limitaciones en la diagnosis de la infección crónica en animales individuales, tanto
en el diagnóstico de abortos (32) como en la identificación de portadores renales o genitales (30). Esto es
particularmente cierto en las infecciones por leptospiras adaptadas al hospedador, como por ejemplo en la
infección de ganado vacuno por el serotipo Hardjo. Cuando se toma como significativo un título de 1/100 o
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Capítulo 2.1.9. — Leptospirosis
superior, la sensibilidad de la prueba solo es del 41%, e incluso cuando el título significativo mínimo se
reduce a 1/10, la sensibilidad de la prueba solo es del 67% (30). Sirve de diagnóstico la demostración de
anticuerpos en la sangre fetal pero los títulos son con frecuencia muy bajos, por ejemplo 1/10, y se requiere
un procedimiento modificado de la prueba en la mayoría de los laboratorios.
Puesto que la leptospirosis es un problema de rebaño, la MAT tiene un uso mucho mayor como una prueba
de rebaño. Para obtener información útil, Cole et al. (17) sugirieron que se tomaran muestras de al menos
diez animales o del 10% del rebaño, la que mayor sea. En un estudio de la infección por Hardjo en el
ganado vacuno, Hathaway et al. (42) encontraron que normalmente una muestra de diez vacas indicaba la
presencia o ausencia de infección en un rebaño. El incremento en el tamaño de la muestra mejoraba
notablemente la información epidemiológica, las investigaciones de la enfermedad clínica y los rastreos
retrospectivos de salud pública.
Al hacer un diagnóstico serológico de la leptospirosis, deben tenerse muy en cuenta el serotipo infectante y
el estado clínico implicado. En el caso del aborto inducido por el serotipo Pomona en el ganado vacuno,
normalmente se encuentra un título alto en el momento del aborto, debido a que el incidente clínico tiene
lugar relativamente pronto después de la infección. El aborto en el ganado vacuno debido al serotipo Hardjo
es un hecho crónico; en este caso, la respuesta serológica en el momento del aborto es más variable,
apareciendo algunos animales seronegativos y otros que muestran títulos altos. El ganado vacuno puede
experimentar una caída en la producción de leche durante la fase aguda de la infección por Hardjo, y este
síntoma clínico está asociado con títulos altos. También debe tenerse en cuenta el historial de vacunación
al interpretar los resultados de la MAT, pues la vacunación extendida contribuye de forma importante al
número de animales seropositivos y puede enmascarar la presencia de infecciones crónicas en el rebaño,
en particular por el serotipo Hardjo.
b)
Enzimoinmunoensayo
Los ELISA para la detección de anticuerpos antileptospira se han elaborado empleando una serie de
preparaciones antigénicas diferentes, protocolos de ensayo y programas de ensayo que incluyen pruebas
en placa y pruebas con tiras reactivas. La información sobre los antígenos superficiales de Leptospira ha
sido revisada (25). En general, los ELISA son bastante sensibles, pero no tienen la especificidad de serotipo
de la MAT. En Europa se ha elaborado y evaluado un ELISA que cuantifica la IgG y la IgM caninas frente a
varios serotipos de leptospira (40, 41). En este ensayo se detecta IgM antileptospira tan solo 1 semana
después de la infección, antes de que estén presentes los anticuerpos aglutinantes. Los anticuerpos IgG se
detectan en los perros infectados, comenzando 2 semanas después de la infección, y persisten durante
largos periodos de tiempo. Por tanto, los perros con leptospirosis aguda tienen títulos de IgM altos y títulos
de IgG relativamente bajos; los perros que están vacunados o han tenido una infección previa por
leptospiras tienen títulos altos de IgG, pero bajos de IgM. Se han elaborado también ensayos similares para
la detección de anticuerpos bovinos, porcinos y ovinos antileptospira (2, 19, 24, 58, 74, 85–87, 94, 104). El
papel más importante asociado a ELISA en el ganado es la utilización de un ELISA de la IgM para la
identificación de infecciones recientes (24) y para la selección de rebaños en las regiones donde no se
practica la vacunación para la leptospirosis. Un ELISA de Ig total es útil en la identificación de animales muy
