Comunicaciones orales - Sociedad Española de Inmunología

Comunicaciones orales
AUTOINMUNIDAD Y TOLERANCIA
O-1. INDUCCIÓN DE TOLERANCIA A LPS
EN MONOCITOS HUMANOS POR LA VÍA
DEL CD14 SOLUBLE
B Vázquez, C Moreno, N Ramírez, A SánchezIbarrola
Servicio de Inmunología. Clínica Universitaria. Faculad
de Medicina. Universidad de Navarra. Pamplona
La molécula reconocedora del receptor multimérico para LPS en monocitos (mCD14) se
p resenta en condiciones fisiológicas como
sCD14. Se ha visto que sCD14 es responsable de
la activación funcional por LPS de células que
no expresan mCD14. En monocitos humanos la
unión de complejos sCD14-LPS a un receptor no
identificado supone activación monocitaria y
p roducción de citoquinas pro i n f l a m a t o r i a s .
N o s o t ros hemos documentado pre v i a m e n t e
estos aspectos funcionales monocitarios en un
modelo experimental de depleción de mCD14
mediante bloqueo de la exocitosis por Brefeldina
A (BFA). En el presente trabajo y utilizando el
mismo modelo, queremos tratar la posibilidad
de inducción de tolerancia a LPS a través de la
interacción de complejos LPS-sCD14 y su receptor.
Se cultivaron células mononucleares de sangre periférica de donantes sanos en presencia de
10 µg/ml BFA durante 24 horas a 37°C, 5% CO2.
A continuación se lavaron y se incubaron con
10 ng/ml LPS de E. coli durante 6 horas.
Posteriormente se efectuó un segundo estímulo
con 100 ng/ml LPS durante 4 horas. La activación celular se comprueba mediante cuantificación de las células productoras de citoquinas
intracelulares; distintos controles incluyen una
única exposición a LPS para comparar con el
modelo de tolerancia a LPS.
En monocitos humanos estimulados por complejos sCD14-LPS no vemos diferencia en la activación cuando se exponen a una o dos dosis de
LPS. La producción de citoquinas proinflamatorias es la misma en el modelo de inducción de tolerancia a LPS que en el modelo de activación por
una única exposición a LPS (n = 7, IL-1, β = 14,8%
rango 11-20, TNFα = 15,6% rango 11-18, versus
IL-1β = 18% rango 8-23, TNFα = 18% rango 9-21).
Se discute el hecho y la significación fisiopatológica de la resistencia a la tolerancia a PS por vía
sCD14.
O-2. PÚRPURA TROMBOPÉNICA INDUCIDA
POR UN ANTICUERPO MONOCLONAL
DIRIGIDO FRENTE A UNA PROTEÍNA
DE SUPERFICIE 35 Kda EXPRESADA EN
PLAQUETAS Y ENDOTELIO DE RATÓN
M. Rodríguez-Calvillo, I. Gabari, M. Duarte,
G. Mazzolini, J. Prieto, I. Melero
Unidad de Terapia Génica. Departamento de Medicina
Interna. Universidad de Navarra. Pamplona
La púrpura trombótica inmune (PTI) es una
de las causas más frecuentes de trombopenia que
se encuentra en la práctica clínica hematológica. Nosotros hemos producido un panel de anticuerpos monoclonales inmunizando ratas con
líneas de células endoteliales derivadas de ratón.
Uno de estos anticuerpos (EOL5F5) inmunoprecipita una proteína de superficie de 35 Kda en
condiciones reductoras y no reductoras a partir
de lisados de plaquetas y de células endoteliales
de ratón. La administración in vivo de este anticuerpo monoclonal purificado induce una purpura clínica franca con un número grande de
petequias que se distribuyen uniformemente en
la superficie de la piel. En estos ratones ocurre
una trombopenia intensa pero transitoria, ya que
se recupera completamente en una semana.
Mediante inmunohistoquímica se detecta el
antígeno reconocido por EOL5F5 en los capilares dérmicos sugiriendo que los efectos dañinos
del anticuerpo sobre células endoteliales pueden además de la trombopenia contribuir a la
púrpura que se observa y explicar la localización
selectiva de las hemorragias en la piel. El síndrome hemorrágico inducido por EOL5F5 imita la
fase efectora de la púrpura trombopénica inmune y permite establecer modelos experimentales
de utilidad.
1
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
O-3. INMUNOLOGÍA DE LA DIABETES
EN UN MODELO MURINO RIP-IFN EN
BACKGROUND SUSCEPTIBLE (NOD)
Y RESISTENTE (NOR)
A. Alba, J. Verdaguer, M. C. Puertas, J. Carrillo,
F. Bosch*, R. Pujol-Borrell, M. Vives-Pi
Unidad de Inmunología. Hospital Germans Trías i
Pujol, Badalona y *Departamento de Bioquímica.
Facultad de Veterinaria. UAB. Barcelona
La diabetes tipo I se produce por una destrucción autoinmune de las células beta del páncreas;
factores ambientales y genéticos son determinantes en el proceso. En páncreas de pacientes diabéticos se han detectado transcritos de interferones de tipo I.
Objetivo: determinar el papel del IFN-β en la
etiopatogenia de la enfermedad.
Métodos: generación de un ratón transgénico
RIP-IFN-β (CD1) que expresa IFN-β humano en
las células productoras de insulina; retrocruzamiento con ratones NOD (modelo de diabetes
espontánea) y NOR (resistente); determinación
de incidencia, grado de insulitis, caracterización
del infiltrado, autoanticuerpos, secreción y contenido de insulina.
Resultados: a) aceleración y aumento de la incidencia de la enfermedad en F1(RIP-IFN-β x NOD)
y (RIP-IFN-β x NOR) (Tabla I); b) presencia de
insulitis en función de la edad, aumentada en RIPIFN-β vs CD1 (control); c) infiltrado: c.1) TCD4+
> TCD8+ > DCs > macrófagos > B; c-2) hiperexpresión de MHC de clase I en células β; d) presencia de anticuerpos anti-islote (ICA); e) el transgén
no causa disminución de la secreción de insulina.
Tabla I
Modelo
Edad
(sem)
RIP-IFN-β
12
%
IDDM
%
IDDM M
%
IDDM H
7
13
0
FI(RIP-IFN-β 12
x NOD)
10
18
0
FI(RIP-IFN-β 12
x NOR)
25
29
20
30
14
26
0
RIP-IFN-β
Conclusiones: la expresión de IFN-β contribuye
a la autoinmunidad aumentando la expresión de
MHC de clase I y presumiblemente la presentación
antigénica endógena. El proceso se ve acelerado
en background susceptible y resistente y, aunque
de momento los estudios se han centrado en F1,
se espera un aumento de la incidencia en sucesivas generaciones.
2
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
O-4. NUEVOS AUTOANTICUERPOS
EN LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO
I. Aguilera, J.R. García-Lozano, A. Núñez-Roldán,
I. Wichmann
Servicio del Inmunología. Hospital Universitario Virgen
del Rocío. Sevilla
Antecedentes: a una paciente con lupus eritematoso sistémico (LES) se le detectaron en el suero
anticuerpos que producían un patrón de immunofluorescencia indirecta (IFI) atípico, en células
Hep-2, con numerosos trazos en el citoplasma, no
observado anteriormente en nuestro laboratorio.
Objetivos: identificar la diana o dianas celulares
reconocidas por los autoanticuerpos presentes en
el suero de esta paciente.
Métodos: a) IFI en células Hep-2 para analizar
la distribución del antígeno(s); b) Western blot;
c) rastreo de una genoteca de expresión HeLa
λ-Zap para aislar clones expresando el/los antígenos; d) secuenciación del cDNA obtenido y búsqueda de homologías en los bancos de datos.
Resultados: se aislaron dos clones, CVR8 con un
inserto de 1,2 Kb y CVR18 con un inserto de 1,0
Kb. Una vez secuenciados se identificó el inserto
de CVR8 con el oncogén K-ras y el de CVRl 8 con
el gen HKE4 también llamado RING5, una proteína con regiones ricas en histidina por lo que se cree
que es una proteína transmembrana, aunque su
función es desconocida. Tras expresar cada uno de
los antígenos en E. coli se purificaron anticuerpos
del suero por afinidad con estos antígenos.
Encontramos que los anticuerpos anti-K-ras nos
reconocen la misma banda en WB (de 130 Kd
aprox.) que reconocía el suero original. Los anticuerpos anti-HKE4 no producen ninguna banda
en WB pero reproducen el patrón de immunofluorescencia observado también con el suero original.
Conclusiones: la identificación de estos nuevos
anticuerpos viene a ampliar la ya vasta gama de
autoanticuerpos que aparecen en el LES dirigidos
frente a proteínas de replicación y transcripción.
Estos anticuerpos de pacientes con enfermedades
autoinmunes pueden ser herramientas muy útiles
para estudiar mecanismos de fisiología celular.
O-5. POLIMORFISMO DEL GEN FcγRIIIB
EN PACIENTES ESPAÑOLES DE LUPUS
ERITEMATOSO SISTÉMICO (CASO I)
F. Aguilar, M.ª P. Bermudo, Y. Vega, J. Sánchez
Román, M.ª F. González Escribano, A. Núñez
Roldán
Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Virgen
del Rocío. Sevilla
Introducción: el lupus eritematoso sistémico
(LES) es una enfermedad autoinmune caracteri-
INMUNOLOGÍA
COMUNICACIONES ORALES
zada por la presencia de autoanticuerpos e inmunocomplejos circulantes. Defectos en los genes
que tienen relación con la eliminación de inmunocomplejos, tales como: los componentes tempranos y receptores del complemento y los receptores de la fracción Fc de las inmunoglobulinas
(FcγRs), pueden estar implicados en la susceptibilidad o evolución del LES. FcγRIIIB se expresa
en los neutrófilos y traduce la señal para la fagocitosis y para el estallido respiratorio. Se ha descrito
un polimorfismo en este gen, denominado
NA1/NA2 que consiste en la sustitución de 5 bases
que se traduce en el cambio de 4 aminoácidos. Se
ha comprobado que los neutrófilos de individuos
NA2NA2 muestran niveles más bajos de fagocitosis que los de individuos NA1NA1.
Objetivos: estudiar la influencia del polimorfismo NA1/NA2 del gen FcγRIIIB en la susceptibilidad o evolución del LES.
Material y métodos: nuestro estudio se llevó a
cabo en 276 pacientes de lupus (99 nefritis) y 194
controles mediante un sistema de PCR-SSP.
Resultados: la frecuencia del genotipo NA2NA2
se encontraba aumentada en pacientes con respecto a los controles (61,2 versus 51,0%; p=0,03; OR
= 1,5). No se encontraron diferencias significativas en la distribución de frecuencias genotípicas o
alélicas entre pacientes con y sin nefritis.
Conclusiones: estos resultados indican que el
polimorfismo del gen FcγRIIIB puede estar implicado en la susceptibilidad al lupus eritematoso sistémico.
tan mayores niveles de transcripción que los individuos AA.
Objetivo: estudiar la influencia del polimorfismo del gen MCP-1 en la susceptibilidad y manifestaciones clínicas del LES.
Material y métodos: el polimorfismo de MCP-1
se determinó en 276 pacientes de LES (99 nefritis
y 54 vasculitis cutáneas) y 194 controles mediante un sistema de PCR-RFLP con la enzima de restricción PvuII.
Resultados: no se encontraron diferencias significativas en cuanto a la distribución de frecuencias entre pacientes y controles, ni cuando se dividieron los pacientes según la presencia o ausencia
de nefritis. Cuando los pacientes se clasificaron
según la presencia o ausencia de vasculitis cutáneas la frecuencia de los heterozigotos AG se
encontraba aumentada entre pacientes con vasculitis (52 versus 32%; p = 0,006; OR = 2,3).
Conclusiones: estos resultados indican que el
polimorfismo del gen MCP-1 puede estar implicado en el desarrollo de vasculitis cutánea en pacientes de lupus eritematoso sistémico.
O-6. POLIMORFISMO DEL GEN FcγRIIIB
EN PACIENTES ESPAÑOLES DE LUPUS
ERITEMATOSO SISTÉMICO (CASO II)
En la IDVC se distingue un grupo de pacientes
que, a pesar de cumplir los criterios del IUIS ( niveles séricos disminuidos de IgG e IgA, deficiente
formación de anticuerpos específicos y exclusión
de otras causas de hipogammaglobulinemia), presentan una clínica predominantemente autoinmune.
Estos pacientes plantean dificultades tanto en
el diagnóstico (por la escasa clínica infecciosa)
como en el manejo terapéutico.
Presentamos tres pacientes con IDVC cuya clínica está dominada por los fenómenos autoinmunes
(citopenias, gastritis atrófica, enteropatía autoinmune, neumonitis intersticial y artritis). El tratamiento
de los brotes incluyó inmunosupresores y gammaglobulina a dosis moduladoras (0,4 g/kg/día durante 5 días). A pesar de la ausencia de infecciones,
excepto las relacionadas con la inmunosupresión,
las cifras de IgG sérica por debajo de 300 mg/dl en
dos de los tres pacientes, llevaron a instaurar de forma empírica y profiláctica, tratamiento con inmunoglobulina IV a dosis sustitutiva (0,4 g/kg/mes).
Tras un periodo medio de seguimiento de 12 meses,
los tres pacientes permanecieron libres de infecciones y la patología autoinmune experimentó franca
F. Aguilar, M.ª P. Bermudo, Y. Vega, J. Sánchez
Román, M.ª F. González Escribano, A. Núñez
Roldán
Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Virgen
del Rocío. Sevilla
Introducción: el lupus eritematoso sistémico
(LES) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la presencia de autoanticuerpos, concentraciones elevadas de componentes activos del
complemento y formación y deposición de inmunocomplejos. Estos estímulos provocan la activación de los leucocitos de sangre periférica y de las
células endoteliales que secretan moléculas proinflamatorias que desencadenan el desarrollo de glomerulonefritis y/o vasculitis severas. MCP-1 es
una potente quimiocina atrayente de monocitos a
las zonas de inflamación. Recientemente, se ha
descrito un polimorfismo en la región promotora
nt –2518 (A/G) de este gen que afecta a los niveles
de transcripción. Los individuos AG o GG presen-
O-7. IDVC CON CLÍNICA AUTOINMUNE:
DIFICULTADES DIAGNÓSTICAS Y
TERAPÉUTICAS
L. Sánchez, F. León, C. Cámara, R. Pena, J. A. García,
A. Bootello, J. L. Castañer
Servicio de Inmunología. Hospital Ramón y Cajal.
Madrid
3
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
mejoría en dos de ellos, empeorando tras la retirada
de la gammaglobulina para la vacunación diagnóstica.
A pesar de la dificultad en establecer una relación causa-efecto entre la normalización de los
niveles séricos de gammaglobulinas y la mejoría
de los procesos autoinmunes, estos casos ilustran
la posible utilidad de este abordaje.
O-8. MICA Y NO MICB ES EL GEN QUE
DETERMINA LA SUSCEPTIBILIDAD A LA
ARTRITIS PSORIÁSICA
S. González, J. Martínez-Borra, J. C. Torre-Alonso,
A. López-Vázquez, C. López-Larrea
Biología Funcional. Universidad de Oviedo. Servicio de
Inmunología. Hospital Central de Asturias. Oviedo
Objetivo: determinar si MICA está primariamente asociado con artritis psoriásica (PsA) o su
asociación es secundaria a desequilibrio de ligamiento con un gen cercano.
Métodos: se analizaron 65 pacientes con PsA y
109 controles. En estos individuos fueron tipados
para Cw*0602, HLA-DR, HLA-B y se determinaron las repeticiones de un microsatélite situado en
el intrón 1 de MICB.
Resultados y conclusiones: HLA-Cw*0602 estaba
incrementado en pacientes con PsA (Pc <0,00001,
OR = 7). Hay un ligero incremento de todos los alelos que están en desequilibrio de ligamiento con Cw6
en nuestra población (B13, B37, B50 y B57). MICAA9 estaba incrementado en pacientes con PsA
(Pc<0,0012, OR = 3,36). Hay un incremento secundario de los alelos de HLA-B que están en desequilibrio de ligamiento con MICA-A9, como HLA-B38,
B39 y B57. MICB-CA22 está incrementado en enfermos con PsA (Pc<0,05, OR=3,8). Este polimorfismo
forma parte del haplotipo extendido Cw6-B57MICA-A9-MICB-CA22, y su asociación es secundaria a desequilibrio de ligamiento. Los diferentes
haplotipos asociados con PsA llevan diferentes alelos MICB y HLA-DR. Esto sugiere que MICA está primariamente asociado con PsA, y HLA-B38, B39, B57
y MICB-CA-22 están asociados secundariamente al
desequilibrio de ligamiento con MICA-A9.
O-9. IMPLICACIÓN FUNCIONAL DEL
POLIMORFISMO GENÉTICO DE CD154
M. J. Citore, P. Pérez-Aciego, A. Durántez*
Fundación Lair. *Medicina Interna I. Clínica Puerta de
Hierro. Madrid
CD154 es una proteína implicada en la regulación del sistema inmune y en procesos como la
4
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
inflamación. Su hiperexpresión se ha relacionado
con enfermedades autoinmunes y su ausencia con
inmunodeficiencias, lo que indica que su expresión debe estar sujeta a un control estricto. Esta
regulación es fundamentalmente postranscripcional por estabilidad de ARNm y está involucrado
su extremo 3UTR. En esta región se encuentra un
microsatélite (CA)n que podría influir en dicha
estabilidad y por tanto en la expresión proteica de
CD154.
Objetivo: valorar el posible papel funcional del
microsatélite localizado en el 3UTR del ARNm de
CD154.
Métodos: células polimorfonucleares de sangre
periférica (PBMC) de 30 sujetos sanos con distintos grupos de alelos del polimorfismo: <24CA,
24CA (alelo mayoritario) y >24CA, se sometieron
a varios estímulos in vitro y se midió la expresión
de CD154 en LT y LB por citometría de flujo.
Resultados: cuando los PBMC se activaron con
PMA más ionomicina o SAC más IL2, no se encontraron diferencias ni en los niveles de CD154 ni en
su cinética de expresión. Sin embargo, tras 72
horas de estimulación con PHA más anti-CD28, la
expresión de CD154 disminuía en homocigotos
para 24CA o <24 CA, mientras que en los homocigotos para alelos con >24CA dicha expresión
seguía aumentando. La diferencia de expresión
entre estos grupos era significativa tanto en LT
(p = 0,0068) como en LB (p = 0,024).
Conclusión: el polimorfismo localizado en el
3UTR de CD154, puede estar involucrado en el
mantenimiento de la expresión de dicha proteína
ante estímulos específicos de LT.
O-10. ARA, EMA, GECA Y AGA
AUTOANTICUERPOS EN PACIENTES
ESPAÑOLES CON DIABETES MELLITUS
INSULINODEPENDIENTE Y SU RELACIÓN
CON EL FENOTIPO HLA
J. M. Martín Villa*, J. C. López Suárez*, M. Pérez
Blas*, J. Martínez-Laso**, S. Ferre López**,
J. Manzanares***, G. Lledó****, A. Arnaiz
Villena*,**
*Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
Complutense de Madrid. **Inmunología, ***Gastroen terología Infantil, ****Endocrinología Infantil. Hospital
Universitario 12 de Octubre. Madrid
Se estudió la frecuencia de anticuerpos frente a
reticulina, endomisio y gliadinaen en un grupo de
86 pacientes diabéticos. Además se determinó su
fenotipo HLA. Como grupo control se consideraron una población de 76 pacientes con enfermedad celíaca y 176 individuos sanos no emparentados.
INMUNOLOGÍA
Cuatro pacientes diabéticos (5%) poseían ARAIgG (patrón R1), ocho (9%) AGA-IgG y ocho (9%)
AGA-IgA. No se encontraron EmA y GECA.
Al comparar el grupo de diabéticos ARA-IgG+
con el ARA-IgG-, se encontró un aumento en la
frecuencia de HLA-DR7 (p = 0,064), mientras que
al comparar el grupo AGA-IgG+ con el AGA-IgG,
HLA-DR6 y HLA-DQ1 mostraron un aumento significativo (p = 0,034 y p = 0,015, respectivamente).
Cuando se realizaron comparaciones con un
grupo de pacientes celíacos (no diabéticos) se
observó un aumento en la frecuencia de HLA-DR4
y HLA-DQ3 (p = 0,00001) en el grupo de pacientes AGA-IgA+, mientras que HLA-DQ2 estaba disminuido en el grupo de pacientes diabéticos AGAIgG+ y AGA-IgA+ (p=0,0045).
Finalmente, al comparar el grupo diabético con
un grupo control sano, hay un descenso en la frecuencia de HLA-DR7 en el grupo ARA-IgG- (p =
0,0000001), mientras que en el grupo AGA-IgGHLA-DQ3 está aumentando (p = 0,00005) y HLADR6 y HLA-DQ1 disminuidos (p = 0,0072 y p =
0,00001) respectivamente). Estos datos sugieren
que el componente genético relacionado con la
aparición de los anticuerpos específicos de celiaquía en pacientes diabéticos, difieren según el tipo
de autoanticuerpos y es también diferente al componente genético de susceptibilidad a padecer diabetes en la población española.
O-11. ASOCIACIÓN DE LOS
POLIMORFISMOS DE LA MBL CON EL
FENOTIPO DEL LUPUS ERITEMATOSO
SISTÉMICO
M. I. García-Laorden, I. Rua-Figueroa*,
M. J. Citores**, P. Pérez-Aciego**, J. C. RodríguezPérez***,C. Erausquin*, A. Bilbao*, A. Anabitarte**,
A. Domínguez, C. Rodríguez-Gallego
Servicios de Inmunología, *Reumatología y ***Nefro logía. Hospital Dr. Negrín. Las Palmas Gran Canaria.
**Fundación LAIR (Grupo de Estudio de Genética de
LES)
La MBL es una proteína sérica que participa en
la inmunidad innata. Su defecto, como el de otros
componentes del sistema de complemento, se ha
asociado a un aumento de la susceptibilidad a
infección y a desórdenes autoinmunes. Se analizaron en población canaria dos grupos de mujeres: 82 pacientes con LES y 188 controles. Los
haplotipos del gen se estudiaron mediante PCRRFLP, SDM-PCR-RFLP y PCR-SSP.
No se observaron diferencias significativas en las
frecuencias génicas ni genotípicas entre pacientes y
controles. Al analizar a las pacientes según sus características clínicas, se vió que la prevalencia de anti-
COMUNICACIONES ORALES
cuerpos anti-RNP disminuía en aquellas con alelos
mutados (p=0,034), así como con genotipos bajo o
no-productores. De manera similar, la prevalencia
de anticuerpos anti-Sm era menor en las pacientes
con genotipos bajo o no-productores (p=0,024). Por
otro lado, en pacientes homozigotas o heterozigotas
para alelos mutados, las edades de inicio de enfermedad y de cumplimiento de 4 criterios, fueron
mayores (p = 0,009 y p = 0,022).
Los polimorfismos de MBL no se asocian con
mayor susceptibilidad a padecer LES; sin embargo, pueden afectar a la presentación de la enfermedad, al menos en mujeres. Las pacientes con déficit de MBL: a) presentan una edad de inicio de la
enfermedad más tardía; b) la prevalencia de anticuerpos anti-Sm y anti-RNP es menor.
O-12. PRESENCIA DE ANTICUERPOS
FRENTE A SEROALBÚMINA BOVINA
EN PACIENTES DIABÉTICOS CON
AUTO-ANTICUERPOS CARACTERÍSTICOS
CELÍAQUIA
A. Fuertes Huerta, C. Rodríguez Juan, L. Sala
Silveira, M. Pérez Blas, M. J. Recio, J. M. Martín
Villa
Servicio de Inmunología. Facultad Medicina. UCM.
Madrid
Los anticuerpos anti BSA se implicaron como
factor de riesgo en la aparición de la DMID.
Además algunos diabéticos desarrollan anticuerpos EmA, ARA, y AGA, marcadores de enfermedad celíaca.
Se estudió la presencia de anticuerpos frente a
BSA en diabéticos divididos en dos grupos según
tenían (n = 16) o no (n = 63) EmA, ARA o AGA, y se
comparó con un grupo control (n=45), pacientes
celíacos (n=30) y pacientes con tiroiditis (n=10).
Se realizó un ELISA adsorbiendo BSA sobre
placas de poliestireno. Se utilizó un suero que
producía unas lecturas espectrofotométricas muy
elevadas para crear una curva patrón y transformar los valores de densidad óptica (DO) obtenidas en unidades estándar. Se utilizaron 45 sueros
sanos para establecer el punto de corte a part i r
del cual se consideraba que el suero era positivo
(X + 3SD = 26,2 U), y se compararon las medias
de las unidades obtenidas en cada grupo (MannWhitney).
Sólo los celíacos (X = 38,8 U) y los diabéticos
con anticuerpos de enfermedad celíaca (X = 35,7
U) mostraron niveles elevados de anticuerpos
anti-BSA por encima del punto de corte establecido, a diferencia del resto de los grupos.
Además, estos valores difieren estadísticamente al compararlos con cualquiera de los otros tres
grupos, mientras que no difieren entre sí.
5
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
Los pacientes con un aumento de la permeabilidad intestinal (enfermedad celíaca o diabéticos
con marcadores de enfermedad celíaca), producen
anticuerpos anti-BSA.
TRANSDUCCIÓN DE SEÑAL
APOPTOSIS Y MOLÉCULAS
DE ADHESIÓN
O-13. LAS SEÑALES INHIBIDORAS
INICIADAS POR CD3-<EPSILON>
DEPENDEN DE LA FOSFORILACIÓN
SELECTIVA DE LA TIROSINA N-TERMINAL
DE SU ITAM
M. Guirado, T. Orta, I. de Aós, L. Rivas*,
C. Terhorst**, M. Zubiaur***, J. Sancho
Instituto de Parasitología y Biomedicina, Consejo
Superior de Investigaciones Científicas, Granada.
*Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior
de Investigaciones Científicas, Madrid. **Division of
Immunology, Beth Israel Deaconess Medical Center,
Harvard Medical School, Boston, MA. EE.UU.
***Hospital Clínico Universitario San Cecilio. Granada
Se estudiaron señales tempranas mediadas por
CD3-<epsilon> en células Jurkat TCR/CD3+
transfectadas con receptores quiméricos CD8<alpha>-CD3-<epsilon> (denominado CD8-<epsilon>
wt) o los correspondientes mutantes en las tirosinas del motivo de secuencia denominado ITAM
(Y170F, Y181F o Y170F/181F). La estimulación
simultánea del TCR/CD3 endógeno y de la quimera Y181F induce una inhibición selectiva de: a) la
fosforilación en tirosina de determinadas proteínas; b) la liberación de Ca2+ intracelular; y c) la
activación de las MAP-quinasas Erk1 y Erk2.
Por el contrario, no se observaron estos efectos
con las otras quimeras (CD8-<epsilon> wt, Y170F
o Y170F/Y181F). Estos y otros datos sugieren que
las señales mediadas por CD3-<epsilon> dependen del grado de fosforilación de su ITAM y de las
proteínas efectoras asociadas al mismo.
O-14. LA ACTIVACIÓN DE RAS/ERK
MEDIADA POR CD38 O EL TCR/CD3 PUEDE
OCURRIR POR UNA VÍA ALTERNATIVA
QUE NO REQUIERE LOS ITAM DE CD3-zeta,
NI LOS ADAPTADORES LAT O SLP-76
M. Zubiaur, B. Malissen*, F. Malavasi**,
J. Sancho***
Hospital Clínico Universitario San Cecilio. Granada.
*Centre d'Immunologie CNRS/INSERM de Marseille
-Luminy. Marseille, Francia. **Laboratory of Immu -
6
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
nogenetics. Torino, Italia. ***Instituto de Parasitología
y Biomedicina, Consejo Superior de Investigaciones
Científicas. Granada
Los linfocitos T pueden activarse a través del
receptor para el antígeno (TCR/CD3) o mediante
la estimulación de otros receptores de membrana
entre los que se incluye el correceptor CD38.
Datos previos de nuestro laboratorio indican que
el módulo CD3-gamma, -delta, -epsilon es necesario y suficiente para activar el linfocito T a través de CD38. En este trabajo mostramos la señalización mediada por CD38 en linfocitos T que
expresan una subunidad CD3-zeta del TCR/CD3
que carece de todos los ITAM (CD3-zeta truncada), o en linfocitos deficientes en la expresión de
los adaptadores LAT o SLP-76. En estos linfocitos
la estimulación de CD38 con el anticuerpo monoclonal anti-CD38, IB4, o del TCR/CD3 con el anticuerpo anti-CD3, OKT3, induce la activación de
la MAP quinasa Erk independientemente de la
presencia de los ITAM de CD3-zeta, de la fosforilación de LAT y/o de la presencia de LAT o SLP76. Por tanto, los resultados sugieren que la activación de Ras/Erk mediada por CD38 o el
TCR/CD3 puede ocurrir por una vía alternativa
que no requiere CD3-zeta ni la fosforilación de
LAT o SLP-76.
