Marazita, Mariela C.. 2010 - Biblioteca Digital de la Facultad de

P19INK4D y su fosforilación secuencial son
críticas para el mantenimiento de la integridad del
genoma
Marazita, Mariela C.
2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. Luis
Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la
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Fuente / source:
Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UN I VERSI D AD D E BUEN OS AI RES
Facult ad de Ciencias Exact as y Nat urales
Depart am ent o de Quím ica Biológica
P1 9 I N K4 D , ACTI VAD A POR FOSFORI LACI ÓN
SECUEN CI AL, ES CRÍ TI CA EN EL M AN TEN I M I EN TO D E
LA I N TEGRI D AD D EL GEN OM A
Tesis present ada para opt ar al t ít ulo de Doct or de la Universidad de
Buenos Aires en el área Quím ica Biológica
M a r ie la C. M a r a zit a
Direct ores de Tesis: Dr. Eduardo Tom ás Cánepa
Dr. Om ar Pedro Pignat aro
Consej ero de Est udios: Dr. Eduardo Tom ás Cánepa
Lugar de t rabaj o: Laborat orio de Biología Molecular, Depart am ent o de
Quím ica Biológica, FCEyN- UBA.
Laborat orio de Endocrinología Molecular y
Transducción de Señales, I ByME- CONI CET.
Buenos Aires, 2010
Re su m e n
Las prot eínas I NK4 ( p16I NK4a, p15I NK4b, p18I NK4c, y p19I NK4d) com ponen
una fam ilia de inhibidores de quinasas dependient es de ciclinas ( CDKs) que
funcionan en la fase G1 bloqueando la act ividad de las quinasas CDK4 y CDK6.
Mient ras que com part en sim ilit udes en sus est ruct uras form adas por repet iciones
de m ot ivos ankirina, est as prot eínas difieren en sus pat rones de expresión durant e
el desarrollo y en el adult o. Más allá de la aparent e redundancia de su función en el
cont rol del ciclo celular, algunos de sus m iem bros han sido involucrados en
dist int os procesos t ales com o diferenciación, senescencia y supresión t um oral.
En est e t rabaj o dem ost ram os que p19I NK4d es inducido por radiación UV en
diferent es t ipos celulares ( células de Leydig MA- 10, cult ivos prim arios de células de
Leydig, BHK- 21 y WI - 38) y que la inducción es específica de est e m iem bro de la
fam ilia. Plant eam os que la inducción podría im plicar una posible part icipación de
p19I NK4d en la reparación del ADN. Mediant e diversas est rat egias, est ablecim os
que p19I NK4d efect ivam ent e t iene una función en est e proceso. Adem ás, frent e a
daño genot óxico la dism inución en los niveles de p19I NK4d aum ent ó el núm ero de
aberraciones crom osóm icas, concluyendo que la act ividad de p19I NK4d afect a el
m ant enim ient o de la int egridad del genom a. Sum ado a est o, las células con niveles
reducidos
de
p19I NK4d
result aron
con
m enor
capacidad
de
sobrevivir
al
t rat am ient o con radiación UV.
En respuest a al daño al ADN se encienden una serie de cascadas de señales
que involucran diversas prot eínas quinasas. Est as quinasas act ivan a su vez
diferent es sust rat os efect ores de la respuest a conduciendo a la reparación, o no,
del daño. Habiendo descript o una función de p19 en est e proceso el siguient e
obj et ivo consist ió en est udiar si p19 form aba part e de est e grupo de prot eínas
efect oras fosforiladas frent e al daño. Encont ram os que p19 es fosforilada por
agent es que inducen diferent es t ipos de daño ( radiación UV, pépt ido β- am iloide y
cisplat ino) . I dent ificam os dos sit ios de fosforilación, serina 76 y t reonina 141, los
cuales son fosforilados en form a secuencial. Los result ados señalan a CDK2 y CDK5
com o responsables de la fosforilación en serina 76 y a PKA en t reonina 141. La
fosforilación de am bos sit ios ocurre en el cit oplasm a y la serina 76 es necesaria
para la t ranslocación de p19 al núcleo en est a respuest a.
Evaluam os luego la relevancia fisiológica de la fosforilación en est os sit ios.
Encont ram os que t ant o la serina 76 com o la t reonina 141 son est rict am ent e
necesarias para la función de p19 en la reparación del ADN. Sin em bargo, m ut ant es
en est os sit ios incapaces de ser fosforiladas, m ant ienen la m ism a capacidad de
inhibir la proliferación del ciclo celular cuando son sobreexpresadas. Est o señala
que exist e una independencia en la función de reparación respect o de la función
inhibit oria de CDK4/ CDK6.
Por
últ im o,
iniciam os el
est udio
referido
a las posibles prot eínas que
int eract úan con p19I NK4d relacionadas a la función de reparación del ADN.
Describim os seis int eract ores encont rados por
análisis de doble híbrido en
levaduras que result an de part icular int erés porque present an funciones en
procesos com unes a p19I NK4d. Est os posibles int eract ores part icipan en la
reparación del ADN, en la rem odelación de la crom at ina y en la regulación de
fact ores de t ranscripción del ciclo celular y la apopt osis.
En vist a de la part icipación de p19I NK4d en respuest a a diversos agent es
genot óxicos, que act ivan dist int os m ecanism os de reparación, post ulam os que
p19I NK4d act uaría en la reparación del ADN específicam ent e en una et apa
t em prana de la respuest a celular al daño al ADN. El análisis de los pot enciales
int eract ores de p19I NK4d, luego de la inj uria genot óxica, perm it e sugerir la
part icipación de est a prot eína en los com plej os rem odeladores de la crom at ina
necesarios para perm it ir el acceso de las m aquinarias de reparación en los sit ios de
daño.
Palabras clave:
Ciclo Celular -
p19I NK4d – Respuest a al Daño al ADN –
Reparación del ADN – Fosforilación.
Abst r a ct
I NK4 prot eins are m em bers of a fam ily of cyclin- dependent kinase ( CDK)
inhibit ors t hat funct ion in G1 t o block t he act ivit y of CDK4 and CDK6. While t hey
share clear st ruct ural sim ilarit ies, num erous st udies have shown t hat I NK4 prot eins
differ in t heir expression pat t erns during developm ent and in t he adult , and have
differing roles in different iat ion, senescence and t um or suppression.
We dem onst rat ed t hat p19I NK4d is induced in response t o UV radiat ion in
different cell t ypes ( Leydig MA- 10 cell line, prim ary Leydig cell cult ure, BHK- 21 y
WI - 38) and t hat t his induct ion is specific of t his fam ily m em ber. We hypot hesized
t hat t his fact could be relat ed t o a role of p19I NK4d in DNA repair. Taking
advant age of diverse st rat egies, we found t hat p19I NK4d effect ively part icipat es in
t his process. Adding t o t his, dim inished p19I NK4d levels when cells are exposed t o
genot oxics leads t o an increase in t he num ber of chrom osom al aberrat ions. From
t hese fact s we concluded t hat p19I NK4d influences t he m aint enance of genom e
int egrit y. Furt herm ore, cells wit h reduced p19 expression result ed in a significant
decrease of t he survival rat e upon UV dam age.
I n DNA dam age response different pat hways are t riggered involving t he act ivit y
of prot ein kinases. These kinases in t urn act ivat e diverse subst rat es t hat act as
effect ors of t he response leading or not t o DNA repair. Having described a funct ion
of p19I NK4d in t his process, t he next aim leaded t he st udy t o analize whet her
p19I NK4d is part of t he effect or prot eins phosphorylat ed aft er DNA dam age. We
found out t hat p19 is phosphorylat ed by t reat m ent wit h agent s which induce
different t ypes of DNA dam age ( UV light , β- am yloid pept ide and cisplat in) .
We
ident ified t wo phosphorylat ion sit es, serine 76 and t hreonine 141, which are
sequent ially
phosphorylat ed.
Our
result s
point ed
out
CDK2
and
CDK5
as
responsible kinases t o act on serine 76 and PKA as t he one act ing on t hreonine
141. Bot h sit es are phosphorylat ed in t he cyt oplasm ic space but only serine 76 is
required for p19I NK4d t ranslocat ion t o t he nucleus in t his response.
We invest igat e t he physiological relevance of t he phosphorylat ion process in
t hese sit es. We showed t hat serine 76 and t hreonine 141 are st rict ly necessary for
p19 funct ion in DNA repair. However, t hose m ut ant s of p19 not able t o be
phosphorylat ed have full capacit y for inhibit ing cell proliferat ion when t hey are
overexpressed. This fact indicat es t he independence of p19I NK4d funct ions.
Last ly, we began t he st udy relat ed t o pot ent ial prot eins int eract ing wit h
p19I NK4d linked t o DNA repair. We described six int eract ors found by a yeast t wo
hybrid screening which appear part icularly int erest ing because t hey have funct ions
in com m on processes t o p19I NK4d. These int eract ors part icipat e in processes such
as: DNA repair, chrom at in rem odelling and regulat ion of t ranscript ion fact ors of t he
cell cycle and apopt osis.
Taking int o account p19I NK4d part icipat ion in response t o diverse genot oxic
agent s which act ivat e different DNA repair m echanism s, we finally raised t he
hypot hesis t hat p19 would be t aking part in an early st ep in DNA dam age response,
specifically in DNA repair. The analysis of pot ent ial p19I NK4d int eract ors, aft er
genot oxic inj ury, suggest s t hat t his prot ein could play a role as a m em ber of
chrom at in - rem odeling com plexes necessary for t he accessibilit y of DNA repair
m achineries t o DNA dam aged sit es.
Keywords: Cell Cycle - p19I NK4d - DNA Dam age Response - DNA repair Phosphorylat ion
-
El prim er capít ulo de est e t rabaj o ha dado lugar a la publicación del
siguient e art ículo:
D N A Re pa ir 6 ( 2007 ) 626–638
Ce ll cycle in h ibit or , p1 9 I N K4 d, pr om ot e s ce ll su r viva l a n d de cr e a se s
ch r om osom a l a be r r a t ion s a ft e r ge not ox ic in su lt
du e t o e nh a n ce d D N A r e pa ir
M. E. Scassa* , M. C. Marazit a* , J. M. Cerut i, A. L. Carcagno, P. F. Sirkin, M.
González- Cid, O. P. Pignat aro, E. T. Cánepa.
* Est os aut ores colaboraron de form a igual en est e t rabaj o.
- Se encuent ra en preparación el siguient e m anuscrit o t it ulado:
p1 9 I N K4 D D N A r e pa ir fu n ct ion r e la ys on se qu e n t ia l ph osphor yla t ion
M. C. Marazit a, M. F. Ogara, J.M. Cerut i, A. C. Carcagno, S. V. Sonzogni, N. Duset t i,
M. Mart í, O. Pignat aro, Eduardo T. Cánepa
Í NDI CE
Abr e via t u r a s ......…………………………………………………………..……….…………….1
I N TROD UCCI ÓN ………..…………………………………………………..…….……………....2
1.
Ciclo Ce lu la r .............................................................................................3
1.1
Regulación del ciclo celular ............................................................. 3
1.1.1
Quinasas dependient es de ciclinas ( CDKs) ............................................... 4
1.1.2
Ciclinas .............................................................................................. 6
1.1.3
I nhibidores de quinasas dependient es de ciclinas ( CKI s) ............................ 8
1.2
Fam ilia I NK4 ................................................................................. 8
1.2.1
2.
M a n t e n im ie n t o de la in t e gr ida d de l ge n om a ..........................................1 2
2.1
Agent es genot óxicos .................................................................... 13
2.1.1
Radiación UV ......................................................................... 13
2.1.2
Cis- plat ino ............................................................................. 14
2.1.3
3.
Función de las prot eínas I NK4 .................................................. 10
Pépt ido
- am iloide ................................................................. 14
Pu n t os de con t r ol de da ñ o .....................................................................1 4
3.1 Part icipant es en la respuest a al daño al ADN ..................................... 16
3.1.1
Sensores ............................................................................... 16
3.1.2
Mediadores ............................................................................ 17
3.1.3
Transduct ores ........................................................................ 17
3.1.4
Efect ores............................................................................... 18
3.2
Checkpoint s G1, S y G2 ............................................................... 18
3.2.1
Checkpoint G1 ....................................................................... 19
3.2.2
Checkpoint S ......................................................................... 19
3.2.3
Checkpoint G2 ....................................................................... 20
4 . Sist e m a s de Re pa r a ción ..........................................................................2 1
4.1
Reparación por Escisión de Nucleót idos ( NER) ................................. 21
4.2
Reparación por Escisión de Base ( BER) ........................................... 23
4.3
Mism at ch Repair ( MMR) ............................................................... 23
4.4
Mecanism o de reparación por Recom binación Hom óloga ( HR) ............ 24
4.5
Mecanism o de reparación por unión de ext rem os no hom ólogos( NHEJ) 25
OBJETI VOS e H I PÓTESI S ...............................................................................2 9
Obj e t iv o Ge n e r a l .............................................................................................3 0
Obj et ivos Específicos .......................................................................................3 0
H ipót e sis .........................................................................................................3 1
RESULTAD OS ...................................................................................................3 2
Ca pít u lo 1 : pa r t icipa ción de p1 9 I N K4 d e n la r e pa r a ción de l AD N ....................3 3
Í NDI CE
1 .1
p1 9 I N K4 d se e x pr e sa e n for m a pe r iódica e n e l ciclo ce lu la r e n cé lu la s
de Le y dig M A- 1 0 ..........................................................................................3 3
1 .2
La e x pr e sión de p1 9 I N K4 d e s in du cida por r a dia ción UV .....................3 5
1 .3
p1 9 e s la ú n ica I N K4 cu ya e x pr e sión e s in du cida por r a dia ción UV ......3 7
1 .4
p1 9 pa r t icipa e n la r e pa r a ción de l AD N ................................................3 8
1.4.1
Ensayo de reparación del ADN por HCR........................................ 38
1.4.2
Est udio de la capacidad de reparación del ADN por UDS ................. 42
1.4.3
Análisis de reparación del ADN por rem oción de CPDs .................... 44
1.4.4
Ensayo del Com et a ................................................................... 46
1 .5
p1 9 con fie r e m a yor r e sist e n cia a la ir r a dia ción por UV ........................4 8
1 .6
La de ficie n cia de p1 9 a u m e n t a la fr e cu e n cia de a be r r a cion e s
cr om osóm ica s ..............................................................................................5 3
1 .7 p1 9 pa r t icipa de la r e pa r a ción de l AD N e n for m a in de pe n die n t e de su
fu n ción in h ibit or ia de l ciclo ce lu la r ..............................................................5 6
Ca pít u lo 2 : M e ca n ism o de a ct iva ción de p1 9 I N K4 d fr e n t e a da ñ o ge n ot óx ico. 5 9
2 .1
p1 9 e s fosfor ila da e n r e spu e st a a l da ñ o ge n ot óx ico .............................6 0
2 .2
Pr e dicción de sit ios de fosfor ila ción e n p1 9 .........................................6 2
2 .3
Los sit ios se r in a 7 6 y t r e on in a 1 4 1 son cr ít icos pa r a la fosfor ila ción de
p1 9 ..............................................................................................................6 5
2 .4
Pr e dicción de qu in a sa s r e spon sa ble s de la fosfor ila ción de p1 9 ...........6 6
2 .5
PKA y m ie m br os de la fa m ilia CD K e st á n in volu cr a dos e n la fosfor ila ción
de p1 9 .........................................................................................................6 7
2 .6
p1 9 e s fosfor ila da e n for m a se cu e n cia l ................................................6 8
2 .7
Sim u la ción de fosfor ila ción se cu e n cia l e n p1 9 .....................................7 0
2 .8
CD K2 e st á in volu cr a da e n la fosfor ila ción de p1 9 .................................7 3
2 .9
CD K2 y CD K5 t ie n e n la ca pa cida d de fosfor ila r e n for m a dir e ct a a p1 9 7 6
2 .1 0
PKA pu e de fosfor ila r e n for m a dir e ct a a p1 9 ......................................7 9
2 .1 1
PKA in t e r a ccion a con p1 9 in vivo .......................................................8 2
2 .1 2
La fosfor ila ción de p1 9 lu e go de da ñ o ge n ot óx ico e s in icia da e n e l
cit opla sm a ...................................................................................................8 3
2 .1 3
La se r in a e n la posición 7 6 e s n e ce sa r ia pa r a la t r a n sloca ción n u cle a r
de p1 9 .........................................................................................................8 4
Ca pit u lo 3 : Re le va n cia fisiológica de l pr oce so de fosfor ila ción de p1 9 I N K4 d e n
r e spu e st a a ge n ot óx icos..................................................................................8 8
3 .1
An á lisis de la con se r va ción de los sit ios se r in a 7 6 y t r e on in a 1 4 1 e n t r e
los m ie m br os de la fa m ilia I N K4 ..................................................................8 8
3 .2
Se r in a 7 6 y Tr e on in a 1 4 1 son n e ce sa r ia s pa r a la fu n ción de p1 9 e n la
r e pa r a ción de l AD N ......................................................................................9 0
Í NDI CE
3 .3
La sobr e e x pr e sión de p1 9 dism in u ye la a popt osis in du cida por
ge n ot óx icos .................................................................................................9 2
3 .4
La fosfor ila ción de p1 9 e s n e ce sa r ia e n la r e sist e n cia qu e e j e r ce p1 9
con t r a la a popt osis. .....................................................................................9 3
3 .5
La fosfor ila ción de p1 9 n o e st á in volu cr a da e n su fu n ción in h ibit or ia de l
ciclo ce lu la r ..................................................................................................9 5
3 .6
La s m u t a n t e s de p1 9 qu e sim u la n e l e st a do fosfor ila do de la pr ot e ín a
t ie n e n igu a l ca pa cida d de r e pa r a r e l AD N qu e p1 9 sa lva j e ...........................9 6
3 .7
La se r in a 7 6 y la t r e on in a 1 4 1 son los ú n icos sit ios de fosfor ila ción e n
p1 9 e n r e spu e st a a da ñ o ..............................................................................9 9
3 .8
Am bos sit ios, se r in a 7 6 y t r e on in a 1 4 1 , son fosfor ila dos e n e l
cit opla sm a lu e go de da ñ o a l AD N ............................................................... 1 0 0
Ca pít u lo 4 : I n t e r a ct or e s de p1 9 ..................................................................... 1 0 2
4 .1
Bú squ e da de in t e r a ct or e s de p1 9 por e n sa yo de doble h íbr ido .......... 1 0 2
4.1.1
Descripción del sist em a ........................................................... 102
4.1.2
Det erm inación de int eract ores de p19 ....................................... 103
4.1.3
Análisis de los int eract ores....................................................... 104
Con clu sion e s ................................................................................................. 1 1 2
D I SCUSI ÓN ................................................................................................... 1 1 3
1.
Fu n ción de p1 9 e n la r e spu e st a a l da ñ o a l AD N y e n la su pe r vive n cia
ce lu la r ........................................................................................................ 1 1 4
1.1
I nducción de p19 en respuest a a daño por UV............................... 114
1.2
p19 en la respuest a al daño ........................................................ 115
1.3
p19 en la supervivencia celular y en el m ant enim ient o de la int egridad
del genom a ..................................................................................... 117
1.4
2.
3.
I ndependencia de funciones........................................................ 118
D a ñ o a l AD N y fosfor ila ción de p1 9 ...................................................... 1 1 9
2.1
p19 result a fosforilada en respuest a a daño .................................. 119
2.2
¿En qué sit ios es fosforilada p19 ? ............................................... 120
2.3
¿Cuáles son las quinasas involucradas en el proceso de fosforilación? 121
2.4
Hipót esis de la fosforilación secuencial ......................................... 124
2.5
¿En qué com part im ient o subcelular ocurre la fosforilación de p19? ... 125
2.6
¿Cuál es la relevancia fisiológica de la fosforilación? ....................... 126
I n t e r a ct or e s de p1 9 liga dos a l r ol de r e pa r a ción de l AD N .................... 1 2 8
M ATERI ALES Y M ÉTOD OS .............................................................................. 1 3 1
Cu lt ivo de Lín e a s Ce lu la r e s ........................................................................ 1 3 2
Ar r e st o de l ciclo ce lu la r . ............................................................................ 1 3 3
Í NDI CE
An á lisis de l ciclo ce lu la r m e dia n t e cit om e t r ía de flu j o. .............................. 1 3 3
An á lisis de ARN por N or t h e r n blot . ............................................................ 1 3 3
Marcación de sondas ......................................................................... 134
An á lisis de pr ot e ín a s por W e st e r n blot ...................................................... 1 3 6
Age n t e s ge n ot óx icos.................................................................................. 1 3 8
I n h ibidor e s de qu in a sa s............................................................................. 1 3 9
Pr e pa r a ción de plá sm idos .......................................................................... 1 3 9
Análisis de las preparaciones plasm ídicas. ............................................ 140
Su bclon a dos y M u t a gé n e sis D ir igida .......................................................... 1 4 1
Subclonado del cADN de p19I NK4d ..................................................... 141
Const rucción de m ut ant es p19S66A, P19S76A, p19T141A, p19S76E ........ 141
Const rucción de m ut ant es p19ANKless, p19S13A, p19T141A, p19S76T141A,
p19S76T141E .................................................................................. 143
Tr a n sfe cción t r a n sit or ia de cé lu la s y se le cción . ......................................... 1 4 4
Act ivida d de la e n zim a ca spa sa - 3 .............................................................. 1 4 5
Ge n e r a ción de lín e a s ce lu la r e s e st a ble s pa r a p1 9 I N K4 d ............................ 1 4 6
Sín t e sis de AD N n o pr ogr a m a da ( UD S, Un sch e du le d AD N Syn t h e sis) . ....... 1 4 6
En sa yo de r e a ct iva ción e n la cé lu la h u é spe d ( H CR) ................................... 1 4 7
I n cor por a ción de 3 H - t im idin a . .................................................................... 1 4 9
En sa yo de M TT: e st im a ción de via bilida d ce lu la r ........................................ 1 4 9
En sa yo clon ogé n ico. .................................................................................. 1 4 9
En sa yo de l com e t a " Com e t Assa y" ............................................................ 1 5 0
An á lisis de a be r r a cion e s cr om osóm ica s ..................................................... 1 5 1
Fosfor ila ción in vit r o .................................................................................. 1 5 3
Ensayo de fosforilación del pépt ido de p19 por PKA ............................... 153
Ensayo de fosforilación de GST- p19 por PKA ......................................... 154
Ensayo de fosforilación del pépt ido de p19 por CDK2 y CDK5 .................. 155
Ensayo de fosforilación de GST- p19 por CDK2 y CDK5 ........................... 155
I nm unoprecipit ación de CDK2 ó CDK5 ................................................. 156
D ism in u ción de los n iv e le s de la s qu in a sa s CD K1 y CD K2 .......................... 1 5 6
I n t e r a cción de p1 9 y PKA in vivo ............................................................... 1 5 7
I n du cción y pu r ifica ción de GST- p1 9 .......................................................... 1 5 7
Té cn ica de D oble H íbr ido e n le va du r a s ...................................................... 1 5 8
An á lisis de e st r u ct u r a y sim u la ción de fosfor ila ción de p1 9 ....................... 1 5 8
REFEREN CI AS ................................................................................................ 1 6 0
Abr e via t u r a s
AD N c: Ácido desoxirribonucleico copia del ARN m ensaj ero
ASCD K1 : oligonucleót ido ant isent ido para CDK1
ASCD K2 : oligonucleót ido ant isent ido para CDK2
ATM : at axia- t elangiect asia m ut at ed
ATR: ATM and RAD3- relat ed
BER: m ecanism o de reparación por excisión de bases
CAT: cloram fenicol acet il t ransferasa
CD Ks: quinasas dependient es de ciclinas
CKI s: prot eínas inhibidoras de CDK
CPD : dím eros de t im idina t ipo ciclobut ano
D D R: respuest a al daño al ADN
D SBs: rot uras del ADN de doble cadena
GGR: reparación global del genom a
H CR: ensayo de reparación Host Cell React ivat ion
H D ACs: deacet ilasas de hist onas
H R: m ecanism o de reparación por recom binación hom óloga
I N K4 : inhibidores de quinasas dependient es de ciclinas
M A- 1 0 p1 9 S: línea celular con expresión inducible de p19
M A- 1 0 p1 9 AS: línea celular con expresión inducibles p19 ant isent ido
N ER: m ecanism o de reparación por escisión de nucleót idos
p- H 1 : pépt ido de hist ona H1 cont eniendo una secuencia consenso para PKA
PKA: prot eína quinasa A
p- S7 6 : pépt ido de p19 cont eniendo el sit io serina 76
p- T1 4 1 : pépt ido de p19 cont eniendo el sit io t reonina 141
p1 9 : p19I NK4d
ssAD N : cadena sim ple de ADN
TCR: reparación acoplada a la t ranscripción
UD S: sínt esis de ADN no program ada
UV: radiación ult raviolet a
1
I N TROD UCCI ÓN
I NTRODUCCI ÓN
1.
Ciclo Ce lu la r
La función principal del ciclo celular es duplicar con exact it ud el ADN de los
crom osom as y luego dividir las copias en dos células hij as idént icas. El ciclo celular
est á dividido en cuat ro fases: G1, S, G2 y M. Durant e dos de est as fases, las células
ej ecut an los dos event os m ás im port ant es de la división celular: la generación de una
copia confiable de su m at erial genét ico ( fase S) y la dist ribución de t odos los
com ponent es celulares ent re dos células hij as idént icas ( fase M) . Las ot ras dos fases
del ciclo ( G1 y G2) represent an períodos “ gap” durant e los cuales las células se
preparan para com plet ar con éxit o las fases S y M, respect ivam ent e ( Malum bres and
Barbacid, 2001) ; ( Norbury and Nurse, 1992) .
Las células en cult ivo, al iniciar una nueva ronda de división, pasan por un período
de dependencia de fact ores m it ogénicos necesarios para prom over la división celular.
A m edida que el ciclo progresa est a dependencia desaparece y las células se
encuent ran com prom et idas a concluir el ciclo iniciado independient em ent e de la
presencia de fact ores ext ernos ( Pardee, 1974; Pardee, 1989) . Est a t ransición se
denom ina Punt o de Rest ricción o punt o R y es com únm ent e ut ilizado para dividir las
fases G1 t em prana y G1 t ardía del ciclo celular ( Malum bres and Barbacid, 2001) . El
punt o R det erm ina una sit uación de no- ret orno, si los m it ógenos son rem ovidos del
m edio ant es de est e m om ent o las células ret ornan al est ado de quiescencia o G0, si la
rem oción ocurre una vez alcanzado est e punt o la progresión del ciclo celular no se ve
afect ada ( Kondo et al., 2001) . En el est ado G0, las células det ienen la división celular
aunque m ant ienen un m et abolism o act ivo y, ant e un est ím ulo adecuado, abandonan el
est ado G0 y ent ran a la fase G1 reiniciando el ciclo proliferat ivo ( Kondo et al., 1999) .
El ciclo celular m it ót ico se m odifica hacia un ciclo m eiót ico durant e la form ación de
las gam et as, llevando a la reducción del núm ero de crom osom as, esencial para la
reproducción sexual, y al aum ent o en la variabilidad genét ica, sust rat o de la evolución
por selección nat ural y por deriva génica ( Nurse, 2000) . Por lo t ant o, el ciclo celular
j uega un rol cent ral en la concreción y el desarrollo de t oda la vida, y asegura su
cont inuidad a t ravés de las generaciones.
1 .1
Re gu la ción de l ciclo ce lu la r
El pasaj e de una a ot ra fase del ciclo se encuent ra est rict am ent e cont rolado por
una gran
cant idad de prot eínas involucradas en
regular
t ant o posit iva com o
negat ivam ent e la progresión del ciclo celular. El cont rol riguroso que ej ercen o es
3
I NTRODUCCI ÓN
ej ercido sobre est os fact ores evit a la iniciación de la fase siguient e sin que la ant erior
halla sido com plet ada sat isfact oriam ent e ( Bulavin et al. 2002; Hart well and Weinert ,
1989) , cont ribuyendo a la fidelidad en el m ant enim ient o y en la t ransferencia de la
inform ación genét ica ( Zhou and Ellege, 2000) .
Com o
fact ores
principales
en
la
regulación
se
encuent ran:
las
quinasas
dependient es de ciclinas ( CD Ks) que fosforilan a diversas prot eínas en serinas y
t reoninas, las ciclinas que regulan la act ividad quinasa de las CDKs, y las prot eínas
inhibidoras de CDKs ( CKI s) ( Figu r a I I I ) . Est as prot eínas int egran el fluj o de
inform ación provenient e desde el ext erior celular para dirigir el inicio del ciclo celular y
la progresión a t ravés de t odas sus fases.
1 .1 .1
Qu in a sa s de pe n die n t e s de ciclin a s ( CD Ks)
Las quinasas dependient es de ciclinas son un grupo de serina t reonina quinasas
que form an com plej os act ivos het erodim éricos luego de unirse a las ciclinas, sus
subunidades regulat orias ( Morgan, 1997; Sherr, 2000) . Est as holoenzim as, com plej os
CDK- ciclina, cat alizan una gran variedad de reacciones, fosforilando diversos sust rat os
que perm it en el pasaj e de las células a t ravés de las dist int as fases del ciclo celular
( Herrup and Yang, 2007) .
En hum anos se report aron num erosos loci que codifican para CDKs y ciclinas ( 13 y
25 loci respect ivam ent e) ( Malum bres and Barbacid, 2005) . Sin em bargo, sólo un
grupo de com plej os CDK- ciclinas est á direct am ent e relacionado en la conducción del
ciclo celular. Est e grupo incluye t res CDKs de int erfase ( CDK2, CDK4 y CDK6) , una
CDK de fase M ( CDK1, t am bién conocida com o cdc2 por cell division cont rol prot ein 2)
y 10 ciclinas que pert enecen a 4 clases diferent es ( ciclinas de t ipo A, B, D y E)
( Malum bres and Barbacid, 2009) . CDK4 y de CDK6 est án involucradas en la fase G1
t em prana, m ient ras que CDK2 es requerida para com plet ar G1 e iniciar S ( Figu r a I y
I I ) . CDK4 y CDK6 form an com plej os act ivos con las ciclinas de t ipo D ( ciclina D1, D2
y D3) ( At t wooll et al., 2004) , m ient ras que CDK2 form a com plej os act ivos con ciclina E
y ciclina A ( Sherr, 2000) y CDK1 con ciclina A y ciclina B ( Evans et al., 1983; Ewen et
al., 1993; Weinberg, 1995) .
Evolut ivam ent e, est as quinasas est án m uy relacionadas y han resist ido la
diferenciación
funcional,
except o por
los dist int os pat rones de act ivación
que
present an ( Meyerson and Harlow, 1994) . La act ividad enzim át ica de est as prot eínas
CDKs se encuent ra regulada por al m enos t res m ecanism os diferent es. El prim ero
const a de su unión a ciclinas y su consecuent e act ivación. El segundo, por acción de
4
I NTRODUCCI ÓN
los inhibidores de quinasas dependient e de ciclinas ( CKI s) . En el t ercer m ecanism o, la
regulación se produce por procesos de fosforilación en residuos t reonina y t irosina, los
cuales regulan la act ividad cat alít ica de la enzim a t ant o posit ivam ent e ( cuando act úa
el com plej o CDK7- ciclina H, t am bién conocido com o CAK; CDK act ivat ing kinase)
( Malum bres and Barbacid, 2001) , com o negat ivam ent e ( quinasas Wee1 y MYT1) . A su
vez, est a inhibición es ret irada cuando las fosfat asas CDC25 ( CDC25A, CDC25B o
CDC25C) defosforilan est os residuos, disparando la ent rada en m it osis ( Trim archi and
Lees, 2002) .
Los principales sust rat os de CDK4/ 6 y CDK2 en la progresión de la fase G1 son los
m iem bros de la fam ilia de prot eínas de ret inoblast om a ( Rb, p107 y p130) . Est as
m oléculas funcionan com o sit ios de anclaj e para una serie de prot eínas que deben ser
fuert em ent e reguladas durant e el ciclo celular. Por ej em plo, la prot eína Rb se une a
los fact ores de t ranscripción de la fam ilia E2F, asegurando que est os perm anezcan
inact ivos durant e las fases M y G0. Adem ás, los com plej os Rb- E2F part icipan en un
m ecanism o de represión act iva sobre algunos prom ot ores: est e proceso involucra
ot ras fam ilias de prot eínas, com o las deacet ilasas de hist onas ( HDACs) , com plej os
rem odeladores de la crom at ina SWI / SNF y m et ilt ransferasas de hist onas com o
SUV39H1. La act ividad de las prot eínas Rb es m odulada m ediant e fosforilación
secuencial por los com plej os CDK4/ 6- ciclina D y CDK2- ciclina E. Rb t am bién puede ser
regulada por acet ilación m ediada por hist onas acet ilasas asociadas a p300/ CBP. Est as
acet ilasas est án baj o el cont rol del ciclo celular e im piden la eficient e fosforilación de
Rb por el com plej o CDK2- ciclina E. Las prot eínas Rb hiperfosforiladas liberan las
m oléculas que se unen a sus isoform as hipofosforiladas. Est a “ liberación” les perm it e
llevar a cabo sus roles específicos en el ciclo celular ( Malum bres and Barbacid, 2001) .
En las células eucariot as se ha regist rado que, durant e la fase G1, los niveles de
act ividad CDK net a son relat ivam ent e baj os. Sin em bargo, est a act ividad aum ent a
progresivam ent e m ient ras las células avanzan en el ciclo de división. I nicialm ent e
present a un pico y luego decae rápidam ent e durant e la m it osis ( Morgan, 1997) . El
nivel reducido de act ividad CDK, observado durant e la fase G1, es requerido para la
form ación de los com plej os de preiniciación en los orígenes de replicación del ADN
crom osóm ico ( Massague, 2004) .
Luego, la ent rada y la progresión a t ravés de la fase S y la ent rada en m it osis
pueden proceder únicam ent e en la presencia de una act ividad enzim át ica m ás robust a
( Sherr and Robert s, 2004) . Por lo t ant o, los reguladores de CDKs, al m odular su
act ividad, pueden cont rolar el dest ino del ciclo celular.
5
I NTRODUCCI ÓN
1 .1 .2
Ciclin a s
Las ciclinas const it uyen
una fam ilia de prot eínas que son
sint et izadas y
degradadas en m om ent os específicos del ciclo celular. Los m iem bros de est a fam ilia
com part en ciert o grado de sim ilit ud en cuant o a su com posición am inoacídica y son
definidas por una región com ún denom inada “ cyclin box” que perm it e la unión a las
CDKs y su act ivación ( Peeper et al., 1993; Pines and Hunt er, 1989) . Hay dos clases
principales de ciclinas: las ciclinas G1, que se unen a CDKs durant e G1 y son
necesarias para el inicio de la fase S, y las ciclinas m it ót icas, que se unen a CDKs
durant e la fase G2, siendo necesarias para la ent rada en m it osis.
Exist en dos t ipos de ciclinas de fase G1: las de t ipo D ( D1, D2 y D3) y las de t ipo
E ( E1 y E2) . Est as ciclinas poseen una vida m edia cort a, siendo sus niveles regulados
a nivel t ranscripcional y por degradación. El ensam blado con sus respect ivas CDKs
( CDK 4 ó 6, y CDK2, respect ivam ent e) se produce a m edida que la célula va
progresando en la fase G1. Por ot ro lado, se conocen dos t ipos de ciclinas m it ót icas
denom inadas A y B. La expresión de la ciclina A com ienza en la fase S, la de t ipo B lo
hace en la fase G2. Durant e la m it osis am bas ciclinas son degradadas. CDK2 es
act ivada secuencialm ent e por ciclinas de t ipo E durant e la t ransición G1/ S, y las
ciclinas de t ipo A ( ciclina A1 y A2) durant e la fase S. Luego, la quinasa principal es
CDK1, act ivada prim ero por ciclinas A y m ás t arde por ciclinas de t ipo B ( B1 y B2)
( Minshull et al., 1990; Pines and Hunt er, 1990) .
Com o m encionam os ant eriorm ent e, los niveles de ciclinas no son const ant es a lo
largo del ciclo celular, sino que se ven som et idas a un proceso de sínt esis y
degradación, est a últ im a por el sist em a de ubiquit inación- prot easom a, dent ro de cada
período. Est e acont ecim ient o result a fundam ent al, ya que, de est a m anera, se logra la
regulación de la form a act iva de las CDKs para así poder fosforilar a sus sust rat os,
generalm ent e relacionados con el inicio o la regulación de sucesos im port ant es dent ro
del ciclo celular ( Murray, 2004) . Las ciclinas poseen la capacidad de dirigir a las CDKs
al núcleo, dado que, a diferencia de est as últ im as, cont ienen señales de localización
nuclear.
6
I NTRODUCCI ÓN
Figu r a I . Regulación de los fact ores int racelulares ( CDK y ciclinas) involucrados en el
cont rol del ciclo celular. Modificado de Dom enico Coppola.
Figu r a I I . Niveles prot eicos de las diferent es ciclinas a lo largo del ciclo celular
7
I NTRODUCCI ÓN
1 .1 .3
I n h ibidor e s de qu in a sa s de pe n die n t e s de ciclin a s ( CKI s)
En m am íferos exist en 2 fam ilias de prot eínas que act úan com o inhibidores de
quinasas dependient es de ciclinas ( CKI s) ( Hiram a and Koeffler, 1995; Ort ega et al.,
2002; Sherr and Robert s, 1999; Trim archi and Lees, 2002) ( Figu r a I I I ) . La fam ilia de
las I NK4 ( por inhibit ors of CDK4) com puest a por las prot eínas p16I NK4a, p15I NK4b,
p18I NK4c y p19I NK4d; y la fam ilia de las Cip/ Kip, form ada por p21 ( ó Cip1, CDK2
int eract ing prot ein) , p27 ( ó Kip1, kinase inhibit ing prot ein 1) y p57 ( ó Kip 2) ( Figu r a
I ) . Las Cip/ Kip t ienen el pot encial necesario para inhibir a diferent es CDKs,
principalm ent e CDK2- ciclina E/ A y CDK1-
ciclina B ( Hengst
and Reed, 1998;
Nakayam a and Nakayam a, 1998) . Las 4 prot eínas que conform an al grupo I NK4
t ienen la capacidad de unirse a CDK4/ 6, inhibiendo la unión de la ciclina D e
im pidiendo su act ivación.
