síntesis y evaluación biológica in vitro de compuestos de coordinación

2° Congreso Nacional de Química Médica
Flood Garibay y col.
SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA IN VITRO DE
COMPUESTOS DE COORDINACIÓN [CU(4,7-DIMETIL1,10-FENANTROLINA)(N-O)]NO3 (CASIOPEINAS®) EN
DIFERENTES LÍNEAS TUMORALES HUMANAS
b
a
a
a
Jessica Flood Garibay , Maria Elena Bravo , Lena Ruiz Azuara . Departamento de Química
Inorgánica y Nuclear, División de Posgrados, UNAM.; México, D.F. bLic. En Química, UDLA-P. Santa
Catarina Martir, Cholula, Puebla. C.P. 72820 [email protected]
RESUMEN
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial1, y en México el 10%
del total de muertes anuales son a causa de algún tipo de cáncer2. Uno de los tratamientos
de mayor importancia contra el cáncer es la quimioterapia; que es el uso de compuestos
químicos que inhiben la proliferación celular3. Todos los compuestos usados en
quimioterapia atacan células de rápida proliferación por lo que los efectos secundarios son
severos4. Actualmente existen cinco fármacos de origen inorgánico a base de platino
aprobados para la práctica clínica; siendo el cisplatino el de más amplio uso5. En general,
los tratamientos existentes tienen altos precios y son difíciles de adquirir por la población de
escasos recursos. Por lo anterior la Dra. Lena Ruiz Azuára desarrolló en la década de los
80’s la familia de compuestos Casiopeínas® como fármacos antinopleásicos de menor
costo6,7. En el presente trabajo se realizó la síntesis de siete compuestos de esta familia,
teniendo como ligante diimina la 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina y como ligante a-aminoacidato
siete distintos a-aminoácidos (Gli, Ala, Ac. A. But, Val, Leu, Isoleu y Norleu). Los
compuestos sintetizados de acuerdo con las patentes36 fueron caracterizados por A.E., IR,
IR-lejano, UV, UV-visible, EPR, conductimetría y meff. Por último se llevaron acabo
pruebas de inhibición de la proliferación celular por el ensayo de Sulforodamina B
encontrando que todos los compuestos son activos en las líneas celulares utilizadas,
especialmente en HeLa; y en todos los casos superan la actividad inhibitoria del cisplatino.
Palabras clave: cáncer, quimioterapia, casiopeínas.
INTRODUCCIÓN
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial1, y en México
el 10% del total de muertes anuales son a causa de algún tipo de cáncer2. Uno de los
tratamientos de mayor importancia contra el cáncer es la quimioterapia3; tratamiento que
ataca células de rápida proliferación, por lo que los efectos secundarios son severos4.
Actualmente existen cinco fármacos de origen inorgánico a base de platino aprobados para
la práctica clínica; siendo el cisplatino el de más amplio uso5. En general, los tratamientos
existentes tienen altos precios y son difíciles de adquirir por la población de escasos
recursos. Por lo anterior la Dra. Lena Ruiz Azuára desarrolló en la década de los 80’s la
familia de compuestos Casiopeínas® como fármacos antinopleásicos de menor costo. Las
Casiopeínas ® son una familia de compuestos de coordinación de cobre (II) en cuya esfera
de coordinación hay dos ligantes bidentados; un ligante de tipo diimina (N-N) y un segundo
ligante de tipo a-aminoacidato (N-O) o donador (O-O)6,7.
En el presente trabajo se realizó la síntesis de siete compuestos de esta familia,
teniendo como ligante diimina la 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina y como ligante αaminoacidato siete distintos α-aminoácidos (Gli, Ala, Ac. A. But, Val, Leu, Isoleu y Norleu).