O-15. WIP (WASP INTERACTING PROTEIN)
REGULA POLIMERIZACIÓN DE ACTINA A
TRAVÉS DE N-WASP Y LA FORMACIÓN DE
FILOPODIUM
N. Martínez-Quiles*, R. Rohatgi**, I. M. Antón*,
M. Medina***, J. H. Hartwig****, R. S. Geha*,*****,
N. Ramesh*
*Division of Immunology. Children’s Hospital and
****Division of Experimental Medicine Brigham and
Women’s Hospital. *Departments of Pediatrics, **Cell
Biology. ***Neurology and ****Medicine. Harlard
Medical School. Boston, Massahusetts. EE.UU.
En 1994 fue clonado el gen mutado en la inmunodeficiencia síndrome de Wiskott-Aldrich
(WAS), desde entonces diversos estudios han relacionado la proteína (WASP) con la regulación del
citoesqueleto de actina. Nuestros estudios se han
centrado en la caracterización de WIP, una proteína que interacciona con WASP. En esta comunicación presentamos hallazgos que serán recientemente publicados (Nature Cell Biology, vol 3,
May), que sugieren que WIP es un regulador de
WASP. A través del estudio de la fisiología de la
interacción entre un homólogo de WASP, llamado
N-WASP y WIP, concluimos que el complejo
WASP/WIP es un regulador de la activación del
INMUNOLOGÍA
complejo Arp2/3 en la polimeración de actina, y
de la formación de filopodia, en la ruta de GTPasa
Cdc42.
O-16. ACTIVACIÓN DE LA RUTA
DE SEÑALIZACIÓN RHO-RHO-QUINASA
(P160ROCK) POR LA QUIMIOQUINA SDF-1:
PAPEL DE P160ROCK EN EL
MANTENIMIENTO DE LA MORFOLOGÍA
Y LA MIGRACIÓN DE LINFOCITOS
J. Román Cabrero, M. Vicente-Manzanares, M. Rey,
M. Pérez-Martínez, F. Sánchez-Madrid
Servicio de Inmunología. Hospital de La Princesa.
Universidad Autónoma de Madrid. Madrid
La ruta de señalización que implica a la GTPasa
Rho y a p160ROCK (quinasa asociada a Rho) en la
activación celular inducida por SDF-1 se ha estudiado en linfocitos humanos de sangre periférica.
SDF-1 induce la activación de RhoA pero no la de
Rac1. La activación de RhoA induce la activación
de p160ROCK, la cual conduce a la fosforilación de
MLC (cadena ligera de miosina), que por lo tanto
es dependiente tanto de la actividad de RhoA como
de p160ROCK. El análisis cinético de la activación
de RhoA, p160ROCK y de la fosforilación de MLCK
sugiere una activación secuencial de las tres moléculas. Se examinó el papel de esta ruta de señalización en la morfología celular y en las respuestas funcionales a SDF-1 mediante el uso de distintos
inhibidores químicos. La inhibición de pl60ROCK
no bloquea la polimerización de actina a corto plazo inducida por SDF-1 ni afecta a la polaridad celular, pero induce la formación de largos apéndices
celulares sustentados por actina. Por el contrario
ML-7 (inhibidor de MLCK) inhibe completamente
la polarización celular. Además, la inhibición en distintos pasos de la ruta Rho-p160ROCK-MLCK bloquea la migración de los linfocitos inducida por
SDF-1. Nuestros resultados indican que el eje Rhopl 60ROCK juega un papel decisivo en el control de
la morfología celular como condición previa para
la quimiotaxis dirigida de 1.
O-17. PROTEÍNAS ADAPTADORAS
Y SEÑALIZACIÓN MEDIADA POR CD5
J. M. Vilà, I. Gimferrer, O. Padilla, M. Arman,
L. Places, J. Vives, J. Alberola-Ila, F. Lozano
Institut Clínic d'Infeccions i Immunología (ICII).
Hospital Clínic. Facultat de Medicina. Universitat de
Barcelona. Barcelona
Introducción: CD5 es una glicoproteína linfocitaria capaz de modular las señales mediadas por el
COMUNICACIONES ORALES
receptor antigénico por mecanismos todavía no
bien conocidos. CD5 es susceptible de ser fosforilado y de inducir fosforilación de numerosos sustratos intracelulares. Se desconoce si dichas fosforilaciones incluyen proteínas con función
adaptadora que acoplarían CD5 a diferentes cascadas señalizadoras.
Objetivo: estudiar el patrón de proteínas adaptadoras asociadas a Grb2, inducido durante la activación linfocitaria vía CD5.
Métodos: análisis del contenido en fosfotirosinas de proteínas adaptadoras inmunoprecipitadas
de lisados de células Jurkat estimuladas vía CD3 o
CD5.
Resultados: el patrón de fosfoproteínas asociadas a Grb2 en células estimuladas vía CD5 difiere
del inducido vía CD3. Existen bandas comunes de
120 y 76 kD y bandas específicas para CD3 o para
CD5 de 36/38 y 55 kD, respectivamente. La banda
de 120 kD corresponde a Cbl y la de 36/38 kD a LAT.
La intensidad de la fosforilación de Cbl vía CD5 es
similar a la inducida vía CD3. Es rápida y transitoria y no se afecta por la deleción de 2/3 C-terminales
de la región citoplasmática de CD5, ni por sustitución de sus residuos tirosina. En cambio, la de LAT
es muy débil comparada con la inducida vía CD3.
Conclusiones: dado el papel señalizador negativo atribuido a Cbl, el predominio de la fosforilación de Cbl sobre LAT podría estar relacionado con
la función moduladora negativa reportada para
CD5 en timocitos y células B1a.
O-18. DETECCIÓN EN UNA LIBRERÍA
LINFOCITARIA DE LA INTERACCIÓN DE
LAS PROTEÍNAS DEL CICLO CELULAR SKP2
Y CksH1: EFECTO SOBRE LA FUNCIÓN DE
CDK2 QUINASA
L. Mongay, S. Plaza, E. Vigorito, C. Serra-Pagès,
J. Vives
Servei d’Immunología. Institut Clínic d’Infeccions i
Immunología (ICII). Hospital Clínic. Barcelona
La proliferación celular, la apoptosis y destrucción proteica por ubiquitinización son procesos
cuyo equilibrio es esencial para una adecuada
regulación de la respuesta inmune. Estos procesos
se pueden considerar como mecanismos estrechamente relacionados con los mecanismos reguladores del ciclo celular. Bajo esta línea nos propusimos conocer las interacciones proteicas de la
molécula SKP2 (S-phase kinase associated protein)
que se ha descrito que actúa en los procesos de ubiquitinización y en la regulación del ciclo celular
formando complejos con ciclina A y CDK2. Para
ello, mediante la técnica de Two hybrid, en la que
se utilizó una librería de linfocitos humanos, se
detectó la interacción de SKP2 con CksHs1. Se
7
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
había descrito que la proteína CksHsl se podía asociar con ciclina A y CDK2, pero aún no se conoce
su función ni tampoco se conocía su capacidad de
unión a SKP2. La unión de SKP2 con CksHs1 que
observamos por Two Hybrid se confirmó mediante estudios de coprecipitación en las líneas linfoides CEM y Jurkat. Utilizando los adecuados constructs observamos también que SKP2 se asocia con
CksH1por su región C terminal. Debido a que
ambas moléculas se asocian con CDK2, estudiamos su acción sobre la función de CDK2, observando mediante transfecciones en células COS-7
que la sobreexpresión de CksHs1 inhibe la actividad CDK2 quinasa y que la expresión adicional de
SKP2 neutraliza esta inhibición y restaura la actividad CDK2 quinasa. Asimismo se demostró que
la asociación de CksHs1 y SKP2 es mutuamente
exclusiva sugiriendo que podría poseer un efecto
funcional sobre la regulación de la actividad quinasa de CDK2.
O-19. CUANDO LAS CÉLULAS
DENDRÍTICAS SON INFECTADAS
CON ADENOVIRUS RECOMBINANTES
DEFECTIVOS SE ACTIVA NFκ-B Y MADURAN
PARCIALMENTE
M. Duarte, P. Bova, M. Rodríguez-Calvillo,
I. Narvaiza, C. Qian, J. Prieto, I. Melero
Unidad de Terapia Génica. Departamento de Medicina
Interna. Universidad de Navarra. Pamplona
Las células dendríticas se vienen usando como
adyuvantes naturales para inducir respuestas
inmunitarias con utilidad terapéutica. Para conseguir esto, los genes que codifican para antígenos
relevantes son transfectados en células dendríticas mediante vectores virales y no virales. Los adenovirus recombinantes defectivos que codifican
para antígenos o citoquinas, se utilizan con gran
eficiencia para transfectar ex-vivo células dendríticas. Hemos estudiado los efectos de infectar células dendríticas humanas y murinas, con adenovirus que codifican para el gen reportero βgalactosidasa (AdCMVLacZ). La infección con
AdCMVLacZ induce la translocación nuclear de
de diferentes factores de transcripción de la la
familia de NFκ-B, a través la inducción de fosforilación de Ik-B, según se demuestra mediante geles
de retardo de movilidad e inmunoblots. La activación de NFκ-B se indujo también, con cápsides
virales semipurificadas o adenovirus sin transgen,
pero no mediante un adenovirus que codifica para
un inhibidor dominante negativo de IkB
(AdCMVIκ-B). AdCMVLacZ a diferencia de
AdCMVIκ-B, induce aumentos en la expresión de
CD40, CD80 y CD86 con aumentos menos significativos de la expresión de MHC clase II. También
8
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
induce la expresión de IL-6 pero no de TNFα ni
IL-12. Estos cambios, hacen que las células dendríticas sean más eficientes en inducir proliferación en MLR alogénicos. Nuestros resultados
muestran que los adenovirus recombinantes inducen de forma independiente de transgen, cambios
en el estatus madurativo de células dendríticas
humanas y murinas que son relevantes para sus
funciones.
O-20. RENAL CELL CARCINOMA INDUCES
APOPTOSIS IN JURKAT CELLS BY
CASPASE-8-DEPENDENT AND
MITOCHONDRION-DEPENDENT
PATHWAYS THAT ARE DOWNREGULATED
BY BCL-XL OVEREXPRESSION
L. Molto, L. Reese, C. Tannenbaum, T. Bloom,
P. Rayman, R. Bukowski, A. Novick, J. Finke
Departments of Immunology, Urology and Cancer
Center. The Cleveland Clinic Foundation. Cleveland,
EE.UU.
Apoptosis of immunocompetent cells is dependent on prior upregulation of Fas (or TNF-related) receptors following engagement by its ligand
or a strong antigenic challenge. These mechanisms
can result in the suicide or activation-induced celldeath of immunocompetent cells. Procaspases are
inactive cisteine proteases activated during apoptosis. Recruitment and cleavage of caspase-8 is one
step in cell death pathway following Fas receptor
ligation. In turn, caspase-8 is responsible for the
activation of downstream caspases, such as caspase-3 which is responsible for the cleavage of intracellular proteins and the eventual demise of the
cells. However some components of the apoptotic
sinal require amplification through the mitochondrion pathway by release of apoptosis-inducing
proteins such as caspase-9 which in turn also cleaves caspase-3. Here we dissect the ability of FasLexpressing Renal Cell Carcinoma 45 line (RCC45)
to induce apoptosis in Jurkat lines.
Material and methods: after coculture with
RCC45 Jurkat lines were stained for DNA break
using APO-BrdU TUNEL apoptosis delection kit
and analyzed in a FACsan. Whole cell lysate of protein of Jurkat was isolated in lysis buffer containing protease inhibitors. Equivalent amounts of
protein were resolved on 12.5% SDS-PAGE gel,
transfected to nitrocellulose and probed with specific Ab and horseradish peroxidase-linked secondary Ab and then visualized by chemiluminiscence.
Results: by repeated culture in FasL-enriched
supernatants we obtained a mutant Jurkat cell line
resistant to treatment with anti-Fas antibody. The
mutant Fas-resistant Jurkat cell line has surface
INMUNOLOGÍA
expression of Fas receptor in a range similar to that
found in WT Jurkat cells but is caspase-8 negative
(C8-). However following coculture with RCC45
cell line 65% of wild type (WT) Jurkat cells underwent DNA fragmentation. C8- Jurkat cells were
killed in a lower range than that found in WT
Jurkat cells (27%). Immunoblotting showed that
WT Jurkat cells cocultured with RCC45 express
cleaved products of caspase 8 (37, 35 kD), caspase 9 (35 kD) and caspase 3 (17 kD), whereas C8Jurkat cells showed only a pattern of cleavage for
caspase 9 (35 kD) and 3 (17 kD) but no expression
of caspase 8. Experiments also showed that following 72 hours of coculture overexpression of BclXL in Jurkat cells protects these cells from apoptosis induced by RCC45 and Etoposide treatment.
Conclusion: our results show that in Jurkat cells
there are 2 signaling pathways of apoptosis following interaction with tumor, one that is mainly
signaled by caspase 8 and caspase 3 cleavage and
the other involves the mitochondrial pathway of
activation of caspases 9 and 3. However overexpression of Bcl-XL, protects Jurkat cells from both
receptor-mediated and mitochondrial pathway of
cell death following interaction with RCC45
tumor cell line.
O-21. ATAXIA TELANGIECTASIA:
MUTACIONES NUEVAS Y ACTIVACIÓN
LINFOCITARIA DEFICIENTE A TRAVÉS
DE LA PROTEÍNA KINASA C
L. M. Allende, M. A. García-Pérez, A. Corell,
P. Varela, A. Moreno, A. Sotoca, E. Paz-Artal, E.
Sarreiro*, A. Moreno*, S. Ferre, P. Paule, A. ArnaizVillena
Departamento de Inrnunología y Biología Molecular.
*Departamento Genética. Hospital 12 de Octubre.
Universidad Complutense. Madrid
La ataxia telangiectasia es una enfermedad
autosómica recesiva caracterizada por ataxia cerebelar progresiva, telangiectasias óculo-cutáneas,
inmunodeficiencia, concentraciones séricas elevadas de α-fetoproteína e inestabilidad cromosómica.
El gen responsable de la ataxia telangiectasia
(ATM) se mapeó en el cromosoma 11 y se sabe que
codifica para una proteína (ATM) que juega un
papel muy importante en el mantenimiento de la
estabilidad del genoma y en la transducción de
señal.
En este trabajo se han caracterizado inmunológica y molecularmente tres pacientes con ataxia
telangiectasia. El paciente 1 presenta dos mutaciones de splicing que afectan a los exones 15 y 21 del
gen de la ATM. El paciente 2 presentó una deleción genómica en homozigosis de 28 nucleótidos
COMUNICACIONES ORALES
en el último exon del gen. Esta deleción cambia la
pauta de lectura normal tras el aminoácido 3.008
y por tanto originará una proteína ATM truncada.
El paciente 3 es un heterocigoto compuesto donde sólo se descubrió uno de los defectos que consistió en una transición G>A en el primer nucleótido del intrón 62 (sitio donante de splicing) lo cual
dio lugar a la deleción completa del exón 62.
Los resultados de proliferación celular obtenidos durante 3 años mostraron un defecto en la coactivación con PMA (activador de la proteína
Kinasa C) tras la estimulación con CD69, CD26,
CD28, CD3, PHA, PWM and Con A y no utilizando otros como CD2 o ionomicina., por lo que se
podría proponer una posible interacción entre
ATM y PKC.
HISTOCOMPATIBILIDAD
O-22. UTILIZACIÓN DE LA TÉCNICA RSCA
(REFERENCE STRAND MEDIATED
CONFORMATION ANALYSIS) PARA
RESOLVER AMBIGÜEDADES DE TIPAJE
DEL GEN HLA-DRB1
A. Corell, A. L. Pay, A. M. Little, M. A. Oddinott,
J. R Argüello, H. Ogilvie, J. O’shea, J. A. Madrigal,
S. G. E. Marsh
Departamento de Pediatría, Inmunología, Obstetricia y
Ginecología. Facultad de Medicina. Universidad de
Valladolid
Anthony Nolan Research Institute, Royal Free Hospital,
London, Reino Unido
Se muestra la utilización de la técnica RSCA
(Reference Strand mediated Conformation Analisis) para resolver sin ninguna ambigüedad tipajes de HLA-DRB1 en dos casos de trasplante de
médula ósea utilizando un banco de donantes no
emparentados.
En el primer caso, el tipaje del gen HLA-DRB1,
tanto por el método SSP (PCR con primers específicos de secuencia) como SSO (tipaje con
Oligonucleótidos específicos de secuencia) realizados de modo rutinario en dos laboratorios diferentes, dieron resultados ambiguos para dos posibles donantes. Ambos individuos resultaron
tipados como HLA-DRB1*04011 + 0403 ó alternativamente HLA-DRB1*0407 + 0413. Esta ambigüedad no se podía resolver mediante secuenciación directa del exón 2 de los genes HLA-DRB1,
pues nos encontraríamos de nuevo con la misma
ambigüedad. Utilizando células homocigotas de
tipaje para los alelos HLA-DRB1*04011, 0403 y
0407 y utilizando la técnica RSCA, ambos individuos fueron tipados como HLADRB104011 +
9
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
0403, sin ningún tipo de ambigüedad. De modo
que ambos eran válidos como donantes, puesto
que el receptor se había tipado mediante estudio
familiar como HLA-DRB1*04011 + *0403
mediante estudio familiar.
En el segundo caso, un donante fue tipado como
HLA-DRB1 * 1102 + 1103 mediante la técnica SSP,
y de modo contradictorio la técnica SSO excluía
del tipaje el alelo HLADRB1*1102. En tanto que
el receptor se había tipado sin ambigüedades como
HLADRB1*1101 + *1103. Utilizando de nuevo la
técnica RSCA y células homocigotas de tipaje para
los alelos HLA-DRB1*1101, *1102, *1104 y heterocigotas para HLADRB1*1101 + *1103, se pudo
determinar sin ambigüedades que el donante
potencial era HLA-DRB1 * 1103 homocigoto.
Por lo tanto, y aunque esta técnica aún no está
completamente desarrollada para realizar un tipaje de alta resolución de los alelos de HLA-DRB1,
en la actualidad puede ser empleada como una
herramienta muy valiosa para resolver ambigüedades de tipaje generadas por otras técnicas, como
SSP, SSO o SBT (secuenciación directa) con una
elevadísima fiabilidad. Es necesario disponer de
células homocigotas de tipaje con los alelos HLADRB1 involucrados en las ambigüedades.
O-23. UNA NUEVA VARIANTE DE HLA-B37
CON HISTIDINA EN LA POSICIÓN 171
N. Gómez-Lozano, E. Estefanía, R. de Pablo, M. E.
Moreno, C. Vilches
Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Clínica
Puerta de Hierro, Madrid
El antígeno HLA-B37 está representado con una
baja frecuencia en la población caucásica española. Se ha publicado la existencia de dos alelos HLAB*37; el segundo de ellos es en realidad una quimera entre B*3701 (dominio alfa-1) y B*27
(porción carboxi-terminal). Durante un estudio
familiar rutinario de tipificación HLA obtuvimos
indicios de la existencia de una nueva variante de
HLA-B*37. Un miembro de la familia (H156H2)
mostraba patrones de PCR-SSP y PCR-SSO reverso compatibles con la presencia de HLA-B*37,
excepto por una extrarreacción en PCR-SSOr no
explicable por los alelos B*37 conocidos.
Mediante microlinfocitotoxicidad se observó reactividad con algunos sueros que reconocían a los
antígenos HLA-B37 o B18.
Para determinar el origen de dicha extrarreacción, obtuvimos cDNA a partir de células mononucleadas de sangre periférica del donante mencionado (H156H2) y amplificamos la región codificante
completa de HLA-B mediante PCR con cebadores
específicos para sus regiones 5’ y 3&#8217
no traducidas. Tras clonar el producto de PCR y
seleccionar mediante PCR-RFLP clones portadores
10
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
de un inserto relacionado con B*37, determinamos
su secuencia de nucleótidos. De acuerdo con ésta,
H156H2 posee una nueva variante de HLA-B*37 que
porta una sustitución de Tyr por His en la posición
171 (hélice alfa del dominio alfa-2). Este polimorfismo es único entre los alelos B*37, pero es compartido por otros alelos HLA-B, principalmente
B*14, B*18 y algunos B*51.
O-24. EVOLUCIÓN DE LOS GENES DE
HISTOCOMPATIBILIDAD EN UN MODELO
NATURAL DE AVES SUDAMERICANAS
A. Arnaiz-Villena, S. Ferre, J. Martínez-Laso,
P. Varela, E. Lowy, J. Guillén, J. Zamora, L. M.
Allende
Departamento de Inmunología y Biología Molecular.
Hospital 12 de Octubre. Universidad Complutense..
Madrid
La evolución de los genes de histocompatibilidad
ha llevado aparentemente a la existencia de un gran
polimorfismo en las especies “no naturales” (muy
consanguíneas) estudiadas, incluyendo el pollo,
ratón y el hombre. No hay modelos naturales donde
se puede estudiar la evolución de estos genes. En el
presente trabajo se han conseguido recolectar la
mayoría de las especies de los jilgueros/lúganos sudamericanos (género Carduelis) que aparecieron y evolucionaron hace 3 millones de años después de que
una especie norteamericana colonizase los Andes al
levantarse el istmo de Panamá. Se han determinado
sus relaciones filogenéticas por medio del análisis del
DNA mitocondrial y posteriormente se han secuenciado los genes de histocompatibilidad de clase I. Se
ha comprobado que existe un bajo polimorfismo
entre las especies con variabilidad aminoacídica solamente en la posición 57. Asimismo, se ha observado
la existencia de evolución convergente en varias especies y asegurado la secuencia ancestral (coincidente
con la de la especie norteamericana originaria) a nivel
del polimorfismo descrito. Se discuten los hallazgos
comparando el bajo polimorfismo “natural” con el
alto polimorfismo “no natural” y relacionando este
hecho con la aparición de enfermedades autoinmunes.
O-25. ORIGEN Y EVOLUCIÓN DE LOS
HAPLOTIPOS HLA-B27 EN POBLACIONES
HUMANAS
M. AGelaz, A. López-Vázquez, S. García-Fernández,
S. González, J. Martínez-Borra, C. López Larrea
Servicio de Inmunología, Hospital Central de Asturias
Una de los características más importantes del
MHC es el fuerte desequilibrio de ligamiento. El
INMUNOLOGÍA
estudio de los haplotipos HLA es una herramienta
útil para analizar diversidad de las poblaciones
humanas. La descripción de marcadores microsatélites dentro de la región MHC pueden ser utilizados para analizar la evolución de los haplotipos
HLA. Hasta el momento se han descrito 23 alelos
B27 diferentes, aunque no existen datos concluyentes de su generación y evolución poblacional.
Objetivos: en el presente trabajo se han analizado diferentes poblaciones B27 pos. de diferentes
grupos étnicos (N=10) que contienen los subtipos
mayoritarios descritos en poblaciones (B*270109), en un entorno de 300 kb alrededor de HLAB, así como en diferentes lineas celulares. B27+.
Métodos: para ello se han estudiado el polimorfismo HLA (-B,-C, MICA) y de los siguientes marcadores microsatélites polimórficos: D6S273/ K11A,
TNFβ,α, LTA, C1-2A, MIB, C1-4-1 y C1-2-5.
Resultados y conclusiones: los resultados derivados del presente análisis permiten examinar la evolución y la historia de los haplotipos HLA-B27, el
origen de los subtipos y los patrones de recombinación en diferentes poblaciones. Los resultados
indican que existen dos regiones principales donde se han producido los cambios: TNFα/LTA, C14-1/C1-2-5. Se discuten los resultados en relación
con la estabilidad genómica de esta región MHC.
O-26. IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS
LIGANDOS DE HLA-B27 DERIVADOS
DE REGIONES POLIMÓRFICAS DE LA
MISMA Y DE OTRAS MOLÉCULAS DE
CLASE I BASADAS EN LA GENERACIÓN
DIRECTA POR EL PROTEASOSA
I. Álvarez, L. Sesma, M. Marcilla, M. Ramos, M.
Martí, E. Camafena, J. A. López de Castro
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. CSICUAM. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de
Madrid
HLA-B27 está fuertemente asociado con la
espondilitis anquilosante y la artritis reactiva. Es
posible que péptidos de regiones polimórficas de
HLA-B27 u otros antígenos de clase I presentados
en superficie por la propia molécula de HLA-B27
puedan estar implicados en la enfermedad. Se ha
descrito un péptido con estas características,
correspondiente en la región comprendida entre
los aminoácidos 169 y 179 de la secuencia de HLAB27. El principal sistema proteolítico implicado
en la generación de péptidos que se presentan por
las moléculas de clase I es el proteasoma. Sin
embargo, no está claro si dichos péptidos son generados directamente, o se producen precursores que
posteriormente son degradados por peptidasas,
tanto en el citosol como en el retículo endoplásmico.
COMUNICACIONES ORALES
En este trabajo, se ha estudiado la generación
del autopéptido de HLA-B27 comentado anteriormente por el proteasoma 20S purificando en digestiones in vitro a partir de percusores peptídicos. En
estas condiciones, el proteasoma rompió los enlaces implicados en la generación de dicho ligando.
La posición del ligando dentro de la secuencia de
sustratos precusores no modificó significativamente la especificidad de proteasoma, excepto en
las posiciones C-terminales del percusor, posiblemente debido a la carga negativa del extremo Cterminal. Además, dichas digestiones ha permitido predecir la presencia de dos nuevos ligandos de
HLA-B27 provenientes de moléculas de clase I,
que posteriormente se han encontrado en el repertorio peptídico de este alotipo.
O-27. AUSENCIA DE ISOFORMAS G4, G5 Y
G6 EN MHC-G DE PRIMATES EN LA FAMILIA
PONGIDAE
M. J. Castro, P. Morales, J. Martínez-Laso,
L. Allende, R. Rojo-Amigo, M. González-Hevilla,
P. Varela, J. Moscoso, M. García-Berciano,
J. Zamora, J. L. Peña, A. Arnaiz-Villena
Departamento de Inmunología y Biología Molecular.
Hospital 12 de Octubre. Universidad Complutense.
Madrid
HLA G es un gen de Clase I no Clásico perteneciente al Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC). La proteína que codifica se expresa en la interfase materno-fetal, donde se ha
postulado que inhibe la lisis celular producida por
las células Natural Killer (NK).
El tránscrito MHC-G humano presenta formas
de maduración alternativas. Hasta la fecha se han
descrito 6 isoformas distintas generadas por la eliminación de unos u otros exones.
Para estudiar la importancia evolutiva de este
fenómeno, hemos estudiado la presencia de splicing alternativos en las moléculas de mRNA de
MHC-G en distintas especies de primates de la
familia Pongidae: chimpancé, gorila y orangután.
Como resultados se han obtenido los transcritos de tres isoformas: G1, G2 y G3. No han aparecido las isoformas G4 ni las solubles GS y G6.
Además, hemos encontrado una nueva isoforma
en el gorila, a la que hemos llamado “G2short”.
Esta molécula es similar a la isoforma G2 a la que
le faltan los primeros 29 aminoácidos codificados
por el exón 4.
Como hipótesis, se sugiere la posibilidad de que
las isoformas solubles no sean necesarias para las
funciones desempeñadas por MHC-G en este grupo de primates (chimpancés, gorilas y orangutanes).
11
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
O-28. REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL
Y PROCESAMIENTO DESCOORDINADO DEL
HETERODÍMERO HLA-DP
O-29. RECONOCIMIENTO ESPECÍFICO
DE LA MOLÉCULA DE CLASE Ib HLA-E
POR UN CLON T CITOTÓXICO HUMANO
M. T. Coiras, A. Álvarez*, J. Arroyo, M. SánchezPérez**
Departamento de Microbiología I. Facultad de Farmacia,
UCM. *CCF, UCM. **Departamento de Microbiología y
Genética. Facultad de Farmacia. Universidad de
Salamanca
P. García, M. Llano, T. Bellón, A. Beltrán de
Heredia*, P. Aparicio*, V. M. Braud**, M. López-Botet
Servicio de Inmunología. Hospital de la Princesa. Madrid.
*Departamento de Bioquímica B e Inmunología. Facultad
de Medicina. Universidad de Murcia.**Molecular
Immunology Group. Institute of Molecular Medicine.
John Radcliffe Hospital. Oxford, Reino Unido
Antecedentes: varias líneas celulares linfoblastoides defectivas en la expresión de HLA-DP
(serie 45.EM) fueron generadas a partir de la línea
p a rental 45.1, haploide para HLA de clase II
(expresa DPw2). Por citometría de flujo se conf i rmó que estas LCLs no expresaban DPw2, y
experimentos de RT-PCR mostraron que la cantidad de mRNA para DPA1*0103 y DPB1*02012
era variable en los diferentes mutantes. La obtención de híbridos somáticos entre las LCLs 45.EM
y la línea 180 (negativa para HLA Clase II), permitió agrupar estos mutantes en transcripcionales y no transcripcionales, en función de si recuperaban o no, después de la fusión, la expresión
de HLA-DPw2.
