Practica 4 LA LEVADURA Y SU IDENTIFICACION

Practica 4
PRODUCCION DE ACIDO PURIVICO DURANTE LA FERMENTACION DE LA GLUCOSA POR
LA LEVADURA Y SU IDENTIFICACION
INTRODUCCION
La glucólisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a Etanol y CO2, y/ó a ácido láctico dependiendo
del organismo que lo efectúe, como siendo en el primer caso las levaduras las responsables.
Ambas rutas de fermentación son similares hasta la formación de piruvato, manteniendo idénticas las etapas
de conservación de energía que conducen a la formación de ATP.
La glucólisis no solo es la ruta principal para el metabolismo de la glucosa que conduce a la producción de
Acetil−Co−A y a su oxidación en el ciclo del ácido cítrico, sino que también proporciona una vía importante
para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los alimentos. La característica de la glucólisis de
proporcionar ATP en ausencia de oxígeno es de significado crítico biomédico, porque permite al músculo
esquelético hacer un trabajo sumamente eficiente aún cuando la oxidación aeróbica se vuelva insuficiente, a la
vez que los tejidos con capacidad glucolítica pueden sobrevivir a episodios de anoxia. Inversamente el
músculo cardíaco, que está adaptado al trabajo aeróbico, tiene una capacidad glucolítica relativamente
deficiente y supervivencia escasa bajo condiciones de isquemia. Hay un número pequeño de enfermedades en
las que las enzimas del sistema glucolítico como por ejemplo la piruvatocinasa muestran actividad deficiente;
estas anomalías se manifiestan principalmente como anemias hemolíticas. En las células cancerosas que
proliferan con rapidez, la glucólisis procede a una velocidad mucho mayor que la requerida por el ciclo del
ácido cítrico, por tanto, se produce más piruvato que el puede ser metabolizado. El resultado es una
producción excesiva del lactato, que favorece un entorno local relativamente ácido en el tumor, situación que
puede tener implicaciones con ciertos tipos de terapéutica contra el cáncer. También se produce acidosis
láctica por deficiencia de piruvato deshidrogenasa.
OBJETIVOS
• Demostrar la formación de ácido pirúvico durante la fermentación de la glucosa por levadura.
• Producir e identificar ácido pirúvico a partir de glucosa.
• Observar el comportamiento reaccionante del sistema.
• Explicar sus observaciones y resultados.
MATERIAL
• Tubos de ensaye de 13 x 100
• Tubos de centrifuga
• Tripie, rejilla, anillo, mechero.
• Baño maría.
• Pipetas de 5 ml. graduadas.
• Centrifuga.
• Vasos de precipitados de 250 y 600 ml.
• Pinzas para tubos de ensaye.
• Solución de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0, 2.0%
• Suspensión de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentación antes de su
utilización).
• Ácido tricloroacético al 10%
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• Nitroprusiato de sodio.
• 2,4 dinitrofenil−hidracina.
• Hidróxido de amonio concentrado.
• Hidróxido de sodio 0.1N
• Sulfato de amonio sólido.
Nota: un día antes de la práctica llevar su levadura para fermentarla
METODOS Y TECNICAS
Formación de Piruvato:
• Marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml. de las soluciones de glucosa a las diferentes
concentraciones 0.5, 1.0, 2.0% a ambas series.
• A una de las series de tubos adicionarles 3 ml. de suspensión de levadura con fosfatos de sodio(0.213 g/100
ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml. de la suspensión de levadura con fosfatos de
potasio(0.09 g/100 ml) y marcarlos como B.
• Colocar todos los tubos en baño maría a 37º.C por 30 minutos y añadir posteriormente a cada tubo 1 ml. de
TCA al 10% mezclado vigorosamente y centrifugar a 2500 r.p.m. por 10 minutos. Separar el sobrenadante
y desechar el precipitado.
Identificación de Piruvato:
• Reacción con nitroprusiato de sodio
En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y hervirlo.
Adicionarle 0.5 gr. de sulfato de amonio sólido y agitar.
Agregar dos gotas del reactivo y mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del tubo unas gotas de
hidróxido de amonio concentrado, hasta la formación de dos capas. La formación de un anillo verde o azul en
la interfase indica afirmativo para la prueba. Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.
• Reacción con 2,4 dinitrofenil−hidracina.−
En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y adicionar 1 ml. del reactivo, agitar con fuerza
y pasar a otro tubo la mitad de la mezcla formada, y adicionar 1 ml. de NaOH 0.1N. La aparición de un color
rojo indica prueba afirmativa.
Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Observar la coloración e intensidad de la
misma en cada caso.
CUESTIONARIO
• ¿Qué finalidad tiene adicionar a la suspensión de levadura Na2HPO4 y KH2PO4?
• ¿Porqué deben estar los tubos en baño maría a 37°C por 30 minutos.
• ¿Por qué se adiciona TCA al 10%?
• Escriba la reacción para la segunda reacción. Indicando la función del NaOH.
• ¿Explique y esquematice las reacciones que intervienen en la glucólisis?
• Esquematice la molécula de ácido pirúvico.
• ¿Cuántos enlaces fosfato de alta energía surgen en el catabolismo de la glucosa? Tanto aeróbica como
anaeróbicamente.
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• ¿Qué es el metabolismo?
• ¿Qué es catabolismo?
• ¿Qué es anabolismo?
• Esquematice y explique el ciclo de Cori.
• ¿Qué importancia tiene la glucosa en el trabajo muscular?
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