caracterización y expresión recombinante de una celulasa

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOTECNOLOGÍA
CARACTERIZACIÓN Y EXPRESIÓN RECOMBINANTE
DE UNA CELULASA DE ORIGEN ANTÁRTICO
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL EN
BIOTECNOLOGÍA
ROMELA MICHA MARÍN ALVARADO
PROFESOR GUÍA:
DRA. ORIANA SALAZAR
PROFESOR CO-GUÍA:
DRA. MARÍA ELENA LIENQUEO
PROFESOR INTEGRANTE:
DRA. ZIOMARA GERDTZEN
SANTIAGO DE CHILE
AGOSTO 2007
RESUMEN
Las celulasas son enzimas pertenecientes al grupo de las glicosil hidrolasas y son
responsables de la degradación de celulosa. Estas enzimas en la actualidad poseen
variadas aplicaciones en la industria biotecnológica. Una de las aplicaciones más
importantes es en la industria de detergentes. Con el fin de encontrar soluciones a la
búsqueda de detergentes más eficientes y económicos en el proceso del lavado, se
plantea la producción de celulasas activas a bajas temperaturas en forma
recombinante, lo que busca disminuir la temperatura de lavado utilizada actualmente y
permitir por lo tanto un ahorro, tanto energético como económico.
En el presente Trabajo de Memoria de Título se presenta la purificación,
caracterización y producción en forma recombinante de una celulasa de origen marino
antártico, denominada Cel3. La enzima se purificó desde el organismo productor
nativo mediante un método de tres etapas: precipitación con sulfato de amonio al
90 %, cromatografías de intercambio aniónico y de filtración en gel. En la
caracterización se obtuvo que la enzima pura es estable hasta pH 11 y que su pH
óptimo de reacción es 8. Su temperatura óptima de reacción es de 40 ºC aprox.,
decayendo la actividad drásticamente sobre los 50 ºC; es estable frente a un amplio
rango de temperaturas (20-45 ºC). Se concluye que esta enzima es adecuada para ser
utilizada en procesos de lavado a temperatura ambiente, ya que a 20 ºC retiene un
80 % de actividad, temperatura a la cual las enzimas de organismos mesofílicos
prácticamente no poseen actividad. La enzima posee un P.M de 35,7 kDa y un P.I de
aproximadamente 4,5. Los parámetros cinéticos KM, VMAX y Kcat son 10,8 mg/mL, 357
U/L y 5,6x10-3 s-1, respectivamente. Con las características encontradas, la celulasa
estudiada resulta prometedora para utilizarla como aditivo a detergentes. Por esta
razón se procedió a su expresión recombinante, paso importante para una futura y
posible comercialización.
La secuencia de Cel3 fue obtenida mediante la técnica de Genome Walking, la cual
permitió obtener la secuencia completa del gen. Se encontró un marco de lectura
abierto (ORF) de 1486 pb, que codifica para un péptido de 494 aa, en donde se
identificó la presencia de un péptido señal de 32 aa, un dominio catalítico y un dominio
de unión a celulosa, separados por una secuencia aminoacídica no estructurada.
2
Para la expresión recombinante se utilizó el sistema E. coli BL21(DE3)/pET22b(+).
Con dicho sistema se obtuvo una celulasa del tipo endoglucanasa, que mostró ser
activa a 37 ºC en ensayos en medio sólido.
Los objetivos de esta memoria se cumplieron en su totalidad. Los resultados de la
purificación y caracterización de Cel3 desde el organismo nativo y su producción en
forma recombinante en E. coli son un aporte al conocimiento de las endoglucanasas
de origen antártico y sus potenciales aplicaciones biotecnológicas.
3
INDICE DE CONTENIDOS
RESUMEN…………... .................................................................................................... 2
INDICE DE CONTENIDOS............................................................................................. 4
INDICE DE FIGURAS .................................................................................................... 6
INDICE DE TABLAS ...................................................................................................... 6
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................... 7
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................... 7
1
INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 8
1.1 ANTECEDENTES GENERALES........................................................................ 8
1.2 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ............................................................... 9
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1.2.6
Características de la Enzima Celulasa. ................................................................ 9
Aplicaciones Industriales de celulasas. .............................................................. 11
Características de microorganismos y enzimas psicrofílicas. ............................. 13
Aplicaciones biotecnológicas de enzimas adaptadas a bajas temperaturas..... 14
Celulasas activas a bajas temperaturas. ............................................................ 15
Expresión de genes psicrofílicos en Escherichia coli.......................................... 16
1.3 DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO Y SU JUSTIFICACIÓN .............................. 18
1.4 OBJETIVOS...................................................................................................... 19
1.4.1
1.4.2
2
Objetivo General. ............................................................................................... 19
Objetivos Específicos. ........................................................................................ 19
METODOLOGÍA ...................................................................................... 20
2.1 ESTRATEGIA DE TRABAJO............................................................................ 20
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................. 20
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
Cepas Bacterianas. ............................................................................................ 20
Reactivos. .......................................................................................................... 20
Enzimas de Restricción. ..................................................................................... 21
Vectores de clonamiento y expresión. ................................................................ 21
2.3 MÉTODOS........................................................................................................ 22
2.3.1
2.3.1.1
2.3.1.2
2.3.2
2.3.3
2.3.3.1
2.3.4
2.3.4.1
2.3.4.2
2.3.4.3
2.3.4.4
2.3.4.5
2.3.4.6
2.3.5
2.3.6
2.3.7
2.3.8
2.3.8.1
2.3.8.2
2.3.9
2.3.10
2.3.11
3
Obtención de la celulasa producida por bacterias antárticas.............................. 22
Cultivo a 4 y 20 ºC de las bacterias antárticas.................................................... 22
Purificación de la celulasa secretada por la bacteria antártica. .......................... 23
Determinación de Actividad celulasa. ................................................................. 24
Caracterización de la enzima celulasa producida por las bacterias antárticas. .. 25
Determinación de Parámetros Cinéticos. ........................................................... 26
Búsqueda de secuencias río arriba y río abajo del gen codificante para celulasa
mediante la tácnica de Genome Walking. .......................................................... 27
Diseño de partidores para la obtención de las secuencias río arriba y río abajo
del gen de Cel3. ................................................................................................. 27
Digestión del DNA genómico y elongación......................................................... 28
Construcción del oligo-adaptador. ...................................................................... 28
Construcción de la genoteca-adaptador. ............................................................ 28
Amplificación de los extremos 3’ y 5’ del gen de Cel3. ....................................... 29
Secuenciación y análisis de los extremos 3’ y 5’ del gen codificante para Cel3. 31
Diseño de partidores para el clonamiento del gen codificante para Cel3. .......... 31
Amplificación de DNA mediante PCR................................................................. 32
Digestión de producto de PCR y linearización del vector de expresión
pET22b(+). ......................................................................................................... 33
Ligación de fragmentos de DNA a vectores de clonamiento y expresión. .......... 33
Ligación en el vector de clonamiento pGEM-T Easy. ......................................... 33
Ligación en el vector de expresión pET22b(+). .................................................. 34
Clonamiento de los constructos en células E. coli DH5α................................... 34
Clonamiento de los plasmidios recombinantes en células de E. coli BL21(DE3).35
Pruebas de actividad celulasa extracelular......................................................... 35
RESULTADOS Y DISCUSION ................................................................ 36
3.1
CARACTERIZACIÓN BÁSICA DE LA CELULASA EN EL MICROORGANISMO
PRODUCTOR.............................................................................................................. 36
4
3.1.1
3.1.1.1
3.1.1.2
3.1.2
3.1.2.1
Obtención de la celulasa producida por bacterias antárticas.............................. 36
Cultivo a 4 y 20 ºC de las bacterias antárticas.................................................... 36
Purificación de la celulasa secretada por bacterias antárticas........................... 37
Caracterización de la enzima celulasa producida por las bacterias antárticas. .. 41
Determinación de Parámetros Cinéticos. ........................................................... 47
3.2 BÚSQUEDA DE SECUENCIAS FALTANTES DEL GEN CODIFICANTE PARA
CELULASA ....................................................................................................... 48
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
Diseño de partidores para la obtención de las secuencias río arriba y río abajo
del gen de celulasa. ........................................................................................... 49
Digestión del DNA genómico y elongación......................................................... 50
Construcción del oligo-adaptador y de la genoteca-adaptador........................... 50
Amplificación de los extremos 3’ y 5’ del gen de Cel3. ....................................... 51
Secuenciación y análisis de los extremos 3’ y 5’ del gen codificante para
celulasa. ............................................................................................................. 52
3.3 CLONACIÓN DEL GEN CODIFICANTE PARA CELULASA............................ 56
3.3.1
3.3.2
Diseño de partidores para el clonamiento del gen codificante para Cel3. .......... 56
Clonamiento del gen codificante para celulasa en el vector de expresión
pET22b(+). ......................................................................................................... 57
3.4 EXPRESIÓN DEL GEN DE LA CELULASA EN EL MICROORGANISMO
RECOMBINANTE ............................................................................................. 59
3.4.1
4
5
6
Prueba de actividad celulasa extracelular. ......................................................... 59
A
CONCLUSIONES .................................................................................... 62
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 64
ANEXOS .................................................................................................. 67
METODOLOGÍA ADICIONAL ........................................................................... 67
A.1
A.2
A.3
A.4
A.5
A.6
A.7
A.8
A.9
Determinación de la concentración de proteínas.......................................................... 67
Extracción de DNA Genómico desde bacterias............................................................ 67
Electroforesis de DNA .................................................................................................. 68
PCR de Colonias.......................................................................................................... 68
Electroforesis de proteínas SDS-PAGE ....................................................................... 69
Zimograma de Celulasas ............................................................................................. 69
Purificación de DNA a partir de geles de agarosa ........................................................ 69
Minipreparación de DNA plasmidial ............................................................................. 70
Preparación células electrocompetentes...................................................................... 70
B
Medios de Cultivos y Buffers............................................................................. 71
B.1 Medios Líquidos ........................................................................................................... 71
B.2 Medios Sólidos............................................................................................................. 72
B.3 Soluciones y Buffers..................................................................................................... 73
C
Curvas de Calibración....................................................................................... 75
C.1
C.2
C.3
C.4
Curva de Calibración BSA ........................................................................................... 75
Curva de Calibración DNS ........................................................................................... 75
Curva de Calibración Determinación Peso Molecular mediante Filtración por Gel....... 76
Curva Calibración de Crecimiento de Biomasa en Medio Marino al 0,5 % (p/v) CMC 77
D
Curva de Linealización según Dixon de curva de saturación ............................ 78
5
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Modelo de degradación de celulosa por un complejo natural multicompetente de
celulasa. ................................................................................................................... 10
Figura 2: Vectores de clonamiento y expresión utilizados en el trabajo de tesis...................... 22
Figura 3: Diagrama de la técnica de “Genome Walking” empleada para la obtención de la
secuencia 5’ y 3’ del gen codificante para la celulasa............................................... 30
Figura 4: Región de Clonamiento del vector de expresión pET22b(+). .................................... 32
Figura 5: Curvas de crecimiento microorganismo productor de la celulasa. ............................ 36
Figura 6: Cromatógrama de la etapa de Intercambio Anionico. ............................................... 38
Figura 7: Cromatógrama de la etapa de Intercambio Anionico. ............................................... 38
Figura 8: Análisis electroforético de las distintas etapas de la purificación de la celulasa........ 39
Figura 9: Zimograma de las distintas etapas de la purificación de la celulasa. ........................ 40
Figura 10: Efecto de la temperatura de reacción en la actividad específica de la celulasa.. .... 42
Figura 11: Estabilidad de la celulasa frente a la Temperatura. ................................................ 43
Figura 12: Efecto del pH de reacción en la actividad específica de la celulasa........................ 44
Figura 13: Estabilidad de la celulasa frente al pH. ................................................................... 45
Figura 14: Cromatógrama de filtración por gel de la celulasa para la determinación de su peso
molecular. ................................................................................................................. 46
Figura 15: Isolelectroenfoque de la celulasa nativa.. ............................................................... 47
Figura 16: Curva de saturación de la celulasa. ........................................................................ 48
Figura 17: Partidores para la amplificación de la secuencia 5’ y 3’ del gen codificante para
celulasa. ................................................................................................................... 49
Figura 18: AdaptHindIIITotal. ................................................................................................... 50
Figura 19: Análisis electroforético de los productos de PCR para la obtención del extremo 5’ y
3’ del gen codificante para celulasa. ......................................................................... 52
Figura 20: Secuencia Aminoácidica de la celulasa. ................................................................. 53
Figura 21: Análisis electroforético de los productos de PCR para la amplificación del gen
codificante para celulasa e inserción de sitios de corte. ........................................... 57
Figura 22: Análisis electroforético de las digestiones de las minipreparaciones. ..................... 58
Figura 23: Ensayo de actividad de celulasa extracelular. ........................................................ 60
Figura 24: Curva de Calibración BSA. ..................................................................................... 75
Figura 25: Curva calibración DNS para la detección de azúcares reductores.......................... 76
Figura 26: Curva calibración P.M en cromatografía de filtración por gel. ................................ 76
Figura 27: Curva de calibración de Biomasa. .......................................................................... 77
Figura 28: Linealización de curva de saturación según Lineweaver-Burk................................ 78
INDICE DE TABLAS
Tabla 1: Reactivos utilizados durante el trabajo de tesis.......................................................... 21
Tabla 2: Enzimas de restricción utilizadas durante el trabajo de tesis...................................... 21
Tabla 3: Tabla de Purificación de la Celulasa producida por el microorganismo nativo. .......... 40
Tabla 4: Partidores para la obtención de la secuencia 5’ y 3’ para el gen codificante para
celulasa. ................................................................................................................... 50
Tabla 5: Diferencias de residuos entre CelG y la Celulasa....................................................... 55
Tabla 6: Partidores para el clonamiento del gen codificante para celulasa en el vector de
expresión pET22b(+).. .............................................................................................. 57
Tabla 7: Buffers utilizados para el ensayo de actividad celulasa.............................................. 74
Tabla 8: Proteínas utilizadas para la construcción de la curva de calibración de peso molecular
y sus respectivos pesos moleculares........................................................................ 76
6
LISTA DE ABREVIATURAS
1Kpb
Marcador de peso molecular 1Kbp
Amp
Ampicilina
DNA
Ácido desoxirribonucleico
RNA
Ácido ribonucleico
RNAr
Ácido ribonucleico ribosomal
BSA
Seroalbúmina de bovino
dNTPs
Deoxiribonucleótidos trifosfato
OD
Densidad óptica
EDTA
Etilendiaminotetraacetato
CMC
Carboximetil Celulosa
CAPS
(3-[Cyclohexylamino]-1-propanesulfonic)
g
Fuerza de gravedad
gr
Gramo
h
Hora
IPTG
Isopropil tio-β-D-galactósido
KDa
Kilodalton
LB
Medio Luria-Bertani
M
Molar
MES
(2-[N-Morpholino] ethanesulphonic acid)
min
Minutos
mL
Mililitros
mM
Milimolar
MOPS
(3-[N-Morpholino] propanesulfonic acid)
PAGE
Electroforesis en gel de poliacrilamida.
pb
Pares de bases
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
pH
Potencial hidrógeno
rpm
Revoluciones por minuto
RNasa
Ribonucleasa
s
Segundo
SDS
Dodecil sulfato de sodio
TAPS
(N-tris[Hidroxymethyl]methyl-3-aminopronesulfonic acid)
TEMED
N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina
Tris (TRISMA)
Tris-(hidroximetil)-aminoetano
U
Unidad enzimática
UV
Radiación ultravioleta
V
Voltio
X-GAL
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
7
1
1.1
INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES GENERALES
El extraordinario progreso de la biotecnología industrial desde hace 10 a 20 años,
particularmente en biología molecular, ingeniería de proteínas y tecnología de
fermentación, ha resultado en el desarrollo de nuevas aplicaciones enzimáticas.
Actualmente las áreas industriales en donde se utilizan las enzimas son diversas, tales
como en la de los detergentes, la del papel y pulpa, en manufacturera textil, industria
del cuero, para la producción de combustible, producción de farmacéuticos, industria
de alimentos y alimenticia, cosmética, productos médicos y como herramientas para
investigación y desarrollo [1].
La tecnología enzimática es una de las tecnologías básicas de la biotecnología – el
gasto mundial de enzimas se cifra en varios miles de millones de dólares anuales. Los
procesos además de buscar la rentabilidad industrial y económica, buscan la
reducción de los costos sobre el medio ambiente, al disminuir el uso de productos
químicos contaminantes [2]. Sumándose a lo anterior, la búsqueda de la disminución
de costos en la eficiencia de los pasos de calentamiento/enfriamiento en los procesos
biotecnológicos y aumentos en la recuperación de productos a partir de reacciones
enzimáticas, hace aumentar el interés en las enzimas de los organismos extremófilos,
por ser funcionales en condiciones en que los otros no lo son; por consiguiente, su
utilización podría incrementar el rendimiento de los procesos industriales, reducir su
costo económico y seguir mejorando las condiciones del medio ambiente [3].
El uso de enzimas como aditivos en los detergentes representa la mayor aplicación de
la industria enzimática, ya sea en valor como en volumen [4]. Las enzimas contribuyen
a la remoción altamente eficiente de manchas de origen proteico, grasa y almidón,
mejorando el rendimiento del proceso de lavado a tiempos de ciclos menores.
Entre las enzimas utilizadas como aditivos para detergentes, se enfoca el interés en
las celulasas, del tipo endoglucanasas, las cuales marcaron un punto decisivo en la
historia de los detergentes por tener la habilidad de no digerir las hebras principales de
los tejidos, como el resto de las hidrolasas, si no que digieren la microfibrillas de éstos,
dándoles un aspecto a nuevo más duradero y colores nítidos por más tiempo [5].