Objetivos: estudio de la regulación de HLA-DP
mediada por factores transactivadores específicos
(CIITA, RFX …), y la influencia del procesamiento postraduccional de esta molécula.
Resultados: las líneas 45.EM3 y 45.EM15 poseen transcritos para las cadenas α/β de HLA-DP
(mRNA para DPA1: 75 y 148%, y para DPB1: 80
y 20%, respectivamente). Se transfectaron los
ORFs de DPA1*0103 y DPB1*02012 en
45.EM15 y 45.EM3. En 45.EM15 la expresión de
DPw2 se recuperó tras la transfección de DPB1,
pero en 45.EM3 no se recuperó la expresión. El
análisis intracitoplasmático, por citometría de
flujo, determinó la presencia de hetero d í m e ro s
α/β de HLA-DP en el citoplasma de 45.EM3, pero
no en 45.EM15. Los híbridos de 45.EM15 con la
línea 180 no expresaban DPw2 pero sí los híbridos con la línea 127 (haploide para HLA Clase
II: expresa DPw4). Los híbridos de 45.EM15 con
líneas prototipos de grupos de complementación
BLS sí recuperaron la expresión de DPw2.
C o n c l u s i o n e s : la línea mutante transcripcional 45.EM15 podría presentar una mutación en
un factor transcripcional específico del gen
DPB1 que puede localizarse en la región del
MHC delecionada en 180. La línea mutante
45.EM3 no expresa HLA-DP en superficie, debido a la posible alteración de la ruta de pro c e s amiento y secreción de HLA-DP. Estos resultados
indican que no sólo existen mecanismos de regulación específicos de locus y de cadena, sino,
además, diferentes rutas de procesamiento de los
h e t e ro d í m e ros de clase II, como se ha descrito
para HLA-DQ.
12
HLA-E es una molécula de clase Ib (no clásica)
que presenta péptidos hidrofóbicos derivados de
las secuencias señal de otras moléculas HLA de clase I, constituyendo el ligando de los receptores tipo
lectina CD94/NKG2A (inhibidor) y CD94/
NKG2C (activador). En el transcurso de nuestros
estudios sobre la función de CD94/NKG2 en linfocitos T, enfrentamos un clon T citotóxico (K14B06;
α/β+ CD8+ CD94/NKG2H+) a la línea murina
RMA-S transfectada con HLA-E/hβ2-m, y preincubada con péptidos sintéticos correspondientes a
diferentes moléculas HLA de clase I que se unen a
HLA-E; como control se empleó la RMA-S transfectada con hβ2-m. Algunos péptidos (VMAPRTLIL, VMEPRTLIL, VMAPRTLLL) estimularon
significativamente la respuesta citotóxica específica, mientras que otros tuvieron un efecto menor o
inapreciable (VMAPRTLVL y VMAPRTLFL); no se
observó ningún efecto con los nonámeros que no
estabilizan HLA-E (VTAPRTLLL y VTAPRTVLL).
El tratamiento con AcM anti-CD94/NKG2 no
modificó la lisis mientras que, por el contrario, dos
AcM anticlonotípicos (HP-P15 y QA106), que
reconocen específicamente el TcR de K14B06, inhibieron la citotoxicidad. Por otra parte, se ensayó
por inmunofluorescencia y citometría de flujo el
marcaje del clon K14B06 con tetrámeros solubles
de HLA-E/β2-m, replegados con diferentes péptidos sintéticos (VMAPRTVLL, VMAPRTLIL y
VMAPRTLFL). En este tipo de experimentos se
observó una unión específica de los tetrámeros de
HLA-E, que se bloqueó por los AcM anticlonotípicos y no se modificó preincubando con los AcM
anti-CD94. Estos resultados constituyen la primera evidencia de la capacidad de los linfocitos T
humanos para reconocer específicamente HLA-E
a través del TcR.
O-30. GENES HLA EN MACEDONIOS
Y EL ORIGEN SUB-SAHARIANO DE LOS
GRIEGOS
A. Arnaiz-Villena, K. Dimitroski, A. Pacho,
J. Moscoso, E. Gómez-Casado, C. Silvera-Redondo,
P. Varela, R. Rojo-Amigo, M. García-Berciano,
J. Martínez-Laso
INMUNOLOGÍA
Departamento de Inmunología y Biología Molecular,
Hospital 12 de Octubre. Universidad Complutense.
Madrid.*Tissue Typing Laboratory Institute of Blood
Transfusion. Skopje, República de Macedonia
Se han determinado los alelos HLA en individuos de la República de Macedonia por técnicas
de tipaje de DNA y secuenciación. Las fre c u e ncias alélicas y los haplotipos extendidos de los
loci HLA-A, -B, -DR, -DQ se han determinado por
primera vez y los resultados se han comparado
con los de otros mediterráneos, especialmente
con sus vecinos los griegos. Se han calculado las
distancias genéticas, los árboles filogenéticos y
los análisis de correspondencia. Se ha llegado a
las siguientes conclusiones: a) los macedonios
pertenecen al sustrato más antiguo de los mediterráneos, como los íberos (incluyendo vascos),
n o rteafricanos, italianos, franceses, cre t e n s e s ,
judíos, libaneses, turcos (anatolios), armenios e
iraníes; b) los macedonios no se relacionan con
sus vecinos los griegos, los cuales no pertenecen
al sustrato antiguo de los mediterráneos; c) los
griegos tienen una gran relación con los subsaharianos (etíopes) y se separan de los otros grupos de mediterráneos. Tanto los griegos como los
etíopes comparten alelos DRB1 cuasi específicos
como son *0305, *0307, *0411, *0413, *0416,
*0417, *0420,*1110, *1112, *1304 y *1310. Las
distancias genéticas son más cercanas entre los
griegos y los etíopes / sub-saharianos que con
cualquier otro grupo mediterráneo y además los
griegos se unen con los etíopes / sub-saharianos
tanto en los dendrogramas filogenéticos como en
los análisis de correspondencia. El periodo de
tiempo en el que se establecieron estas relaciones
podría ser muy antiguo pero incierto y podría
estar relacionado con los desplazamientos de las
poblaciones egipcio-etíopes que vivían en el
Egipto faraónico.
O-31. DIFERENCIAS EN LOS HAPLOTIPOS
HLA DE LAS POBLACIONES DE LAS ISLAS
BALEARES
C. Crespí, N. Martínez, A. Etxagibel, I. Muñoz,
A. Luque, D. Priego, A. Serra, M. Centeno, J. Milà,
N. Matamoros
Servicio de Inmunología. Hospital Son Dureta. Palma
de Mallorca
Antecedentes: la población actual de las Islas
Baleares se puede considerar como un punto de
fusión de las diferentes culturas mediterráneas.
De las tres islas principales (Mallorca, Menorca
e Ibiza), Ibiza muestra diferencias respecto a las
otras dos islas en cuanto a los orígenes de sus
COMUNICACIONES ORALES
poblaciones fundadoras. En Mallorca destaca la
presencia de los descendientes de los judíos conversos conocidos como chuetas, que se han mantenido aislados como población hasta nuestros
días.
Objetivos: estudiar las diferencias en los haplotipos HLA de las poblaciones baleares.
Métodos: 110 chuetas seleccionados al azar,
sanos con los apellidos típicos (15 apellidos son
conocidos en la isla como chuetas) fueron estudiados. 400 individuos con apellidos típicos Baleares
no-chuetas componen la población Balear. Todos
los individuos fueron tipados serológicamente o
por medio de métodos basados en PCR (SSP o SSO,
Dynal).
Las frecuencias alélicas y haplotípicas fueron
calculadas con el programa Arlequín 2.000.
Resultados: los haplotipos más frecuentes son:
A1-Cw7-B8-DRB1*03-DQB1*02 (Mallorca, 5,7%;
Menorca, 0,8%; Ibiza, 6,1%; Chuetas, 1,7%), A29Cw16-B44-DRB1*07-DQB1*02 (Mallorca, 2,3%;
Menorca, 3,9%, Ibiza, 6,1%, Chuetas, 2,6%), A2Cw5-B44-DRB1*04-DQB1*03 (Mallorca, 1,1%,
Menorca, 0,8%, Ibiza, 4,4%, Chuetas, 0,9%). En la
población chueta destaca la frecuencia del haplotipo A24-Cw6-B38-DRB1*11-DQB1*03 (4,3%).
Conclusiones: se observan marcadas diferencias
entre población ibicenca, población chueta y el
resto.
O-32. EFECTO DE LA MUTACIÓN C282Y
DEL GEN HFE Y DEL TRATAMIENTO CON Fe
INTRAVENOSO EN PACIENTES DIALIZADOS
C. Rodríguez-Gallego, A. Domínguez, F. Alonso*,
M. I. García-Laorden, L. Palop*, F. Sánchez,
A. Fernández*
Servicios de Inmunología y *Nefrología. Hospital de
Gran Canaria Dr. Negrín. Gran Canaria
Los pacientes con insuficiencia renal crónica
reciben con frecuencia Fe intravenoso (FeIV)
como tratamiento de su anemia. Hemos estimado
de interés analizar la influencia de la mutación
C282Y del gen HFE (hemocromatosis hereditaria)
en el metabolismo del hierro en estos pacientes.
Se ha analizado la mutación C282Y a 233
pacientes sometidos a diálisis (102 mujeres y 131
varones; edad media de 56,6 ± 15,03 años). 148
pacientes cumplieron los criterios de inclusión
para recibir FeIV (2 gramos durante 4 meses).Se
analizan los parámetros básicos del metabolismo
del hierro al inicio del tratamiento, al fin del mismo y tras 4 meses de seguimiento, y se comparan
los resultados entre los individuos heterozigotos
para la mutación C282Y (C282Y +/-; 11 individuos) y los individuos negativos para la mutación
(C282Y -/-).
13
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
Si bien no se evidencian diferencias al inicio del
tratamiento, en los pacientes C282Y +/- que reciben FeIV se aprecia un mayor incremento de la
ferritina sérica al finalizar el tratamiento respecto
a los pacientes C282Y -/- (939,9205,98 mg/ml vs
659209,06 mg/ml respectivamente; p= 0,004), y
se mantiene hasta al menos cuatro meses después
de finalizado el mismo (668,80159,12 vs
411,53240,33; p = 0,022).
El análisis de la mutación C282Y permitiría predecir la mayor sobrecarga de hierro en los pacientes C282Y+ tras el tratamiento con FeIV y, de este
modo, prevenir las sobrecargas de Fe en estos
pacientes, con el consiguiente beneficio para su
salud.
O-33. ASOCIACIÓN DEL DÉFICIT DE IgA
A GENES DEL MHC
P. Vigil Cuesta, M. Fernández Arquero, A. Martínez
Doncel, F. Lázaro Hernán, M. C. García Rodríguez*,
G. Fontán**, E. Gómez de la Concha
Servicio de Inmunología del Hospital Clínico San
Carlos. *Servicio de Inmunología del Hospital La Paz.
Madrid
Introducción:el déficit de IgA (DIgA)es la inmunodeficiencia primaria más frecuente. En ella
influyen factores genéticos que aún no han sido
determinados con precisión. La mayor asociación
se ha encontrado en la región del MHC, en concreto con los alelos HLA-DR1, HLA-DR3 y HLA-DR7
dentro de la Clase II.
Objetivo: saber si la susceptibilidad a la enfermedad viene dada por estos alelos o por regiones
adyacentes que se encuentran en desequilibrio de
ligamiento.
Método: se han estudiado 91 familias de enfermos con DIgA, estableciéndose los 4 haplotipos
paternos. Se han considerado haplotipos enfermos
aquellos que aparecen en los sujetos con DIgA y
haplotipos sanos el resto. En total se han estudiado 193 haplotipos enfermos frente a 154 haplotipos sanos. En todos los casos se han tipado 4 genes
polimórficos (HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLADQB1 y HLA-B) y 5 microsatélites ( D6S273, BAT2, TNFα, TNFβ y MICA).
Resultados: en nuestros enfermos vemos asociación significativa con DRB1*0102 y con DR7
pero no con DR3. Sin embargo si consideramos el
haplotipo HLA-DR3, HLA-B8 (8.1AH) la asociación sí es significativa. En el caso de DR7 y
DRB1*0102 la asociación es mayor con estos alelos que con los haplotipos completos correspondientes.
Discusión: nuestros resultados muestran que en
el caso de DR3 la asociación no es con Clase II sino
14
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
con genes situados más teloméricos pertenecientes al haplotipo ancestral 8.1AH.
Tanto en el caso de DRB1*0102 y DR7 la susceptibilidad vendría dada por estos alelos de Clase
II o algunos muy próximos a ellos.
INMUNOTERAPIA
Y NUEVAS TECNOLOGÍAS
O-34. VACUNACIÓN TERAPÉUTICA
CON CÉLULAS DENDRÍTICAS EN EL
MELANOMA MALIGNO DISEMINADO
D. Benítez, R. Martí, R. Vilana, M. Lozano,
J. Milà, J. Pomés, R. Rull, A. Vilalta, E. Yachi,
S. Puig, C. Conill, T. Castel, R. Vilella
Unidad Funcional de Melanoma. Hospital Clínic de
Barcelona
Se han seleccionado 11 pacientes con melamona maligno diseminado, estadio IV, refractarios a
cualquier tipo de tratamiento, quimio o bioquimioterapéutico, con presencia de multiples metástasis en diferentes localizaciones, para el tratamiento con células dendríticas autólogas y
cargadas con un lisado de 10 líneas celulares de
melanoma heterólogas. La generación de las células dendríticas se ha hecho a partir de leucoaféresis, para evitar las múltiples extracciones. Las alicuotas se mantienen en nitrógeno líquido, hasta
el día de la obtención de monocitos por adherencia en plástico y eliminación de las células sobrenadantes. Las células se cultivan en medio X-VIVO
15, libre de SBF o de suplementos de plasma, con
500 U/ml de rIL-4 y 1.000 U/ml de GM-CSF. El día
7 de cultivo se obtienen células dendríticas inmaduras (con pérdida de expresión de CD14) y se
maduran, durante 48 horas, con un cocktail de
citocinas compuesto de 10 ng/ml de IL-1, 1.000
U/ml de IL-6, 10 ng/ml de TNF-α y 1 ng/ml de
PGE2, aunque posteriormente se ha pasado a utilizar 20 ng/ml de TNF-α, como único estímulo
madurativo; las células son pulsadas con el lisado
antigénico 24 horas antes de inducir la maduración, para que la captación sea más eficiente.
Aproximadamente 2*106 de células dendríticas
se resuspenden en 500 ml de PBS y se inoculan
directamente en un ganglio linfático inguinal, por
vía ecográfica.
El promedio de supervivencia de este grupo de
enfermos durante un año de seguimiento ha sido
de 7,24 meses, frente a los 2-4 meses descritos para
este grupo de pacientes no respondedores a la bioquimioterapia. Se observó una respuesta parcial,
con una reducción importante de la masa tumo-
INMUNOLOGÍA
ral, por un periodo de tres meses, 4 pacientes no
respondieron al tratamiento (exitus entre 3 y 5
meses), tres pacientes se retiraron del protocolo,
por aparición de lesiones cerebrales 2, y uno de
manera voluntaria, y del resto 2 presentan progresión lenta de la enfermedad (11 y 9 meses de seguimiento) y otro la enfermedad se estabilizó por un
periodo de 9 meses, aunque posteriormente tuvo
una rápida progresión. No se ha observado ningún
tipo de toxicidad asociada a este tratamiento.
O-35. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES
DE UTILIZACIÓN TERAPÉUTICA DE LAS
CÉLULAS DENDRÍTICAS EN PACIENTES
AFECTOS DE MELANOMA MALIGNO
DISEMINADO
D. Benítez, J. Milà, T. Castel, R. Vilella
Unidad Funcional de Melanoma. Hospital Clínic de
Barcelona
Las células dendríticas son los adyuvantes naturales en la inducción de la respuesta T específica.
Han sido utilizadas en inmunoterapia de diversos
cánceres: melanoma, próstata, linfomas,… con
resultados esperanzadores. Sin embargo, es preciso optimizar diversos aspectos de su utilización
terapéutica: su fuente de obtención, su maduración in vitro, la fuente de antígenos tumorales, el
“cargado” de los antígenos tumorales, la vía de
administración al organismo y la forma de monitorizar la respuesta inducida por la administración
de estas células.
Las células dendríticas se obtienen a partir de
cultivo de monocitos (por adherencia a plástico
de la fracción mononuclear de sangre periférica de
linfoaféresis de enfermos de MM) con IL-4 + GMCSF, en medio de cultivo X-Vivo 15. Tras 7 días de
cultivo, se procede a su maduración y cargado con
antígenos tumorales. Se estudiaron los siguientes
estímulos madurativos: a) IL-1 + IL-6 + TNFα +
PGE2 (CM); b) TNFα; c) CD40L y d) TNFα + IL1 + L-6, en presencia de lisados de células de melanoma autólogas o heterólogas. Se muestran los
resultados de: a) citometría de flujo, con una batería de anticuerpos monoclonales pertinentes; b)
proliferación inducida sobre linfocitos autólogos
y heterólogos; c) producción de citocinas por las
células dendríticas.
Resultados:
1. La presencia del CM induce una potente
maduración de las células dendríticas en función
de la expresión de marcadores de maduración
(CD40, CD80, CD83, CD86), respecto a las otras
condiciones madurativas. A pesar del fenotipo tan
maduro, la eliminación de la IL-4 en el cultivo
revierte la expresión de CD14, lo que no sucede en
las otras condiciones de maduración.
COMUNICACIONES ORALES
2. La proliferación que se obtiene en situaciones alogénicas es independiente de los estímulos
madurativos, y son detectables a tres días de cultivo. Respecto a la respuesta inducida por tumor
autólogo, no es detectable utilizando PBLs, aunque cabe investigar la generación de líneas específicas.
3. Únicamente se detecta IL-10 con CM y
TNFα+IL-1+IL-6. No se detectan niveles de IL-12
(p70) en ninguna de las situaciones, efecto que
puede ser debido a la falta de algún componente
en las condiciones de cultivo (se utiliza medio de
cultivo sin ningún tipo de suplemento de suero o
plasma).
O-36. VACUNACIÓN IDIOTÍPICA
EN LINFOMAS B DE BAJO GRADO:
UNA NUEVA TERAPIA ANTITUMORAL
R. Yáñez, Y. Barrios, A. Plaza, E. Suárez,
R. Cabrera*, F. Díaz-Espada
Servicios de Inmunología y *Hematología. Clínica
Puerta de Hierro. Madrid
Introducción: la mayoría de los pacientes con
LNH B de bajo grado no se curan con tratamientos de quimioterapia y/o radioterapia, recayendo.
Una alternativa terapéutica es la inducción de respuesta inmune mediante vacunación con la inmunoglobulina de superficie de células B.
Material y métodos: el idiotipo tumoral se obtuvo por fusión somática de células tumorales con
el heteromieloma K6H6/B5.La Ig secretada se purificó de cultivos de alta densidad y se conjugó a
KLH. La respuesta anti-idiotípica se estudió por
ELISA y la presencia de linfocitos tumorales por
PCR específica para la traslocación t(14;18).
Resultados: presentamos los resultados del primer ensayo clínico llevado a cabo en Europa con
inmunización idiotípica en pacientes con LNH B
de bajo grado .
De un total de 12 pacientes, 7 han sido vacunados. Todos desarrollaron una respuesta humoral
anti-idiotipo específica y en aquellos pacientes con
traslocación, desaparecieron las células portadoras de la misma. El seguimiento es de 5 años.
Conclusiones: estos pacientes pueden inducir
respuesta inmune contra el idiotipo expresado en
su propio tumor. Este tratamiento es ventajoso al
no dañar células B normales y su efecto es más prolongado que el uso de anticuerpos monoclonales
humanizados dirigidos contra moléculas específicas de células B.
Es necesario ampliar este protocolo a un mayor
número de pacientes y un periodo de seguimiento
más prolongado para probar si existe una relación
entre la inmunidad anti-idiotípica y un mayor
periodo libre de enfermedad.
15
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
O-37. RECHAZO TUMORAL POR LA
INFILTRACIÓN DE CÉLULAS SUPRESORAS
NATURALES TRAS EL TRATAMIENTO CON
INMUNOTERAPIA ADOPTIVA Y
CICLOFOSFAMIDA
B. Peláez, J. A. Campillo, J. A. López Asenjo,
J. L. Subiza
Departamentos de Inmunología y Patología. Hospital
Clínico San Carlos. Madrid
Las células supresoras naturales (NS) son células generadas durante el crecimiento tumoral.
Estas células son progenitoras de la serie mieloide
que producen grandes cantidades de óxido nítrico (NO) e inhiben respuestas linfocitarias. Esta
propiedad inmuno-supresora se encuentra dentro
de los mecanismos de escape tumoral.
Las células NS también son inducidas bajo el
régimen de quimioterapia con Ciclofosfamida
(Cy). Paradójicamente, la utilización de Cy potencia la respuesta antitumoral durante el tratamiento con inmunoterapia adoptiva.
El objetivo de este trabajo fue investigar si dentro del sinergismo antitumoral que existe entre la
Cy y la terapia adoptiva estaban implicadas la
generación y activación de las células NS.
Se estudió la inducción de células NS por la Cy
y su capacidad supresora. Se evaluaron cortes histológicos tumorales y la implicación del NO generado por las NS en el rechazo tumoral tanto in vivo
como in vitro.
Los resultados in vivo revelaron que las células
NS ejercieron una acción supresora antitumoral
sólo en presencia de señales T activadoras (IFN-γ
+ CD40). En las biopsias se identificaron células
NS con el mAb ER-MP54 dentro de la reacción
inflamatoria de rechazo tumoral, la cual sólo se
desarrolló tras el régimen de terapia adoptiva y Cy.
La utilización de un inhibidor del NO tanto en cultivo como in vivo, demostró que esta molécula,
generada por las células NS, era la responsable de
rechazar la proliferación y el desarrollo de la masa
tumoral. Las células NS intratumorales expresaron el enzima que sintetiza el NO.
La conclusión de este estudio es que el sinergismo entre el tratamiento con Cy y terapia adoptiva
depende por un lado, de la generación de células
NS y por otro, de su activación, llegada al entorno
tumoral y de su síntesis de NO. Estas dos últimas
condiciones dependen de las señales linfocitarias
provenientes de la terapia adoptiva.
O-38. GENERACIÓN DE CTLS HB1ESPECÍFICAS MEDIANTE LA TRANSDUCCIÓN
DE CÉLULAS DENDRÍTICAS CON UN VECTOR
ADENOVIRAL
A. Balas, M. Avilés, F. García-Sánchez, R. Lillo,
A. Álvarez, J. L. Vicario
16
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
Departamento de Histocompatibilidad. Centro de Trans fusión de Madrid
El antígeno menor de histocompatibilidad
(mHA) HB1 está constituido por un péptido de 10
aminoácidos, presentado en el contexto de B44.
HB1 presenta un polimorfismo en el residuo en
posición 8 (H/Y), siendo el alelo H el que provoca
respuesta citotóxica con expresión restringida en
células LLA-B y EBVs.
Células dendríticas (CD) fueron diferenciadas
a partir de monocitos procedentes de individuos
sanos, obteniendo tras siete días de cultivo niveles óptimos de expresión de marcadores de maduración. Condiciones de transducción fueron optimizadas utilizando un vector adenoviral que
contiene la proteína verde fluorescente (Ad-GFP),
obteniendo cerca del 100% de eficiencia.
Se construyó un adenovirus que contiene un
minigen incluyendo la región codificante del péptido HB1 H (Ad-HB1 H). La correcta transducción
realizada con el Ad-HB1 H fue analizada a nivel de
transcripción del minigen mediante RT-PCR.
Células CD8+ autólogas fueron co-cultivadas
con CD transducidas con Ad-HB1 H utilizando
proporciones de 5:1 a 10:1. Se llevaron a cabo tres
rondas de estimulación.
La capacidad de lísis específica de las líneas
CD8+ obtenidas fue analizada mediante ensayos
de liberación de cromo estándar, utilizando como
células diana líneas EBV HLA-B44 positivas previamente tipadas para el gen HB-1 mediante PCRRFLP. Estos ensayos demostraron la posibilidad
utilizando este sistema in vitro de obtener líneas
CD8+ capaces de reconocer y lisar células diana
que expresen y presenten de forma adecuada el
péptido HB1 H. Estos resultados demuestran que
CD transducidas con un adenovirus que codifica
para este péptido tumor-específico inducen ‘in
vitro’ respuesta citotóxica específica, abriendo la
posibilidad de utilizar este sistema en la generación de terapia celular anti-leucemia.
O-39. MONITORIZACIÓN IN VITRO DE LA
INMUNOTERAPIA: ELECCIÓN DE LA MEJOR
COMBINACIÓN DE CITOCINAS
S. Viñas, E. Caparrós, R. Verdú, A. Mora*, G. Rubio
Divisió de Immunologia. Universitat Miguel Hernán dez. Sant Joan, Alacant. *Alergología. Hospital Univer sitario Morales Meseguer. Murcia
La efectividad de la inmunoterapia hiposensibilizante (IT) en enfermedades alérgicas se constata por criterios clínicos tras largos periodos de tratamiento. No se dispone de pruebas objetivas in
vitro comúnmente aceptadas. El análisis de clones
T alérgeno específicos indica un cambio desde un
INMUNOLOGÍA
fenotipo Th2 a Th1 o incrementos globales en la
producción de IL-10 con la IT. Previamente hemos
descrito cambios en la frecuencia de células T alérgeno específicas secretoras de IFN-γ e IL-4 asociadas a la duración de la IT y en este trabajo se analiza la contribución de IL-2 e IL-10. Se utiliza como
modelo la alergia a ácaros Dermatophagoides sp.
(Derp). PBMC se obtienen de asmáticos alérgicos
a Derp o a pólenes, recibiendo o no IT, y de donantes sanos. Se incuban con un extracto dializado de
Derp y mAb 9,3 y HP2/1 como coestimuladores
durante 6-18 horas, transcurriendo las últimas 517 horas en presencia de un agente de bloqueo
(monensina), según los experimentos. Las células
se marcan en superficie con anti CD4 e intracelularmente con anti CD69 y mAb anti IL-2 e IL-10 y
se analizan por citometría de flujo (4FL).
Se detectaron células T Derp-específicas IL-2+
con frecuencias que oscilaron entre 1 y 240 células/10.000 linfocitos T CD4. Las frecuencias son
solapantes en pacientes de los dos grupos de asmáticos y en los controles sanos, sin relación aparente con el tratamiento con IT o su duración, aunque se está analizando la presencia de células
definidas como altamente secretoras (FL intensa)
en un grupo ampliado de alérgicos con IT durante
más de 12 meses. No se han detectado linfocitos T
alérgeno específicos productores de IL-10 en ninguno de los pacientes o controles de la serie.
Cambios en el protocolo de estimulación, como
alargamiento (5 vs 17 h) del periodo de acumulación en Golgi, o del de preincubación libre de agente de bloqueo (1, 2, 13 h) no revelan la presencia
de células IL-10+ Derp-específicas. Por tanto, la
determinación de células T Derp-específicas productoras de IL-2/IL-10 no mejora la información
que brinda la detección y estimación de la frecuencia clonal de células productoras de IFN-γ/IL-4.
O-40. CORRECCIÓN FENOTÍPICA
Y FUNCIONAL IN VITRO DE LINFOCITOS T
DEFICIENTES DE CD3 : EFECTOS
ADVERSOS DE LA TERAPIA GÉNICA
POST-TÍMICA
A. Pacheco-Castro, J. M. Martín, R. Millán,
J. Clemente*, A. Arnaiz-Villena*, L. Allende*,
O. Sanal**, J. R. Regueiro
Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. *Hospital 12 de Octubre. Madrid.
**Hacettepe University Children’s Hospital. Ankara,
Turquía
La deficiencia humana de CD3g es una inmunodeficiencia congénita de linfocitos T caracterizada por presentar un defecto de expresión en
membrana del receptor de la célula T, el complejo
TCR/CD3, así como alteraciones en determinadas
COMUNICACIONES ORALES
funciones del linfocito T, como la modulación del
complejo TCR/CD3 mediada por PMA o la síntesis de IL2 tras activación. Las deficiencias congénitas de linfocitos T son unas de las enfermedades
en las que se están realizando ensayos de terapia
génica.
El objetivo del presente trabajo fue generar un
protocolo de terapia génica in vitro para la deficiencia de CD3γ utilizando como células diana linfocitos T de sangre periférica derivados de los dos
casos existentes en la actualidad, uno de origen
español y otro de origen turco, con dicha deficiencia.
Para ello, se infectaron PBL derivados de los dos
individuos con deficiencia de CD3γ y de dos controles sanos, con un vector retroviral bicistrónico
portador del cDNA de CD3γ (LZRS-γ) y como proteína marcadora la proteína verde fluorescente, así
como con el mismo vector pero sin el gen de interés (LZRS-mock). Las células deficientes de CD3γ
de ambos individuos transducidas con el vector
LZRS-γ aumentaron la expresión en membrana del
complejo TCR/CD3 (hasta llegar a niveles comparables a los individuos control), y restablecieron
el defecto de modulación del complejo TCR/CD3
mediado por PMA, pero, sorprendentemente,
sufrieron una alteración en la síntesis de IL2 (y no
de otras citocinas como IFNγ), volviéndose constitutiva.