susceptibles que es conveniente para el trabajo de infección experimental (34). Se han elaborado también
ensayos ELISA para la detección de anticuerpos del serotipo Hardjo en la leche de vacas aisladas o en un
tanque de almacenamiento de leche. Estas pruebas han sido útiles en la identificación de rebaños
infectados por Hardjo. Sin embargo, los rebaños que están vacunados frente al serotipo Hardjo también
darán resultados positivos en estos diferentes ELISA disminuyendo su utilidad en las regiones donde la
vacunación es una práctica rutinaria. Se han elaborado nuevas pruebas de ELISA basadas en la detección
de anticuerpos contra proteínas superficiales o lipoproteínas de Leptospira (12, 27, 55, 65, 67) pero estas
pruebas no están todavía ampliamente disponibles.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
Las vacunas contra la leptospirosis para uso veterinario son suspensiones de una o más cepas patógenas de
Leptospira inactivadas de tal manera que se conserva la actividad inmunógena. Aunque se han probado vacunas
experimentales basadas en extractos celulares (9), las vacunas comerciales son, con pocas excepciones,
productos que contienen células completas. Las leptospiras se cultivan en medios de cultivo apropiados, que
pueden contener suero o proteínas del suero. En caso de utilizarse, el suero y las proteínas del suero deben
eliminarse del producto final. Las vacunas pueden contener adyuvantes adecuados.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se dan en el capítulo 1.1.8. Principios de producción
de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el capítulo 1.1.8 son de carácter genérico y pueden
complementarse mediante requisitos nacionales o regionales.
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Capítulo 2.1.9. — Leptospirosis
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Para la producción de vacunas es de suma importancia la selección adecuada de las cepas. La inmunidad
inducida mediante la vacunación es en gran medida específica de serotipo (18). Una vacuna debe
formularse para su uso en una especie concreta de animal de una región geográfica concreta. Solo debe
contener aquellos serotipos – y preferentemente aquellos genotipos – que causen problemas en la especie
animal, o que se transmitan de una especie animal a otra en la región. Las cepas seleccionadas para
utilizarlas de cultivo de inóculo original deben clonarse en un medio sólido para asegurar la ausencia de
contaminantes saprofitos de Leptospira y la uniformidad del cultivo.
Posteriormente, deben seleccionarse las cepas adecuadas por su capacidad para crecer con alto
rendimiento en las condiciones de cultivo de lotes.
b)
Métodos de cultivo
Cada cepa componente que se incluye en la vacuna final debe cultivarse por separado en medio líquido,
preferiblemente en medio libre de proteínas (8, 80) o bajo en proteínas (8).
El volumen de cada cultivo de inóculo original debe amplificarse mediante el crecimiento durante 2–10 días
a 29 ± 1°C en una serie de subcultivos hasta que se alcance un volumen suficiente para su uso como un
cultivo de inóculo de producción. Los cultivos deben airearse y agitarse cuando sea necesario.
En cada subcultivo del cultivo de inóculo original debe comprobarse su pureza y su crecimiento adecuado.
La pureza puede comprobarse mediante la inoculación del contenido de un asa del cultivo en placas de
agar sangre o en caldo de tioglicolato para su incubación a 37°C durante 2–5 días, y mediante el examen
de una extensión de precipitado del cultivo teñida con Gram. El crecimiento se puede examinar con un
microscopio de campo oscuro. Para garantizar la pureza y la homogeneidad, cada cultivo de inóculo de
producción también debe comprobarse frente a su antisuero de conejo homólogo (28). Los MAb también se
pueden utilizar para este fin.
c)
Validación como vacuna
Hay una gran cantidad de información sobre la eficacia de las vacunas contra la leptospirosis. En la mayoría
de los casos, las vacunas proporcionan una protección importante frente a la enfermedad producida por una
infección homóloga en las condiciones de campo.