8
Actualmente las enzimas utilizadas en los detergentes son del tipo mesófilo, las cuales
tienen temperaturas óptimas de catálisis de alrededor de los 60 ºC, lo que obliga un
aumento de temperatura del lavado para su óptimo funcionamiento [1]. Con el fin de
mejorar este proceso, en términos de una disminución de la temperatura y por
consiguiente un ahorro energético, nace el interés en las enzimas producidas por
organismos
psicrofílicos,
microorganismos
que
habitan
en
ambientes
con
temperaturas cercanas a la de congelamiento. En particular los mares antárticos
resultan ser una atractiva fuente de organismos que produzcan celulasas eficientes a
bajas temperaturas (20 ºC) y resistentes a las altas concentraciones salinas.
Para una óptima aplicación de las enzimas adaptadas a bajas temperaturas en la
industria de los detergentes, es necesario, su expresión en forma recombinante. La
técnica del DNA recombinante es actualmente la principal tecnología para el desarrollo
y manufactura de nuevas enzimas, con alta producción de enzimas purificadas a gran
escala y a costos competitivos, además de entregar enzimas mejoradas técnicamente
en términos de especificidad, pureza, estabilidad y propiedades bioquímicas [1].
Con dichos antecedentes se centrará la investigación de este proyecto en la
producción en forma recombinante de una celulasa producida por microorganismos
aislados de la región antártica chilena.
1.2
1.2.1
ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
Características de la Enzima Celulasa.
La celulasa es una glicosil hidrolasa, producida por hongos y bacterias, así como
también algunos animales. Esta enzima posee un rol muy importante en la biosfera, ya
que es responsable de la degradación de la celulosa, la que comprende la fuente de
carbono más abundante en la tierra. Este polímero es un homopolisacárido
(compuesto por un solo tipo de monómero) rígido e insoluble, que contiene hasta
cientos de miles de unidades de glucosa, unidas mediante enlaces del tipo β-1,4glucosídico.
Estas enzimas han sido clasificadas según
su actividad en: endoglucanasas, las
cuales hidrolizan los enlaces 1,4-β –glucosidicos en forma aleatoria en el interior de la
cadena; celobiohidrolasas o exoglucanasas, encargadas de hidrolizar los enlaces 1,4β- glucosidicos, liberando celobiosa desde los extremos no reducidos de la cadena; y
β-glucosidasas, que catalizan la hidrólisis de la celobiosa liberando β-D-glucosa. Los
9
dominios catalíticos de las celulasas se encuentran en 16 familias de glicosil
hidrolasas, entre las 108 familias existentes en la base de datos de CAZY
(Carbohydrate Active Enzymes, www.cazy.org) [6,7].
El proceso de degradación de la celulosa parece ser diferente para distintas especies,
especialmente entre microorganismos aeróbicos y anaeróbicos. Microorganismos
aeróbicos como Trichoderma reesei secreta una combinación de endoglucanasas y
celobiohidrolasas,
las
cuales
atacan
su
sustrato
individualmente
pero
sinergísticamente. Por otro lado, microorganismos anaeróbicos como Clostridium
cellulovorans,
Clostridium
cellulolyticum,
Clostridium
Josui,
y
Clostridium
thermocellum, producen complejos multienzimáticos extracelulares que tienen alta
actividad degradando celulosa cristalina [8].
La hipótesis más aceptada (Internacional Union of Biochemistry and Molecular Biology,
1992) sugiere que la hidrólisis comienza con endoglucanasas que hidrolizan los
enlaces 1,4-β-glucosidicos en la sección amorfa de la celulosa (Figura 1). Esto reduce
significativamente el grado de polimerización del sustrato y crea nuevos extremos de
cadenas que facilitan el acceso para las celobiohidrolasas que las separan en
unidades de celobiosa. Seguido a lo anterior, la β-glucosidasa hidroliza la celobiosa en
unidades de glucosa [9].
Figura 1: Modelo de degradación de celulosa por un complejo natural multicompetente de celulasa. CBH I y
CBH II (representado como círculos y triángulos, respectivamente) actúan en las extremidades de la cadena de
celulosa, mientras que la EG (mostrada como flechas) actúa en el polímero en la zona amorfa de la celulosa (mostrada
como las zonas zigzag). β-Glucosidasa (rombos) hidroliza la celobiosa (círculos dobles) a glucosa (círculos simples).
10
La mayoría de las celulasas exhiben una organización multimodular, donde dos
dominios funcionales son separados por un enlace flexible. Esta organización resulta
importante por aumentar la sinergia entre el dominio catalítico y el dominio de unión a
la celulosa (Carbohydrate Binding Domain, CBD) con su sustrato natural, ya que la
eliminación del enlace disminuye drásticamente la actividad enzimática sobre la
celulosa cristalina [10]. El rol específico de este dominio no está del todo claro pero se
le han atribuido un par de funciones: a) participar en la destrucción de la celulosa
interfiriendo con el empaquetamiento regular de las fibrillas; b) y/o aumentar la
concentración local del dominio catalítico al que están unidos. Se cree también, por
resultados experimentales, que dicho dominio es necesario para la secreción de la
enzima al medio extracelular [11].
Se han reportado estudios de estructuras tridimensionales que demuestran que en
celobiohidrolasas, provenientes de Trichoderma reesei (CBHI y CBHII) existen túneles
formados por hojas β paralelas en donde se encuentra el sitio activo, de esa forma la
celulosa puede acceder al sitio activo sólo desde uno de sus extremos de la cadena,
desde donde la enzima actúa progresivamente, liberando así las unidades de
celobiosa. La presencia de este túnel permite una interacción más cercana entre el
dominio catalítico y los extremos de la cadena que se encuentran en la superficie de
la celulosa cristalina. En contraste a las celobiohidrolasas, las estructuras de las
endoglucanasas, en particular el dominio catalítico de EGI, se asemeja más a un
pliegue abierto, donde se une el sustrato. Esto les permite interactuar con las zonas
amorfas o desordenadas de la celulosa cristalina en forma más eficiente [9].
1.2.2
Aplicaciones Industriales de celulasas.
Las celulasas y enzimas relacionadas son utilizadas en industrias alimenticias, de
cervecería, de vino, alimentación animal, textil, de detergentes, del papel, así como
también en la agricultura y en investigaciones [12]. Esta gran gama de aplicaciones
hacen a estas enzimas muy atractivas y demuestran su enorme valor comercial en la
industria biotecnológica.
Por ejemplo en la industria del papel, que alcanza ventas de millones de dolares en
Estados Unidos y Europa [2], las celulasas y hemicelulasas usadas en etapas de pretratamiento permiten una mejor deslignificación y ahorro en reactivos químicos en la
etapa posterior de blanqueamiento [13]. Las celulasas también mejoran la remoción de
11
tintas de papeles de diario viejos, dando mejores resultados que cuando se utilizan
químicos [14].
Por otro lado la industria del textil, se ha convertido en los últimos 14 años en una de
las principales áreas para las aplicaciones industriales de enzimas. Las celulasas
representan el mayor grupo de enzimas en esta industria, considerando el hecho que
cerca del 70 % de las fibras procesadas por esta industria son de celulosa. Las
aplicaciones más relevantes en esta área son: destinción de prendas para dar
apariencia de gastado, tratamiento de las telas para eliminar imperfecciones de las
fibras, preparación de la tela previa a tinciones o impresiones para obtener mayor
afinidad con los pigmentos y desfibrilación realizada antes y después del teñido [1].
Por otro lado las celulasas poseen diversas aplicaciones en la industria de la comida,
entre las cuales se destacan la habilidad de hidrolizar componentes de las paredes
celulares, con lo que se disminuye la viscosidad y se mantiene la textura en los jugos
de frutas. Además liberan antioxidantes de la fruta, lo que ayuda a controlar
enfermedades coronarias. Así mismo, se utilizan celulasas del tipo endoglucanasas
junto con xilanasas para la separación de gluten y almidón de la harina, gracias a la
hidrólisis de arabinoxilano y almidón [12].
En la industria de la cerveza y el vino las celulasas tienen diversas y atractivas
aplicaciones, una de ellas es en el proceso de producción de la cerveza, en donde las
celulasas del tipo endoglucanasa son utilizadas para la hidrólisis del enlace 1,4-βglucosídicos de las semillas de cebada, lo que reduce la viscosidad y libera azúcares
reducidos durante la primera fermentación. Con esto se obtiene un aumento de
eficiencia en dicha etapa, y en la etapa de filtración, y un mejoramiento en la calidad
de la cerveza. En la industria del vino, celulasas del tipo β-glucosidasa son utilizadas
para el mejoramiento del aroma del vino. Así mismo el uso de endoglucanasas es
conocido para el mejoramiento en las eficiencias de las etapas de maceración,
clarificación y filtración, así como también para a la obtención de un vino de mejor
calidad y estabilidad [12].
El uso de aditivos en los detergentes representa la mayor aplicación en la industria de
las enzimas. Las hidrolasas han sido un conjunto representativo de esta industria por
más de treinta años, entre ellas se pueden nombrar las proteasas, amilasas, lipasas y
celulasas. Éstas últimas han sido utilizadas desde hace 15 años en esta industria.
Primero fue una endoglucanasa alcalina de Bacillus sp. KSM-635, incluida en un
12
detergente de formulación tipo compacto por la compañía japonesa KAO en 1987 y
más tarde la endoglucanasa V de Humicola insolens, clonada y expresada en
Aspergillus oryzae, fue desarrollada como una enzima para detergente con el nombre
comercial de Carezyme®.
Contrariamente a las otras enzimas utilizadas en detergentes, la celulasa no degrada
manchas, si no que es activa en las fibras de celulosa de la ropa, alcanzando una o
más de los siguientes efectos:
•
Remoción de manchas de suciedad atrapada en las fibrillas de celulosa;
•
Suavidad permanente de la ropa;
•
Mejoramiento del color por la remoción de las pelusas formadas por las
fibrilación;
•
Desfibrilación con efecto antidepositante en la suciedad.
Así, los detergentes principalmente explotan una gran característica del complejo
celulasa, esto es como su capacidad de remover fibrillas de celulosa que deshilachan,
devolviendo el color y la apariencia original,
incluso después de reiterados lavados.
Adicionalmente se le suma la cualidad de no dañar el algodón u otros materiales de
celulosa de la ropa, manteniendo sin cambios la resistencia a la tensión de la tela.
La celulasa más comúnmente utilizada en esta aplicación es la del tipo
endoglucanasa, por ser capaz de actuar en las zonas amorfas de las fibras de
algodón, por lo que se asume que además contribuye indirectamente a la remoción de
suciedad atrapada en la región amorfa de las fibras de algodón. Las celulasas de
detergentes deben actuar en un amplio rango de pH, yendo desde pH 6 a hasta
alrededor de 10, deben también ser resistentes a surfactantes aniónicos, condiciones
de blanqueamiento, durante el tiempo que dura el lavado, así como también durante el
periodo de almacenamiento [1,5].
1.2.3
Características de microorganismos y enzimas psicrofílicas.
Organismos adaptados a ambientes fríos o psicrofílicos crecen a temperaturas
cercanas al punto de congelamiento y han colonizado exitosamente habitats fríos,
tales como regiones polares, mares profundos, zonas montañosas altas, etc. Este tipo
de zonas constituyen más de tres cuartos de la superficie terrestre y están expuestas a
temperaturas en forma permanente de alrededor a 5 ºC [15]. El poder crecer en este
13
tipo de ambiente le atribuye a los microorganismos psicrofílicos la ventaja de haber
enfrentado dos desafíos: primero, la baja temperatura, ya que cualquier disminución
en la temperatura afecta exponencialmente la tasa de reacciones bioquímicas
(Ecuación de Arrhenius, k=Ae-Ea/RT, donde A es el factor pre-exponencial, Ea es la
energía de activación, R la constante de los gases y T la temperatura absoluta en
Kelvin); y segundo, la viscosidad de ambientes acuosos, que aumenta por un factor
mayor que el doble entre 37 y 0 ºC [16]. A pesar del efecto negativo de las bajas
temperaturas en las reacciones bioquímicas, estos organismos respiran, crecen y se
mueven a tasas similares a aquellos que viven en ambientes temperados. Ellos, por lo
tanto, han desarrollado varias adaptaciones del tipo estructural al nivel de, por
ejemplo,
sus
membranas,
proteínas
y
enzimas
constitutivas,
permitiéndoles
compensar los efectos negativos de la temperatura [17].
Las enzimas activas a bajas temperaturas poseen una característica en común: todas
tienen una eficiencia catalítica alta, asociada sin embargo, a una baja estabilidad
frente a la temperatura. En las mayorías de los casos, la adaptación al frío es
alcanzada a través de una reducción en la energía de activación que posiblemente
origina un aumento en la flexibilidad, de ya sea una área en particular, como de toda la
proteína. Esta plasticidad mejorada parece inducir una estabilidad termal débil de las
enzimas adaptadas a bajas temperaturas. Este balance entre estabilidad y flexibilidad
representa uno de los puntos cruciales en la adaptación de la proteína a diferentes
temperaturas [18].
La flexibilidad es alcanzada por una combinación de factores estructurales, entre los
cuales se pueden incluir una reducción de centros hidrofóbicos, un menor número de
interacciones iónicas y electroestáticas, un aumento de residuos cargados en la
superficie que promueven el aumento de la interacción con el solvente, loops en las
superficies adicionales, sustitución de residuos de prolina por glicinas en los loops de
las superficies, una disminución en la razón arginina/lisina, menos interdominios con
interacciones entre subunidades y menos interacciones aromáticas [19].
1.2.4
Aplicaciones biotecnológicas de enzimas adaptadas a bajas
temperaturas.
La síntesis de productos farmacéuticos, químicos especializados, agroquímicos
y
otros, está usualmente amparada por procesos de producción de alto costo, y que
además sufren de baja selectividad y de la generación de productos secundarios no
14
deseados. Las enzimas mesofílicas no se adaptan, debido a las duras condiciones
requeridas en los procesos industriales, esto último debido a su falta de estabilidad.
Las enzimas adaptados al frío producidas por microorganismos psicrofílicos
despliegan una eficiencia catalítica alta a bajas temperaturas (20 ºC) que ofrece un
potencial considerable para la industria biotecnológica, como por ejemplo, en la
industria de detergentes y de comida, así como también en la producción químicos
finos [20].
Las dos propiedades de las enzimas psicrofílicas que tienen aplicación biotecnológica
más obvia, son su alta actividad catalítica a temperatura ambiente y su baja
termoestabilidad a temperaturas elevadas (sobre los 45 ºC). El principal beneficio es
que el uso de este tipo de enzima conlleva un ahorro energético, ya que no requieren
etapas de calentamiento, las cuales resultan ser costosas; funcionan en ambientes
fríos y durante la época de invierno; además de lo anterior proveen rendimientos de
reacción mejorados, se acomodan a altos niveles de estereoespecifidad, minimizan
reacciones químicas no deseadas que pueden ocurrir a temperaturas más altas y al
ser termolábiles se pueden inactivar fácilmente cuando el proceso lo requiera. La
propiedad de inactivación al calor tiene particular importancia en la industria
alimenticia, donde es importante prevenir cualquier modificación del sustrato, el que
puede ser sensible a cambios de temperatura, así como también para etapas de
proceso en secuencia (biología molecular), donde la acción de enzimas necesita ser
terminada antes de la siguiente etapa. Con enzimas adaptadas a bajas temperaturas
esto puede ser llevado a cabo por inactivación por calor en lugar de usar el método de
extracción con químicos. Ejemplos de aplicaciones comerciales y aplicaciones
biotecnológicas han sido listados y mencionados en literatura relacionada [19].
1.2.5
Celulasas activas a bajas temperaturas.
Hasta el momento se han publicado sólo dos celulasas activas a bajas temperaturas
del tipo endoglucanasa. Ambas son provenientes de bacterias identificadas como
Pseudoalteromonas [21, 22].La primera de ellas fue aislada de una bacteria antártica,
la cual fue identificada como Pseudoalteromonas haloplanktis. El gen codificante para
esta enzima (CelG) fue clonado, secuenciado y expresado en E. coli [21]. El segundo
caso corresponde a una celulasa, denominada CelX, que fue aislada desde una
bacteria psicotrópica, identificada como Psudoalteromonas sp. DY3, la cual fue
extraída de sedimentos profundos del océano pacífico. Al igual que el caso anterior el
15
gen codificante para dicha celulasa fue clonado, secuenciado y expresado en E. coli
[22].
Se encontró que ambas enzimas están fuertemente relacionadas en estructura con la
celulasa Cel5 de Erwinia chrysanthemi. Los resultados experimentales muestran a
ambas enzimas como celulasas neutras, pero siguen siendo óptimamente estables a
valores de pHs entre 8 y 9,5 para el caso de CelG, y 9 y 10 en el caso de CelX. La
actividad de ambas enzimas aumenta exponencialmente en temperaturas hasta los
40 ºC, pero sobre los 45 ºC se desvanece [21, 22]. En cuanto a la semejanza de las
secuencias a nivel de aminoácidos, CelX presenta un 95 % de identidad con CelG. Las
dos enzimas poseen 5 residuos en el dominio catalítico que son estrictamente
conservados entre las glicosil hidrolasas de la familia 5, por lo que sus dominios
catalíticos fueron clasificados dentro de ésta familia.
Además de estos dos casos, existe la publicación de una cellobiohidrolasa (cbh 1)
aislada de
Penicillium chrysogenum FS010, extraido del mar Huanghai. El gen
codificante se secuenció, se clonó y se expresó en Saccharomyces cerevisiae H158.