Estos resultados indican que el vector retroviral utilizado puede restablecer in vitro los defectos
fenotípicos y funcionales descritos en la deficiencia de CD3γ, siendo válido el protocolo empleado
como modelo de terapia génica, pero también
sugieren que la reconstitución de células T posttímicas deficientes de CD3γ puede alterar la regulación de determinadas funciones de los linfocitos
T y, por lo tanto, generar procesos autoinmunes
y/o linfoproliferativos. La reconstitución de precursores pre o intratímicos sería la estrategia más
apropiada.
O-41. INMUNIZACIÓN CON ANTÍGENOS
ESPECÍFICOS DEL VIH-1 Y ALOANTÍGENOS
UTILIZANDO UN INMUNÓGENO DE VIH-1
INACTIVADO (REMUNE): IMPLICACIONES
EN INMUNOTERAPIA DE LA INFECCIÓN
POR EL VIH-1
J. Navarro, M. L. Abad, L. Díaz, B. Jiménez,
F. García-Sanchez*, J. L. Vicario*, M. A. MuñozFernández, M. Clereci**, E. Fernández-Cruz*
Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Marañón.
*Centro de Transfusiones, CAM. Madrid. **Cattedra di
Immunología. Universita' di Milano. Italia
En nuestro centro coordinamos un ensayo clínico multicéntrico, randomizado, doble ciego,
17
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
controlado por adyuvante de REMUNE (una vacuna terapéutica consistente en un inmunógeno
VIH-1 sin gp120) versus IFA administrados con
antirretrovirales. Los resultados son analizados de
forma blindada. REMUNE (REM) se obtiene de la
línea celular humana T78 (HuT-78) infectada por
la cepa HZ321 de VIH-1, y contiene un 11,7% de
HLA-DR. En el mes 24 postvacunación, encontramos anticuerpos anti-HLA (29% clase I; 65% clase II) en 25/34 pacientes de REM (REM-pts), pero
solo en 8/32 pacientes de IFA (IFA-pts ) (9% clase
I; 22% clase II) (p<0,0001). Estos anticuerpos en
REM son específicos de HuT-78. Encontramos una
respuesta linfoproliferativa (LPR) significativa a
HZ321 (índice de estimulación, SI = 29,6; p
<0,005) y a HuT-78 (SI = 25,8; p <0,05) en REMpts, pero no en IFA-pts (SI=5,8 y 7,5 respectivamente). No existen diferencias entre ambos grupos en reacción mixta linfocitaria frente a CMSP
de 6 donantes (SI = 48,3 y 51,7).
Observamos una fuerte correlación entre LPR
a antígenos HZ321 del VIH-1 (Subtipo A), a
np24de VIH-1 (r = 0,86) y BaL (Subtipo B) (r =
0,81). Encontramos alta citotoxicidad específica
frente a Gag/pol del VIH-1 en REM-pts comparado con IFA-pts (media: 20,3 Unidades Líticas,
UL/106 CMPS vs 1,9 UL/106 CMSP) (p <0,05).
Además, la citotoxicidad frente a HuT-78 en REM
pts fue mayor que IFA-pts (14,9 UL/106 CMPS vs
3 UL/106 CMPS) (p<0,05). Estos datos indican
que la vacunación terapéutica con RENUME induce respuestas específicas frente a aloantígeno y
frente al VIH-1, lo que podría tener implicaciones
prácticas en el tratamiento de la infección por el
VIH-1.
O-42. UTILIZACIÓN DE LA TÉCNICA RSCA
(REFERENCE STRAND MEDIATED
CONFORMATION ANALYSIS) PARA
RESOLVER AMBIGÜEDADES DE TIPAJE
DEL GEN HLA-DRB1
A. Corell, A. L. Pay, A. M. Little, M. A. Hoddinott,
J. R. Argüello, H. Ogilvie, J. O’shea, J. A. Madrigal,
S. G. E. Marsh
Departamento de Pediatría, Inmunología, Obstetricia y
Ginecología, Facultad de Medicina, Universidad de
Valladolid. Anthony Nolan Research Institute, Royal
Free Hospital. London, Reino Unido
Se muestra la utilización de la técnica RSCA
(Reference Strand Mediated Conformation Análisis)
para resolver sin ninguna ambigüedad tipajes de
HLA-DRB1 en dos casos de trasplante de médula
ósea utilizando un banco de donantes no emparentados.
En el primer caso, el tipaje del gen HLA-DRB1,
tanto por el método SSP (PCR con primers especí-
18
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
ficos de secuencia) como SSO (tipaje con oligonucleótidos específicos de secuencia) realizados de
modo rutinario en dos laboratorios diferentes, dieron resultados ambiguos para dos posibles donantes. Ambos individuos resultaron tipados como
HLA-DRB1*04011 + 0403 ó alternativamente
HLA-DRB1*0407 + 0413. Esta ambigüedad no se
podía resolver mediante secuenciación directa del
exón 2 de los genes HLA-DRB1, pues nos encontraríamos de nuevo con la misma ambigüedad.
Utilizando células homocigotas de tipaje para los
alelos HLA-DRB1*04011, 0403 y 0407 y utilizando la técnica RSCA, ambos individuos fueron tipados como HLA-DRB104011 + 0403, sin ningún
tipo de ambigüedad. De modo que ambos eran
válidos como donantes, puesto que el receptor se
había tipado mediante estudio familiar como HLADRB1*04011 + *0403 mediante estudio familiar.
En el segundo caso, un donante fue tipado como
HLA-DRB1*1102 + 1103 mediante la técnica SSP,
y de modo contradictorio la técnica SSO excluía
del tipaje el alelo HLA-DRB1*1102. En tanto que
el receptor se había tipado sin ambigüedades como
HLA-DRB1*1101 + *1103. Utilizando de nuevo la
técnica RSCA y células homocigotas de tipaje para
los alelos HLA-DRB1*1101, *1102, *1104 y heterocigotas para HLA-DRB1*1101 + *1103, se pudo
determinar sin ambigüedades, que el donante
potencial era HLA-DRB1*1103 homocigoto.
Por lo tanto, y aunque esta técnica aún no está
completamente desarrollada para realizar un tipaje de alta resolución de los alelos de HLA-DRB1,
en la actualidad puede ser empleada como una
herramienta muy valiosa para resolver ambigüedades de tipaje generadas por otras técnicas, como
SSP, SSO o SBT (secuenciación directa) con una
elevadísima fiabilidad. Es necesario disponer de
células homocigotas de tipaje con los alelos HLADRB1 involucrados en las ambigüedades.
O-43. BÚSQUEDA DE NUEVOS
OLIMORFISMOS DEL GEN HLA-DRB1
EN LOS ALELOS SEROLÓGICOS MENOS
POLIMÓRFICOS: DR7, DR9 Y DR10
MEDIANTE LA TÉCNICA RSCA
A. Corell, S. T. Cox, P. K. Chenery, A. L. Pay,
R. J. Argüello, M. Pérez, J. Madrigal, S. G.E. Marsh
Departamento de Pediatría, Inmunología, Obstetricia y
Ginecología, Facultad de Medicina, Universidad de
Valladolid. Anthony Nolan Research Institute, Royal
Free Hospital. London, Reino Unido
El motivo de este trabajo fue investigar la existencia de nuevos polimorfismos moleculares de
alelos del sistema HLA, y en concreto del locus
HLA-DRB1. Se investigaron en particular los 3 alelos con menos variantes moleculares: HLA-DR7,
INMUNOLOGÍA
DR9 y DR10. Para ello se utilizaron DNAs de 400
individuos no relacionados (de diferente procedencia étnica) y que habían sido previamente tipados como HLA-DR7, DR9 o DR10 por técnicas
rutinarias tanto serológicas, como moleculares.
Se amplificó el exón 2 de todos los DNAs y los
amplificados se hibridaron con diferentes DNAs
de referencia (moléculas de tipaje conocido y que
han sido marcadas fluorescentemente en una de
las 2 hebras). Además se utilizaron células homocigotas de tipaje para los alelos DR7, DR9 y DR10
conocidos, como control de la técnica. El resultado de las hibridaciones se separó electroforéticamente en un Secuenciador Automático de DNA
(ALFexpress, Pharmacia) para realizar el análisis
de los homo y heterodúplex formados.
El resultado obtenido fue que ninguno de los
DNAs estudiados mostró nuevas movilidades
(comparadas con los alelos previamente conocidos), y por lo tanto que no parece muy probable
que aparezcan un número elevado de alelos moleculares de estos 3 alelos serológicos (DR7, DR9 y
DR10). Se analizaron en profundidad las características genéticas y funcionales de estos 3 alelos
comparándolas con otros alelos del gen HLADRB1 en busca de alguna razón que pudiera justificar esta diferencia en los polimorfismos del locus
HLA-DRB1. Se concluye que la única relación aparente es la longitud de un microsatélite compuesto localizado en el segundo intrón del gen DRB1:
a mayor longitud y complejidad del microsatélite,
mayor polimorfismo exónico.
INMUNOLOGÍA TUMORAL
Y CÉLULAS NK
O-44. CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO
ANTÍGENO DE DIFERENCIACIÓN CON
FUNCIÓN INHIBIDORA EN CÉLULAS NK
M.ª de Miguel, F. Navarro, M. López-Botet*
Servicio de Inmunología. Hospital Universitario de La
Princesa. Madrid. *Universidad Pompeu Fabra (CEXS).
Barcelona
Entre los receptores leucocitarios con función
inhibidora, un grupo se adscribe a la superfamilia
de las Ig (Ig-SF), mientras que otros son moléculas tipo lectina. El mecanismo de inhibición implica en general la asociación del receptor a fosfatasas con dominios SH2 (SHP-1 o SHIP). Algunos
receptores inhibidores reconocen moléculas conocidas (MHC de clase I, Fc de IgG, ácido siálico),
aunque en muchos casos se ignora la naturaleza
de los ligandos.
COMUNICACIONES ORALES
A fin de identificar receptores de superficie
implicados en la regulación funcional de las células NK, generamos anticuerpos monoclonales
(AcM) inmunizando con la línea NKL (CD3 CD16+ CD94/NKG2A+, ILT2+). Se seleccionó un
AcM (HP-F2) por su efecto inhibidor de la citotoxicidad en ensayos de lisis redirigida de la NKL
frente a la línea P815. Por citometría de flujo la
expresión de HP-F2 se detecta con intensidad
variable en células T (CD4+ y CD8+) y NK, activadas in vitro, así como en neutrófilos. Por el contrario, en células mononucleares de sangre periférica el AcM HP-F2 sólo marca muy débilmente
monocitos y una subpoblación de linfocitos B. En
un panel de líneas tumorales de origen linfoide y
mieloide/monocítico (n = 17), HP-F2 se detecta
en algunas líneas T, NK y B. Este AcM inmunoprecipita y reconoce en western blot una molécula de
Mr=150 kD (Mr=90 kD después de tratamiento
con N-glicanasa). Por ensayos de western blot en
células tratadas con pervanadato se ha observado
que, al igual que otros receptores inhibidores, el
antígeno HP-F2 se fosforila en tirosina y coprecipita la tirosina fosfatasa SHP-1; por el contrario,
no se ha detectado asociación con SHP-2. Actualmente, se están desarrollando diferentes estudios
funcionales en linfocitos T. Asimismo, como la distribución y características bioquímicas de HP-F2
no parecen coincidir con las de otros receptores
leucocitarios inhibidores bien caracterizados, se
ha emprendido el clonaje molecular aplicando
diferentes estrategias.
O-45. ANÁLISIS MUTACIONAL DEL TALLO
CITOPLÁSMICO DEL RECEPTOR
INHIBIDOR ILT2/LIR1
T. Bellón, J. Sayos*, F. Kitzig*, M. López-Botet*
Servicio de Inmunología. Hospital de la Princesa. Madrid.
*Universidad Pompeu Fabra (CEXS). Barcelona
El receptor inhibidor ILT2/LIR-1 re c o n o c e
específicamente moléculas HLA de clase I y regula el umbral de activación de células linfoides y
mieloides. En el tallo citoplásmico de ILT2 se
encuentran cuatro ITIM (I m m u n o rreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motifs) que responden a
la secuencia consenso I/V/LxYxxV/L. Tras la fosforilación en tirosina, el receptor se une a la tirosina fosfatasa SHP-1, implicada en la señal negativa. Con objeto de estudiar en detalle la base
e s t ructural de la señal inhibidora mediada por
ILT2, hemos realizado experimentos de deleción
p a rcial y de mutagénesis dirigida del tallo citoplásmico, sustituyendo individualmente cada
uno de los residuos tirosina por fenilalanina. Los
distintos mutantes se han transfectado de forma
estable en la línea de basófilos de rata RBL, ana-
19
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
lizando la fosforilación, asociación a SHP-1, y su
capacidad para inhibir la secreción de serotonina desencadenada a través del receptor de IgE
(FceR-I). El análisis mutacional del tallo citoplásmico de ILT2 demuestra que el residuo Y644
, junto con el Y614, es el principal responsable de
la unión a los dominios SH2 de SHP-1, y de la
transmisión de la señal negativa. La mutación del
residuo Y533 impide la fosforilación de los restantes ITIM de ILT2, anulando su capacidad inhibidora; ese residuo parece regular la actividad del
receptor sin participar de forma directa en la interacción con SHP-1.
O-46. EXPRESIÓN FUNCIONAL DE CD94
Y MOLÉCULAS NKG2 EN LINFOCITOS T
CD4+ HUMANOS ACTIVADOS VÍA CD3
P. Romero, C. Ortega, A. Palma, I. J. Molina*,
J. Peña, M. Santamaría
Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina.
Hospital Universitario Reina Sofía. Universidad de
Córdoba. Córdoba.*Unidad de Inmunología, Facultad de
Medicina. Universidad de Granada. Granada
Hemos investigado la capacidad de linfocitos
CD4+ humanos de sangre periférica para expresar CD94 y moléculas de la familia NKG2 en respuesta a su activación vía CD3, así como la función de estos re c e p t o res en esta subclase de
linfocitos.
Usando células CD4+ purificadas de sangre
periférica reestimuladas mediante anti-CD3,
encontramos expresión de CD94 y NKG2A hacia
el día 15 de cultivo. También hemos determinado mediante RT-PCR la presencia de genes de
otros miembros de la familia NKG2, confirmándose la expresión secuencial de NKG2ACD y E
en células T CD4+. Por otro lado, hemos investigado el efecto de diferentes citocinas sobre la
e x p resión de los re c e p t o res CD94/NKG2A,
observándose que TGF-β e IL-10 regulan positivamente la expresión de estos receptores en células CD4+.
También hemos estudiado el papel funcional de
NKG2A en células CD4+ , encontrándose que el
crosslinking del receptor NKG2A mediante mAb
específicos modifica el perfil de citocinas secretado por las células CD4+ activadas mediante CD3,
de modo que la señalización a través del receptor
NKG2A , no así de CD94, inhibe la secreción de
IFN-γ y TNF-α.
La demostración de la expresión y función de
estos receptores en linfocitos T CD4+ implica un
papel más general de las moléculas NKG2 en el sistema inmune, originalmente confinado a células
citotóxicas.
20
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
O-47. EXPRESIÓN DE RECEPTORES
ASOCIADOS A CÉLULAS NK EN
LINFOCITOS T DE ANCIANOS
O. De la Rosa, R. Tarazona, J. G. Casado, E. Peralbo,
J. Peña, R. Solana
Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina.
Hospital Universitario Reina Sofía. Córdoba
El envejecimiento induce cambios en el fenotipo y función de los linfocitos T, que están relacionados tanto con la diferenciación de células memoria o células efectoras, como con el proceso de
senescencia replicativa.
Nuestro grupo ha descrito que la expresión de
receptores NK está aumentada en linfocitos T de
individuos ancianos.
El objetivo de este trabajo es analizar la expresión de receptores asociada a células NK (NK-Rs)
en linfocitos T de ancianos sanos comparada con
jóvenes. Hemos estudiado por fluorescencia multiparamétrica la expresión de NK-Rs en linfocitos
T obtenidos de ancianos sanos que reúnen los criterios Senieur y controles jóvenes sanos.
Se observó un aumento en la expresión de
CD56, CD94, CD16 y CD244 en las células CD3+
de ancianos, así como una expansión de la subpoblación CD3+CD28-. La expresión de CD56 y
CD16 estaba aumentada significativamente en
células CD3+CD28- de ancianos mientras que
CD161, CD45RA y perforina estaban disminuidas
en esta subpoblación celular en comparación con
controles jóvenes. La expresión de CD16, CD94 y
CD244 también estaba elevada en las células
CD3+CD28+ de forma significativa.
La elevada expresión de algunos NK-Rs en linfocitos T en el envejecimiento apoya que exista
una expansión de células T efectoras en ancianos,
si bien la disminución de perforina intracelular en
linfocitos T CD3+CD28- podría explicar el defecto de la respuesta inmune antiviral asociado al
envejecimiento.
O-48. ALTERACIONES FENOTÍPICAS
Y FUNCIONALES EN LINFOCITOS T
DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES
CON CARCINOMA GÁSTRICO
A. P. Valeri Lozano, M. Pérez Blas, N. Aguilera
Montilla, A. Gutiérrez*, J. Martín*, T. Ratia*, J. M.
Muguerza*, A. López*, I. Lara*, M. Martín Villa
Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid. *Cirugía Digestivo. Hospital
Príncipe de Asturias. Alcalá de Henares. Madrid
Se estudió la capacidad funcional in vitro de TPBL y de líneas celulares T de pacientes con carcinoma gástrico, tras su activación vía CD3, CD2
INMUNOLOGÍA
y CD28, aisladamente o con otros mitógenos. Se
p ro c e s a ron muestras de 7 controles y 6 pacientes. Además, se transform a ron T-PBL con
Herpesvirus saimiri (HVS) a fin de obtener líneas
T estables. El estudio fenotípico de las células TPBL muestra una disminución de las células
CD3+ y de la expresión de CD28, así como un
aumento de las células CD16+. Los datos funcionales de T-PBL revelaron que la activación mediada por PHA, CD3, CD2 y CD28 es defectuosa,
mientras que la combinación PMA + Ionomicina
induce una adecuada proliferación. La transformación permitió obtener líneas celulares T-CD8.
El fenotipo muestra expresión de TCRab, CD45,
CD45RO, CD56, CD2, CD3, CD28, HLA-DR y
CD86 similares a líneas T HVS control. La expresión de CD80 y CD25 se hallan disminuidas frente al control.
Se constata una inadecuada proliferación tras
activación vía CD2, CD3 y CD28, defecto no
corregible mediante la adición de IL2 . Por tanto, las líneas T HVS+, pese a las alteraciones fenotípicas inherentes a la transformación, mantienen el defecto funcional básico vía CD3, CD2 y
CD28 observado en las células T- PBL de los
pacientes.
O-49. ALTERACIONES FENOTÍPICAS
Y FUNCIONALES EN LINFOCITOS T DE
MUCOSA GÁSTRICA TUMORAL,
TRANSFORMADOS CON HERPESVIRUS
SAIMIRI
A. P. Valeri Lozano, M. Pérez Blas, N. Aguilera
Montilla, A. Gutiérrez*, J. Martín*, T. Ratia*, J. M.
Muguerza*, A. López*, I. Lara*, J. M. Martín Villa
Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid. *Servicio de Cirugía Digestivo.
Hospital Universitario Príncipe de Asturias. Alcalá de
Henares
Los linfocitos infiltrantes de tumor en el carcinoma gástrico muestran diversas alteraciones
fenotípicas (aumento de β1 integrinas, CD44,
CD54, cadherinas E y P, menor expresión de FasL
y CD80) y funcionales (mayor expresión de IL10,
TGFβ, IL6, IL8, G-CSF, GM-CSF).
En este trabajo, tras procesar la muestra de tejido tumoral gástrico, se aislan linfocitos T de la
mucosa gástrica y se transforman con Herpesvirus
saimiri para disponer de un número suficiente de
células sobre las que realizar estudios fenotípicos y
funcionales. Se obtuvieron así 7 líneas HVS-CD4+
de pacientes. En paralelo, se utilizaron controles de
linfocitos de mucosa de intestino delgado sano
transformados con HVS (n = 8) y células T de sangre periférica también transformadas (n = 4).
COMUNICACIONES ORALES
El estudio fenotípico en las líneas T-HVS de los
pacientes muestra un expresión de TCRαβ, CD54,
CD2, CD3, CD45RO, CD28, CD80 y HLA-DR
comparables a las de las líneas control, mientras
que la expresión de CD86 y CD25 (p <0,01) estaba incrementada.
La respuesta proliferativa mostró que la activación vía CD3, CD2 y CD28 eran defectuosas
(CD2 + CD28, p <0,05; CD2 + CD3, p <0,05).
Por tanto, en los linfocitos de mucosa de carcinoma gástrico existen importantes alteraciones
funcionales con distintos estímulos de membrana
(CD3, CD2, CD28).
O-50. EXPRESIÓN DE MARCADORES NK EN
LINFOCITOS T OBTENIDOS DE ENFERMOS
DE MELANOMA
J. G. Casado, R. Soto, O. de la Rosa, E. Peralbo,
R. Solana, L. Rioja, J. Peña, R. Tarazona
Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina.
Universidad Reina Sofía. Hospital de Córdoba. Córdoba
La expresión de re c e p t o res re g u l a d o res de la
citotoxicidad ha sido descrita en enfermos afectos de melanoma. El objetivo de este trabajo es
estudiar la expresión de receptores NK y marcad o res de activación en diferentes subpoblaciones de linfocitos T obtenidos de pacientes de
melanoma. Hemos estudiado mediante fluorescencia multiparamétrica la expresión de marcad o res NK y de activación en linfocitos T
C D 8b r i g h t. Los resultados indicaron que en
enfermos de melanoma la subpoblación de células CD8bright que expresa CD56, CD57 y p58.2,
está incrementada mientras que en la subpoblación CD8bright CD28- existe un aumento en la
e x p resión del p58.1 y un descenso en el marc ador NKG2A, que no se relacionó con cambios en
la expresión de CD94. En células CD8b r i g h t l a
e x p resión del marcador de activación CD244 y
el contenido de perforina intracelular presentaron porcentajes más altos en enfermos de melanoma que en individuos sanos, mientras que la
e x p resión de CD45RA estaba descendida. Es
i n t e resante indicar que el porcentaje de células
C D 8b r i g h t CD28- y CD8b r i g h t CD27- también
se encontraba aumentado en enfermos de melanoma. Estos resultados indican que en enfermos
de melanoma existe un predominio de células
C D 8b r i g h tt con un fenotipo efector/memoria
(CD28-, CD27-, CD56+, CD57+, CD244,
CD45RA- y Perforina+). Sin embargo, la actividad citotóxica de estos linfocitos podría encontrarse contrarrestada por la presencia de los
receptores inhibidores de la citotoxicidad p58.1
y p58.2.
21
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
O-51. RESTAURACIÓN DE LA EXPRESIÓN
DE MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y DE LA
RESPUESTA ESPECÍFICA DE LINFOCITOS T
CITOTÓXICOS EN CÉLULAS DE MELANOMA TRAS TRATAMIENTO CON 5-AZA-2DEOXICITIDINA
R. Méndez, A. Serrano, C. Esparza, P. Jiménez,
A. Clavero, A. García, F. Ruiz-Cabello, F. Garrido
Hospital Virgen de las Nieves. Granada
Las células T citotóxicas desempeñan un papel
clave en la eliminación de células infectadas por
virus y células tumorales, siendo necesario para
este proceso, la expresión en superficie de las
moléculas HLA de clase I. La disminución o perdida de estas moléculas es muy frecuente en estos
procesos.
Tres mecanismos principales han sido descritos como responsables de la ausencia de expresión de las moléculas HLA de clase I: mutaciones
en el gen de la -2microglobulina, deficiencias en
los genes TAP y baja afinidad de los factores de
transcripción por elementos reguladores. El objetivo de este trabajo es la descripción de otro mecanismo molecular generador de la ausencia de
moléculas HLA de clase I en una línea (MSR3mel) derivada de un paciente con melanoma
metastásico. La hipermetilación fue puesta de
manifiesto con un ensayo de Southern Blot con
DNA de la línea y DNA de PBLs autólogos, y con
el tratamiento de la línea celular con el agente
desmetilante 5-aza-deoxicitidine (DAC). Tras el
tratamiento con DAC se observa la recuperación
de transcritos para HLA-A y HLA-B, recuperación
de su expresión en superficie de estas moléculas,
así como el reconocimiento por CTLs específicos
para los antígenos tumorales MAGE. Este estudio muestra que la hipermetilación del DNA
podría ser un mecanismo responsable de la perdida de moléculas HLA de clase I, proporcionando una nueva ruta de escape al re c o n o c i m i e n t o
inmunológico.
O-52. GENERACIÓN IN VIVO DE METÁSTASIS TAP POSITIVAS Y TAP NEGATIVAS
DESDE UN CLON TUMORAL TAP NEGATIVO
A. García-Lora, P. Jiménez, I. Algarra, F. RuizCabello, F. Garrido
Servicio de Análisis Clínicos e Inmunología. Hospital
Universitario Virgen de las Nieves. Granada
En nuestro laboratorio hemos generado un sistema tumoral murino constituido por líneas celulares derivadas de clonos de un tumor primario
(GR9) inducido por metilcolantreno en ratones
22
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
BALB/c, y metástasis espontáneas generadas a partir de estos clonos en ratones inmunocompetentes
y nude. El clon del tumor primario B9, no muestra
expresión basal en superficie de moléculas H-2 de
clase I, pero sí son inducidas todas las moléculas
por tratamiento con IFN-γ. Mediante estudios de
RT-PCR, con células en estado basal, detectamos
niveles normales de mRNA de las moléculas K, D
y L. Análisis de la expresión de los genes TAP-1 y
LMP-2 por RT-PCR, mostró una pérdida de expresión de estas moléculas en este clon.
El tratamiento con IFN recuperó la expresión
de dichas moléculas.
En metástasis espontáneas obtenidas en ratones inmunocompetentes con este clon, encontramos el mismo fenotipo y el mismo defecto molecular que en el clon B9. Por el contrario, cuando
generamos metástasis espontáneas en ratones
nude con el mismo clon, las metástasis encontradas presentan expresión basal de moléculas H-2
de clase I, recuperando la expresión de los genes
TAP-1 y LMP-2. Estos resultados indican que en
ausencia de células T (ratones nude), las metástasis generadas "recuperaron" la expresión en superficie de moléculas H-2 de clase I, y la expresión de
los genes TAP-1 y LMP-2.
O-53. RECHAZO TUMORAL POR LA
INFILTRACIÓN DE CÉLULAS SUPRESORAS
NATURALES TRAS EL TRATAMIENTO CON
INMUNOTERAPIA ADOPTIVA
CICLOFOSFAMIDA
B. Peláez, J.A. Campillo, J. A. López Asenjo,
J. L. Subiza
Departamentos de Inmunología y Patología. Hospital
Clínico San Carlos. Madrid
Las células supresoras naturales (NS) son células generadas durante el crecimiento tumoral.
Estas células son progenitoras de la serie mieloide
que producen grandes cantidades de óxido nítrico (NO) e inhiben respuestas linfocitarias. Esta
propiedad inmuno-supresora se encuentra dentro
de los mecanismos de escape tumoral.
Las células NS también son inducidas bajo el
régimen de quimioterapia con ciclofosfamida
(Cy). Paradójicamente, la utilización de Cy potencia la respuesta antitumoral durante el tratamiento con inmunoterapia adoptiva.
El objetivo de este trabajo fue investigar si dentro del sinergismo antitumoral que existe entre la
Cy y la terapia adoptiva estaban implicadas la
generación y activación de las células NS.
Se estudió la inducción de células NS por la Cy
y su capacidad supresora. Se evaluaron cortes histológicos tumorales y la implicación del NO gene-
INMUNOLOGÍA
rado por las NS en el rechazo tumoral tanto in vitro
como in vitro.
Los re s u l t a d o s in vivo re v e l a ron que las células NS ejerc i e ron una acción supresora antitumoral sólo en presencia de señales T activadoras
(IFNγ + CD40). En las biopsias se identificaron
células NS con el mAb ER-MP54 dentro de la
reacción inflamatoria de rechazo tumoral, la cual
sólo se desarrolló tras el régimen de terapia adoptiva y Cy. La utilización de un inhibidor del NO
tanto en cultivo como in vivo, demostró que esta
molécula, generada por las células NS, era la responsable de rechazar la proliferación y el desarrollo de la masa tumoral. Las células NS intratumorales expresaron el enzima que sintetiza el
NO.