Figu r a I I I . Regulación de los com plej os ciclina – CDKs a lo largo del ciclo celular. Modificado de
Trim archi y Lees, 2002.
1 .2
Fa m ilia I N K4
Las prot eínas I NK4 com ponen una de las dos fam ilias de inhibidores de quinasas
dependient es de ciclina. Han sido ident ificados cuat ro m iem bros: p16I NK4a ( p16) ,
p15I NK4b ( p15) , p18I NK4c ( p18) y p19I NK4d ( p19) , nom brados de acuerdo a su
m asa y en el orden que fueron descubiert os ( Chan et al., 1995; Guan et al., 1996;
Hannon and Beach, 1994; Hirai et al., 1995; Serrano et al., 1993) . Cada uno es
codificado por un único gen, los cuales m apean en los siguient es crom osom as:
8
I NTRODUCCI ÓN
p16I NK4a y p15I NK4b unidos en t ándem en 9p21, p18I NK4c en 1p32 y p19I NK4d en
19p13.
Las prot eínas I NK4 t ienen act ividades sim ilares, inhibiendo específicam ent e a las
quinasas CDK4 y CDK6 ( Serrano et al., 1993) . Cuando son expresadas ect ópicam ent e,
arrest an a las células en G1, pero únicam ent e en presencia de prot eínas pRb
funcionales ( Bruce et al., 2000) . Las bases est ruct urales para la inhibición de la
act ividad quinasa de CDK4/ 6 por las prot eínas I NK4 est án claram ent e est ablecidas
( Brot hert on et al., 1998; Ort ega et al., 2002; Roussel, 1999) . Las cuat ro I NK4 son
est ruct uralm ent e sim ilares dom inando su est ruct ura repet iciones de m ot ivos ankirina.
Los m ot ivos ankirina cont ienen 32 am inoácidos y consist en en pares de ⟨- hélices
ant iparalelas, conect adas ent re sí por una serie de m ot ivos horquilla ( “ int ervening
hairpin m ot ifs” )
( Pavlet ich,
1999) .
Mient ras que p16I NK4a y
p15I NK4b est án
com puest as por cuat ro m ot ivos ankirina, p18I NK4c y p19I NK4d poseen cinco. Est os
dom inios est ruct urales est án involucrados en la unión a la región no- cat alít ica de
CDK4 y CDK6 opuest a al sit io de unión de ciclina D. La unión de las I NK4 induce un
cam bio alost érico en CDK4/ 6, alt erando el sit io de unión de las ciclinas D y reduciendo
su afinidad por ATP ( Pavlet ich, 1999) .
Las cuat ro I NK4, adem ás de com part ir los m ot ivos ankirina en la est ruct ura,
poseen un int rón que int errum pe la secuencia codificant e de sus genes en la m ism a
posición, lo que sugiere que t odos los m iem bros de la fam ilia han evolucionado desde
un ancest ro com ún ( Ruas and Pet ers, 1998) . En t érm inos evolut ivos, la redundancia
de funciones en una fam ilia prot eica sólo es posible si los diferent es m iem bros poseen
pat rones de expresión diferent e y/ o si exist en funciones caract eríst icas que han sido
seleccionadas a lo largo de la hist oria evolut iva. Y est e hecho se corrobora en los
m iem bros de la fam ilia I NK4, para los cuales fue report ada la expresión diferencial en
el desarrollo del rat ón ( Cunningham and Roussel, 2001) . p18 y p19 son expresadas
principalm ent e en el em brión, m ient ras que p16 y p15 son det ect adas únicam ent e
luego del nacim ient o, en la m ayoría de los t ej idos.
Los m ecanism os m oleculares involucrados en la regulación de la expresión de las
I NK4 no est án del t odo definidos. Solam ent e la expresión de p19 es periódica a lo
largo del ciclo celular ( Hirai et at , 1995; Thullberg et al., 2000) . Su expresión es baj a
en G0/ G1 y t iene un m áxim o de expresión al final de G1 y en fase S. Luego, es
rápidam ent e degradada por un m ecanism o dependient e de ubiquit ina/ prot easom a de
m anera t al que, en G1 t em prana, el nivel de p19 es baj o para facilit ar el ensam ble de
los com plej os CDK4/ 6 - ciclina D.
El m ayor nivel de expresión prot eica de p19I NK4d ( p19) ocurre en cerebro,
t est ículos, bazo y t im o. p19 est á relat ivam ent e bien caract erizada en el sist em a
9
I NTRODUCCI ÓN
nervioso cent ral, donde es una de las prot eínas I NK4 m ayorit arias. Es expresada
t em pranam ent e durant e el desarrollo en el cerebro y allí su expresión es m ant enida
en la vida adult a.
1 .2 .1
Fu n ción de la s pr ot e ín a s I N K4
El rol específico de cada m iem bro de la fam ilia I NK4 fue definido principalm ent e
m ediant e la generación de cepas de rat ones genét icam ent e m odificados, deficient es
en uno o varios m iem bros de est a fam ilia génica ( Ta bla 1 ) . Se ha dem ost rado que las
prot eínas p16I NK4a, p15I NK4b y p18I NK4c son supresores t um orales ( Cánepa et al,
2007) .
Rat ones
que
expresan
una
versión
inest able
de
p16
se
desarrollan
norm alm ent e y sólo un pequeño porcent aj e t ienen linfom as de células- B luego de una
lat encia prolongada. Por ot ro lado, rat ones hom ocigot os para una m ut ación que
elim ina el exón 1α de p16 desarrollan una variedad de t um ores a una t asa m ás
elevada ( 25% de incidencia al año de edad) . Por lo t ant o, p16 parece t ener una
act ividad supresora t um oral m oderada en rat ones. En hum anos, est á am pliam ent e
report ada la exist encia de m ut aciones punt uales que afect an específicam ent e la
expresión de p16 y que est án asociadas con la aparición de t um ores ( Cánepa et al,
2007) .
El fenot ipo de rat ones nulos para p16 se asem ej a al de anim ales m ut ant es para
las ot ras I NK4. Las dist int as cepas desarrollan variados t ipos de t um ores, con baj a
incidencia y no present an anorm alidades significat ivas en el desarrollo. Rat ones
deficient es en prot eínas I NK4 son propensos a t ener desórdenes hem at opoiét icos. La
alt eración frecuent e de p15 en t um ores hem at opoiét icos hum anos y m urinos, sugiere
que la ausencia de est a prot eína podría predisponer a la t ransform ación m aligna en
est as células hem at opoiét icas. p18 act úa com o supresor t um oral o regula la
hom eost asis celular dependiendo del t ej ido y t ipo celular ( Franklin et al., 1998; Lat res
et al., 2000) .
Rat ones deficient es en p19 no desarrollan t um ores u ot ro t ipo de desórdenes
proliferat ivos. Est os rat ones a pesar de poseer at rofia t est icular, son fért iles. Est e
fenot ipo est á asociado con un aum ent o en la apopt osis de las células germ inales, un
result ado que correlaciona con la elevada expresión de p19 en t est ículo ( Zindy et al.,
2000) .
Est udios recient es realizados en rat ones knock out para p19, dem ost raron que la
falt a de p19 increm ent a la sensibilidad celular a la m uert e apopt ót ica o aut ofágica y
sugieren un posible rol para la inducción de p19I NK4d en la quim ioprevención
10
I NTRODUCCI ÓN
( Tavera- Mendoza et al., 2006a; Tavera- Mendoza et al., 2006b) . Los rat ones doble
m ut ant es ( p18; p19) present an una incidencia t um oral sim ilar a la de los anim ales
deficient es en p18 parent ales. Est os result ados en conj unt o indicarían que p19 no es
un supresor t um oral propiam ent e dicho.
Ta bla I . Principales fenot ipos para rat ones knock out para CDK4 e I NK4
11
I NTRODUCCI ÓN
2.
M a n t e nim ie n t o de la in t e gr ida d de l ge n om a
Para asegurar la supervivencia y la propagación del genom a a lo largo de las
generaciones, las células eucariot as han desarrollado m ecanism os de respuest a al
daño o a est ruct uras anorm ales en el ADN a t ravés de vías m ult ifacét icas que
coordinan la progresión del ciclo celular con la reparación del ADN, la rem odelación de
la crom at ina, la m odificación de program as t ranscripcionales, senescencia y la m uert e
celular ( Lukas et al., 2004) .
Mient ras que, en organism os unicelulares, la respuest a a la presencia de lesiones
en el ADN act iva los punt os de cont rol y los m ecanism os de reparación, en los
organism os m ult icelulares, cuando el daño es significat ivo, una célula puede derivar al
inicio de un program a apopt ót ico ( Hahn and Weinberg, 2002; Mart in et al., 2003) . A
nivel celular, si el daño al ADN no es correct am ent e reparado, se produce inest abilidad
genóm ica, senescencia o t am bién apopt osis, la cual afect a al desarrollo de los
organism os. La pérdida de la int egridad genóm ica predispone al organism o a la
inm unodeficiencia, desórdenes neurológicos y cáncer ( O'Driscoll and Jeggo, 2002;
Pet erson and Cot e, 2004) . Es por est o que, a lo largo de la evolución, se han
seleccionado m ecanism os de respuest a al daño al ADN cada vez m ás eficient es, ya
que una respuest a efect iva conferiría un m ayor valor adapt at ivo a los organism os que
la t uvieran. Mas allá de las fuent es exógenas de daño al ADN, una célula hum ana debe
reparar m ás de 10.000 lesiones en el ADN por día generadas por acción de fuent es
endógenas ( Lindahl et al., 1993; Pet erson and Cot e, 2004) . De hecho, se ha
propuest o que la m ayor part e de la m aquinaria de reparación ha evolucionado para
reparar est e t ipo de daño ( Lindahl and Barnes, 2000; Lindahl and Wood, 1999) . El
daño al ADN act iva m ecanism os específicos de respuest a, dependiendo del t ipo de
lesión producida. Las lesiones son reparadas in sit u o rem ovidas y en general el ADN
es rest ablecido a su secuencia original ( Hoeij m akers, 2001) .
Mient ras que hast a el año 1996 t odo el conocim ient o relacionado con la respuest a
al daño al ADN provenía del est udio en levaduras ( Elledge, 1996) , en los últ im os años
se han hecho num erosos avances en el est udio de la respuest a al daño al ADN en
eucariot as superiores. Se ha vist o que las vías regulat orias de est a respuest a son
com plej as y est án alt am ent e conservadas en m am íferos. La respuest a al daño al ADN
com prende dos et apas fundam ent ales. Por un lado, la m aquinaria de los punt os de
cont rol del ciclo celular arrest a a las células en punt os específicos del ciclo para
perm it ir la reparación de las lesiones ant es de que sean convert idas en m ut aciones
perm anent es. Por ot ro lado, el sist em a de reparación propiam ent e dicho, que rem ueve
o repara el daño ( Hoeij m akers, 2001; Sandal, 2002) .
12
I NTRODUCCI ÓN
En los últ im os años, se ha delineado la hipót esis de que frent e al daño en el ADN,
adem ás de las dos acciones m encionadas ant eriorm ent e, exist e una respuest a
int egradora que involucra m ecanism os de replicación, t ranscripción y dinám ica de la
est ruct ura de la crom at ina ( Rouse and Jackson, 2002) .
2 .1
Age n t e s ge n ot óx icos
Las lesiones en el ADN pueden deberse a t res causas principales: 1) causas
endógenas: const it uidas por product os del m et abolism o celular norm al, com o las
especies react ivas de oxígeno derivadas de la respiración oxidat iva y de product os de
la peroxidación de lípidos ( Cadet et al., 1997) ; 2) causas exógenas: const it uídas por
agent es am bient ales com o: radiación ionizant e, radiación ult raviolet a y varios agent es
genot óxicos que causan m odificaciones en la est ruct ura del ADN ( Hoeij m akers, 2001) ;
3)
ot ras
causas:
uniones
quím icas
en
el
ADN
que
t ienden
a
desint egrarse
espont áneam ent e baj o condiciones fisiológicas. La hidrólisis de nucleót idos dej a sit ios
abásicos
no- inst ruct ivos.
La
deam inación
de
cit osina,
adenina,
guanina
o
5-
m et ilcit osina conviert e est as bases en las respect ivas bases no codificant es uracilo,
hipoxant ina, xant ina y t im ina ( Lindahl et al., 1993) .
Las lesiones provocadas en los m odelos experim ent ales de est a t esis son las que
se producen por causas exógenas: la radiación UVC y el cis- plat ino; y por causas
endógenas: el pépt ido
2 .1 .1
- am iloide.
Ra dia ción UV
La luz UV es una radiación elect rom agnét ica em it ida por el sol ( o por una fuent e
art ificial) , invisible al oj o hum ano. La radiación UV puede ser de t res t ipos de acuerdo
a la longit ud de onda: UVA 315- 380 nm , UVB 280- 315 nm y UVC 190- 280 nm . El
cont enido de energía de la radiación es inversam ent e proporcional a su longit ud de
onda, siendo UVC el com ponent e m ás dañino de la luz UV. Las células cont ienen
m oléculas fot osensibles, los crom óforos, que luego de recibir fot ones de radiación UV,
elevan sus elect rones hacia est ado de energía superiores ( Tyrrell, 1994) . Debido a las
est ruct uras de anillos arom át icos de sus bases, el ADN absorbe eficient em ent e las
longit udes de onda m as cort as de la luz UV, y es el principal crom óforo para la
radiación UVC ( de Gruij l and Rebel, 2008) . Los principales t ipos de lesiones producidos
por la radiación UV son los dím eros de t im idina t ipo ciclobut ano ( CPD) y los ( 6- 4) -
13
I NTRODUCCI ÓN
fot oproduct os ( 6- 4PPs) , los cuales ent recruzan bases adyacent es del ADN ( Ravanat et
al., 2001) . Est as dist orsiones en la hélice de ADN det ienen la elongación de la ARN
polim erasa, inhibiendo la expresión génica ( Tornalet t i and Hanawalt , 1999) . Est as
est ruct uras generan, adem ás, el at ascam ient o de horquillas de replicación en est os
sit ios ( Squires et al, 2004)
2 .1 .2
Cis- pla t in o
El cis- plat ino es uno de los agent es ant it um orales m ás pot ent es ut ilizado, con
fines t erapéut icos, para una am plia variedad de t um ores sólidos. Su m odo de acción
cit ot óxico
es m ediado
por
su
int eracción
con
el
ADN para
form ar
aduct os,
principalm ent e de ent recruzam ient o int racat enario, los cuales act ivan varias vías de
t ransducción de señales, incluyendo aquellas que involucran a ATR, p53, p73 y MAPK
( Siddik, 2003) .
2 .1 .3
El
Pé pt ido β- a m iloide
pépt ido
- am iloide
es
la
m olécula
causant e
de
enferm edades
neurodegenerat ivas com o el Alzheim er, y es el principal com ponent e de las placas
seniles ( Kim et al., 2003) . Los m ecanism os involucrados en su acción neurot óxica no
son t ot alm ent e conocidos, a pesar de que hay una gran variedad de evidencias que
sugieren la part icipación del est rés oxidat ivo ( Markesbery, 1997; Miranda et al., 2000;
Sm it h et al., 2000) . El est rés oxidat ivo increm ent a los niveles de iones m et álicos, los
cuales aceleran la form ación de radicales libres ( Suh et al., 2000; Thom pson et al.,
1988) , increm ent a la oxidación de lípidos ( But t erfield et al., 1994; Schippling et al.,
2000) , prot eínas ( Aksenov et al., 1997; Sm it h et al., 2000) y ADN ( Lovell et al.,
1999) .
3.
Pu n t os de con t r ol de da ñ o
La respuest a al daño al ADN com prende una serie de vías de t ransducción de
señales que int egran diferent es procesos, com o la progresión del ciclo celular, la
replicación, la reparación del ADN, la senescencia y la m uert e celular.
14
I NTRODUCCI ÓN
Para preservar la int egridad del genom a, los organism os eucariot as poseen
m ecanism os de vigilancia, llam ados punt os de cont rol o checkpoint s. Est os punt os de
cont rol det ect an t ant o lesiones en el ADN causadas por product os del m et abolism o
celular com o por agent es genot óxicos ext ernos. Los checkpoint s son vías de
t ransducción
de
señales
conform adas
por
m oléculas
sensoras,
m ediadoras,
t ransduct oras y efect oras ( Norburry and Zhivot ovsky,2004; Zhou and Elledge, 2000) .
Las prot eínas sensoras det ect an la presencia de daño o de est ruct uras aberrant es en
el ADN y t ransform an est os est ím ulos en señales bioquím icas que m odulan las
funciones de sus prot eínas blanco río abaj o. Las prot eínas m ediadoras reciben est as
señales y act ivan a los t ransduct ores de la señal. Est as prot eínas, al act ivarse,
am plifican las señales que reciben de los m ediadores y las t rasladan a los efect ores,
los cuales llevan a cabo una variedad de act ividades que incluyen el arrest o del ciclo
celular en las fases G1, S o G2.
Figu r a I V. Punt os de cont rol ( checkpoint s) del ciclo celular.
Com o principales reguladores de la respuest a al daño al ADN se han descript o las
prot eínas quinasas relacionadas a la fosfat idil - inosit ol 3 quinasa ( PI KKs) , ent re ellas
se incluyen: at axia- t elangiect asia m ut at ed ( ATM) y ATM and RAD3- relat ed ( ATR)
( Khanna et al., 2001; Rot m an and Shiloh, 1998; Niida and Nakanishi, 2006) . ATM y
ATR com part en varias sim ilit udes bioquím icas y funcionales. Am bas son quinasas de
alt o peso m olecular ( 350kDa y 301kDa para ATM y ATR, respect ivam ent e) con alt a
15
I NTRODUCCI ÓN
hom ología en sus secuencias y con una preferencia de fosforilación de serinas o
t reoninas
seguidas
de
glut am ina.
Est as
quinasas
t ienen
com o
sust rat os
de
fosforilación prot eínas que prom ueven el arrest o del ciclo celular, la reparación del
ADN, la senescencia o la m uert e celular. ( Brown and Balt im ore, 2000; Cort ez et al.,
2001; de Klein et al., 2000)
3 .1 Pa r t icipa n t e s e n la r e spu e st a a l da ñ o a l AD N
3 .1 .1 Se n sor e s
La ident idad de los sensores del daño al ADN no est á aún com plet am ent e
dilucidada. Sin em bargo, varios est udios han dem ost rado que el com plej o 9- 1- 1
( form ado por RAD9, RAD1, HUS1) de la fam ilia PCNA- like y RAD17 y RFC2- 5 de la
fam ilia de prot eínas RFC- like son fact ores esenciales para prom over las señales de los
checkpoint s ( Niida and Nakanishi, 2006) . Una vez producido el daño, el com plej o
9- 1- 1 es reclut ado a est os sit ios por el com plej o RAD17. Luego, el com plej o 9- 1- 1
facilit aría el reclut am ient o de sust rat os específicos al sit io de daño para ser
fosforilados por las quinasas ATM y ATR ( Abraham , 2001) . Sum ado a est os com plej os,
se ha descript o el com plej o MRN ( com puest o por MRE11/ RAD50/ NBS1) involucrado en
el sensado de rot uras de doble cadena ( DSBs) ( Pet rini and St racker, 2003) . La
int eracción del com plej o MRN con la lesión de t ipo DSBs reclut a ATM ( Lukas et al.,
2003) .
El com plej o MRN- ATM act iva señales que culm inan en el rearreglo de la crom at ina
que cont iene al daño. Est as señales incluyen la fosforilación de H2AX m ediada por
ATM, que luego perm it irá el anclaj e de prot eínas m ediadoras. Adem ás, est e com plej o
es necesario para iniciar la resección del DSB y dar lugar a una cadena sim ple de ADN
( ssADN) , int erm ediario necesario para la reparación por recom binación hom óloga y
t am bién para act ivar la vía de ATR. ( Adam s et al., 2006; Cuadrado et al., 2006;
Jazayeri et al., 2006; Myers and Cort ez, 2006)
La resección en la reparación de los DSB t am bién requiere de la act ividad de CDKs
y est á rest ringida a las fases S y G2 del ciclo celular ( Jazayeri et al., 2006) Una vez
generado el ssADN es cubiert o por la prot eína RPA que facilit a el reclut am ient o de
ATR- ATRI P.
16
I NTRODUCCI ÓN
3 .1 .2
M e dia dor e s
Est án const it uidos por prot eínas que son reclut adas a los sit ios de daño, com o
MDC1, 53BP1, BRCA1, claspina y Brit 1/ Mcph1 ( Bart ek and Lukas, 2003; Pet rini and
St racker, 2003) . A diferencia de las prot eínas sensoras, que se acum ulan en los sit ios
de daño de una m anera ATM independient e, el reclut am ient o de est as prot eínas
m ediadoras a los foci de daño depende de la fosforilación de H2AX por ATM ( Lukas et
al., 2004)
3 .1 .3
Tr a n sdu ct or e s
ATM y ATR funcionan com o prot eínas quinasas apicales de los punt os de cont rol
( Abraham , 2001; Shiloh, 2003) . En general ATM responde principalm ent e a las
lesiones de t ipo DSBs, m ient ras que ATR es act ivada por ssADN y horquillas de
replicación at ascadas ( Bart ek and Lukas, 2007; Shiloh, 2003) . ATM se encuent ra en
form a de dím ero inact ivo en ausencia de daño. Cuando es reclut ada a los DSBs, se
disocia y se aut ofosforila en m últ iples residuos necesarios para la correct a act ividad
de la enzim a en hum anos ( Bakkenist and Kast an, 2003; Jazayeri et al., 2006; Kozlov
et al., 2006) . En cuant o a ATR, no se observa un cam bio en la act ividad quinasa de la
enzim a y se sugiere que podría est ar consit ut ivam ent e act iva pero que su función
sería dependient e de su ubicación subcelular. ATR en células hum anas form a un
com plej o con ATRI P ( ATR- int eract ing prot ein) que ha sido descript o com o un pot encial
com pañero regulat orio. La act ividad t ant o de ATM com o de ATR involucra el
reclut am ient o de las m ism as a los sit ios de lesión en el ADN a t ravés de los m ot ivos
conservados en los C- t erm inales de Nbs1 y ATRI P respect ivam ent e ( Zou L. Et al,
2002) . Est os m ot ivos conservados son crít icos para el reclut am ient o y t am bién para
los event os de señalización que gobiernan la m aquinaria de la respuest a al daño al
ADN ( DDR, DNA Dam age Response) . El descubrim ient o de los m ot ivos conservados
sugiere sim ilit udes no esperadas ent re las principales PI KKs involucradas en el DDR y
m uest ra que sus m ecanism os de acción en las et apas t em pranas de los checkpoint s
est án m ás conservados de lo que previam ent e se pensaba. ( Falck et al., 2005; You et
al., 2005) .
Las cascadas de fosforilaciones iniciadas por las PI KKs son am plificadas por las
serina/ t reonina quinasas Chk1 y Chk2. Chk2 es una prot eína est able que se expresa a
lo largo del ciclo celular ( Lukas et al., 2001) . Chk2 es inact iva en ausencia de daño y
es act ivada principalm ent e por ATM en respuest a DSBs. Su act ivación involucra
dim erización y aut ofosforilación. En cont rast e, Chk1 es una prot eína lábil rest ringida a
17
I NTRODUCCI ÓN
las fases S y G2 del ciclo celular, est á act iva aún en células sin pert urbar y, a pesar de
que es adicionalm ent e act ivada por ATR en respuest a al daño por UV o al est rés
replicat ivo, no requiere de dim erización o aut ofosforilación. Originalm ent e se relacionó
la act ivación de Chk1 por ATR y de Chk2 por ATM, sin em bargo, est e concept o ha sido
m odificado por t rabaj os que dem uest ran la exist encia de varios ent recruzam ient os o
crosst alks ent re est as quinasas, ej em plificado por la fosforilación/ act ivación de Chk1
por ATM en respuest a a las radiaciones ionizant es ( Gat ei et al., 2003; Sorensen et al.,
2003) .
3 .1 .4
Efe ct or e s
Las prot eínas efect oras const it uyen un am plio y diverso grupo com puest o por
reguladores del ciclo celular, prot eínas de la m aquinaria de reparación del ADN,
com ponent es y reguladores de la crom at ina y la apopt osis. Luego de su act ivación,
Chk1 y Chk2 fosforilan a sus genes blanco efect ores río abaj o y propagan la
señalización de la respuest a al daño. Chk2 fosforila a las prot eínas BRCA, PI K3, Pm l y
E2F- 1, m ient ras que Chk1 fosforila a Tlk1/ 2. Am bas quinasas com part en sust rat os y
fosforilan a Mdm 2, p53, cdc25A y Cdc25C. ( Bart ek and Lukas, 2003; Donzelli and
Draet t a, 2003; Jazayeri et al., 2006; Shiloh, 2003; St ucki and Jackson, 2006) ( Zhou
and Elledge, 2000) .
3 .2
Ch e ck poin t s G1 , S y G2
Com o fue m encionado ant eriorm ent e, se denom ina checkpoint s a las cascadas de
t ransducción de señales que sensan daños en el ADN, prom ueven el arrest o del ciclo
celular dando t iem po para que la reparación ocurra y act ivan la m uert e celular o la
senescencia si el daño escapa a las posibilidades de reparación. Los checkpoint s son
m ecanism os de cont rol, ext ernos al ciclo celular, que no son requeridos para la
progresión del m ism o. Una caract eríst ica fundam ent al de un checkpoint es que su
act ividad no se m anifiest a en ausencia de errores en el ADN y solo cuando surgen
condiciones de est rés donde es alt am ent e probable la aparición de lesiones, los
checkpoint s result an herram ient as esenciales para la sobrevida ( Khodj akov and
Rieder, 2009) . Est o no im plica que est én inact ivos en ausencia de errores, com o
m uchas veces es sugerido
cuando,
frent e a
un
t rat am ient o,
se describe la
¨ act ivación¨ o el ¨ disparo¨ de un checkpoint . Com o el rol de un punt o de cont rol es
18
I NTRODUCCI ÓN
det ect ar un problem a, el m ecanism o de m onit oreo t iene que est ar act ivo ant es de que
el problem a surj a.
3 .2 .1
Che ck poin t G1
Luego de daño genot óxico, ATM/ ATR act ivas fosforilan direct am ent e el fact or de
t ranscripción p53, que t am bién es blanco de Chk1 y Chk2. La ligasa de ubiquit ina
MDM2, que norm alm ent e se une a p53 asegurando su degradación, t am bién es
fosforilada por ATM/ ATR luego del daño y por Chk2/ Chk1. Est o cont ribuye a la
acum ulación de p53 y al aum ent o de su act ividad com o fact or de t ranscripción. En
consecuencia, aum ent a el nivel de p21Cip1 causando un arrest o en G1. Est e hecho,
no sólo im pide el inicio de la sínt esis de ADN, sino que t am bién preserva la vía Rb/ E2F
en su form a act iva, supresora del crecim ient o, causando un bloqueo sost enido en G1
( Kast an and Bart ek, 2004; Massague, 2004) . En G1 t ardía, com o respuest a a un
est rés genot óxico y por las act ividades aum ent adas de Chk1 y Chk2, se produce la
degradación de CDC25A, una fosfat asa necesaria para la progresión de G1 a S que
act iva CDK2 por rem oción de dos fosfat os inhibit orios. Com o consecuencia de est a
degradación se inhiben los com plej os ciclina E( A) / CDK2. El checkpoint de Chk1/ Chk2CDC25A es im plem ent ado rápidam ent e, independient em ent e de p53, y ret rasa la
t ransición G1/ S ( Bart ek and Lukas, 2003; Donzelli and Draet t a, 2003) .
3 .2 .2
Che ck poin t S
EL arrest o en la fase S es iniciado cuando horquillas de replicación quedan
at ascadas a causa del ADN dañado ( Bart ek et al., 2004) . Las funciones de est e
checkpoint son dos: por un lado, inhibir la iniciación de la replicación a part ir de
orígenes nuevos y, por ot ro,
prot eger la int egridad de las horquillas at ascadas
perm it iendo la recuperación de la progresión del ciclo celular luego de la reparación
del ADN. Los com ponent es claves de est a m aquinaria son la prot eína RPA, el com plej o
ATR- ATRI P, la prot eína m ediadora claspina, RAD17 y el com plej o ( 9- 1- 1) .
El checkpoint int ra- fase- S: es act ivado por DSBs generados en los loci genóm icos
ext ernos a los replicones act ivos ( Bart ek et al., 2004) . La caract eríst ica fundam ent al
que diferencia est e cont rol del ant erior es su independencia de las horquillas de
replicación. En est as células, Chk1 o Chk2 fosforilan a CDC25A induciendo su
degradación y la post erior inact ivación del com plej o ciclina E/ CDK2. Est e event o
19
I NTRODUCCI ÓN
im pide la unión de CDC45 ( prot eína esencial para la iniciación de la replicación) al
origen de replicación produciendo el arrest o en la fase S ( Bart ek et al., 2004) .
3 .2 .3
Che ck poin t G2
Est e cont rol im pide que las células inicien m it osis cuando sufren daño en el ADN
durant e G2, o cuando pasan por G2 con algún daño no reparado inflingido durant e las
fases previas S o G1. El blanco crít ico es la act ividad de CDK1. La fosfat asa CDC25 es
necesaria para la act ividad de CDK1 en G2. Luego de est rés genot óxico, Chk1 y Chk2
act úan fosforilando CDC25, que result a ubiquit inada y degradada inhibiendo CDK1
arrest ando el ciclo en la fase G2 ( Guardavaccaro and Pagano, 2006) .
Figu r a V. Los principales t ransduct ores de la señal que siguen a la act ivación de ATM / ATR y el
sit io en el cuál im pact an en la progresión del ciclo celular. ( Adapt ado de Shiloh Y. et
al., 2003) .
20
I NTRODUCCI ÓN
4 . Sist e m a s de Re pa r a ción
Los punt os de cont rol sensan el daño, arrest an el ciclo celular y, a su vez, act ivan
los sist em as de reparación que represent an la segunda part e fundam ent al de la
respuest a al daño al ADN.
Frent e a la gran variedad de lesiones, a lo largo de la evolución, se han
desarrollado varios sist em as de reparación del ADN, que en conj unt o cubren la m ayor
part e de las lesiones sufridas en la inform ación genét ica de una célula. Cuál de los
sist em as de reparación es act ivado en respuest a al daño depende t ant o del t ipo de
lesión com o de la fase del ciclo celular en la cual ocurra ( Branzei and Foiani, 2008) .
Los principales m ecanism os de reparación descript os hast a el m om ent o que
operan en m am íferos son los siguient es: la reparación por escisión de nucleót idos
( nucleot ide excision repair, NER) , la reparación por escisión de base ( base excision
repair, BER) , reparación por recom binación hom óloga y no hom óloga ( hom ologous
recom binat ion HR, Non- hom ologous end j oining NHEJ) y la reparación de los errores
de apaream ient o ( m ism at ch repair, MMR)
4 .1
Re pa r a ción por Escisión de N u cle ót idos ( N ER)
Est e m ecanism o de reparación est á dest inado a reparar lesiones que dist orsionan
la est ruct ura helicoidal del ADN. Ent re los agent es que provocan est e t ipo de
alt eraciones
se
incluyen
la
radiación
UV,
quím icos
m ut agénicos
y
drogas
quim iot erapéut icas que form an aduct os en el ADN ( Leibeling et al., 2006) . En est e
m ecanism o han sido ident ificadas dos subvías que t ienen, en part e, dist int as
especificidades de sust rat o. Est as dos subvías se denom inan: reparación global del
genom a ( global genom e repair, GGR) , la cual es responsable de la reparación de
lesiones en las zonas no t ranscript as del genom a que dist orsionan su est ruct ura, y
reparación acoplada a la t ranscripción ( t ranscript ion- coupled repair, TCR) , que act úa
sobre los genes act ivos t ranscripcionalm ent e, reparando los daños que bloquean la
elongación de la ARN polim erasa ( Bat t y and Wood, 2000; de Laat et al., 1999;
Hoeij m akers, 2001; Mit chell et al., 2003; Tornalet t i and Hanawalt , 1999)
En am bos casos, la reparación de la lesión involucra los m ism os pasos,
except uando la det ección del daño. Luego del reconocim ient o de la lesión, ocurre el
reclut am ient o del com plej o TFI I H con act ividad helicasa que abre una región de
aproxim adam ent e 30 nucléot idos alrededor de la lesión, a cont inuación son reclut adas
21
I NTRODUCCI ÓN
las endonucleasas ERCC1- XPF y XPG que generan las incisiones en 5´ y 3´ y por
últ im o, la sínt esis y ligación de la nueva secuencia de ADN sint et izada ( Figu r a VI ) .
Figu r a VI . Mecanism o de reparación por NER genóm ico global ( GG- NER) y NER acoplado a
t ranscripción ( TCR- NER) . ( Jan Hoeij m akers, NATURE Vol 411, 17 May o 2001.)
22
I NTRODUCCI ÓN
4 .2
Re pa r a ción por Escisión de Ba se ( BER)
La vía de reparación BER es responsable de la reparación de las bases oxidadas y
alquiladas, así com o t am bién de los sit ios abásicos generados por depurinación
espont ánea. En general, las lesiones que son sust rat o de BER incluyen aquellas que no
dist orsionan el esquelet o de ADN suficient em ent e com o para det ener las horquillas de
replicación. En consecuencia, la inact ivación de BER puede ser alt am ent e m ut agénica.
La lesión m ás prevalent e y alt am ent e m ut agénica que debe ser corregida por BER es
la base oxidada, 8- oxo guanina ( t am bién conocida com o 8- oxoG o 8- oxo- 7,8dihidroguanina) , que puede aparearse t ant o con cit osina o adenina. Si no es
det ect ada, 8- oxoG result a en una t ransversión de G: C a T: A, que es la segunda
m ut ación m ás com ún hallada en cánceres hum anos .
Las enzim as m ás im port ant es en el BER son las ADN glicosilasas. Est as enzim as
rem ueven las bases m odificadas o dañadas, y luego el sit io apurínico o apirim idínico
( AP) es rem ovido por una AP endonucleasa, la p- desoxirribosa result a escindida por
una fosfodiest erasa. Por últ im o, el fragm ent o falt ant e es sint et izado por una ADN
polim erasa y la hebra es unida por una ligasa ( Bruner et al., 2000; Klungland et al.,
1999) ( Figu r a VI I ) .
4 .3
M ism a t ch Re pa ir ( M M R)
El rol principal del m ecanism o MMR es el de reparar apaream ient os falt ant es o
incorrect os causados por pequeñas deleciones o inserciones que se generan durant e la
replicación del ADN y la recom binación hom óloga. En eucariot as, los apaream ient os
incorrect os producidos durant e la replicación son reconocidos por los het erodím eros
MSH2/ MSH6 y MSH2/ MSH3. El prim ero reconoce principalm ent e apaream ient os
incorrect os ent re bases y el segundo loops de inserción o deleción. A est os
het erodím eros se les une un t ercero, MLH1/ PMS2, form ando un com plej o que
prom ueve la reparación por su act ividad nucleolít ica conduciendo a la escisión del
apaream ient o erróneo ( Kadyrov et al., 2009) . En el paso siguient e, la hebra es
nuevam ent e sint et izada y los fragm ent os de ADN son ligados ( Fleck and Nielsen,
2004) .
23
I NTRODUCCI ÓN
Figu r a VI I . Mecanism os de reparación de la vía BER. ( Modificado de Jan Hoeij m akers, NATURE
Vol 411, 17 May 2001.)
4 .4
M e ca n ism o de r e pa r a ción por Re com bin a ción H om óloga ( H R)
El m ecanism o de recom binación hom óloga part icipa en la reparación de los daños
al ADN de t ipo doble cadena. Es un m ecanism o que act úa libre de errores puest o que
ut iliza un t em plado hom ólogo en el proceso de reparación. La recom binación
hom óloga parece dom inar durant e las fases S y G2, m om ent o en que el ADN est á
24
I NTRODUCCI ÓN
duplicado, proveyendo una copia fiel de la secuencia que es la crom át ida herm ana,
para alinear los daños ( Sung and Klein, 2006) .
El com plej o MRN part icipa en el reconocim ient o del DSB y en el procesam ient o de
los ext rem os de ADN. El com plej o Ct I P- BRCA1- BATD1 coopera con el com plej o MRN
en la rem oción de nucleót idos que generan una secuencia de ssADN. A est a secuencia
sim ple cadena se le une la prot eína RPA para im pedir la form ación de est ruct uras
secundarias en el ADN. En el sit io se acum ula, adem ás, BRCA2 que a su vez prom ueve
la unión de RAD51 en el ext rem o 5´ libre. Rad51 encuent ra la secuencia hom óloga
que se ut ilizará en la reparación del daño ( Hart lerode and Scully, 2009) .
Exist en varias vías de reparación por recom binación hom óloga describiéndose
com o principales la vía SDSA ( por synt hesis- dependent st rand annealing) y la vía
DSBR ( por double- st rand break repair) . En am bos m odelos se observa invasión de una
secuencia de 32 nucleót idos en la secuencia hom óloga. En general est a secuencia se
encuent ra en la crom át ida herm ana, y com ienza la ext ensión de la hebra ent rant e por
polim erasas de ADN, rest aurando la inform ación genét ica en el sit io de la lesión. Las
vías SDSA y DSBR varían en el m odo de resolución del event o de reparación. Mient ras
que en la vía DSBR exist e int ercam bio de fragm ent os de ADN ent re el sit io original de
daño y la secuencia hom óloga t ant o de t ipo non- crossover com o crossover, en la vía
SDSA la hebra nueva, sint et izada a part ir de la secuencia hom óloga, se desplaza luego
a su sit io original sin int ercam bio de fragm ent os ent re los dos sit ios ( Sung and Klein,
2006) ( Figu r a VI I I ) .
