EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

EXTRACCIÓN Y
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Consideraciones iniciales
- Condiciones de limpieza y esterilidad
- Peligrosidad de algunos reactivos usados en la purificación
Fases
- Rotura-homogeneización: obtención de un lisado celular
- Bacterias: lisozima
- Plantas y hongos: rotura mecánica y/o enzimas
específicas (celulasas, quitinasas)
- Células animales: detergente
- Rotura mecánica: macerado con nitrógeno líquido, prensa
de French, homogeneizador, sonicación.
- Purificación: separación de los ácidos nucléicos del resto de
componentes celulares
- Extracción con solventes orgánicos, precipitación de
proteínas y otras impurezas
- Concentración: mediante precipitación
- Lavado y resuspensión
Rotura-homogeneización
- Prevenir la degradación del ADN
- Evitar rotura física del ADN
- Impedir acción de nucleasas: EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético)
- Detergentes: SDS, desestabilizan las membranas celulares
- Proteinasa K: degrada proteínas
- Buffer rotura, composición típica: Tris, EDTA, SDS, CTAB
Purificación
- Extracción con fenol-CIA (1:1)
(CIA: cloroformo:alcohol isoamílico 24:1)
- Acetato potásico: elimina proteínas
SDS y lípidos, precipitados por
centrifugación
Concentración
- Precipitación con alcoholes: etanol (2.5:1) o isopropanol (0,7:1), en
presencia de cationes monovalentes (Na+, K+, NH4+)
- Centrifugación en frío
- Lavado con etanol 70%. Secado.
- Resuspensión en TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8)
Purificación mediante columnas
- Gel filtración: separación por tamaño
- Columnas de afinidad, intercambiador aniónico
Purificación de ADN plasmídico
- Lisis alcalina
- Boiling
-
Rotura: tampón con glucosa, lisozima, EDTA
Desnaturalización: tampón con SDS, NaOH
Purificación: acetato potásico en solución ácida
Rotura, hervido, hielo, centrifugación.
- Columnas de
afinidad
- Gradiente de
cloruro de cesio
Purificación de ADN plasmídico
- Gradiente de cloruro de cesio
- Utiliza un gradiente de cloruro de cesio y el agente intercalante bromuro de
etidio para generar diferencias de densidad entre el ADN superenrrollado
plasmídico (ccc) y el ADN lineal cromosómico o plasmídico circular abierto (oc).
El superenrrollado acepta menos BrEt y será más denso, apareciendo más
abajo tras la centrifugación
Cuantificación de ácidos nucleicos
- Electroforesis
- Marcadores de peso molecular de concentración
conocida, comparar la intensidad de la señal tras la
tinción con bromuro de etidio. Densitometría
- Espectrofotometría
- 260 nm (máxima absorbancia de ácidos nucléicos)
- 280 nm (máxima absorbancia de proteínas)
-
ADNss: 1.0 OD = 33 µg/µl
oligonucleótidos: 1.0 OD = 20 µg/µl
ADNds: 1.0 OD = 50 µg/µl
ARNss: 1.0 OD = 40 µg/µl
Para ADN puro:
A260/A280 = 1.65 – 1.9
Para ARN puro:
A260/A280 = 2.0
EXTRACCIÓN DE ARN
Fases
- Material de partida
- Siempre fresco o congelar inmediatamente, preferiblemente en
nitrógeno líquido.
- Evitar acción ARNasas: espacio de trabajo limpio, siempre guantes, tratar en
autoclave todo el material dos veces o en horno a 260ºC durante 12 h. Todas las
soluciones tratadas con DEPC (dietil pirocarbonato) 0.1% (mezclar por agitación
durante 2-3 h al menos y luego tratar en autoclave), excepto las que llevan Tris,
para éstas usar H2O DEPC ya esterilizada de partida. El DEPC inactiva las RNAsas
por carboxietilación de determinados aminoácidos.
- Rotura: similar al caso del ADN, conveniente hacerlo en frío, por ejemplo
nitrógeno líquido. Rápidamente añadir buffer de rotura.
- Purificación: Varios sistemas.
- Mezclas tipo Trizol (Invitrogene): Isotiocianato de guanidina. Precipita
las proteínas y permite una separación de los diferentes componentes
celulares: ADN, ARN, proteínas, etc
- Extracciones con fenol-cloroformo y precipitación selectiva con LiCl
0.2 M. Siempre quedan trazas de DNA, deben eliminarse con ADNasa
libre de ARNasas, sobre todo si se va a realizar RT-PCR
- Columnas RNeasy de Qiagen: ARN de muy buena calidad, algo de
contaminación con ADN.
- Almacenamiento
En H2O DEPC a -80ºC durante semanas-meses. A -20ºC es mucho más inestable.
También precipitado con etanol/sal a -80ºC
Típico gel de agarosa con ARN
de hongos teñido con BrEt
- Las bandas intensas
corresponden a los ARN
ribosomales (aprox. 80% del total
en la célula), aproximadamente
3.4 y 1.7 kb de tamaño
- El ARNm no representa más del
2-5% del total y aparece como un
barrido o a veces no es visible
¿ARN total o ARNm?
- Para la mayor parte de usos ARN total puede ser utilizado: Northern, RT-PCR
- ARNm es imprescindible para construcción de bibliotecas de ADNc y para el
marcaje de sondas para hibridación de microarreglos.
Purificación de ARNm
- Columnas de oligo(dT)-celulosa
- Retienen el ARNm al tener una cola de poly-A en 3’. Una ronda
elimina entre 50-70% ARNr, se pierde entre un 20 y un 50% del total de
ARNm. Una segunda ronda elimina hasta 95% de ARNr y es imprescindible
para marcaje de cDNA en microarrays.
- Dyna-beads
- Dyna-beads (de Dynal), recubiertas con oligo(dT) pemiten
separar eficientemente el ARNm mediante separación magnética
Bolita magnética
Streptavidina
Biotina
Oligo-dT 25 nucleótidos
Molécula de ARNm