La conclusión de este estudio es que el sinergismo entre el tratamiento con Cy y terapia adoptiva
depende por un lado, de la generación de células
NS y por otro, de su activación, llegada al entorno
tumoral y de su síntesis de NO. Estas dos últimas
condiciones dependen de las señales linfocitarias
provenientes de la terapia adoptiva.
O-54. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN
DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA-2
(CD25) EN LA LEUCEMIA LINFOCÍTICA
CRÓNICA DE CÉLULAS B (LLC-B) POR
INTERLEUCINA 2 (IL2) Y TRANSFORMING
GROWTH FACTOR-B (TGF-B)
Y. Romero, J. A. Vargas, M. Villarreal, R. Castejón,
A. Gallego, J. García-Marco*, A. Durántez
Servicios de Medicina Interna I y *Hematología. Clínica
Puerta de Hierro. Madrid
Introducción: la LLC-B es un proceso neoplásico en el que se acumulan linfocitos B monoclonales CD5+. In vitro se produce apoptosis que varias
citocinas, como la IL-2, son capaces de prevenir.
Por otro lado, el TGF-β es un importante inmunorregulador de los linfocitos B normales, en los que
inhibe proliferación dependiente de IL2 (modula
respuesta a IL2), mientras que en la LLC-B tiene
un efecto heterogéneo que parece depender de la
expresión de sus propios receptores en la superficie celular.
Objetivo: analizar el efecto del TGF-β en la expresión de receptores de IL-2 (CD25) en la LLC-B.
Pacientes y métodos: analizamos 19 pacientes con
LLC-B. Se obtuvieron las células leucémicas mediante centrifugación diferencial y selección negativa con
hematíes de carnero. Se cuantificó la expresión del
receptor de IL2 mediante tinción con anticuerpos
monoclonales (CD19, CD5, CD25) en células cultivadas 24 y 48 horas con IL-2, con TGF-β, con ambas
citocinas y en situación basal. Se utilizó un citóme-
COMUNICACIONES ORALES
tro FACSort (Becton Dickinson) y los programas
Lysis II y Paint-a-gate.
Resultados: la expresión de CD25 en linfocitos
recién obtenidos fue de 30,7%. Tanto la IL2 como
el TGF-β, como ambas citocinas juntas incrementaron de forma significativa la expresión del receptor de IL2. La t de student para la diferencia de las
medias fue significativa en todos los casos con una
p <0,05. La combinación de ambas citocinas produjo un incremento en la expresión de CD25 significativamente superior al de ambas citocinas por
separado.
Control IL2 TGF-β IL2+TFG-β
% CD25 24H 58,1 ± 25,7 72,7 ± 20,1 69,8 ± 15,7
77,3 ± 15,7.
% CD25 48H 65,4 ± 25,1 77,6 ± 15,7 77,2 ± 19,8
82,6 ± 14,5.
Conclusión: en la LLC-B existe una respuesta
anómala al TGF-β que, en este caso, a través del
incremento en la expresión del CD25 podría
potenciar el efecto de la IL2 como factor de supervivencia de estas células.
ALERGIA, INFECCIÓN,
INFLAMACIÓN Y COMPLEMENTO
O-55. ALTERACIONES FENOTÍPICAS
Y FUNCIONALES EN LINFOCITOS T
DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES
CON CARCINOMA GÁSTRICO
A. P. Valeri Lozano, M. Pérez Blas, N. Aguilera
Montilla, A. Gutiérrez*, J. Martín*, T. Ratia*, J. M.
Muguerza*, A. López*, I. Lara*, A. Martín Villa
Inmunología. Facultad Medicina. Universidad Com plutense. Madrid. *Cirugía Digestivo. Hospital Príncipe
de Asturias. Alcalá de Henares. Madrid
Se estudió la capacidad funcional in vitro de TPBL y de líneas celulares T de pacientes con carcinoma gástrico, tras su activación vía CD3, CD2 y
CD28, aisladamente o con otros mitógenos. Se
procesaron muestras de 7 controles y 6 pacientes.
Además, se transformaron T-PBL con Herpesvirus
saimiri (HVS) a fin de obtener líneas T estables. El
estudio fenotípico de las células T-PBL muestra
una disminución de las células CD3+ y de la expresión de CD28, así como un aumento de las células
CD16+.
Los datos funcionales de T-PBL revelaron que
la activación mediada por PHA, CD3, CD2 y
CD28 es defectuosa, mientras que la combinación PMA+Ionomicina induce una adecuada proliferación.
23
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
La transformación permitió obtener líneas celulares T-CD8. El fenotipo muestra expresión de
TCRαβ, CD45, CD45RO, CD56, CD2, CD3,
CD28, HLA-DR y CD86 similares a líneas T HVS
control. La expresión de CD80 y CD25 se hallan
disminuidas frente al control.
Se constata una inadecuada proliferación tras
activación vía CD2, CD3 y CD28, defecto no corregible mediante la adición de IL2 .
Por tanto, las líneas T HVS+, pese a las alteraciones fenotípicas inherentes a la transformación,
mantienen el defecto funcional básico vía CD3,
CD2 y CD28 observado en las células T- PBL de los
pacientes.
O-56. ALTERACIONES FENOTÍPICAS
Y FUNCIONALES EN LINFOCITOS T
DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES
CON ENFERMEDAD INFLAMATORIA
INTESTINAL
N. Aguilera Montilla, A. P. Valeri Lozano, M. Pérez
Blas, G. Castellano*, B. Casís*, F. Sanchez F*, J. M.
Martín Villa
Inmunología. Facultad de Medicina. UCM. Madrid.
*Servicio de Digestivo. Hospital 12 de Octubre. Madrid
Se estudió la capacidad funcional in vitro d e
células T de sangre periférica (T-PBL) y de líneas celulares T de pacientes con enfermedad de
Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU) tras su activación vía CD3, CD2 y CD28, aisladamente o en
combinación con otras sustancias mitogénicas.
Se pro c e s a ron muestras de 60 controles y 6
pacientes -3 CU y 3 EC-. Además, se transformaron las células T-PBL con Herpesvirus saimiri
(HVS) para obtener líneas T estables. El estudio
fenotípico de las células T-PBL muestra expresión comparable al control en CD2, CD3, CD4,
CD8, CD45 y HLA-DR. La expresión de CD25 es
menor en CU que en controles. La activación
mediada por CD3 se halla alterada en células TPBL de pacientes con EC y CU (p <0,05), defecto que no se corrige con la adición de IL2, PMA
ni CD28. La respuesta a PHA es menor que en
c o n t roles, mientras que la activación mediante
PMA+Ionomicina induce una adecuada respuesta. Obtuvimos 4 líneas celulares T-CD8 HVS procedentes de los pacientes con EC y 2 líneas THVS de controles. El fenotipo de las líneas T-HVS
de pacientes es similar al de líneas control. La
activación de las líneas T-HVS de los pacientes
mostró que la respuesta frente a CD2, CD3 y
CD28 era mayor que en las líneas control, lo que
puede reflejar el estado de activación de las células T-PBL de los pacientes. La discordancia con
las células T-PBL puede deberse al tratamiento
inmunosupresor de los pacientes.
24
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
O-57. ALTERACIÓN DE LA RESPUESTA
INFLAMATORIA Y AUMENTO DE LA
NEURODEGENERACIÓN EN RATONES
DEFICIENTES DE METALOTIONEÍNA I Y II
CON ENCEFALITIS AUTOINMUNE
EXPERIMENTAL
C. Espejo, M. Penkowa*, X. Montalbán,
J. Hidalgo**, E. Martínez-Cáceres
Unitat Neuroinmunologia Clínica. Servei Neurologia.
Hospital Universitario Vall d’Hebron. Barcelona. *The
Panum Inst. Departament Medical Anatomy.
University Copenhagen. Dinamarca. **Departamento.
Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Universidad
de Fisiología Animal, Facultad Ciencias. UAB,
Barcelona
Las metalotioneínas (MT) I y II son proteínas
antioxidantes que tienen un papel pro t e c t o r
durante la inflamación en el sistema nerv i o s o
central (SNC). Recientemente, se ha descrito que
la administración exógena de MT-II disminuye
significativamente los signos clínicos, mort a l idad e infiltración leucocitaria en el SNC durante
la encefalitis autoinmune experimental (EAE),
modelo animal de esclerosis múltiple (EM). En
este trabajo hemos analizado la influencia de las
MT sobre la EAE en ratones deficientes de MT-I
y II (MT-I+II-/-).
Material y métodos: se inmunizaron 32 ratones
129Sv y 30 ratones 129Sv-MT-I+II-/- de 8-14 semanas de edad con 100 µg del péptido 40-55 de la glicoproteína mielínica de los oligodendrocitos de
rata (MOG40-55). Se valoró diariamente el curso clínico. Los animales fueron sacrificados el día 37
post-inmunización y se realizó estudio inmunohistoquímico de cerebro y médula espinal para
analizar la respuesta inflamatoria, de estrés oxidativo y apoptosis celular.
Resultados: se observó que los ratones MT-I+II-/eran más susceptibles (70 vs 44%; p <0,05) y sufrían una enfermedad más grave (puntuación máxima: 3,52 ± 2,09 vs 1,66 ± 2,15; p<0,05) que la cepa
control. También se observó mayor respuesta
inflamatoria, tanto a nivel de tamaño del infiltrado celular como de producción de citocinas proinflamatorias como IL-1β, IL-6 y TNF-α, en el SNC
de ratones MT-I+II-/- respecto a ratones control. Los
ratones MT-I+II-/- presentaron niveles más elevados de marcadores de estrés oxidativo como iNOS,
NITT y MDA. La técnica de TÚNEL reveló que
había más muerte neuronal y glial en ratones MTI+II-/- que en la cepa control.
Conclusiones: estos resultados apoyan que MTI y II pueden regular la respuesta inflamatoria y
proteger al SNC del daño tisular que se produce
durante la EAE, por lo que estas proteínas antioxidante podrían tener un papel importante en el
tratamiento de la EAE/EM.
INMUNOLOGÍA
O-58. ESTUDIO DEL INFILTRADO
INFLAMATORIO DE LOS ANEURISMAS
DE AORTA ABDOMINAL
E. Ocaña, J. C. Bohorquez*, J. A. Brieva, C. Rodríguez
Servicios de Inmunología y *Cirugía Vascular. Hospital
Universitario Puerta del Mar. Cádiz
Antecedentes: los aneurismas de aorta abdominal (AAA) son la forma más común de enfermedad aneurismática siendo causa de muerte en el
1-2% de varones mayores de 65 años. Histológicamente se caracterizan por fragmentación
de la red de elastina, disminución en el número
de células musculares y existencia de un infiltrado inflamatorio en las capas media y adventicia.
Aunque la etiopatogenia de los AAA no es completamente conocida, la inflamación de la pared
vascular ha sido propuesta como un factor causal. La población linfoide infiltrante no ha sido
aún definida.
Objetivos: el objetivo del estudio fue la caracterización del infiltrado linfoide de los AAA y la identificación de su estadio madurativo.
Material y métodos: se procesaron segmentos
de AAA humanos obtenidos de pacientes sometidos a cirugía reparadora .Como control se
empleó sangre periférica. Se hizo un pro c e s amiento independiente de las capas media y
adventicia mediante disgregación mecánica,
digestión con colagenasa y posterior separación
celular mediante gradiente de densidad. El análisis de las poblaciones linfoides se re a l i z ó
mediante citometría de flujo utilizando Acmo
específicos.
Resultados: el infiltrado inflamatorio leucocitario de los AAA está formado fundamentalmente
por linfocitos T (CD45+CD3+) y, en menor cantidad, por linfocitos B (CD45+CD19+). No aparecen representadas otras poblaciones celulares
(granulocitos, NK, células plasmáticas ).Los linfocitos T infiltrantes tienen características de
memoria (CD45RO+RA-, CD27+), con predominio CD4+ y expresión del TCR αβ, están activados
(CD69+, DR+, CD71+, CD25+) y son no recirculantes (CD62L-). El estado madurativo de los linfocitos B que infiltran los AAA es el de linfocitos B
maduros (kappa+/lambda+, CD34-). Además de
una población IgM+IgD+, se detectan poblaciones
de linfocitos B con características de memoria
(IgD-IgM+/IgA+, CD27+). No se detectan linfocitos B en estadio de centro germinal (CD38+,
CD10). Los linfocitos B también expresan marcadores de activación (CD69, CD80) y son no recirculantes (CD62L-).
Conclusiones: la existencia de poblaciones linfoides de memoria y activadas sugiere su posible
papel patogénico en los AAA. La caracterización
de estas poblaciones permite la realización de estudios funcionales en este sentido.
COMUNICACIONES ORALES
O-59. DESCRIPCIÓN DEL INFILTRADO
LINFOIDE T EN LAS LESIONES HEPÁTICAS
DE PACIENTES CON HEPATITIS CRÓNICA
POR VIRUS C
C. Serrano, S. Castañón, M. Rico*, J. A. Quiroga*,
V. Carreño*, D. Subirá
Servicio de Inmunología de la Fundación Jiménez Díaz.
Instituto de Hepatología. Hospital Pardo de Aravaca y
*Fundación para el estudio de hepatitis virales. Madrid
Los mecanismos responsables de la lesión hepática crónica en la infección por el virus C (HCVC)
aún no están bien establecidos.
Objetivo: definir las características fenotípicas
del infiltrado linfoide T de las lesiones hepáticas
de pacientes con hepatitis crónica por virus C.
Pacientes: se sometió a biopsia hepática a 39
pacientes con HCVC,16 presentaban niveles normales de transaminasas (Grupo I) y 23 tenían enzimas elevadas (Grupo II). El daño tisular se calificó de 0 a 10.
Métodos: los anticuerpos monoclonales CD3
FITC/ CD4 PE/ CD8 RPE-Cy5 se utilizaron para
determinar por citometría de flujo las características de infiltrado linfoide de las biopsias y de las
subpoblaciones linfocitarias de sangre periférica.
Resultados:
1. Los pacientes del Grupo I tienen menor daño
histológico que los del Grupo II.
2. Los niveles de transaminasas y el resultado
del cociente CD4/CD8 intrahepático permite
agrupar a los pacientes según la tabla adjunta.
Tabla I
Cociente CD4/CD8
Grupo I
Grupo II
0,3-0,6
0,6-1
>1
7
10
9
8
5
3. Los 7 pacientes sin daño histológico están en
el Grupo I. El infiltrado de la biopsia muestra un
promedio de linfocitos T CD4 de 20,2 y de linfocitos T CD8 de 37,2.
4. Sólo hay pacientes con un cociente
CD4/CD8>1 en el Grupo II y todos ellos tienen
daño histológico moderado o severo (entre 6 y 10).
5. En ambos grupos, a medida que el daño histológico es mayor aumenta la proporción de linfocitos T CD4 y disminuye la de los linfocitos TCD8.
Conclusiones: en la HCVC, existe una relación
directa entre el infiltrado linfoide T CD4, el grado
de daño hepático y los niveles séricos de transaminasas. La relación es inversa para los linfocitos T
CD8 sin que exista correlación con las subpoblaciones linfocitarias en sangre periférica.
25
XXVII CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
O-60. LAS ESTATINAS POTENCIAN LA
RESPUESTA IMMUNE FRENTE A
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
IN VITRO
J. Matilla, G. Carpeño, M.ª T. Montero, M. A.
Lasunción
Servicio de Bioquímica-Investigación. Hospital Univer sitario Ramón y Cajal y Universidad de Alcalá. Madrid
Antecedentes: el IFNγ es una citocina clave en la
resolución de infección por M. tuberculosis.
Recientemente, hemos descrito que la inhibición de
la síntesis de colesterol con estatinas aumenta la actividad de la caspasa-1, proteasa que procesa Il-1β e Il18 a su forma madura, observándose un aumento en
la secreción de IFNγ en respuesta a M. Tuberculosis.
Objetivo: estudiar el efecto de las estatinas sobre
la cinética de secreción de las citocinas reguladoras de la producción de IFNγ y determinar las
poblaciones celulares implicadas en el aumento.
Métodos: PBMCs aisladas a partir de buffy coat,
se cultivaron a 2 x 106/ml en medio completo, en
presencia o ausencia de fluvastatina 5mM. Ambas
condiciones se activaron o no con M. tuberculosis
H37RA. A distintos intervalos del proceso valoramos la actividad enzimática por fluorometría y la
producción de citocinas por ELISA. Los efectos de
Il-12, Il-1β e Il-18 sobre IFNγ fueron estudiados
añadiendo anticuerpos específicos o inhibiendo
la caspasa-1 con YVAD. Estudiamos, mediante
citometría de flujo, las poblaciones celulares
implicadas en el incremento de la secreción de
IFNγ, así como la supervivencia celular.
Resultados: fluvastatina aumenta la producción
de Il-1β y de Il-18 a lo largo del proceso sin afectar a
la liberación de Il-12.YVAD, anti-Il-12, anti Il-1β y
anti Il-18 revierten el efecto de la estatina, sugiriendo que el aumento de IFNγ es inducido por Il-1β y
por Il-18, pero necesitan la Il-12. La estatina aumenta el IFNγ intracelular en células CD3+(CD8+ y
CD8-), y en CD3-/CD56+. El número de células
CD14+/CD36+ disminuye con la bacteria, efecto que
es más intenso en combinación con el fármaco.
Conclusiones: la activación de caspasa-1 potencia la respuesta inmune contra M. tuberculosis,
ofreciendo nuevas posibilidades terapéuticas.
O-61. ESTUDIO DEL POTENCIAL DE
MEMBRANA MITOCONDRIAL EN
LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA
(LSP) DE INDIVIDUOS SANOS Y EN
PACIENTES CON INFECCIÓN CRÓNICA
POR VIH- 1
P. Madrigal, S. Martínez-Rodríguez, R. Polo,
J. Verdejo, M. González Muñoz
Servicio de Inmunología. Servicio de Enfermedades
Infecciosas. Hospital Carlos III. Madrid
26
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
Objetivo: comparación del potencial de membrana mitocondrial (PMm) de los LSP de individuos sanos e infectados por VIH-1.
Sujetos del estudio y métodos: se extrajo sangre
heparinizada de sujetos sanos (n = 16) e infectados por VIH-1 (n = 70) y se procesó inmediatamente. El PMm se midió con un fluorocromo
lipofílico catiónico (JC-1). El análisis de las muestras se realizó por citometría de flujo. Los LSP se
seleccionaron según sus propiedades de dispersión de luz (FSC/SSC). Mediante un agente despolarizante (valinomicina) se ajustó los parámetros del citómetro y se definió la región de análisis
de la población linfocitaria con PMm alterado. Los
resultados se expresan como el % de LSP con disminución del PMm (PMmL).
Resultados: el PMmL fue 1,19% (0,18-2,81) y
2,08% (0,2-10,67) en individuos sanos e infectados
por VIH-l respectivamente (p = 0,007). De los VIH+,
el 19,2% mostraron un PMmL >3,82% (media + 3 DE
del grupo control). El PMmL correlaciona negativamente con el número de CD4 (r = -0,34; p = 0,004),
positivamente con el %CD8 (r = 0,32; p = 0,007), y
no correlaciona con la carga viral. El 28,3% de
pacientes tratados tenían el PMmL >3,82%, mientras
que ninguno de los no tratados tenían PMmL >3,82%
(p = 0,01; test exacto de Fisher).
Conclusiones: se pueden valorar alteraciones
significativas en el PMm de los LSP de pacientes
VIH-1+ sin necesidad de cultivo celular. La presencia de PMmL puede ser la consecuencia de la
inducción de apoptosis por el VIH-1 en órganos
linfoides secundarios, o puede estar relacionada
con la toxicidad mitocondrial de los NRTls.
O-62. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL
DEFECTO DE LYST EN LÍNEAS DE
LINFOCITOS T CD8+ TRANSFORMADAS CON
HERPESVIRUS SAIMIRI PROCEDENTES DE
PACIENTES CON EL SÍNDROME DE CHEDIAK
HIGASHI
J. M. Martín Fernández, J. García Cabanillas, P. R.
Rodríguez Duque*, R. A. Spritz**, J. R. Regueiro
Inmunología. Universidad Complutense de Madrid.
*Hospital Central de San Cristóbal, Venezuela.
**University of Colorado Health Sciences Center.
Denver. EE.UU.
El síndrome de Chédiak Higashi (CHS) es una
anomalía humana de herencia autosómica recesiva originada al mutar un gen (CHS1) que codifica
una fosfoproteína (Lyst) relacionada con la regulación del tráfico lisosómico.
Partimos de un modelo de linfocitos T transformados con Herpesvirus saimiri de 3 pacientes, 7
portadores y líneas control.
Hemos confirmado mediante experimentos funcionales (actividad NK) y microscopía que las líneas
INMUNOLOGÍA
de los pacientes poseían la marca diagnóstica (baja
citolisis NK y gránulos gigantes) y hemos intentado
sin éxito caracterizar las mutaciones de cada línea
por secuenciación de sus 54 exones. Sólo aparecía
un raro polimorfismo consistente en una sustitución
en el aminoácido K590N, en un portador obligado
(CH2) heterocigoto para esta sustitución.
En conclusión, la clínica, el diagnóstico por
microscopía y los experimentos funcionales apuntan a la presencia del síndrome, pero no hallamos
mutaciones exónicas. Es posible que exista otro
tipo de mutaciones en CHS1 o, lo que sería más
interesante, que Lyst sea normal y sea otra proteína de dicha ruta la afectada.
Este trabajo fue financiado por el MEC
(CPR264/97-7415), utilizando instalaciones del
Centro de Técnicas Inmunológicas de la U.C.M.).
O-63. CANDIDA ALBICANS INFECTION
ENHANCE IMMUNOSUPPRESSION
INDUCED BY CYCLOPHOSPHAMIDE BY
SELECTIVE PRIMING OF SUPPRESSIVE
MYELOID PROGENITORS
I. Angulo Barturen, B. Jiménez*, M. A. MuñozFernández*, M. Fresno
Centro de Biología Molecular, CSIC-UAM. *Depart ment of Immunology. Hospital Gregorio Marañón.
Madrid
Infections in immunocompromised patients
oftenly complicate chemotherapy.
In particular, systemic infections caused by fungi
after cytoreductive therapies, mostly used in conditioning regimes for bone marrow transplantation or
cancer treatment, are especially difficult to deal with
in spite of currently available antimicrobials. This
fact has prompted researchers and clinicians to develop suitable complementary immunotherapies.
However, little is known about the effects of fungi
on the immune system of immunosuppressed hosts.
We have addressed this by studying the in vitro T cell
responses after systemic infection with Candida albicans in cyclophosphamide-treated mice. During
recovery from the cytotoxic effects of cyclophosphamide, a massive splenic colonisation by immature myelomonocytic (Ly-6G+CD11b+) cells takes
place, which contribute to immunosuppression by
inhibiting T proliferative responses via a nitric oxide (NO)-dependent mechanism. Systemic infection
of cyclophosphamide-treated mice with a sublethal
dose of Candida albicans further increased NOdependent suppression by selective priming of myeloid precursors (Ly-6G+CD31+) for iNOS protein
expression. The results indicate that systemic fungal infection can augment the effects of immunosuppressive therapies by promoting funtional changes in immunosuppressive cell populations.
COMUNICACIONES ORALES
O-64. EL FACTOR Xa ACTÚA SOBRE EL
TERCER COMPONENTE DEL SISTEMA
DEL COMPLEMENTO
C. Pastor, L. Vidarte, S. Mas, A. B. Blázquez,
C. Durán, F. Vivanco
Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez
Díaz. Madrid
Se han descrito múltiples relaciones entre el sistema del Complemento y el sistema de la Coagulación.
Dichas relaciones cubren un amplio rango, pero
básicamente tienen como objetivo principal proteger las células endoteliales de una activación inespecífica del complemento. Esta protección va desde
la secreción del C1 inhibidor, hasta el reclutamiento de leucocitos, previniendo una ampliación del
daño tisular.
El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar
la digestión que realiza el factor Xa del sistema de
la coagulación sobre tercer componente del sistema del complemento (C3).
La secuencia de los extremos amino-terminal de
los fragmentos generados por la digestión de C3 por
el factor Xa da un patrón similar a los generados por
el factor I (proteína reguladora del sistema del complemento). Los resultados demuestran que el factor
Xa digiere C3, generando su forma activa C3b.
Además el factor Xa es capaz de actuar sobre C3 unido a un activador generando la molécula de degradación C3dg, molécula ampliamente relacionada
con la activación de la respuesta inmune.
Estos datos sugieren que la degradación por
parte del factor Xa de C3 podría ser otro mecanismo de protección de las células endoteliales frente a la activación inespecífica de complemento: el
daño tisular por la activación del sistema del complemento activaría las células del endotelio, provocando un aumento en la concentración de factor
Xa, el cual, actuaría como agente de control del C3
evitando una ampliación del daño.
DIFERENCIACIÓN, CÉLULAS
Y CITOQUINAS
O-65. CARACTERIZACIÓN Y ESTUDIO DE
LOS PRECURSORES DE LINAJE PRESENTES
EN EL HÍGADO EMBRIONARIO
S. Minguet, J. A. Martínez*, P. Gonzalo*, B. de
Andrés*, A. Izcue1, M. L. Gaspar*, M. A. R. Marcos
CBM-SO. Universidad Autónoma de Madrid. *CNBFISCIII. Majadahonda. Madrid
Durante el desarrollo embrionario temprano,
el hígado fetal (HF) es el principal órgano hematopoiético. A 10.5-11 días de gestación (dpc), ya
27
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
han tenido lugar los primeros cambios morfológicos y la formación del primordio hepático.
Basándonos en la expresión de marcadores
específicos de linaje y de células precursoras,
hemos caracterizado cuatro poblaciones celulares
que constituyen la totalidad del HF en la ventana
10.5-13.5 dpc. Así tenemos, una población (A) de
fenotipo c-Kit+CD45+Ter119- que constituye el
componente hematopoiético del HF y contiene
precursores B, T y precursores mieloides. En condiciones que promueven el desarrollo linfoide, es
la única capaz de originar colonias hematopoiéticas. Una población (B) de fenotipo c-Kit+
CD45+Ter119+, formada por precursores eritroides, que van perdiendo la expresión de c-Kit y
CD45, maduran y se expanden formando el componente eritroide definitivo del HF (población C,
c-Kit-CD45-Ter119+). Por último, existe una
población de fenotipo c-Kit+CD45-Ter119-,
mayoritaria a 10.5-11.5 dpc, negativa para marcadores hematopoiéticos. Considerando que esta
población pudiera incluir precursores hepáticos
(hepatoblastos), se analizó la expresión de genes
específicos de este linaje, siendo la única que
expresa estos tránscritos (AFP, albúmina, TTR,
HNF-4, c-met...). Trabajando con cultivos que
favorecen la formación de colonias hepáticas, se
analizó la frecuencia de precursores clonables y el
fenotipo de las colonias obtenidas. Se comprobó
que, exclusivamente las células de fenotipo
c-Kit+CD45-Ter119- son capaces de establecer
colonias, que tienen características tanto de hepatocitos como de colangiocitos. Por tanto, esta
población contiene precursores hepáticos bipotenciales (liver stem cells). Estos resultados completan la identificación fenotípica de las poblaciones de precursores, hematopoiéticos y hepáticos,
presentes desde las primeras etapas de formación
del HF.
O-66. POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN
DE POBLACIONES PROGENITORAS
EMBRIONARIAS (AA4.1+/ CD19+ Y AA4.1+/
CD19-) DE HÍGADO FETAL A DÍA 11.5DPC
P. Gonzalo, B. de Andrés, S. Minguet, PG. Soro, M.
A. R. Marcos, M. L. Gaspar
CNBF, Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda.
Madrid
La diferenciación de un progenitor multipotencial a un linaje requiere la aparición de determinados factores intrínsecos (factores de transcripción y
microambientales (contactos intercelulares, y factores solubles) los cuales coinciden en estadios temporales muy concretos durante la vida embrionaria.
Nuestra línea de trabajo ha descrito la existencia de una onda muy temprana de activación de
28
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
genes ligados a desarrollo B tales como rag1/2,
VpreB y más recientemente CD19 y Pax5 a día 1011 de gestación.
Con objeto de mostrar la existencia de progenitores unipotenciales B en estadios tan tempranos hemos desarrollado diversos sistemas de diferenciación in vitro.
La evaluación del potencial linfoide/mieloide se
realizó utilizando sistemas de expansión in vitro,
con una línea estromal ST2 y la combinación de
citoquinas (SCF stem cell factor, IL7 y IL11) de
poblaciones purificadas por sorting AA4.1+ CD19+
y AA4.1+ CD19- a día 11 de gestación. Los resultados muestran que la población CD19+ exclusivamente genera células CD19, B220,
Thy1, Mac1,
+
mientras que la población AA4.1 CD19- contiene
progenitores B (CD19+, B220+) y mieloide (CD19-,
Gr1+, Mac1+). Además utilizamos el sistema de cultivo FTOC (fetal thymic organotipic culture) para
poder estudiar la capacidad de generar células T in
vitro de ambas fracciones, obteniendo únicamente
células CD3+ en el caso de la fracción CD19-.