Los compuestos sintetizados de acuerdo con las patentes36 fueron caracterizados por A.E.,
IR, IR-lejano, UV, UV-visible, EPR, conductimetría y µeff. Por último se llevaron acabo
pruebas de inhibición de la proliferación celular por el ensayo de Sulforodamina B
2° Congreso Nacional de Química Médica
Flood Garibay y col.
encontrando que todos los compuestos son activos en las líneas celulares utilizadas,
especialmente en HeLa; y en todos los casos superan la actividad inhibitoria del cisplatino.
OBJETIVO
Sintetizar, caracterizar y evaluar la actividad biológica in vitro en distintas líneas
tumorales humanas de compuestos pertenecientes a la familia de las Casiopeinas®
manteniendo el ligante diimina (4,7-dimetil-1,10-fenantrolina) constante y variando la
longitud de la cadena carbonada del ligante α-aminoacidato.
METODOLOGÍA
Síntesis y Caracterización. Los complejos fueron sintetizados según el lo reportado
en las patentes8 después de lo cual fueron caracterizados por Análisis Elemental (%C, %H,
%N, Analizador Elemental Pager 2000), IR (dilución sólida en KBr, 400-4000 cm-1,
Espectrofotómetro fT-IRNicolet Avantar 320), IR lejano (dilución sólida en CsI, 200-650 cm 1
, Espectrofotómetro IR Burker Vector 22), UV (EtOH: 25°C, Espectrofotómetro de Arreglo
de Diodos Hewlett Packard 8452a), UV-Visible (muestras en polvo, Espectrofotómetro UVVIS-NIR Carey 5E), EPR (polvos a 25°C y solución MeTOH/H2O 1:1 a 77K; banda X,
Espectrofotómetro de Resonancia Paramagnética Electrónica Broker Elexsys E500),
Momento Magnético (Balanza de Susceptibilidad Magnética Mkl Sherwood Scientific) y
Conductimetría (H2O 1mM, Instrumento de Conductividad YSI 3100). La geometría de los
complejos fue determinada calculando los factores isotrópicos del EPR y graficando en
gráficas de Symons9.
Determinación de la CI50 in vitro. Se utilizó el ensayo de la Inhibición de la
Proliferación celular y tinción con Sulforrodamida B en las líneas tumorales humanas HeLa,
PC-3, HCT-15 y SKLU-1 adquiridas a la American Type Culture Collection (ATCC)10,11. Las
concentraciones utilizadas fueron de 0.01, 0.1, 1.0 y 10.0 µg/ml; como control positivo se
utilizó Cisplatino y como control negativo se utilizó H2Odist. La CI50 fue calculada utilizando el
método estadístico Probit con el programa Log Probit Análisis by Maximum Likelihood de
Novartis.
2° Congreso Nacional de Química Médica
Flood Garibay y col.
RESULTADOS
#
Compuesto
1
[Cu(4,7-dm-fen)(Gli)]NO3•2H2O
CuC16H20N4O7
2
481.98
[Cu(4,7-dm-fen)(Isoleu)]NO3•3H2O
CuC20H30N4O8
7
467.95
[Cu(4,7-dm-fen)(Leu)]NO3•H2O
CuC20H26N4O6
6
489.93
[Cu(4,7-dm-fen)(Val)]NO3•H2O
CuC19H24N4O6
5
421.90
[Cu(4,7-dm-fen)(Ac.A.But.)]NO3•3H2O
CuC18H26N4O8
4
443.87
[Cu(4,7-dm-fen)(Ala)]NO3
CuC17H18N4O5
3
P.M.
(g/mol)
517.98
[Cu(4,7-dm-fen)(Norleu)]NO3•2H2O
CuC20H28N4O7
499.98
%Obs.
%Calc.