Las vacunas son menos eficaces en la prevención de la infección en animales, y un porcentaje de los
animales vacunados se infectarán con el serotipo pertinente, y pueden eliminar el microorganismo en la
orina a pesar de no presentar síntomas clínicos de la enfermedad.
Los ensayos de eficacia y la validación de vacunas deben llevarse a cabo en la especie a la que se destina
la vacuna. La vacuna debe administrarse como se indica en la etiqueta, y debe comprobarse la inmunidad
mediante la infección con cepas de campo virulentas de cada serotipo por vías las naturales de infección,
es decir, mediante la infección conjuntival y/o vaginal. Los estudios de validación se han llevado a cabo con
frecuencia provocando la inmunidad mediante inoculaciones intravenosas o intramusculares de leptospiras.
Las vacunas validadas de esta forma no siempre han ofrecido protección frente a la infección de campo,
que tiene lugar por la exposición de las mucosas del ojo, la boca y el tracto genital a las leptospiras. Las
vacunas comerciales contra la leptospirosis que contienen el serotipo Hardjo no siempre protegen al
ganado de la infección conjuntival o de campo con el serotipo Hardjo (11). Se ha publicado un método para
la comprobación de la eficacia de las vacunas con serotipo Hardjo que especifica el uso de vías de
infección más naturales (35).
2.
Método de producción
La producción se lleva a cabo mediante el cultivo de lotes en fermentadores de tamaño apropiado. Estos deben
estar equipados con tomas para la adición estéril del cultivo de inóculo, aire y medio de cultivo. Deben contar
también con tomas para el muestreo de forma que puedan supervisarse la pureza y el crecimiento del cultivo de
producción.
Para la producción, se emplean preferentemente los medios bajos o libres de proteínas. Sin embargo, algunas
cepas requieren la presencia de una proteína animal para alcanzar rendimientos adecuados; esta se suministra
normalmente como BSA. Todos los componentes de los medios que no se degraden por el calor deben
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
7
Capítulo 2.1.9. — Leptospirosis
esterilizarse por calor. Esto reduce el riesgo de contaminación por las leptospiras saprofitas que lleva el agua,
que no son eliminadas mediante la esterilización por filtración.
Después de la adición del cultivo de inóculo, se puede supervisar el crecimiento del cultivo de producción a
intervalos frecuentes en relación al inicio de la fase logarítmica del crecimiento. Una vez observado esto,
entonces se agita y se airea el recipiente. El rendimiento final puede mejorarse con frecuencia mediante la
adición de más Tween 80 al cultivo cuando se observe por primera vez la ralentización en el crecimiento
logarítmico. Un crecimiento adecuado puede requerir hasta 10 días de incubación a 29 ± 1°C.
La inactivación se hace normalmente mediante la adición de formalina, pero también se ha utilizado el fenol, el
mertiolato y la inactivación por calor.
Después de un periodo adecuado de inactivación, el cultivo puede concentrarse y el material proteico superfluo
puede eliminarse mediante ultrafiltración. Después se pueden mezclar volúmenes iguales de las diferentes cepas
que se van a incluir en la vacuna final y añadir el adyuvante y el conservante, si se considera oportuno.
3.
Control del proceso
Durante el proceso de producción, deben tomarse submuestras de forma diaria o dos veces al día y supervisar el
crecimiento de las leptospiras y la ausencia de contaminantes. El crecimiento se supervisa contando leptospiras
en una cámara de recuento en un microscopio de campo oscuro o mediante un nefelómetro. La ausencia de
contaminación se puede establecer mediante el examen microscópico de preparaciones teñidas con Gram de un
cultivo centrifugado.
Inmediatamente antes de la inactivación, debe tomarse una muestra para su comprobación frente a sus
anticuerpos homólogos con una MAT. Debe comprobarse que el cultivo inactivado esté libre de leptospiras
viables. Esto se lleva a cabo inoculando alícuotas de cultivo inactivado en un medio de crecimiento apropiado
como el medio de Jonson & Harris (47), incubándolo a 29 ± 1°C durante al menos 4 semanas y examinándolo
semanalmente mediante microscopía de campo oscuro para detectar la presencia de leptospiras viables.