Así pues, presentamos de forma relevante la
caracterización de una población progenitora
comprometida al linaje linfoide B a tiempos tempranos en la gestación de ratón (11.5 pdc).
O-67. CARACTERIZACIÓN DE LOS
PROCESOS DE DIFERENCIACIÓN DE
CÉLULAS DENDRÍTICAS INTRATÍMICAS
HUMANAS
V. G. de Yébenes, Y. R. Carrasco, A. R. Ramiro,
M. L. Toribio
Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. Univer sidad Autónoma. Madrid
Los procesos de diferenciación de células dendríticas (DCs) intratímicas humanas no han sido
caracterizados hasta la fecha, aunque trabajos
anteriores de nuestro y otros grupos, han demostrado que los precursores más inmaduros del timo
humano retienen el potencial de diferenciación a
células dendríticas y a otros linajes linfoides como
células T y NK. Los estudios realizados en ratón
han relevado la existencia de una única población
de células dendríticas de timo, relacionada con el
linaje linfoide, que se genera a partir de un precursor común a células T.
En este trabajo hemos analizado las células dendríticas del timo humano y hemos identificado una
subpoblación nueva con características mieloides.
Los objetivos fundamentales de este trabajo han
sido la caracterización de los procesos de diferenciación de este nuevo subtipo de DCs relacionadas con el linaje mieloide, así como determinar si
las DCs mieloides tienen un origen intratímico, o
por el contrario, se generan en periferia y poste-
INMUNOLOGÍA
riormente migran al timo. Para ello, se han establecido sistemas in vitro,de diferenciación de DCs
a partir de precursores multipotenciales CD34++
de timo humano que han permitido identificar los
precursores intermediarios que intervienen en el
procesos de diferenciación. Durante la diferenciación, se generan dos precursores intermediarios CD34+/- diferentes, que han sido caracterizados por su expresión diferencial de los marcadores
CD44, CD5 y CD33. Dichos precursores fueron
aislados por separado para determinar su potencial de diferenciación a células T, células NK,
monocitos y DCs de fenotipo mieloide (DC1).
Los resultados obtenidos demuestran que los
precursores CD34+/CD44++CD5-CD33- son precursores de monocitos, DCI y NKs que han perdido la capacidad de diferenciación a células T. Por
el contrario, los precursores CD34+/-CD44+/CD5+CD33+ son precursores de células T y células NK, desprovistas del potencial de diferenciación a monocitos y DC1. La relevancia
fisiológica de dichos precursores intermediarios
fue demostrada al encontrar precursores fenotípicamente y funcionalmente equivalentes en preparaciones de timo humano.
Por tanto, este trabajo ha permitido identificar
y caracterizar un proceso de diferenciación intratímico de un nuevo subtipo de células dendríticas
con características mieloides.
0-68. EL ÁCIDO MICOFENÓLICO INDUCE
LA GENERACIÓN DE CÉLULAS
DENDRÍTICAS CD14+ Y CON POBRE
CAPACIDAD ESTIMULATORIA
M. Lejeune, F. García, C. Martínez, M. Plana,
O. Millán, J. Martorell, J. M. Miró, J. M. Gatell,
T. Gallart
Institut Clínic d’Infeccions i Immunologia. IDIBAPS.
Hospital Clínic. Barcelona
Antecedentes: el ácido micofenólico (MPA) es el
metabólito activo del mofetil micofenolato, un fármaco immunosupressor ampliamente utilizado en
trasplantes alogénicos que inhibe la proliferación
linfocitaria. Recientemente se está utilizando también en enf. autoinmunitarias así como en pacientes VIH+ como un medio para reprimir la replicación vírica, al evitar la proliferación linfocitaria.
No hay datos acerca de los efectos del MPA en las
células dendríticas (CD) humanas.
Objetivos: analizar si el MPA tiene un efecto
directo sobre la generación y funcionalidad de las
CD humanas derivadas de monocitos (CD-DM).
Resultados: la presencia de MPA durante la generación de CD-DM con GM-CSF+IL-4 no afecta
aparentemente al inmunofenotipo y morfología
de las CD-DM. Sin embargo, al sustituir a la IL-4
COMUNICACIONES ORALES
con MPA los monocitos se transforman en CD de
características morfológicas similares a las obtenidas con GM-CSF+IL-4, pero con la diferencia de
que son CD14+ y que muestran menor expresión
de CD40, CD80 y CD86. Además, presentan una
pobre capacidad estimulatoria de las células T
autólogas frente a antígenos proteicos solubles. La
presencia de TNF-α durante los 3 últimos días de
cultivo induce una fuerte activación de las CD-DM
obtenidas con GM-CSF+IL-4 lo que se traduce por
un aumento de CD83 y translocación hacia la
membrana del DR intracelular, unos efectos que
no tienen lugar en las CD-DM CD14+. A pesar de
expresar CD14, el LPS tampoco tiene efectos activatorios en dichas CD-DM obtenidas con GMCSF+MPA.
Conclusiones: los datos sugieren que los efectos
inmunosupresores del MPA pueden no depender
sólo de la inhibición de la proliferación linfocitaria, sino también de sus efectos negativos sobre la
generación y funcionalidad de las CD mieloides
(FIS99/0289).
0-69. OTPIMIZACIÓN DE LA MADURACIÓN
DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Y EL PULSADO
ANTIGÉNICO EN CONDICIONES GMP
PARA USO CLÍNICO
M. Lejeune, F. García, C. Martínez, M. J. Maleno,
M. Plana, J. M. Miró, J. M. Gatell, T. Gallart
Institut Clínic d’Infeccions i Immunologia. IDIBAPS.
Hospital Clínic Universitari. Barcelona
Antecedentes: el grado de maduración de las
células dendríticas y el momento apropiado para
el pulsado antigénico son puntos esenciales para
el uso de las CD-DM como adyuvante de una vacunación terapéutica. Algunos postulan que antes
del pulsado debe inducirse la maduración de las
CD-DM con un “monocyte-condicioned medium”,
lo que complica el proceso según criterios GMP.
Objetivos: analizar la capacidad de las CD-DM
de presentar el antígeno a las células T según el
pulsado antigénico se haga antes o después de su
maduración inducida con TNF-α o IFN-α.
Resultados: el IFN-α es un medicamento y por
tanto cumple las condiciones GMP. Las CD-DM
obtenidas tras 7-8 días de cultivo con GM-CSF+IL4 pueden hacerse madurar en presencia de TNF-α
durante los 3 últimos días del cultivo, lo que se traduce por el aumento de la expresión de CD83 y la
translocación hacia la membrana del DR intracelular. Estas CD-DM son poco eficaces para presentar antígenos proteicos a las células T lo que probablemente indica que su excesiva maduración
impide una buena captura del antígeno. Por el contrario, las CD-DM obtenidas clásicamente con GMCSF+IL-4 después de ser pulsadas durante 24 h con
29
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
antígenos solubles en presencia de suero autólogo
con anticuerpos IgG contra el antígeno, experimentan un proceso de maduración, medida por
translocación de HLA-DR a la membrana, siendo
capaces de inducir potentes respuestas en las células T. Esta maduración y eficiencia estimuladora
puede incrementarse si se añade IFN-α durante las
últimas 20 horas del pulsado.
Conclusiones: el pulsado antigénico de las CDDM debe realizarse en un estado relativamente
inmaduro. Dicho pulsado induce su activación/
maduración si se realiza en presencia de suero
autólogo con anticuerpos IgG contra el antígeno,
y la adición de IFN-α en las últimas 20 h permite
incrementar dicha maduración y capacidad estimulatoria.
0-70. CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS
FOLICULARES DENTRÍTICAS
J. M. García Pacheco, F. J. Blanco*, M. Kimatrai*,
E. García Olivares*
Laboratorio de Inmunología. Hospital do Meixoeiro.
Vigo. *Unidad de Inmunología. Facultad de Medicina.
Universidad de Granada. Granada
Las células foliculares dentríticas (FDC, folli cular dendritic cells) desempeñan una función fundamental en la respuesta secundaria de las células
B, sin embargo, su origen y adscripción celular es
incierto. En el presente trabajo hemos purificado
FDC y estudiado su fenotipo antigénico y funciones.
Las FDC fueron purificadas por adhesividad
diferencial y por su capacidad de proliferar in vitro,
obteniéndose al cabo de aproximadamente dos
semanas, una población con una pureza superior
al 97%. Las células crecen en cultivo con una morfología fibroblástica durante un periodo de dos a
tres meses, a partir del cual, dejan de multiplicarse y mueren. Las células mantuvieron la capacidad
de unir células B y una expresión antigénica constante. El fenotipo antigénico de estas células fue
estudiado mediante citometría de flujo y RT-PCR,
detectando, de acuerdo a la mayor parte de los
autores, la expresión de antígenos del linaje B,
como el CD21 y CD23; antígenos específicos de
FDC, como el HJ2 y DRC-1 (CD21L); HLA-II y
ausencia de CD45. Sin embargo, y en disconformidad con lo publicado previamente, observamos
que nuestras células expresaban CD10, pero no
CD14. Estos datos, junto con el hecho de que las
FDC sean también positivas para CD34 y STRO1, sugiere que las FDC aisladas por nosotros se
encuentran en una etapa inicial de diferenciación
y están relacionadas con el precursor estromal de
médula ósea. También encontramos que las FDC
expresan alfa-smooth muscle actin.
30
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
O-71. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE
DLEC, UN NUEVO GEN MIEMBRO DE LA
FAMILIA DE LAS LECTINAS
DEPENDIENTES DE CALCIO QUE SE
EXPRESA PREFERENCIALMENTE EN
CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE
MONOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA
I. Arce, P. Roda-Navarro, M. C. Montoya*, P.
Hernanz-Falcón, E. Fernández-Ruiz
Unidad de Biología Molecular. *Servicio de Inmu nología. Hospital Universitario de la Princesa. Madrid
El análisis de las bases de datos de EST nos ha
permitido la identificación de un nuevo gen que
codifica para una proteína de membrana de tipo
II que hemos denominado DLEC (dendritic-cell
lectin). Esta proteína pertenece a la familia de las
lectinas dependientes de calcio. La región citoplásmica de DLEC no presenta motivos consenso de señalización mientras que la part e
extracelular presenta un único dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD). El gen
DLEC se encuentra situado en el cro m o s o m a
12p13.2 en la zona telomérica del complejo
génico NK y presenta una estructura genómica
similar a otras lectinas relacionadas. La expresión de DLEC se detecta a nivel de mRNA por
Northern Blot únicamente en células dendríticas
derivadas de monocitos de sangre periférica.
DLEC es un nuevo gen que codifica para una lectina de tipo C y se expresa preferencialmente en
células dendríticas.
O-72. ESPECIALIZACIÓN FUNCIONAL
DE CD3γ Y CD3δ EN LOS PROCESOS DE
SELECCIÓN TÍMICA
E. Fernández, P. Delgado, B. Alarcón
Centro de Biología Molecular. Universidad Autónoma
de Madrid. Cantoblanco. Madrid
En ratones carentes de la subunidad CD3δ del
TCR se produce una parada de la diferenciación
tímica en el estadio de timocitos doble positivos
(DP), resultando en un efecto diferencial sobre los
procesos de selección positiva y negativa. La selección positiva está totalmente bloqueada, mientras
que la selección negativa está afectada sólo marginalmente. Anteriormente demostramos que en la
ausencia de CD3δ se produce un defecto específico en la activación de la ruta Ras-ERK de transmisión de señales. Este defecto parecía originarse por
una fosforilación defectuosa de la subunidad
CD3ζ en microdominios de membrana ricos en
colesterol. Para tratar de corregir el defecto en
selección positiva, hemos cruzado los ratones deficientes en CD3δ con ratones transgénicos para
INMUNOLOGÍA
v-Raf, una forma activa de un miembro de la ruta
Ras-ERK. La expresión de v-Raf no revierte el
defecto en selección positiva, sin embargo sí que
resulta aumento de la sensibilidad a la inducción
de apoptosis promovida por inyecciones de anticuerpos anti-CD3.
Contrariamente a los ratones deficientes en
CD3δ, los ratones carentes de CD3γ que estamos
estudiando tienen un defecto en selección negativa mucho más intenso que en selección positiva.
Aunque en estos ratones la activación de ERK está
disminuida, el efecto es menor que el de timocitos
carentes de CD3δ. Además, la ausencia de CD3γ
no causa sólo un defecto en la activación de ERK
sino que la actividad de las otras MAP quinasas,
JNK y p38 está también disminuida en el tiempo.
Parece que el defecto en maduración tímica en la
ausencia de CD3γ deriva no de la baja activación
de una ruta específica, como en la ausencia de
CD3δ, sino más bien de una disminueión generalizada de varias rutas de señalización.
O-73. DINÁMICA DEL COMPLEJO
TCR/CD3G EN LINFOCITOS T MADUROS
CD3γ-/-CD4+ vs CD8+ INMORTALIZADOS
CON HERPESVIRUS SAIMIRI (HVS)
COMUNICACIONES ORALES
nar el papel de la cadena CD3γ en la dinámica del
complejo TCR/CD3 tras estimulación celular. Para
ello se analizó en células T HVS CD4+ y CD8+ deficientes de CD3γ los procesos de internalización
(por citometría), tráfico intracelular (por microscopia confocal), degradación (por inmunoprecipitación) y reexpresión (por citometría) del complejo TCR/CD3 tras la estimulación con anti-CD3.
Nuestros datos apuntan que tras la activación
celular con ésteres de forbol no hay internalización del complejo TCR/CD3 en células γ-. Tras la
activación con anti-CD3, primero, la internalización en células γ- es menor respecto a las γ+, segundo, el tráfico intracelular del complejo TCR/CD3
internalizado está alterado en las células γ- respecto a las γ+ , la degradación y la expresión del complejo TCR/CD3 tras la modulación del receptor se
encuentra retrasada en γ- respecto a las γ+. Por ello,
la cadena CD3 γ está implicada en la internalización (vía PKC y vía CD3), en el tráfico intracelular endocítico y exocítico del complejo TCR/CD3
en células estimuladas con anticuerpos anti-CD3.
Este trabajo fue financiado en parte por la CAM
(13/97) y la DGES (PM 98/91) y MCT (HF-19990029) utilizando instalaciones del Centro de
Técnicas Inmunológicas de la U.C.M.
P. S. Torres, D. A. Zapata, A. Pacheco-Castro,
J. R. Regueiro
Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid
O-74. APROXIMACIÓN PARA EL ESTUDIO
FUNCIONAL DE LAS VARIANTES ISO Y
ALOTÍPICAS CODIFICADAS POR LOS LOCI
DE MIP-1β
El fenómeno de internalización del complejo
TCR/CD3 es un proceso utilizado por las células
para reducir rápidamente el nivel de expresión
superficial, en células estimuladas tiene una doble
finalidad: por un lado, favorece el encuentro entre
las moléculas señalizadoras y el receptor y por
otro, contribuye a la terminación de la respuesta
celular. Las secuencias señalizadoras para la internalización se encuentran caracterizadas en dos
motivos: los basados en tirosina (Tyr) existentes
en las subunidades CD3-γ, -δ, -ε y ζ , y los basados
en leucina (Leu) existentes en CD3-γ y-δ. Ambos
motivos jugarían un papel en la internalización del
complejo TCR/CD3 basal y/o tras la activación de
la célula T.
Numerosos estudios apuntan que en células no
estimuladas, la internalización y el reciclaje del
complejo TCR/CD3 depende de la subunidad
CD3γ. En respuesta a ésteres de forbol, las células
T humanas HVS deficientes de CD3γ no modulan
el TCR/CD3 superficial, mientras que, en respuesta a anticuerpos (anti-CD3), la modulación del
TCR/CD3 es menos eficiente en que las células
control, sin embargo, los datos de ratones
Knockout de CD3γ no modulan el TCR/CD3 en respuesta a anti-CD3. Nuestro objetivo es determi-
R. Colobran, P. Adreani, I. Gómez, Y. Ashhab,
P. Caro, O. Domínguez, R. Pujol Borrell, M. Juan
Unidad de Inmunología. Hospital Universitari Germans
Trias i Pujol. Badalona, Barcelona
La CC-quimiocina MIP-1β (o CCL4) se
encuentra estrechamente relacionada con un gran
número de funciones biológicas con interés inmunológico (entre ellas, MIP-1β se une a CCR5, uno
de los correceptores del HIV).
El MIP-1β presenta dos isoformas codificadas
por dos loci genéticos (A y B), con ciertas diferencias en su secuencia. Además, uno de ellos (locus
B) presenta un polimorfismo poblacional que
codifica para una aloforma con probable importancia funcional. El polimorfismo, que altera el
lugar de corte y unión (splicing site), se traduce en
la generación de una nueva proteína con 5 aminoácidos menos que la original y que llamamos MIP1β truncada. Recientemente en nuestro laboratorio hemos encontrado otra variante del locus B del
MIP-1β no relacionada con el polimorfismo descrito anteriormente. Se trata de un nuevo tránscrito que presenta una secuencia nucleotídica correspondiente a la del locus B del MIP-1β pero con una
delección completa del segundo exón. Este hecho
31
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
provoca una reducción muy importante del tamaño de la proteína, con la pérdida del motivo CC
característico de las β-quimiocinas. Además, a partir del punto donde se produce la deleción, encontramos un cambio en la pauta de lectura que hace
que esta proteína solamente presente los 2 primeros aminoácidos iguales a los del locus B del MIP1β. Hemos denominado a esta nueva variante
MBDSP (MIP-1 locus B Derived Small Protein).
Con el fin de estudiar las diferencias funcionales que puedan existir entre estas variantes del
MIP-1β (locus A, B, forma truncada y MBDSP), las
hemos producido de forma recombinante en su
forma nativa, fusionadas con la GFP y con colas
de 6-HIS y HA, a través de transfectantes estables.
Con los productos sintetizados realizaremos estudios de unión a los receptores de membrana (especialmente al CCR5), unión y valoración de la capacidad estimulatoria y/o quimiotáctica en
diferentes células diana, capacidad de unión a proteoglicanos y análisis de la capacidad de las variantes en la inhibición de la entrada de virus HIV R5.
Proyecto financiado por el FIS (99/1063).
del mRNA. Para generar el Estándar Intern o
competitivo, hemos escogido una secuencia no
relacionada (insulina) que se amplifica con un
mayor peso molecular y que a su vez presenta un
punto de corte para la endonucleasa Mspl. Al
emplear oligonucleótidos híbridos, obtuvimos
un producto de mayor peso molecular que se
amplificaba con los cebadores del MIP-lβ y se
digería con MspI. Este amplímero crecido y
secuenciado post-clonación en un vector plasmídico, se cuantifica al incluirlo en la re a c c i ó n
de RT-AFLP de las muestras. Este Estándar
Interno, nos ha permitido conocer de una manera rápida y eficaz la cantidad de transcrito producido tanto por el locus A como por el locus B
del MIP-1β.
O-75. CUANTIFICACIÓN DE LOS DOS LOCI
A Y R DE LA QUIMIOCINA MIP-1B POR
MEDIO DE LA GENERACIÓN DE UN
ESTÁNDAR INTERNO
C. Rodríguez Juana, M. Pérez Blasa, A.F. Huerta*,
A. P. Valeria, N. Aguilera*, M. J. Recio*, A. Arnaiz
Villena*, S. Ferré López**, A. Corell**, J. M. Martín
Villa*
*Inmunología. Facultad Medicina. Universidad Com plutense de Madrid. **Inmunología. Hospital 12 de Oc tubre. Madrid
P. Adreani Rizo, I. Gómez Melé, R. Colobrán Oriol,
Y. Ashhab. F. Pelusa, R. Pujol Borrell, M. Juan i
Otero.
Unidad de Inmunología. Hospital Universitari Germans
Trias i Pujol. Badalona, Barcelona
Dentro del amplio grupo de citocinas quimiotácticas, la β-quimiocina MIP-lβ, se encuentra
implicada en un gran número de funciones con
interés inmunológico; entre las cuales pudiéramos destacar el efecto quimioatrayente que ejerce sobre monocitos y linfocitos T CD4+. Por otro
lado, trabajos previos realizados en nuestro laboratorio, nos han permitido demostrar que tanto
la quimiocina MIP-lα como la MIP-lβ se encuentran incrementadas en enfermedades autoinmunes. Habiendo descrito que esta quimiocina es
codificada por 2 loci (a los cuales nos re f e r i remos como locus A y B) con ciertas diferencias en
la secuencia, nos plantearemos estudiar la expresión de estas dos variantes mediante una RTPCR. Debido a que es posible distinguir entre
ambos loci de MIP-lβ, mediante la digestión
enzimática con la enzima de restricción MspI,
hemos diseñado una técnica de RT-AFLP semicuantitativa en relación con un Estándar Interno
(de mayor peso molecular) competitivo con el
cDNA nativo, que permite evaluar la expre s i ó n
32
O-76. ANÁLISIS FENOTÍPICO
Y PRODUCCIÓN DE CITOQUINAS EN
CULTIVOS DE LA LÍNEA CACO-2:
AUMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE
RANTES Y EN LA TRANSCRIPCIÓN DE IL-2,
TRAS ESTIMULACIÓN CON IL-1β
Caco-2 es una línea tumoral de origen colónico que cuando se cultiva muestra características
fenotípicas de enterocito y puede ser un modelo
adecuado para llevar a cabo experimentos que nos
permitan estudiar su función en respuestas inmunológicas locales, y su implicación en situaciones
patológicas. Parece razonable obtener un análisis
inmunológico de la línea y comparar los datos
obtenidos con enterocitos.
Caco-2 se cultivó hasta su diferenciación y se
analizó la presencia de diferentes marcadores de
superficie, y la producción de citoquinas por PCR
y ELISA tras estimularlas con IL-1β e IL-2.
El análisis de citometría reveló la presencia de
marcadores leucocitarios presentes también en
enterocitos humanos: proteasas de superficie
(CD10, CD13 y CD26), marcadores de células presentadoras de antígeno (CD13, CD14, CD35 y
CD63) integrinas (CD18 y CD61), marcadores
epiteliales/endoteliales (CD21, CD31, CD47 y
CD59) y CD25 y CD28. No se detectó la presencia de moléculas HLA-II en células en reposo o estimuladas con γ-IFN. Además, cultivos llevados a
cabo con linfocitos alogénicos, revelaron que la
INMUNOLOGÍA
línea celular era incapaz de inducir su proliferación. El estudio de citoquinas mostró un aumento
en la síntesis de RANTES y en la trasncripción de
IL-2, tras estimulación con IL1β-. CCR1 se expresa de forma constitutiva.
O-77. ESTUDIO DE LA ESPECIFICIDAD
ANTIGÉNICA DE LOS LINFOCITOS B
GENERADOS EN FOLÍCULOS LINFOIDES
INTRATIROIDEOS
M. P. Armengol, M. Juan, C. B. Cardoso-Schmidt,
A. Lucas*, T. Gallart**, R. Pujol Borrell
Unitat d’Immunologia i *Endocrinologia. Hospital
Universitat Germans Trias i Pujol. Badalona. **Unitat
d’Immunologia Hospital Clínic de Barcelona
El papel que desempeñan los folículos linfoides (FLs) intratiroideos en la generación de células B autoreactivas en el tejido diana no se conoce bien ni la contribución relativa de éstas en la
generación de autoanticuerpos circ u l a n t e s .
Datos de nuestro laboratorio (elevada expresión
de mensaje para RAG1 y RAG2) sugieren que las
células B intratiroidales adquirirían características de respuesta dirigida por antígeno en estos
FLs por hipermutación somática y revisión del
receptor. El objetivo es analizar la especificidad
de las células B intratiroidales contra autoantígenos caracterizados (Tg, TPO, TSHR) y otro s
no descritos. La especificidad, número y tipo de
célula se ha estudiado usando antígenos biotinilados sobre secciones de tiroides de Graves y
Hashimoto. Se han observado numerosas células pequeñas con distribución similar a la de los
linfocitos B y con un marcaje de membrana y
células grandes con una intensa tinción citoplasmática distribuidas tanto en los FLs como en el
infiltrado difuso que recuerdan las células plasmáticas. La mitad de los FLs contienen hasta un
30% de células Tg+ o TPO+ mientras que algunos son negativos. La mayoría son IgG+ aunque
una pequeña pro p o rción son IgM+. Resultados
similares se han obtenido de linfocitos B intratiroidales aislados mediante citometría de flujo.
Además se han generado heterohíbridos por
fusión de linfocitos B intratiroideos con la línea
F3B6 obteniéndose 93 líneas que mantienen su
capacidad secretora de Igs y su reactividad contra Tg y TPO y 140 clones. Del cribaje por secreción de Igs (ELISA), reactividad específica de
tejido (dot-blot sobre extractos tisulares), reactividad específica de antígeno (ELISA y IFL sobre
secciones de tiroides) se han encontrado 8/30 y
14/30 clones que reconocen Tg y TPO respectivamente. Los resultados parecen indicar que en
los FLs del tiroides tiene lugar la generación de
COMUNICACIONES ORALES
células B específicas de antígenos tiroideos dirigida por antígeno, contribuyendo activamente a
la patogenia de la enfermedad.
O-78. ¿CÓMO PARTICIPAN LAS
QUIMIOCINAS EN LA FORMACIÓN DE
FOLÍCULOS LINFOIDES EN TIROIDES
AUTOINMUNES?
M. P. Armengol, M. Plana*, T. Gallart*, R. PujolBorrell, M. Juan
Unidad de Inmunología. Hospital Universitari Germans
Trias i Pujol. Badalona. *Unidad de Inmunología.
Hospital Clínic de Barcelona
La organización y mantenimiento de folículos
linfoides secundarios viene regulada, entre otros,
por un patrón de quimiocinas determinado. Para
analizar cómo las quimiocinas estructuran la respuesta autoinmune en el órgano diana, hemos
comparado mediante RT-PCR en tiempo real la
e x p resión de: S t romal cell-Derived Factor 1 a
(SDF1α o CXCL12), Secondary Lymphoid tissue
C h e m o k i n e (SLC o CCL21) y B - c e l l - a t t r a c t i n g
chemokine 1 (BCA-1 o CXCL13). Como muestras
se tomaron 2 tiroides de Hashimoto (HT), 7
G r a v e s - B a s e d o w (GD) con centros germ i n a l e s
(CGs), 4 GD sin CGs, 7 bocios multinodulare s
(MNG) y dos glándulas de donantes sanos. La
cuantificación se ha realizado tomando como
referencia el nivel de expresión de las citadas quimiocinas en amígdala palatina. Asimismo, se ha
estudiado el patrón de distribución de las tre s
quimiocinas en las glándulas mediante IFI y de
sus re c e p t o res (CXCR4 y CXCR5). Los re s u l t ados demuestran que SDF1α está presente en
todas las muestras, aunque su nivel de expresión
génica está significativamente disminuido en GD
sin CGs y en las muestras de controles. A nivel
proteico la IFI detecta SDF1α tanto en células de
CG como en algunos tirocitos. SLC está incrementado en HTs y GD con CG y ausente en algunos tejidos controles. Por su distribución se
encuentra restringida en células de endoteliales
que constituyen las HEVs polarizándose intraluminalmente. BCL se encuentra únicamente
e x p resada en HTs y GD con CGs y sigue un
patrón de distribución similar al de las células
dendríticas foliculares. CXCR4 (receptor de
SDF1) está presente en los linfocitos que rodean
los FLs mientras que está ausente en infiltrados
difusos. La mayoría de células CXCR5+ (receptor de BCA) están situadas en la zona del manto.
La expresión diferencial y la compartimentalización tisular de las quimiocinas y de sus re c e ptores sugiere la funcionalidad de los FLs intratiroidales.
33
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
SIDA
O-79. PRODUCCIÓN DE CITOQUINAS
INTRACELULARES EN PACIENTES VIH+
TRAS ESTÍMULO ANTIGÉNICO
L. Molero, A. Jiménez, P. Llorente, A. M. Jiménez,
C. Serrano, M. de Górgolas*, M. FernándezGuerrero*, R. García
Departamentos de Inmunología y *Enfermedades In fecciosas. Fundación Jiménez Díaz. Madrid
Objetivo: estudio de la producción de citocinas
intracelulares IL-2 e IFN-γ en linfocitos de pacientes VIH+ con diferentes estímulos: un estímulo inespecífico por forbol (PDBu) + ionóforo A23187, y
estímulo antígeno específico por la proteína gag de
VIH-1.
Material y métodos: 10 pacientes VIH+ (6 en
estadio C y 4 en estadio A), todos con 12 meses de
tratamiento con terapia antirretroviral de alta eficacia durante 1 año, y con cargas virales menores
de 3 log. en el momento del estudio. Se utilizaron
4 controles sanos VIH-. Se cultivaron 1 x 106 linfocitos en presencia de brefeldina A, con PDBu +
A23187 o con el antígeno gag de VIH-1 + antiCD28. Después de 4 horas las células se marcaron
con anticuerpos monoclonales anti-IL-2-FITC y
anti IFN-γ-PE y se analizan en un citómetro de flujo Epics-Elite.