Se encontró homología con celobiohidrolasas de hongos pertenecientes a las glicosil
hidrolasas de la familia 7 y se determinó que su actividad óptima de reacción en el
extracto crudo fue de 35 ºC, ya que no se ha caracterizado en forma purificada [23].
A pesar de que los usos y aplicaciones de celulasas, así como también la producción
en forma recombinante de genes relacionados, han sido ampliamente investigados y
reportados, queda de manifiesto que el caso particular de celulasas adaptadas a bajas
temperaturas todavía está poco estudiado, y sigue abierto a nuevas investigaciones.
Es una razón más para ahondar en este tema, en donde las aplicaciones asociadas
son de gran importancia.
1.2.6
Expresión de genes psicrofílicos en Escherichia coli.
La fermentación a gran escala de microorganismos psicrofílicos sufre de dos grandes
inconvenientes: la baja tasa de producción por las cepas salvajes y los altos costos de
crecer microorganismos a bajas temperaturas. Una alternativa a lo anterior, es sobreexpresar el gen codificante para una proteína activa a baja temperaturas en un
huésped mesofílico.
16
Se ha encontrado que las propiedades de una enzima adaptada a bajas temperaturas
son preservadas cuando es expresada en un huésped mesofílico, siempre y cuando
se provea una temperatura lo suficientemente baja para permitir un correcto
plegamiento y evitar una denaturación irreversible, y a su vez una temperatura
compatible con el apropiado crecimiento del huésped y funcionamiento de la
maquinaria de expresión del mismo.
Para llevar a cabo lo anterior se propone como organismo huésped a la bacteria
Gram-negativa Escherichia coli, debido a que es capaz de producir en forma rápida y
económica proteínas recombinantes [24].
Uno de los ejemplos de expresión recombinante de proteínas psicrofílicas en un
huésped mesofílico es el caso de α-amilasa de Pseudoalteromonas Haloplanktis, la
cual fue expresada en E. coli. El sistema de expresión fue cultivado a una temperatura
de 18 ºC [25]. Además de lo anterior, como se mencionó en el punto 1.2.5 las dos
únicas celulasas activas a bajas temperaturas del tipo endoglucanasa descritas a la
fecha fueron expresadas en E. coli. Es por esto, que se cree que el utilizar como
organismo huésped E. coli, promete resultados exitosos en la expresión de una
celulasa aislada de bacterias antárticas.
17
1.3
DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO Y SU JUSTIFICACIÓN
En los últimos años diversos grupos de investigación han concentrado el interés en
enzimas adaptados a bajas temperaturas (eficiencia catalítica alta a temperatura
ambiente, 20 ºC) producidas por microorganismos psicrofílicos, las cuales ofrecen un
potencial considerable en la industria biotecnológica.
Una de las aplicaciones más importantes es la industria de los detergentes, en donde
el aporte de este tipo de enzimas se asocia a una disminución de gasto energético, ya
que su eficiencia a baja temperatura permite la remoción selectiva de manchas en la
ropa a temperaturas de lavado menores. Por ello producir una celulasa activa a baja
temperatura en forma recombinante, enzima ampliamente utilizada en los detergentes,
resulta un problema de vanguardia, en donde este proyecto pretende aportar a la
solución.
En este proyecto se pretende purificar, caracterizar, clonar y expresar una celulasa
psicrofílica producida por microorganismos aislados de la antártica chilena, etapas que
resultan ser indispensables para una posterior producción a nivel industrial.
A partir de una muestra de microorganismos de origen antártico, se han realizado
pruebas en el CIByB (Centro de Ingenieria Bioquímica y Biotecnología), que muestran
la producción por parte de ellos de enzimas con actividad de celulasa, en particular
actividad del tipo endoglucanasa, de diversas características. A partir de dichos
resultados se identificó una cepa con potenciales características compatibles para una
posterior aplicación en detergentes. Como primer paso se propone una purificación y
caracterización breve de la celulasa nativa. Gracias a la caracterización se
comprobará si la celulasa tiene efectivamente un perfil adecuado para utilizarla como
aditivo a los detergentes, de ser así pasa a convertirse en una enzima atractiva para
producir en mayores cantidades. Para ello es necesario obtener una celulasa
expresada en forma recombinante en un sistema de fácil manejo y que permite
producir grandes cantidades de la enzima en forma más económica. Con el fin de
obtener al gen de la celulasa en un sistema recombinante, se considera la
secuenciación del gen codificante para celulasa mediante PCR, su posterior
clonamiento en el vector de expresión pET22b(+) y su respectiva expresión
recombinante en células E.coli BL21(DE3).
18
Con las actividades contempladas en el proyecto se espera ofrecer una celulasa
recombinante activa a bajas temperaturas compatible para el uso en la industria de
detergentes, y así contribuir en la meta global de ofrecer a la sociedad detergentes
comerciales eficientes a temperaturas menores de lavado.
1.4
OBJETIVOS
1.4.1
ƒ
1.4.2
ƒ
Objetivo General.
Producir una celulasa activa a bajas temperaturas en forma recombinante.
Objetivos Específicos.
Estudiar las propiedades de una celulasa proveniente de un microorganismo
psicrofílico.
ƒ
Diseñar una estrategia de clonación.
ƒ
Llevar a cabo la clonación de los genes de la enzima.
ƒ
Expresar el gen de la celulasa en el microorganismo recombinante.
19
2
METODOLOGÍA
2.1
ESTRATEGIA DE TRABAJO
Se trabajó con una cepa bacteriana, aislada desde la región antártica chilena, que
crece eficientemente a 4 ºC. La cepa fue seleccionada por expresar una celulasa en el
sobrenadante del cultivo, del tipo endoglucanasa, con características de actividad a
pH alcalinos y con buena termoestabilidad, características que fueron encontradas en
ensayos preliminares. Dichas características resultan atractivas para una celulasa
recombinante que se quiera comercializar en la industria de los detergentes. Esta
enzima será denominada Cel3, ya que es la celulasa secretada por la cepa 3 de los
microorganismos existentes en el laboratorio.
La estrategia de trabajo, consistió en encontrar las condiciones que mejor permitan
producir volúmenes adecuados para una producción de enzima celulasa nativa, para
luego purificarla y caracterizarla. Se buscó el gen que codifica para la enzima
mediante la técnica Genome Walking.
El gen encontrado que codifica para la enzima celulasa fue clonado en el vector de
expresión pET22b (+) y la enzima se expresó en las células BL21 (DE3) de E. coli.
A continuación se muestra con mayor detalle la metodología utilizada:
2.2
MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1
ƒ
Cepas Bacterianas.
E. coli cepa DH5α, genotipo: F- Φ80dlacΔM15 Δ(lacaya-argF) U169 recA1
endA1 hsdR178rk-,mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1.
ƒ
2.2.2
E. coli BL21 (DE3), genotipo: F- ompT hsdSB (rB-mB+) gal dcm (DE3).
Reactivos.
Los reactivos utilizados durante el trabajo de tesis y el laboratorio proveedor se
detallan en la Tabla 1.
20
Tabla 1: Reactivos utilizados durante el trabajo de tesis.
Laboratorio
Promega (WI-USA)
Invitrogen (CA-USA)
Sigma (MO-USA)
Supelco
Pharmacia Biotech
Fermentas
Disco (DT- USA)
New England Biolabs (MA-USA)
Novagen, Madison (WI-USA)
Qiagen
Winkler
J.T Backer
Fermelo
Merk
2.2.3
Reactivos
Enzimas de restricción HindIII, BamHI y PvuII.
Taq DNA polimerasa, pGEM-T Easy
T4 DNA ligasa, estándar de tamaño molecular 100
Kb, dNTPs, cepa E. coli DH5α
X-GAL, IPTG, Reactivos MES, MOPS, TRIZMA,
TAPS, CAPS
Columna cromatográfica, SigmaChromTM GFC100
Columna Q-Sepharose HR 5/5
Estándar de tamaño molecular preteñido de
proteínas.
Triptona, extracto de levadura, medio LB, agar.
Enzima de restricción XhoI, Nde I.
pET22b(+), cepa E. coli BL21 (D3E).
Los sistemas de purificación de productos de
PCR, de DNA plasmidial y de extracción de DNA
desde geles de agarosa.
Tris, SDS, Glicerol
Cloruro de sodio.
Agarosa
El resto de las sales, ácidos, bases, bromuro de
etidio y solventes de grado analítico o de grado
biología molecular.
Enzimas de Restricción.
En la siguiente tabla se detallan las enzimas de restricción utilizadas y el tipo de corte
que producen.
Tabla 2: Enzimas de restricción utilizadas durante el trabajo de tesis.
Enzima Tipo de Corte Sitio de Reconocimiento (5’-3’)
Romo
CAGCTG
PvuII
AAGCTT
HindIII Cohesivo
Cohesivo
CATATG
NdeI
Cohesivo
CTCGAG
XhoI
2.2.4
Vectores de clonamiento y expresión.
Con el fin de obtener un alto número de copias de fragmentos de DNA, se utilizó el
vector de clonamiento pGEM-T Easy. Este vector se caracteriza por poseer una
timidina en el extremo 3’ de cada una de las hebras en el sitio de inserción lo que
permite la ligación de segmentos de DNA obtenidos por PCR que tienen una adenina
21
en el extremo 3’ de cada hebra debido a la acción de la Taq polimerasa. Para la
expresión de la proteína recombinantes en E. coli se utilizó el vector pET22b(+), el
cual produce una proteína recombinante unida por su extremo carboxi terminal a un
péptido de 6 histidinas que permite su posterior purificación (Figura 2).
Figura 2: Vectores de clonamiento y expresión utilizados en el trabajo de tesis: F1 ori: origen de replicación de
DNA de hebra simple derivado del bacteriofago F1. Ampr: gen de resistencia a ampicilina, T7: promotor para T7
polimerasa, LacI: gen que codifica el represor lac, lacZ, región codificante para la β-galactosidasa interrumpida por el
sitio de clonamiento. Ap: secuencia codificante para bla, contiene la región codificante para la β-galactosidasa
interrumpida por el sitio de clonamiento. (A) pET-22b(+), contiene una secuencia codificante para un péptido de
polihistidinas y el promotor y terminador T7. (B) Vector pGEM-T Easy posee una timidina en el extremo 3’ de cada una
de las hebras en el sitio de inserción para la ligación de segmentos de DNA obtenidos por PCR.
2.3
MÉTODOS
2.3.1
Obtención de la celulasa producida por bacterias antárticas.
2.3.1.1 Cultivo a 4 y 20 ºC de las bacterias antárticas.
Se tomó un inóculo de la reserva de la cepa 3 de bacterias antárticas de placas con
medio Marino 2216 (Anexo B.2 parte c), conservadas a 4 ºC, y se traspasó a un
cultivo de 5 mL de medio Marino 2216 al 0,5 % (p/v) Carboximetil Celulosa (CMC)
estéril (Anexo B.1 parte d). Este cultivo se incubó con agitación orbital a 4 ºC durante 4
días. Se transfirió 100 µL de este cultivo a 2 matraces con 100 mL del mismo medio y
se incubaron a 4 y 20 ºC respectivamente, ambos con agitación orbital. Para medir el
crecimiento celular y la actividad celulasa del sobrenadante a cada cultivo, se tomaron
muestras de 1 mL cada 2 horas en condiciones de esterilidad. Para la medición de
biomasa se midió la densidad óptica a 600 nm, la cual se encuentra relacionada con
la concentración de biomasa por curva de calibración (Anexo C.4). Se realizó un
ensayo de actividad celulasa en medio líquido, el que consiste en la determinación de
azúcares reductores liberados a partir de la hidrólisis del sustrato soluble CMC. Para la
22
cuantificación de los azúcares reductores se utilizó ácido dinitrisalisílico (DNS). El
producto proveniente de la reducción de DNS (Anexo B.3 parte c) se midió por
espectrofotometría a 550 nm en un lector de placas. El ensayo consistió básicamente
en los siguientes pasos:
1. Se centrifugó 1 mL de cultivo a 13.000 rpm por 5 minutos. (Centrifuga
Eppendorf 5403 de Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania).
2. 50 ul de sobrenadante se mezclaron con 50 µL de carboximetil celulosa (CMC)
al 1 % (p/v), disuelta en buffer Etanol Amina 25 mM pH 10. Se incubó la
muestra a 37 ºC por 45 min. con 700 rpm de agitación.
3. A 50 ul de la reacción se adicionó 50 µL de DNS y se procedió a incubar a
100 ºC por 10 min.
4. Se incubó un par de minutos en hielo, para luego traspasar 50 µL de muestra a
una micro placa Falcon de 96 pocillos.
5. Se leyó la absorbancia a 550 nm en un lector de placas (Anthos 2010).
2.3.1.2 Purificación de la celulasa secretada por la bacteria antártica.
Se cultivó el inoculo de la bacteria de acuerdo a lo descrito en el punto 2.3.1.1. Se
transfirieron 500 µL de este cultivo a 500 mL del mismo medio, los cuales se incubaron
a 4 ºC durante 4 días.
Posteriormente el cultivo se centrifugó por 30 min a 8.500 rpm a 4 ºC (centrifuga
Sorvall® RC-28S y rotor GS-3 Sorvall®, DuPont, CT, USA). El sobrenadante se
precipitó con sulfato de amonio (NH4)2SO4 al 90 % (p/v). La mezcla se agitó durante 1
hora en hielo. Se dejó reposar por 30 min y se centrifugó a 8.500 rpm por 45 min
(centrifuga Sorvall® RC-28S y rotor GS-3 Sorvall®, DuPont, CT, USA). El sedimento
se resuspendió en 3 mL de buffer Tris-HCl 20 mM pH7, para ser dializado durante toda
la noche a 4 ºC incubado en el mismo buffer de resuspensión.
La muestra dializada fue sometida a purificación cromatográfica. En una primera etapa
se realizó una cromatografía de intercambio aniónico y luego una filtración por gel.
Para la cromatografía de intercambio aniónico (IEX) se usó una columna Q-Sefarosa
(Column HR 5/5, Pharmacia Biotech, de dimensiones 5 cm x 5 mm, Resina QSepharose Fast Flow, Code Nº 17-0510-01) de 1 mL y un flujo de 0,5 mL/min, con un
gradiente escalonado creciente de Buffer B, correspondiente a Tris 20 mM 1 M NaCl
23
pH 7, en donde el primer gradiente fue hasta un 15 % con una largo de 5 volúmenes
de columna; el segundo gradiente aumentó la sal hasta un 35 % en 20 volúmenes de
columna y finalmente el tercero terminó en un 100 % de sal en 5 volúmenes de
columna. Se buscó actividad celulasa en las fracciones, siguiendo el procedimiento
antes descrito para el ensayo de actividad (sección 2.3.1.1), usando en este caso 50
µL de muestra proveniente de cada una de las fracciones cromatográficas. Las
fracciones que presentaron actividad celulasa positiva, se juntaron y
fueron
concentradas en Centriplus (Amicom), los cuales fueron centrifugados durante 6 h a
4.800
rpm (centrífuga Sorvall® RC-28S y rotor F-24 Sorvall®, DuPont, CT, USA)
lográndose una concentración de 10 veces. En la filtración por gel se utilizó una
columna Supelco GFC 100 (Supelco, SigmaChromTM, Gel Filtration HPLC Column,
13,25 mL de 300 x 7,5 mm) con un flujo de elusión de 0,08 mL/min al 100 % de buffer
Tris 50 mM 0,1 M NaCl pH 7,5 en 1,5 volúmenes de columna.
Los peacks de interés obtenidos en las cromatografías fueron analizados en
electroforesis en gel de poliacrilamida 12,5 % (p/v) en condiciones denaturantes para
determinar la pureza de las fracciones, según el protocolo descrito en el Anexo A.5
[26]. También se analizaron mediante zimogramas, siguiendo el protocolo descrito en
Anexo A.6. Para la cuantificación de la concentración de proteínas totales se utilizó el
método de Bradford de acuerdo a lo descrito en Anexo A.1. Las fracciones con mayor
grado de pureza se mantuvieron a 4 ºC para su posterior uso.
2.3.2
Determinación de Actividad celulasa.
A partir de muestras de celulasa purificada según el protocolo descrito en 2.3.1.2, se
determinó la cantidad de azúcares reductores liberados a partir de la hidrólisis de un
sustrato soluble CMC. Para la cuantificación de los azúcares reductores se utilizó
DNS. El producto proveniente de la reducción de DNS se midió por espectrofotometría
a 550 nm.
Los pasos del ensayo estándar de actividad en medio líquido son los siguientes:
1. 75 µL de celulasa (0,005 mg/mL) en buffer pH 7 (Anexo B.3 parte l) se
mezclaron con 75 uL de buffer pH 7 al 1 % de CMC.
2. A tiempo 0 min se toma una alícuota de 50 µL de la reacción. Se adicionó 50
uL de DNS y se procedió a incubar a 100 ºC por 10 min.
24
3. Se incubó un par de minutos en hielo, para luego traspasar 50 uL de muestra a
una micro placa Falcon de 96 pocillos.
4. Se leyó la absorbancia a 550 nm en un lector de placas (Anthos 2010).
5. Se incubó la muestra restante a 20 ºC por 40 min con 700 rpm de agitación.
6. Al tiempo 40 min a 50 uL de la reacción se adicionó 50 uL de DNS y se
procedió a incubar a 100 ºC por 10 min.
7. Se incubó un par de minutos en hielo, para luego traspasar 50 uL de muestra a
una micro placa Falcon de 96 pocillos.
8. Se leyó la absorbancia a 550 nm en un lector de placas (Anthos 2010).
Se calculó la actividad celulasa con la siguiente relación y la curva de calibración de
DNS (Anexo C.2).