4 .5
M e ca n ism o de r e pa r a ción por u n ión de e x t r e m os n o h om ólogos
( N H EJ)
El m ecanism o de reparación por unión de ext rem os no hom ólogos es ot ra vía
involucrada en la reparación de DSBs, y result a de part icular im port ancia en la fase
G0, G1, y en la fase S t em prana del ciclo celular cuando aún no fue duplicado el
m at erial genét ico. El m ecanism o de NHEJ involucra la religación de dos ext rem os de
ADN y, debido a que est a reacción no es reguiada por un ADN m olde, es propensa a
com et er errores ( Delacot e and Lopez, 2008) . Los ext rem os de ADN form ados por las
DSBs reclut an el het erodím ero de Ku ( Ku70/ 80) y luego la quinasa ADN- PKcs j unt o
con ot ras prot eínas que procesan el ADN y generan ext rem os adecuados para la
ligación. Finalm ent e, el com plej o X4- L4 j unt o con XLF liga los ext rem os sellando la
rot ura. ( Hart lerode and Scully, 2009) ( Figur a I X ) .
25
I NTRODUCCI ÓN
Figu r a VI I I . Repar ación de rot uras doble cadena por m ecanism o de recom binación
hóm ologa ( DSBR y SDSA) . ( Modificado de Pat rick Sung y Hannah Klein,
Oct . 2006, Mol.Cell Biol., vol. 7., 739- 750.)
26
I NTRODUCCI ÓN
F igu r a I X . NHEJ en m am íferos. ( Adapt ado de Andrea J. HARTLERODE and Ralph SCULLY
Biochem . J. ( 2009) 423, 157–168.)
27
I NTRODUCCI ÓN
A m odo de resum en, en la siguient e figura se represent an las vías de respuest a al
daño al ADN y los m ecanism os involucrados.
Figu r a X. Vías de respuest a al daño al ADN. ( Modificado de Zhou y Elledge, 2000; Hoeij m akers,
2001 y Shiloh, 2003.)
28
OBJETI VOS
e H I PÓTESI S
OBJETI VOS e HI PÓTESI S
Los cuat ro m iem bros de la fam ilia I NK4 poseen una est ruct ura sim ilar y son
igualm ent e pot ent es com o inhibidores de CDK4/ 6. Sin em bargo, y a pesar de est e
papel redundant e, son diferencialm ent e expresados en el desarrollo y, en t érm inos de
funciones biológicas, se ha observado la part icipación de diferent es m iem bros de la
fam ilia en dist int os procesos fisiológicos com o la diferenciación y senescencia celular.
Adem ás, algunas I NK4 est án ausent es o inact ivadas por m ut aciones en diversos t ipos
de cánceres, represent ando supresores t um orales o candidat os a serlo. Por ot ra part e,
la gran diversidad en su pat rón de expresión, sugiere que est a fam ilia de inhibidores
del ciclo celular podría t ener funciones específicas de t ej ido o de t ipo celular.
Obj e t ivo Ge n e r a l
El obj et ivo general plant eado en est e t rabaj o consist ió en est udiar la part icipación
de p19I NK4d en la respuest a celular al daño genot óxico y su m ecanism o de acción.
A part ir de est e obj et ivo general se desprendieron los siguient es obj et ivos
específicos.
Obj e t ivos Espe cíficos
1-
Est udiar la part icipación de la prot eína p19I NK4d en la reparación del ADN.
2-
Analizar la fosforilación com o m ecanism o de act ivación de p19I NK4d frent e al
daño al ADN.
3-
Det erm inar la relevancia fisiológica del proceso de fosforilación de p19I NK4d en
respuest a a genot óxicos.
4-
Analizar prot eínas int eract oras de p19I NK4d ligadas a su función en la reparación
del daño.
30
OBJETI VOS e HI PÓTESI S
H ipót e sis
La célula responde al daño en el ADN act ivando una serie de procesos
coordinados
que
involucran
la
progresión
del
ciclo
celular,
program as
t ranscripcionales, la reparación del ADN, el rem odelam ient o de la crom at ina y la
m uert e celular.
Post ulam os que p19I NK4d part icipa de los m ecanism os involucrados en el
m ant enim ient o de la int egridad del genom a cum pliendo una función en la reparación
del ADN, independient e de su act ividad com o inhibidor del ciclo celular. Proponem os,
que est a función est á regulada por procesos de fosforilación sobre est a prot eína
relacionados a la respuest a celular act ivada frent e al daño genot óxico. Y adem ás, que
la fosforilación conduce a cam bios conform acionales en la est ruct ura de p19I NK4d,
perm it iendo su int eracción con prot eínas relacionadas con el proceso de det ección y/ o
reparación del ADN, ej erciendo de est e m odo su función en el m ant enim ient o de la
int egridad del genom a.
31
RESULTAD OS
RESULTADOS
Ca pít u lo 1 : Pa r t icipa ción de p1 9 I N K4 d e n la r e pa r a ción de l AD N
1 .1
p1 9 I N K4 d se e x pr e sa e n for m a pe r iódica e n e l ciclo ce lu la r e n
cé lu la s de Le ydig M A- 1 0
p19 se expresa en alt os niveles en órganos específicos, com o cerebro y t est ículo.
Fue report ado que rat ones deficient es en p19 present an at rofia t est icular, apopt osis
de células germ inales y m enor esperm at ogénesis. Las células de Leydig son esenciales
para la esperm at ogenesis, puest o que producen t est ost erona necesaria en est e
proceso ( Zyndy F. et al 2000, Zyndy F. et al 2001) . En est e sent ido, la ut ilización de
células derivadas de t ej ido t est icular result a un sist em a int eresant e para el est udio de
p19 y de pot encial relevancia fisiológica. En est a prim era part e del t rabaj o ut ilizam os
una línea celular est ablecida a part ir de t est ículo de rat ón, específicam ent e de células
de Leydig y denom inada Leydig MA- 10 ( MA- 10) .
La expresión periódica de p19 a lo largo del ciclo celular fue descript a en varios
t ipos celulares ( Hirai et al., 1995; Thullberg et al., 2000) . En prim er lugar, buscam os
ent onces analizar la expresión de est a prot eína en el ciclo celular del sist em a en
est udio. Para ello, las células de Leydig MA- 10 fueron sincronizadas en G0 m ediant e la
deprivación de suero por 36 horas y luego de est e t iem po, las células fueron
est im uladas a ingresar al ciclo celular por adición de m edio fresco cont eniendo 10% de
suero.
Con el obj et o de cont rolar la sincronización de los cult ivos cuant ificam os por
cit om et ría de fluj o la proporción de células en cada fase del ciclo celular a los dist int os
t iem pos luego de liberado el arrest o de la fase G0. Con los dat os obt enidos est im am os
en 24 horas la duración del ciclo celular de las células MA- 10, y det erm inam os la
duración de cada fase del ciclo de est a línea celular ( Figu r a 1 C) .
Por ot ro lado, evaluam os los niveles de ARNm de p19 por ensayos de Nort hern
blot y de prot eína p19 por West ern Blot a diferent es t iem pos. Observam os que los
niveles de ARNm de p19 com ienzan a det ect arse a las 4 horas de liberado el arrest o
del ciclo celular, período correspondient e al final de la fase G1 y que sus niveles
m áxim os se alcanzan ent re las 8 y 12 horas cuando las células ingresan y t ransit an en
la fase S, para luego dism inuir a las 24 horas, fase G2/ M. Los niveles de ARNm de p19
se observan aum ent ados a las 28 horas m om ent o en el cual las células se encuent ran
nuevam ent e en la fase G1 ( Figur a 1 A) . Los niveles de prot eínas observados a lo largo
del ciclo celular m uest ran correlación con la cinét ica del ARNm de p19 ( Figu r a 1 B) .
33
RESULTADOS
En conclusión, y com o fue descript o para ot ros t ipos celulares, la expresión de
p19, t ant o el ARNm com o la prot eína, en células de Leydig MA- 10, result an ser
periódicas, com enzando su expresión en la fase G1, observándose su m áxim a
expresión en la fase S para luego ir dism inuyendo durant e las fases G2 y M cuando
ocurre la división celular.
Figur a 1 . Ex pr e sión de p1 9 dur a nt e la pr ogr e sión de l ciclo celula r . Las células MA- 10 fueron
incubadas en m edio sin suero por 36 horas para est ablecer un est ado de quiescencia, luego fueron
est im uladas para reent rar al ciclo celular en form a sincronizada por agregado de suero. ( A) ARN t ot al
( 20μg) ext raído de células a part ir de los t iem pos indicados fueron analizados por Nort hern blot con
las sondas m arcadas con P32 indicadas en el m argen izquierdo. ( B) Niveles de prot eína p19 a lo largo
del ciclo. p19 fue inm unoprecipit ada a part ir de las diferent es m uest ras y los com plej os inm unes
analizados por West ern blot . Se m uest ra una banda represent at iva de nivel de carga de prot eínas en
la inm unoprecipit ación. β- t ub, β- t ubulina; CB, coom asie blue ( C) Las fases y la duración del ciclo
celular fueron det erm inadas m ediant e cit om et ría de fluj o. En la t abla se indica la cant idad de células
en porcent aj e.
34
RESULTADOS
1 .2
La e x pr e sión de p1 9 I N K4 d e s in du cida por r a dia ción UV
La hipót esis de est e t rabaj o sugiere la part icipación de p19 en la respuest a celular
disparada por daño genot óxico. Si est a hipót esis result ara correct a, una de las
posibilidades que surge es la de un cam bio en los niveles de expresión de p19 luego
de inducir el daño al ADN, hecho que fue descript o para una am plia gam a de
prot eínas, com o por ej em plo p21Cip1 ( Fot edar et al., 2004) .
Com o prim er abordaj e, ut ilizam os radiación UVC que genera predom inant em ent e
dím eros de pirim idinas de t ipo ciclobut ano ( CPD) y fot oproduct os pirim idina ( 6- 4)
pirim idona. Las células MA- 10 fueron irradiadas con diferent es dosis de luz UVC ( 4 , 8
y 12 m J / cm 2 ) y 24 horas luego del daño fueron evaluados los niveles de ARNm de
p19. Encont ram os efect ivam ent e que lo niveles de ARNm de p19 result an inducidos
por luz UV con un increm ent o significat ivo a part ir de una dosis de 4 m J/ cm 2 ( Figur a
2 ) . Com o cont rol de la efect ividad del daño evaluam os los niveles de ARNm de
p21Cip1, observando, com o era esperado, un increm ent o significat ivo en función del
daño aplicado.
Evaluam os adem ás, la inducción de p19 en función del t iem po, a las 12, 24 y 48
horas luego de la irradiación con UV. Observam os un aum ent o t ransit orio en los
niveles de ARNm de p19 ent re las 12 y 24 horas post eriores al daño y que
correlacionan con un aum ent o en los niveles prot eicos de la m ism a ( Figu r a 3 A y B) .
Con el obj et o de det erm inar si el efect o de UV es un event o general y no una
observación de est a línea celular en part icular, est udiam os la expresión de p19 en
ot ras líneas celulares de dist int o origen. En est e est udio em pleam os cult ivos prim arios
de células de Leydig de rat a, fibroblast os de ham st er BHK- 21 y fibroblast os hum anos
WI - 38. Para los t res t ipos celulares, se observó inducción de p19 con una dosis de 4
m J/ cm 2 ( Figu r a 4 )
Est os result ados dem uest ran que la expresión de p19 es inducida en respuest a al
daño genot óxico provocado por luz UV, sugieren que est e aum ent o est aría dado por
una regulación a nivel t ranscripcional y que represent a un respuest a celular general
no ligada a un t ipo celular específico.
35
RESULTADOS
Figur a 2 . Efe ct o de la dosis de r a dia ción UV e n la e x pr e sión de p1 9 . Células MA- 10 fueron
irradiadas con las dosis de UV indicadas y cosechadas luego de 24 horas de irradiación. ARN t ot al ( 20
μg) de los lisados celulares fueron analizados por Nort hern blot con las sondas m arcadas con
32
P
indicadas en el m argen izquierdo. La figura es represent at iva de 2 ensayos independient es.
Figur a 3 . Ex pr e sión de p1 9 e n función de l t ie m po lue go de da ño por UV. ( A) Células MA- 10
fueron irradiadas con 8 m J/ cm 2 de UV y cosechadas luego de 24 horas del daño. ARN t ot al ( 20 μg) de
los lisados celulares fue analizado por Nort hern blot con las sondas m arcadas con P32 indicadas en el
m argen izquierdo. ( B) La expresión de la prot eína p19 fue analizada por West ern blot . La figura es
represent at iva de 2 ensayos independient es.
36
RESULTADOS
Figur a 4 . I nducción de la e x pr e sión de p1 9 por UV e n dist int os t ipos ce lula r e s. Cult ivos
prim arios de células de Leydig, células BHK- 21 y WI - 38 fueron irradiados o no con 8 m J/ cm 2 de UV y
luego de 24 horas fueron cosechadas. ARN t ot al ( 2 0μg) de los lisados celulares fueron analizados por
Nort hern blot con las sondas m arcadas con
32
P indicadas en el m argen izquierdo. La figura es
represent at iva de 2 ensayos independient es.
1 .3
p1 9 e s la ú n ica I N K4 cu ya e xpr e sión e s in ducida por r a dia ción UV
Nos pregunt am os luego si el efect o de UV sobre p19 sería part icular de est e
inhibidor o una caract eríst ica t am bién de los dem ás m iem bros de la fam ilia I NK4. Para
est udiar est e punt o, células MA- 10 fueron irradiadas con una dosis de 8 m J/ cm 2 de UV
y, en alícuot as t om adas 12, 24 y 48 horas luego del daño, se det erm inaron los niveles
de ARNm de los cuat ro m iem bros de la fam ilia I NK4 por Nort hern Blot . Los result ados
m uest ran que ninguno de los rest ant es inhibidores, p15, p16 ó p18, varían su
expresión en respuest a al daño ( Figu r a 5 ) .
Est os result ados describen a p19 com o el único m iem bro de la fam ilia I NK4 cuya
expresión es inducida por daño genot óxico generado por radiación UV.
37
RESULTADOS
Figur a 5 . p1 9 e s e l único m ie m br o de la fa m ilia I N K4 que induce su e x pr e sión por UV .
Células MA- 10 fueron irradiadas con 8 m J/ cm 2 de UV y cosechadas luego de 24 horas de irradiación.
ARN t ot al ( 20 μg) de los lisados celulares fue analizado por Nort hern blot con las sondas m arcadas
con
32
P indicadas en el m argen izquierdo. La figura es represent at iva de 2 ensayos independient es.
1 .4
p1 9 pa r t icipa e n la r e pa r a ción de l AD N
Uno de los principales m ecanism os de defensa que se dispara en respuest a al
daño por agent es genot óxicos com o la radiación UV es la act ivación de las vías de
reparación del ADN ( Guan et al., 1996) . En base a los result ados descript os en las
figuras ant eriores post ulam os que p19, inducida luego de daño genot óxico, podría
part icipar en algún m ecanism o de reparación en respuest a al daño.
1 .4 .1
En sa yo de r e pa r a ción de l AD N por H CR
Com o prim er enfoque para analizar est a hipót esis ut ilizam os el ensayo de Host
Cell React ivat ion ( HCR) . En est e ensayo se m ide la capacidad de las células de reparar
un ADN dañado agregado exógenam ent e. La cant idad de ADN dañado que la célula
puede reparar ( ó react ivar) puede ser m edida a t ravés de la cuant ificación de un gen
report ero. En nuest ro est udio, ut ilizam os com o ADN exógeno el plásm ido pCMVCAT
que cont iene la secuencia que codifica para la enzim a cloranfenicol acet ilt ransferasa
( CAT) río abaj o del prom ot or const it ut ivo y fuert e cit om egalovirus ( CMV) . Para definir
la dosis de UV m ás adecuada para dañar el plásm ido realizam os una curva de dosis
aplicando 3 energías dist int as de UV ( 16, 32 o 64 m J/ cm 2 ) . Est os plásm idos dañados
38
RESULTADOS
fueron luego t ransfect ados en células MA- 10 y 72 horas luego de la t ransfección las
m uest ras fueron recolect adas y la act ividad CAT evaluada.
En prim er lugar, confirm am os que el t rat am ient o con UV ej ercía un daño efect ivo
en el ADN ya que la expresión de CAT cuant ificada 72 horas luego de la t ransfección
m ost ró una dism inución en función de la dosis de UV aplicada ( Figu r a 6 ) . La dosis
que seleccionam os para cont inuar con est os ensayos fue de 32 m J/ cm 2 . Est a dosis
m ost ró una act ividad dism inuida en un 50% respect o del plásm ido no dañado ( Figu r a
6 ) considerándola una diferencia adecuada para evaluar cam bios en la habilidad de
reparación de las células en los diferent es t rat am ient os y sin ser una dosis dem asiado
alt a que afect ara el plásm ido de m odo irreversible.
Figur a 6 . La dosis de 3 2 m J/ cm 2 de UV sobr e e l plá sm ido pCM VCAT e s a de cua da pa r a su
uso e n H CR. Células MA- 10 fueron co- t ransfect adas con el plásm ido pCMVCAT previam ent e irradiado
o no con dist int as dosis de UV y el vect or de referencia pCMV gal. La expresión de CAT fue
cuant ificada 36 horas luego de la t ransfección y relat ivizada con la expresión de β- galact osidasa. La
figura m uest ra la m edia ± D.E. de los valores obt enidos en dos ensayos independient es por t riplicado.
Una vez definida la dosis a ut ilizar para dañar el plásm ido, est ablecim os el t iem po
post - t ransfección necesario para evaluar la act ividad de CAT. Hicim os una curva de
t iem po t ransfect ando las células con el vect or dañado con 32 m J/ cm 2 de UV y
evaluam os act ividad a las 24, 36, 48 y 72 horas post - t ransfección ( Figu r a 7 A) . Se
observa, nuevam ent e, que el plásm ido result ó efect ivam ent e dañado ya que, a las 24
horas, la act ividad CAT es m enor en el vect or irradiado con UV respect o del vect or
cont rol. Por ot ro lado, la reparación del daño result a evident e dado que la velocidad
con la que aum ent a la act ividad de CAT del ADN dañado es m ayor que la del ADN
cont rol ( Figu r a 7 B) . El aum ent o m ás pronunciado en la act ividad relat iva de CAT del
vect or con daño indica que, no solo est a act ividad aum ent a por acum ulación en el
39
RESULTADOS
t iem po de la enzim a, sino t am bién por la reparación o react ivación de las secuencias
CAT dañadas que ahora t am bién expresan la prot eína. Elegim os el t iem po de 48 horas
para evaluar est e ensayo en los experim ent os siguient es, dónde result a evident e la
act ividad de reparación sobre el ADN exógeno. Concluim os, adem ás, que las células
de Leydig MA- 10 son un sist em a adecuado para evaluar reparación de fot olesiones por
HCR.
Figur a 7 . Ele cción de l t ie m po post e r ior a la t r a nsfe cción pa r a m e dir a ct ivida d de CAT.
Células MA- 10 co- t ransfect adas con el plásm ido pCMVCAT previam ent e irradiado o no con 32 m J/ cm 2
de UV y pCMVβgal sobre las cuales ( A) la act ividad de CAT fue det erm inada a dist int os t iem pos luego
de la t ransfección y relat ivizada con la expresión de β- galact osidasa. ( B) El result ado de ( A) fue
expresado com o porcent aj e de la act ividad de la m uest ra de 24 horas sin daño, el cual fue
est ablecido com o 100. Cada punt o represent a el prom edio +
S.E.M. de dos experim ent os
independient es realizados por duplicado.
40
RESULTADOS
Definidos los parám et ros para evaluar reparación por HCR en células de Leydig
MA- 10, buscam os analizar si la capacidad de las células de reparar el ADN result a
alt erada por m odificaciones en los niveles de la prot eína p19. Observam os que la
cot ransfección de un vect or de expresión de p19 con el plásm ido pCMVCAT dañado
aum ent a significat ivam ent e, y en form a dosis dependient e la act ividad relat iva de CAT
respect o a las células t ransfect adas solo con pCMVCAT irradiado, sugiriendo que la
habilidad de reparar el ADN es fuert em ent e increm ent ada por p19 ( Figur a 8 ) . Por el
cont rario, cuando los niveles endógenos de p19 fueron dism inuidos por expresión del
ADNc de p19 en dirección ant isent ido o por oligonucleót idos ant isent ido de est a
prot eína, se observó una dism inución significat iva de los niveles de reparación en
com paración con las células con niveles basales de p19.
Est os result ados apoyan la hipót esis de la part icipación de p19 en la reparación
del daño inducido por UV.
Figu r a 8 . D ife r e n t e s n ive le s de p1 9 m odifica n la ca pa cida d de la s cé lu la s de r e pa r a r u n
plá sm ido da ñ a do. ( A) Ensayos de HCR se realizaron en células MA- 10 t ransfect adas con 4 μg
de plásm ido pCMVCAT dañado o no dañado por UV ( 32 m J/ cm 2 ) y co- t ransfect adas con
cant idades cr ecient es del vect or de expresión para el ADNc de p19 en dirección sent ido ( p19S;
2, 4, 8 μg) o ant isent ido ( P19AS; 4 μg) o con un oligonucleót ido de p19 ant isent ido ( ASON; 2
μM) . Los result ados est án expresados com o la act ividad relat iva de CAT con respect o al vect or
report ero no dañado que fue est ablecido en un valor de 100. Las barr as repr esent an el
prom edio + S.E.M. de 3 experim ent os diferent es hechos por duplicado. El Test de St udent fue
ut ilizado para com parar la m uest ras t ransfect adas dañadas con las m uest ra cont rol. ( * P< 0,05) .
41
RESULTADOS
1 .4 .2
Est u dio de la ca pa cida d de r e pa r a ción de l AD N por UD S
Com o ya fue descript o, el m ecanism o de reparación responsable de rem over los
aduct os generados por UV en el ADN es el m ecanism o NER. El m ism o com prende dos
vías: la de reparación acoplada a t ranscripción ( TCR) , generalm ent e la m ás rápida de
las dos, la cual rem ueve el ADN dañado de las regiones t ranscribibles del genom a, y la
reparación global del genom a ( GGR) , que elim ina el daño en el rest o de la crom at ina.
Com o el ensayo de HCR involucra react ivación por la reparación de un gen
t ranscripcionalm ent e act ivo, ent onces, est e ensayo principalm ent e evalúa la vía de
reparación TCR cuando se ut iliza com o dañador luz UV ( Johnson and Lat im er, 2005) .
Ahora, de m odo de evaluar m ás en profundidad la part icipación de p19 en est e
m ecanism o de reparación, em pleam os el ensayo de ¨ Sínt esis de ADN No Program ada¨
( Unscheduled ADN Synt hesis, UDS) que m ide la capacidad celular de reparación global
del genom a ( GGR) por NER, adem ás, de la reparación por TCR. El t érm ino “ Sínt esis de
ADN No Program ada” se em plea para describir la sínt esis de ADN que ocurre fuera de
la fase S del ciclo celular, es decir, fuera de la replicación sem iconservat iva de ADN.
En est e caso, la replicación evaluada proviene del proceso de reparación por NER que
involucra la elim inación de una secuencia de ADN cont eniendo la lesión y la sínt esis de
un nuevo fragm ent o sano. Est a sínt esis puede ser det ect ada por incorporación de
H3 - t im idina en el ADN, inhibiendo previam ent e la replicación.
Para evaluar si la m odificación en los niveles de p19 afect an la capacidad de las
células de Leydig MA- 10 de reparar su propio ADN, originam os en prim er lugar,
células MA- 10 est ablem ent e t ransfect adas con el ADNc de p19 en dirección sent ido
( MA- 10p19S) para sobreexpresar p19, ó ant isent ido ( MA- 10p19AS) para dism inuir los
niveles de p19. La expresión de p19 en est as células es inducible y conducida por el
prom ot or de m et alot ioneína ( MT) por est im ulación con Zn 2+ , el cuál nos perm it e
seleccionar el m om ent o de “ encendido y apagado” de la expresión de p19 o de su
ADNc ant isent ido. Adem ás, est ablecim os cult ivos con el vect or vacío para ser
ut ilizados com o cont roles. Luego del período de selección obt uvim os varios clones
independient es que fueron am plificados. Para cada uno de est os clones evaluam os los
niveles de ARNm de p19 por Nort hern blot luego de 4 horas de inducción por Zn 2+
75 μM. El result ado de est e análisis, para el caso de las líneas que sobreexpresan p19,
m ost ró que t odos, except uando el clon 10, expresaron niveles sim ilares de inducción
de p19 ( Figu r a 9 A) . Elegim os el clon 14 para los siguient es ensayos. En el caso de los
clones que sobreexpresan el ARNm ant isent ido de p19 se observaron m ayores
diferencias. Mient ras el clon 15 no pareció reducir los niveles de ARNm de p19, los
clones 7 y 18 reduj eron m edianam ent e est os niveles, y los clones 1, 11, 17 y 21
42
RESULTADOS
reduj eron el ARNm de p19 a niveles indet ect ables ( Figu r a 9 B) . En est e caso elegim os
el clon 21 de p19 ant isent ido para cont inuar t rabaj ando.
En el análisis por UDS, las 3 líneas seleccionadas fueron incubadas por 48 horas
en m edio con 1% de suero fet al bovino, y en m edio libre de arginina, est as
condiciones generan
el arrest o del ciclo celular
necesario para cuant ificar
la
incorporación de H3 - t im idina en los sit ios de reparación sin int erferencia de event os de
replicación. Durant e las últ im as 4 horas, las células fueron incubadas con Zn 2+ con el
obj et o de inducir la expresión de p19 o p19 ant isent ido. Luego, las células fueron
irradiadas con 8 m J/ cm 2 de UV e incubadas en m edio con H3 - t im idina por 12 horas,
m om ent o en el cual fueron cosechadas y la incorporación de m arca radiact iva
cuant ificada. Observam os que la línea MA- 10p19S duplicó la incorporación de m arca
radiact iva en el ADN respect o de las células que cont ienen el vect or vacío ( MA10em pt y) , reflej ando un aum ent o en la sínt esis de ADN y consecuent em ent e en la
capacidad de reparación de est a línea ( Figu r a 1 0 A) . Por el cont rario, la sínt esis de
ADN dism inuyó significat ivam ent e en las células MA- 10p19AS dañadas por UV. Es
im port ant e dest acar que est os result ados no solo dem uest ran que la sobreexpresión
de p19 m ej ora la capacidad de las células de reparar el ADN,
sino t am bién que los
niveles endógenos de p19 son cruciales para alcanzar una respuest a com plet a al daño
al ADN, indicado por la reducción significat iva en la capacidad de reparación de la
línea MA- 10p19AS.
Figu r a
9.
An á lisis
e x pr e sión
de
p1 9
de
en
la
la s
lín ea s e st a ble s M A- 1 0 p1 9 S
y M A- 1 0 p1 9 AS. ( A) Análisis
de la expresión de p19 en los
clones
individuales
derivados
de células MA- 10 est ablem ent e
t ransfect adas con un vect or de
expresión que codifica para p19
en
dirección
10p19S)
o
sent ido
ant isent ido
( MA( MA-
10p19AS) , baj o la regulación
del
prom ot or
m et alot ioneína.
Las
de
células
provenient es de est os clones
fueron incubadas con 75μM de
ZnSO4 durant e 4 horas, fueron
cosechadas y el ARN t ot al purificado analizado por Nort hern blot .
43
RESULTADOS
Figur a 1 0 . La ca pa cida d de la s cé lula s M A- 1 0 de r e pa r a r el AD N e s de pe n die n t e de los
nive le s de p1 9 . Las líneas celulares indicadas fueron m ant enidas en m edio libre de arginina
cont eniendo 1% de suero fet al bovino durant e 48 horas, e incubadas con 75 μM de ZnSO4 durant e las
últ im as 4 horas. Luego de est e t iem po, las células fueron irradiadas con 8 m J/ cm 2 de UV, incubadas
con 1 m Ci [ 3 H] t im idina y los lisados celulares analizados por ensayos de sínt esis de ADN no
program ada ( UDS) a diferent es t iem pos. La figura m uest ra la m edia ± S.E.M de los valores obt enidos
en 3 ensayos independient es por t riplicado. El Test de St udent fue ut ilizado para com parar las
m uest ras de MA- 10p19S y
MA- 10p19AS t rat adas con UV respect o a la línea t ransfect ada
est ablem ent e con el vect or vacío, MA- 10em pt y, a las 12 horas ( * P< 0,05) . ARN t ot al fue purificado de
las células irradiadas o no irradiadas y suj et o a Nort hern blot ut ilizando una sonda específica para p19
hum ano y β- t ubulina. La figura es represent at iva de 3 ensayos independient es.
1 .4 .3
An á lisis de r e pa r a ción de l AD N por r e m oción de CPD s
Para confirm ar los result ados obt enidos con la aplicación de la t écnica de UDS,
ut ilizam os un m ét odo alt ernat ivo para evaluar la reparación global del genom a. Com o
fue m encionado con ant erioridad, el daño por UV induce en el ADN lesiones del t ipo
dím eros de pirim idinas, ent re ot ras, que son elim inadas por el m ecanism o de
reparación NER. Evaluam os ahora la capacidad de las células de elim inar est os
dím eros de pirim idina ( cyclobut ane pyrim idine dim ers, CPDs) ut ilizando un ant icuerpo
de reconocim ient o específico para los dím eros form ados ent re t im inas, o ent re t im inas
44
RESULTADOS
y cit osinas. Em pleam os las 3 líneas est ables ya descript as para det erm inar la
capacidad, que t iene cada una de ellas, en la rem oción de CPDs en función del t iem po.
Los clones est ables derivados de células MA- 10 fueron incubados por 4 horas con
Zn 2+ , irradiados con una dosis de UV de 8m J/ cm 2 y luego incubados a diferent es
t iem pos para perm it ir la reparación. El ADN de las células dañadas fue aislado y
exam inado para det erm inar la presencia de lesiones CPDs por inm unoslot blot , usando
un ant icuerpo específico para las est ruct uras m encionadas. La cant idad inicial de
daño, det erm inada por la banda del t iem po cero en las m uest ras irradiadas, fue
aproxim adam ent e igual en las 3 líneas celulares evaluadas. Observam os que, en las
células MA- 10em pt y, el 40% del daño inicial result a rem ovido luego de 12 horas de
generado. Por su part e, en la línea MA- 10p19S se observa una t asa de reparación
llam at ivam ent e m ás veloz, alcanzando el m ism o nivel de reparación 4 horas ant es que
la línea cont rol ( Figu r a 1 1 A y B) . Por el cont rario, la línea MA10p19AS present ó una
t asa de reparación m enor, m ant eniendo un 68% del daño inicial luego de 12 horas. En
est e m ism o t iem po, las células cont rol dism inuyeron los niveles de daño a un 58% , y
la línea con sobreexpresión de p19 observó la m ayor t asa de reparación con un 38%
rem anent e del daño inicial.
Figu r a 1 1 . p1 9 e s n ece sa r ia pa r a una e lim ina ción m á s e ficie nt e de la s le sione s CPD . Se
evaluó la presencia de lesiones CPD en líneas celulares MA- 10em pt y, MA- 10S ó MA- 10p19AS. Las
células fueron incubadas por 4 horas en m edio con 75 μM de ZnSO4 ant es de la irradiación UV y
m ant enidas en est e m edio hast a que las m uest ras fueron recolect adas. El ADN de las células dañadas
fue aislado a los t iem pos indicados y exam inados para la presencia de lesiones CPD por inm unoslot blot usando un ant icuerpo específico para est as est ruct uras. El panel izquierdo m uest ra una fot ografía
represent at iva de t res experim ent os independient es con result ados sim ilares y el panel derecho indica
el porcent aj e de lesiones CPD que perm anecen en las m uest ras a los t iem pos indicados. La figura
m uest ra la m edia ± S.E.M de los valores obt enidos en 3 ensayos independient es.
45
RESULTADOS
1 .4 .4
En sa yo de l Com e t a
Por últ im o, en est a serie de est udios realizados para est ablecer la part icipación de
p19 en los m ecanism os de reparación del ADN, ut ilizam os el Ensayo del Com et a
( Com et Assay) . Est e ensayo perm it e est udiar reparación del ADN a nivel de células
individuales em pleando la variant e denom inada “ ensayo del com et a a pH alcalino” .
Luego de radiación UV rot uras sim ple cadena ocurren en el ADN com o part e del
proceso de reparación de la vía NER. Est e m ecanism o de reparación im plica la incisión
a cada lado de la lesión, la rem oción de una sim ple hebra de 24- 32 nucleót idos de
largo cont eniendo el daño y la reconst it ución de la doble hebra por la ADN polim erasa
( Sancar et al., 2004) . A t iem pos cort os, la radiación UV no produce direct am ent e
rot uras sim ple o doble cadena, por lo t ant o el largo de los com et as reflej a el nivel de
las rot uras de cadena asociadas a la escisión del daño y dan cuent a del nivel de
reparación.
Brevem ent e, el ensayo del Com et a consist e en preparar una suspensión de células
en agarosa de baj o punt o de fusión y const ruir, con est a suspensión, m inigeles sobre
port aobj et os. Las células cont enidas y fij adas en los m inigeles son lisadas en
condiciones de alt a concent ración salina de m odo de perm it ir la liberación del ADN.
Luego, los m inigeles son suj et os a incubación en condiciones alcalinas ( pH aproxim ado
a 12,1) para perm it ir el desenrollam ient o y desnat uralización del ADN y la liberación
de las rot uras sim ple cadena. El siguient e paso consist e en realizar una elect roforesis
en condiciones t am bién alcalinas para im pulsar la m igración de los ext rem os de las
rot uras sim ple cadena. Finalizada la elect roforesis, los m inigeles son neut ralizados y
t eñidos ( con brom uro de et idio, por ej em plo) para ser evaluados por m icroscopía de
fluorescencia. Las células luego de concluido est e proceso, t ienen la apariencia de un
com et a, asem ej ando la región nuclear de la célula a la cabeza y la cola del com et a a
la región cont eniendo las hebras sim ple cadena que m igraron en la elect roforesis.
Para evaluar el efect o de p19 sobre la reparación a nivel de células individuales
por ensayo del com et a, se ut ilizaron las líneas est ables MA- 10p19em pt y, MA10p19S y
MA10- p19AS. Las células fueron incubadas con Zn 2+ por 4 horas ant es de generar el
daño y, a diferent es t iem pos post UV, se recolect aron m uest ras de cada línea celular.
Aproxim adam ent e 10.000 células por m uest ra fueron em bebidas en agarosa de baj o
punt o de fusión para generar los m inigeles. Luego de la desnat uralización de las
hebras de ADN en solución alcalina, la elect roforesis procedió por 20 m inut os. Los
m inigeles fueron lavados con una solución de neut ralización y t eñidos con brom uro de
et idio. Las fot os t om adas fueron analizadas por el program a CASP ( Com et Asssay
Soft ware Proj ect ) que evalúa varios parám et ros de los com et as, ent re ellos el llam ado
46
RESULTADOS
“ Mom ent o de la Cola” ( Tail Mom ent ) . El m om ent o de la cola es definido com o el
product o ent re el largo de la cola y la fracción del ADN t ot al en la m ism a. El valor de
est e parám et ro se relaciona con la capacidad de reparación, cuánt o m ayor sea el
m om ent o de la cola, m ayores los niveles de reparación del ADN en la célula evaluada.
Los result ados en la Ta bla 1 m uest ran que luego de 45 m inut os de daño por UV,
las células sobreexpresando p19, MA- 10p19S, observaron un aum ent o de 2,7 veces
en el m om ent o de la cola en cont rast e con las células cont rol MA- 10em pt y. Est os
valores indican un nivel de reparación m ás eficient e de las células MA- 10p19S. La
línea pMTp19AS m ost ró una dism inución leve pero significat iva en el m om ent o de la
cola en el m ism o t iem po. Aún m ás, el 90% de las células analizadas para la línea MA10p19S a los 45 m inut os de aplicado el daño, m uest ran valores significat ivam ent e
m ayores que los observados para el t iem po 0, en com paración con el 38% y el 46%
para las células MA- 10em pt y y MA- 10p19AS.
Nuevam ent e, est os result ados cont ribuyen con la hipót esis que post ula a p19
com o part icipant e en los m ecanism os involucrados en la reparación de ADN por luz
UV. En la Figu r a 1 2 se observan fot ografías represent at ivas de los result ados
expresados en la Tabla 1.
47
RESULTADOS
Figur a 1 2 . Aná lisis de la ca pa cida d de r e pa r a ción de l AD N de la s lín e a s M A- 1 0 p1 9 S y M Ap1 9 AS por en sa yo de l Com e t a . Las células fueron plaqueadas en caj as de 35 m m , incubadas con
75 μM de ZnSO4 por 4 horas y luego dañadas por UV. A diferent es t iem pos luego del daño, m uest ras
de cada línea celular fueron recolect adas y 10.000 células por m uest ra fueron em bebidas en agarosa
Low Melt ing generando un m inigel. El nivel de rot uras sim ple cadena asociado a la reparación del ADN
fue evaluado a diferent es t iem pos por el ensayo del com et a. Los com et as fueron evaluados por
m icroscopía de fluorescencia. Las fot os t om adas fueron analizadas por el program a CASP.
1 .5
p1 9 con fie r e m a yor r e sist e n cia a la ir r a dia ción por UV
Los result ados descript os hast a ahora sugieren que p19 est aría involucrada en la
capacidad de las células de reparar eficient em ent e el ADN luego de daño por UV t ant o
en la reparación por las vías TC- NER com o por GG- NER. Hem os m encionado, adem ás,
que la respuest a celular al daño consist e, prim ariam ent e, en act ivar m ecanism os de
reparación del genom a con el propósit o de elim inar las lesiones. Sin em bargo,
dependiendo de la ext ensión del daño inflingido y de la capacidad de la célula de
repararlo, se act ivan sim ult áneam ent e m ecanism os de m uert e de m odo de elim inar,
de form a direct a, la célula afect ada. Postulam os ent onces que, si p19 desem peña una
función en los m ecanism os de reparación, variaciones en los niveles de p19 afect arían
la supervivencia celular al daño genot óxico.