Resultados: en los pacientes VIH+ el porcentaje
de linfocitos productores de IL-2 (2,7 ± 1,8%) y de
IFN-γ (2,2 ± 2,4%) bajo estímulo mitogénico es significativamente inferior al de los sujetos controles
(7,2 ± 6,1% y 6,5 ± 0,5%). No existen diferencias
entre los grupos clínicos A y C, cuando se trata de
síntesis de intracitocinas por estímulo específico
con gag-VIH (A: IL-2 1,3 ± 1,4%, IFN-γ 1,5 ± 1,4%.
Grupo C: IL-2 1,8 ± 3% y IFN-γ 1,5 ± 2,1%) ni por
estímulo forbol + ionóforo (A: IL-2 1,2 ± 1,2%, IFNγ 2 ± 0,8%. Grupo C: IL-2 3,6 ± 1,5% y IFN-γ 2,3 ±
3,2 %.
O.80. -QUIMIOCINAS Y SU RELACIÓN CON
LA RESISTENCIA A LA INFECCIÓN POR VIH
Y SU PROGRESIÓN
C. Martínez, A. Soriano, E. Palou, M. Plana, F. García,
M. J. Maleno, A. García, J. I. Aróstegui, M. Leujeune,
J. M. Miró, J. del Romero*, C. Rodríguez*, J. I.
Lorenzo**, J. M. Gatell, T. Gallart.
Institut Clínic d’Infeccions i Immunologia. IDIBAPS.
Hospital Clínic. Barcelona. *Centro Sandoval. Madrid.
**Hospital La Fe. Valencia
Antecedentes: el hecho de que las β-quimiocinas
MIP-1β, RANTES y MIP-1α inhiban la entrada de
34
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
las cepas VIH-1 NSI (R5) en las células diana al bloquear CCR5, hace pensar que desempeñen un papel
protectivo contra la infección, y la progresión de la
misma.
Objetivo: analizar los niveles plasmáticos de
dichas quimiocinas y su posible relación con la
resistencia a la infección y su progresión en los
siguientes grupos de individuos: expuestos no
infectados (ENI, n = 55), 55 individuos VHI+ no
progresores, (LTNP), 52 individuos VIH+ progresores típicos (PT), y 70 donantes sanos como (GC).
Ningún individuo era homocigoto para la delección
CCR5∆32.
Resultados: los ENI presentaban niveles plasmáticos de MIP-1β significativamente superiores
(mediana = 401,4 pg/ml) a los del GC (mediana =
97,8 pg/ml) (p <0,001), mientras que los niveles en
LTNP y PT no diferían de los del GC (p >0,05). Los
niveles de RANTES en ENI, LTNP y en PT eran inferiores (mediana = 1.398,7; 1.468,5 y 1.269,0 pg/ml,
respectivamente) a los del GC (mediana = 1601,4
pg/ml), siendo las diferencias sólo significativas
para los PT (p <0,005) y los ENI (p = 0,004). Los
individuos VIH+, particularmente los PT, presentaban niveles muy elevados de MIP-1α (medianas =
LTNP 92,5 pg/ml; PT 923,4 pg/ml) respecto al GC
y los ENI (medianas = 24,4 y 22,0 pg/ml, respectivamente)(p <0,001). No hubo diferencias significativas entre los distintos grupos respecto a la proporción de linfocitos T CD4+ que expresaban
CCR5.
Conclusiones: los datos indican que niveles elevados de MIP-1β se asocian con resistencia a la
infección, y sugieren que niveles muy aumentados
de MIP-1α podrían relacionarse con la progresión
y/o activación linfocitaria. (FIS:99/0289).
O-81. AUMENTO DE LA EXPRESIÓN
DE HLA-G EN MONOCITOS Y LINFOCITOS
DE INDIVIDUOS HIV-1+
J. M. Lozano, R. González, J. M. Kindelán, G. Dueñas,
R. Solana, R. Tarazona, I. Molina, M. Santamaría,
N. Ballesteros, E. Vidal, R. Caballos, J. Peña
Servicio de Inmunología y Unidad de Infecciosos,
Hospital Reina Sofía, Universidad de Córdoba
En algunos casos el virus HIV trata de proteger
a las células en donde se replica modificando la
expresión de moléculas de histocompatibilidad
clase I (HLA-I). Se ha publicado que el descenso de
expresión de moléculas HLA protege a las células
infectadas por HIV de las células NK y CTL. Hemos
estudiado la expresión de HLA-G en linfocitos y
monocitos de individuos HIV+. Se sabe que la molécula HLA-G tiene como función básica la de inducir tolerancia de la madre frente al feto y nuestro
objetivo ha sido ver si en la infección HIV-1, esta
INMUNOLOGÍA
COMUNICACIONES ORALES
molécula puede desempañar alguna función protectora del virus HIV frente al sistema inmune del
huésped. La expresión de HLA-G se ha medido por
doble fluorescencia utilizando anti HLA-G: MEMG/9 y 87G.
Los resultados encontrados indican que la
expresión de HLA-G aumenta en la superficie de
monocitos y linfocitos T de individuos con infección HIV-1.
La mayoría de los monocitos (92,9 ± 1,7%)
obtenidos de individuos HIV-1+ expresan HLA-G,
mientras sólo una proporción muy baja de monocitos de los individuos (14,2 ± 4,3%) sanos expresan esta molécula. Cuando los linfocitos T se estudiaron en individuos HIV-1+, encontramos que el
30% de ellos expresaban HLA-G, que en los individuos sanos sólo expresó el 1%.También estudiamos el mRNA de la molécula HLA-G en linfocitos
T y monocitos. Se presentan estos resultados y se
discute la función del aumento HLA-G en la infección HIV.
En resumen, la respuesta generada frente a la
g l i c o p roteína de la envuelta viene mediada por
la presencia de varios péptidos antigénicos, los
cuales están a su vez unidos a los dos alelos del
haplotipo H-2d analizados. Esta diversidad
excepcional de complejos péptido/MHC-I contribuiría a generar una respuesta T con una
mayor diversidad de TCR, aumentando la posibilidad de controlar la infección viral por el sistema inmune.
O-82. RESPUESTA INMUNE DE LINFOCITOS
T CITOTÓXICOS FRENTE A LA GLICOPROTEÍNA DE LA ENVUELTA DE HIV-1
Analizamos la asociación entre subpoblaciones
funcionales de linfocitos TCD4 y CD8, marcadores solubles de activación, recuento de CD4 y viremia VIH plasmática, y el riesgo de progresión a
SIDA. Realizamos un estudio prospectivo de seguimiento (media = 37 + 13 meses) de la evolución de
la infección por el VIH en una cohorte de 85
pacientes ADVP. Las subpoblaciones de linfocitos
TCD4 y CD8 se cuantificaron mediante citometría
de flujo de tres colores. La viremia VIH se determinó mediante técnica de PCR (Ultrasensitive
Amplicor HIV Test). Los marcadores solubles
incluidos fueron β-2 microglobulina, neopterina
(radioinmunoanálisis) e IgA sérica (nefelometría
cinética). Mediante análisis de regresión bivariante de Cox ajustando por cifras de CD4 encontramos que incrementos en los porcentajes de células T CD4+CD38+DR+ [riesgo relativo (RR), 3,82;
P= 0,03], CD4+CD45RO+ (RR, 4,18; P = 0,03) y
CD8+CD38+ (RR, 7,18; P= 0,01) mostraron valor
pronóstico adicional de progresión a SIDA. Tras
ajuste por viremia VIH, las subpoblaciones
CD4+CD38+DR+ (RR, 4,36; P <0,02],
CD4+CD45RO+DR+ (RR, 3,35; P = 0,04), CD8+
CD38+ (RR, 5,10; P = 0,03) y CD8+ CD45RO+
CD38+ (RR, 3,18; P = 0,02) retenían valor pronóstico significativo. Ajustando por marcadores solubles de activación encontramos que incrementos
en los porcentajes de células T CD4+CD38+DR+
y CD8+CD38+ mostraron valor pronóstico adicional de progresión a SIDA. El fuerte valor predictivo asociado a la determinación de linfocitos T
CD4+CD38+DR+ y CD8+CD38+ sugiere que estos
marcadores en combinación con el nivel de viremia VIH son útiles para identificar más precisamente el riesgo de progresión a SIDA.
D. López, Y. Samino, M. del Val Latorre
Instituto de Salud Carlos III. Madrid
La respuesta de CTL en ratones BALB/c frente a
la cepa IIIB de HIV-1 está dirigida contra un epítopo situado en el tercer dominio hipervariable de
la glicoproteína de la envuelta, el cual es presentado en asociación al alelo Dd de MHC de clase I. El
núcleo mínimo necesario para el reconocimiento
por CTL es el péptido 320-327, pero los de 9 y 10
aminoácidos son más efectivos en generar respuesta. Este epítopo es presentado por diversas
moléculas de MHC de clase I tanto murinas, como
humanas.
Se obtuvo una línea de linfocitos heterogénea
capaz de reconocer el epítopo de env cuando es
presentado por los alelos Dd y Ld de clase I. A partir de ésta, y de forma espontánea, se obtuvieron
sublíneas de CTL, cada una de las cuales reconoce
el epítopo de env en asociación a ambas moléculas de forma independiente. Estos datos indican la
existencia de dos poblaciones de CTL, cada una
de ellas con un TCR distinto, capaz de reconocer
cada uno de los alelos por separado y de forma
similar, descartándose una respuesta cruzada.
La posterior caracterización molecular del epítopo mostró la existencia de los péptidos de 9 y 10
aminoácidos asociados, ambos, a los alelos Ld y Dd
de clase I en cantidades equivalentes en la célula
infectada. Adicionalmente, se detecta la presencia
de un péptido de longitud mayor en aquellas células que poseen el alelo Ld de clase I.
O-83. LOS MARCADORES CELULARES
CD4+CD38+DR+ Y CD8+CD38+ PREDICEN
CON MAYOR PRECISIÓN LA PROGRESIÓN
A SIDA
J. Carbone, J. Gil, J. M. Benito, J. Bartolomé,
J. Navarro, M.ª A. Muñoz-Fernández, E. FernándezCruz
Servicio de Inmunología. Hospital General Univer sitario Gregorio Marañón. Madrid
35
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
O-84. INCREMENTO DE LAS RESPUESTAS T
COOPERADORA Y CITOTÓXICA FRENTE
AL VIH-1 EN PACIENTES TRATADOS CON
UNA VACUNA TERAPÉUTICA: RESULTADOS
A LOS 36 MESES
J. Navarro, M. L. Abad, L. Díaz, C. Cantó, S. Resino,
J. L. Jiménez, J.Carbone, M. A. Muñoz-Fernández,
E. Fernández-Cruz* (STIR -2102)
Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Marañón.
Madrid
Hemos analizado las respuestas inmunológicas frente al VIH-1 en 54 pacientes VIH+ incluidos un ensayo clínico de REMUNE (un inmunógeno VIH-1 sin gp120) vs IFA administrados con
antirretrovirales. Los resultados fueron analizados de forma blindada. Se observó una significativa y sostenida respuesta linfoproliferativa (LPR)
a antígenos HZ321 del VIH-1 (p <0,005) en el grupo de REMUNE. La producción de IFN-γ y B-quimiocinas se encontraba también elevada en
REMUNE. Se encontró una fuerte correlación
entre LPR a antígenos HZ321 del VIH (Subtipo A)
y LPR a p24 (r = 0,86) y al antígeno BaL (Subtipo
B) del VIH-1 (r = 0,81). Observamos en el mes 36
un incremento de los linfocitos T CD4 y CD8 de
memoria y T CD8+ efectores en REMUNE. La
citotoxicidad frente a Gag/pol se incrementó en
REMUNE (n = 13) comparado con IFA (n = 9),
tanto al cuantificar la frecuencia de precursores
como las unidades líticas (CTLp: 2,294 vs 168
cel/106 CMSP; 20,3 vs 1,9 UL /106 CMSP).
Observamos en REMUNE un incremento menos
acentuado de la citotoxicidad a env (CTLp: 744
vs 100 cel/106 CMSP; 8,6 vs 1,8 UL/106 CMSP).
Encontramos correlación entre LPR a antígenos del VIH y citotoxicidad frente a Gag/pol.
Nuestros resultados muestran que una vacuna
terapéutica puede inducir respuestas cooperadoras y citotóxicas específicas de larga duración,
además de inducir reactividad cruzada entre diferentes subtipos del VIH-1.
O-85. PAPEL DEL ÓXIDO NÍTRICO SOBRE
LA REPLICACIÓN DEL VIH-1 EN CÉLULAS T
J. L. Jiménez, S. Álvarez, J. González-Nicolás,
M. Fresno*, M. A. Muñoz-Fernández
Inmunología. Hospital Gregorio Marañón. *CBM.
Universidad Autónoma de Madrid
En cultivos de CMSP, infectadas in vitro por distintas cepas del VIH-1 y activadas con mitógenos,
la adición de donadores de óxido nítrico (NO) produjo un aumento significativo en la replicación
viral, no asociándose este efecto con cambios en
la proliferación celular. Este efecto fue observado
36
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
sólo con cepas de VIH-1 T-trópicas X4 o X4R5 pero
no con virus R5.
Por otro lado, la replicación del VIH-1 se inhibió parcialmente en cultivos estimulados con
mitógenos y tratados con inhibidores específicos
de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Los
donadores de NO, también aumentaron la infección de líneas T humanas, Jurkat y MT-2. Se observó, también que el NO produce un aumento de la
replicación del VIH-1 en células T humanas no
activadas y transfectadas con un plásmido que
codifica para el genoma entero del VIH-1 y posteriormente activadas con ésteres de phorbol más
ionóforo de calcio. Así, en estos cultivos los
donadores de NO potenciaron la replicación del
VIH-1 de forma dosis-dependiente, de modo similar a una estimulación por TNF-α#61537. Además
la replicación del VIH-1 inducía la transcripción
de iNOS y TNF-α tanto en células T como en líneas celulares T.
Es interesante destacar que los donadores de
NO también estimularon la transcripción del LTRviral mientras que inhibidores de iNOS bloquearon parcialmente la transcripción del LTR inducida por TNF-α. Por lo tanto, nuestros resultados
sugieren que el NO está implicado en la replicación del VIH-1, especialmente en la inducida por
TNF-α.
O-86. A NOVEL POLYMORPHISM IN THE
5’ UNTRANSLATED REGION (5’URT) OF
CD28 GEN IS ASSOCIATED WITH
RESISTANCE TO HIV-1 INFECTION
A. Soriano, C. Martínez, M. Plana, F. García,
J. Aróstegui, E. Palou, F. Lozano, S. Morillas, M. J.
Maleno, A. García, M. Leujeune, J. M. Miró, J. del
Romero, C. Rodríguez*, A. Barrasa*, J. I. Lorenzo**,
J. M. Gatell, T. Gallart
Institut Clínic d’Infeccions i Immunologia. IDIBAPS.
Hospital Clínic, Barcelona. *Centro Médico Sandoval.
Madrid. **Coagulopatías Congénitas. Hospital la Fe.
Valencia
Background: CD28 plays an important role in
determining the T-cell immune responses and is
also specifically involved in down-regulating the
expression of CCR5, the main co-receptor of HIV1 NSI (R5) strains, which transmit the infection.
Objective: to investigate the existence of genetic variants of CD28 that might be related to resistance/susceptibility to HIV infection and/or progression to AIDS.
Material and methods: PCR-amplified 559bp 5’end of CD28 5’UTR was analysed by Single-Strand
Conformation-Polymorphism (SSCP) as a screening
method in 296 individuals: 77 healthy controls
(HC), 57 uninfected highly exposed to HIV-1
INMUNOLOGÍA
COMUNICACIONES ORALES
(EU), and 160 HIV-1+ patients: 82 long-term non
progressors (LTNP) and 78 typical progressors
(TP). Sequencing was also performed.
Results: two main SSCP patterns, designated a
and b were identified. The pattern a corresponds
to a homozygous state of the wild type (wt) allele
(GenBank sequence). The pattern b corresponds
to a heterozygous combination of the wt allele with
a new allele resulting from a 5bp repeat (CTTTT)
deletion at the 5’ end region. There were no differences in the frequency of pattern b between HC
(31%), LTNP (24%) and TP (28.5%), while it was
significantly decreased (p <0.05) in EU (13.5%).
Conclusion: data demonstrate the existence of a
non previously reported genetic variant of CD28
consisting of a 5bp repeat deletion at the 5’ end of
5’UTR, which is associated with resistance to HIV1 infection. The functional consequences of this
deletion need further investigations (Supported
by Grant FIS: 99/0289).
tas (IO) (p <0,001), así como en los ENI por vía
sexual (p <0,001), mientras que en los PT con IO
dichos niveles no diferían del GC. Los niveles de
SDF1 en los homocigotos eran inferiores a los de
los heterocigotos y no mutados (p = 0,04). Los
niveles de SDF-1 plasmáticos se relacionaban
inversamente con la expresión de CXCR4 en linfocitos T CD4+ y CD8+.
Conclusiones: la homocigocia SDF1-3’A se relaciona con niveles plasmáticos bajos de SDF-1 y no
se asocia con progresión lenta a SIDA, y la heterocigocia tampoco se asocia con resistencia a la
infección. Niveles altos de SDF-1 plasmático se
asocian con resistencia a la infección por vía sexual
y pueden proteger frente a la progresión (FIS:
99/0289).
O-87. POLIMORFISMO SDF1-3’A Y NIVELES
PLASMÁTICOS DE SDF-1 Y RESISTENCIA A
LA INFECCIÓN POR VIH Y SU PROGRESIÓN
O-88. NITRIC OXIDE-PRODUCING CD11B +
LY-6G (GR-1) + CD31 (ER-MP12) + CELLS IN
THE SPLEEN OF CYCLOPHOSPHAMIDETREATED MICE
C. Martínez, A. Soriano, E. Palou, M. Plana, F. García,
M. J. Maleno, A. García, J. I. Aróstegui, M. Leujeune,
J. M. Miró, J. del Romero*, C. Rodríguez*, A. Barrasa*,
J. I. Lorenzo**, J. M. Gatell, T Gallart
Institut Clínic d’Infeccions i Immunología. IDIBAPS.
Hospital Clinic. Barcelona. *Centro Sandoval. Madrid.
**Hospital La Fe. Valencia
Antecedentes: en población americana (USA), la
heterocigocia del polimorfismo SDF1-3’A se halló
incrementada en homosexuales expuestos no
infectados, sugiriéndose un efecto protectivo contra la infección, mientras que la homocigocia se
encontró asociada con progresión lenta en VIH+,
creyéndose que tal vez implicara una mayor producción de SDF1 que bloqueara la infección por
cepas X4.
Objetivos: analizar la frecuencia de la mutación
SDF1-3’A y su posible relación con los niveles plasmáticos de SDF-1 en una cohorte de expuestos no
infectados (ENI, n = 66; 31 por vía sexual; 35 por
hemoderivados) en comparación con un grupo de
controles (GC,n = 90) y con pacientes infectados
no progresores (LTNP, n = 67) y progresores típicos (PT, n = 57). Ningún individuo era homocigoto para CCR5∆32.
Resultados: la frecuencia de homocigotos fue
6,8% en GC, 2,4% en LTNP, 9% en PT y 6,4% en
ENI, y la de heterocigotos estaba incrementada
(p = 0,05) en los pacientes VIH+ (51,3%) y disminuida (p = 0,05) en los ENI (24,1%) respecto al GC
(37,5%). Los niveles de SDF-1 estaban incrementados en LTNP y en PT sin infecciones oportunis-
TRASPLANTES
I. Ángulo Barturen, M. A. Muñoz-Fernández*,
M. Fresno
Centro de Biología Molecular, CSIC-UAM, *Inmuno logía. Hospital Gregorio Marañon. Madrid
During recovery from intensive chemotherapy
with cyclophosphamide (CTX), mice suffer a severe but transitory impairment in spleen cell (SC)
proliferation to T cell mitogens (Con A or antiCD3 plus IL-2). Although CTX treatment reduced
spleen T cell cellularity this cannot fully account
for T cell unresponsiveness. The results showed
that CTX induces the colonization of spleen by an
immature myeloid CD11b+Ly-6G+CD31+ population. Its presence closely correlated with the
maximum inhibition of proliferation of T cells.
Moreover, this suppressive activity was dependent
on NO production in cultures since: a) higher
amounts of nitric oxide (NO) and inducible nitric
oxide synthase (iNOS) mRNA were produced in
CTX-SC than in control splenocyte cultures (SC),
and b) NOS inhibitors greatly improved the proliferation of T lymphocytes. NO production and
suppressive activity were also dependent on endogenous IFN-g production since anti-IFN-γ abrogated both effects. Finally, iNOS protein expression was restricted to a heterogeneous population
of CD31+ cells of which CD11b+Ly-6G+ were
required to suppress T cell proliferation. These
results indicated that CTX might also cause immunosuppression by a mechanism involving the presence of immature myeloid cells with suppressor
37
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
activity. This may have implications in clinical praxis since inappropriate immunotherapies in
patients treated with intensive chemotherapy
could lead to deleterious T cell responses.
Conclusión: la expresión del mismo MHC a nivel
periférico que aquel donde las células T han sido
seleccionadas no juega un papel crítico en la supervivencia a largo plazo de las células T CD4.
O-89. CÉLULAS T CD4 MURINAS
SE DIFERENCIAN EN UN XENOINJERTO
DE TIMO PORCINO Y SOBREVIVEN EN LA
PERIFERIA EN PRESENCIA DE UN
COMPLEJO DE HISTOCOMPATIBILIDAD
DISTINTO
O-90. MODULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE
RECEPTORES DE MONOCITOS/
MACRÓFAGOS PORCINOS INDUCIDA POR
CITOCINAS
J. I. Rodríguez-Barbosa, Y. Zhao, G. Zhao, S. Wang,
D. H. Sachs, M. Sykes
Bone Marrow Transplantation Section. Transplantation
Biology Research Center. Massachusetts General
Hospital/Harvard Medical School. Boston
Propósito: nuestro laboratorio ha demostrado
que el injerto de timo fetal porcino (FPTHY) en
ratones inmunocompetentes tratados con un régimen no mieloablativo de acondicionamiento, permite inducir tolerancia a xenoinjertos. Numerosos
grupos han postulado recientemente que las células T seleccionadas positivamente en un MHC,
necesitan interaccionar con el mismo MHC en la
periferia para poder sobrevivir. El objetivo de
nuestro trabajo fue estudiar la supervivencia periférica de células T CD4 murinas seleccionadas en
un MHC xenogénico y compararla con células T
CD4 seleccionadas en un MHC singénico.
Métodos: se realizaron injertos de FPTHY y
NMTHY debajo de la cápsula renal de ratones B6
de clase II WT (cepa salvaje) y de clase II KO (knockout). A las 13 semanas después del trasplante, una
vez que se observaba la reconstitución del compartimento de células T en la periferia, se eliminó
el riñón que contenía el injerto tímico en la mitad
de los ratones de cada grupo y la otra mitad se dejó
sin nefrectomizar como controles del experimento. Periódicamente después de la nefrectomía y
durante 15 semanas, los ratones se sangraron para
estudiar la cinética de decaimiento del %CD4+
PBL (linfocitos de sangre periférica) y de células
T CD4 naive.
Resultados: ratones de clase II WT y de clase II KO
injertados con FPTHY o NMTHY reconstituían el
compartimento de células T CD4 en la periferia con
una eficiencia similar. Solamente a las 15 semanas
después de la nefrectomia fue posible detectar un
incremento estadísticamente significativo de la cinética de decaimiento de células T CD4 en ratones
nefrectomizados de clase II KO con respecto a los
ratones de clase II WT controles (p <0,05). Sin
embargo, el decaimiento del % CD4+ PBL y células
T CD4 naive (CD4+ CD 44low) después de la nefrectomía era gradual y similar en ratones de clases II
WT injertados con FPTHY o NMTHY.
38
B. Álvarez, S. Chamorro, C. Revilla M. P. RodríguezCarreño, F. Alonso, A. Ezquerra, J. Domínguez
Departamento de Mejora Genética y Biotecnología.
INIA. Madrid
Los macrófagos muestran una gran heterogeneidad en morfología y fenotipo. Las citocinas junto
con otros factores tisulares locales contribuyen en
gran parte a generar esta heterogeneidad. El objetivo de este estudio ha sido analizar en el modelo porcino el efecto de diversas citocinas sobre la expresión
de CD163, SWC9 y otros receptores reconocidos por
los Acmo BA4B12, BA1H1, BA1H8 y BA2H8, con
expresión restringida a células del sistema mononuclear-fagocítico. La expresión de CD163 y SWC9,
marcadores previamente asociados con un fenotipo
maduro, se incrementó tras el tratamiento de los
monocitos con IL-10 recombinante porcina (rpIL10), y cuando se añadió suero de cerdo al medio de
cultivo. Ambos tratamientos también indujeron un
aumento de la expresión de los antígenos BA1H1,
BA1H8 y BA2H8, mientras que disminuyeron la del
BA4B12. En los monocitos tratados con rpIL-4,
rpIFN-α y rpIFN-γ se observó una reducción de la
expresión de CD163. La rp IL-4 y el rpIFN-α también ejercieron un efecto negativo sobre la expresión
de BA1H1 y BA4B12 respectivamente; en cambio
ambas citocinas aumentaron la expresión de BA1H8.
No se observó ningún efecto del TNF-α sobre la
expresión de estos marcadores. Los resultados obtenidos reflejan la regulación de la expresión de los
receptores analizados por señales derivadas de
mediadores pro- y anti-inflamatorios.
O-91. LA XENORREACTIVIDAD
DE CÉLULAS T GAMMADELTA ESTÁ
MEDIADA POR LA RUTA DE LA
PERFORINA/GRANZIMA B
J. Yélamos López, M. Rodríguez-Gago, A. de
Heredia, P. Ramírez, P. Parrilla, P. Aparicio, J.
Yélamos
Unidad de Trasplante. Hospital Universitario Virgen de
la Arrixaca. Murcia
Introducción: el papel jugado por los linfocitos T
gammadelta en la respuesta inmune es aún poco
INMUNOLOGÍA
claro aunque parecen estar implicados en la primera línea de defensa junto con otras células del
sistema inmune innato como macrófagos y células NK. La respuesta celular innata juega un papel
muy importante en el rechazo de xenoinjertos.
Objetivo: estudiar la respuesta de linfocitos T
gammadelta humanos frente a células endoteliales porcinas.
Métodos: se ha estudiado la xenorreactividad de
clones gammadelta humanos, obtenidos de diferentes fuentes (sangre periférica, bazo, cordón
umbilical y timo), frente a células endoteliales porcinas utilizando la técnica clásica de liberación de
Cr-51 en presencia y ausencia de anticuerpos bloqueantes de diferentes moléculas.
Resultados: 38,9% de los clones gammadelta utilizados fueron citotóxicos frente a las células porcinas. Esta respuesta citotóxica se bloqueó significativamente con OKT3. La incubación de los clones con
concanamicina A, un inhibidor de la ruta perforina/granzima B, inhibió la actividad lítica de los clones gammadelta frente a endotelio porcino. Sin
embargo, esta inhibición no se observó trás la incubación con anticuerpos anti-TNF alfa y anti-FasL.
Conclusión: la actividad lítica de células T/ gammadelta frente a células porcinas probablemente
ocurre a través de la ruta de la perforina/granzima
B y puede representar un importante obstáculo
para el xenotrasplante.
O-92. ACTIVACIÓN DEL ENDOTELIO
EN EL XENOTRASPLANTE DE CERDOS
TRANSGÉNICOS PARA hDAF EN BABUINOS
EN AUSENCIA DE ANTICUERPOS ANTI-GAL
N. Doménech, C. Ruiz de Valbuena, T. Díez,
A. Centeno, E. López-Peláez, R. Mañez
Unidad de Investigación. Complejo Hospitalario Juan
Canalejo. ACoruña
Introducción: la supresión de los xenoanticuerpos que reconocen mayoritariamente el antígeno
Gal1-3Gal(Gal) permite prolongar significativamente la supervivencia de los xenoinjertos porcinos trasplantados en babuino y prevenir el rechazo vascular agudo, pero no evita totalmente el
depósito de xenoanticuerpos.
Métodos: seis babuinos recibieron un xenotrasplante de corazón heterotópico de cerdo transgénico hDAF y fueron tratados con una polilisina que
lleva unido Gal (GAS 914) e inmunosupresión. En
muestras del xenoinjerto obtenidas antes de la
reperfusión y en el momento del fracaso del injerto o muerte del animal, se analizó mediante inmunohistoquímica la expresión de marcadores de
células endoteliales activadas. También se determinaron los niveles de xenoanticuerpos totales
por citometría de flujo.
COMUNICACIONES ORALES
Resultados: a pesar de la depleción de anticuerpos anti-Gal en el suero se detectó la presencia significativa de xenoanticuerpos frente a linfocitos
porcinos que puede explicar el depósito de IgM
detectado en los xenoinjertos. En el momento del
fracaso del injerto o muerte del animal se detectó
la expresión de antígenos asociados con una activación del endotelio como CD62 y CD106, y especialmente el 5A6/8.