Actividad = (
( Abs tiempo 40 − Abs tiempo 0 ) − n)
t rx
) × 1000 m
(1)
En la formula (1) n y m corresponden al intercepto y la pendiente de la curva de
calibración respectivamente (Anexo C.2), trx al tiempo de duración de la reacción, y se
multiplica por 1000 para obtener la actividad en µmoles/(min·L). Considerando la
concentración de proteínas de cada muestra se calculó la actividad específica. La
unidad enzimática se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 uMol
de glucosa, desde el sustrato utilizado, por minuto, a 20 ºC, de la siguiente forma:
Actividad ⋅ Específica = Actividad
[Pr oteína]Total
(2)
De esta forma la formula (2) entrega el valor de Actividad Específica en [U/mg].
2.3.3
Caracterización de la enzima celulasa producida por las bacterias
antárticas.
Se analizó el efecto de la temperatura y del pH sobre la actividad específica. El ensayo
de actividad se realizó a diferentes temperaturas y distintos valores de pH (el buffer
con CMC al 1 % (p/v) se preparó a diferentes pH, Anexo B.3 parte l).
Además se analizó la estabilidad de la celulasa frente a la temperatura y el pH. Para
ello la enzima purificada se preincubó a diferentes temperaturas durante 10 min y
posteriormente se midió la actividad residual a la temperatura máxima de actividad. A
25
su vez la estabilidad frente al pH se estimó preincubando 24 horas a 4 ºC la celulasa
en soluciones con diferentes pH y se realizó posteriormente el ensayo de actividad
estándar al pH óptimo de actividad, para finalmente calcular la actividad residual al pH
máximo de actividad. La actividad relativa se calculó de la siguiente forma:
Actividad Re lativa = Actividad Re sidual
ActividadMáxima
(3)
Donde la Actividad Residual corresponde a la actividad obtenida después del ensayo
de actividad habiéndola incubado previamente, ya sea a diferentes temperaturas o a
soluciones a distintos pHs. La Actividad Máxima corresponde a la mejor actividad de
la enzima obtenida en el ensayo estándar con la pre-incubación.
Se determinó la masa molecular con cromatografía de filtración por gel en una
columna Supelco GF100, relacionando el volumen de elusión a su peso molecular con
la curva de calibración (Anexo C.3), realizada con proteínas de peso molecular
conocidos. El P.I se determinó mediante isoelectroenfoque en el equipo PhastSystem
(Pharmacia Biotech) con un gel PhasGelTM IEF 3-9 (Amersham Pharmacia Biotech AB,
Suecia), siguiendo las instrucciones del proveedor para el procedimiento “Sensitive
Silver Stain” (Ficha Nº210).
2.3.3.1 Determinación de Parámetros Cinéticos.
Para la determinación de los parámetros cinéticos se utilizó el ensayo de actividad
descrito anteriormente, pero con diferentes concentraciones de CMC, las cuales se
encontraban en el rango de 0,1 a 10 mg/mL. Se consideró que la enzima seguía un
comportamiento de Michaelis Menten. Se utilizó la linealización descrita por Dixon, la
cual grafica s/v vs. s, en que s es la concentración de sustrato y v corresponde a la
velocidad de reacción. La ecuación de la recta queda descrita como sigue:
⎛ s ⎞ ⎛⎜ K m
⎜ ⎟=⎜
⎝ v ⎠ ⎝ Vmax
⎞ ⎛ 1
⎟⎟ + ⎜⎜
⎠ ⎝ Vmax
⎞
⎟⎟ × s
⎠
(4)
26
La pendiente de la recta queda determinada por el coeficiente 1/VMAX y el intercepto
con el eje y corresponde al inverso de KM/VMAX, además la prolongación de la curva,
hasta que s/v es igual a cero, corresponde a -KM.
2.3.4
Búsqueda de secuencias río arriba y río abajo del gen codificante para
celulasa mediante la tácnica de Genome Walking.
La técnica de Genome Walking estandarizada en el laboratorio (CIBYB, Facultad de
Ciencias Físicas y Matemática, Universidad de Chile), consiste básicamente en
amplificar secuencias adyacentes de DNA genómico a segmentos de secuencias
conocidas. Esta técnica se puede resumir en 5 etapas importantes [26]:
1. Diseño de partidores y adaptadores para la obtención de la secuencia río arriba
y río debajo de un fragmento del gen de celulasa ya secuenciado.
2. Digestión del DNA genómico con enzimas de restricción, las cuales deben
producir extremos romos o cohesivos con el extremo 5’ saliente, para luego
elongar los fragmentos producidos, mediante el uso de la Taq DNA polimerasa
que agrega una adenina a los extremos 3’ de cada fragmento.
3. Construcción de un oligo-adaptador de doble hebra que contiene una timidita
no apareada en un extremo 3’.
4. Ligación del oligo-adaptador con los fragmentos de DNA, con lo que se obtiene
una genoteca-adaptador.
5. Amplificación de cada uno de los extremos.
A continuación de detalla la metodología de cada uno de las etapas.
2.3.4.1 Diseño de partidores para la obtención de las secuencias río arriba y
río abajo del gen de Cel3.
Se diseñaron partidores específicos a partir de un segmento de gen parcialmente
codificante para una celulasa descrita en el laboratorio mediante la técnica de PCR y
diseño de partidores degenerados, los cuales a su vez se diseñaron en base a
secuencias conservadas entre secuencias de genes de celulasa.
27
2.3.4.2 Digestión del DNA genómico y elongación.
Se digirió el DNA genómico de la cepa aislada en el laboratorio, el cual se purificó
según el protocolo descrito en Anexo A.2, con las enzimas de restricción PvuII y
HindIII, con los respectivos buffer recomendados por el proveedor. La reacción se
formó con 6 µL de DNA genómico purificado (1 µg de DNA aprox.), 2 µL de Buffer 10X
y 1 U de enzima. Se completó con agua Milli-Q estéril hasta un volumen final de 20 µL.
La reacción se incubó por 3 horas a 37 ºC.
Para la elongación de los extremos de los segmentos obtenidos con la digestión
enzimática y para la obtención de una adenina en los extremos 3’, se incubó 15 µL de
DNA digerido y purificado con 10 µL buffer Taq 5X, 1,375 µL de 10 mM dNTPs, 4 µL
de MgCl2, 0,8 µL de Taq Polimerasa y se completó con agua Milli-Q estéril hasta un
volumen final de 50 µL. La reacción se incubó a 70 ºC por 45 minutos.
2.3.4.3 Construcción del oligo-adaptador.
Se construyó un oligo-adaptador, el cual incluye 6 sitios de restricción, mediante la
hibridización de los oligonucleotidos desfosforilados AdaptHindIII y AdaptHindIIIR,
calentando 5 minutos a 95 ºC una solución 10 mM de cada uno, y enfriando
lentamente en agua hirviendo hasta llegar a temperatura ambiente.
Con el alineamiento se obtiene el adaptador de doble hebra AdaptHindIIItotal. Este
adaptador posee una timidina no apareada en uno de sus extremos 3’.
2.3.4.4 Construcción de la genoteca-adaptador.
Para la construcción de la genoteca-adaptador, que corresponde al DNA genómico
digerido unido al oligo-adaptador en sus extremos, se procedió a ligar 6 µL de la
mezcla de fragmentos de DNA elongados con la adenina no apareada en los extremos
3’ con 15 pmoles del adaptador AdaptHindIIItotal, 2 µL de buffer 5X y 1 U de T4 DNA
ligasa, completando un volumen total de 10 µL. La reacción se incubó a 16 ºC por 16
horas.
28
2.3.4.5 Amplificación de los extremos 3’ y 5’ del gen de Cel3.
Para la amplificación del extremo 3’, se utilizó el partidor específico Cell3R1 y para el
extremo 5’ Cell3F1. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 µL,
con concentraciones finales de 1,9 mM de MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 µM de partidor
especifico, 4 µL de buffer Taq 5X, 5 µL de la genoteca-adaptador diluida 10 veces y
0,3 µL de Taq Polimerasa. Las condiciones térmicas de los ciclos de PCR fueron: 1
ciclo a 94 ºC por 1 min, 25 ciclos de 94 ºC por 32 s y 68 ºC por 5 min, y un ciclo
adicional de 70 ºC por 7 min. Las reacciones fueron llevadas a cabo en el
termociclador Eppendorf Master Cycler Gradient.
El producto de PCR fue diluido 10 veces, 3 µL de esta dilución se utilizaron como
templado para el segundo PCR.
La segunda reacción de amplificación se llevo a cabo en un volumen total de 20 µL, en
donde las concentraciones finales fueron: 1,9 mM de MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 µM
de partidor especifico, para el extremo 3’ se utilizó el partidor específico Cell3R2 y para
el extremo 5’ Cell3F2, 0,2 µM del partidor específico para el oligo-adaptador AdapTF2,
4 µL de Buffer Taq 5X, 3 µL del producto del primer PCR diluido y 0,3 µL de Taq
Polimerasa. Las condiciones térmicas de los ciclos de PCR fueron: 1 ciclo a 94 ºC por
1 min, 35 ciclos de 94 ºC por 32 s y 68 ºC por 5 min, y un ciclo adicional de 70 ºC por
7 min.
El producto de la amplificación fue observado en un gel de agarosa al 1 % (p/v) y fue
purificado desde éste (Anexo A.7); se ligó (Sección 2.3.8) al vector de clonamiento
pGEM-T Easy. El producto de ligación se utilizó para transformar células de E. coli
DH5α, utilizando el mismo protocolo descrito en la Sección 2.3.9, pero con la
diferencia de que en este caso, las placas utilizadas contenían Ampicilina 100 μg/mL,
IPTG 0,1 μM y X-Gal 80 mg/mL. Finalmente se realizó una minipreparación de DNA
plasmidial (Anexo A.8) de las colonias recombinantes que resultaron positivas en el
PCR de colonias (Anexo A.4) (con inserto), para su posterior secuenciación.
Una ilustración de las etapas de amplificación del procedimiento Genome Walking se
puede apreciar en la Figura 3.
29
Figura 3: Diagrama de la técnica de “Genome Walking” empleada para la obtención de la secuencia 5’ y 3’ del
gen codificante para la celulasa. Este esquema muestra la amplificación del extremo 5’ del gen desde un fragmento
de secuencia conocida. Después de la digestión de DNA genómico con las enzimas de restricción, éste se somete a la
elongación de los extremos con Taq polimerasa, la cual tiene la capacidad de dejar una adenina en el extremo 3’.
Luego se liga el adaptador AdaptHindIITotal, el cual contiene una timidina desapareada. El primer PCR realiza un
enriquecimiento lineal del extremo del gen con un partidor específico (Cell3R1 o Cell3F1 para el extremo 3’ y 5’
respectivamente). Luego se realiza un segundo PCR, utilizando como templado el producto del primer PCR, en el cual
se realiza la amplificación exponencial del extremo del gen utilizando el primer que se encuentra más central que el
primer partidor utilizado (Cell3R2 o Cell3F2 para el extremo 3’ y 5’ respectivamente) y AdaptF2, el que se une a una
región en AdaptHindIIITotal.
30
2.3.4.6 Secuenciación y análisis de los extremos 3’ y 5’ del gen codificante
para Cel3.
Los constructos en pGEMT-Easy, con los insertos correspondientes a los extremos 3’
y 5’ del gen codificante para Cel3, se mandaron a secuenciar a Macrogen S.A.
(Corea). Las secuencias obtenidas se analizaron con el software Omiga 2.0, en donde
se construyó la secuencia completa del gen. Además se comparó la secuencia
obtenida con secuencias de genes de celulasas existentes en la base de datos de
NCBI ( http://ww.ncbi.nih.gov/) mediante los algoritmos BLASTn y BLASTp.
2.3.5
Diseño de partidores para el clonamiento del gen codificante para Cel3.
Con el fin de poder insertar el gen codificante para celulasa en el vector de expresión
pET22b(+), se diseñaron partidores que agregan sitios de corte para enzimas de
restricción, sitios que servirán para introducir el gen en el sitio de multiple clonamiento
del vector. Con dichos partidores se realizó un PCR a partir del DNA genómico para la
amplificación del gen con los sitios de corte incorporados.
Se diseñó dos construcciones de vectores recombinantes:
•
Opción 1: Incluye los sitios de restricción NdeI y XhoI en el gen, con lo que se
busca que el gen conserve su peptido señal y se exprese con una cola de
histidinas unida en su extremo carboxi terminal. Para ello se diseñaron los
partidores CelNdeIS y CelXhoIA.
•
Opción 2: Incluye los sitios de restricción BamHI y XhoI en el gen, con lo que
se busca que el gen se ligue al vector sin su péptido señal, y que en su lugar
utilice el péptido de exportación del vector. Este caso también incluye la cola de
histidinas unida en su extremo carboxi terminal. Para ello se diseñó el partidor
CelBamHIS y se utilizó el partidor CelXhoIA mencionado anteriormente (Figura
4).
31
Figura 4: Región de Clonamiento del vector de expresión pET22b(+). Mapa de clonamiento del vector de expresión
pET22b(+). Para la opción 1 se utilizó los sitios de corte NdeI y XhoI para dejar al gen unido a su propio peptido señal.
Para la opción 2 se utilizó los sitios de corte BamHI y XhoI para dejar al gen unido al péptido de exportación del vector.
Figura de Novagen.
2.3.6
Amplificación de DNA mediante PCR.
Se realizaron amplificaciones del gen de Cel3 a partir del material genético mediante la
técnica de PCR utilizando como enzima de polimerización Taq DNA polimerasa.
La reacción de PCR se llevó a cabo en tubos eppendorf de 0,6 mL estériles en un
volumen final de 300 µL con buffer de PCR 1X (40 mM Tris-HCl (pH 8.4), 100 mM
KCl), donde las concentraciones finales fueron: 1,9 mM de MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,5
µM de partidores (CelNdeIS y CelBamHIS como partidor sense en la opción 1 y 2
respectivamente y CelXhoIA como partidor antisence para ambos casos), 7,5 µL de
DNA genómicos y 2,25 µL de Taq Polimerasa. Las condiciones del PCR fueron: 1 ciclo
a 94 ºC por 5 min, 2 ciclos de 94 ºC por 32 s, 45 ºC por 40 s y 70 ºC por 2 min, 30
ciclos de 94 ºC por 32 s, 60ºC por 40 s y 70 ºC por 2 min y un ciclo adicional de 70 ºC
por 7 min.
De esta manera el gen quedó con los extremos requeridos para las dos opciones
explicadas en la sección 2.3.5 (con sitios de corte para enzimas de restricción) para
ser clonados finalmente en el vector de expresión.
32
2.3.7
Digestión de producto de PCR y linearización del vector de expresión
pET22b(+).
Los productos de la amplificación por PCR del gen de celulasa con los extremos
modificados, se purificaron a partir de un gel de agarosa al 1 % (p/v) según el
protocolo descrito en el Anexo A.7. Luego fueron digeridas con las enzimas de
restricción correspondientes para cada opción (sección 2.3.5). La reacción final de
digestión contenian 5 μL de tampón 5X recomendado por New Englands Biolabs para
digestiones dobles, 2 μL de cada enzima, 25 μL de producto de PCR purificado en 50
μL de volumen total.
Con la finalidad de ligar los fragmentos provenientes de las amplificaciones del gen de
celulasa al vector de expresión, éste fue digerido con las mismas enzimas de
restricción con las que fue digerido el producto de PCR purificado. Las reacciones
finales de digestión contenian 5 μL de tampón 5X recomendado por New Englands
Biolabs para digestiones dobles, 2 μL de cada enzima, 40 μL de vector pET22b(+) y 1
μL de agua Milli-Q estéril para completar 50 μL de volumen total.
Las digestiones se incubaron durante 3 horas a 37 ºC y el resultado fue analizado
mediante un gel de agarosa al 1 % (p/v). Luego se purificaron según protocolo descrito
en Anexo A.7.
2.3.8
Ligación de fragmentos de DNA a vectores de clonamiento y expresión.
Para todas las reacciones de ligación, se utilizó como inserto los productos de PCR,
los cuales se obtuvieron mediante purificación desde geles de agarosa (Anexo A.7).
Los procedimientos de ligación de los insertos a vectores de clonamiento o de
expresión se detallan a continuación.
2.3.8.1 Ligación en el vector de clonamiento pGEM-T Easy.
La reacción se llevo a cabo en un volumen final de 10 µL, cuyos componentes fueron
50 ng de vector pGEM-T Easy, Buffer de ligación 1X 3,5 µL de inserto y 1 µL de
enzima T4 DNA ligasa, correspondiente a 1 U. La reacción se dejó toda la noche a
4 ºC. El producto de ligación se utilizó para la transformación de células E. coli DH5α
33
electrocompetentes, las cuales fueron preparadas de acuerdo al protocolo descrito en
el Anexo A.9.
2.3.8.2 Ligación en el vector de expresión pET22b(+).
La reacción se llevo a cabo en un volumen final de 10 µL, cuyos componentes fueron
100 ng de vector digerido, Buffer T4 DNA ligasa 1X, 80 ng de inserto, digerido con las
mismas enzimas de restricción y 1 µL de enzima T4-DNA ligasa (250 mM Tris-HCl (pH
7,6), 50 mM MgCl2, 5 mM ATP, 5 mM DTT, 25 % (p/v), correspondiente a 1 U. La
reacción se incubó a 16 ºC por 16 horas. El producto de ligación se utilizó para la
transformación de células E. coli BL21(DE3) electrocompetentes, las cuales fueron
preparadas de acuerdo al protocolo descrito en el Anexo A.9.
2.3.9
Clonamiento de los constructos en células E. coli DH5α.
Para obtener un mayor número de copias de los constructos pET-Inserto (con y sin
peptido señal), éstos fueron clonados en células electrocompetentes E. coli DH5α.