∆
%C 43.57
%C 43.29
0.28
%H 4.58
%H 4.54
0.04
%N 12.52
%C 48.24
%N 12.62
%C 48.40
0.10
0.16
%H 4.28
%H 4.30
0.02
%N 13.20
%C 44.67
%N 13.28
%C 44.12
0.08
0.55
%H 5.27
%H 5.53
0.26
%N 12.19
%C 48.67
%N 11.43
%C 48.77
0.76
0.10
%H 5.30
%H 5.17
0.13
%N 11.98
%C 49.63
%N 11.97
%C 49.84
0.01
0.21
%H 5.44
%H 5.44
0.00
%N 11.52
%C 46.42
%N 11.62
%C 46.37
0.10
0.05
%H 6.02
%H 5.84
0.18
%N 10.58
%C 48.02
%N 10.82
%C 48.04
0.03
0.02
%H 5.26
%H 5.64
0.38
%N 11.44
%N 11.21
0.23
Tabla 1. Análisis Elementales, Pesos Moleculares y Rendimientos. ∆ =% Observado - %
Calculado
%Rend
29.34%
53.67%
70.96%
61.08%
48.46%
11.11%
7.18%
2° Congreso Nacional de Química Médica
#
(-NH3)
(COO
-
Flood Garibay y col.
(C=C)
(NO3)
(N=C)
(N-CU-O)
1579.05
1383.32
871.77
559.25
(CU-N)
539.97
(CUN)
487.90
(CUO)
316.27
1
3305.50
)
1600.91
2
3253.91
3430.33
1656.60
1577.92
1382.19
871.13
559.25
235.27
539.97
464.76
487.90
279.60
347.12
3
3326.50
1627.90
1580.34
1383.58
869.46
556.49
539.97
466.69
482.12
277.69
320.13
4
3222.45
3305.40
1647.59
1578.15
1385.21
870.94
559.25
539.97
462.83
484.05
325.91
5
3243.35
3440.48
1649.76
1580.34
1383.60
865.30
561.18
430.05
538.04
464.76
484.05
316.13
6
3261.19
3463.93
1615.58
1579.05
1384.23
869.90
557.32
539.97
462.83
484.05
327.84
7
3313.18
1657.52
1579.10
1384.02
869.26
559.25
287.41
538.04
462.83
484.05
322.05
-
466.68
364.48
3243.16
Tabla 2. Señales de IR debido a los ligantes (N-N) y (N-O); así como de coordinación con el centro
metálico.
#
1
2
3
4
5
6
7
λmax1a
ε1
λmax2a
ε2
λmax3b
Λ
µeff
(nm)
(molL-1cm1
)
68,550.08
57,754.97
54,836.84
54,922.78
78,201.65
72,021.11
72,930.45
(nm)
(molL-1cm1
)
54,185.55
46,428.56
43,732.78
46,394.81
64,357.72
63,276.15
54,661.98
(nm)
(µ
µS)
(M.B.)
610.94
596.23
626.64
609.54
595.57
605.39
614.79
102.05
104.65
121.55
100.49
100.10
98.25
126.88
1.780
1.895
2.051
1.814
1.771
1.685
1.692
210
210
210
210
210
210
210
274
274
274
274
274
274
274
Tabla 3. Señales de UV , UV-Visible (Reflectancia Difusa),Conductividad (Λ
Λ) y Momento Magnético
Efectivo (µ
µeff).
a
b
a
Sólidos
#
1
2
3
4
5
6
7
g⊥
2.0697
2.0603
2.0630
2.0719
2.0696
2.0664
2.0695
g
2.2399
2.2727
2.2490
2.3123
2.3079
2.2905
2.2718
gz
2.239
2.236
2.238
2.236
2.231
2.235
2.236
gx
2.002
2.057
2.058
2.057
2.057
2.057
2.057
gy
2.058
2.003
2.002
2.000
2.000
2.001
2.001
Solución
giso
2.081
2.117
2.118
2.117
2.115
2.116
2.117
Az
178.88
182.72
184.77
183.00
186.98
183.00
181.39
Ax
11.7
12.6
12.3
12.5
12.5
12.2
12.4
Aiso
67.43
69.31
69.79
69.33
70.66
69.13
68.73
2° Congreso Nacional de Química Médica
Flood Garibay y col.