Conclusión: el depósito de xenoanticuerpos noGal en el xenoinjerto porcino se asocia con una activación del endotelio, que aunque no causa un rechazo vascular agudo, puede actuar de forma negativa
en la supervivencia del injerto a largo plazo.
O-93. GAS 914, UNA POLILISINA QUE
CONTIENE GAL, PREVIENE EL RECHAZO
VASCULAR AGUDO EN EL
XENOTRASPLANTE HETEROTÓPICO DE
CORAZÓN DE CERDOS TRANSGÉNICOS
HDAF EN BABUINOS
N. Doménech, C. Ruiz de Valbuena, A. Juffe,
A. Centeno, E. López-Peláez, R. Mañez
Unidad de Investigación. Complejo Hospitalario Juan
Canalejo. ACoruña
Introducción: el rechazo vascular agudo (RVA) es
la causa más importante de fracaso en el xenotrasplante de órganos de cerdos transgénicos hDAF en
primates no-humanos. En el presente estudio se
investiga la eficacia de GAS 914, una molécula de
polilisina que contiene residuos de GAL en la prevención del rechazo vascular agudo producido en
estos trasplantes.
Métodos: 19 babuinos fueron sometidos a un
xenotrasplante heterotópico con órganos de cerdos
transgénicos para hDAF. Trece de éstos (grupo A)
recibieron un protocolo de inmunosupresión que
incluye 4 dosis-perioperatorias de ciclofosfamida,
Neoral, ERL micofenolato sódico y esteriodes. Los
otros seis babuinos (grupo B) recibieron la misma
inmunosupresión y GAS 914 i.v o s.c.
Resultados: 4 xenotrasplantes del grupo A sufrieron rechazo hiperagudo, mientras que ese tipo de
rechazo no se dio en el grupo B. Excluyendo los
casos de rechazo hiperagudo, todos los xenotrasplantes del grupo A fracasaron debido a RVA con
la excepción de dos animales que murieron por
fallo renal. En el grupo B ningún injerto fallo por
RVA, observándose únicamente mínimos depósitos de IgM y fibrina en los injertos en el momento
del fracaso del mismo o fallecimiento del animal
por diversas causas.
Conclusión: el tratamiento con GAS 914 por 17
días antes y de forma continuada después del trasplante, previene el rechazo hiperagudo y RVA de
los xenotrasplantes porcinos hDAF en babuinos.
39
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
O-94. ANÁLISIS DE LOS LINFOCITOS
INTRAEPITELIALES INTESTINALES (i-LIE)
COMO MARCADOR DE EVOLUCIÓN DEL
TRASPLANTE (Tx) DE INTESTINO CLÍNICOEXPERIMENTAL
P. Eiras, Y. Quijano, C. Correa, G. Roy, F. León,
C. Redondo, A. Bootello, E de Vicente
Inmunología y Unidad Tx Hepato-Intestinal. Hospital
Ramón y Cajal. Madrid
En 1995 comenzamos una línea experimental de
trasplante intestinal con vistas a la realización,
recientemente alcanzada, de Tx intestinales aislados y combinados hepatointestinales por primera
vez en España. Su objetivo era avanzar en el conocimiento de los mecanismos inmunológicos implicados en el eventual rechazo o aceptación del injerto.
Material y métodos: Tx alogénico ortotópico, funcionalizado y bidireccional entre dos cepas de rata
(DA/Lw) (n = 74), pauta corta de inmunosupresión (FK-506, 1 mg/kg 14 días). Análisis morfológico y por citometría de flujo de los injertos tras
muerte o sacrificio.
Resultados: 5 ratas (todas DA con injerto Lw)
alcanzaron supervivencia indefinida (>1 año).
Estos 5 injertos mostraron, como única característica distintiva, un importante aumento en el
número de i-LIE sin signos morfológicos de rechazo crónico. El análisis fenotípico de los mismos
demostró que la gran mayoría de ellos resultaban
ser la población NK-Like recientemente caracterizada en humanos, que desaparece en enfermos
celícos y que muestra una estrecha similitud fenotípica con otra población NK-Like descrita en la
decidua humana y posiblemente implicada en la
tolerancia materno-fetal (u-NK).
Conclusión: con independencia de la posible
implicación funcional de esta población de i-LIE
en el establecimiento del aparente estado de tolerancia alogénica, consideramos que la determinación fenotípica de los i-LIE tiene un probable valor
como marcador evolutivo del Tx de intestino clínico-experimental
O-95. ACTIVIDAD CALCINEURINA
Y PRODUCCIÓN IN VITRO DE IL-2 E IFN
COMO PARÁMETROS FARMACODINÁMICOS
EN EL TRATAMIENTO CON CsA
O. Millán, M. Brunet, J. M. Campistol, I. Rojo,
E. Vidal, O. Jiménez, P. J. Iñigo, J. Corbella,
F. Oppenheimer, J. Martorell
Institut Clinic Infeccions i Immunologia (ICII), Servei
Toxicologia i Unitat de Trasplantament Renal. Hospital
Clinic, IDIBAPS. UB Barcelona
Objetivo: encontrar parámetros farmacodinámicos que proporcionen información adicional
sobre la monitorización de inmunosupresores,
40
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
con el fin de valorar la variabilidad individual en
el efecto biológico.
Métodos: hemos estudiado: a) actividad calcineurina en linfocitos (aCN); b) producción in vitro
de IL-2 e IFNγ; en sangre total activada con PHA,
y c) niveles de CsA y de MPA. Todas las determinaciones se realizaron a 0 y 2 horas post-dosis en
trasplantados renales estables tratados con CsA o
MMF (12 + 10) y en 10 individuos sanos (NHC).
La aCN se midió utilizando un péptido marcado
con 32P, introduciendo la fosfatasa alcalina como
valor interno de referencia. La producción de IL-2
e IFNγ en sangre total se determinó por ELISA.
Resultados: en el grupo de CsA la aCN estaba claramente reducida a 0 y 2 horas, en relación con el
grupo de MMF y el NHC (p <0,001); la producción de IL-2 e IFNγ estaba reducida en el grupo de
CsA en comparación con el NHC a 2 horas
(p=0,017 & p=0,009) a pesar que no se han encontrado diferencias con el grupo de MMF. En el grupo de MMF la IL-2 estaba ligeramente reducida a
las 2 horas (p=0,052) en comparación con el NHC.
En el grupo de CsA se ha encontrado una correlación significativa entre: a) los niveles de CsA a 2
horas y la producción de IFNγ; (p=0,037); b) aCN
a 2 horas y producción de IL-2 tanto a 0 como 2
horas (p=0,022 & p=0,020); y c) IL-2 e IFNγ; a 2
horas (p = 0,033). No se encontró correlación de
estos parámetros en el grupo de MMF.
Conclusiones: a) la capacidad predictiva de los
niveles de CsA a 2 horas es mejos que a 0 horas; b)
aCN a 2 horas correlaciona mejor con la producción
de IL-2 que con la de IFNγ; c) pacientes con valores
extremos para estos parámetros pueden ser de interés para identificar la variabilidad interindividual.
O-96. RESPUESTAS ALOGÉNICAS EN
TRASPLANTES RENALES: COMPARACIÓN
DE LAS VÍAS DIRECTA E INDIRECTA EN EL
RECHAZO CRÓNICO
M. P. Hernández-Fuentes, R. J. Baker, W. F. Ng, P. A.
Brookes, A. N. Chaudhry, R. I. Lechler
Departamento de Inmunología. ICSM. Hammersmith
Hospital. Londres, Reino Unido
Antecedentes: el rechazo crónico es una de las
causas más importantes de pérdida de trasplantes
en la clínica. Es importante verificar qué vía de
activación están utilizando los linfocitos T CD4 +
para originar rechazo crónico.
Objetivos: este estudio pretende comparar respuestas efectoras consecuencia de activación alogénica tanto por la vía directa como por la indirecta en un grupo de pacientes receptores de un
trasplante renal de larga evolución.
Métodos: hemos estudiado respuestas de linfocitos T CD4+ a aloantígenos de los donantes presentados por la vía directa (frecuencias de precur-
INMUNOLOGÍA
sores secretores de citocinas o proliferantes) y por
la vía indirecta (PBMCs estimulados con proteínas de membrana de células de donantes).
Pacientes: 22 recipientes de un trasplante renal
de larga evolución cuyo donante es un familiar
vivo (9 con rechazo crónico -CAN-; los 13 restantes con buena función del trasplante).
Resultados: hemos encontrado hipo-respuestas
donante-específicas por la vía directa de una forma generalizada en ambos grupos de pacientes
(22/22 para producción de IL-2 y 17/22 para proliferación). No hemos encontrado evidencia de
polarización Th1 o Th2 en estas respuestas. La
mediana de las frecuencias anti-donante por vía
indirecta era mayor en el grupo de pacientes que
presentaba rechazo crónico que en el grupo con
buen funcionamiento (p <0,05).
Conclusión: estos datos sugieren que las respuestas anti-donante por vía directa están específicamente inhibidas en los trasplantes renales de larga evolución. La vía indirecta sería la principal
responsable de la activación inmune asociada al
rechazo crónico.
COMUNICACIONES ORALES
MO y biopsia ganglionar, observándose una infiltración T de idéntico fenotipo y la práctica ausencia de
linfocitos B en todas estas localizaciones junto a una
hematopoyesis conservada. El postoperatorio se
complica con una neumonía nosocomial y reaparición de la bicitopenia tras una recuperación breve y
transitoria. Se observa además hepatomegalia e infiltración nodular de ambas parótidas, riñones, colon
ascendente y transverso y adenopatías en retroperitoneo y cadena yugular que impresionan de granulomas. Hasta la fecha la paciente ha sufrido reiterados ingresos por complicaciones infecciosas y fiebre
(con cultivos persistentemente negativos), linfocitosis, neutropenia y trombopenia. Desde hace 2
meses se administran 30 mg/d de prednisona para
control de la bicitopenia. En la última quincena, pese
a un recuento normal de CD4, la paciente desarrolla neumonía intersticial por pneumocystis carinii.
Estos datos sugieren una forma granulomatosa
(Grupo B) de IDVC, relacionada con hiperactivación del sistema TNF-TNF-R. Nos planteamos el
posible beneficio de otras opciones terapéuticas
alternativas a los esteroides (AcMo anti-TNF,
Metotrexate,...).
INMUNODEFICIENCIAS
O-97. INMUNODEFICIENCIA VARIABLE
COMÚN, EXPANSIÓN DE LINFOCITOS
GRANDES GRANULARES, BICITOPENIA
RECURRENTE Y NEUMONÍA POR P. CARINII
I. Salcedo, J. Chamorro, A. Macías, J. A. Brieva,
A. Sampalo
Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Puerta
del Mar. Cádiz
Presentamos un caso de evolución tórpida agresiva y atípica de IDVC, que además de su propio
interés descriptivo, invita a una reflexión sobre la
heterogeneidad de manifestaciones clínicas e
inmunológicas de una entidad que empieza a ser
considerada más como un conjunto de síndromes
agrupables en categorías que como una única
enfermedad (Immunol Today 1997; 18: 325).
Mujer de 26 años, diagnosticada en 1997 de IDVC
por infecciones otosinusales de repetición, IgG <250
mg/dl, linfopenia B, baja respuesta proliferativa T y
escasa producción de Igs en cultivo. Destacamos
como antecedentes una mononucleosis infecciosa
de curso severo un año antes, y dos hermanos (v y
h) con déficit de IgA. Durante 4 años se observa una
respuesta favorable a tratamiento sustitutivo con Igs
IV. En junio del 2000 requiere un primer ingreso por
fiebre elevada, neutropenia (150/mmc) y trombopenia (11.000/mmc) severas, y gran esplenomegalia; detectándose en SP una proliferación policlonal
de LGGs CD3+ CD8+ CD57+ DR+ (70%;
>7.000/mmc). Se realiza esplenectomía, punción de
O-98. UN CASO DE INMUNODEFICIENCIA T
PROBABLEMENTE PRIMARIA
DE APARICIÓN EN LA EDAD ADULTA
R. Pena, F. León, C. Cámara, J. A. García,
L. Sánchez, A. Bootello, J. L. Castañer
Servicio de Inmunología. Hospital Ramón y Cajal.
Madrid
El diagnóstico y manejo de las inmunodeficiencias primarias (IDP) combinadas en adultos es
complejo, tanto por su escasa frecuencia como por
la imposibilidad de establecer su etiología en
muchos casos. Presentamos el caso de una mujer
de 24 años, que debuta con neumonía por oportunistas y linfopenia severa. Descartadas causas
secundarias se plantea la posibilidad de una IDP.
La paciente carece de antecedentes clínicos de
interés salvo adenopatía 6 meses antes (diagnóstico PAAF: linfadenitis inespecífica). Presenta historia familiar de autoinmunidad en varias mujeres de la rama materna. El inmunofenotipo de SP
mostró linfopenia (300 linfocitos/µl), a expensas
de la población T (CD3 17%), una población CD3+
CD4-CD8- que representa el 75% de las células T
y cociente CD4/CD8 invertido. No hubo respuesta funcional a CD3, pero sí a mitógenos. Tanto la
madre como una de las hermanas presentaban
fenotipo y funcionalidad similares, aunque mucho
menos severos. PNP, ADA, JAK-3 y cadena γc de
IL-R normales. Durante dos años persistió intensa linfopenia con normalización paulatina de la
población DN, desarrollando entonces un linfoma anaplásico CD30+ por VEB. Tras tratamiento
41
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
del tumor con quimioterapia y TMO de una hermana sana, la paciente recuperó rápidamente
poblaciones linfocitarias hasta niveles actualmente normales. Este caso de probable IDP combinada T-B+NK+ de etiología no aclarada ilustra la
necesidad de no descartar la presencia de una IDP
en adultos con patología compatible y en los que
no se halla una etiología secundaria.
O-99. DEFICIENCIA DE FACTOR I CON
EPISODIOS DE MENINGITIS RECURRENTE
ASOCIADOS CON LA MENSTRUACIÓN
C. González-Rubio, A. Ferreira-Cerdán, J. Arpa,
G. Fontán, M. López-Trascasa
Servicio de Inmunología. Hospital Universitario La Paz.
Madrid
Antecedentes: la deficiencia total del inhibidor
de la vía alternativa del complemento, el factor I,
se asocia frecuentemente con infecciones piógenas recurrentes así como con una mayor incidencia de glomerulonefritis y fenómenos lupus-like.
Presentamos una paciente de 23 años que desarrolló a los 16 años una sepsis meningocócica coincidente con la menstruación. Desde agosto de 1999
comienza a tener episodios recurrentes de meningitis perimenstruales que se resuelven con tratamiento antibiótico. En su familia se documenta la
muerte de un hermano por meningitis.
Objetivos: diagnosticar y estudiar inmunoquímicamente a la paciente y a su familia antes y
durante el tratamiento.
Resultados: el estudio inmunológico de la paciente muestra unos niveles bajos persistentes de C3,
además de niveles disminuidos de factor B, factor H
y properdina. El factor I era indetectable por ELISA
y Western-Blot. El resto del estudio únicamente
mostró títulos elevados de inmunocomplejos y un
aumento policlonal de IgM. Además, se detectaron
en suero niveles aumentados de complejos C3b/FH,
C3b/P, C3b/IgG y P/IgG. El patrón analítico de los
LCR en los episodios era de carácter infeccioso, aunque no siempre se pudo detectar Neisseria meningitidis mediante PCR. El tratamiento profiláctico con
antibióticos, anti-estrógenos, rifampicina, infusiones de plasma fresco ó gammaglobulina intravenosa no han podido eliminar los episodios mensuales
de meningitis. En función de las concentraciones de
FI en su familia, la herencia es compatible con un
patrón autosómico recesivo (padres y un hermano
con ~50% de los niveles, y una hermana con ~3% de
los niveles).
Conclusiones: describimos la primera familia
española con deficiencia de factor I. Además de la
paciente, esta familia presenta padres sanos heterozigotos y dos hermanos sanos (un heterozigoto
y una homozigota). Actualmente hemos iniciado
el estudio molecular del gen del factor I.
42
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
O-100. IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES
EN EL SÍNDROME DE HIPER IgM LIGADO
AL X (HIMX)
E. López Granados, R. Cambronero, A. Ferreira,
G. Fontán, M. C. García Rodríguez
Unidad de Inmunología. Hospital La Paz. Madrid
Introducción: el síndrome de HIMX es una
inmunodeficiencia primaria causada por defectos
en el gen del CD40L. Para el diagnóstico definitivo de la enfermedad es imprescindible la identificación de la mutación responsable, ya que pacientes con Inmunodeficiencia Variable Común (IDVC)
pueden presentar anomalías en la expresión de
esta proteína detectadas por citometría de flujo.
Materiales y métodos: estudiamos en dos familias
(A y B), a tres varones afectos y a las posibles portadoras. En una familia (C), con antecedentes de tres
varones fallecidos con sospecha de HIMX, estudiamos a la madre como posible portadora obligada y a
una hermana que solicitó consejo genético.
Analizamos el gen mediante PCR y secuenciación
automática. En la familia A confirmamos la repercusión a nivel de ADNc mediante RT-PCR.
Resultados: en la familia A identificamos una
mutación puntual en la posición +5 de la región
donadora de “splicing” del intrón 3 que afecta al
procesamiento de parte del ARNm perdiendo el
exón 3. La familia B presentaba una mutación
“missense” en el dominio extracelular de la proteína. En la familia C las dos mujeres estudiadas eran
portadoras de una deleción de 14 bases que condicionaría la síntesis de una proteína truncada en
el dominio extracelular.
Conclusiones: el estudio del gen del CD40L permite confirmar el diagnóstico de HIMX en las familias estudiadas. El tipo y localización de las mutaciones encontradas, permiten la expresión de
productos proteicos no funcionales en membrana
justificando, en cada caso, las imágenes obtenidas
mediante citometría de flujo en pacientes y portadoras de la enfermedad.
O-101. ESTUDIO GENÉTICO
E INMUNOLÓGICO EN INCONTINENCIA
PIGMENTI
N. Martínez, J. Pons, J. Ferrer, D. Heine*,
A. Etxagibel, A. Martín**, N. Matamoros
Servicio de Inmunología, Servicio de Genética*, Servicio
de Dermatología**. Hospital Son Dureta. Palma de
Mallorca
La incontinencia pigmenti (IP) es un trastorno
genético dermatológico dominante ligado a X,
generalmente letal en varones durante periodo prenatal. Produce alteraciones a distintos niveles: piel,
pelo, uñas, dientes, ojos y sistema nervioso central.
Varios de los casos padecen infecciones recurrentes
INMUNOLOGÍA
y/o alteraciones en la quimiotaxis de los neutrófilos. La proteína moduladora IKK; (NEMO) es necesaria para la activación del factor de transcripción
NF-B, fundamental en numerosos procesos biológicos. Mutaciones en el locus del gen IKKg producen la mayoría de casos de IP, siendo el 80% de ellos
por reordenamiento genómico incorrecto.
Mediante técnica de PCR y primers específicos del
exón 3 y de una secuencia 3 del exón 10, se amplifica la secuencia del gen NEMO.
Se determinan poblaciones linfocitarias, inmunoglobulinas séricas, y respuesta proliferativa a
distintos estímulos. En controles y pacientes se
amplifica una región de 13 Kb del gen NEMO. En
algunos pacientes se amplifica además una secuencia de 2 Kb que corresponde a la deleción de los
exones 4-10. Una de las pacientes padece infecciones recurrentes graves asociadas a disgammaglobulinemia; la población CD3+CD8+ permanece
de forma constante en el límite inferior de la normalidad. Los resultados demuestran una delección
de los exones 4-10 del gen NEMO como la mutación más representativa en las familias estudiada,
tal y como se había descrito en el Consorcio de IP
de mayo de 2000. Se describe la relación genotipo/fenotipo de estos pacientes.
COMUNICACIONES ORALES
descritas deberían ser consideradas como causantes de enfermedad, sin realizar un estudio poblacional en individuos sanos, ya que pueden tratarse de polimorfismos. También, se describe otra
mutación (857A>G) como causante de PLS en una
familia española de Madrid, dicho cambio ya se
había identificado en otros trabajos como el causante del síndrome Haim-Munk (HMS, variante
alélica del síndrome Papillon-Lefévre) en judíos
de la India.
Por otra parte, se ha visto como los pacientes
PLS mejoran empleando un tratamiento basado en
retinoides (vitamina A), lo cual podría explicarse
por la existencia de elementos de respuesta a ácido retinóico en la región promotora del gen de la
catepsina C.
O-103. ESTUDIO PRELIMINAR DE
FOSFORILACIÓN TOTAL EN LINFOCITOS
T CD4+ TRANSFORMADOS CON
HERPESVIRUS SAIMIRI DE PACIENTES
CON INMUNODEFICIENCIA COMÚN
VARIABLE (CVID)
J. A. Cabanillas, A. Pacheco, J. R. Regueiro
Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina.
Universidad Complutense. Madrid
O-102. IDENTIFICACIÓN DEL PRIMER
PACIENTE HETEROZIGOTO COMPUESTO
PARA EL SÍNDROME PAPILLON-LEFÈVRE Y
DE UNA NUEVA MUTACIÓN ASINTOMÁTICA
EN EL GEN DE LA CATEPSINA C
L. M. Allende, M. A. García-Pérez, A. Moreno,
A. Corell, M. Carasol*, P. Martínez-Canut**,
S. Ferre, A. Sotoca, M. A. Díaz-Espada, A. ArnaizVillena
Departamento de Inmunología y Biología Molecular.
Hospital 12 de Octubre. *Departamento de Odontología.
Universidad Complutense. Madrid. **Departamento de
Odontología. Universidad de Valencia
Recientemente se ha publicado que el gen de la
catepsina C es el responsable del síndrome
Papillon-Lefèvre (PLS), el cual se caracteriza por
provocar keratosis palmoplantar asociada a una
agresiva periodontitis donde en la mayoría de los
casos se complica con distintos tipos de infecciones bacterianas. Hasta el momento, se han identificado trece mutaciones homozigotas en el gen
de la catepsina C en pacientes PLS de distinto origen étnico. En el presente estudio, se describe el
primer paciente heterozigoto compuesto para el
síndrome Papillon-Lefèvre (706G > T y 872G > A,
mutación materna y paterna respectivamente).
Además, se describe la primera mutación asintómática (458C > T) en homozigosis en tres individuos sanos. Por tanto, no todas las mutaciones
En la inmunodeficiencia común variable (CVID)
se han postulado alteraciones primarias tanto en
células B, como en células T, como en monocitos.
Buscando preservar donde existan, defectos
intrínsecos del linaje T, transformamos dichas
células con H. saimiri (HVS) y exploramos su capacidad de inducción de factores solubles (IL-2,
TNF-α e IFN-γ) y de membrana (CD154, CD69)
relevantes en la cooperación T-B. Los resultados
indicaron que los linfocitos T de pacientes con
CVID inmortalizados con H. saimiri no presentan,
como grupo, alteraciones funcionales intrínsecas
significativas en los parámetros analizados. Sin
embargo, se observó un defecto severo en la inducción de IL-2 y de CD154 en el linaje CD4+ tras estímulo con anti-CD3 en 3 de 10 pacientes analizados, sugiriendo que quizá algunos pacientes sí
sufran disfunciones intrínsecas TCR/CD3-dependientes.
En el presente trabajo analizamos mediante
Western blot la fosforilación total tras activación
con anti-CD3 en las 3 líneas precitadas y en un control sano. En uno de los pacientes se observó que
faltaba una banda constitutiva cuyo peso molecular aparente era de 32 kDa. Se requieren estudios
posteriores para tratar de identificar la proteína a
la que corresponde dicha banda.
Este trabajo fue financiado por el FIS (96/0860)
utilizando instalaciones del Centro de Técnicas
Inmunológicas de la U.C.M.
43
XXVII CONGRESO DE
LA SOCIEDAD
ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA
O-104. DIFERENCIAS ESTRUCTURALES
EN EL COMPLEJO TCR/CD3 DE LA MEMBRANA DE LINFOCITOS T CD4+ Y CD8+
MADUROS TRANSFORMADOS
DEFICIENTES DE CD3
D. A. Zapata, P. S. Torres, A. Pacheco-Castro,
J. R. Regueiro
Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina.
Universidad Complutense. Madrid
El receptor para antígeno del linfocito T es una
estructura multimérica de membrana constituida
por dos tipos de cadenas: cadenas CD3 (CD3γ,
CD3ε, CD3δ y CD3ζ), invariables y responsables
de la exportación/estabilización del receptor en la
membrana celular y de la transmisión de señales
tras el reconocimiento antigénico, y cadenas TCR
(TCRα y TCRβ en linfocitos Tαβ; TCRγ y TCRδ
en linfocitos Tγδ), variables y responsables de
dicho reconocimiento. La construcción del complejo TCR/CD3 tiene lugar en el retículo endoplásmico de manera secuencial y ordenada, y sólo complejos completos se exportan a la membrana.
Además se asume que los linfocitos Tαβ CD4 + y
CD8+ construyen complejos bioquímica y conformacionalmente idénticos. Sin embargo, nuestro
trabajo de caracterización bioquímica de un receptor mutante, deficiente de CD3γ, sugiere que las
células Tαβ CD4+ (γ-) y Tαβ CD8+ (γ-) construyen receptores estructuralmente distintos.
Experimentos de inmunoprecipitación (con anticuerpos anti-CD3) del complejo TCR/CD3 ensamblado en el citoplasma por estas células mostraron
que: 1. tanto los linfocitos T CD4+ γ - como los
CD8+ γ - contenían cadenas CD3 (δ y ε) cualitativa y cuantitativamente normales y con idéntico
comportamiento en términos de sensibilidad a
Endo H y 2 tanto en las células CD8+ γ - como en
las CD4+ γ - las cadenas TCR coprecipitaban normalmente con el resto del complejo, si bien las
células CD8+ γ - contenían cadenas TCRβ y TCRα
anormales. Por otra parte, el estudio bioquímico inmunoprecipitación con anticuerpos anti-CD3del receptor mutante exportado a la superficie
celular (receptor “funcional”) mostró: a) diferencias en el patrón de glicosilación de CD3δ en células CD8+ γ- vs CD4+ γ - (cadenas Endo H-resistentes y Endo H-sensibles, respectivamente) y b)
prácticamente total ausencia de coprecipitación
de cadenas TCR con el resto del complejo tanto en
células CD8+ γ - como CD4+ γ - . En este contexto
nuestro trabajo pretendía encontrar y estudiar las
teóricamente exportadas -junto con el resto de
componentes CD3- cadenas TCR. Experimentos
de inmunoprecipitación directa (anticuerpos antiTCRα y anti-TCRβ) de las cadenas TCRα y TCRβ
44
VOL.
20 SUPL.1 / 2001
de la superficie de las células mutantes mostraron
que: a) las células CD4 + γ - exportaban cadenas
TCRα y TCRβ diferentes a las de sus respectivos
controles (¿diferentes patrones de glicosilación?)
aunque reconocibles por los correspondientes
anticuerpos monoclonales pero que, b) las células
CD8+ γ - no exportaban cadenas TCR reconocibles por esos anticuerpos. Estos resultados sugieren la existencia de importantes diferencias dependientes de linaje en los mecanismos de
procesamiento postraduccional de los complejos
TCR/CD3.
O-105. REGISTRO ESPAÑOL DE INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS (REDIP).
INFORME DE ACTUALIZACIÓN MARZO
2001
A. Etxagibel, C. Crespí, N. Martínez, I. Muñoz,
J. Milà, N. Matamoros
Servicio de Inmunología. Hospital Son Dureta. Palma
de Mallorca
El papel de los registros nacionales de inmunodeficiencias primarias (IDP) está siendo fundamental en el mejor conocimiento de este tipo de
patologías que por su escasa incidencia precisa de
estudios colaborativos. El REDIP, iniciado en marzo de 1993 recoge a marzo de 2001 un total de 2.087
casos. Los diagnósticos están basados en la clasificación y criterios establecidos por la IUIS, octubre
1999.
En primer lugar y por grandes grupos se encuentran las inmunodeficiencias predominantemente
de anticuerpos con un 68,4% de casos. En segundo lugar las deficiencias T y combinadas con un
13% de los casos. A continuación le siguen los déficits del sistema complemento con un 10,1%, las
deficiencias de la fagocitosis con un 5,1% y otros
déficits primarios que suponen el 3,3% del total.
Además de la importancia epidemiológica de los
datos obtenidos, éstos son de utilidad para el mejor
conocimiento de las enfermedades recogidas. La
aplicación de los mismos para el diagnóstico y tratamiento precoces puede en ocasiones curar al
paciente o mejorar sustancialmente su calidad y
esperanza de vida.
Finalmente destacar la colaboración entre diferentes grupos de trabajo promovidos por el registro así como la elaboración de subregistros de
inmunodeficiencias, todo ello encaminado a ofrecer una mejor comprensión de este tipo de patologías y atención a los pacientes con inmunodeficiencias primarias.