Para est udiar si la regulación posit iva o negat iva de p19 t iene algún significado
biológico y j uega un rol funcional en la respuest a celular a la inj uria genot óxica,
48
RESULTADOS
analizam os en prim er lugar la supervivencia celular en las líneas est ables m ediant e el
ensayo
de
MTT
( Brom uro
de
3- [ 4,5
dim et ilt iazol- 2- yl] - 2,5- difenilt et razolio) .
Brevem ent e, est e es un ensayo colorim ét rico que cuant ifica la reducción del MTT por
la m it ocondria de células viables en crist ales insolubles de color m orado. El color es
evaluado por espect rofot om et ría y se obt iene una relación lineal ent re el núm ero de
células y la absorbancia m edida. Tam bién puede ser em pleado para evaluar m uert e
celular m ediada por agent es dañadores del ADN ( Plum b, 2004) .
En est e ensayo evaluam os la viabilidad celular durant e varios días luego de la
aplicación de luz UV, com o form a de est im ar proliferación celular luego de daño
genot óxico. Para inducir la expresión de p19 en dirección sent ido y ant isent ido, y así
m odular los niveles de p19, el Zn 2+ fue agregado al m edio de cult ivo 4 horas ant es de
irradiar con UV y hast a 24 horas post eriores al daño. Cum plido est e t iem po la
inducción fue det enida para evit ar que la sobreexpresión de p19 arrest ara las células
en la fase G1 e im pidiera la proliferación. Consideram os que de exist ir un efect o de
p19 sobre la supervivencia celular ést e est aría dado por la capacidad de reparación del
daño en las prim eras horas de generado, m om ent o en el cual est a prot eína cum pliría
su función.
En prim er lugar, descart am os cualquier efect o delet éreo del ZnSO4 sobre la
viabilidad celular ( Figur a 1 3 A, línea MA- 10 em pt y y MA- 10 em pt y+ ZnSO4 ) . Por ot ro
lado, com param os la proliferación de las líneas celulares ent re sí, encont rando que
cada una de ellas t ienen diferent e pot encial de proliferación ( Figu r a 1 3 A) . La línea
MA- 10p19AS
t iene
una
t asa
de
proliferación
m ayor
que
la
línea
cont rol.
Cont rariam ent e, la t asa de proliferación en la línea MA- 10p19S es significat ivam ent e
m enor que la línea MA- 10em pt y. Est as diferencias pueden explicarse t eniendo en
cuent a la función inhibit oria de p19 sobre CDK4/ 6, la sobreexpresión de p19 act uaría
inhibiendo la proliferación celular m ient ras que la dism inución en la expresión de p19
ej ercería el efect o inverso.
Finalm ent e analizam os la capacidad de est as t res líneas de sobrevivir y proliferar
luego del daño ( Figu r a 1 3 B) . Observam os que a part ir del día 3 post UV el núm ero
relat ivo de células viables de la línea MA- 10p19S es significat ivam ent e m ayor a los
valores hallados para las células MA- 10em pt y y, adem ás, est a diferencia es m ant enida
hast a el últ im o día del ensayo. Podem os not ar que, luego de 6 días de aplicado el
t rat am ient o, las células MA- 10p19S present an un aum ent o en el núm ero de células
viables del 21% respect o de las células de la línea cont rol. Por ot ro lado, la línea
MA- 10p19AS result ó significat ivam ent e m ás sensible al daño que las células cont rol. Al
igual que en la línea MA- 10p19S, desde el t ercer día post - daño se m uest ran
diferencias significat ivas respect o a las células MA- 10em pt y, alcanzando en el día 6 un
49
RESULTADOS
núm ero relat ivo de células viables 20% m enor. A part ir de est os result ados podem os
describir un efect o “ prot ect or”
de p19 sobre la viabilidad celular post
daño,
observando no solo que la sobreexpresión de p19 m ej ora sensiblem ent e est e
parám et ro sino que t am bién los niveles endógenos de est a prot eína ej ercen un efect o
posit ivo sobre la supervivencia. Si bien, en la línea MA- 10em pt y los niveles de p19 son
inducidos por efect o de la irradiación UV, las diferencias observadas con la línea
MA- 10p19S resalt an la capacidad de resist encia que confiere la presencia de alt os
niveles de p19 en el m om ent o de la inj uria.
Est os dat os result an aún m ás llam at ivos al recordar que en ausencia de daño, las
3 líneas celulares t ienen diferent es t asas de proliferación, siendo MA- 10p19S la de
proliferación m ás lent a.
Figur a 1 3 . La via bilida d lu e go
de
da ño
por
UV
e st á
in flu e ncia da por los n ivele s de
p1 9 e n la cé lu la . La viabilidad
celular fue evaluada en células
MA- 10p19S, MA- 10p19AS y MA10em pt y durant e 6 días sin daño
( A) y luego de irradiación con UV
( 4 m J/ cm 2 ) m ediant e análisis de
MTT ( B) . Cada punt o represent a
el
prom edio
experim ent os
±
S.E.M.
diferent es
de
3
hechos
por quint uplicado. En ( A y B) el
t est de St udent fue ut ilizado para
com parar las células MA- 10p19S ó
MA- 10p19AS
con
MA- 10em pt y
( * P< 0,01) .
50
RESULTADOS
Para analizar en m ayor profundidad los efect os a largo plazo y la relevancia
fisiológica de p19 en la supervivencia celular se em plearon las diferent es líneas
celulares en ensayos clonogénicos. El ensayo clonogénico se ut iliza para evaluar
supervivencia celular y se basa en la habilidad de una única célula de generar una
colonia de por lo m enos 50 células. Est e m ét odo perm it e est udiar m uert e celular
causada por un am plio núm ero de agent es cit ot óxicos. Las células t rat adas y diluidas
adecuadam ent e son incubadas de 1 a 3 sem anas para perm it ir la form ación de las
colonias ( Franken et al., 2006) .
En prim er lugar evaluam os si el ZnSO4 , ut ilizado para inducir el prom ot or de
m et alot ioneína, m odificaba la capacidad de las células de form ar colonias ( Figu r a
1 4 A) . No observam os ninguna diferencia significat iva ent re las células t rat adas con
ZnSO4 indicando que las t res líneas celulares poseen capacidad sim ilar de form ar
colonias baj o est as condiciones.
El prot ocolo de agregado de ZnSO4 fue igual al ut ilizado para m edir los ensayos de
viabilidad y proliferación celular por MTT. Se em plearon diferent es dosis de radiación
UV, ent re 1 y 8 m J/ cm 2 , y las células fueron crecidas por un período de 10 días ant es
del análisis. Lo prim ero que podem os observar es que la irradiación con dosis
crecient es de UV produj o una dism inución en la capacidad form adora de colonias en
las 3 líneas celulares indicando, com o era de esperar, t oxicidad celular significat iva del
dañador ut ilizado ( Figu r a 1 4 B) . En cuant o a las curvas de respuest a a diferent es
dosis de UV de las líneas celulares vem os que difieren significat ivam ent e dependiendo
de los niveles de p19 expresados en cada una. Claram ent e, lo prim ero que podem os
not ar es la diferencia significat iva en la sobrevida ent re la línea celular MA- 10p19S y
MA- 10p19em pt y luego de ser irradiadas con 4m J/ cm 2 de luz UV. Mient ras que la línea
MA- 10p19em pt y conserva un valor de sobrevida del 38% , est e aum ent a a un 63% en
la línea MA- 10p19S. De est os result ados podem os concluir que la m uert e celular es
reducida significat ivam ent e en las células que al m om ent o del daño expresan p19 en
alt os niveles. Sum ado a est os result ados, podem os t am bién observar que las células
deficient es en p19 al m om ent o de producir la lesión dism inuyen abrupt am ent e, casi en
un 80% , su resist encia a la luz UV aún a la dosis m ás baj a ensayada.
Todos los result ados descript os en est e punt o indican que los niveles de p19
influencian la sensibilidad de las células al daño por radiación UV, y que la presencia
de p19 confiere una vent aj a not able en la resist encia al est rés genot óxico.
51
RESULTADOS
Figur a 1 4 . La supe r vivencia lue go de da ño por UV e st á influe ncia da por los nive le s de
e x pr e sión de p1 9 . La viabilidad celular por ensayo clonogénico fue evaluada en células MA- 10p19S,
MA- 10p19AS y MA- 10em pt y durant e 10 días con o sin t rat am ient o de ZnSO4 ( A) ó con t rat am ient o
de ZnSO4 y después de la irradiación con diferent es dosis de UV ( B) . En B Los result ados est án
expresados com o porcent aj e del núm ero de colonias con respect o a las células no t rat adas, el cual
fue est ablecido con el valor de 100. Cada punt o represent a el prom edio ± S.E.M. de 3 experim ent os
independient es por sext uplicado. Test de St udent ( * P< 0,01) .
52
RESULTADOS
1 .6
La de ficie n cia de p1 9 a u m e n t a la fr e cu e n cia de a be r r a cion e s
cr om osóm ica s
La est abilidad genóm ica es de fundam ent al im port ancia para la supervivencia y
para la ej ecución de las funciones vit ales de t odos los organism os. Fallas en el
funcionam ient o de los procesos que norm alm ent e m ant ienen la int egridad del genom a
pueden conducir a la generación de aberraciones crom osóm icas y aum ent ar la
predisposición al cáncer. Las aberraciones crom osóm icas se generan cuando el ADN
por alguna causa, com o puede ser la acción de un agent e genot óxico, sufre rot uras en
diferent es punt os y los ext rem os de est as rot uras se unen defect uosam ent e dando
pat rones diferent es a su arreglo original. Est as est ruct uras aberrant es se hacen
evident es cuando la célula progresa a t ravés de la fase S y la m it osis. La evaluación
de los crom osom as en m et afase pueden revelar varios t ipos de est ruct uras diferent es,
com o los crom osom as dicént ricos o t rirradiales, int ercam bios ent re crom át ides o ent re
crom osom as, crom osom as en form a de anillos, rot uras crom osóm icas y puent es
crom osóm icos, ent re ot ras ( Chipchase and Melt on, 2002) .
Hast a aquí fue dem ost rado que p19 part icipa de la reparación eficient e del daño
por UV y que la supervivencia celular se correlaciona con los niveles de p19 al
m om ent o de la inj uria.
Ahora plant eam os que si p19 cum ple una función en la
reparación del ADN, las líneas celulares que expresen est a prot eína t endrán, adem ás,
una m ayor capacidad para m ant ener la int egridad del genom a.
Para est udiar est e punt o realizam os un análisis crom osóm ico, en las 3 líneas
celulares derivadas de MA- 10 y que expresan niveles aum ent ados, deficient es o
norm ales de p19, luego de la irradiación con luz UV. Se evaluaron las siguient es
caract eríst icas:
el núm ero de m et afases con aberraciones, el núm ero t ot al de
aberraciones, el núm ero de aberraciones crom osóm icas por m et afase y finalm ent e el
núm ero de m et afases con alt o nivel de daño ( con m ás de 5 est ruct uras aberrant es) .
Est e est udio fue realizado en colaboración con la Dra. Marcela González Cid,
int egrant e del I nst it ut o de I nvest igaciones Hem at ológicas de la Academ ia Nacional de
Medicina.
De los result ados obt enidos podem os concluir que, luego del daño, en las células
MA- 10p19AS el porcent aj e de m et afases con aberraciones ( principalm ent e rot uras e
int ercam bio ent re crom át ides y crom osom as) es un 20% m ás alt o en com paración con
la línea MA- 10em pt y
( Ta bla
2).
La sensibilidad m ás elevada de las células
MA- 10p19AS fue not oria no sólo en la m ayor cant idad de células anorm ales sino
t am bién en la cant idad t ot al de aberraciones crom osóm icas. Por el cont rario, las
53
RESULTADOS
células MA- 10p19S irradiadas con UV m uest ran una dism inución del 23% en el
núm ero de m et afases aberrant es en relación con las células MA- 10em pt y cont rol
( Ta bla 2 ) .
Es int eresant e dest acar que las células que t ienen niveles de p19 reducidos
m uest ran un 50% m ás de m et afases con aberraciones com o de aberraciones t ot ales,
en claro cont rast e con las células que expresan niveles alt os de p19 al m om ent o del
daño. Más aún, el núm ero de células con alt o nivel de daño ( m ás de 5 aberraciones
por
m et afase)
es
un
33%
m ás
alt o
en
la
línea
MA- 10p19AS
respect o
a
MA- 10p19S. Es im port ant e dest acar que las células dañadas fuert em ent e son
elim inadas diferencialm ent e por apopt osis, y dado que, luego de la exposición a UV las
células MA- 10p19AS son m as sensibles a la m uert e celular, es lógico pensar que la
cant idad
de
aberraciones
crom osóm icas
observadas
en
est as
células
est a
subest im adas y por lo t ant o las diferencias observadas ent re las líneas celulares
pueden ser aún m ayores.
La sensibilidad de las células MA- 10p19AS a la radiación UV indica que est as
células no son capaces de m ant ener correct am ent e la int egridad del genom a. Est a
evidencia sugiere que, aun en ausencia de agent es ext ernos, la est abilidad del
genom a en est a línea podría est ar afect ada. Analizam os, ent onces, la frecuencia de
aberraciones crom osóm icas en las 3 líneas en ausencia de fact ores dañadores
ext ernos. El análisis cit ogenét ico reveló un nivel de m et afases con aberraciones
crom osóm icas espont áneas en la línea MA- 10p19AS que casi alcanza un 50% m ás que
el encont rado para la línea cont rol ( Tabla 2) .
Para concluir, en nuest ra opinión est os dat os m uest ran un efect o aún m ás
int eresant e de p19 dem ost rando que la expresión de est a prot eína es esencial para
m ant ener la est abilidad crom osóm ica y consecuent em ent e la int egridad global del
genom a.
54
RESULTADOS
En la Figur a 1 5 se m uest ran fot ografías represent at ivas de los result ados
expresados en la Tabla 2
Figur a 1 5 . p1 9 e n e l m a n t e nim ie n t o de la in t e gr ida d de l ge nom a . Se m uest ran las m et afases
de células no irradiadas ( MA- 10 em pt y) o irradiadas ( UV) de las líneas celulares clonales expresando
diferent es niveles de p19. La inducción del prom ot or de m et alot ioneína fue iniciada 4 horas ant es del
daño por UV. Cuarent a y ocho horas después del daño, las células fueron arrest adas en m et afase con
colchicina, fij adas, y visualizadas por t inción con Giem sa. Las flechas indican diferent es t ipos de
aberraciones crom osóm icas.
55
RESULTADOS
1 .7 p1 9 pa r t icipa de la r e pa r a ción de l AD N e n for m a in de pe n die n t e de
su fu n ción in h ibit or ia de l ciclo ce lu la r
p19, al igual que los ot ros m iem bros de la fam ilia I NK4, se une a las quinasas
CDK4 o CDK6 inhibiendo la progresión del ciclo celular cuando es sobreexpresada. Por
ot ro lado, la reparación del ADN requiere de t iem po suficient e para elim inar el daño.
Ent onces es lógico pensar que la sobreexpresión de p19 al conducir a la inhibición de
la proliferación perm it iría aum ent ar el t iem po de reparación y consecuent em ent e la
eficiencia de la reparación.
Para evaluar est e punt o, ut ilizam os un am inoácido veget al llam ado m im osina que
arrest a los cult ivos celulares en un punt o discret o de la fase G1 t ardía. En principio
evaluam os la efect ividad de est e induct or para arrest ar el ciclo celular realizando un
análisis de incorporación de
3
H- t im idina ( Figu r a 1 6 A) . Células MA- 10 fueron
t ransfect adas con un vect or de expresión para p19 o t rat adas con m im osina por un
período de 24 h. Com o se puede observar, la m im osina t iene la capacidad de inhibir el
ciclo celular al m ism o nivel que p19. Si la sobreexpresión de p19, ent onces, m ej ora la
reparación debido a perm it irle a las células m ayor t iem po de reparación, m im osina, al
im it ar el efect o inhibit orio de p19, debería alcanzar los m ism os niveles de reparación.
Para est udiar est e punt o realizam os ensayos de HCR ( Figu r a 1 6 B) . Podem os ver que
m im osina, a pesar de inhibir la proliferación celular al igual que p19, no aum ent a los
niveles de reparación del ADN significat ivam ent e. En est e sent ido, m im osina no im it a
el efect o de p19 sobre la reparación.
Est os result ados sugieren que la sobreexpresión de p19 m ej ora la reparación del
ADN dañado por UV por un m ecanism o diferent e de aquella función relacionada con la
inhibición del ciclo celular.
Si est a hipót esis es correct a, es lógico pensar que p19 no requeriría de la
int eracción con CDK4 para ej ercer su función sobre la reparación. Para probar est a
cuest ión se realizaron ensayos de HCR en células MA- 10 co- expresando CDK4 salvaj e
o una versión m ut ant e CDK4R24C y un vect or de expresión de p19 ( Figur a 1 7 ) . Est a
m ut ant e de CDK4 t iene una m ut ación punt ual ( el cam bo de arginina por cist eína en la
posición 24) en el prim er exón codificant e, dando expresión a un prot eína con
act ividad quinasa com plet a pero sin capacidad de unión a las prot eínas I NK4, y en
consecuencia no pudiendo ser inhibida ( Sot illo et al., 2001) .
Analizando los result ados observam os que, cuando p19 es expresada j unt o con
CDK4 salvaj e, la habilidad de est a I NK4 de aum ent ar la reparación del ADN se ve
significat ivam ent e dism inuida. CDK4 salvaj e act uaría en est e caso secuest rando p19 e
56
RESULTADOS
im pidiendo su función en la reparación. Por ot ro lado, cuando p19 es co- expresada
con la m ut ant e CDK4R24C, se observan valores de react ivación del gen report ero CAT
significat ivam ent e m ayores al t rat am ient o cont rol sin p19, sim ilares a los encont rados
para la sobreexpresión de p19 sola.
Est os result ados proponen un m ecanism o por el cual p19 part iciparía en la
reparación
del
ADN de
form a
independient e
de
la
int eracción
con
CDK4
y
consecuent em ent e de m odo independient e de su función com o inhibidor del ciclo
celular ( en la Figu r a 4 0 se profundiza en est e est udio) .
Figur a 1 6 . p1 9 pa r t icipa e n la r e pa r a ción
de l
AD N
inde pe ndie nt e m e nt e
de
su
fu n ción in h ibit or ia de l ciclo ce lula r . ( A)
Mim osina im it a el efect o de la sobreexpresión
de p19 en el arrest o celular. Células MA- 10
fueron t ransfect adas con 2 μg del vect or de
expresión
codificando
p19
en
dirección
sent ido ( p19S) o ant isent ido ( p19AS) o un
oligonucleót ido ant isent ido de p19 ( ASON, 2
m M) j unt o con 0,5 μg de puroBABE. Luego de
24
horas
fueron
seleccionadas
con
purom icina. 24 horas m ás t arde 500 μM de
m im osina fue agregada en los t rat am ient os
indicados y la incubación procedió por 24
horas m ás en presencia de purom icina. Todos
los cult ivos fueron
incubados con
1
μCi
3
[ H ] t im idina y su incorporación evaluada 6
horas m ás t arde. Las barras represent an la
m edia ± S.E.M. de 3 experim ent os hechos
por duplicado. El ARN t ot al fue ext raído de
los cult ivos señalados y suj et o a Nort hern
blot . ( B)
fueron
Ensayo de HCR. Células MA- 10
t ransfect adas
con
el
plásm ido
pCMVCAT y co- t ransfect adas con un vect or
de expresión para p19 en dirección sent ido
( p19S, 4 μg) ó incubada con 500 μM de
m im osina por 24 horas. Los result ados est án
expresados com o la act ividad relat iva de CAT
con respect o al vect or report ero no dañado,
el
cual
fue
est ablecido
con
un
valor
de 100. El t est de St udent fue ut ilizado para
com parar los diferent es t rat am ient os con las células cont rol no t rat adas ( * P< 0,05) .
57
RESULTADOS
Figu r a 1 7 . p1 9 pa r t icipa e n la r e pa r a ción del AD N in de pe n die n t e m e nt e de su fu nción com o
r e gu la dor de l ciclo ce lula r . Células MA- 10 fueron t ransfect adas con 4μg de plásm ido pCMVCAT
dañado o no dañado ( 32 m J/ cm 2 ) y co- t ransfect ado con un vect or de expresión codificando para p19
en dirección sent ido ( p19S, 4 μg) y/ o CDK4 ( 4 μg) , y/ o CDK4R24C ( 4 μg) com o se indica en la figura.
La act ividad CAT fue m edida 48 horas luego de la t ransfección. Los result ados est án expresados com o
la act ividad relat iva de CAT con respect o al vect or report ero no dañado, el cual fue est ablecido con
un valor de 100. El t est de St udent fue ut ilizado para com parar las m uest ras co- t ransfect adas con
alguna versión de CDK4 y p19S con las m uest ras t ransfect adas solo con la CDK4 respect iva
( * P< 0,05) .
58
RESULTADOS
Ca pít u lo 2 : M e ca n ism o de a ct iva ción de p1 9 I N K4 d fr e n t e a
da ñ o ge n ot óx ico.
Las
m odificaciones
post - t raduccionales
j uegan
un
papel
im port ant e
en
la
coordinación de la respuest a celular al daño en el ADN. Evidencias recient es sugieren
una
int eracción
ent re
m últ iples
m odificaciones,
incluyendo
fosforilación,
ubiquit inación, acet ilación y sum oilación, las cuales se com binan para propagar la
señal del daño y ej ecut ar el arrest o del ciclo celular, la reparación del ADN, la
apopt osis y la senescencia ( Bode and Dong, 2004;
Toledo and Wahl, 2006) .
Modificaciones post - t raduccionales específicas perm it en un cont rol t em poral y espacial
sobre la relocalización, int eracción y la act ivación o inhibición de funciones prot éicas.
Est as m odificaciones perm it en adem ás la am plificación de la señal del daño que
const it uye un paso necesario para el m ant enim ient o de la est abilidad genóm ica.
Hast a aquí hem os dem ost rado que p19 t iene una función, no relacionada con la
inhibición del ciclo celular, involucrada en la respuest a celular al daño ej ecut ada frent e
al t rat am ient o con UV com o agent e genot óxico.
Com o hem os m encionado con ant erioridad en la int roducción de est e t rabaj o, se
ha descript o que la respuest a al daño al ADN est á m ediada por una cascada de
señales conducida principalm ent e por event os de fosforilación de la que part icipan
prot eínas sensoras, m ediadoras, t ransduct oras y efect oras de la respuest a.
En est a segunda part e del t rabaj o plant eam os que, si p19 present a una función
ligada al m ant enim ient o de la est abilidad del genom a, form ando part e de la respuest a
celular al daño al ADN, ent onces es posible que est a función est é regulada por
m odificaciones post - t raduccionales com o los event os de fosforilación. En est e segundo
capít ulo enfocam os el est udio sobre p19 en est e sent ido.
59
RESULTADOS
2 .1
p1 9 e s fosfor ila da e n r e spu e st a a l da ñ o ge n ot óx ico
Un t rabaj o recient e basado en t écnicas de prot eóm ica a gran escala ha
ident ificado m ás de 700 prot eínas que result an fosforiladas en respuest a al daño.
Est os result ados revelan una red int rincada de prot eínas que es orquest ada y regulada
por est e t ipo de m odificación post - t raduccional ( Mat suoka et al., 2007) . Con el obj et o
de det erm inar si p19 pert enece a est a red de prot eínas evaluam os, en prim er lugar, si
es fosforilada in vivo en respuest a a la acción de diversos genot óxicos. Para ello, se
realizaron ensayos de m arcación m et abólica.
El est udio fue conducido en la línea celular hum ana WI - 38 ut ilizando t res t ipos de
agent es genot óxicos diferent es: luz UV, pept ido β- am iloide y cisplat ino. Las células
fueron incubadas por 3 h con
de
32
32
P- ort ofosfat o de sodio, de m odo de asegurar la sínt esis
P- ATP, y luego dañadas con los diferent es agent es genot óxicos. Se t om aron
m uest ras a diferent es t iem pos post eriores al daño y, en cada una de ellas, p19 fue
inm unoprecipit ada
por
m edio
de
un
ant icuerpo
m onoclonal
específico.
Los
inm unoprecipit ados fueron resuelt os m ediant e elect roforesis en gel de poliacrilam ida
desnat uralizant e y el gel expuest o a pant allas de alm acenam ient o de fósforo ( st orage
phosphor
screens) .
La
im agen
fue
obt enida
a
t ravés
de
la
ut ilidad
St orm
Phosphoim ager Scanner.
A part ir de la im agen result ant e ( Figu r a 1 8 ) , podem os decir que p19 en
condiciones basales, en ausencia de daño, no se fosforila, al m enos en niveles
det ect ables. Sin em bargo, cuando las células son expuest as a radiación UV, ó
incubadas con cis- plat ino, ó con pépt ido β- am iloide observam os, efect ivam ent e, que
p19 es fosforilada en t odos los t iem pos ensayados y al m enos hast a las 8 horas
post eriores al daño se observa fosforilación.
En vist a de la fosforilación de p19 luego del t rat am ient o con diversos genot óxicos
y dado que las respuest as al daño al ADN se act ivan rápidam ent e con el obj et o de
elim inar
la
lesión,
realizam os ensayos sim ilares pero
a
t iem pos m ás cort os
( Figu r a 1 9 ) . En est os ensayos podem os observar que p19 result a fosforilada al
m enor t iem po est udiado correspondient e a 20 m inut os, luego de dañar los cult ivos
celulares con UV.
60
RESULTADOS
Figu r a 1 8 . p1 9 e s fosfor ila da e n r e spue st a a da ño ge not óx ico. Células WI - 38 fueron
preincubadas con 0,5 m Ci de
pépt ido
32
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3 horas y t rat adas post eriorm ent e con
- am iloide ( 10 µM) , cisplat ino ( 20 µM) ó radiación UV ( 4 m J/ cm 2 ) . Cant idades iguales de
prot eínas ( 100 µg) de las m uest ras recolect adas a diferent es t iem pos luego del daño fueron
inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo ant i- p19 hum ano. Los com plej os inm unes fueron suj et os a
SDS- PAGE 12% y la fosforilación fue analizada a t ravés de la ut ilidad St orm Phosphoim ager Scanner.
Niveles de p19 inm unoprecipit ado fueron analizados por West ern blot . La figura es represent at iva de
2 ensayos independient es. ( P- p19, p19 fosforilada; I P p19, p19 inm unoprecipit ada)
Figu r a 1 9 . p1 9 e s fosfor ila da a t ie m pos cor t os en r e spue st a a da ño por UV. Células WI - 38
fueron preincubadas con 0,5 m Ci de
32
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3 horas y t rat adas
post eriorm ent e con radiación UV ( 4 m J/ cm 2 ) . Cant idades iguales de prot eínas ( 100 µg) de las
m uest ras recolect adas a diferent es t iem pos luego del daño fueron inm unoprecipit adas usando un
ant icuerpo ant i- p19 hum ano. Los com plej os inm unes fueron suj et os a SDS- PAGE 12%
y la
fosforilación fue analizada a t ravés de la ut ilidad St orm Phosphoim ager Scanner. Niveles de p19
inm unoprecipit ado fueron analizados por West ern blot . La figura es represent at iva de 2 ensayos
independient es.
61
RESULTADOS
2 .2
Pr e dicción de sit ios de fosfor ila ción e n p1 9
En el punt o ant erior dem ost ram os que p19 es fosforilada en respuest a a daños
que lesionan el ADN. El siguient e obj et ivo que plant eam os consist ió en ident ificar los
sit ios de p19 que result an fosforilados luego del daño.
Com o prim er abordaj e, em pleam os una herram ient a inform át ica predict iva de
sit ios pot enciales de fosforilación. La herram ient a Net phos 2.0 server perm it e predecir
sit ios pot enciales de fosforilación en residuos de serina, t reonina y t irosina.
Luego del análisis de la secuencia de la prot eína p19 hum ana encont ram os 4 sit ios
con alt a probabilidad de ser fosforilados: serina 13 , serina 76, t reonina 89 y t reonina
141, con los scores respect ivos 0.956, 0.975, 0.899 y 0.962 ( Figu r a 2 0 ) . En el
análisis, adem ás, son señalados ot ros 2 sit ios, serina 66 y serina 73, cuyos scores,
0.626 y 0.573, se encuent ran m ás cercanos al punt o de cort e definido en 0.5, lo que
sugiere una m enor probabilidad de fosforilación en los m ism os.
Cont inuam os el análisis in silico con el obj et o de det erm inar si est os sit ios
pot enciales de fosforilación se encont raban conservados en diferent es especies.
Analizam os la secuencia prot eica de 4 especies : Hom o sapiens, Mus m usculus, Rat t us
norvegicus, y Macaca m ulat t a. Est e análisis fue llevado a cabo ut ilizando el program a
T- Coffee,
que
perm it e
el
alineam ient o
de
m últ iples secuencias ( Figu r a
21).
Encont ram os que los seis sit ios con pot encial para ser fosforilados ( los de alt a
probabilidad serinas 13 y 76, y t reoninas 89 y 141, y los de probabilidad m edia
serinas 66 y 73) se encuent ran conservados en las cuat ro especies de m am íferos
analizadas.
La conservación de est os sit ios ent re diferent es especies apoya las predicciones
obt enidas a t ravés de la herram ient a Net phos 2.0 server.
62
RESULTADOS
Figu r a 2 0 . An á lisis de sit ios pot e ncia le s de fosfor ila ción e n la pr ot eín a p1 9 . La secuencia
prot eica de p19 fue analizada a t ravés de la herram ient a Net phos 2.0 para det erm inar los sit ios
pot enciales de fosforilación. El punt o de cort e para est e análisis fue est ablecido en 0,5.
63
RESULTADOS
Figur a 2 1 . Conse r va ción de los sit ios pot e ncia le s de fosfor ila ción de p1 9 e n difer e nt e s
e spe cie s. Alineam ient o de secuencias de p19 para las especies Hom o sapiens, Mus m usculus, Rat t us
norvegicus y Macaca m ulat t a. Est e análisis fue realizado ut ilizando el program a T- Coffee.
64
RESULTADOS
2 .3 Los sit ios se r in a 7 6 y t r e on in a 1 4 1 son cr ít icos pa r a la
fosfor ila ción de p1 9
El análisis in silico predice 6 sit ios pot enciales de fosforilación en p19. A
cont inuación analizam os si alguno de est os sit ios est á involucrado en la fosforilación
de est a prot eína luego de la exposición a agent es genot óxicos. La est rat egia ut ilizada
consist ió en const ruir m ut ant es punt uales para cada uno de est os sit ios y det erm inar,
in vivo, si est as m ut aciones m odifican la capacidad de p19 de ser fosforilada.
Const ruim os est as m ut ant es reem plazando los residuos de serina o t reonina por
alanina para 5 de est os sit ios. No se const ruyó una m ut ant e para la serina en la
posición 73 en vist a de su baj a probabilidad de const it ut ir un verdadero sit io de
fosforilación.
Las
secuencias
m ut ant es
de
p19,
denom inadas
m ut ant es
de
fosforilación, fueron clonadas en el vect or pcDNA4 V5/ HI S C que expresa la prot eína
fusionada al epít ope V5. La versión p19 salvaj e ( p19wt ) t am bién fue clonada en est e
vect or. El epít ope V5 result a út il al m om ent o de discrim inar ent re la prot eína
endógena y la m ut ant e en los ensayos que se describen m ás adelant e.
La capacidad de est as m ut ant es de ser fosforiladas se analizó por m edio de
ensayos de m arcación m et abólica. Cada una de las m ut ant es de fosforilación, así
com o la const rucción de p19 salvaj e, fueron t ransfect adas en células BHK- 21 y, 24
horas después, incubadas con
32
P- ort ofosfat o siguiendo el prot ocolo descript o para la
figura 18, a excepción del ant icuerpo ut ilizado en el paso de inm unoprecipit ación que
fue reem plazado por un ant icuerpo cont ra el epít ope V5.
En prim er lugar observam os, com o era esperable, que p19wt sobreexpresada no
fue fosforilada en est a línea celular. Por ot ro lado, la aplicación de UV com o dañador
efect ivam ent e induj o la fosforilación de p19wt ( Figu r a 2 2 A) . Est e com port am ient o
concuerda con el observado para p19 endógena, concluyendo de est os dat os que el
sist em a result a adecuado para est e est udio.
Cont inuando con el análisis, encont ram os que las m ut ant es en serina 13, 66 y
t reonina 89 ( p19S13A, p19S66A, p19T89A) son fosforiladas en form a sim ilar ent re
ellas y al m ism o nivel que p19wt . Sin em bargo, el nivel de fosforilación de la m ut ant e
en t reonina 141 ( p19T141A) result ó not ablem ent e dism inuido. Aún m ás, la versión de
p19 m ut ada en serina 76 ( p19S76A) perdió por com plet o la capacidad de ser
fosforilada ( Figur a 2 2 B) . La reducción o la elim inación com plet a de la fosforilación
est arían indicando que, al m ut ar la serina 76 o la t reonina 141, se han elim inado sit ios
efect ivos de fosforilación.
65
RESULTADOS
Concluim os que serina 76 y t reonina 141 serían sit ios fosforilados en la prot eína
p19 en respuest a a la acción de genot óxicos.
Figu r a 2 2 . La s m u t a nt e s p1 9 S7 6 A y p1 9 T1 4 1 A m odifica n su ca pa cida d de fosfor ila ción.
Células BHK- 21 fueron t ransfect adas con p19wt ( A y B) ó con las m ut ant es p19S13A, p19S66A,
p19S76A y p19T141A ( B) las cuales son expresadas fusionadas al epít ope V5. Veint icuat ro horas
luego de la t ransfección fueron preincubadas con 0,5 m Ci de
32
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3 horas
2
y t rat adas post eriorm ent e con radiación UV ( 4 m J/ cm ) . Cant idades iguales de prot eínas ( 200 µg) de
las m uest ras recolect adas 2 horas luego del daño fueron inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo
ant i- V5. Los com plej os inm unes fueron suj et os a SDS- PAGE 12% y la fosforilación fue analizada a
t ravés de la ut ilidad St orm Phosphoim ager Scanner. Niveles de p19 inm unoprecipit ado fueron
analizados por West ern blot con un ant icuerpo ant i- V5. La figura es represent at iva de 2 ensayos
independient es. ( I P V5- p19, p19 fusionada a V5 inm unoprecipit ada) .
2 .4
Pr e dicción de qu in a sa s r e sponsa ble s de la fosfor ila ción de p1 9
La descripción de los am inoácidos serina 76 y t reonina 141 com o sit ios
responsables de la fosforilación en p19 luego del daño al ADN, abre el int errogant e
sobre las posibles quinasas act uant es sobre ellos. Com o prim era aproxim ación en el
est udio de las quinasas involucradas, ut ilizam os la herram ient a bioinform át ica
Net phosK 1.0 server. Est a es una herram ient a com put acional que perm it e predecir
quinasas específicas para det erm inados sit ios de fosforilación.
Del result ado de est e análisis observam os que una quinasa de la fam ilia CDK,
CDK5, podría pot encialm ent e fosforilar en la serina 76 y que la prot eína quinasa A
( PKA) sería responsable de la fosforilación en t reonina 141 ( Ta bla 3 ) .
66
RESULTADOS
2 .5
PKA y m ie m br os de la fa m ilia CD K e st á n in volu cr a dos e n la
fosfor ila ción de p1 9
El prim er paso en el est udio de las quinasas responsables de fosforilar a p19
consist ió en la ut ilización de inhibidores específicos, para las quinasas obt enidas en el
análisis predict ivo, en ensayos de fosforilación in vivo. En est e sent ido, se realizaron
t ransfecciones t ransit orias de p19wt en células BHK- 21. Em pleam os dos inhibidores de
quinasas, H- 89, específico de PKA y Roscovit ina, un pot ent e inhibidor de CDK1, CDK2,
CDK5 y CDK7. Los inhibidores fueron agregados al m edio de cult ivo una hora ant es de
la inducción del daño.
Encont ram os que la inhibición de la enzim a PKA reduj o en gran m edida la
fosforilación de p19wt . Por su part e, el agregado de Roscovit ina conduj o a la com plet a
inhibición de la fosforilación de est a prot eína. Sim ilares result ados fueron obt enidos
con cualquiera de los t res agent es genot óxicos ensayados ( Figu r a 2 3 ) .
Est os result ados m uest ran que efect ivam ent e PKA y alguna de las CDKs,
part icipan del proceso de fosforilación de p19. Aún m ás, la inhibición de PKA, result a
en el m ism o pat rón de fosforilación que el observado para la m ut ant e p19T141A ( ver
Figur a 2 2 ) , y la inhibición de las CDKs, deriva en la inhibición t ot al de la fosforilación
im it ando lo ocurrido para la m ut ant e p19S76A.
67
RESULTADOS
Concluim os que t ant o PKA com o alguna CDK inhibida por Roscovit ina, part icipan
en la fosforilación de p19 en respuest a a daño, siendo la t reonina 141 y la serina 76
los sit ios pot enciales de ser fosforilados por est as quinasas, respect ivam ent e.
Figur a 2 3 . PKA y a lgún m ie m br o de la fa m ilia CD K pa r t icipa n e n la fosfor ila ción de p1 9 .
Células BHK- 21 fueron t ransfect adas con p19wt fusionada al epít ope V5. Veint icuat ro horas luego de
la t ransfección las células fueron preincubadas con 0,5 m Ci de
horas y t rat adas post eriorm ent e con pépt ido
32
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3
- am iloide ( 10 µM) , cisplat ino ( 20 µM) ó radiación UV ( 4
2
m J/ cm ) . Cant idades iguales de prot eínas ( 200 µg) de las m uest ras recolect adas 2 horas luego del
daño fueron inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo ant i- V5. Los com plej os inm unes fueron suj et os
a SDS- PAGE 12% y la fosforilación fue analizada a t ravés de la ut ilidad St orm Phosphoim ager
Scanner. Niveles de p19 inm unoprecipit ado fueron analizados por West ern blot con un ant icuerpo
ant i- V5. La figura es represent at iva de 3 ensayos independient es.