Para ello células DH5α fueron transformadas con el producto de la reacción de
ligación. A 20 µL de células se agregó 1 uL de mezcla de ligación.
La electroporación se llevo a cabo en un equipo Cell-Porator, con 420 Volts, 330 µF,
baja impendancia, una tasa de carga rápida y un tiempo máximo de 2,5 mseg. Las
células transformadas se mezclaron con 1 mL de medio SOC (Anexo B.1 parte b) y se
incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Se plaqueó en placas con medio LB agar estériles
que contenían ampicilina 100 µg/mL (Anexo B.2 parte a). Las placas con el producto
de transformación se incubaron a 37 ºC durante toda la noche.
Al día siguiente se seleccionaron colonias desde la placa y se dejó creciendo en medio
LB con ampicilina 100 µg/mL a 37 ºC con agitación hasta el día siguiente. Luego se
realizó una minipreparación de DNA plasmidial (Anexo A.8), la cual fue digerida con
las enzimas de restricción correspondientes para confirmar las presencia de inserto y
por ende identificar aquellas colonias recombinantes (siguiendo el protocolo descrito
en 2.3.7, con la diferencia que ahora el volumen final de reacción fue de 20 μL. Se
digirió 5 μL de la minipreparación con 1 μL de cada enzima).
34
2.3.10 Clonamiento de los plasmidios recombinantes en células de E. coli
BL21(DE3).
Se transformaron células competentes E. coli BL21(DE3) con los plasmidios
recombinantes de la misma forma en que se explicó en la sección 2.3.9. Se
seleccionaron colonias y se dejaron creciendo a 37 ºC toda la noche en placas LB
ampicilina 100 µg/mL.
2.3.11 Pruebas de actividad celulasa extracelular.
De la transformación en células competentes E. coli BL21(DE3) se seleccionaron
colonias, las cuales se traspasaron a placas LB al 0,5 % (p/v) CMC (Anexo B.2 parte
b), ampicilina 100 µg/mL e IPTG 0,1 μM y a placas LB ampicilina 100 µg/mL (ambas
en gradilla númerada para una posterior identificación de las colonias). Se incubó a
37 ºC hasta el día siguiente. Luego las placas con sustrato fueron teñidas con Rojo
Congo al 0,1 % (p/v) por 30 minutos y luego se destiñeron con Cloruro de Sodio 1M.
Aquellas colonias que actividad (degradación del sustrato) fueron seleccionadas de las
placas LB ampicilina 100 µg/mL y se dejaron creciendo a 37 ºC por 8 horas en 4 mL
de medio LB y carbenicilina a una concentración de 100 µg/mL. A 900 µL de cultivo se
agregó 100 µL de Glicerol 80 %. Los tubos fueron guardados a -80 ºC.
35
3
RESULTADOS Y DISCUSION
3.1
CARACTERIZACIÓN BÁSICA DE LA CELULASA EN EL MICROORGANISMO
PRODUCTOR
3.1.1
Obtención de la celulasa producida por bacterias antárticas.
3.1.1.1 Cultivo a 4 y 20 ºC de las bacterias antárticas.
Los cultivos de bacterias antárticas incubados durante 6 días a 4 y 20 ºC, fueron
monitoreados para analizar el crecimiento y la actividad celulasa que se encontraba en
el sobrenadante de los cultivos en función a las dos temperaturas de incubación. Las
curvas de crecimiento y de actividad de celulasa se muestran en el Figura 5.
10,00
300
Células [g/mL]
1,00
200
150
0,10
100
50
0,01
0
20
40
60
80
100
120
140
Actividad Celulasa[U/L]
250
0
160
Tiempo [h]
Figura 5: Curvas de crecimiento microorganismo productor de la celulasa. Curva para cultivo incubados a 4 ºC
(
) y 20 ºC (
). La actividad celulasa a 4 ºC (
) y a 20 ºC (
).
Se observa en el Figura 5 que el cultivo incubado a 4 ºC tarda más en llegar al estado
estacionario comparado con su similar a 20 ºC, sin embargo su nivel final de
crecimiento es mayor, llegando a un valor de 2,41 g de células/mL, comparado con 1,6
gramos de células/mL que alcanza el cultivo a 20 ºC. Se observa una diferencia en la
producción de celulasa en ambos cultivos: en el caso del cultivo a 4 ºC se mantiene la
actividad celulasa en un nivel bajo en toda la etapa exponencial del crecimiento hasta
el comienzo de la etapa estacionaria que se produce un cambio, donde se observa el
aumento de la actividad celulasa en el sobrenadante. El cultivo a 20 ºC en cambio,
presenta una producción de celulasa a la par al crecimiento celular, aumenta durante
la etapa exponencial y se estanca en el estacionario.
36
Se eligió el cultivo a 4 ºC para posteriores experimentos, por entregar un mayor
manejo del cultivo, el cual basta con detenerlo en el comienzo de la fase estacionaria,
mientras que el cultivo de 20 ºC llega a su máximo de producción de celulasa antes
del inicio de la fase estacionaria, punto que resulta más difícil de determinar con el
monitoreo de de la actividad celulasa.
3.1.1.2 Purificación de la celulasa secretada por bacterias antárticas.
La purificación de Cel3 se realizó a partir de un cultivo de 500 mL, incubado a
4 ºC,
el cual se detuvo a un valor de D.O600 de 5, equivalente a 7 miligramos de células/mL
(curva de calibración Anexo C.4). El inicio del estado estacionario se identificó cuando
el monitoreo arrojó tres mediciones seguidas en un mismo nivel de D.O600.
A los 440 mL de sobrenadante de cultivo, se agregó 297 gramos de sulfato de amonio
para la precipitación de Sulfato de Amonio, la cual después de reposar en hielo, se
centrifugó 2 horas a 8.500 rpm. El pellet resuspendido en 3 mL de buffer Tris 20 mM
pH 7, tomó un volumen final de 10 mL, los cuales fueron dializados en el mismo buffer
durante la noche. El producto de la diálisis tuvo un volumen final de 45 mL
aproximadamente.
En
la
cromatografía
las fracciones
con
actividad
celulasa
se
encontraron
principalmente a lo largo del segundo segmento del gradiente, es decir eluyeron entre
un 15 y 30 % de buffer B (con sal), Figura 6. Las fracciones con actividad positiva con
valores de D.O550 mayores a 0,4 fueron juntadas y concentradas para la etapa de
purificación siguiente.
37
90
800
80
700
70
600
60
500
50
400
40
300
30
200
20
100
10
0
-100
Conductividad [mS/cm]
mAU 280 y 550 nm
900
0
10
20
30
40
50
60
70
0
Ve [mL]
Figura 6: Cromatógrama de la etapa de Intercambio Anionico. Se observa el perfil de Abs a 280 nm [mAU] (color
azúl), de Abs a 550 nm [mAU] (color céleste) y el de conductividad [mS/cm] (color verde).
Las fracciones juntas se les denominaron Ori F.G (Original de Filtración por Gel), las
que sumaron un total de 1,8 mL después de la concentración. Las fracciones con
actividad celulasa positiva se encontraron en el inicio del peack principal, a valores de
400
500
300
400
200
300
100
200
0
Abs 550 nm mAU
Abs 280 nm mAu
elusión de 6 a 7 mL (Figura 7).
100
0
2
4
6
8
10
-100
12
14
16
18
0
Ve [mL]
Figura 7: Cromatógrama de la etapa de Intercambio Anionico. Se observa el perfil de Abs a 280 nm [mAU] (color
azúl) y el de Abs a 550 nm [mAU] (color céleste).
Para un análisis de la pureza de la muestra final se realizó una electroforesis en gel de
poliacrilamida al 12,5 % (p/v), el cual se ilustra en la Figura 8. Se observa una banda
única en el carril en donde se cargó la celulasa, lo que indica la pureza de la enzima.
38
Figura 8: Análisis electroforético de las distintas etapas de la purificación de la celulasa. Gel de Poliacrilamida al
12,5% en condiciones desnaturantes, teñido con azul de comasie y con plata. Carril 1: muestra proveniente
directamente del sobrenadante de cultivo (0,8 μg); Carril 2: muestra proveniente del dializado del sedimento
precipitación con sulfato de amonio al 90% (3 μg); Carril 3: mezcla de fracciones con actividad celulasa posterior a IEX
(3,6 μg); Carril 4: mezcla de fracciones con actividad celulasa posterior a F.G (proteína purificada, 1,4 μg); M: marcador
de masa molécular.
Como se puede observar en la Figura 8 la proteína en la última etapa de purificación
se encuentra totalmente pura. Se cuantificó mediante el método de Bradford (Anexo
A.1) y se obtuvo una concentración de enzima purificada de 10 ηg/mL, teniendo una
producción total de 0,14 mg de celulasa a partir de un cultivo de 500 mL. En la
Figura 9, se puede observar un zimograma realizado para las mismas muestras que
fueron analizadas en la electroforésis de la Figura 8. En el zimograma se puede
observar en cada fracción actividad de celulasa, la cual es representada por halos
amarillos, los que equivalen a la degradación de CMC inducida en el gel (Anexo A.6).
Esta actividad indica la presencia de la enzima en cada una de las muestras, desde el
sobrenadante hasta la muestra de la enzima purificada, por lo que el proceso de
purificación fue asertivo al seguimiento de la enzima de interés.
39
Figura 9: Zimograma de las distintas etapas de la purificación de la celulasa. Gel de Poliacrilamida al 10%.Carril
1: muestra proveniente directamente del sb de cultivo; Carril 2: muestra proveniente del dializado de la precipitación
con sulfato de amonio al 90%; Carril 3: mezcla de fracciones con actividad celulasa posterior a IEX; Carril 4: mezcla de
fracciones con actividad celulasa posterior a F.G (proteína purificada).
Para la realización de la Tabla de Purificación, fue necesario realizar otro cultivo y a
su vez una nueva purificación, ya que la enzima purificada en el primer cultivo no fue
suficiente para este propósito. Vale decir que en este segundo cultivo no se obtuvo ni
el crecimiento de bacterias esperado, y por ende la producción de celulasa fue menor
(el estado estacionario de las bacterias antárticas fue de un nivel de D.O550 de 3, lo que
equivale a 4,3 miligramos de células/mL). A pesar de lo anterior se procedió a la toma
de datos necesarios para la construcción de la tabla. A continuación se presenta la
tabla de purificación asociada al protocolo utilizado.
Tabla 3: Tabla de Purificación de la Celulasa producida por el microorganismo nativo. La actividad específica se
midió con CMC como sustrato. El volumen con que se empezó fue de 500 mL. Se muestran las cuatro etapas de
purificación
Sobrenadante
Cultivo
Dializado
Intercambio
Aniónico
Filtración por
Gel
Vol
(mL)
430
Proteína Total
(mg)
6,33
Actividad
Total (U)
71,697
Actividad Especifica
(U/mg)
11,320
15
7,2
2,28
1,31
6,683
3,972
6,75
0,49
2,745
Recuperación
(%)
Paso
Total
100
100
2,933
3,027
9,32
59,43
9,32
5,54
5,591
69,11
3,83
Como se puede observar en la Tabla 3, usando este protocolo de purificación cerca
del 3,8 % de la proteína fue recuperada en su totalidad. Este nivel de recuperación se
debe principalmente a la etapa de precipitación con sulfato de amonio, en donde tan
sólo se recupera el 9,32 % de la proteína total. Se cree que las proteínas del
40
sobrenadante se degradan. Dicha etapa es crucial en el procedimiento por permitir una
concentración de alrededor de 25 veces, concentración que es necesaria para las
siguientes etapas. Además no se asocia el problema a que queden proteínas en el
sobrenadante de la precipitación, ya que al utilizar un 90 % de saturación, se precipita
la mayoría de las proteínas del sobrenadante, y subir este nivel resulta complicado de
manejar. A pesar de lo anterior, las etapas de cromatografía posteriores poseen una
recuperación por etapa mayor al 50 % por lo que se consideran eficientes. Se sugiere
hacer el ejercicio de precipitar con sulfato de amonio, pero en presencia de inhibidores
de proteasas, lo que evitaría la degradación de proteínas debido a proteolisis, de esa
forma se podría saber si la perdida de proteína en dicha etapa es debida a este
motivo.
Observando los porcentajes de purificación se puede inferir que es en la etapa de
precipitación con sulfato de amonio en donde se pierde enzima de interés, lo que se ve
reflejado en los valores de actividad específica, etapa en la cual se recupera sólo el
0,25 veces de Cel3. En las etapas posteriores los valores de actividad específica
aumentan levemente, lo que demuestra que en dichas etapas se purifica la proteína
(1,8 veces en la última etapa). El nivel de purificación total es de 0,49 veces, lo que
significa que la proteína no fue purificada en su totalidad, sin embargo en la Figura 8
se puede observar la pureza alcanzada (única banda en el carril 4), lo que se
contradice con los valores de la
Tabla 3. Se puede decir entonces, que la enzima si
fue purificada bajo el criterio cromatográfico. En cuanto a la tabla esto no se ve
reflejado, debido a artefactos que puedan haber influido en los resultados de ésta.
A pesar de lo anterior, se consideró que el protocolo seguido para la purificación de la
enzima a partir del microorganismo antártico, permitió obtener la celulasa purificada,
que es lo que se buscaba, lo que permite realizar una posterior caracterización, a
pesar de obtener cantidades pequeñas.
3.1.2
Caracterización de la enzima celulasa producida por las bacterias
antárticas.
Con el fin de caracterizar a la enzima purificada, y ver su comportamiento frente a la
temperatura y el pH se realizaron ensayos de actividad y estabilidad en función de
estas dos variables, con ellos se podrá determinar si esta enzima es apta para una
futura aplicación en la industria de los detergentes.
41
Efecto de la temperatura de reacción en la actividad de la celulasa.
Se encontró que la temperatura de reacción óptima fue de 45 ºC, decayendo la
actividad específica fuertemente después de dicha temperatura (Figura 10), dicha
termolabilidad es una característica común de las enzimas psicrofílicas, en el caso de
una enzima mesófilica su temperatura óptima de reacción puede estar cercano a los
55 ºC, temperatura en la cual ya la celulasa ha perdido prácticamente el 50 % de
actividad [15,21]. Se puede observar también que entre los 15 y 20 ºC la enzima
posee entre un 60 y 80 % de su actividad, temperaturas en las cuales Cel5 de Erwinia
chrysanthemi, una celulasa mesófilica, prácticamente no posee actividad [22]. Esto
último resulta interesante, ya que de aplicar esta enzima como aditivos a detergentes,
permitiría obtener una buen comportamiento de la enzima en agua sin calentar
(20 ºC), obteniendo así un mejor rendimiento en el lavado.
Actividad Relativa %]
120
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Temperatura [ºC]
Figura 10: Efecto de la temperatura de reacción en la actividad específica de la celulasa. Ensayo realizado a
distintas temperaturas durante 40 minutos en buffer MOPS a pH 7 (ensayo estándar), usando como sustrato CMC al
1%.
Termoestabilidad.
Al someter a la enzima a una preincubación de 10 minutos a diferentes temperaturas y
posteriormente realizar el ensayo estándar, se observó que la actividad relativa se
mantuvo alrededor de 100 % para valores de temperaturas de incubación hasta los
40 ºC, para valores más altos de temperatura hubo una caída de la actividad relativa.
Este resultado indica una estabilidad frente a la temperatura atractiva para una enzima
proveniente de un organismo adaptado a bajas temperaturas, ya que éstas se
caracterizan por ser muy termolábiles [17] (Figura 11). Sin embargo, este
42
comportamiento se repite en el caso de CelX, una de las dos endoglucanasas activas
a bajas temperaturas publicadas [22]. Con estos valores fue posible determinar la Tm
de la proteína, que corresponde a la temperatura donde pierde el 50 % de la actividad.
Este correspondería a un valor de 54 ºC, valor que es mayor a las Tm de α-amilasa de
Alteromonas haloplanktis,
de xilanasa de Cryptococcus adeliae y de la lipasa de
Aspergillus ridulans WG 312, las cuales rodean los 45 ºC [19].
Actividad Relativa %
120
100
80
60
40
20
0
-20 15
25
35
45
55
65
75
T [ºC]
Figura 11: Estabilidad de la celulasa frente a la Temperatura. Ensayo de actividad realizado durante 40 minutos en
buffer MOPS a pH 7 a 20ºC, con previa incubación de la enzima durante 10 minutos a las diferentes temperaturas
usando como sustrato CMC al 1%.
Efecto del pH de reacción en la actividad de la Cel3.
Se encontró que el pH óptimo es de 8 (Figura 12), valor que difiere de los pH óptimos
de las endoglucanasas CelG y CelX, los cuales son de 7 y 6-7, respectivamente.
Además el rango en donde la celulasa posee altas actividades es mayor que el rango
que poseen CelG y CelX: 80 % a pH 8 y sin actividad a pH 10 en el caso de CelG; y
73 y 63 % de actividad residual a pH 9 y 10 respectivamente en el caso de CelX
[21,22]. Con lo anterior se puede decir que esta celulasa posee un comportamiento
más alcalino que las enzimas mencionadas anteriormente, y es más apta para actuar
como aditivo a detergentes, ya que para ello se requiere que posean actividad en
amplios rangos de pHs alcalinos, rango alcanzado por esta Cel3 (valores altos desde
pH 6 a 11).
43
Actividad Relativa %
120
100
80
60
40
20
0
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
pH
Figura 12: Efecto del pH de reacción en la actividad específica de la celulasa. Ensayo realizado durante 40
minutos a distintos pHs a 20ºC (ensayo estándar), usando como sustrato CMC al 1%.
Estabilidad de la celulasa frente al pH de incubación.