Después de realizar la mezcla, los niveles de agentes inactivantes libres, de minerales presentes en los
adyuvantes (como el aluminio) y conservantes (como el tiomersal) deben estar dentro de los límites prescritos.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las muestras seleccionadas de la vacuna completa deben examinarse para detectar la ausencia de
bacterias viables y de hongos (16, 22, 23, 95). En el capítulo 1.1.9 pueden encontrarse las pruebas para
comprobar la esterilidad y la ausencia de contaminación de los materiales biológicos.
b)
Inocuidad
Debe comprobarse la inocuidad de muestras procedentes del producto acabado. Los métodos para realizar
esto se han descrito en otro lugar (15, 22, 96). La prueba debe llevarse a cabo para cada vía de inoculación
indicada en la etiqueta y en dos animales sanos de cada categoría (por ejemplo, animales en gestación y
en ganado joven) a los que va dirigida la vacuna. Los animales deben ser susceptibles a los serotipos
contenidos en la vacuna y sus sueros deben estar libres de anticuerpos aglutinantes para esos serotipos. A
cada animal se le administra la vacuna a través de la vía recomendada con el doble de la dosis
recomendada, conforme se indica en la etiqueta. Los animales se observan durante 14 días y no deben
mostrar efectos adversos locales o sistémicos atribuibles a la vacuna.
c)
Potencia
Debe examinarse la potencia de las muestras de la vacuna completa en hámsteres o cobayas. La potencia
se mide normalmente por la capacidad de la vacuna para impedir la muerte del animal cuando se infecta
con 10--10.000 LD50 (dosis letal 50%). Con algunos serotipos que no son letales para el hámster o el
cobaya, como el serotipo Hardjo, la potencia se mide frente a la resistencia a la infección renal cuando los
animales se infectan con 10--10.000 ID50 (dosis infecciosa 50%) o mediante la inducción de un título de
anticuerpos adecuado en conejos.
Un ejemplo de protocolo consiste en inocular un 1/40 de la dosis de perro de la vacuna a diez hámsteres
sanos de no más de 3 meses. Después de 15–30 días, cada hámster vacunado y diez sin vacunar de la
misma edad, se inocula intraperitonealmente con una cantidad adecuada de un cultivo virulento de
leptospiras del serotipo utilizado para elaborar la vacuna (o una suspensión de tejido de hígado o riñón
8
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2.1.9. — Leptospirosis
tomado de un animal infectado experimentalmente). En el caso de las vacunas bivalentes, cada serotipo se
examina por separado. Para que la vacuna supere la prueba, al menos 8/10 animales vacunados deben
permanecer con buena salud durante 14 días después de la muerte de los controles. Otros protocolos
pueden referirse a vacunas para ganado vacuno y porcino que contienen cinco o seis componentes.
Las pruebas in-vitro de potencia para las vacunas contra la leptospirosis se están elaborando basándose en
la cuantificación del antígeno protector de la vacuna utilizando MAb en un ELISA de captura (76). Estos
ensayos se están estandarizando empleando vacunas de referencia y la correlación con ensayos de
potencia existentes en hámsteres o basados en anticuerpos y los datos de la eficacia diana–hospedador.
d)
Duración de la inmunidad
La duración de la inmunidad debe determinarse en la especie animal a la que la vacuna está dirigida,
empleando las vías naturales de infección (11). La inmunidad vacunal debe persistir al menos durante
6 meses o más, dependiendo de la indicación de la etiqueta.
e)
Estabilidad
Cuando las vacunas se almacenan en las condiciones prescritas, se espera que estas retengan su potencia
durante 1–2 años. La estabilidad debe evaluarse mediante la determinación de la potencia después del
almacenamiento a 4°C, a temperatura ambiente y a 37°C.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Véase la sección C.4.b.
b)
Potencia
Véase la sección C.4.c.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la leptospirosis (véase el cuadro de la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consúltese la página Web de la OIE para conseguir la relación más actualizada:
www.oie.int).
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