2 .6 p1 9 e s fosfor ila da e n for m a se cu e n cia l
Hast a aquí dem ost ram os que la elim inación del sit io serina 76 ó la inhibición de
las CDKs por Roscovit ina, pot enciales quinasas act uando sobre est e am inoácido,
elim inan por com plet o la posibilidad de fosforilación de p19. Adem ás, hem os vist o
que, t ant o el reem plazo de la t reonina 141 com o la inhibición de PKA, pot encial
quinasa de est e sit io, dism inuyen la fosforilación de p19 aunque sin inhibirla
com plet am ent e.
Est os
result ados
nos
llevan
a
plant ear
com o
hipót esis
una
fosforilación secuencial de p19 en respuest a a daño. En prim er lugar p19 sería
fosforilada en serina 76 por alguna de las CDKs m encionadas, siendo est e prim er
event o necesario para perm it ir una segunda fosforilación est a vez en el sit io t reonina
141 y en un proceso cat alizado por PKA.
Para est udiar m ás en profundidad est a hipót esis, em pleam os ensayos de
m arcación m et abólica sobre las m ut ant es de fosforilación de p19 ut ilizando ahora los
inhibidores de PKA y CDKs. Sum am os una nueva m ut ant e al est udio, denom inada
68
RESULTADOS
p19ANKless, en la cual fue elim inado el últ im o dom inio ankirina cont eniendo la
t reonina 141. El últ im o dom inio ankirina en p19 es el que present a m enor hom ología
de secuencia con el rest o de las I NK4 ( Figu r a 3 7 ) por lo que pensam os que en él
podría residir en part e el com port am ient o diferencial de p19 en la reparación.
En la Figur a 2 4 podem os observar que, com o fue descript o ant eriorm ent e, la
señal de fosforilación para p19wt dism inuye pronunciadam ent e cuando se t rat a a las
células con el inhibidor de PKA. Sin em bargo, cuando las células t ransfect adas con las
m ut ant es de t reonina 141 ( p19T141A y p19ANKless) son incubadas con H- 89, ningún
cam bio es observado en el est at us de fosforilación para los dos genot óxicos
evaluados. Est a últ im a observación nos lleva a concluir que no hay en p19 ot ro sit io
diferent e a t reonina 141 que involucre la fosforilación por PKA. Por ot ro lado, cuando
se ut iliza el inhibidor Roscovit ina, la fosforilación es com plet am ent e inhibida en las
m ut ant es en t reonina 141.
Cóm o era de esperar, para las m ut ant es en serina 76 ( p19S76A, p19S76T141A)
no se det ect ó fosforilación por UV ni t am poco por pépt ido β- am iloide, aún en ausencia
de inhibidores.
Est os result ados apoyan la idea de la fosforilación secuencial de p19 m ediada por
agent es genot óxicos, en la cual sería necesaria, en prim er lugar la fosforilación por
alguna CDK en serina 76, para que luego pudiera ocurrir la segunda fosforilación en
t reonina 141 por la enzim a PKA.
69
RESULTADOS
A
B
Figu r a 2 4 . Fosfor ila ción se cu e n cia l de p1 9 . Células BHK- 21 fueron t ransfect adas con p19wt ó con
las m ut ant es p19S13A, p19S66A, p19S76A y p19T141A ( A y B) las cuales son expresadas
fusionadas al epít ope V5. Veint icuatro horas luego de la t ransfección fueron preincubadas con 0,5 m Ci
de
32
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3 horas. Una hora ant es del daño las células fueron t rat adas con
los inhibidores H- 89
(1
µM)
inhibidor
de PKA y
roscovit ina ( 10
2
µM) ,
Post eriorm ent e, fueron dañadas con ( A) radiación UV ( 4 m J/ cm ) ó ( B) pépt ido
inhibidor
de CDKs.
- am iloide ( 10 µM) .
Cant idades iguales de prot eínas ( 200 µg) de las m uest ras recolect adas 2 horas luego del daño fueron
inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo ant i- V5. Los com plej os inm unes fueron suj et os a SDSPAGE 12% y la fosforilación fue analizada a t ravés de la ut ilidad St orm Phosphoim ager Scanner.
Niveles de p19 inm unoprecipit ado fueron analizados por West ern blot con un ant icuerpo ant i- V5. La
figura es represent at iva de 3 ensayos independient es.
2 .7
Sim u la ción de fosfor ila ción se cue n cia l e n p1 9
En vist a de los result ados descript os, nuest ro siguient e obj et ivo consist ió en
evaluar m ediant e sim ulación in silico las consecuencias est ruct urales que ocurrirían en
p19 en respuest a a las m odificaciones post - t raduccionales post uladas, para finalm ent e
cont rast ar est e result ado con la hipót esis de secuencialidad plant eada a part ir del
análisis in vivo. Para ello, em pleam os una t écnica com put acional, llam ada Dinám ica
Molecular ( MD, por Molecular Dynam ics) , sim ulando la fosforilación secuencial en p19.
Est e est udio se realizó en colaboración con el Dr. Marcelo Mart í int egrant e del
Laborat orio de Biología Est ruct ural del Dept o. de Quím ica Biológica, FCEyN- UBA.
70
RESULTADOS
La MD es una t écnica de sim ulación m olecular en la cual la evolución t em poral de
un grupo de át om os que int eract úan puede ser seguida m ediant e la int egración de sus
ecuaciones de m ovim ient o ( Beard and Schlick, 2001) . Com enzam os el análisis de p19
est udiando, en principio, su est ruct ura sin t ener en cuent a las m odificaciones post t raduccionales a t ravés del program a VMD ( Visual Molecular Dynam ics) . La prot eína
p19 est á form ada por 5 repet iciones de m ot ivos ankirina de aproxim adam ent e 30 a 35
residuos am inoacídicos. Cada repet ición consist e en un m ot ivo est ruct ural t ipo
horquillas β (β- hairpin)
seguido
de
2
α- hélices
ant iparalelas
cada
una
de,
aproxim adam ent e, 10 residuos am inoacídicos ( Figu r a 2 5 ) . La prim era repet ición
carece del β- hairpin inicial. Se observó que p19 es una m olécula de alt a rigidez de
acuerdo a lo indicado por el valor de RMSF m enor a 2 ( RMSF, Root Mean Square
Fluct uat ion) . Est e parám et ro es ut ilizado com o indicador de flexibilidad. Regiones
parcialm ent e flexibles se encuent ran en los 4 giros t ipo β- hairpin y ent re las hélices I y
I I en la quint a repet ición anquirina. El análisis det allado de los residuos post ulados de
ser fosforilados m uest ra que el grupo hidroxilo de la serina 76 se encuent ra form ando
enlaces t ipo puent es de hidrógeno ent re el grupo carbonilo de la valina 69 o el
nit rógeno en posición δ de la hist idina 79. El hidroxilo en la t reonina 141 form a
puent es de hidrógeno con el carboxilo del ácido glut ám ico ( Glu) en posición 144 y ést e
a su vez int eract úa fuert em ent e con la arginina ( Arg) 135.
Figu r a 2 5 . Esqu e m a de la e st r uct ur a de p1 9 for m a da por 5 r e pe t icion e s de m ot ivos
a n k ir ina .
La com paración direct a ent re las est ruct uras prom edio de p19 y p19 fosforilada en
serina 76 ( P- p19) , realizada a t ravés del program a AMBER, m uest ra que dichas
71
RESULTADOS
est ruct uras son m uy sim ilares con un valor t ot al de RMSD de 2,03 ( RMSD, Root Mean
Square Deviat ion) . Est e parám et ro es ut ilizado com o m edida num érica de las
diferencias ent re 2 est ruct uras, es la m edida de la dist ancia prom edio ent re los
esquelet os carbonados superpuest os de las prot eínas analizadas ( Figu r a 2 6 A) . Sin
em bargo, la sim ulación de la fosforilación en serina 76, post ulada com o la prim era en
ocurrir, produce un aum ent o m arcado en la m ovilidad del m ot ivo β- hairpin de la
t ercera repet ición ankirina, donde se encuent ra serina 76, y t am bién en el de la cuart a
repet ición. En la est ruct ura de p19 am bos hairpins se encuent ran cercanos ent re sí
pero la presencia del grupo fosfat o separa est as est ruct uras. Un increm ent o en la
m ovilidad, t am bién se observa en el m ot ivo β- hairpin del quint o dom inio ankirina
donde se posiciona la t reonina 141. Diferencias m enores se observan t am bién en el
giro ent re las hélices I y I I de est e últ im o dom inio.
El grupo fosfat o en serina 76 se observa solvat ado y form ando un enlace
alt am ent e est able con el grupo am ino de la asparagina 68. Las int eracciones en
t reonina 141 no se m odifican respect o de las observadas para p19 sin fosforilar.
Por ot ro lado, cuando se sim ula la fosforilación de los dos residuos serina 76 y
t reonina 141 ( PP- p19) , la m ovilidad es m uy sim ilar a la observada para P- p19. La
com paración direct a ent re las est ruct uras de P- p19 y PP- p19 m uest ra, com o era
esperado, que las principales diferencias se encuent ran en el quint o dom inio ankirina
dónde est á localizada la t reonina 141 ( Figu r a 2 6 B) . La presencia del grupo fosfat o
rom pe la int eracción ent re Arg 135 y Glu 144. El am inoácido Glu 144 es alej ado y se
est ablece, ent onces, una fuert e int eracción ent re Arg 135 y el grupo fosfat o.
Los result ados de est e análisis sugieren que la fosforilación en serina 76 podría
conducir a cam bios conform acionales del t ercer al quint o m ot ivo ankirina en est a
m olécula. Llam at ivam ent e, en est e últ im o m ot ivo, los cam bios son observados en la
región
que
cont iene
a
la
t reonina
141.
Post ulam os
que
est os
cam bios
conform acionales generados por la fosforilación en serina 76 podrían perm it ir la
int eracción ent re p19 y una segunda quinasa, probablem ent e PKA, que act úe sobre el
sit io t reonina 141. Finalm ent e, los cam bios observados por est a segunda fosforilación
podrían favorecer int eracciones con ot ras prot eínas ligadas a la función de p19 en la
reparación del ADN.
72
RESULTADOS
Figu r a 2 6 . Sim u la ción de la fosfor ila ción de p1 9 e n se r ina 7 6 y t r e on in a 1 4 1 . ( A) Dist anciaCA ent re las est ruct uras prom edio de p19 y p19 fosforilada en serina 76 ( P- p19) . Com paración ent re
las est ruct uras de p19 ( celest e) y P- p19 ( roj o) en serina76. ( B) Dist ancia- CA ent re las est ruct uras
prom edio de P- p19 y p19 fosforilada en serina 76 y t reonina 141 ( PP- p19) . Com paración ent re las
est ruct uras de P- p19 ( roj o) y PP- p19 ( am arillo) .
2 .8
CD K2 e st á in volu cr a da e n la fosfor ila ción de p1 9
En las figuras 23 y 24 dem ost ram os, ut ilizando un inhibidor específico para ciert os
m iem bros de la fam ilia CDK, que alguna de est as enzim as est á relacionada con la
fosforilación de p19. Por ot ro lado, la predicción de quinasas con pot encial para
fosforilar p19 m ost ró a CDK5 com o candidat a a fosforilar est a prot eína en serina 76
( Tabla 3) . CDK5 es una serina t reonina quinasa con alt o grado de hom ología con
73
RESULTADOS
CDK1 y CDK2 ( Meyerson et al., 1992) . La expresión de CDK5 es principalm ent e
abundant e en el sist em a nervioso cent ral adult o, se observa en un nivel int erm edio en
t est ículo y a baj o niveles o de form a indet ect able en ot ros t ej idos ( Tsai et al., 1994) .
En cuant o a la act ividad de CDK5, solo a sido descript a en cerebro y no se ha
encont rado act ividad en líneas celulares de ot ros t ej idos a pesar de cont ar con alt a
expresión de CDK5 ( Tsai et al., 1994) . Est e hecho se debe a que la act ivación de
CDK5 depende de la presencia de su subunidad regulat oria p35 la cual t iene un pat rón
de expresión específico de neuronas. En base a est os dat os, y t eniendo en cuent a que
en los m odelos celulares en dónde fue evaluada la fosforilación, hast a aquí al m enos,
no fue report ada la expresión de p35, lo cual excluiría la part icipación de CDK5,
decidim os evaluar si CDK1 y/ o CDK2 podrían est ar im plicadas en la fosforilación de
p19. Tant o CDK1 com o CDK2 com part en la m ism a secuencia consenso de fosforilación
que CDK5, la cual est á const it uida por una serina ó t reonina seguida por una prolina y
un am inoácido básico en la posición + 3, es decir, ( S/ T) PX ( K/ H/ R) ( Songyang et al.,
1994; Songyang et al., 1996) . La secuencia de p19 en la región de serina 76,
pot encial am inoácido fosforilado por CDKs, t iene un consenso perfect o para est as
quinasas const it uido por la secuencia S P V H ( Figur a 2 0 A) .
En prim er lugar, buscam os dism inuir la expresión de CDK1 o de CDK2 a t ravés de
la ut ilización de un oligonucleót ido ant isent ido específico para sus secuencias ( ASCDK1
y ASCDK2) . La efect ividad del oligonucleót ido diseñado para cada una fue evaluada en
la línea celular WI - 38. Las células fueron t ransfect adas con est os oligonucleót idos, 24
horas ant es de la recolección de las m uest ras. Observam os que los niveles de ARNm
de CDK1 y CDK2 result aron dism inuidos en los t rat am ient os con ASCDK1 y ASCDK2
respect ivam ent e, considerándolos ent onces com o adecuados para cont inuar con los
siguient es ensayos ( Figu r a 2 7 ) .
74
RESULTADOS
Figu r a 2 7 . D ism in u ción de los n ive le s de CD K1
y CD K2
u t iliza n do oligon u cleót idos
a n t ise nt ido e spe cíficos. Células WI - 28 fueron t ransfect adas o no con un oligonucléot ido ant isent ido
específico para CDK1 ó CDK2 ( ASCDK1 y ASCDK2) ó con un oligonucleót ido inespecífico ( AScont rol) .
24 horas luego de la t ransfección las células fueron irradiadas o no con UV ( 4 m J/ cm 2 ) y las m uest ras
recolect adas en los t iem po indicados. ARN t ot al ( 20μg) fueron analizados por Nort hern blot con las
sondas m arcadas con
32
P indicadas en el m argen izquierdo. La figura es represent at iva de 2 ensayos
independient es.
Est udiam os, luego, si la dism inución en los niveles de CDK1 o CDK2 m ost raba
algún efect o sobre la fosforilación de p19 endógena. Nuevam ent e, el oligonucleót ido
cont ra las CDKs fue t ransfect ado 24 horas ant es de com enzar el ensayo de
fosforilación in vivo. Analizando los result ados podem os ver que, el em pleo de
ASCDK2, dism inuye sensiblem ent e los niveles de fosforilación de p19 ( Figu r a 2 8 ) . La
inhibición incom plet a del proceso de fosforilación, en est e caso, podría explicarse
señalando que los niveles prot eicos de CDK2 no fueron dism inuidos en su t ot alidad por
est a t écnica. Por ot ro lado, el oligonucleót ido ASCDK1 no t uvo efect o sobre la
fosforilación. Sin em bargo, no podem os descart ar su part icipación en la fosforilación
de p19 a part ir de est e result ado. CDK1 t iene act ividad principalm ent e en las fases
G2/ M. Est os ensayos fueron realizados en células asincrónicas, por lo cual la población
de células en est as fases es baj a. Por lo t ant o, si CDK2 y CDK1 est uvieran realm ent e
fosforilando a p19, la dism inución en los niveles de CDK1 podría no afect ar la
fosforilación observada del inhibidor. La act ividad de CDK2, en m ayor proporción en
las células asincrónicas, podría ocult ar el cam bio en la fosforilación de p19 dado por el
em pleo del oligonucleót ido ASCDK1. Est e punt o será desarrollado m ás profundam ent e
en la discusión de est e t rabaj o.
75
RESULTADOS
Concluim os de esa figura que CDK2 efect ivam ent e part icipa de la fosforilación de
p19 en respuest a a luz UV. Por ot ro lado, la part icipación de CDK1 m ediant e est a
est rat egia debería ser evaluada nuevam ent e en poblaciones de células sincronizadas.
F igu r a 2 8 . CD K2 pa r t icipa e n la fosfor ila ción de p1 9 . Células WI - 28 fueron t ransfect adas o no
con un oligonucléot ido ant isent ido específico para CDK1 ó CDK2 ( ASCDK1 y ASCDK2) ó con
oligonucleót ido
inespecífico
( AScont rol) .
preincubadas con 0,5 m Ci de
32
Veint icuat ro
horas
luego
de
la
t ransfección
fueron
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3 horas. Post eriorm ent e, fueron
dañadas o no con radiación UV ( 4 m J/ cm 2 ) . Cant idades iguales de prot eínas ( 150 µg) de las m uest ras
recolect adas 2 horas luego del daño fueron inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo ant i- p19
hum ano. Los com plej os inm unes fueron suj et os a SDS- PAGE 12% y la fosforilación fue analizada a
t ravés
de
la
ut ilidad
St orm
Phosphoim ager
Scanner.
Los
ext ract os
ut ilizados
en
la
inm unoprecipit ación fueron analizados por West ern Blot para las prot eínas indicadas. La figura es
represent at iva de 3 ensayos independient es.
2 .9
CD K2 y CD K5 t ie n e n la ca pa cida d de fosfor ila r e n for m a dir e ct a a
p1 9
Cont inuam os evaluando la posibilidad de que p19 est uviera siendo fosforilada en
form a direct a por las CDKs ant es m encionadas, CDK2 y CDK5. Com enzam os con
ensayos de fosforilación in vit ro em pleando pépt idos de p19 cont eniendo el sit io serina
76 pot encialm ent e fosforilable por est as quinasas ( p- S76: RGTSPVHDAART) . Para ello
se ut ilizaron células HEK- 293T que fueron irradiadas con luz UV. Treint a m inut os
después las células fueron recolect adas y se prepararon ext ract os. CDK2 fue
inm unoprecipit ada con un ant icuerpo específico a part ir de dichos ext ract os.
76
RESULTADOS
Del m ism o m odo, CDK5 fue inm unoprecipit ada a part ir de células SH- SY5Y de
neuroblast om a en las cuales fue report ada su act ividad ( Sharm a M. et . Al., 2002) . Los
inm unoprecipit ados fueron incubados j unt o con los pépt idos en un buffer de reacción
adecuado cont eniendo γ
32
P- ATP, a 30 º C y por 30 m inut os. El volum en t ot al, luego
de la reacción, fue sem brado en papel de fosfocelulosa y la m arca radioact iva m edida
a t ravés de un cont ador de cent elleo. Com o cont rol de la act ividad de las enzim as
inm unprecipit adas se ut ilizó un pépt ido de hist ona H1 cont eniendo una secuencia
consenso para CDKs ( p- H1: PKTPKKAKKL) dado que las diferent es variant es de
hist ona 1 ( H1) poseen varios sit ios consenso para est as quinasas ( Talasz et al., 1996) .
Los alt os niveles de m arca radioact iva en las m uest ras del pépt ido H1 m uest ran que
las quinasas inm unoprecipit adas se encont raban act ivas baj o las condiciones del
ensayo ( Figu r a 2 9 A y B) . Los result ados obt enidos para el pépt ido S76, cuando es
incubado t ant o con CDK2 com o con CDK5, m uest ran alt os niveles de incorporación de
32
P en el m ism o. Est e hecho señala que el pépt ido de p19 efect ivam ent e puede ser
fosforilado por am bas quinasas est udiadas.
Figur a 2 9 . CD K2 y CD K5 fosfor ila n e n for m a dir e ct a un pé pt ido de p1 9 . Ensayos de
fo sforilación in vit ro de un pépt ido de p19 cont eniendo el sit io definido de fosforilación serina 76 ( pS76) . Células HEK- 293T fueron irradiadas con luz UV y 30 m inut os luego del daño se prepararon
ext ract os a part ir de los cuales fue inm unoprecipit ada CDK2. Del m ism o m odo, CDK5 fue
inm unoprecipit ada a part ir de células SH- SY5Y. Ot ro pépt ido cont eniendo un sit io de fosforilación par a
CDK correspondient e a la prot eína H1 fue ut ilizado com o cont rol de act ividad de las quinasas. Los
inm unoprecipit ados de CDK2 ( A) y CDK5 ( B) fueron incubados j unt o con los pépt idos en un buffer de
reacción adecuado cont eniendo
32
ATP, a 30 º C y por 30 m inut os. El volum en t ot al de reacción fue
absorbido en papel de fosfocelulosa y la m arca radiact iva m edida a t ravés de un cont ador de
cent elleo. La figura m uest ra la m edia ± DE de los valores obt enidos en dos ensayos independient es
por t riplicado.
77
RESULTADOS
Los result ados observados con la aplicación de est a prim era est rat egia apoyan la
posibilidad de la acción direct a de CDK2 o CDK5 sobre el sit io serina 76 en p19.
Ahondando en est e punt o, realizam os ensayos de fosforilación in vit ro con las
quin asas CDK2 y CDK5 pero ahora sobre la prot eína p19 ent era. Para est o, en prim er
lugar expresam os y purificam os la prot eína recom binant e GST- p19 ( Figu r a 3 0 A y
B) . Una vez purificada est a prot eína realizam os ensayos de fosforilación in vit ro
obt eniendo CDK2 ó CDK5 t al com o fue descript o para la Figura 29. Observam os que
cuando GST- p19 es incubada con CDK2, se obt iene una banda de fosforilación
correspondient e al peso m olecular de GST- p19. Un result ado sim ilar se obt iene
cuando la quinasa ut ilizada en la incubación es CDK5 ( Figu r a 3 1 A y B) . Hist ona H1
fue em pleada com o cont rol de la act ividad de las enzim as. Concluim os que, t ant o
CDK2 com o CDK5, son capaces de fosforilar in vit ro a p19 y que el m ot ivo que incluye
el sit io serina 76 sería el sust rat o de est as quinasas.
Fig ur a 3 0 . I nducción y pur ifica ción de GST- p1 9 . ( A) Cult ivos de bact erias BL21( DE3) pLys GSTp19 fueron incubados con I PTG ( 0,4 m M) a 37 º C por 4 horas para inducir la expresión de GST- p19.
Mu est ras a diferent es t iem pos de incubación ( 15 µl) fueron t om adas y analizadas por SDS- PAGE 12%
y t inción por Coom asie Blue para verificar la inducción. La purificación de GST- p19 fue realizada a
t ravés de una resina de int ercam bio con glut at ión según el prot ocolo descript o por el frabricant e
( SI GMA) . ( B) Muest ras de los eluidos de est a purificación ( 10 µl) fueron analizados por SDS- PAGE
12% y t eñidos con Coom asie Blue.
78
RESULTADOS
Figu r a 3 1 . Fosfor il a ción de GST- p1 9 por CD K2 y CD K5 . Ensayos de fosforila ción in vit ro de GSTp19 por CDK2 y CDK5. Células HEK- 293T fueron irradiadas con luz UV y 30 m inut o s luego del daño se
prepararon ext ract os a part ir de los cuales fue inm unoprecipit ada CDK2. Del m ism o m odo, CDK5 fue
in m unoprecipit ada a part ir de células SH- SY5Y. Muest ras sin el agregado de ant icuerpo para
inm unoprecipit ar t am bién fueron preparadas. Hist ona H1 fue ut ilizada com o cont rol de act ividad de
las quinasas. Los inm unoprecipit ados de CDK2 ( A) y CDK5 ( B) fueron incubados j unt o con GST,
GST- p19 ó Hist ona H1. Com o cont rol, GST- p19 t am bién fue incubada con las m uest ras precipit adas
sin ant icuerpo. La reacción fue realizada en un buffer de reacción adecuado cont eniendo
32
ATP, a
30º C y por 30 m inut os. Finalizada la reacción las m uest ras fueron separadas por SDS- PAGE 12% y la
fosforilación en el gel fue analizada a t ravés de la ut ilidad St orm Phosphoim ager Scanner. La figura es
represent at iva de t res ensayos independient es.
2 .1 0
En
PKA pu e de fosfor ila r e n for m a dir e ct a a p1 9
experim ent os
ant eriores
hem os
dem ost rado
que
PKA
part icipa
de
la
fosforilación de p19 en respuest a a daño genot óxico y post ulam os que la fosforilación
79
RESULTADOS
dependient e de est a quinasa ocurriría en la t reonina 141. Buscam os ent onces evaluar
si PKA t iene capacidad de fosforilar direct am ent e a p19. Em pleam os, en prim er lugar,
el ensayo de fosforilación in vit ro descript o para la figura 29, que im plica la ut ilización
de pépt idos con residuos pot enciales de ser fosforilados. En est e caso, la secuencia de
p19 a est udiar consist ió en un pépt ido cont eniendo la t reonina 141 ( p- T141:
RDARGLTPLELA) . Se ut ilizó la subunidad cat alít ica de PKA ( PKAc) purificada de
corazón bovino y liofilizada ( cedida gent ilm ent e por la Dra. Silvia Rossi, del
Laborat orio de Biología Molecular, FCEN- UBA) . Cóm o cont rol de la act ividad de la
enzim a se ut ilizó un pépt ido sust rat o de PKA denom inado kém pt ido. El kém pt ido es un
hept apépt ido derivado del sit io de fosforilación de la piruvat o quinasa en hígado y
cuya secuencia es la siguient e: Leu- Arg- Arg- Ala- Ser- Leu- Gly. PKAc y los pépt idos
fueron incubados en un buffer de reacción adecuado cont eniendo γ
32
P- ATP, a 30 º C y
por 30 m inut os. El volum en t ot al, luego de la reacción fue sem brado en papel de
fosfocelulosa y la m arca radioact iva cont enida en los papeles m edida a t ravés de un
cont ador de cent elleo.
El result ado de est e ensayo m uest ra alt os niveles de m arca radioact iva en la
m uest ra del kém pt ido corroborando la act ividad de PKAc baj o las condiciones del
ensayo ( Figu r a 3 2 ) . En cont ram os que el pépt ido T141 t am bién t iene alt os niveles de
inco rporación de
32
P al ser incubado con PKAc. Est a observación dem uest ra que est a
secuencia de p19 efect ivam ent e puede ser fosforilada por la enzim a. Est e result ado
apoya la posibilidad de una act ividad direct a de PKA sobre el sit io t reonina 141 en
p19.
Profundizando en el est udio de la fosforilación direct a de p19 por PKA, realizam os
ensayos de fosforilación in vit ro con la subunidad cat alít ica de la quinasa PKA pero
ahora sobre la prot eína p19 ent era ( Figu r a 3 3 ) . Al igual que para el caso del est udio
de
las
CDKs,
ut ilizam os
en
est e
punt o
la
prot eína
recom binant e
GST- p19.
Encont ram os que cuando GST- p19 es incubada con PKAc en condiciones adecuadas
est a prot eína result a fosforilada. No se observa fosforilación para GST sola incubada
con PKAc. Más aún, la fosforilación en GST- p19 result a específica de PKAc puest o que
la incubación con H89 la inhibe por com plet o. Com o cont rol de act ividad de la enzim a
ut ilizam os la prot eína CREB
Est os result ados, en conj unt o, señalan que PKA es capaz de fosforilar in vit ro a
p19 y que el m ot ivo que incluye el sit io t reonina 141 sería el sust rat o de est a quinasa.
80
RESULTADOS
Figur a 3 2 . PKA fosfor ila e n for m a dir e ct a un pé pt ido de p1 9 . Ensayos de fosforilación in vit ro
de un pépt ido de p19 cont eniendo el sit io definido de fosforilación t reonina 141 ( p- T141) . Ot ro
pépt ido cont eniendo un sit io de fosforilación para PKA ( Kém pt ido) fue ut ilizado com o cont rol de
act ividad de la quinasa. PKAc purificada de corazón bovino fue incubada con los pépt idos en un buffer
de reacción adecuado cont eniendo
32
ATP, a 30 º C y por 30 m inut os. El volum en t ot al de reacción fue
absorbido en papel de fosfocelulosa y la m arca radiact iva m edida a t ravés de un cont ador de
cent elleo. La figura m uest ra la m edia ± D.E. de los valores obt enidos en dos ensayos independient es
por t riplicado.
Figu r a 3 3 . Fosfor ila ción de GST- p1 9 por PKA. Ensayos de fosforilación in vit ro de GST- p19 por
PKAc. PKAc fue incubada o no j unt o con GST, GST- p19 ó CREB. H- 89 fue agregado a la reacción en
las m uest ras indicadas para inhibir la act ividad de la enzim a PKA. La reacción fue realizada en un
buffer adecuado cont eniendo
32
ATP, a 30 º C y por 30 m inut os. Finalizada la reacción las m uest ras
fueron separadas por SDS- PAGE 12% y la fosforilación en el gel analizada a t ravés de la ut ilidad
St orm Phosphoim ager Scanner. La figura es represent at iva de dos ensayos independient es.
81
RESULTADOS
2 .1 1
PKA in t e r a ccion a con p1 9 in vivo
Habiendo dem ost rado que p19 puede ser fosforilada direct am ent e por PKAc in
vit ro, nos propusim os det erm inar si est as prot eínas podrían int eraccionan t am bién in
vivo.
Para llevar a cabo est e punt o, realizam os ensayos de co- inm unoprecipit ación en
los cuales se t ransfect aron, en células BHK- 21, vect ores de expresión para p19wt y la
subunidad cat alít ica de PKA ( PKAc) . Las células, dañadas con luz UV 24 horas luego de
la t ransfección, fueron cosechadas y los ext ract os preparados a los 45 m inut os de
aplicado el daño. Los ext ract os fueron inm unoprecipit ados con el ant icuerpo ant i- V5 y
los com plej os inm unes analizados por West ern blot con un ant icuerpo ant i- PKA
( Figu r a
34 ).
Podem os
observar
que
PKAc
co- inm unoprecipit a
con
V5- p19,
dem ost rando que PKA efect ivam ent e int eracciona con p19 in vivo post - daño.
Figu r a 3 4 . p1 9 in t er a ccion a con PKA. Células BHK- 21 fueron co- t ransfect adas con p19wt
fusionada al epít ope V5 ó con el vect or sin la secuencia de p19 y con PKAc. Veint icuat ro horas
después de la t ransfección las células fueron dañadas con radiación UV ( 4 m J/ cm 2 ) y las m uest ras
cosechadas a diferent es t iem pos. Cant idades iguales de prot eínas ( 200 µg) de las m uest ras
recolect adas fueron inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo ant i- V5. Los com plej os inm unes fueron
suj et os a SDS- PAGE 12% . La co- inm unoprecipit ación de PKAc y p19wt fue analizada por West ern Blot
ut ilizando un ant icuerpo ant i- PKAc. Los ext ract os ut ilizados en la inm unoprecipit ación fueron
analizados para las prot eínas indicadas por West ern Blot con un ant icuerpo ant i- V5, ant i- PKAc y ant i-
β- act ina. La figura es represent at iva de 3 ensayos independient es.
82
RESULTADOS
2 .1 2
La fosfor ila ción de p1 9 lu e go de da ñ o ge n ot óx ico e s in icia da e n
e l cit opla sm a
En nuest ro laborat orio se ha dem ost rado que, en condiciones basales, p19 se
localiza en el cit oplasm a y que, frent e a un daño en el ADN, es t ranslocada al núcleo
( Cerut i et al., 2005) . Sin em bargo, el análisis de la secuencia prot eica de p19 con la
herram ient a bioinform át ica PSORTI I , no ident ifica la presencia de una señal de
localización nuclear ( NLS) . En est e sent ido, la fosforilación observada en p19 luego de
daño se present a com o una posible form a de cont rol t em poral y espacial de su
relocalización.
Com enzam os por analizar el com part im ent o celular en el cual p19 es fosforilada
en respuest a a la acción de genot óxicos. Se ut ilizaron células WI - 38 las cuales fueron
m arcadas m et abólicam ent e con
32
P- ort ofosfat o, dañadas con luz UV y cosechadas a
diferent es t iem pos luego del daño ( 0, 20, 40, 60 y 120 m inut os) . El fraccionam ient o
subcelular se realizó ut ilizando una solución hipot ónica para obt ener la fracción
cit oplasm át ica ( C) y una solución de alt a concent ración salina y agit ación m ecánica en
el caso de la fracción nuclear ( N) . La prot eína p19 fue inm unoprecipit ada a part ir de
las diferent es fracciones y los inm unoprecipit ados con m arca radiaoct iva analizados
com o fue descript o ant eriorm ent e.
Encont ram os que a part ir de los 20 m inut os y hast a al m enos los 40 m inut os
luego del daño, p19 fosforilada se encuent ra solam ent e en la fracción cit oplasm át ica
( Figu r a 3 5 A) . Sin em bargo, alcanzando los 60 m inut os, p19 fosforilada es encont rada
t ant o en la fracción cit oplasm át ica com o en la nuclear. El m ism o pat rón se observa a
los 120 m inut os de inducido el daño.
Cuando analizam os la localización de la prot eína por West ern blot , encont ram os
que p19 se encuent ra en cit oplasm a a los 20 m inut os de generado el daño y que,
luego de 60 m inut os, la prot eína aparece en la fracción nuclear ( Figu r a 3 5 B) . Est e
result ado concuerda con la cinét ica de t ranslocación observada en el ensayo de la
fosforilación.
Est as observaciones nos perm it en concluir que la fosforilación de p19 ocurre, ó al
m enos es iniciada, en el cit oplasm a y que, luego de ser fosforilada en est e
com part im ient o, se produce la t ranslocación nuclear. Est e hecho cont ribuye con la
hipót esis previa que relaciona la t ranslocación nuclear de p19 en respuest a al daño,
con est a m odificación post - t raduccional.
83
RESULTADOS
Figur a 3 5 . La fosfor ila ción de p1 9 e s a l m e nos inicia da e n cit opla sm a . ( A) Células WI - 38
fueron preincubadas con 0,5 m Ci de
32
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3 horas y t rat adas
post eriorm ent e con radiación UV ( 4 m J/ cm 2 ) . Las m uest ras fueron cosechadas en los t iem pos
indicados y cada una fue suj et a a fraccionam ient o subcelular. Cant idades iguales de prot eínas ( 150
µg) de las m uest ras recolect adas a diferent es t iem pos luego del daño fueron inm unoprecipit adas
usando un ant icuerpo ant i- p19 hum ano. Los com plej os inm unes fueron suj et os a SDS- PAGE 12% y la
fosforilación fue analizada a t ravés de la ut ilidad St orm Phosphoim ager Scanner. ( B) Células WI - 38
fueron irradiadas con UV ( 4 m J/ cm 2 ) y cosechadas en los t iem pos indicados. Cada una fue suj et a a
fraccionam ient o subcelular. Las m uest ras fueron analizadas por West ern blot ut ilizando un ant icuerpo
ant i- p19 hum ano. La eficiencia del fraccionam ient o subcelular fue evaluada en los ext ract os con un
ant icuerpo ant i- GAPDH com o m arcador de cit oplasm a y ot ro ant i- hist ona H3 t ot al com o m arcador de
núcleo. La figura es represent at iva de 3 ensayos independient es. ( C, cit oplasm a; N, núcleo; P- p19,
prot eína p19 fosforilada) .
2 .1 3
La se r in a e n la posición 7 6 e s n e ce sa r ia pa r a la t r a n sloca ción
n u cle a r de p1 9
Los experim ent os ant eriores no nos perm it en
definir
el papel de am bas
fosforilaciones en la localización y t ranslocación de p19. Para aclarar est e punt o
aplicam os una est rat egia sim ilar pero ut ilizando las m ut ant es de fosforilación de p19
previam ent e descript as.
84
RESULTADOS
A part ir del result ado obt enido en la figura ant erior, se plant earon varias
posibilidades respect o de la fosforilación de p19 en los dos sit ios serina 76 y t reonina
141 y su relación con la localización subcelular de p19 luego del daño genot óxico.
Previam ent e present am os evidencias referidas a que p19 sería fosforilada en form a
secuencial, prim ero en serina 76 y luego en t reonina 141. Una posibilidad consist e en
que la fosforilación de p19, t ant o en serina 76 com o en t reonina 141, ocurriera en el
cit oplasm a y que alguno de est os dos event os o am bos fueran necesarios para
prom over la t ranslocación al núcleo. Ot ra posibilidad es que p19 fuera fosforilada en el
cit oplasm a sólo en serina 76 y que est a m odificación conduj era a la t ranslocación de la
prot eína para luego ser fosforilada en t reonina 141 en el núcleo. Por últ im o, podría
ocurrir que ninguna de las dos fosforilaciones señaladas fueran necesarias para la
relocalización nuclear post - daño.
Se realizaron ensayos de fosforilación in vivo t ransfect ando células BHK- 21 con
vect ores de expresión para p19wt o p19T141A. La m ut ant e p19S76A no puede ser
fosforilada por lo cual, logicam ent e, fue excluída de est e ensayo. Veint icuat ro horas
luego de la t ransfección se aplicó el daño y las m uest ras fueron recolect adas y
fraccionadas a los 0, 20 y 60 m inut os post UV. Las prot eínas p19wt y p19T141A
fueron inm unoprecipit adas de las fracciones C y N con el ant icuerpo cont ra V5 y los
inm unoprecipit ados analizados com o fue descript o ant eriorm ent e.
Com probam os
que
p19wt
sobreexpresada
m uest ra
el
m ism o
pat rón
de
com port am ient o que p19 endógena: a los 20 m inut os se encuent ra fosforilada
exclusivam ent e en cit oplasm a y luego, a part ir de
los 60 m inut os, se observa
fosforilada t am bién en el núcleo ( Figu r a 3 6 A) .
Por su part e, el análisis de la fosforilación de p19T141A m uest ra que est a m ut ant e
no pierde la capacidad de t ranslocación nuclear, m ost rando m arca de fosforilación a
los 20 m inut os únicam ent e en cit oplasm a y, luego, a los 60 m inut os t am bién en el
núcleo. Un result ado sim ilar fue obt enido cuando se evaluó la fosforilación endógena
de p19 en células WI - 38 ut ilizando el inhibidor H89 para inhibir PKA, la quinasa que
fosforilaría en la t reonina 141 ( Figu r a 3 6 A y 3 6 B) .