Al haber preincubado la enzima durante 24 horas en soluciones de distintos pHs, se
encontró que la actividad relativa se mantuvo alrededor de 90 %, en un rango de
valores de pH desde 5 hasta 11 (Figura 13). Este resultado muestra que la enzima es
estable a valores de pHs alcalinos, lo que resulta muy atractivo para posibles
aplicaciones de esta enzima como aditivo a detergentes, y además si se le suma la
propiedad de mantener cerca del 100 % de actividad previa incubación a un rango de
temperatura entre 20 y 40 ºC, le agrega una ventaja sobre típicas enzimas activas a
bajas temperaturas, que se caracterizan por tener baja estabilidad frente a la
temperatura.
44
Actividad Relativa %
120
100
80
60
40
20
0
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
pH Incubación
Figura 13: Estabilidad de la celulasa frente al pH. Ensayo de actividad realizado durante 40 minutos a pH 7 a 20ºC,
con previa incubación de la enzima durante 24 horas en buffers con distintos pHs, a 4ºC. Se utilizó como sustrato CMC
al 1%.
Observando estos resultados, se puede notar una diferencia entre las celulasas
provenientes de organismos psicrofílicos, de las cuales ya hay antecedentes
publicados, y Cel3. En el caso de CelG, el perfil de actividad frente al pH posee tiene
un comportamiento marcado en el valor de pH 7, siendo este su pH óptimo, a pH 8
conserva cerca del 80 % de actividad, mientras que a pH 10 prácticamente ha perdido
la totalidad de ésta. A su vez, la estabilidad frente al pH de la solución de incubación
tiene su peack en los pHs 7 y 8, y para valores mayores disminuye en forma brusca;
para valores de pH 10
y 11 conserva cerca del 70
y 40 % de actividad,
respectivamente [21]. La mayor alcalinidad y estabilidad a pH básicos de Cel3, se
puede explicar por diferencias estructurales de ambas enzimas, para ello se procederá
a analizar dichas diferencias con las secuencias aminoácidicas en la Sección 3.2.5.
Peso Molecular.
El peso molecular de la enzima se determinó mediante una filtración en gel en donde
se cargó 50 µL de la muestra de celulasa pura concentrada (0,04 mg/mL), con ello se
obtuvo un peack de elusión (Figura 14), al cual se le midió su correspondiente
volumen de elusión, que correspondió a 6,35 mL, con el que se obtuvo un peso
molecular de proteína nativa de 35,7 kDa según a la curva de calibración (Anexo C.3).
El peso molecular de esta enzima es levemente menor al peso molecular determinado
para CelG, de 38 KDa, producida por Pseudoalteromonas haloplanktis [21]. Esta
mínima diferencia de peso se puede deber a diferencias estructurales a nivel
45
aminoacídico, para ello se procederá a analizar dichas diferencias con las secuencias
aminoacídicas en la Sección 3.2.5.
Ovalbúmina
BSA
Ribonucleasa A
Celulasa
Figura 14: Cromatógrama de filtración por gel de la celulasa para la determinación de su peso molecular, mAU
280 nm vs. volumen de elusión [mL]. Se indican los niveles de elusión de las proteínas con pesos moleculares
conocidos con los que se construyo la curva de calibración: BSA, Ovalbúmina y Ribonucleasa A con 66, 43 y 13,7 kDa,
respectivamente. Se destaca en color rojo el peack que corresponde a la celulasa.
Punto Isoeléctrico.
El punto isoeléctrico se determinó mediante un isoelectroenfoque utilizando el sistema
PhasSystem, en un gel con un rango de corrida de valores de pH entre 3 y 9. Los
resultados se muestran en la Figura 15.
46
Figura 15: Isolelectroenfoque de la celulasa nativa. Gel PhastSystem 3-9, teñido con plata. Carril 1: celulasa
purificada (13 μg); M: marcador de punto isoéletrico.
En la Figura 15 se puede observar una banda entre la altura de 4,55 y 5,2, por lo que
este rango puede ser definido como el rango del P.I de la celulasa. Este valor es
consistente con los resultados obtenidos en la cromatografía IEX, que se realiza a un
pH 7. A este pH la proteína tiene una carga neta negativa (por poseer un P.I entre 4,55
y 5,2) que permite que ésta se adsorba a la resina de la columna (Q-sepharose), que
tiene carga positiva.
No hay valores de punto isoeléctricos publicados para el caso de CelG y CelX, por lo
que no se puede comentar al respecto.
3.1.2.1 Determinación de Parámetros Cinéticos.
Para la determinación de los parámetros cinéticos se procedió a realizar el ensayo
estándar, pero con diferentes concentraciones de sustrato las cuales se encontraban
en el rango de 0 a 10 mg/mL. En la Figura 16, se muestra la curva de saturación
obtenida.
47
Curva de Saturación
250
200
V [U/L]
150
100
50
0
-50
0
5
10
15
20
25
CMC [mg/mL]
Figura 16: Curva de saturación de la celulasa. Ensayo de actividad realizado durante 40 minutos a 20ºC, pH 7, con
concentraciones de sustrato de 0 a 10 mg/mL. Se utilizó como sustrato CMC.
Este ensayo se realizó con la celulasa obtenida del segundo cultivo, cultivo que no
cumplió con las expectativas de crecimiento. Además se observó que la celulasa
obtenida de este cultivo tuvo menor actividad específica, que la celulasa obtenida
anteriormente (alrededor de 8 veces menos activa que la obtenida en el primer
cultivo). Se recomienda repetir este ensayo, para obtener valores más cercanos a los
reales y con una enzima en sus óptimas condiciones. A pesar de lo anterior, se
procedió a calcular los parámetros cinéticos con el procedimiento descrito en la
Sección 2.3.3.1.
Se procedió a calcular los parámetros cinéticos, con la linealización de Dixon tomando
como supuesto que la enzima sigue un comportamiento descrito por Michaelis Menten
(Anexo D). Los parámetros cinéticos a 20 ºC KM, VMAX y Kcat son 10,8 mg/mL, 357 U/L
y 5,6x10-3 s-1, teniendo una eficiencia catalítica KM/Kcat de 5,2x10-4 mg·s-1·mL-1. Estos
valores servirán como puntos de comparación para los parámetros que se obtengan
de la futura caracterización de la enzima recombinante.
3.2
BÚSQUEDA DE SECUENCIAS FALTANTES DEL GEN CODIFICANTE PARA
CELULASA
Utilizando el método de Genome Walking estandarizado en el CIByB que permite
identificar regiones desconocidas adyacentes a regiones de DNA previamente
conocidas, fue posible obtener la secuencia completa del gen de Cel3 [26].
48
3.2.1
Diseño de partidores para la obtención de las secuencias río arriba y río
abajo del gen de celulasa.
Los partidores específicos se diseñaron a partir de un segmento de 400 pb,
previamente identificado en el laboratorio. Este segmento fue amplificado con la
técnica de PCR, en el que se utilizaron partidores degenerados, los cuales fueron
diseñados a partir de las zonas
altamente conservadas, que fueron identificadas
gracias a un alineamiento múltiple de genes codificantes para celulasas existentes en
la base de datos del GeneBank (NCBI).
Con la secuencia disponible de dicho segmento fue posible diseñar cuatro partidores,
los cuales fueron utilizados en la búsqueda de las secuencias río arriba y río abajo del
gen codificante para celulasa. En la
Figura 17 se puede visualizar un esquema
ilustrativo de la secuencia previamente identificada y los partidores Cell3R1, Cell3R2,
Cell3F1 y Cell3F2. Sus respectivas secuencias y Tm se detallan en la Tabla 4.
Figura 17: Partidores para la amplificación de la secuencia 5’ y 3’ del gen codificante para celulasa. Las
secuencias en azul corresponden a los partidores Cell3R1 y Cell3R2 , que amplifican el extremo 3’. Las secuencias en
morado corresponden a los partidores Cell3F1 y Cell3F2, que amplifican para el extremo 5’.
49
Tabla 4: Partidores para la obtención de la secuencia 5’ y 3’ para el gen codificante para celulasa.
Nombre
Secuencia (5’-3’)
Tm (ºC)*
Cell3R1
Cell3R2
Cell3F1
Cell3F2
GATAACGAGCCGTTACAAATCTCTTGGG
ATTGTGGTTGGAACGCCTACGTGG
TCGGTAAAAGCCCAGTTAGCGTGGCT
TCCCCACTCTGTGGCGAATAGTGC
68
67
70
69
*: Tm calculada por OligoCalc, Oligonucleotide Properties Calculador
(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).
El diseño de los partidores permite que una vez que se tengan las secuencias de los
extremos 5’ y 3’, éstas posean zonas con secuencias comunes al segmento original de
400 pb, lo que facilita el construir la secuencia entera del gen con tan sólo sobreponer
los extremos con el segmento previamente conocido.
3.2.2
Digestión del DNA genómico y elongación.
Se digirió el DNA genómico, el cual previamente fue extraído desde la cepa de interés
siguiendo el protocolo descrito en el Anexo A.2. La enzima seleccionada para la
digestión fue PvuII. Esta enzima mostró la mejor digestión, por generar segmentos de
tamaño entre 4 y 10 Kb, tamaños con los que se tiene una mayor probabilidad de
incluir el gen su totalidad.
El DNA cromosomal digerido se procedió a purificar según el protocolo descrito en el
Anexo A.7. Luego se procedió a la elongación con Taq DNA polimerasa, la cual deja
una adenina no apareado en los extremos 3’, lo que posteriormente permite una
ligación más óptima al oligo-adaptador.
3.2.3
Construcción del oligo-adaptador y de la genoteca-adaptador.
El oligo-adaptador de doble hebra AdaptHindIIITotal fue construido mediante la
hibridización de los oligonucleotidos AdaptHindIII y AdaptHindIIIR desfosforilados. El
diseño de este oligo-adaptador incluye una timidina no apareada en uno de sus
extremos 3’ (Figura 18).
Figura 18: AdaptHindIIITotal. La hibridización de AdaptHindIII y AdaptHindIIIR da como resultado este oligoadaptador con una timidita no apareada en uno de sus extremos 3’.
Luego este oligo-adaptador fue utilizado para la construcción de la genotecaadaptador, ligándolo a los extremos de DNA genómico digeridos con PvuII y
elongados con Taq DNA polimerasa.
50
3.2.4
Amplificación de los extremos 3’ y 5’ del gen de Cel3.
La genoteca-adaptador fue utilizada como templado para el primer PCR (ver Figura 3),
con los partidores Cell3R1 y Cell3F1 para la amplificación de los extremos 3’ y 5’
respectivamente. Esta reacción de polimerización permite un enriquecimiento de forma
lineal, por lo que sólo se amplifica la hebra complementaria al gen. Esto permite tener
un templado para el segundo PCR con mayor cantidad del fragmento de DNA de
interés. Con este paso de enriquecimiento se asegura una mayor especificidad de la
reacción de amplificación del segundo PCR, por tener mayor concentración del DNA
de interés, lo que da la posibilidad de diluir este templado y así evitar amplificaciones
no deseadas, ya que se disminuye la probabilidad de alineamiento inespecífico de los
partidores a zonas no codificantes para celulasa.
El producto diluido del primer PCR se utilizó como templado para la segunda
amplificación de los extremos del gen de interés. En esta etapa se utiliza como partidor
Cell3R2 y Cell3F2 para la amplificación del extremo 3’ y 5’ respectivamente; como
segundo partidor, para la amplificación de los dos extremos se utiliza AdaptF2, el cual
es complementario al oligo-adaptador.
El uso de un oligo-adaptador desfosforilado, deja después de la ligación un espacio
entre el extremo 5’ del fin del oligo-adaptador y el extremo 3’ del fragmento de DNA,
mientras que el extremo 5’ del fragmento del DNA y el extremo 3’ del oligo-adaptador
está unido. Gracias a esta construcción cualquier otra amplificación con AdaptF2 es
bloqueada y sólo la hebra complementaria generada por el primer partidor específico
servirá como templado para la reacción de PCR con AdaptF2 y el segundo partidor
específico, así el fragmento de DNA deseado puede ser amplificado de forma
específica [26].
Los productos de la segunda ronda de PCR se muestran en la Figura 19. Se observa
en el análisis electroforético bandas nítidas mayores a 1000 pb, con lo que se cree que
son de suficiente tamaño para completar los extremos del gen codificante para esta
celulasa. Esto es debido a que mediante un análisis de las secuencias publicadas de
genes codificantes, se predice un tamaño de gen de aproximadamente 1500 pb, por lo
que los fragmentos obtenidos deberían ser suficientes.
51
Figura 19: Análisis electroforético de los productos de PCR para la obtención del extremo 5’ y 3’ del gen
codificante para celulasa. Gel de Agarosa al 1 %. M: Marcador de Peso Molecular A): Carril 1: Extremo 5’ del gen
codificante para celulasa; B) Carril 1: Extremo 3’ del gen codificante para celulasa.
Por ser bandas únicas en la amplificación, se procedió a seleccionarlas y
posteriormente a purificarlas directamente desde el gel de agarosa (Anexo A.7). Los
fragmentos purificados fueron ligados al vector de clonamiento pGEM-T Easy, para
tener un alto número de copias del vector con el inserto. Se transformó células
competentes DH5α de E. coli con dicha ligación.
Se seleccionó una colonia positiva (vector ligado al inserto de interés) mediante PCR
de colonias (Anexo A.4), para luego realizar una minipreparación, la cual fue enviada a
secuenciar. En el caso de la banda de 2 Kpb, correspondiente al extremo 5’, no se
logró tener una ligación al vector de clonamiento exitosa, por lo que se mandó a
secuenciar el fragmento puro.
3.2.5
Secuenciación y análisis de los extremos 3’ y 5’ del gen codificante para
celulasa.
Las secuencias obtenidas por el método de Genome Walking fueron analizadas con el
programa Omiga y se pudo reconstruir una secuencia de DNA de 2127 pb. En dicha
secuencia se identificó un ORF (marco de lectura abierto) de 1486 pb que codifican
para 494 aminoácidos.
Se analizó la secuencia obtenida con la herramienta Blastp y Blastn y se encontró una
muy alta semejanza a nivel de aminoácidos y de nucleótidos con la celulasa CelG de
52
Pseudoalteromonas Haloplanktis y con CelX de Pseudoaltoromonas sp. DY3, con un
97 y 94 % de identidad respectivamente. Se sabe, de experimentos realizados
anteriormente en el laboratorio, que la cepa con que se trabajó también pertenece a la
especie Pseudoalteromonas, lo que podría explicar el alto porcentaje de identidad
entre dichas celulasas.
Al alinear las tres secuencias de aminoácidos se puede hacer un paralelo entre ellas
y poder identificar en Cel3, el dominio catalítico, el dominio de unión a la celulosa
(CBD, Carbohydrate Binding Domain) y el linker que une dicha estructuras. Con la
herramienta SignalP 3.0 y PSORTb 2.0 del sitio web Expasy, se reconoció en la
secuencia un péptido señal N-terminal de 32 aminoácidos, para secreción extracelular
(Figura 20). La primera herramienta predice la presencia y ubicación de sitios de corte
de péptidos señal en secuencias de aminoacidos de diferentes organismos, utilizando
un método que incorpora una predicción de sitios de corte y una predicción de péptido
señal/péptido no señal, que se basa en una combinación de varias redes neuronales
artificiales y modelos de Markov. La segunda herramienta consiste en un método
probabilístico que integra información obtenida a partir de análisis de secuencia de
aminoácidos, similitud de la proteína con otras de localización conocida, la presencia o
no de péptidos señal, etc. Como resultado entrega una lista de cinco posibles sitios de
localización con puntajes de probabilidad asociados.
Figura 20: Secuencia Aminoácidica de la celulasa. Los aminoácidos destacados en verde corresponden al péptido
señal, en azul al dominio catalítico, en morado al linker de unión y en naranjo al dominio de unión a la celulosa (CBM,
Carbohydrate-binding domain).
Considerando la secuencia de la proteína madura, sin contar el péptido señal Nterminal de 32 aminoácidos, el dominio catalítico N-terminal, puede ser clasificado
dentro de la familia 5 de las glicosil hidrolasas por poseer 5 residuos estrictamente
53
conservados (Arg57, His100, His194, Glu135 y Glu222) [21]. Este dominio también es
relacionado con el Clan A de las glicosil hidrolasas GH-A que se caracteriza por
poseer un plegamiento del tipo (β/α)8. (CAZY, Carbohydrate-Active Enzymes,
http://www.cazy.org/). El CBD se puede clasificar entre los CBD de la familia 5 por
tener un 95 % de similitud con el CBD de CelG, el cual fue clasificado dentro de esa
familia [21].
Se estimó su peso molecular a partir de la secuencia aminoácidica en el sitio web de
Expasy, mediante la herramienta Compute pI/Mw, el que fue de 52.729 Da, el que
difiere del obtenido en forma experimental. Si se hace el ejercicio de introducir sólo la
secuencia del dominio catalítico, se obtiene un peso molecular de alrededor de 30
kDa, lo que se acerca al peso molecular obtenido experimentalmente. Es por esto
último que se cree que la proteína purificada, a partir del sobrenadante del cultivo de la
bacteria antártica, corresponde a una proteína truncada que contiene solamente el
dominio catalítico, probablemente cortada por una proteasa secretada por la misma
bacteria. Esta deleción se ha encontrado en otras oportunidades y se afirma que es un
comportamiento común en microorganismos celulolíticos [21].