Para predecir la geometría de los compuestos, se calcularon los valores de giso y Aiso
(Tabla 4) con las siguientes fórmulas:
giso = (g+2g⊥ )/3
Aiso = (A+2A⊥ )/3
giso = (gz+2gx )/3
Aiso = (Az+2Ax )/3
Y se graficaron los valores obtenidos para los compuestos sintetizados en este
trabajo en una gráfica de Symons, la cuál muestra compuestos reportados en la literatura
cuyos datos de EPR y Rayos X son bien conocidos9. En la gráfica de Symons (Gráfica 1) los
compuestos con mismas geometrías forman grupos bien definidos; todos los compuestos
sintetizados caen entre los compuestos que presentan geometría cuadrada plana o pirámide
de base cuadrada, lo cual sugiere una geometría D4h distorsionada, misma que esta
reportada para esta familia de compuestos (cuadrado plano distorsionado)12,13.
Gráfica de Symons
2,22
Compuestos Sintetizados
Geometría Cuadrada (axial)
Geometría Tetrahédrica
Geometría Cuadrada Distorsionada
Pirámides de Base Cuadrada
Compuestos Hexacoordinados
2,20
2,18
giso
2,16
2,14
2,12
2,10
2,08
55
60
65
70
75
80
85
Aiso
Gráfica 1. Gráfica de Symons.
#
1
2
3
4
5
6
7
*
HeLa
CI50
CI50
(µ
µg/ml)
(µ
µM)
0.4544
1.0237
0.2513
0.5956
0.7245
1.4788
0.7029
1.5021
0.7344
1.5238
0.3321
0.6413
0.5887
1.1774
5.0573
16.8549
PC-3
CI50
CI50
(µ
µg/ml)
(µ
µM)
0.8308
1.8717
3.2497
7.7025
2.9473
6.0158
1.8782
4.0137
1.0005
2.0758
3.5891
6.9302
2.7705
5.5412
7.2535
24.1746
HCT-15
CI50
CI50
(µ
µg/ml)
(µ
µM)
1.6423
3.7000
5.8910
13.9631
3.3988
6.9374
2.1492
4.5928
3.1386
6.5120
4.1424
7.9987
1.8438
3.6877
SN
SKLU-1
CI50
CI50
(µ
µg/ml)
(µ
µM)
2.2069
4.9720
4.0355
9.5651
4.1172
8.4036
4.2041
8.9841
4.1063
8.5196
5.2324
10.1033
4.5448
9.0900
4.9713
16.5684
Tabla 5. Ensayo de la Inhibición celular en HeLa, PC-3, HCT-15 y SKLU. SN= sin respuesta. * =
Cisplatino.
2° Congreso Nacional de Química Médica
Flood Garibay y col.
CONCLUSIONES
Los 7 compuestos sintetizados según las patentes8 son compuestos que contienen
Cu como centro metálico y se comportan como electrolitos 1:1 de acuerdo a los valores de
µeff y conductividad encontrados. Así mismo se encontró en los estududios de IR, IR lejano,
UV y UV-visible que los compuestos sintetizados son ternarios presentando en su
estructura al ligante diimina a la 4,7-dimetil-1,10-fenantrolina y como ligante aminoacidato
los diferentes α-aminoácidos utilizados, y cuya geometría en polvo a temperatura ambiente
es cuadrada plana distorsionada (D4h) según los estudios de EPR. La pureza de cada uno
de los compuestos fue confirmada por el Analisis Elemental.
II
En el ensayo in vitro de inhibición del crecimiento celular se encontró que los
compuestos ternarios de cobre sintetizados en este trabajo son activos en todas las líneas
celulares probadas; mostrando una mayor actividad en HeLa. Igualmente se concluye que
los compuestos exhiben una actividad mayor al cisplatino. Por otro lado se encontró que la
actividad biológica de los compuestos aumenta al aumentar la cadena lineal principal del αaminoacidato coordinado en las líneas celulares PC-3 y HCT-15.