El análisis de los niveles prot eicos por West ern blot se realizó para p19 endógena,
p19wt , p19T141A y ahora sí t am bién para p19S76A ( Figur a 3 6 A, B y C) . Com o era
de esperar las prot eínas p19wt y p19T141A se encuent ran en cit oplasm a al m om ent o
de aplicar el daño, observándose, a los 60 m inut os, un aum ent o de los niveles
prot eicos nucleares. Llam at ivam ent e, est e aum ent o en los niveles de prot eína en el
núcleo no es observado para p19S76A que no t iene capacidad de fosforilarse.
85
RESULTADOS
Est os result ados nos llevan a concluir dos punt os im port ant es. Por un lado,
m uest ran que la m ut ant e p19T141A se t ransloca al núcleo aún sin poder ser
fosforilada en t reonina 141 y consecuent em ent e descart am os est e am inoácido com o
necesario para el pasaj e de p19 al núcleo. Y por ot ro, vem os que p19S76A, incapaz de
ser fosforilada, pierde la relocalización nuclear luego del daño, por lo cual señalam os
que la fosforilación de p19, en part icular la fosforilación del sit io serina 76, sí t iene un
efect o sobre la t ranslocación nuclear.
86
RESULTADOS
Figu r a 3 6 . La fosfor ila ción e n se r ina 7 6 e s n ece sa r ia pa r a la t r a nsloca ción de p1 9 a l n ú cle o
e n r e spue st a a da ño. Células BHK- 21 fueron t ransfect adas con p19wt ó con p19T141A ( A) ; con
p19wt ( B) ; ó con p19S76A ( C) . En ( A) las células fueron incubadas con 0,5 m Ci de
32
P- ort ofosfat o
de sodio durant e 3 horas, 24 horas luego de la t ransfección. Post eriorm ent e, fueron dañadas con UV
( 4 m J/ cm 2 ) . Cant idades iguales de prot eínas ( 200 µg) , de las m uest ras recolect adas en los t iem pos
indicados y fraccionadas subcelularm ent e, fueron inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo ant i- V5.
Los com plej os inm unes fueron suj et os a SDS- PAGE 12% y la fosforilación fue analizada a t ravés de la
ut ilidad
St orm
Phosphoim ager
Scanner.
( B)
Las
células
t ransfect adas
fueron
m arcadas
m et abólicam ent e com o fue descript o para ( A) y 1 hora previa al daño el inhibidor de PKA, H- 89 ( 1
µM) , fue agregado al m edio de incubación. Cant idades iguales de prot eínas ( 200 µg) , de las m uest ras
recolect adas en los t iem pos indicados y fraccionadas subcelularm ent e, fueron inm unoprecipit adas
usando un ant icuerpo ant i- V5. Los com plej os inm unes fueron analizados com o fue descript o para ( A) .
( C) Las células t ransfect adas con p19S76A fueron dañadas con UV ( 4 m J/ cm 2 ) y cosechadas en los
t iem pos indicados. Cada m uest ra fue suj et a a fraccionam ient o subcelular. ( A, B, C) Los ext ract os
fueron analizados por West ern Blot ut ilizando un ant icuerpo ant i- V5. La eficiencia del fraccionam ient o
subcelular fue evaluada en los ext ract os con un ant icuerpo ant i- GAPDH com o m arcador de cit oplasm a
y ot ro ant i- hist ona H3 t ot al com o m arcador de núcleo. Las figuras son represent at ivas de 3 ensayos
independient es. ( C, cit oplasm a; N, núcleo; P- p19, prot eína p19 fosforilada)
87
RESULTADOS
Ca pit u lo 3 : Re le va n cia fisiológica de l pr oce so de
fosfor ila ción de p1 9 I N K4 d e n r e spu e st a a ge n ot óx icos
En la prim era part e de est e t rabaj o hem os dem ost rado que p19 present a una
función relacionada al m ant enim ient o de la est abilidad del genom a, caract erizada por
su part icipación en la reparación eficient e del ADN y en el cont rol de las aberraciones
crom osóm icas. En la segunda part e de est a t esis plant eam os que si p19 int egrara la
int rincada red de prot eínas que part icipan de la respuest a celular al daño, podría sufrir
m odificaciones post - t raduccionales que regularan su act ividad. Dem ost ram os que p19
es fosforilada en respuest a a diferent es agent es genot óxicos com o cis- plat ino, pépt ido
β- am iloide y radiación UV. Describim os que la fosforilación de p19 sería secuencial
act uando la quinasa CDK2 o CDK5 sobre la serina en posición 76 y luego PKA en el
sit io t reonina 141 y adem ás que la fosforilación en serina 76 sería requerida para la
t ranslocación de p19 al núcleo.
En est a t ercera part e invest igam os la relevancia fisiológica de la fosforilación de
p19 en un cont ext o celular de daño al ADN. Plant eam os que las fosforilaciones en est a
prot eína serían necesarias para llevar a cabo su papel ligado a la reparación.
3 .1
An á lisis de la con se r va ción de los sit ios se r in a 7 6 y t r e on in a 1 4 1
e n t r e los m ie m br os de la fa m ilia I N K4
Las cuat ro prot eínas I NK4 son est ruct uralm ent e sim ilares y com part en la función
de inhibir específicam ent e las quinasas CDK4 y CDK6. Sin em bargo, encont ram os que
p19 es el único m iem bro de la fam ilia que es inducido en respuest a a UV ( Figur a 5 ) y
que part icipa en la reparación del ADN ( dat os no publicados) . Post ulam os que est a
caract eríst ica exclusiva de p19 podría est ar relacionada con su fosforilación en
respuest a a daño.
Analizam os si los sit ios fosforilables descript os en p19 eran encont rados en las
dem ás prot eínas I NK4. Ut ilizam os el program a T- Coffee para alinear las secuencias de
los cuat ro inhibidores ( Figur a 3 7 ) . Encont ram os que p19 es el único m iem bro de la
fam ilia I NK4 que cont iene los sit ios serina 76 y t reonina 141, est os am inoácidos no
est án conservados ent re las I NK4. La fosforilación exclusiva de p19 en est os
am inoácidos podría en part e ser la responsable de la act ividad singular sobre la
reparación del ADN.
88
RESULTADOS
Figur a 3 7 . Los sit ios se r ina 7 6 y t r e onina 1 4 1 no e st á n conser va dos e n la fa m ilia I N K4 . Las
secuencias prot eicas de los 4 m iem bros de la fam ilia I NK4 fueron alineadas ut ilizando la herram ient a
T- Coffe. Fue analizada la conservación de los 5 sit ios post ulados com o pot enciales de ser fosforilados.
Sólo la t reonina en la posición 89 se encuent ra conservada.
89
RESULTADOS
3 .2
Se r in a 7 6 y Tr e on in a 1 4 1 son n e ce sa r ia s pa r a la fu n ción de p1 9
e n la r e pa r a ción de l AD N
Hem os dem ost rado, ut ilizando la t écnica de UDS, que la sobreexpresión de p19wt
aum ent a significat ivam ent e la capacidad de las células de reparar el ADN ( Figu r a
1 0 A) . En est e punt o evaluam os la relevancia de la fosforilación de p19 en su función
ligada a la reparación del ADN. Ut ilizam os en est e est udio ensayos de UDS para m edir
la capacidad de reparación de células que sobreexpresaban las m ut ant es de
fosforilación de p19.
Fibroblast os WI - 38 fueron t ransfect ados t ransit oriam ent e con p19wt o con las
m ut ant es de p19 ( p19S13A, p19S66A, p19S76A, p19T89A, p19T141A, p19S76T141A,
p19ANKless) j unt o con el vect or pBABE que confiere resist encia a purom icina.
Veint icuat ro horas luego de la t ransfección el m edio fue reem plazado por m edio sin
arginina con 1% de suero fet al bovino y m ant enido en est as condiciones hast a el final
del ensayo ( inhibiendo de est e m odo la replicación sem iconservat iva) . Las células
fueron seleccionadas con purom icina por 60 horas. Luego de finalizada la selección,
ut ilizam os dos t ipos de dañadores: luz UV y pépt ido β- am iloide. Las células dañadas
fueron incubadas con
3
3
H- t im idina por 10 horas y por últ im o, la incorporación de
H- t im idina fue m edida com o indicador de la capacidad de reparación del daño.
Encont ram os que las células en las cuales fueron sobreexpresadas las m ut ant es
p19S13A, p19S66A y p19T89A los niveles de reparación alcanzados result aron
sim ilares a los observados por la sobreexpresión de p19wt para los dos dañadores
ut ilizados ( Figur a 3 8 A, B, C y D ) . Por el cont rario, las células sobreexpresando
alguna de las m ut ant es en serina 76 ó en t reonina 141 ( p19S76A, p19T141A,
p19S76T141A o
p19ANKless)
dism inuyeron
significat ivam ent e
la
capacidad
de
reparación respect o a p19wt , alcanzando niveles com parables a los observados en las
células cont rol ( Figu r a 3 8 A, B, C y D ) .
Est os result ados dem uest ran que solam ent e las m ut aciones que afect an el est at us
de fosforilación de p19, alt eran su capacidad de reparación. Concluim os, finalm ent e,
que la fosforilación en am bos residuos, serina 76 y t reonina 141, es esencial en la
función de p19 de reparación del ADN.
90
RESULTADOS
Figu r a 3 8 . La se r ina 7 6 y la t r e on ina 1 4 1 son cr ít ica s e n la fu n ción de r e pa r a ción . Células
WI - 38 fueron co- t ransfect adas con p19wt ó con las m ut ant es ( p19S13A, p19S66A, p19S76A,
p19T141A, p19S76T141A y p19ANKless) y el vect or p- BABE con resist encia a purom icina. Luego de
24 horas la selección de las células t ransfect adas fue iniciada por el agregado de purom icina y
adem ás m ant enidas en m edio libre de arginina cont eniendo 1% de suero fet al bovino durant e 60
horas. Pasado est e t iem po, las células resist ent es fueron irradiadas con 4 m J/ cm 2 de UV ( A y B) , o
dañadas con
- am iloide ( 10 µM) ( C y D ) , e incubadas con 1 m Ci [ 3H] t im idina. Los lisados celulares
cosechados 10 horas luego del daño fueron analizados por ensayos de sínt esis de ADN no
program ada ( UDS) . La figura m uest ra la m edia ± D.E. de los valores obt enidos en 3 ensayos
independient es por t riplicado. El Test de St udent fue ut ilizado para com parar las m uest ras de p19wt
con sus m ut ant es. ( * P< 0,01) . La expresión de las diferent es prot eínas fue evaluada por West ern blot
con un ant icuerpo ant i- V5.
91
RESULTADOS
3 .3
La sobr e e x pr e sión de p1 9 dism in u ye la a popt osis indu cida por
ge n ot óx icos
Dos m ecanism os son esenciales en respuest a al est rés genot óxico y en el
m ant enim ient o de la int egridad del genom a: la reparación del ADN y la apopt osis.
Cuando el daño al ADN es m uy severo y se encuent ra m ás allá de la capacidad de
reparación, se act ivan program as de m uert e que culm inan en la elim inación de la
célula irreversiblem ent e afect ada. Habiendo dem ost rado, que p19 part icipa en la
reparación eficient e del ADN y que su sobreexpresión aum ent a significat ivam ent e la
capacidad de reparación nos pregunt am os, ent onces, si est a sobreexpresión conferiría
a las células una m ayor resist encia a la m uert e por apopt osis inducida por agent es
genot óxicos. En est e est udio com o indicador del nivel de apopt osis, m edim os la
act ividad de la caspasa- 3. La caspasa- 3 es un fact or clave en la ej ecución de la
apopt osis en
m am íferos.
La caspasa- 9
es act ivada por
el
com plej o
prot eico
denom inado apopt osom a y est a, a su vez act iva las caspasas efect oras, ent re ellas la
caspasa- 3, lo que desencadena las últ im as fases de apopt osis.
La act ividad de est a caspasa fue m edida en células WI - 38 t ransfect adas
t ransit oriam ent e con el plásm ido que expresa p19wt o con el plásm ido pcADN4c sin
insert o com o cont rol y con el vect or pBABE que confiere resist encia a purom icina. Las
células fueron seleccionadas con purom icina por 60 horas. Las células seleccionadas
fueron dañadas con UV o con pépt ido β- am iloide y la act ividad de caspasa- 3 fue
m edida 24 horas luego de inducido el daño. Observam os, com o era de esperar, que
las
células
cont roles
dañadas
alcanzaron
niveles
de
act ividad
de
caspasa- 3
significat ivam ent e m ayores que aquellas que no recibieron daño. Por su part e, las
células que sobreexpresaban p19wt m ost raron niveles de act ividad significat ivam ent e
reducidos respect o al cont rol con am bos t ipos de daños ( Figu r a 3 9 A, B y C) . Est a
dism inución en la act ividad de caspasa- 3 y consecuent em ent e en el program a de
apopt osis se correlaciona con la m ayor eficiencia de reparación de las células
sobreexpresando p19. Concluim os que la sobreexpresión de p19 confiere m ayor
resist encia a la act ivación del proceso apopt ót ico en células WI - 38, com o t am bién fue
dem ost rado para ot ros t ipos celulares en un t rabaj o publicado por nuest ro laborat orio
( Cerut i et al., 2005) .
92
RESULTADOS
3 .4
La fosfor ila ción de p1 9 e s n e ce sa r ia e n la r e sist e n cia qu e e j e r ce
p1 9 con t r a la a popt osis.
Hem os descript o que la sobreexpresión de p19 m ej ora sensiblem ent e la capacidad
de las células de reparar el ADN y que est e aum ent o en la reparación est á
correlacionado con la dism inución en la m uert e por apopt osis. Teniendo en cuent a que
la función en la reparación que ej erce p19 requiere de su fosforilación, est udiam os el
efect o de las m ut ant es de fosforilación sobre la apopt osis inducida por daño.
Evaluam os la act ividad de caspasa- 3 en células WI - 38 t ransfect adas con los
vect ores que expresan las m ut ant es de fosforilación p19S13A, p19S66A, p19S76A,
p19T89A, p19T141A, p19S76T141A y p19ANKless ( Figur a 3 9 A, B y C) . En est e
análisis observam os que las m ut ant es en los sit ios p19S13A, p19S66A y p19T89, que
no m odifican el nivel de fosforilación de la prot eína frent e a daño, dism inuyeron la
act ividad de caspasa- 3 a valores sim ilares a los obt enidos por la sobreexpresión de
p19wt .
Por
el
cont rario,
las
m ut ant es
p19S76A,
p19T141A,
p19S76T141A
y
p19ANKless, que pierden parcial o t ot alm ent e la capacidad de ser fosforiladas,
present an niveles de act ividad de caspasa- 3 sim ilares a los de las células cont rol
frent e a los dos daños em pleados, UV y pépt ido β- am iloide.
Est os result ados perm it en concluir que las m ut ant es que pierden la función de
reparación del ADN t am bién pierden la capacidad de prot eger a las células de la
apopt osis cuando son sobreexpresadas. La fosforilación t ant o del sit io serina 76 com o
la de t reonina 141 result an fundam ent ales en la resist encia que ej erce p19 cont ra la
apopt osis.
93
RESULTADOS
Figur a 3 9 . El e fe ct o pr ot ect or de p1 9 con t r a la a popt osis e s de pe n die n t e de su fu nción e n la
r e pa r a ción de l AD N . Células WI - 38 fueron co- t ransfect adas con p19wt o con las m ut ant es indicadas
de p19 y el vect or pBABE con resist encia a purom icina. Las células resist ent es a purom icina fueron
irradiadas con 4 m J/ cm 2 de UV ( A y B) , o dañadas con
- am iloide ( 10 µM) ( C) , e incubadas por 24
horas. La act ividad de caspasa- 3 fue det erm inada. La figura m uest ra la m edia ± D.E. de 3 ensayos
independient es por t riplicado. El Test de St udent fue ut ilizado para com parar las m uest ras de p19wt
con sus m ut ant es. ( * P< 0,01) . La expresión de las diferent es prot eínas fue evaluada por West ern blot .
94
RESULTADOS
3 .5
La fosfor ila ción de p1 9 n o e st á in volu cr a da e n su fu n ción
in h ibit or ia de l ciclo ce lu la r
Hem os dem ost rado que p19 requiere de la fosforilación en serina 76 y en t reonina
141 para part icipar en la reparación del ADN. Nos pregunt am os si est os sit ios de
fosforilación t am bién est arían involucrados en la función de p19 de inhibir el ciclo
celular.
Células WI - 38 fueron co- t ransfect adas con p19wt ó con las m ut ant es de
fosforilación y pBABE. La capacidad inhibit oria de p19 y de las m ut ant es sobre la
progresión del ciclo celular se evaluó por incorporación de
3
H- t im idina. Las células
t ransfect adas fueron seleccionadas con purom icina por 60 horas. Luego de la
selección, las células fueron incubadas por 4 horas con 3 H- t im idina y post eriorm ent e la
incorporación de m arca radiact iva fue cuant ificada.
En prim er lugar, para la m ut ant e est ruct ural p19ANKless podem os observar que
que, si bien su sobreexpresión inhibe significat ivam ent e la proliferación celular
respect o de las células cont rol, los niveles de incorporación de m arca radiact iva
t riplican los observados para p19wt ( Figu r a 4 0 ) . Est e hecho sugiere que la pérdida
del últ im o dom inio ankirina, adem ás de elim inar la función de reparación, afect a la
unión de p19 con CDK4/ CDK6 y consecuent em ent e la inhibición del ciclo celular. Sin
em bargo, no podem os discrim inar en base a est os result ados, si la elim inación de un
dom inio ankirina com plet o en la prot eína m odifica el plegam ient o de los dem ás
dom inios o si, de hecho, el cuart o dom inio ankirina es requerido para la int eracción
con las CDKs.
En cuant o a las m ut ant es de fosforilación est udiadas ( p19S13A, p19S66A,
p19S76A, p19T89A, p19T141A, p19S76T141A) observam os que t odas ellas arrest aron
el ciclo celular en form a sim ilar a p19wt ( Figur a 4 0 ) . Est o im plica que ninguno de los
sit ios m ut ados est á ligado a la función inhibit oria del ciclo celular. Consecuent em ent e,
la fosforilación de p19, a pesar de ser necesaria en la función de reparación del ADN,
no es requerida para cum plir con su función ant iproliferat iva. En ot ras palabras, las
m ut ant es en p19S76A y p19T141A que pierden la función vinculada a la reparación
conservan int act a la capacidad de inhibir la proliferación celular.
Est a observación apoya t am bién el result ado obt enido en la Figu r a 1 7 en la cuál
post ulam os que, la función de p19 en la reparación no est á relacionada con su
capacidad de inhibir a CDK4 y de conferir a las células m ayor t iem po para la
reparación del ADN.
95
RESULTADOS
Concluim os que ninguno de los dos sit ios serina 76 o t reonina 141 es necesario
para que p19 inhiba la progresión del ciclo celular de form a eficient e, siendo est a
función independient e de la función en la reparación del ADN.
Figur a 4 0 . N inguno de los sit ios de fosfor ila ción pot e ncia le s e n p1 9 son r e que r idos e n la
fu n ción in h ibit or ia de l ciclo ce lula r . Células WI - 38 fueron co- t ransfect adas con p19wt ó con las
m ut ant es ( p19S13A, p19S66A, p19S76A, p19T141A, p19S76T141A y p19ANKless) y el vect or pBABE
con resist encia a purom icina. Luego de 24 horas la selección de las células t ransfect adas fue iniciada
por el agregado de purom icina y m ant enida por 60 horas. Pasado est e t iem po, t odos los cult ivos
fueron incubados con 1 μCi [ H3 ] t im idina y su incorporación evaluada 6 horas m ás t arde. La figur a
m uest ra la m edia ± D.E. de los valores obt enidos en 2 ensayos independient es por t riplicado. El Test
de St udent fue ut ilizado para com parar las m uest ras cont roles con p19wt o sus m ut ant es. ( * P< 0,01) .
La expresión de las diferent es prot eínas fue evaluada por West ern blot con un ant icuerpo ant i- V5.
3 .6
La s m u t a n t e s de p1 9 qu e sim ula n e l e st a do fosfor ila do de la
pr ot e ín a t ie n e n igu a l ca pa cida d de r e pa r a r e l AD N qu e p1 9 sa lva j e
Los efect os causados por la fosforilación de un sit io serina/ t reonina pueden ser a
veces sim ulados reem plazando el am inoácido fosforilable por ácido glut ám ico o
96
RESULTADOS
aspárt ico ( Li et al., 2008; Park et al., 2006) . La carga negat iva que conllevan est os
am inoácidos puede por lo general suplir la función que desem peña el grupo fosfat o en
una prot eína.
Plant eam os que si p19 requiere de la fosforilación en serina 76 y t reonina 141
para llevar a cabo su función en la reparación del ADN ent onces la m ut ación de est os
residuos por ácido glut ám ico podría im it ar el efect o de la fosforilación. Const ruim os
dos m ut ant es de p19, una reem plazando la serina 76 por ácido glut ám ico ( p19S76E) y
la ot ra reem plazando t ant o a la serina 76 com o a la t reonina 141 por est e m ism o
am inoácido ( p19S76ET141E) . p19wt o las m ut ant es fueron t ransfect adas con en
fibroblast os WI - 38 para m edir la capacidad de reparación celular por UDS.
Nuest ros result ados m uest ran que las células que sobreexpresan la m ut ant e
p19S76E, la cual no puede ser fosforilada en est e sit io, alcanzaron niveles de
reparación sim ilares a los observados en las células que sobreexpresan p19wt con
am bos t ipos de daño ( Figu r a 4 1 ) . El reem plazo por ácido glut ám ico en est e sit io
recupera la act ividad que se encuent ra afect ada en la m ut ant e p19S76A ( Figur a 3 8 ) .
Sum ado a est o, las células t ransfect adas con la m ut ant e p19S76ET141E, sin
posibilidad de ser fosforilada en los sit ios descript os, t am bién m ost raron igual
capacidad de reparar el ADN que aquellas sobreexpresando p19wt ( Figu r a 4 1 ) .
Concluim os, ent onces, que las m ut ant es que im it an la fosforilación de p19 t ienen
la m ism a capacidad de m ej orar la reparación que p19wt cuando son sobreexpresadas,
y consecuent em ent e, est os result ados apoyan fuert em ent e a los am inoácidos serina
76 y t reonina 141 descript os hast a aquí com o los sit ios de fosforilación.
Est as evidencias son consist ent es con una vía de regulación de la act ividad de p19
m ediada por la fosforilación de los sit ios serina 76 y t reonina 141 en respuest a a
daño.
97
RESULTADOS
Figu r a 4 1 . La m u t a nt e de p1 9 que im it a la fosfor ila ción e n se r ina 7 6 y t r e on in a 1 4 1
r e cuper a la función de r e pa r a ción. Células WI - 38 fueron co- t ransfect adas con p19wt ó con las
m ut ant es ( p19S76E y p19S76T141E) y el vect or pBABE con resist encia a purom icina. Luego de 24
horas la selección de las células t ransfect adas fue iniciada por el agregado de purom icina y adem ás
m ant enidas en m edio libre de arginina cont eniendo 1% de suero fet al bovino durant e 60 horas.
Pasado est e t iem po, las células fueron irradiadas con 4 m J/ cm 2 de UV, o dañadas con
- am iloide ( 10
µM) , e incubadas con 1 m Ci [ 3H] t im idina. Los lisados celulares cosechados 10 horas luego del daño
fueron analizados por ensayos de sínt esis de ADN no program ada ( UDS) . La figura m uest ra la m edia
± D.E. de los valores obt enidos en 2 ensayos independient es por t riplicado. El Test de St udent fue
ut ilizado para com parar las m uest ras cont roles con p19wt ó sus m ut ant es. ( * P< 0,01) . La expresión
de las diferent es prot eínas fue evaluada por West ern blot con un ant icuerpo ant i- V5.
98
RESULTADOS
3 .7
La se r in a 7 6 y la t r e on in a 1 4 1 son los únicos sit ios de
fosfor ila ción e n p1 9 e n r e spu e st a a da ñ o
Hem os descript o que la fosforilación de p19 en respuest a a daño genot óxico sería
secuencial, part icipando en prim er lugar la quinasa CDK2 ó CDK5 en serina 76 y luego
PKA sobre la t reonina 141. Tam bién dem ost ram os que am bos sit ios son necesarios en
la función de p19 de reparar el ADN y que las m ut ant es p19S76E y p19S76ET141E
t ienen la m ism a capacidad de p19wt de part icipar en la reparación.
Teniendo en cuent a est as observaciones plant eam os que si la serina 76 es
efect ivam ent e fosforilada y la m ut ant e p19S76E im it a est a m odificación post t raduccional, ent onces, p19S76E podrá ser fosforilada en la t reonina 141 de acuerdo a
la hipót esis de la fosforilación secuencial.
Transfect am os las m ut ant es p19S76E y p19S76T141E en células BHK- 21 para
realizar ensayos de m arcación m et abólica ut ilizando luz UV com o dañador. En el
análisis de los result ados observam os que, la m ut ant e p19S76E recuperó la capacidad
de ser fosforilada que había sido perdida en la m ut ant e p19S76A ( Figu r a 4 2 y Figu r a
2 2 ) . Est o indica que el reem plazo de serina 76 por ácido glut ám ico, perm it e event os
post eriores de fosforilación. Es int eresant e observar que p19S76E no fue fosforilada
en ausencia de UV, señalando la necesidad de una vía act iva de respuest a al daño
para que est o ocurra. Es relevant e dest acar que no observam os fosforilación en la
m ut ant e S76ET141E. El hecho de encont rar que est a m ut ant e no es fosforilada por
daño, a pesar de t ener la m ism a capacidad de p19 de part icipar en la reparación del
ADN, im plica, por un lado, que la t reonina 141 es efect ivam ent e un sit io fosforilado en
p19, porque su m ut ación por ácido glut ám ico elim ina la fosforilación observada para la
m ut ant e p19S76E. Por ot ro lado, est a observación j unt o con la fosforilación de
p19S76E apoyan fuert em ent e la hipót esis de secuencialidad puest o que la t reonina
141 para ser fosforilada requeriría prim ero de la fosforilación en serina 76, que en
est e caso es im it ada por ácido glut ám ico. Y por últ im o, sugiere fuert em ent e que serina
76 y t reonina 141 son los únicos sit ios fosforilados en p19 en respuest a a genot óxicos.
Habíam os vist o que el reem plazo de t reonina 141 por alanina dism inuía la fosforilación
pero no la elim inaba com plet am ent e ( Figu r a 2 2 ) . Est e result ado sería el product o de
la fosforilación en serina 76 luego del daño, pero adem ás, podría est ar m anifest ando
la fosforilación de algún ot ro residuo no ident ificado hast a el m om ent o. Siguiendo el
m ism o razonam ient o, la fosforilación observada en la m ut ant e p19S76E ( Figur a 4 2 )
correspondería a la act ividad de PKA sobre la t reonina 141, pero no podríam os
descart ar a part ir de est e result ado la fosforilación, adem ás, en ot ro sit io diferent e a
los evaluados hast a aquí ( S13, S66, S76, T89, T141) . Sin em bargo, el result ado que
99
RESULTADOS
m uest ra que la m ut ant e S76ET141E no es fosforilada en respuest a a daño, post ularía
a los sit ios serina 76 y t reonina 141 com o los únicos residuos fosforilados en p19 y
necesarios en la act ividad de reparación del ADN.
Figu r a 4 2 . La m ut a n t e p1 9 S7 6 E r e cu pe r a la ca pa cida d de se r fosfor ila da . Células BHK- 21
fueron t ransfect adas con p19S76E ó p19S76T141E. 24 horas luego de la t ransfección fueron
incubadas con 0,5 m Ci de
32
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3 horas y t rat adas post eriorm ent e con
2
radiación UV ( 4 m J/ cm ) . Cant idades iguales de prot eínas ( 180 µg) de las m uest ras recolect adas 1
hora luego del daño fueron inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo ant i- V5. Los com plej os inm unes
fueron suj et os a SDS- PAGE 12% y la fosforilación fue analizada a t ravés de la ut ilidad St orm
Phosphoim ager Scanner. Los niveles de las m ut ant es de 19 en los ext ract os ut ilizados en la
inm unoprecipit ación fueron analizados por West ern blot . La figura es represent at iva de 3 ensayos
independient es.
3 .8
Am bos sit ios, se r in a 7 6 y t r e on in a 1 4 1 , son fosfor ila dos e n e l
cit opla sm a lu e go de da ñ o a l AD N
Los result ados represent ados en la Figu r a 3 5 dem uest ran que la fosforilación de
p19 es iniciada en el cit oplasm a, es decir, que CDK2 ó CDK5 fosforilarían a p19 en
serina 76 en est e espacio subcelular. Buscando ident ificar la localización subcelular de
las fosforilación en t reonina 141 em pleam os ensayos de m arcación m et abólica en
células BHK- 21 t ransfect adas con la m ut ant e S76E. Encont ram os que a los 20 m inut os
de inducido el daño la fosforilación de est a m ut ant e se observa en el espacio
cit oplasm át ico. Est e result ado señala que en est a localización subcelular ocurre, no
sólo la fosforilación en serina 76, sino t am bién la segunda fosforilación de p19 en
t reonina 141 ( Figu r a 4 3 ) . Aún m ás, la fosforilación de S76E se observa en el núcleo
100
RESULTADOS
m ás rápidam ent e que la fosforilación de p19wt . A los 20 m inut os ya podem os
visualizar t ranslocación nuclear de S76E, m ient ras que est a relocalización en p19wt es
observada a los 60 m inut os ( Figur a s 3 5 y 3 6 ) .
Concluim os que am bos am inoácidos, la serina 76 y la t reonina 141, son
fosforilados en el cit oplasm a y que, adem ás, la sim ulación de la fosforilación en
p19S76E hace m ás rápido el pasaj e de la prot eína del espacio cit oplasm át ico al
núcleo.
Figur a
43.
La
fosfor ila ción
en
t r e on in a
141
ocu r r e
en
el
e spa cio
cit opla sm á t ico.
Células BHK- 21 fueron t ransfect adas con la m ut ant e que im it a la fosforilación de p19 en serina 76
( p19S76E) . Las células fueron incubadas con 0,5 m Ci de
32
P- ort ofosfat o de sodio durant e 3 horas, 24
horas de ocurrida la t ransfección. Luego, fueron dañadas con radiación UV ( 4 m J/ cm 2 ) . Cant idades
iguales de prot eínas ( 200 µg) , de las m uest ras recolect adas en los t iem pos indicados y fraccionadas
subcelularm ent e, fueron inm unoprecipit adas usando un ant icuerpo ant i- V5. Los com plej os inm unes
fueron suj et os a SDS- PAGE 12% y la fosforilación fue analizada a t ravés de la ut ilidad St orm
Phosphoim ager Scanner. Los ext ract os fueron analizados por West ern blot ut ilizando un ant icuerpo
ant i- V5. La eficiencia del fraccionam ient o subcelular fue evaluada con un ant icuerpo ant i- GAPDH
com o m arcador de cit oplasm a y ot ro ant i- Hist ona H3 t ot al com o m arcador de núcleo. Las figuras son
represent at ivas de 3 ensayos independient es. ( C, cit oplasm a; N, núcleo; P- p19, prot eína p19
fosforilada)
101
RESULTADOS
Ca pít u lo 4 : I nt e r a ct or e s de p1 9
Las m odificaciones post - t raduccionales com o la fosforilación represent an una
form a rápida y reversible de m odular la act ividad e int eracción de prot eínas en la
célula, ya que no requieren de la sínt esis o de la degradación de m oléculas exist ent es.
En base a los result ados m ost rados hast a aquí, plant eam os que la fosforilación de p19
podría est ar involucrada en la int eracción con ot ras prot eínas relacionadas a la
reparación de ADN.
En est e capít ulo buscam os iniciar el est udio de posibles int eract ores de p19 con
especial int erés en aquellos que pudieran est ar relacionados a la respuest a frent e al
daño. Los result ados m ost rados a cont inuación, fueron obt enidos a t ravés de una
est ancia cort a en la Unidad 624 “ St ress Cellulaire” del I NSERM en Marsella, Francia,
baj o la dirección de los Dres. Nelson Duset t i y Juan I ovanna.
4 .1
Bú squ e da de in t e r a ct or e s de p1 9 por e n sa yo de doble h íbr ido
4 .1 .1
D e scr ipción de l sist e m a
Com o prim era aproxim ación al est udio de int eract ores ut ilizam os la t écnica de
doble híbrido, en part icular, el sist em a de doble híbrido Cyt ot rap. Est e sist em a t iene la
caract eríst ica de perm it ir la ident ificación de int eracciones ent re prot eínas en el
cit oplasm a
de
las
células
de
levaduras,
en
cont raposición
a
ot ros
m ét odos
convencionales que em plean GAL4 y LexA en donde la int eracción ocurre en el núcleo.
Est a caract eríst ica del sist em a ofrece la posibilidad de que las prot eínas sufran en el
cit oplasm a m odificaciones post - t raduccionales crít icas para la int eracción, que no
ocurrirían si la expresión fuese dirigida al núcleo. Las int eracciones prot eína – prot eína
en el cit oplasm a son det ect adas por el reclut am ient o del product o del gen Sos hum ano
( hSos) a la m em brana de la celular en donde act iva la vía Ras. Est e sist em a usa la
cepa de levaduras cdc25H la cual cont iene una m ut ación en el gen cdc25, hom ólogo a
hSos, que la hace sensible a ciert as t em perat uras. Est a prot eína es un fact or
int ercam biador de nucleót idos de guanina que result a esencial para la act ivación de la
vía Ras y finalm ent e para la supervivencia y el crecim ient o de la célula. La m ut ación
en el gen cdc25 perm it e a las células crecer a 25 º C pero no a 37 º C. Est a m ut ación
102
RESULTADOS
puede ser com plem ent ada por el product o del gen hSos cuando est e se localiza en la
m em brana celular perm it iendo el crecim ient o a 37º C.
El sist em a Cyt ot rap ut iliza el vect or pMyr para la const rucción de una bibliot eca de
expresión. Los genes expresados por est e vect or se encuent ran fusionados a una
señal de m irist oilación que dirige y ancla las prot eínas “ t arget ” a la m em brana celular.
La prot eína anzuelo es expresada com o una prot eína de fusión con la prot eína hSos a
part ir del vect or pSos. Cuando la bibliot eca de ADNc y el anzuelo son cot ransform ados en la cepa cdc25H, las únicas células capaces de crecer a 37 º C son
aquellas que result an rescat adas por la int eracción ent re el anzuelo y una prot eína de
la bibliot eca reclut ando hSos a la m em brana celular y act ivando la vía Ras.
1. La prot eína “ t arget ” m fusionada a la señal de m irist oilación se ancla a la m em brana celular.
2. El anzuelo se une a la prot eína “ t arget ” localizando hSos en la m em brana.
3. hSos act iva RAS prom oviendo el int ercam bio GDP/ GTP.
4. RAS act iva la cascada de señales que perm it e a la cepa de levaduras m ut ant e, cdc25H,
crecer a 37º .
4 .1 .2
D e t e r m in a ción de in t e r a ct or e s de p1 9
La secuencia hum ana com plet a de p19 fue clonada en el vect or pSos para generar
la prot eína de fusión hSos- p19. Est a prot eína de fusión fue ut ilizada com o anzuelo en
la búsqueda de int eract ores ut ilizando una bibliot eca de ADNc de células Hela
previam ent e const ruida en el vect or pMyr. Al finalizar el est udio fueron ident ificados
un t ot al de 69 clones posit ivos. El fragm ent o de ADNc cont enido en el vect or pMyr de
cada clon fue am plificado por PCR y secuenciado. Las secuencias obt enidas fueron
ident ificadas ut ilizando la base de dat os GenBank ® ( Ta bla 4 ) .
103
RESULTADOS
4 .1 .3
An á lisis de los in t e r a ct or e s
En prim er lugar, es im port ant e not ar que en la list a de posibles prot eínas
int eract oras de p19 se encuent ra CDK4, una quinasa que efect ivam ent e int eracciona
con p19. Est a int eracción sugiere una expresión correct a del anzuelo en el ensayo y
represent a un cont rol adicional del adecuado funcionam ient o del sist em a.
Luego, 4 de las secuencias obt enidas ( M- phase phosphoprot ein 6, m acropain,
chaperonin cont aining TCP1, m yosin light chain 12B regulat ory) fueron descript as
com o falsos posit ivos debido a que han sido ident ificadas en un alt o núm ero de clones,
no sólo con p19 com o anzuelo, sino t am bién, cuando prot eínas no relacionadas a p19
fueron fusionadas a hSos. De las rest ant es prot eínas enum eradas en la list a, 6 de
ellas result an de especial int erés t eniendo en cuent a las funciones descript as para
cada una de ellas y la pot encial int eracción con p19.
Tres de ellas, las prot eínas br om odom a in cont a ining 7 , ge m inin y m a le spe cific le t h a l 1 h om olog, com part en la caract eríst ica de pert enecer a com plej os
rem odeladores de la crom at ina. La posibilidad de que p19 sea un int eract or real de
est os fact ores rem odeladores result a part icularm ent e at ract iva porque sugeririría un
104
RESULTADOS
pot encial m odo de acción de p19 en la reparación del ADN. Hem os dem ost rado que la
inducción y fosforilación de p19 se produce en respuest a a diferent es agent es
genot óxicos que causan dist int os t ipos de daño y que t am bién son reparados por
diferent es m ecanism os. La eficiencia de est os m ecanism os t am bién se ve influenciada
por los niveles prot eicos de p19 y su fosforilación. El hecho que p19 part icipe en
m ecanism os de reparación t an diversos im plica que su función est aría relacionada con
una respuest a prim aria al daño, com ún a t odos los genot óxicos ensayados, com o
podría ser la rem odelación de la crom at ina, ent onces, p19 podría proponerse com o un
fact or de accesibilidad.
Est a necesidad de rem odelación de la crom at ina est á report ada para procesos
vit ales en la célula que requieren del acceso de fact ores a secuencias escpecíficas en
el ADN, y en los cuales la est ruct ura de la crom at ina alt am ent e condensada
represent a una barrera a sort ear. Exist en diversas m odificaciones que pueden ocurrir
sobre
las
hist onas
que
prom ueven
la
rem odelación
de
la
crom at ina.