Funciones de éste dominio de unión no son del todo claras, pero de le han atribuido
posibles funciones, tales como: a) participar en la destrucción de la celulosa
interfiriendo con el empaquetamiento regular de las fibrillas; b) o simplemente
aumentar la concentración local del dominio catalítico al que están unidos. Se cree
también, por resultados experimentales, que dicho dominio es necesario para la
secreción de la enzima al medio extracelular [11]. Por otro lado se tiene el antecedente
que su presencia aumenta la sinergia entre el dominio catalítico y el dominio de unión
a la celulosa con su sustrato natural, ya que la eliminación del enlace disminuye
drásticamente la actividad enzimática sobre la celulosa cristalina [10]. Al utilizar como
sustrato en este caso carboximetil celulosa (CMC), celulosa del tipo no cristalina, se
cree que la actividad de la enzima no debiera verse afectada en demasía por la
ausencia del dominio de unión, ya que la hidrólisis del enlace 1,4-β-glucosidicos es
realizada por el dominio catalítico.
Gracias a la misma herramienta se estimó el punto isoeléctrico, el cual fue de 4,5,
valor que coincide con el obtenido experimentalmente, que se determinó en el rango
de 4,55 y 5,2, rango que resultó ser un poco estimativo, ya que la banda
correspondiente a la proteína corrió de una manera bastante deformada, por lo que el
54
valor estimado por la herramienta de Expasy, ayuda a acotar dicho rango a un valor
cercano a 4,5.
El gran porcentaje de identidad de las secuencias de CelG y Cel3, lleva a preguntarse
el porque su diferencia frente al comportamiento del pH, mostrado en la sección 3.1.2,
en donde se encontró que el pH óptimo para la celulasa estudiada tiene un valor de 8
(Figura 12), valor que difiere de los pH óptimos de las endoglucanasas CelG y CelX,
los cuales son de 7 y 6-7, respectivamente. Además el rango en donde Cel3 posee
altas actividades es mayor que el rango que poseen CelG y CelX: 80 % a pH 8 y sin
actividad a pH 10 en el caso de CelG; y 73 y 63 % de actividad residual a pH 9 y 10
respectivamente en el caso de CelX. Analizando las secuencias aminoácidicas de la
proteína madura, se tiene una diferencia de 6 aminoácidos en el dominio catalítico, los
que se pueden ver involucrados en las diferencias funcionales entre ambas enzimas.
En la Tabla 5, se detallan dichos residuos en detalle.
Tabla 5: Diferencias de residuos entre CelG y la Celulasa. Se detallan los 6 residuos en que se diferencian las
secuencias en el dominio catalítico y sus respectivas posiciones en la proteína madura.
CelG
Asn
Leu
Thr
Ala
Tyr
Ser
Celulasa
Ser
Ile
Ser
Val
Asp
Ala
Posición
18
26
40
90
133
180
Ninguno de estos residuos está incluido en el grupo de los 20 residuos que
interaccionan directamente con el sustrato [21], por lo que la diferencia no recae en la
interacción con éste, si no que probablemente en la conformación del dominio durante
la catálisis. Si se analizan las características de los aminoácidos de la Tabla 5, se
puede ver que existen dos aminoácidos que son reemplazados por residuos con
características distintas, estos son el caso del residuo en la posición 180, que en CelG
corresponde a una Serina (polar), mientras que en la celulasa es una Alanina (no
polar); el otro caso corresponde al residuo correspondiente a la Tirosina (no polar) de
la posición 133 que en la celulasa corresponde a un ácido aspartico (cargado).
La diferencia de las características de estos dos residuos puede tener efectos en la
alcalinidad de ambas enzimas. Posiblemente la no polaridad de la alanina y la carga
negativa del aspartato en pH básicos, puede dar una conformación estructural al
dominio catalítico que favorezca la catálisis del sustrato, obteniéndose así una curva
55
de Actividad vs. pH con valores más altos en un rango más amplio. En el caso de
CelG, quizás la presencia de la Serina, que es un aminoácido polar, puede estar
jugando un rol en la estructura del dominio catalítico con sus cambios de carga frente
a cambios de pH, repeliendo o atrayendo, según sea el caso, a aminoácidos ubicados
en su cercanía, influyendo así en el mecanismo de reacción de los aminoácidos que sí
interaccionan con el sustrato directamente.
Observando la estructura 3D de CelG se observa que los aminoácidos ubicados en la
superficie de la proteína son: Asn18, Thr40, Ala90 y Ser180. Probablemente el cambio de
estos aminoácidos por lo indicados en la Tabla 5, le den mayor estabilidad a Cel3
frente a pH alcalinos, antecedente que se puede sumar a lo mencionado
anteriormente.
Con los antecedentes disponible (secuencias aminoácidicas) es apresurado concluir
que la diferencia en los perfiles se debe a lo afirmado anteriormente. Es por ello que
se recomienda analizar en forma más detallada el efecto de dichos residuos en la
alcalinidad de las enzimas, mediante análisis a nivel molecular del dominio catalítico o
bien experimentalmente con mutagénesis sitio-dirigida para ver que rol juegan dichos
residuos en la actividad de las enzimas.
3.3
3.3.1
CLONACIÓN DEL GEN CODIFICANTE PARA CELULASA
Diseño de partidores para el clonamiento del gen codificante para Cel3.
Para la inserción del gen de celulasa en el vector de expresión pET22b(+), se realizó a
partir del DNA genómico, un PCR con partidores, que en su diseño incluyen sitios de
corte para enzimas de restricción, enzimas que también tienen sitios de corte en el
sitio de múltiple clonamiento del vector de expresión.
Se diseñaron dos opciones de clonamiento, una incluyendo el péptido señal de
exportación al medio extracelular propio del gen codificante para celulasa, y una
segunda opción que reemplaza dicha secuencia por el péptido de exportación al
periplasma (pelB) del vector. Ambas opciones consideran la unión en el extremo
carboxi terminal de una cola de seis histidinas. Esta última conformación permite una
posterior purificación que se facilita mediante el uso de cromatografías de afinidad por
columna con resina de níquel agarosa (Ni-NTA His·Bond, Novagen), con las cuales
tendría afinidad la cola de histidinas.
56
Las secuencias de los partidores utilizados para la inserción en el vector de expresión
se detallan en la Tabla 6.
Tabla 6: Partidores para el clonamiento del gen codificante para celulasa en el vector de expresión pET22b(+).
El par CelBamHIS y Cel3XhoIA se utilizó para la opción de clonamiento sin péptido señal del gen, es decir utilizando el
péptido de exportación al periplasma (pelB) del vector. El par CelNdeIS y Cel3XhoI se utilizó para la opción de
clonamiento del gen entero.
Nombre
Secuencia (5’-3’)
Tm (ºC)*
CelBamHIS TCAACAATGGATCCTGCCGCT
61
CelNdeIS
ATTTCAATTTAAGGAAATCATATGAATAAC 60
Cel3XhoIA TAAACGCTCGAGATTACAACTATAAAG
62
*: Tm calculada por OligoCalc, Oligonucleotide Properties Calculador
(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).
3.3.2
Clonamiento del gen codificante para celulasa en el vector de expresión
pET22b(+).
A partir del DNA genómico de amplificó el gen codificante para celulasa, con los
partidores que introducen en los extremos del gen los sitios de corte para las enzimas
de restricción, requeridos para la clonación en el vector de expresión.
En la Figura 21, se puede observar el análisis de la amplificación del gen codificante
para celulasa, para ambas combinaciones de partidores.
Figura 21: Análisis electroforético de los productos de PCR para la amplificación del gen codificante para
celulasa e inserción de sitios de corte. Gel de Agarosa al 1%. M: Marcador de Peso Molecular; Carril 1:
Amplificación obtenida con CelBamHIS y Cel3XhoIA; Carril 2: Amplificación obtenida con CelNdeIS y Cel3XhoIA.
Las bandas que se observan en la Figura 21 corresponden al tamaño esperado. En el
caso de la amplificación realizada con los partidores CelBamHIS y CelXhoIA el tamaño
a obtener corresponde al gen sin su péptido señal de 32 residuos, lo que equivale a
57
una banda de 1390 pb. Y para la amplificación realizada con los partidores CelNdeIS y
CelXhoIA el tamaño a obtener corresponde al gen entero, que son 1486 pb.
Estos productos de amplificación fueron purificados desde el gel de agarosa según el
protocolo (Anexo A.7) y digeridos con las respectivas enzimas de restricción según lo
explicado en la sección 2.3.7. Posterior a eso, los insertos fueron ligados al vector de
expresión, que a su vez fue linealizado con las mismas enzimas de restricción que sus
respectivos insertos.
Los constructos fueron transformados en células DH5α de E. coli, y posteriormente
sembradas en placas LB suplementadas con ampicilina. De ambas transformaciones
se eligieron colonias, las cuales se dejaron creciendo en 4 mL de medio líquido LB con
ampicilina.
Para
identificar
aquellas
colonias
recombinantes,
se
realizaron
minipreparaciones de los cultivos con cada colonia, para luego hacer una reacción de
digestión con las enzimas de restricción utilizadas para la clonación, y así verificar la
presencia de inserto, y por ende la identificación de colonias recombinantes. El análisis
de cada digestión se puede apreciar en la Figura 22.
Figura 22: Análisis electroforético de las digestiones de las minipreparaciones. Gel de Agarosa al 1%. M:
Marcador de Peso Molecular; Primeros carriles de izquierda a derecha (Arriba) 3, 5, 9, 11, 14,1 6 y 20: digestiones de
las plasmidios provenientes de las colonias de los mismos números seleccionadas de la construcción pET-BamHI-XhoI;
Carril (Arriba) 1, 3, 5, 7 , (Abajo) ,9 ,11, 13, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23 y 24: digestiones de las plasmidios provenientes
de las colonias de los mismos números seleccionadas de la construcción pET-NdeI-XhoI.
Como se puede observar, en el conjunto de digestiones correspondientes a las
colonias con los constructos pET-BamHI-XhoI, no se observa una ninguna banda en la
altura correspondiente al inserto (1390 pb), sin embargo se observa el vector
linealizado a la altura de 5493 pb, por lo que se cree que la ligación al vector del
inserto purificado y digerido no se produjo. Con lo anterior se puede decir que no hubo
58
colonias recombinantes en este caso. Una explicación a lo anterior es que el sitio de
restricción para BamHI no haya sido reconocido por la enzima de restricción, lo que
produciría una digestión solamente en el extremo 3’ por XhoI. Así el inserto estaría no
apto para ligarse al vector de expresión linealizado, por no poseer uno de los extremos
necesarios. Por lo tanto las colonias analizadas no fueron recombinantes por que no
poseían el inserto. Posiblemente se produjo una autoligación del vector, lo que
permitió a las colonias poder crecer en al antibiótico presente en la placa.
La segunda opción, correspondiente a los constructos pET-NdeI-XhoI, muestra en
todos los casos, (algunos más débiles que otros) digestiones que sí liberaron al inserto
de tamaño esperado, que es de 1486 pb. Este caso por lo tanto si entregó colonias
recombinantes. De estas colonias fueron seleccionadas los clones 1, 5, 9 y 20 para ser
transformados a células de E.coli cepa BL21(DE3).
3.4
EXPRESIÓN DEL GEN DE LA CELULASA EN EL MICROORGANISMO
RECOMBINANTE
3.4.1
Prueba de actividad celulasa extracelular.
Con el fin de identificar aquellos clones con actividad celulasa obtenidos de las
transformaciones en células de E.coli cepa BL21(DE3), se seleccionó un grupo de
colonias para ser analizadas en placas con sustrato LB CMC 0,5 % (p/v), ampicilina
100 µg/mL e IPTG 0,1 μM.
La actividad celulasa se identifica en forma visual por la formación de un halo de color
amarillo alrededor de la colonia, lo que significa una degradación del sustrato presente
en la placa por la enzima liberada al medio. Este ensayo revela actividad extracelular,
ya que el sustrato se encuentra en el medio, por lo que de haber halo alrededor de
ésta, significa que la enzima se secretó al medio extracelular exitosamente y de
manera activa.
59
Figura 23: Ensayo de actividad de celulasa extracelular. Placa LB al 0,5% CMC (p/v), ampicilina 100 μg/mL e IPTG
0,1 μM. Colonias recombinantes provenientes del Clon Nº5, correspondiente a la construcción pET-NdeI-XhoI.
De las cuatro placas, cada una con colonias provenientes de los cuatro clones
seleccionados, una de ellas se diferenció del resto por poseer halos visiblemente más
grandes y nítidos. Las otras placas o no presentaron actividad o el halo era muy
pequeño o difuso. En la Figura 23, se muestra la placa con colonias provenientes del
clon 5, que fue la colonia con mayor actividad.
En la Figura 23 se observan halos alrededor de 19 colonias de 24 sembradas, una de
las cuales fue seleccionada para almacenarla a -80 ºC para un uso posterior.
El tener este resultado significa que se logró producir una celulasa activa, la cual es
secretada al medio extracelular en el sistema recombinante E.coli BL21(DE3)/
pET22b(+), utilizando el péptido de exportación propio del gen. Con lo que se puede
afirmar que la unión en el extremo terminal de la cola de histidinas, no afectó en el
plegamiento propio de la enzima, y por ende la actividad tampoco se vio afectada.
Con lo anterior, sería posible purificarla desde un cultivo en medio líquido, a mediante
el uso de cromatografías de afinidad en columna con resina de níquel agarosa (NiNTA His·Bond, Novagen). Un problema que puede presentarse en esta etapa, es que
la cola de histidinas no tenga acceso a la columna, por encontrarse escondida en el
plegamiento de la enzima, en este caso se podría intentar con el protocolo de
purificación utilizado para la enzima nativa. También puede suceder que se obtenga
una proteína truncada que contenga solamente el dominio catalítico, al igual que el
caso de la proteína secretada por las bacterias antárticas. En ese caso la cola de
histidinas también se perdería, por encontrarse en el extremo C-terminal junto al CBD.
La actividad fue obtenida previa incubación de las colonias a 37 ºC, por lo que se
propone producir esta enzima en medio líquido para una posterior caracterización a
60
diferentes temperaturas, y así obtener un perfil de actividad que se pueda comparar
con el de la enzima nativa purificada. También con lo anterior se podrá saber si la
proteína es secretada en su totalidad al medio extracelular, o bien un porcentaje queda
en el periplasma o citoplasma de las células.
61
4
CONCLUSIONES
Se concluye que el protocolo de purificación consistente en tres pasos: precipitación
con sulfato de amonio al 90 %, cromatografía de intercambio aniónico y por último una
cromatografía de filtración en gel, es efectivo para la obtención de la enzima en forma
pura, pero presenta un rendimiento bajo, el cual debe mejorarse. Con dicho
procedimiento se logró obtener en forma pura una celulasa, del tipo endoglucanasa,
observándose una única banda a la altura de los 36 kDa
aprox., el cual
correspondería al dominio catalítico de la enzima.
Se concluye que la celulasa extracelular nativa, secretada por el microorganismo
antártico Pseudoalteromonas
es estable por al menos 16 h a pH alcalinos. La
actividad máxima se alcanza a pH 8. Cel3 se puede clasificar entre las enzimas
moderadamente adaptadas a bajas temperaturas, ya que su temperatura óptima de
reacción es de 40 ºC aprox, mayor a las estrictamente adaptadas al frío. La enzima es
estable frente a un amplio rango de temperaturas (20 a 45 ºC).
Se concluye que esta enzima es adecuada para ser utilizada en procesos de lavado a
temperatura ambiente, ya que a 20 ºC retiene un 80 % de actividad, temperatura a la
cual las enzimas de organismos mesofílicos prácticamente no poseen actividad. Con
estos resultados es posible concluir que Cel3 posee características que son atractivas
para utilizarla como aditivo para detergentes.
Cel3 posee un P.M de 35,7 kDa y un P.I de aproximadamente 4,5. Los parámetros
cinéticos KM, VMAX y Kcat son 10,8 mg/mL, 357 U/L y 5,6x10-3 s-1.
Se concluye que el método de Genome Walking, es apropiado para la obtención de la
secuencia completa del gen de celulasa. Este gen de 1486 pb codifica para una
proteína de 494 aminoácidos.
Un análisis de la secuencia del gen de Cel3 llevó a concluir que la enzima es
secretada como un precursor que posee un péptido de exportación al medio
extracelular de 32 aminoácidos. La enzima posee un dominio catalítico y un dominio
de unión a celulosa, separados por una secuencia aminoacídica no estructurada. El
62
dominio catalítico de Cel3 presenta similitud a dominios de la familia 5 de las glicosil
hidrolasas, así como el CBD se puede clasificar entre los CBD de la familia 5.
Se concluye que la celulasa producida por el microorganismo de origen antártico es
muy similar, a nivel aminoácidico, a las endoglucanasas de origen antártico CelG y
CelX, con un 97 y 94 % de similitud, respectivamente.
Se logró clonar en forma correcta la secuencia del gen en el vector de expresión
pET22b(+), la cual se expresó en forma activa a 37 ºC. Se concluye por lo tanto, que el
sistema de expresión E. coli BL21(DE3)/pET22b(+) es apropiado para la expresión de
una celulasa recombinante activa, secretada al medio extracelular. También se
concluye que la señal de exportación del microorganismo psicrofílico es funcional en
E. coli, ya que permitió la liberación de la enzima al medio.
En suma, todo lo anterior lleva a concluir que se produjo en forma exitosa una celulasa
de origen antártico en el sistema de expresión E. coli BL21(DE3)/pET22b(+), enzima
que es muy buena candidata para su utilización en la industria de los detergentes.
63
5
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66
6
ANEXOS
A
METODOLOGÍA ADICIONAL
A.1 Determinación de la concentración de proteínas
Se midió la concentración de proteínas total en muestras mediante el método de
Bradford [28], midiendo absorbancia a 595 y 465 nm. Para la obtención de la
concentración de proteínas se utilizó una curva de calibración construida con BSA
como estándar (Anexo C.1), la cual posee un rango de linealidad confiable entre una
razón Abs595/Abs465 de 0,5-3,5, equivalente a 0,05 -0,5 mg/mL.