BIBLIOGRAFÍA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Organización mundial de la Salud (2002) Cervical Cancer Screening in Developing Countries: Report of a
WHO consultation. Organización Mundial de la Salud. Francia.
Fernández, C.S. (2005) El IMSS en Cifras. Los Tumores malignos en población derechohabiente, 19902003. Revista Médica del IMSS, 43, 349-356.
a
King, J.B.R. (2000) Cancer Biology. [2 Edición] Pearson Prentice Hall. Singapore.
Fricker, S.C. (1996) Metal Compounds in cancer therapy. Chapman & Hall. USA. Capítulo 1 y 2.
McClevert, J.A. & Meyer, T.J. (2004) 9.18 Metal Complexes as Drugs and Chemotherapeutic Agents.
Comprehensive Coordination Chemistry II. From Biology to Nanotechnology. Vol.9 Applications of
Coordination Chemistry. [Editor del Volumen: Ward, M.D.] Elsevier Pergamon, Reino Unido.
Bravo, M.E.; Tovar, A.; Ruiz, M.; Ruiz, R.L.& Moreno, E. R. Diseño, Sintesis y Caracterización de
®
compuestos de Coordinación de Cobre Casiopeinas . Memorias de 5ª Jornada de Trabajos en
Casiopeínas. Primer Congreso en Casiopeínas. Taxco, Guerrero, 2 a 3 de Diciembre de 2002. p 1-9.
Aguilera, E.R.; Martinez, E.M.T.; Mácías, R.L.; Cortés, M.L.; Ortiz, M.R.; Ruiz, R.L. & Garcia, M.I.
Estimación del porcentaje de Muerte celular por Apoptosis y Necrosis en Células HeLa, Inducido por cinco
Casiopeínas de la Familia III. Memorias de 5ª Jornada de Trabajos en Casiopeínas. Primer Congreso en
Casiopeínas. Taxco, Guerrero, 2 a 3 de Diciembre de 2002. p 49-55.
Dirección General de Invenciones, Marcas y Desarrollo Tecnológico (SECOFI) Registros Número 18801120579 y 18802-120580. U.S.A. Patent Number 5-107,005. (1992), U.S. Patent Re35, 458, Feb. 18. (1996).
Tovar, A.T. (2005) Caracterización cristalográfica y EPR de complejos mixtos de Cu(II) (Casiopeínas) e
interacciones con algunas biomoléculas. Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México.
México, D.F.
Skehan, P.; Storeng, R.; Scudiera, D.; Monks, A.; MacMahon, J.; Vistica, D.; Warren, T.J.; Bokesch, H.
Kenny, S. & Boyd, R.M. (1990) New Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug Screening. Journal
of the National Cancer Institute, 82, 1107-1112.
Marquez, A.Q. & Marín, H.A. Curso de Cultivos Celulares. UNEXA, Facultad de Química de la Universidad
nacional Autonoma de México, 15-18 Agosto 2000.
Gasque, L.; Moreno-Esparza, R.; Ruíz-Ramirez, L. & Medina-Dickenson, G. (1999) Aqua(4,7-diphenyl-1,10pnenantroline)(salicylaldehydato)copper (II) nitrate monohydrate. Acta Crystalografica, C55, 1065-1067.
Solans, X.; Gasque, L.; Moreno-Esparza, R.; Ruíz-Ramirez, L. & Martínez, A. (1992) Mixed Chelate
Complexes. III. Structures of (L-Alaninato)(aqua)(2,2’-bipyridine)copper(II) Nitrate Monohydrate and
Aque(2,2’-bipyridine)copper(II) Chloride Trihydrate. Acta Crystalografica, C48, 1785-1788.