Est as
m odificaciones est án asociadas por ej em plo a la regulación de la t ranscripción
( Berger, 2007) , a la iniciación de las horquillas de replicación ( Sut er et al., 2007) y a
la reparación del ADN. ( Jha et al., 2008; Murr et al., 2006; Ut ley et al., 2005; Wurt ele
and Verreault , 2006; Zhu and Wani) . La dinám ica de la crom at ina const it uye un
com ponent e act ivo de la respuest a al ADN dañado puest o que la m odificación de su
est ruct ura perm it e la accesibilidad de prot eínas de reparación ( Zhu and Wani, 2010) .
Mecanism os especializados regulan el grado de em paquet am ient o de la crom at ina por
diferent es vías. En uno de ellos part icipan enzim as que int roducen o elim inan
m odificaciones covalent es en las colas de las hist onas ( com o las Hist ona Acet il
t ransferasas, HATs;
e Hist onas Desacet ilasas, HDACs) , m ient ras que en ot ro,
diferent es com plej os de prot eínas ut ilizan la energía de la hidrólisis de ATP para
alt erar la posición o la com posición de los nucleosom as ( com o el com plej o SWI / SNF)
( Berger, 2002; Lydall and Whit ehall, 2005; Saha et al., 2006) .
Ent re las m odificaciones covalent es posibles se encuent ra la acet ilación de
hist onas, para la cual fue dem ost rada su part icipación en la respuest a al daño al ADN
( Cost elloe et al., 2006) . Se ha report ado que los agent es dañadores del ADN, t ales
com o la radiación ionizant e, la luz UV, hidroxiurea y el m et il- m et ano sulfonat o,
inducen la acet ilación de la hist ona H3 en células hum anas y que la HAT responsable
de est a acción es CBP/ p300 ((Lydall and Whitehall, 2005). Est as hist onas acet iladas
colocalizan con H2AXgam m a sugiriendo que la acet ilación ocurre en los sit ios de daño
al ADN. Fue report ado que ot ro com plej o HAT, Tip 60, es reclut ado a los sit ios de
rot uras doble cadena, donde se une y acet ila a la hist ona H4 prom oviendo el
reclut am ient o de prot eínas de reparación com o 53BP1 y RAD51 ( Das et al., 2009)
105
RESULTADOS
Los t res probables int eract ores de p19 que se describen a cont inuación est án
relacionados con el rem odelam ient o de la crom at ina y por est e m ot ivo result an de
int erés en est e est udio.
Br om odom a in con t a in in g 7 ( BRD 7 )
BRD7 fue ident ificada por prim era vez com o una prot eína de unión al Fact or
Regulador del I nt erferón 2 ( I nt erferon Regulat ory Fact or- 2, I RF- 2) . La fam ilia de
fact ores de t ranscripción I RF part icipa en la defensa ant iviral, en la respuest a inm une
y en la regulación del crecim ient o celular. I RF- 2 es descript o com o una oncoprot eína.
( Nguyen et al., 1997) . La proliferación celular prom ovida por I RF- 2 se encuent ra
m ediada por la act ivación t ranscripcional del gen de la hist ona H4 ( Vaughan et al.,
1995; Vaughan et al., 1998) . La localización subcelular de BRD7 fue descript a com o
predom inant em ent e nuclear observando una colocalización con hist onas H3 y H4
hiperacet iladas, en regiones de la crom at ina t ranscripcionalm ent e act iva. ( St aal et al.,
2000) . En células de carcinom a nasofaringeo ( NPC) , la prot eína BRD7 se encuent ra
significat ivam ent e dism inuida ( Zhou et al., 2004) . La sobreexpresión ect ópica de
BRD7 en una línea celular de NPC inhibió el crecim ient o y la progresión del ciclo
celular de la fase G1 a la fase S por m edio de la m odulación t ranscripcional de algunos
genes relacionados con la regulación del ciclo celular, incluyendo a E2F3 ( Peng et al.,
2006) .
El dom ino de brom o es requerido para la unión a la lisina 14 de la hist ona H3. La
unión a t ravés de est e dom inio es esencial para la regulación t ranscripcional que
ej erce BRD7 sobre el prom ot or de E2F3 y sobre la inhibición del ciclo celular. La
sobreexpresión de BRD7 no genera m odificaciones en los niveles de acet ilación de H3
por lo que el rem odelam ient o de la crom at ina, y no la m odificación de hist onas, es el
principal m ecanism o de BRD7 para m ediar la t ranscripción génica. ( Peng et al., 2006)
Sum ado a est o, recient em ent e BRD7 fue descript o com o un com ponent e del
com plej o rem odelador de la crom at ina SWI / SNF en células m adre em brionarias
( ESCs) ( Kaeser et al., 2008) ,
M a le - spe cific le t ha l 1 h om olog ( M SL1 )
MSL1 ( previam ent e conocido com o LOC339287) codifica una de la cinco prot eínas
que form an un com plej o alt am ent e conservado denom inado MSL ( m ale- specific let hal)
con act ividad de hist ona acet il- t ransferasa ( HAT) . El com plej o MSL fue descript o por
prim era vez en Drosophila y la m ut ación de cualquiera de los 5 m iem bros de est e
com plej o ( MSL1, MSL2, MSL3, MLE, MOF) result a let al en m achos de est e género
106
RESULTADOS
( Sm it h et al., 2005) . Recient em ent e fue descript o un com plej o de hist ona acet ilt ransferasas en hum anos que cont iene hom ólogos del com plej o MSL en Drosophila
( MSL1, MSL2, MSL3 y MOF) . Est e com plej o t iene alt a especificidad por la lisina 16 de
la hist ona H4, la cual j uega un papel crucial en la regulación de la rem odelación de la
crom at ina y la expresión génica. Más aún, la pérdida de la acet ilación en la lisina 16
de H4 es una de las caract eríst icas com únm ent e observadas en el cáncer, relacionada
con defect os en el plegam ient o de la crom at ina y la expresión alt erada de genes
( Fraga et al., 2005)
El com plej o MSL de Drosophila es encont rado act uando exclusivam ent e sobre el
crom osom a X en m achos donde aum ent a los niveles de expresión génica por la
acet ilación de de dom inios t ranscripcionales com plet os ( Sm it h et al., 2001) . En
hum anos est e com plej o no se asocia con un crom osom a específico y parece t ener una
dist ribución genóm ica ubicua ( Sm it h et al., 2005)
MOF es el com ponent e del com plej o con act ividad acet ilasa y es el responsable de
la acet ilación en la lisina 16 de H4 ( Sm it h et al., 2005) . Varios est udios han
dem ost rado
que
la
pérdida
de
MOF en
células
de
m am íferos
t iene
varias
consecuencias com o el arrest o del ciclo celular en G2/ M, defect os m orfológicos a nivel
nuclear, aberraciones crom osóm icas espont áneas, t ranscripción reducida de ciert os
genes y una respuest a al daño al ADN defectuosa luego de radiación ionizant e ( Rea et
al., 2007) . MOF t am bién est á involucrado en la act ivación de ATM en respuest a a daño
al ADN y la acet ilación de p53 por MOF influencia la decisión celular de inducir
apopt osis por sobre el arrest o del ciclo celular ( Sykes et al., 2006; Sykes et al., 2009) .
Se encont ró t am bién que MSL1 se une a 53BP1 ( Gironella et al., 2009) . 53BP1 se une
al dom inio de unión al ADN de p53 y rápidam ent e form a foci discret os en respuest a a
la radiación gam m a ( Mochan et al., 2004) .
Por últ im o, recient em ent e fue propuest o un m ecanism o m ediant e el cual la
prot eína 53BP1 reclut aría a MSL1 a los alrededores del ADN dañado y que, luego, el
com plej o MSL aum ent aría la acet ilación en lisina 16 de hist ona H4. La m odificación de
hist onas conduciría a cam bios est ruct urales que inducirían la rem odelación de la
crom at ina y la relaj ación del ADN perm it iendo a la m aquinaria de reparación acceder a
los sit ios dañados ( Gironella et al., 2009) .
Ge m in in , AD N r e plica t ion in h ibit or ( GM N N )
La prot eína gem inina fue caract erizada en dos est udios funcionales independient es
en Xenopus laevis y, subsecuent em ent e, fue caract erizada com o una m olécula de
función dual con roles en el m ant enim ient o de la int egridad del genom a, a t ravés de la
107
RESULTADOS
regulación del licenciam ient o de la replicación del ADN, ( McGarry and Kirschner, 1998)
y en el cont rol del dest ino de la células neurales durant e el desarrollo de la
em briogénesis ( Kroll et al., 1998) .
Por un lado se dem ost ró que gem inina evit aba la reiniciación de la replicación en
un ciclo celular para m ant ener la int egridad crom osóm ica y la euploidía. Los niveles de
gem inina aum ent an durant e la fase S y se asocia con Cdt 1, m iem bro del com plej o de
licenciam ient o, durant e las fases S, G2 y M para evit ar la reiniciación de la replicación.
En anafase es degradada o inact ivada para perm it ir una nueva ronda de replicación.
( McGarry and Kirschner, 1998; Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000) Al m ism o
t iem po fue ident ificada, en ot ros est udios en Xenopus y Drosophila, com o una
m olécula que part icipa en el dest ino de las células neurales. ( Kroll et al., 1998; Quinn
et al., 2001) . En Xenopus, gem inina es alt am ent e expresada al inicio de la
gast rulación en una región que dará inicio a la placa neural y que abarca la población
celular de progenit ores neurales en proliferación ( Kroll et al., 1998) . La pérdida de la
función de gem inina inhibe la form ación de t ej ido neural ( Kroll et al., 1998) . La
sobreexpresión de gem inina t am bién induce células neuronales ect ópicas m ient ras
que, em briones m ut ant es en gem inina, present an deficiencias neuronales ( Quinn et
al., 2001) . Est a prot eína int eracciona con los fact ores de t ranscripción Six3 y Hox y
puede
ant agonizar
las
act ividades
t ranscripcionales
de
est os
para
regular
la
diferenciación celular. ( Del Bene et al., 2004; Luo and Kessel, 2004; Luo et al., 2004) .
Est a capacidad est á relacionada con int eracciones de prot eínas Polycom b que
regulan la est ruct ura de la crom at ina para reprim ir la expresión génica.
Las act ividades t ranscripcionales de gem inina y la int eracción con ot ras prot eínas
regulan la est ruct ura de la crom at ina. Fue descript a la int eracción ent re gem inina y
Brg1, la subunidad cat alít ica del com plej o rem odelador de la crom at ina SWI / SNF, que
ant agoniza la t ranscripción dependient e de Brg1 y
regula la t ransición ent re
proliferación y diferenciación durant e la neurogénesis ( Seo et al., 2005) .
La prot eína descript a a cont inuación result a int eresant e com o probable int eract or
de p19 porque, ent re ot ras funciones, j uega un rol fundam ent al en la regulación del
reconocim ient o inicial del daño por UV y en el reclut am ient o de m iem bros de la
m aquinaria NER.
108
RESULTADOS
Cu llin - a ssocia t e d a nd n e ddyla t ion - dissocia t e d 1 ( CAN D 1 )
Cullin- associat ed
and
neddylat ion- dissociat ed
( CAND)
fue
originalm ent e
ident ificada com o una prot eína int eract ora de TATA- binding prot ein ( TBP) por lo cual
fue denom inada TBP- int eract ing Prot ein 120 ( TI P120) ( Yogosawa et al., 1996) .
La fam ilia TI P120 incluye 2 m iem bros, TI P120A/ CAND1 y TI P120B/ CAND2. La
prot eína CAND1 facilit a la t ranscripción conducida por t odas las clases de RNA
polim erasa ( Kayukawa et al., 1999; Makino et al., 1999) . Por ot ro lado, CAND1 fue
t am bién ident ificada com o una prot eína que int eracciona con la fam ilia de prot eínas
llam ada Cullin ( Liu et al., 2002; Min et al., 2003; Zheng et al., 2002a) .
Las prot eínas de la fam ilia Cullin se asocian a ot ras prot eínas y t rabaj an com o E3ubiquit ina ligasas ( Cardozo and Pagano, 2004) . Cullin 1 ( CUL1) form a un com plej o
j unt o con Skp1 y F- box denom inado com plej o SCF ( Lyapina et al., 1998; Zheng et
al., 2002b) . En el com plej o, una lisina específica en la región C- t erm inal de CUL1 es
covalent em ent e m odificada por Nedd8 en un proceso llam ado nedilación ( conj ugación
de Nedd8 a la lisina de Cullinas) . La nedilación facilit a la asociación de CUL1 con la
enzim a E2 est im ulando la act ividad de ligación. ( Furukawa et al., 2000; Wu et al.,
2000) CAND1 se une a CUL1 no nedilada e inhibe el ensam blado de prot eínas
adapt adoras asociadas a CUL1, regulando negat ivam ent e la act ividad del com plej o
SCF ( Min et al., 2003; Min et al., 2005; Zheng et al., 2002a) .
CAND1 puede inhibir el ensam blado de ot ros com plej os de ubiquit inación form ado
por cullinas diferent es a CUL1, com o por ej em plo el com puest o por cullin- 4A ( CUL4A) ( Goldenberg et al., 2004; Hu et al., 2004; Oshikawa et al., 2003; Zheng et al.,
2002a) . Est e com plej o form ado por CUL- 4A, que result a inhibido por CAND1, est im ula
la degradación de DDB2, un m iem bro del grupo de prot eínas de unión al ADN dañado
( Dam aged
DNA
binding
prot eins,
DDBs)
que
j uega
un
papel
crít ico
en
el
reconocim ient o inicial del daño por UV m ediando el reclut am ient o de fact ores de la
m aquinaria NER. ( Chen et al., 2006; Chen et al., 2001; Nag et al., 2001) . Result a
llam at iva la exist encia de una vía prot eolít ica que lim it e la capacidad de reparación
celular, t ant o a t ravés del cont rol de los niveles prot éico de DDB2 com o t am bién
lim it ando la duración de la asociación de DDB2 al ADN dañando. Sin em bargo,
considerando que la prot eínas DDBs perm it en el reconocim ient o de una gran variedad
de dist orsiones en las hebras de ADN, alt os niveles de DDBs no son deseables puest o
que pueden llevar a la unión de las m ism as, a est ruct uras del ADN nat urales iniciando
la reparación de secuencias no dañadas ( Hanawalt et al., 2003) . Por lo t ant o, aunque
la est abilización de las DDBs es favorable para aum ent ar la act ividad NER, la
capacidad de est as prot eínas de reconocer una am plia gam a de est ruct uras en el ADN
109
RESULTADOS
resalt a el requerim ient o de una regulación precisa de los niveles de DDBs para
alcanzar un balance ent re una act ividad NER deficient e o excesiva. La prot eína CAND1
a t ravés de la inhibición de la act ividad de ubiquit inación de CUL- 4A part icipa en el
m ant enim ient o de est e balance. ( Chen et al., 2006) .
Los dos últ im os int eract ores de p19 descript os a cont inuación, present an
funciones en la regulación de la t ranscripción, sus niveles inhiben o est im ulan la
apopt osis inducida por diferent es est ím ulos y una de ellas part icipa en la regulación de
genes propios del ciclo celular.
I n t e r fe r on r e gu la t or y fa ct or 2 bin din g pr ot e in 2 ( I RF2 BP2 )
Las prot eínas I RF2BP1 e I RF2BP2 fueron ident ificadas por su unión al fact or I RF- 2.
Llam at ivam ent e, ot ro pot encial int eract or de p19, BRD7, t am bién se asocia a I RF- 2.
I RF2BP2 es una prot eína nuclear que se une al dom inio represor C- t erm inal del I RF- 2
e inhibe t ant o la t ranscripción basal com o la t ranscripción act ivada por un est ím ulo.
I RF2BP1 e I RF2BP2 no present an hom ología con ot ros reguladores t ranscripcionales
conocidos por lo que fueron definidos com o una nueva fam ilia de prot eínas corepresoras. ( Childs and Goodbourn, 2003) .
Un t rabaj o recient e describe a I RF2BP2 com o una prot eína cuyo gen es regulado
direct am ent e por p53. La regulación posit iva de I RF2BP2 luego de t rat ar a diferent es
t ipos celulares con act inom icina result a dependient e de p53. El aum ent o en la
expresión de I RF2BP2 ocurre en paralelo a la regulación negat iva de I RF- 2. I RF2BP2
prom ueve el arrest o del ciclo celular e int erfiere con la apopt osis m ediada por p53
inducida por doxorrubicina. Cuando I RF2BP2 es silenciado, la apopt osis inducida por
est rés y m ediada por p53 result a aum ent ada. Por el cont rario, la sobreexpresión de
I RF2BP2 dism inuye la inducción de apopt osis. ( Childs and Goodbourn, 2003) .
Ce ll division cycle a nd a popt osis r e gu la t or 1 ( CCAR1 )
CCAR1 fue descript a com o una prot eína induct ora de apopt osis en respuest a a
diversos t ipos de agent es incluyendo adriam icina. Niveles reducidos de CCAR1
result an en la inhibición de la apopt osis inducida por adriam icina, m ient ras que la
expresión aum ent ada provoca niveles elevados de p21 y apopt osis. CCAR1 t am bién
int eract úa con la prot eína 14- 3- 3 y causa la dism inución de la expresión de genes
regulat orios del ciclo celular incluyendo c- Myc y ciclina B1. La pérdida de c- Myc
110
RESULTADOS
sensibiliza las células a la apopt osis por CCAR1, m ient ras que la expresión de c- Myc o
14- 3- 3 inhibe la apopt osis dependient e de est e fact or. Por lo t ant o, la apopt osis
inducida por est e fact or involucra el secuest ro de 14- 3- 3. La dism inución en los
niveles de CCAR1 conduce a la expresión alt erada de m últ iples genes regulat orios del
ciclo celular. ( Rishi et al., 2003) . CCAR1 es act ivada por fosforilación en t irosina 192 y,
post eriorm ent e, prom ueve la apopt osis por la act ivación de p38MAPK y caspasa- 9
( Rishi et al., 2006) .
La expresión de CCAR1 se encuent ra dism inuida en cáncer de m am a y sus niveles
se correlacionan, inversam ent e, con el grado de severidad de dicho t um or. La
expresión ect ópica de CCAR1 inhibe el crecim ient o de est as células cancerígenas en
part e por la act ivación de la vía apopt ót ica. En aquellos t ipos de cáncer de alt o grado,
que est án usualm ent e pobrem ent e diferenciados, se observan niveles reducidos de
CCAR1, principalm ent e por m et ilación de su prom ot or
( Zhang et al., 2007) . CCAR1
regula la expresión de genes clave para la proliferación ( Kim et al., 2008) .
Si bien el est udio y la confirm ación de la int eracción in vivo ent re p19 y est os
candidat os es un obj et ivo pendient e en est e t rabaj o de t esis, creem os que el int erés
en los 6 int eract ores descript os se encuent ra fuert em ent e fundam ent ado. Por est o,
proponem os, que la cont inuación del t rabaj o en est a línea colaborará en descifrar
finalm ent e el/ los m ecanism o/ os de acción involucrados en la función de p19 ligada a
la reparación del ADN y al m ant enim ient o de la int egridad del genom a.
111
CONCLUSI ONES
Con clu sion e s
-
La prot eína p19 t iene un función en la reparación del ADN, la cual es
independient e de su función inhibit oria de las quinasas CDK4/ CDK6.
-
p19 es necesaria para el m ant enim ient o de la int egridad del genom a y en la
supervivencia celular.
-
p19 es fosforilada en respuest a a genot óxicos en serina 76 y en t reonina 141 de
form a secuencial. CDK2/ 5 y PKA son señaladas com o las responsables de la
fosforilación direct a en est os sit ios respect ivam ent e.
-
La fosforilación de p19 ocurre en el cit oplasm a y la serina 76 es necesaria para
su t ranslocación al núcleo luego de daño.
-
La fosforilación, t ant o en serina 76 com o en t reonina 141, result an crít icas en la
función de reparación del ADN. Por el cont rario no son necesarias para su
función inhibit oria de CDK4/ CDK6.
-
El análisis de los int eract ores de p19 perm it e sugerir la part icipación de est a
prot eína en los com plej os rem odeladores de la crom at ina necesarios para
perm it ir el acceso de las m aquinarias de reparación a los sit ios de daño.
112
D I SCUSI ÓN
DI SCUSI ÓN
D iscu sión
El m ant enim ient o de la int egridad del genom a es de vit al im port ancia para la
supervivencia de un organism o en condiciones adecuadas. El ADN est á expuest o a
sufrir diversos t ipos de daños que pueden ser generados por fact ores exógenos ó
endógenos com o las especies react ivas de oxígeno, los agent es alquilant es y
m et ilant es, radiación ionizant e y UV, y errores est ocást icos que pueden ocurrir
durant e la replicación del ADN y la recom binación. La célula responde a la presencia
de daño en el ADN act ivando punt os de cont rol del ciclo celular y m ecanism os de
reparación. Sin em bargo, cuando el daño result a m uy severo para ser reparado, la
célula dañada es elim inada por apopt osis.
El present e t rabaj o est á vinculado con la respuest a celular frent e al daño
genot óxico y en el m ism o se desarrollaron cuat ro obj et ivos principales. El prim ero
consist ió en analizar la part icipación de p19 en la respuest a al daño al ADN y en la
supervivencia celular. En el segundo, est udiam os la ocurrencia de procesos de
fosforilación sobre p19 en respuest a al daño. En t ercer lugar evaluam os si la
fosforilación de p19 t iene alguna relevancia fisiológica en la respuest a celular al daño
genot óxicoo. Y por últ im o, buscam os posibles int eract ores de p19 ligados al rol de
reparación del ADN.
1.
Fu n ción de p1 9 e n la r e spu e st a a l da ñ o a l AD N y e n la
su pe r vive n cia ce lu la r
1 .1 I n du cción de p1 9 e n r e spu e st a a da ñ o por UV
Hem os m encionado previam ent e que p19 se expresa en alt o niveles en órganos
específicos, com o cerebro y t est ículo. En la prim era part e del t rabaj o ut ilizam os una
línea
celular
est ablecida
a
part ir
de
t est ículo
de
rat ón,
denom inada
MA- 10.
Describim os que en est a línea celular t ant o los niveles de ARNm com o de prot eína de
p19 varían periódicam ent e a lo largo del ciclo celular, del m ism o m odo que fue
report ado por ot ro aut ores en ot ros t ipos celulares est udiados ( Guan et al., 1996;
Hirai et al., 1995) . Su expresión es baj a en G0/ G1 y t iene un pico al final de G1 y en
la fase S. La periodicidad de la prot eína p19 durant e el ciclo celular est á regulada en
part e por el m ecanism o de degradación dependient e de ubiquit ina/ prot easom a
perm it iendo que la abundancia de la prot eína siga los cam bios en la expresión del
m ensaj ero ( Thullberg et al., 2000) . Los m ecanism os que det erm inan la expresión
114
DI SCUSI ÓN
cíclica del gen de p19 no fueron aún descript os. Sin em bargo, result ados de nuest ro
laborat orio post ulan a un fact or de la fam ilia E2F en est a regulación.
Luego, hallam os que la irradiación UV en las células MA- 10 induce cam bios en el
st at us de p19. Tant o los niveles de ARNm com o los de la prot eína p19 aum ent aron
significat ivam ent e luego del daño. Est e hecho fue observado en ot ros t res t ipos
celulares evaluados ( BHK- 21, WI - 38 y cult ivos prim arios de células de Leydig de
rat ón) y t am bién en líneas no analizadas en est e t rabaj o com o la línea celular de
neuroblast om a SH- SY5Y y HeLa de cáncer de cérvix ( Cerut i et al., 2005) por lo cual
est a regulación posit iva de p19 parece ser un fenóm eno general en respuest a
al
daño. En eucariot as superiores fue descript a la expresión de 4 I NK4 est ruct uralm ent e
relacionadas e igualm ent e pot ent es com o inhibidores de CDK4/ 6 ( ( Pei and Xiong,
2005; Sherr and Robert s, 1999) . Llam at ivam ent e, nuest ros result ados m ost raron que
solam ent e la expresión de una de esas I NK4, p19, es inducida en respuest a a UV. Est e
hecho podría ser explicado por un m ecanism o de regulación génica diferencial de los
m iem bros de est a fam ilia. El análisis in silico de la región regulat oria 5´ proxim al del
gen de p19 reveló sit ios de alt a hom ología para el fact or E2F. Fue report ado que E2F1
es inducido por varios agent es dañadores del ADN incluyendo luz UV y drogas
quim iot erapéut icas. Est a inducción result a rápida y dependient e de la act ividad de las
quinasas
ATM/ ATR
que
específicam ent e
fosforilan
a
E2F1
conduciendo
a
la
est abilización de la prot eína ( Lin et al., 2001; St evens and La Thangue, 2004) .
Sum ado a est o, en un t rabaj o publicado recient em ent e por nuest ro laborat orio hem os
descript o que, en respuest a a agent es genot óxicos, el aum ent o en los niveles de E2F1
es consecuencia, no solo de la est abilización de la prot eína, sino t am bién de la
act ivación a nivel t ranscripcional de su gen ( Carcagno et al., 2009) . Aún m ás,
result ados no publicados dem uest ran que la inducción de p19 en respuest a a radiación
UV es dependient e de E2F1 y que est e fact or es crít ico en est a regulación.
1 .2
p1 9 e n la r e spu e st a a l da ñ o
La inducción de p19 en respuest a a daño en el ADN por radiación UV llevó a
plant ear la posibilidad de la part icipación de p19 en la reparación de est as lesiones.
Est e punt o fue evaluado en profundidad m ediant e 4 est rat egias diferent es; ensayos de
HCR, experim ent os de UDS, det ección de est ruct uras t ipo CPD por inm unoquím ica y
análisis a nivel de células individuales por ensayos del com et a. Dem ost ram os que la
sobreexpresión de p19 aum ent a significat ivam ent e la capacidad de reparación del
ADN y adem ás describim os que la deficiencia de p19 m uest ra el efect o inverso sobre
la reparación.
115
DI SCUSI ÓN
Com o hem os m encionado, NER es el m ecanism o de reparación del ADN
responsable de la rem oción de los aduct os de ADN producidos por la luz UV, por
cisplat ino y por ciert os carcinógenos am bient ales ( Friedberg, 2001; Sancar et al.,
2004; Sancar and Reardon, 2004) . El m ecanism o NER com prende dos vías: reparación
acoplada a t ranscripción ( TCR) , la cual rem ueve el daño en regiones t ranscribibles del
genom a; y la reparación genóm ica global ( GGR) , la cual elim ina el daño en el rest o de
la crom at ina ( Rubbi and Milner, 2003) . Adem ás de am enazar la int egridad del
genom a, los daños en el ADN obst ruyen la t ranscripción, y el arrest o de las ARN
polim erasas, provocado por est as lesiones, result a en la act ivación de la vía TCR que
finalm ent e elim ina el daño ( Sarker et al., 2005) .
El ensayo de HCR nos perm it ió est ablecer la act uación de p19 en est a vía de
reparación. Dado que en la t écnica de HCR las células no est án suj et as a un agent e
dañant e, sino que el daño es dirigido a un plásm ido que luego es t ransfect ado en las
células, concluim os, adem ás, que las señales gat illadas por las ARN polim erasas
at ascadas podrían ser suficient es para m odular la función de p19 en la respuest a al
daño por TCR. Por ot ro lado, las ot ras 3 t écnicas m encionadas ( UDS, ensayo del
Com et a y evaluación de CPDs) en las cuales el genom a com plet o est á expuest o al
daño, perm it en la evaluación de am bos m ecanism o TCR y GGR. Los result ados de
est os ensayos apoyan un rol de p19 en la reparación del ADN que no est aría
circunscript o solam ent e a la vía TCR. Est a conclusión est á basada en que los genes
act ivam ent e t ranscript os const it uyen un 5- 8% del genom a de eucariont es y por lo
t ant o t am bién las lesiones reparadas por TCR est án lim it adas a est os valores. Dado
que la sobreexpresión de p19 causa aproxim adam ent e un 60% de aum ent o en la
reparación del ADN dañado, un 40% de aum ent o en los fot oproduct os CPDs reparados
y un increm ent o de aproxim adam ent e un 65% en los niveles de reparación evaluados
por el ensayo del com et a, es lógico pensar que p19 est á act uando en form a m ás
general a lo largo de t odo el genom a y no sólo en las regiones t ranscribiles. Es
im port ant e dest acar que en las células MA- 10 con deficiencia en p19 se observó una
reducción significat iva en la reparación del ADN en los cuat ro ensayos evaluados.
Est os últ im os result ados sugieren fuert em ent e un rol fisiológico de p19 en la
reparación
del
ADN,
descart ando
cualquier
efect o
art ificial
causado
por
la
sobreexpresión de la prot eína.
116
DI SCUSI ÓN
1 .3
p1 9 e n la su pe r vive n cia ce lu la r y e n e l m a n t e n im ie n t o de la
in t e gr ida d de l ge n om a
La sobreexpresión de p19 no sólo m ej ora la reparación del ADN sino que t am bién
prom ueve la supervivencia celular en condiciones de est rés genot óxico. El aum ent o en
la viabilidad celular y en la resist encia al est rés pueden ser explicados por la
part icipación de p19 en la reparación del daño. Nuest ros result ados son consist ent es
con est a últ im a afirm ación: p19 es inducida en respuest a a luz UV, la eficiencia en la
reparación del daño es dependient e de los niveles de p19 y est os niveles m odifican la
supervivencia evaluada t ant o por ensayos clonogénicos com o por ensayos de MTT de
viabilidad
celular.
Result ados de
nuest ro
laborat orio
obt enidos en
células de
neuroblast om a SH- SY5Y m ost raron que la sobreexpresión de p19 dism inuye la
apopt osis inducida por daño ( Cerut i et al., 2005) . Al respect o, ot ros est udios
realizados en rat ones knock- out para p19 dem ost raron que la falt a de p19 increm ent a
la sensibilidad celular a la m uert e por apopt osis o aut ofagia y sugieren un posible rol
de la inducción de p19 en la quim ioprevención ( Tavera- Mendoza et al., 2006a;
Tavera- Mendoza et al., 2006b) . Est os result ados apoyan la idea que post ula una
función de p19 en la reparacion del daño cuya acción se t raduciría finalm ent e en una
m ayor resist encia a la m uert e inducida por agent es genot óxicos.
Cuando los daños en el ADN no son reparados previam ent e a la replicación
pueden result ar en efect os det ect ables, por ej em plo, a nivel de aberraciones
crom osóm icas ( Laurent et al., 2003) . Si la sobreexpresión de p19 no est uviera
act uando sobre la reparación del ADN y favoreciera de alguna form a la supervivencia
celular, por ej em plo, a t ravés de la inhibición de algún punt o de cont rol las células que
escapan a una reparación del ADN eficient e serían m ás sucept ibles a la event ual
aparición de aberraciones crom osóm icas. Sin em bargo, encont ram os que las células
que sobreexpresan p19 m uest ran una im port ant e dism inución del núm ero no solo de
m et afases aberrant es sino t am bién en el núm ero t ot al de figuras crom osóm icas
aberrant es. Es int eresant e señalar que las m et afases de las células MA- 10p19AS con
niveles dism inuidos de p19 al m om ent o del daño, t uvieron un nivel significat ivam ent e
m ayor en el núm ero de aberraciones espont áneas respect o de la Línea MA- 10em pt y.
Est os result ados son consist ent es con un m odelo en el cuál p19 est aría involucrado en
la efect ividad de la reparación del daño al ADN y cuya función sería necesaria para
alcanzar la m áxim a eficiencia en el m ant enim ient o de la int egridad del genom a.
Las células de Leydig en el t est ículo, t ienen la función de producir t est ost erona
que result a esencial en la esperm at ogénesis ( Bart kova et al., 2000) . Fue report ado
que pacient es t rat ados con quim iot erapéut icos t ienen niveles aum ent ados de ADN
117
DI SCUSI ÓN
dañado en células esperm át icas y que exist e una correlación ent re el nivel de daño y
la secreción dism inuida de t est ost erona en est os individuos ( Chat t erj ee et al., 2000) .
Por ot ro lado, fue descript o que rat ones knock- out para p19 exhiben at rofia t est icular
m uy m arcada que se encuent ra asociada con el aum ent o en la apopt osis en la línea
germ inal ( Zindy et al., 2000) . Y sum ado a est o, rat ones doble knock- out para p18 y
p19 son infért iles debido a una dism inuida producción de células esperm át icas y a la
reducida m ovibilidad y viabilidad de los esperm at ozoides que llegan a desarrollarse
( Zindy et al., 2001) . En est e sent ido, las funciones de p19 en la reparación del ADN y
la supervivencia celular podrían ser fisiológicam ent e relevant es para las células de
Leydig en el t est ículo.
1 .4
I n de pe n de n cia de fu n cion e s
Finalizando est e prim er obj et ivo, nos pregunt am os si la función de p19 en la
reparación del ADN se encont raba asociada a su act ividad com o inhibidor del ciclo
celular. Para iniciar el est udio en est a dirección m edim os reparación del ADN por HCR
ut ilizando en est e caso el am inoácido m im osina. Est e am inoácido recapit uló el arrest o
del ciclo celular que fue observado por la sobreexpresión de p19 en células MA- 10.
Ent onces propusim os que, si el efect o de p19 sólo est uviera relacionado con la
inhibición del ciclo celular, el ensayo de reparación por HCR para m im osina alcanzaría
valores sim ilares a los obt enidos para p19. Sin em bargo, aunque el t rat am ient o con
m im osina t uvo un aum ent o en la reparación, est e no result ó est adíst icam ent e
significat ivo respect o de las células cont rol.
Por ot ro lado, int roduj im os en el est udio una m ut ant e de CDK4 incapaz de
int eraccionar con p19. Ut ilizando nuevam ent e ensayos de HCR encont ram os que CDK4
wild
t ype dism inuyó
los niveles de
reparación
del
ADN observados para
la
sobreexpresión de p19, m ient ras que la m ut ant e CDK4R24C no t uvo ningún efect o
sobre la respuest a de est a prot eína. Concluim os que CDK4 wild t ype est aría
“ secuest rando p19” im pidiendo que est a prot eína ej erza su función en la reparación,
no ocurriendo lo m ism o cuando CDK4R24C es co- expresada con el inhibidor. Est os
result ados en conj unt o apoyan la hipót esis de independencia de funciones de p19, en
donde la función en la reparación no est aría relacionada a su función ant iproliferat iva.
118
DI SCUSI ÓN
2.
2 .1
D a ñ o a l AD N y fosfor ila ción de p1 9
p1 9 r e su lt a fosfor ila da e n r e spu e st a a da ñ o
La respuest a canónica al daño generado en el ADN fue t radicionalm ent e dividida
en dos vías que involucran cascadas de fosforilaciones. Las quinasas principales de
est as vías, ATM y ATR, pert enecen a la fam ilia de prot eínas sim ilares a la fosfat idilinosit ol- 3- quinasa ( PI KK) . Las quinasas ATM y ATR cont rolan los punt os de cont rol
G1/ S, int ra- S y G2/ M a t ravés de la act ivación de sus efect ores río abaj o, Chk2 y Chk1
respect ivam ent e. Las quinasas Chk2 y Chk1 finalm ent e act ivan prot eínas efect oras
que propagan la señalización de la respuest a. ( Abraham , 2001; Bart ek and Lukas,
2003; Harper and Elledge, 2007) .
En el segundo obj et ivo de est e t rabaj o evaluam os la posibilidad de que p19
form ara part e de la com plej a la red de prot eínas que result an fosforiladas en la
respuest a al daño. Hem os descript o que la expresión de p19 es inducida en respuest a
a radiación UV. Sin em bargo, la inducción de p19 no est á rest ringida a est e dañador.
Ha sido dem ost rado por nuest ro grupo de t rabaj o que ot ros agent es genot óxicos
t am bién t ienen la capacidad de inducir la expresión de p19 ( Cerut i et al., 2008) . En
est e últ im o t rabaj o se evaluaron dos dañadores, cisplat ino y pépt ido β- am iloide, los
cuales prom ueven diferent es t ipos de daño. El cisplat ino es una pot ent e droga
ant it um oral que genera principalm ent e aduct os int racat enarios, y el pépt ido β-
am iloide aum ent a los niveles de est rés oxidat ivo int racelular y genera rot uras del t ipo
doble cadena en el ADN ( Rabik and Dolan, 2007; Tam agno et al., 2006) .
Para est udiar si p19 result a fosforilada en respuest a a est os daños se realizaron
ensayos
de
m arcación
m et abólica
con
32
P- ort ofosfat o
en
fibroblast os
WI - 38.
Observam os que p19 en condiciones basales no posee niveles det ect ables de
fosforilación, sin em bargo, cuando las células son t rat adas con alguno de los t res
genot óxicos m encionados ( luz UV, cisplat ino o pépt ido β- am iloide) p19 efect ivam ent e
result a fosforilada. El m ínim o t iem po luego del daño para el cual det ect am os
fosforilación fue de 20 m inut os. Teniendo en cuent a est os result ados y la función en la
reparación del ADN de p19 hipot et izam os que la m ism a podría form ar part e del grupo
de prot eínas t arget de las quinasas que com ponen las vías ATM/ ATR. Result ados aún
no publicados, ut ilizando inhibidores para algunas quinasas de est as cascadas de
señales, m ost raron que t ant o las enzim as apicales ATM y ATR com o las quinasas Chk2
y Chk1 est arían involucradas en el proceso de fosforilación de p19 luego de daño,
apoyando la hipót esis ant erior.
119
DI SCUSI ÓN
2 .2
¿En qu é sit ios e s fosfor ila da p1 9 ?
Para definir los sit ios de fosforilación realizam os en prim er lugar un análisis in
silico de la secuencia prot eica de p19 buscando los sit ios probables de ser m odificados
a t ravés de la herram ient a Net phos. Para los sit ios con valores de probabilidad m ás
alt os, const ruim os m ut ant es reem plazando las serinas o t reoninas por alaninas
( serinas:
13, 66, 76;
t reoninas:
89, 141) .