A.2 Extracción de DNA Genómico desde bacterias
Las bacterias se crecieron en 200 mL de medio Marino 2216, al 2 % de glucosa
(Anexo B.1 parte e), a 4 ºC con agitación orbital durante 4 días. Posteriormente el
cultivo se dividió en tubos falcón de 15 mL, con 10 mL de cultivo cada uno. Los tubos
fueron centrifugados por 10 min a 5.000 rpm
a 4 ºC. El pellet obtenido fue
resuspendido en 1 mL de Buffer TE (Anexo B.1 parte a). Luego se siguió el siguiente
protocolo de extracción de DNA genómico bacterial. (Protocolo descrito por Sambrook
& Russell) [29]:
1. En un tubo Eppendorf estéril se centrifugó a 13.000
rpm
por 1 minuto.
(Centrifuga Eppendorf 5403 de Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania).
2. Se resuspendió el pellet en 200 μL de Tritón X-100 SDS filtrado (Anexo B.1
parte b). Se agregó 200 μL de una mezcla fenol-cloroformo 1:1 más 0,3 g de
perlas de vidrio (425-600 μm). Se agitó con vortex por 2 minutos.
3. Se agregó 200 μL de buffer TE y se agitó con vortex. Luego se centrifugó por 5
min a velocidad máxima (13.000 rpm). (Centrifuga Eppendorf 5403 de
Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania).
4. La fase acuosa se transfirió a otro tubo Eppendorf estéril y se repitió la
extracción con 200 μL de cloroformo, se volvió a centrifugar a 13.000 rpm por 5
min (Centrifuga Eppendorf 5403 de Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) y se
transfirió nuevamente la fase acuosa (superior) cuidadosamente a un tubo
limpio estéril.
67
5. Se agregó 1 mL de etanol 100 % frío. Se mezcló por inversión muy despacio,
dos veces. Se dejó incubar a 4 °C por 30 min.
6. Luego de la incubación se centrifugó a máxima velocidad (13.000 rpm) por 10
min a 4 °C. (Centrifuga Eppendorf 5804 R de Eppendorf AG, Rotor Eppendorf
F45-30-11, Hamburgo, Alemania).
7. El pellet se lavó con 1 mL de etanol 70 % frío y se centrifugó por 5 minutos.
8. Se dejó secar el pellet (cerca del mechero 10 a 15 minutos) hasta que se su
color fue transparente. Luego se resuspendió en
buffer TE (400 μL) y se
agregó 1 μL de Rnasa.
9. Finalmente se guarda a -20 °C.
A.3 Electroforesis de DNA
Los fragmentos de DNA fueron analizados en geles de agarosa de una concentración
en función del tamaño del fragmento a analizar; para tamaños de DNA genómicos se
utilizó una concertación del 0,8 a 1 % (p/v), hasta 2,5 % (p/v) para fragmentos
menores a 500 pb; a los geles se agregó bromuro de etidio 5 µg/ml. Se utilizó el buffer
TAE 1X (Anexo B.3 d) para la preparación de agarosa y como buffer de corrida. La
electroforesis se realizó a 100 volts. Las muestras se prepararon en proporción 5:1 con
buffer de carga 6X (Anexo B.3 parte e). Se observó el gel sobre un transluminador UV
y se fotografió.
A.4 PCR de Colonias
Con el fin de comprobar la presencia de insertos en las colonias transformantes de
color blanco, las colonias seleccionadas se transfirieron con el extremo de una punta
estéril desde la placa de transformación hacia la placa LB agar suplementada con
ampicilina con una cuadrícula numerada. La placa se incubó a 37 ºC toda la noche.
También la punta con la colonia rescatada de la placa es pasada en 40 µL de agua
Milli-Q estéril en un tubo eppendorf de 0,6 mL. Se incubó dicho tubo a 100 ºC durante
10 min, y se transfirió 5 µL de dicha a mezcla a un tubo eppendorf de 0,6 mL con 15
µL de mezcla de PCR. La existencia de inserto se confirmó utilizando en el PCR de
colonias los partidores utilizados para la amplificación del fragmento clonado. El
protocolo del PCR fue el descrito en la sección 2.3.4.5. Los productos de PCR de
colonias fueron analizados en un gel de agarosa al 1 % (p/v).
68
A.5 Electroforesis de proteínas SDS-PAGE
Las separaciones electroforéticas en condiciones denaturantes se realizaron en una
cámara vertical MiniProtean II. Las muestras para cargar se prepararon en razón 4:1
con buffer de carga 5X, se denaturaron por ebullición durante 5 minutos y
posteriormente se cargaron en geles de bis-acrilamida al 12,5 % (p/v) preparado de
acuerdo a la metodología descrita en [26]. La electroforesis se realizó bajo voltaje
constante de 200 V, utilizando buffer de corrida descrito [26].
Para la visualización de las proteínas en el gel de poliacrilimida, se procedió a teñirlo
durante 1 h con una solución de tinción Coomasie (ver Anexo B.3 parte j) incubándolo
a temperatura ambiente con agitación orbital. Luego, se procedió a desteñirlo con la
solución de destinción (ver Anexo B.3 parte k) incubándolo a temperatura ambiente
con agitación orbital durante 1 hora.
A.6 Zimograma de Celulasas
Para determinar la actividad enzimática in situ, es decir visualizar la actividad en un gel
de poliacrilamida, se corrió un gel de bis-acrilamida al 10 % (p/v) preparado según la
metodología descrita en [26]. Las muestras se prepararon en razón 4:1 con el buffer
de carga 5X “Nativo” y se cargaron en el gel. La corrida del gel se realizo igual que la
electroforesis de proteínas normal.
Para la visualización de las bandas de actividad en el gel de poliacrilimida, se procedió
a lavarlo durante 1 h con Tritón X-100 2,5 % (p/v) incubándolo a temperatura ambiente
con agitación orbital, después de eso se lavo durante 5 minutos con agua destilada.
Luego, se procedió a incubarlo durante 10 min en el buffer a pH 10, o en su defecto
toda la noche a temperatura ambiente. Se tiñó el gel con Rojo congo al 0,1 % (p/v)
durante 15 a 20 min para finalmente lavar el gel con Cloruro de Sodio 1M.
A.7 Purificación de DNA a partir de geles de agarosa
Se cortó la banda de DNA de interés desde el gel de agarosa con un bisturí limpio,
tratando de minimizar lo más posible el fragmento, eliminando los excesos de agarosa.
69
Se colocó la agar en un tubo eppendorf de 1,5 mL limpio estéril, previamente pesado.
Se pesó el tubo con la agarosa, y se obtuvo la masa de la agarosa. Luego se siguió el
protocolo descrito por el sistema QIAEX II Gel Extratction (QIAGEN). Finalmente se
eluyó el DNA en agua Milli-Q estéril pH 8,5 a 50 ºC.
A.8 Minipreparación de DNA plasmidial
Se purificó y se extrajo el DNA plasmidial según el protocolo propuesto por el sistema
QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).
A.9 Preparación células electrocompetentes
Se incoculó 10 mL de medio SOB (Anexo B.1 parte a) con una colonia de células de E.
coli DH5α o BL21(DE3) conservadas a -80 ºC y se creció con agitación orbital durante
toda la noche a 37 ºC. Al día siguiente se midió la densidad óptica del cultivo D.O600,
utilizando como blanco medio estéril, y se calculó el volumen del inóculo necesario
para 1 L de cultivo con D.O600 final igual a 0,05. Se incubó el cultivo de 1 L de 2 a 4
horas con agitación orbital a 37 ºC hasta que se obtuvo una D.O600 entre 0,6 y 0,8.
Luego el cultivo fue enfriado en hielo durante 10 minutos y se centrifugó a 5.000 g por
10 minutos (centrifuga Sorvall® RC-28S y rotor GS-3 Sorvall®, DuPont, CT, USA). Las
células contenidas en el pellet obtenido de la centrifugación se lavan 4 veces con
glicerol 10 % (v/v) estéril. Finalmente el pellet lavado se resuspendió en el glicerol
residual del último lavado. Se alicuotó en volúmenes de 50, 75 y 100 µL para ser
almacenados a -80 ºC.
70
B
Medios de Cultivos y Buffers
B.1 Medios Líquidos
a) Medio SOB (100 mL)
•
•
•
•
•
•
2 g triptona
0,5 g de extracto de lavadura
0,0584 g de NaCl
0,0186 g de KCl
100 mL agua destilada
Autoclavar 20 min a 110 ºC.
b) Medio SOC (100 mL)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
0,36 g glucosa (20mM)
0,21 g cloruro de magnesio (10 mM)
0,25 g sulfato de magnesio (10 mM)
0,018 g cloruro de potasio (2,5 mM)
0,058 g cloruro de sodio (10 mM)
4 g triptona (20 g/L)
1 g extracto de Levadura (5 g/L)
100 mL agua destilada
Autoclavar 20 min a 110 ºC.
c) Medio Marino 2216 Difco, contiene cada 1L:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
5 g peptona
1 g extracto de lavadura
0,1 g citrato férrico
19,45 g cloruro de sodio
5,9 g cloruro de magnesio
3,24 g sulfato de sodio
1,8 g cloruro de calcio
0,16 g bicarbonato de sodio
0,55 g cloruro de potasio
0,08 g bromuro de potasio
0,034 g cloruro de estroncio
0,022 g ácido bórico
0,004 g silicato de sodio
0,0024 g fluoruro de sodio
0,0016 g nitrato de amonio
0,008 g fosfato disódico
Cada 1 L de agua destilada se disolvió 37,4 g del Medio Marino. Se hirvió unos
minutos y se esterilizó por autoclave por 20 minutos a 110 ºC.
71
d) Medio Marino 2216 al 0,5 % (p/v) CMC
Al medio marino se agregó 0,5 gramos de CMC cada 100 mL luego de hervirlo.
Se autoclavó por 20 minutos a 110 ºC.
e) Medio Marino 2216 al 2 % (p/v) Glucosa (100 mL)
Al medio marino se agregó 0,5 g de CMC cada 100 mL luego de hervirlo. Se
autoclavó por 20 minutos a 110 ºC.
f) Medio LB (Luria Bertani) contiene cada 1 L:
•
•
•
10 g Triptona
5 g extracto levadura
5 g cloruro de sodio
Se agregó 0,95 g NaCl cada 100 mL y se autoclave por 20 minutos a 110 ºC.
B.2 Medios Sólidos
a) Placas Petri con LB-agar (100 mL)
•
•
•
•
•
1,55 g de medio LB
0,95 g NaCl
1,5 g agar
100 mL agua destilada
Autoclavar 20 min a 110 ºC.
Se dejó enfriar hasta que llegue aproximadamente a los 50 ºC, se agregó
100 µL de ampicilica de concentración 100 mg/mL (concentración final de
100 µg/mL), 100 µL de IPTG 0,1 M (concentración final 100 µM) y 160 µL
de X-Gal a una concentración de 50 mg/mL. Se agregó esta mezcla a
placas petri de 8 cm antes de enfriarse totalmente. Se esperó que se
gelifique.
b) Placas Petri con LB-agar con sustrato (100 mL)
•
•
•
•
•
•
1,55 g de medio LB
0,95 g NaCl
1,5 g agar
100 mL agua destilada
50 mg Carboximetil Celulosa (CMC)
Autoclavar 20 min a 110 ºC
Se dejó enfriar hasta que llegue aproximadamente a los 50 ºC, se agregó
100 µL de ampicilica de concentración 100 mg/mL (concentración final de
100 µg/mL), 100 µL de IPTG 0,1 M (concentración final 0,1 mM). Se agregó
esta mezcla a placas petri de 15 cm antes de enfriarse totalmente. Se
esperó que se gelifique.
72
c) Placas Petri con Medio Marino 2216
Se agregó 1,5 g de agar a 100 mL de Medio Marino 2216 líquido. Se
autoclave 20 min a 110 ºC.
B.3 Soluciones y Buffers
a) Buffer TE
•
•
Tris 10 mM, pH 8
EDTA 1 mM pH 8
b) Tritón X-100 SDS
•
•
•
•
•
Tris-HCl 10 mM pH 8
Tritón X-100 2 % (v/v)
SDS (Sodio Dodecil Sulfato) 1 % (p/v)
NaCl 100 mM
EDTA 1 mM pH 8
c) Solución DNS (100 mL)
•
•
•
1 g de ácido dinitrosalicílico
20 mL de NaOH (2N)
30 g de sales de Rochelle
d) Buffer TAE 50X (1 L)
•
•
•
242 g Tris base
57,1 g de ácido acético glacial
100 mL EDTA 0,5 M, pH 8
e) Buffer de Carga 6X
•
•
Glicerol 30 % (p/v)
Azul de Bromofenol 0,25 % (p/v)
f) IPTG 0,1 M
Se preparó una solución de IPTG 0,1 M en agua Milli-Q estéril. Se esterilizó
por filtración mediante un filtro estéril con tamaño de poro de 0,2 µm. Se
almacenó a -20 ºC.
g) X-Gal 50 mg/ml
Se preparó una solución de 5-bromuro-4-cloro-3-indolil-D-galactosido (XGal) a una concentración de 50 mg/mL en N,N’-dimetil-formamida. Se
almacenó a
-20 ºC.
73
h) Ampicilina 100 mg/ml
Se preparó una solución de ampicilina en agua Milli-Q estéril a una
concentración final de 100 mg/mL. Se esterilizó por filtración mediante un
filtro con tamaño de poro de 0,2 µm. Se almacenó a -20 ºC.
i)
Carbenicilina 100 mg/ml
Se preparó una solución de carbenicilina en agua Milli-Q estéril. Se purificó
por filtración mediante un filtro con tamaño de poro de 0,2 µm. Se almacenó
a -20 ºC.
j)
Solución Tinción de Gel Coomassie (1L)
•
•
•
•
1 g Comassie Blue R-250
450 mL Metanol
450 mL Agua destilada
100 mL Acido Acético
k) Solución Destinción Gel (1L)
•
•
•
l)
450 mL Metanol
450 mL Agua destilada
100 mL Ácido Acético
Buffers utilizados para ensayo de actividad celulasa
Tabla 7: Buffers utilizados para el ensayo de actividad celulasa. Los reactivos de los buffers de pH 6 a 11 son
SIGMA, y todos se prepararon con concentración 25 mM
pH
3
5
6
7
8
9
10
11
Buffer
Citrato de Sodio
Acetato de Sodio
MES
MOPS
TRIZMA
TAPS
CAPS
CAPS
74
C
Curvas de Calibración
C.1 Curva de Calibración BSA
Se utilizaron distintas concentraciones de BSA entre 0,5 a 0,0625 mg/mL. El
blanco se realiza con agua en vez de proteína. Se determinó la concentración de
(Abs 595/Abs 465)M-(Abs 595/Abs
465)B
proteínas según el método de Bradford [28].
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
y = 6,7689x
R2 = 0,994
1,5
1,0
0,5
0,0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
BSA [mg/ml]
Figura 24: Curva de Calibración BSA
C.2 Curva de Calibración DNS
Se utilizaron distintas diluciones de una solución de glucosa de concentración de
3,125 mg/mL. A 50 µL de cada dilución de le agregó 50 µL de DNS en una placa
de 96 pocillos. Se incubó por 10 minutos a 100 ºC, se enfrió en hielo y se leyó la
absorbancia a 550 nm a 50 µL de reacción. Se utiliza como blanco agua.
75
1,0
Abs 550 nm
0,8
0,6
y = 0,0469x + 0,0021
R2 = 0,9855
0,4
0,2
0,0
0
5
10
15
20
Glucosa [mM]
Figura 25: Curva calibración DNS para la detección de azúcares reductores
C.3 Curva de Calibración Determinación Peso Molecular mediante
Filtración por Gel
Para la construcción de la curva de calibración se realizó cromatografías de
filtración por gel con proteínas de peso molecular conocido, dichas proteínas y sus
respectivos pesos moleculares se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8: Proteínas utilizadas para la construcción de la curva de calibración de peso molecular y sus
respectivos pesos moleculares
Proteína
Peso [kDa]
BSA
Ovalbúmina
Quimiotripsinógeno
Ribonucleasa A
66
43
25
13,7
P.M. [kDa]
80
60
40
20
0
5
5,5
6
6,5
Ve [mL]
7
7,5
y = -22,777x + 180,42
R2 = 0,9355
Figura 26: Curva calibración P.M en cromatografía de filtración por gel
76
8
C.4 Curva Calibración de Crecimiento de Biomasa en Medio Marino al
0,5 % (p/v) CMC
Una vez finalizado el cultivo, se tomó 15 mL de muestra, y se realizaron diluciones
en duplicado, completando un volumen de 4 mL por dilución. Se midió densidad
óptica a 600 nm. Se filtró 3 mL de cada dilución utilizando filtros de 0,2 µm, los
cuales fueron pesados antes de filtrar. Se dejaron secar los filtros durante 48 horas
en estufa a 60 ºC. Se usó como referencia un filtro seco y un filtro en el cual se
filtró solo agua. Por diferencia de peso, se obtuvo la correlación de biomasa y
D.O600 medidas.
3,0
Abs 600 nm
2,5
2,0
y = 767,47x - 0,3422
R2 = 0,9765
1,5
1,0
0,5
0,0
0,001
0,0015
0,002
0,0025
0,003
Biomasa [gr/ mL]
Figura 27: Curva de calibración de Biomasa
77
0,0035
0,004
D
Curva de Linealización según Dixon de curva de saturación
Linealización Dixon
y = 0,0028x + 0,0304
R2 = 0,9586
0,1
[CMC]/V
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
5
10
15
20
CMC [mg/mL]
Figura 28: Linealización de curva de saturación según Lineweaver-Burk
78
25