Est os sit ios, adem ás, result aron
conservados en el alineam ient o de secuencias de p19 correspondient es a diferent es
especies de m am íferos. El est udio de la fosforilación in vivo de est as m ut ant es nos
llevó a concluir que los am inoácidos S13, S66 y T89 no son sit ios reales de
fosforilación por daño, puest o que el est at us de fosforilación en dichas m ut ant es no
fue m odificado con respect o al grado de fosforilación observado para p19wt . Sin
em bargo, sí observam os una dism inución en los niveles de fosforilación para la
m ut ant e T141 com o así t am bién para ot ra m ut ant e, p19ANKless que carece del últ im o
dom inio ankirina en el cuál est á cont enido el sit io T141. Más aún, la m ut ant e en S76
pierde por com plet o la capacidad de ser fosforilada. Est os result ados post ularían a la
serina 76 y la t reonina 141 com o sit ios efect ivos de fosforilación en respuest a a
genot óxicos. Hast a el m om ent o fue report ado un único t rabaj o en el cuál se describe
fosforilación en p19 ( Thullberg 2000) . Los aut ores observaron fosforilación en la línea
celular U2OS, t ransfect ada con el inhibidor y en condiciones basales. Mediant e el
análisis de los fosfopét idos en geles bidim ensionales describen dos sit ios en donde
ocurriría la fosforilación, serina 66 y serina 76 y, adem ás, m encionan una posible
fosforilación en alguna t reonina. La posibilidad de que la serina 76 y alguna t reonina
sean fosforiladas concuerda con los result ados hallados en nuest ro t rabaj o. Sin
em bargo, exist en discrepancias en la observación de fosforilación sin la aplicación de
t rat am ient o alguno y en la fosforilación de la serina 66. Est a diferencia podría
originarse en los sist em as ut ilizados para realizar los est udios. Nuest ros ensayos de
fosforilación fueron conducidos en líneas celulares WI - 38 y BHK- 21 derivadas de
t ej idos norm ales, m ient ras que la línea celular U2OS fue est ablecida a part ir de t ej ido
t um oral provenient e de ost eosarcom a, la cual por su origen podría present ar alt erada
alguna vía que prom oviera la fosforilación. Fue report ado, por sobreexpresión de p19
en células U2OS y SAOS- 2 ( ot ra línea derivada de ost eosarcom a) , que el efect o
inhibit orio de p19 a lo largo del ciclo celular es m odulado por el m ecanism o de
degradación ubiquit ina- prot easom a ( Thullberg et al., 2000) . Por ot ro lado, en un
t rabaj o publicado recient em ent e observaron que m ut ant es de p19 im it ando una doble
fosforilación en los residuos S66 y S76, por reem plazo con ácido glut ám ico,
aum ent aban la capacidad de p19 de ser ubquit inada in vit ro (Low et al., 2009) La
fosforilación de p19 observada in vivo en condiciones basales podría prom over
120
DI SCUSI ÓN
ent onces, un nivel de degradación m ás act ivo de est e inhibidor del ciclo celular que
perm it iera a su vez una t asa de proliferación m ás elevada en est as líneas t um orales.
Est a sería una posible explicación a las diferencias encont radas respect o de nuest ros
result ados.
El hecho de haber encont rado que la m ut ant e p19T141A dism inuye su nivel de
fosforilación y que la m ut ant e p19S76A pierde la capacidad de fosforilarse en su
t ot alidad nos llevó a plant ear la hipót esis de secuencialidad de la fosforilación.
Plant eam os que un prim er paso de fosforilación en serina 76 podría ser necesario para
que una segunda fosforilación ocurriera en la t reonina 141.
2 .3
¿Cu á le s son la s qu in a sa s in volu cr a da s e n e l pr oce so de fosfor ila ción ?
En el análisis in silico de las quinasas capaces de fosforilar a p19, CDK5 y PKA
fueron señaladas com o posibles responsables de la fosforilación en serina 76
y
t reonina 141, respect ivam ent e. Si bien sólo CDK5 fue señalada en el análisis, CDK1 y
CDK2 com part en la m ism a secuencia consenso de fosforilación ( Songyang et al.,
1996) . Ut ilizam os inhibidores para est as quinasas en ensayos de fosforilación in vivo
para evaluar la part icipación de las m ism as en el proceso de fosforilación de p19
endógena, p19wt sobreexpresada y t am bién sobre las m ut ant es de p19. En el caso de
p19 endógena y p19wt , los result ados m uest ran que am bos inhibidores m odificaron
los niveles de fosforilación frent e al t rat am ient o con diferent es agent es dañadores
( UV, pépt ido β- am iloide y cisplat ino) . Roscovit ina, pot ent e inhibidor de CDK1, CDK2,
CDK5 y CDK7, el cuál afect aría la fosforilación en serina 76 elim inó la fosforilación de
p19 en su t ot alidad, m ient ras que H- 89 inhibidor de PKA, enzim a que cat alizaría la
fosforilación en t reonina 141, dism inuyó la fosforilación. A part ir de est os result ados
concluim os, en prim er lugar, que PKA y alguna de las CDK que es inhibida por
Roscovit ina est án involucradas, probablem ent e en form a direct a, en el proceso de
fosforilación de p19 gat illado en respuest a a genot óxicos. Los result ados obt enidos son
congruent es con los encont rados en el análisis de fosforilación de las m ut ant e
p19S76A y p19T141A com ent ados previam ent e y, consecuent em ent e, apoyan la
hipót esis de secuencialidad.
Por ot ro lado, ut ilizando est os m ism os inhibidores en el análisis de la fosforilación
de las m ut ant es de p19 encont ram os que Roscovit ina, com o era esperado, elim ina la
fosforilación observada para p19T141A y p19ANKless. En cuant o al inhibidor de PKA,
H- 89, observam os que la m ut ant e p19T141A no m odifica su nivel de fosforilación por
est e t rat am ient o y t am poco lo hace la m ut ant e p19ANKless con ninguno de los
121
DI SCUSI ÓN
dañadores ut ilizados. Est os result ados nos llevaron a concluir que las m ut ant es
p19T141A y p19ANKless est án siendo fosforiladas por alguna CDK y que, adem ás, en
ellas habría sido efect ivam ent e elim inado el sit io de fosforilación en el cuál PKA
ej ercería su acción. Es decir que la t reonina en la posición 141 sería el único sit io de
p19 en donde est aría involucrada la fosforilación por PKA.
En eucariot as, la división celular y la respuest a a est rés genot óxico est án
est recham ent e ligadas, por ej em plo, por las vías de los checkpoint s que det ect an la
presencia del daño en el ADN y conducen a un arrest o reversible del ciclo celular.
I ndependient em ent e del m ecanism o de reparación del daño que act úe, un paso
est rict am ent e necesario en la respuest a al daño en las células proliferant es es la
inhibición del ciclo celular, la cual es m ediada por la inhibición de las CDKs, enzim as
responsables de conducir la progresión del ciclo ( Cerqueira et al., 2009) . En células
proliferant es, la act ividad de las CDKs est á m odulada por quinasas, fosfat asas e
inhibidores que se encuent ran direct a o indirect am ent e regulados por las vías de
respuest a al daño ( Malum bres and Barbacid, 2005) . La inhibición en respuest a a daño
de la act ividad de CDKs que part icipan en la regulación del ciclo celular, com o CDK1 y
CDK2, cont rast a con los result ados descript os respect o de las quinasas probables de
fosforilar a p19 en la serina 76. Sin em bargo, t rabaj os recient es revelan una nueva
conexión ent re la respuest a al daño y los principales act ores de la división celular, en
la cual, las CDKs que gobiernan la fase de sínt esis de ADN y la m it osis adem ás
part icipan direct am ent e en procesos de reparación del ADN ( ( Wohlbold and Fisher,
2009) . Por ej em plo, en levaduras, CDK1 prom ueve la reparación de daños doble
cadena por el m ecanism o de recom binación hom óloga y est a act ividad es necesaria en
m últ iples pasos de est e m ecanism o de reparación ( Aylon et al., 2004; Huert as et al.,
2008; I ra et al., 2004) ) . En m am íferos, las funciones precisas de las CDKs en la
reparación direct a del daño aún no fueron det erm inadas. Sin em bargo, fue report ado
que la pérdida de CDK2 result a en una deficient e reparación del daño doble cadena
( Deans et al., 2006;
Huert as and Jackson, 2009;
Muller- Tidow et al., 2004;
Sat yanarayana et al., 2008) . Ent re las prot eínas t arget s de CDKs, int egrant es de
m ecanism os de reparación que han sido descript as hast a el m om ent o, podem os
m encionar a 53BP, Ct iP, BRCA1, Rad9, Crb2 y ATRI P ( Caspari et al., 2002; Myers et
al., 2007; Yat a and Esashi, 2009) . Est os result ados describen a las CDKs com o
efect ores posit ivos en la respuest a al daño, hast a el m om ent o en la vía de reparación
del daño doble cadena, y result an coherent es con la idea de fosforilación de p19 por
CDKs.
La hipót esis acerca de la acción direct a de las quinasas fue analizada m ediant e
diferent es est rat egias. En prim er lugar, buscam os definir en la línea WI - 38 cuál de las
122
DI SCUSI ÓN
CDKs podría est ar act uando en la fosforilación. Si bien sólo la quinasa CDK5 fue
indicada por la herram ient a Net phosK en la fosforilación de p19, CDK1 y CDK2
com part en la m ism a secuencia consenso de fosforilación ( Songyang et al., 1996) .
Evaluam os fosforilación de p19 ut ilizando oligonucleót idos ant isent ido de CDK1 y
CDK2 ( ASCDK1 y ASCDK2) para dism inuir sus respect ivas act ividades. Com o fue
m encionado con ant erioridad la act ividad de CDK5 solo fue report ada en t ej ido
nervioso, por lo cual descart am os su part icipación en la línea celular WI - 38. Los
result ados indicaron que CDK2 part iciparía en el proceso de fosforilación. Sin
em bargo, no fue det ect ada ninguna variación en la fosforilación de p19 cuando las
células fueron t rat adas con el oligonucleót ido ASCDK1. Si bien el hecho de no observar
variaciones cuando las células son incubadas con ASCDK1 podría im plicar que est a
quinasa no est á relacionada con el proceso de fosforilación, no podem os descart ar su
part icipación a part ir de est os result ados puest o que no hem os podido det ect ar una
dism inución en los niveles de prot eína CDK1, observando una baj a int ensidad de las
bandas de la prot eína por West ern blot . Una explicación posible podría est ar
fundam ent ada en que la prot eína CDK1 t uviera una vida m edia larga o t am bién que
hubiera fallado el diseño de la sonda ant isent ido. Sin em bargo, obt uvim os una efect iva
dism inución de los niveles de ARNm para la quinasa CDK1, lo cual indicaría el correct o
funcionam ient o de la est rat egia. CDK2 present a act ividad sobre el final de la fase G1 y
en la fase S, m ient ras que la act ividad de CDK1 se desarrolla principalm ent e en las
fase G2 y M ( Trim archi and Lees, 2002) . Al conducir los ensayos en células no
sincronizadas, el m ayor porcent aj e de células en est udio se encuent ra en las fases G1
y S, para las cuales est á descript a la act ividad de CDK2. Podem os suponer que CDK1
es una quinasa que efect ivam ent e fosforila p19, que la sonda ant isent ido para la
m ism a est á funcionando correct am ent e y que el problem a en la det ección de la
prot eína est uviera en el ant icuerpo y/ o las diluciones del m ism o ut ilizadas. En t al caso
el baj o porcent aj e de células en las fase G2/ M y consecuent em ent e la baj a act ividad
de CDK1 en el t ot al de la población de células analizadas podría explicar la no
dism inución en el nivel de fosforilación de p19 ut ilizando la sonda ASCDK1. En est e
caso la fosforilación por CDK2 enm ascararía la dism inución de la fosforilación por
depleción de CDK1. Ent onces, no descart am os la act uación de CDK1 sobre la
fosforilación de p19 y concluim os que para analizar est e punt o el ensayo debería ser
realizado en células sincronizadas.
Profundizando en el est udio de las quinasas involucradas en la fosforilación
quisim os evaluar si CDK2, CDK5 y PKA serían capaces de fosforilar a p19 en form a
direct a. En el prim er abordaj e ut ilizam os pépt idos represent ando las secuencias de
p19
alrededor
de
respect ivam ent e) .
los
El
sit ios
pépt ido
serina
p- S76
76
y
fue
t reonina
incubado
141
con
( p- S76
CDK2
y
o
p- T141
CDK5
123
DI SCUSI ÓN
inm unoprecipit adas de ext ract os celulares apropiados dañados por UV, m ient ras que
el pépt ido p- T141 fue incubado con PKAc purificada de corazón bovino. Concluim os
que, t ant o CDK2 com o CDK5 pueden fosforilar direct am ent e al pépt ido p- S76 y
adem ás que, PKAc t iene la capacidad de fosforilar a p- T141.
Est udiam os luego la capacidad de est as quinasas de fosforilar in vit ro a la prot eína
com plet a p19, em pleando las m ism as fuent es de las enzim as descript as para el punt o
ant erior. Observam os fosforilación de GST- p19 para las t res quinasas evaluadas,
CDK2, CDK5 y PKAc. Llam at ivam ent e, observam os fosforilación por PKAc sobre p19
sin encont rarse fosforilada en serina 76, un posible requerim ient o para que est a
fosforilación t enga lugar. Sin em bargo, el cont ext o art ificial que im plica est e ensayo in
vit ro m uy probablem ent e act úe forzando est a reacción de fosforilación.
Finalm ent e, buscam os com probar la int eracción in vivo ent re las quinasas y p19.
En prim er lugar, se realizaron est udios de co- inm unoprecipit ación, t ransfect ando
solam ent e la prot eína p19 en las células. Lam ent ablem ent e est os ensayos no fueron
exit osos, quizás debido a que las int eracciones quinasa- sust rat o son m uy débiles y de
m uy cort a duración, por lo cual plant eam os la necesidad de co- t ransfect ar p19 y las
enzim as respect ivas. La co- t ransfección de p19 y PKAc nos perm it ió det ect ar la coinm unoprecipit ación de est as dos prot eínas. El m ism o análisis con las quinasa CDK2 y
CDK5 es un obj et ivo pendient e en est e t rabaj o. En est e caso, adem ás de t ransfect ar
las quinasas será necesario co- t ransfect ar los coact ivadores de cada una de ellas.
2 .4
H ipót e sis de la fosfor ila ción se cu e n cia l
Ahondando en el est udio de la fosforilación secuencial de p19 fue ut ilizada la
t écnica de dinám ica m olecular ( MD) para sim ular est e proceso. Los result ados de est e
análisis m ost raron que la fosforilación en serina 76, podría conducir a cam bios
est ruct urales
en
algunas
regiones,
part icularm ent e
los
β- hairpins
de
las
repet iciones ankirina 3º , 4º y 5º . El β- hairpin del quint o dom inio ankirina cont iene a la
t reonina en la posición 141 por lo cual hipot et izam os que est e cam bio conform acional
podría perm it ir la int eracción ent re p19 y una segunda quinasa, probablem ent e PKA,
que act uara sobre el sit io t reonina 141. A su vez, los cam bios est ruct urales generados
por est a segunda fosforilación podrían favorecer int eracciones con ot ras prot eínas
ligadas a la función de p19 en la reparación del ADN.
Const ruim os ent onces, una m ut ant e sim ple y una doble m ut ant e de p19 im it ando
la fosforilación en serina 76 o en am bos residuos, serina 76 y t reonina 141 ( p19S76E
y p19S76T141E respect ivam ent e) . Si la hipót esis de secuencialidad result ara válida, la
124
DI SCUSI ÓN
m ut ant e que no puede ser fosforilada en serina 76 pero que sí sim ula est a
fosforilación debería perm it ir la fosforilación de un segundo residuo am inoacídico.
Observam os que la m ut ación por sí m ism a no es suficient e para prom over la
fosforilación
de p19S76E en
condiciones basales,
sin
em bargo,
efect ivam ent e
com probam os que p19S76E result a fosforilada cuando la act ivación de la respuest a al
daño es prom ovida por luz UV. Sum ado a est o, observam os que la m ut ant e
p19S76T141E no present a niveles de fosforilación det ect ables frent e al m ism o daño
evaluado. Est o hecho sugiere que serina 76 y t reonina 141 serían los únicos sit ios en
p19 en ser fosforilados en respuest a a daño, la fosforilación en serina 76 est aría
prom oviendo solam ent e la fosforilación en t reonina 141. Por lo cual, de est a part e
concluim os que,
t ant o
el
result ado
del
análisis por
MD com o
est as últ im as
observaciones, apoyan fuert em ent e la hipót esis de secuencialidad de la fosforilación
de p19 en respuest a a agent es genot óxicos, prim ero en serina 76 y luego en t reonina
141.
2 .5
¿En qu é com pa r t im ie n t o su bce lu la r ocu r r e la fosfor ila ción de p1 9 ?
La predicción in silico de la localización de p19 describe a est a prot eína com o
predom inant em ent e cit oplasm át ica. Sin em bargo, fue report ado que p19 se t ransloca
al núcleo luego de irradiación por UV ( Cerut i et al., 2005) . Modificaciones post t raduccionales com o la fosforilación perm it en un cont rol t em poral y espacial sobre la
relocalización de prot eínas. Nos pregunt am os ent onces si la fosforilación, prom ovida
por daño genot óxico, es requerida para el pasaj e de p19 desde el cit oplasm a al
núcleo.
Con est e obj et ivo, evaluam os la localización de la prot eína por West ern blot en
relación con los event os de fosforilación de p19wt o de las m ut ant es de p19
( p19S76A, p19141A, p19S76T141A y p19S76E) m ediant e ensayos de m arcación
m et abólica en los cuales se realizó un fraccionam ient o subcelular en form a previa a la
inm unoprecipit ación de p19wt y sus variant es.
Los result ados obt enidos indican que la fosforilación de p19, luego del daño al
ADN, ocurre en el espacio cit oplasm át ico. Los ensayos con la m ut ant e p19T141A y el
t rat am ient o con H- 89 en las células con p19wt indican que el sit io serina 76 result a
fosforilado en el cit oplasm a y que, adem ás, la t reonina 141 no es necesaria para el
pasaj e de p19 al núcleo puest o que, en am bos t rat am ient os, p19 se observa a los 60
m inut os luego de la irradiación con UV en est e espacio subcelular. Por ot ro lado, los
ensayos ut ilizando la m ut ant e p19S76E señalan que la t reonina 141, único residuo con
125
DI SCUSI ÓN
capacidad de ser fosforilado en est a prot eína, es t am bién m odificado en el cit oplasm a.
Finalm ent e, la fosforilación de p19 en serina 76 es est rict am ent e necesaria para la
t raslocación de la prot eína, ya que la m ut ant e p19S76A pierde la capacidad de
relocalización nuclear.
2 .6
¿Cu á l e s la r e le va n cia fisiológica de la fosfor ila ción ?
Dem ost ram os que la sobreexpresión de p19wt aum ent a significat ivam ent e la
capacidad de las células MA- 10 y WI - 38 de reparar el ADN en respuest a a genot óxicos
y, adem ás, que p19wt es fosforilada por el t rat am ient o con est os m ism os dañadores.
Result ó lógico plant ear que la fosforilación de p19 podría est ar ligada con su función
en la reparación del ADN. Encarando el est udio en est a dirección, realizam os ensayos
de UDS para m edir reparación del ADN t ransfect ando las m ut ant es de p19 que
dism inuyen o pierden por com plet o la capacidad de ser fosforiladas ( p19S76A,
p19T141A, p19 ANKless y p19S76T141A) . Observam os que las m ut aciones en est os
sit ios afect an sust ancialm ent e los niveles de reparación en cont rast e con los
result ados
derivados
de
la
sobreexpresión
de
p19wt .
Los
t rat am ient os
correspondient es a las m ut ant es p19S13A, p19S66A y p19T89A no m odificaron la
respuest a obt enida para p19wt . Est os result ados avalan la hipót esis plant eada
inicialm ent e en la cual la fosforilación de p19 fue post ulada com o necesaria en la
función de p19 de reparación del ADN. Aún m ás, am bos sit ios, serina 76 y t reonina
141, son requeridos en est a función. La m ut ant e p19T141A, que conserva ciert o nivel
de fosforilación por daño, pierde com plet am ent e el efect o sobre la reparación. Por ot ro
lado, las m ut ant es p19S76E y p19S76T141E que im it an la fosforilación, pero
perdiendo parcial o com plet am ent e la capacidad de ser fosforiladas, recuperan la
función de reparación. Hem os señalado previam ent e, que la serina en la posición 76
es necesaria y suficient e para la t ranslocación de p19 al núcleo en respuest a a daño.
El
result ado
del
análisis
por
UDS
dem uest ra
que
adem ás
t reonina
141
es
est rict am ent e necesaria en la función de reparación. La fosforilación en est e sit io
podría perm it ir la int eracción de p19 en el núcleo con ot ras prot eínas involucradas en
la reparación del ADN para cum plir con su función.
Describim os que p19wt capaz de ser fosforilada aum ent a sensiblem ent e la
capacidad de las células de reparar el ADN y que est e aum ent o en la reparación est á
correlacionado con la dism inución en la m uert e por apopt osis. Plant eam os luego que
las m ut ant es de fosforilación perderían el efect o prot ect or de p19 sobre la apopt osis
inducida por daño. En efect o, las células t ransfect adas con las m ut ant es que pierden
la función de reparación del ADN present an niveles de apopt osis sim ilares a los
126
DI SCUSI ÓN
observados en las células cont rol, sin sobreexpresión de p19wt . La función de
reparación de p19 y en consecuencia, el sit io serina 76 y t reonina 141, son
fundam ent ales en la resist encia que ej erce p19 cont ra la m uert e por apopt osis
inducida por daño.
El alineam ient o de secuencias para las diferent es I NK4 reveló que ninguno de los
dos am inoácidos, serina 76 o t reonina 141 se encuent ran conservados en est a fam ilia
de inhibidores. La fosforilación en est os sit ios podría ser la clave para explicar el
com port am ient o diferencial de p19 en sit uaciones de daño al ADN.
Por últ im o, evaluam os la necesidad de la fosforilación en la función clásica de p19
com o inhibidor de CDK4/ CDK6. En el alineam ient o de secuencias para la fam ilia I NK4
observam os t am bién que un único sit io pot encial de ser fosforilado, t reonina 89, se
encont raba conservado. Los result ados descript os hast a aquí nos llevaron a plant ear
que si la función de p19 en la reparación result ara efect ivam ent e independient e de su
función inhibit oria del ciclo celular, los sit ios serina 76 y t reonina 141 responsables de
la fosforilación en p19 por daño no est arían involucrados en la inhibición de la
proliferación. Adem ás, si bien no obt uvim os fosforilación de p19 en ausencia de daño,
pensam os que la t reonina conservada en la posición 89 podría t ener alguna
im plicancia, quizás est ruct ural, en la función ant iproliferat iva de p19. El est udio fue
realizado por incorporación de 3 H- t im idina en la línea WI - 38 sobreexpresando t odos
las m ut ant es generadas para p19. No encont ram os diferencias significat ivas en las
capacidades de arrest ar el ciclo celular para ninguna de las m ut ant es de fosforilación
analizadas.
La
m ut ant e
est ruct ural
p19ANKless
sí m odifica
parcialm ent e
est a
capacidad. En est a m ut ant e la elim inación del quint o dom inio ankirina com plet o podría
est ar desest abilizando la est ruct ura de p19 en los dom inios 1 y 2 que fueron
report ados com o los responsables de la int eracción con CDK4/ 6 ( Low et al., 2009) .
Teniendo en cuent a que las m ut ant es p19S76A, p19T141A y p19S76T141A
pierden su función en la reparación pero no en la inhibición del ciclo celular, los
result ados expuest os en est e punt o apoyan fuert em ent e la hipót esis de independencia
de funciones de la prot eína p19.
127
DI SCUSI ÓN
3.
I n t e r a ct or e s de p1 9 liga dos a l r ol de r e pa r a ción de l AD N
La pregunt a lógica que surge, en base a t odos los result ados descript os y
discut idos hast a aquí, apunt a a descifrar cuál podría ser el m odelo de acción de p19
en respuest a al daño al ADN. En est e últ im o obj et ivo iniciam os el est udio en est a
dirección a t ravés de la búsqueda de posibles int eract ores de p19. Ut ilizam os la
t écnica de doble híbrido Cyt ot rap, a part ir de la cual, ident ificam os 6 prot eínas de
int erés. Est as prot eínas pueden ser clasificadas en 3 grupos dist int os en base a sus
funciones descript as hast a el m om ent o: Prot eínas de Reparación; Reguladores de
Fact ores de Transcripción ligados al Ciclo Celular y a la Apopt osis; y Fact ores
Rem odeladores de la Crom at ina. Las 6 prot eínas present an funciones en procesos
com unes a p19, razón por la cual result an de part icular int erés.
Encont ram os una prot eína en el prim er grupo llam ada Cullin- associat ed and
neddylat ion- dissociat ed 1 ( CAN D 1 ) . Est a prot eína t iene, ent re ot ras funciones, un rol
fundam ent al en la regulación del reconocim ient o del daño por UV en el ADN y en el
reclut am ient o de la m aquinaria NER. Est e rol fue descript o en el año 2006.
En el segundo grupo que com prende Fact ores de t ranscripción encont ram os a 2
prot eínas : I nt erferon regulat ory fact or 2 binding prot ein 2 ( I RF2 BP2 ) y Cell division
cycle and apopt osis regulat or 1 ( CCAR1 ) .
I RF2 BP2 fue descript a por prim era vez en el año 2003 com o una prot eína
nuclear
de unión
al dom inio
represor
C- t erm inal
del
I RF- 2.
I nhibe t ant o
la
t ranscripción basal com o la t ranscripción act ivada por un est ím ulo de los genes
regulados por est e fact or. Prom ueve el arrest o del ciclo celular e int erfiere con la
apopt osis m ediada por p53.
CCAR1 fue descript a por prim era en el año 2003, com o un induct or de apopt osis
que regula est a vía de m uert e en respuest a a diversos t ipos de agent es incluyendo
adriam icina. Niveles reducidos de CCAR1 result an en la inhibición de la apopt osis,
m ient ras que la expresión aum ent ada provoca niveles elevados de p21 y m uert e
celular. CCAR1 t am bién int eract úa con la prot eína 14- 3- 3 y produce la dism inución de
la expresión de genes regulat orios del ciclo celular incluyendo c- Myc y ciclina B1.
En el últ im o grupo encont ram os 3 prot eínas que t ienen funciones en la
rem odelación de la crom at ina: brom odom ain cont aining 7 ( BRD 7 ) ; Gem inin, ADN
replicat ion inhibit or ( GM N N ) ; y m ale- specific let hal 1 hom olog ( M SL1 ) .
La int eracción de p19 con fact ores rem odeladores de la crom at ina result a
part icularm ent e at ract iva porque la función de p19 en la reparación del ADN no parece
128
DI SCUSI ÓN
est ar dirigida a un m ecanism o de reparación en part icular. Hem os descript o que la
inducción y fosforilación de p19 se produce en respuest a a dist int os agent es
genot óxicos y cuyos daños result an reparados por m ecanism os diferent es. La
eficiencia de reparación de est os daños se ve influenciada por los niveles prot eicos de
p19 y t am bién por su fosforilación. La part icipación de p19 en m ecanism os diversos
podría ser explicada por una función en la respuest a prim aria al daño com ún para los
genot óxicos ensayados. Est a función podría ser la de act uar en la rem odelación de la
crom at ina, razón por la cual p19 sería propuest o com o un fact or ligado a la
accesibilidad de la crom at ina.
BRD 7 fue ident ificada por prim era vez com o una prot eína de unión al Fact or
Regulador
observando
del
I nt erferon
una
2
( I RF- 2)
co- localización
con
en
1997.
Es predom inant em ent e
hist onas
H3
y
H4
nuclear
hiperacet iladas.
La
sobreexpresión de BRD7 inhibe el crecim ient o y la progresión del ciclo celular de la
fase G1 a la fase S. Recient em ent e BRD7 fue descript o com o un com ponent e del
com plej o rem odelador de la crom at ina SWI / SNF ( 2008) .
M SL1 es una prot eína descript a recient em ent e en hum anos ( 2005) que codifica
una de la cinco prot eínas que form an un com plej o alt am ent e conservado denom inado
MSL ( m ale- specific let hal) con act ividad de hist ona acet il- t ransferasa ( HAT) . La
prot eína MOF, que form a part e del com plej o est á involucrada en la act ivación de ATM
en respuest a a daño al ADN. La acet ilación de p53 por MOF influencia la decisión
celular de inducir apopt osis por sobre el arrest o del ciclo celular. Fue propuest o que la
prot eína 53BP1 reclut aría a MSL1 a los alrededores del ADN dañado y que luego el
com plej o MSL aum ent aría la acet ilación en lisinas 16 en hist onas H4. La m odificación
de hist onas conduciría a cam bios est ruct urales induciendo la rem odelación de la
crom at ina y la relaj ación del ADN perm it iendo a la m aquinaria de reparación acceder a
los sit ios dañados ( 2009) .
GM N N fue caract erizada com o una m olécula de función dual con roles en el
m ant enim ient o
de
la
int egridad
del
genom a
a
t ravés
de
la
regulación
del
licenciam ient o de la replicación del ADN. Fue descript a la int eracción ent re GMNN y
Brg1, la subunidad cat alít ica del com plej o rem odelador de la crom at ina SWI / SNF, que
ant agoniza la t ranscripción dependient e de Brg1 y
regula la t ransición ent re
proliferación y diferenciación durant e la neurogénesis ( 2005) . Tam bién int eracciona e
inhibe Cdt 1, el cual es prot eolizado en la fase G1 en respuest a a daño en el ADN,
presum iblem ent e conform ando un nuevo checkpoint .
Es int eresant e dest acar que las prot eínas descript as ó bien las funciones que
hacen m ás llam at iva la posibilidad de int eracción de ellas con p19, han sido descript as
en los últ im os 6 años. Est o podría im plicar que aún exist e un am plio cam po de est udio
129
DI SCUSI ÓN
en los m ecanism os en los cuales est án involucradas y de los cuales p19 podría form ar
part e.
La confirm ación de las int eracciones in vivo ent re p19 y est os candidat os es un
obj et ivo que será cont inuado por el laborat orio. Aspiram os a describir un m ecanism o
de acción que int egre la inducción de la expresión de p19, su fosforilación y la
part icipación de est a prot eína en la respuest a al est rés genot óxico, la cual result a
crít ica en el m ant enim ient o norm al de la est abilidad del genom a y consecuent em ent e
en la supervivencia celular.
130
M ATERI ALES
Y M ETOD OS
MATERI ALES Y MÉTODOS
Cu lt ivo de Lín e a s Ce lu la r e s
M e dios de cu lt ivo. Las células de Leydig MA- 10 fueron cult ivadas en bot ellas T25
y T75 ( TRP) y m ant enidas en m edio Waym out h MB752/ 1 cont eniendo 1,1 m g/ m l de
NaHCO3 , 20 m M HEPES, 50 μg gent am icina y 15% de suero de caballo, a 37 º C en
at m ósfera hum idificada con 5% de CO2. La línea celular fibroblást ica hum ana WI - 38
fue cult ivada en placas de 100 m m de diám et ro y en bot ellas T75 ( TRP) y m ant enida
en m edio esencial m ínim o ( MEM) cont eniendo 10% de suero fet al bovino ( SFB) , Lglut am ina 2 m M, piruvat o de sodio 1 m M, am inoácidos no esenciales 0,1 m M,
bicarbonat o de sodio 1,5 g/ l, penicilina 100 U/ m l, est rept om icina 100 µg/ m l,
Anfot ericina B 1 m g/ m l a 37 º C y en at m ósfera de aire con 5% de CO2 . La línea celular
fibroblást ica BHK- 21 provenient e de riñón de hám st er ( Mesocricet us aurat us) fue
cult ivada en placas de 100 m m y m ant enidas en m edio D- MEM ( Dulbecco´ s m odified
Eagle m edium , GI BCO) suplem ent ado con 10% de SFB, L- glut am ina 2 m M, piruvat o
de sodio 1 m M, am inoácidos no esenciales 0,1 m M, bicarbonat o de sodio 1,5 g/ l,
penicilina 100 U/ m l, est rept om icina 100 µg/ m l, Anfot ericina B 1m g/ m l a 37 º C y en
at m ósfera de aire con 5% de CO2 .
Tr ipsiniza ción . Una vez que las células form aron una m onocapa, el m edio de
cult ivo fue aspirado y descart ado, las células se lavaron una vez con PBS para
rem over los inhibidores de t ripsina present es en el suero y luego se agregó a cada
placa o bot ella 1,5 m l de solución de t ripsina 0,25% , EDTA 0,53 m M ( GI BCO) . Se
incubaron a 37 °C hast a observar en el m icroscopio que las células se despegaron.
Luego fueron resuspendidas en m edio fresco, se det erm inó el núm ero y la viabilidad
celular com o se indica m ás abaj o y se sem braron a una densidad de 2,0 x 10 4 células/
cm 2 en bot ellas T25 o T75 o en placas de 100 m m de diám et ro.
PBS: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO4 , y 0,24 g de KH2 PO4 en 1 lit ro de
agua bidest ilada, pH 7,4.
D e t e r m in a ción de l nú m e r o de cé lu la s y su via bilida d. Para la det erm inación
del núm ero de células y su viabilidad se em pleó el m ét odo de exclusión del azul
t ripán. Se colocaron 50 μl de la suspensión celular en 30 μl de m edio y 20 μl de la
solución de azul t ripán 4% ( azul t ripán 400 m g, NaCl 810 m g, K2 HPO4 60 m g y m et ilp- hidroxibenzoat o 50 m g a pH 7,4, en PBS) . Se colocó una got a de est a m ezcla en
una cám ara de Neubauer y se efect uó el recuent o celular ( N) al m icroscopio ópt ico en
los cuat ro cuadrant es de la cám ara ent re los 5 y los 10 m inut os luego del agregado
del colorant e. El núm ero de células t ot ales por m l y el porcent aj e de viabilidad se
calculó aplicando las siguient es fórm ulas:
132
MATERI ALES Y MÉTODOS
Cé lu la s/ m l = ( N / 4 ) x 1 .0 0 0 x 2 x 1 0
% de viabilidad = células no t eñidas x 100
células t ot ales
Ar r e st o de l ciclo ce lu la r .
Las células creciendo exponencialm ent e fueron arrest adas en la fase G1 t em prana
m ediant e la incubación en m edio con 1% de suero durant e 36 horas y fueron
inducidas a ret om ar el ciclo celular en form a sincrónica m ediant e el agregado de 10%
ó 15% de suero al m edio de cult ivo dependiendo del cult ivo celular.
An á lisis de l ciclo ce lu la r m e dia n t e cit om e t r ía de flu j o.
Pr e pa r a ción de los e x t r a ct os. Aproxim adam ent e 1 x 10 6 células fueron
cosechadas con 1 m l de PBS cont eniendo 10% SFB. Luego, se cent rifugaron a 1000
rpm durant e 5 m inut os. El pellet celular se resuspendió suavem ent e en 100 μl de PBS,
se pasó a ot ro t ubo cont eniendo 1 m l de m et anol y se dej ó a 4 º C t oda la noche. Las
células fij adas se lavaron 2 veces con PBS, se les agregó 200 μl de RNAsa A 0,2
m g/ m l en PBS y se incubaron 30 m inut os a 37 º C. Luego se resuspendieron en 200 μl
de PBS cont eniendo ioduro de propidio 50 μg/ m l. El cont enido de ADN celular fue
analizado en un cit óm et ro de fluj o FACScan ( Bect on Dickinson I m m unocyt om et ry
Syst em s, San Jose, CA, USA) . Los dat os fueron analizados con el program a WinMDI
2.8.
An á lisis de ARN por N or t h e r n blot .
Obt e n ción de RN A t ot a l. El ARN t ot al fue obt enido según el m ét odo descript o
previam ent e ( Chom czynski and Sacchi, 1987) , levem ent e m odificado. Part iendo de 2
x 10 6 células en placas de 6 cm de diám et ro, se lavaron una vez con PBS frío, se
agregaron 700 μl de solución D desnat uralizant e, se hom ogeneizaron con m icropipet a
y se t rasvasaron a un t ubo eppendorf. Todo el t rabaj o se realizó sobre hielo. Se
agregaron luego 50 μl de acet at o de sodio 2 M pH 4,5, 400 μl de fenol sat urado en Tris
pH 8,0 y 90 μl de cloroform o- alcohol isoam ílico ( 49: 1) . La suspensión fue agit ada
vigorosam ent e durant e 10 segundos con un vórt ex y cent rifugada durant e 20 m inut os
a 10.000 rpm a 4 º C. La fase superior acuosa, que cont iene el RNA se t rasvasó a ot ro
t ubo y el m ism o fue precipit ado agregando un volum en de isopropanol y dej ándolo
durant e 1 hora a - 20 º C. Se cent rifugó luego a 10.000 rpm durant e 20 m inut os a 4
º C, se descart ó el sobrenadant e y el pellet fue resuspendido en 150 μl de solución D.
133
MATERI ALES Y MÉTODOS
El ARN fue reprecipit ado con 150 μl de isopropanol cent rifugándolo 20 m inut os a
10.000 rpm . Se lavó 2 veces con et anol 75% y se resuspendió en 22 μl de agua est éril
libre de RNasas.
La concent ración del ARN se calculó m idiendo la absorbancia a 260 nm ( 1 OD 260 =
40 μg de RNA) acept ando com o crit erio de pureza un cocient e A260 / A280 m ayor que 1,7
( Sam brook et al, 1989) .
Solución
D
desnat uralizant e:
isot iocianat o
de
guanidina
25 m M pH 7, N- laurilsarcosina 5 % , β- m ercapt oet anol 0,1 M.
4M,
cit rat o
de
sodio
Ele ct r ofor e sis de RN A. La separación elect roforét ica del ARN t ot al se realizó
según una adapt ación del m ét odo descript o por ( McMast er and Carm ichael, 1977) . Las
m uest ras de ARN ( 20 μg) se desnat uralizaron a 50 º C durant e 60 m inut os en una
m ezcla cont eniendo glioxal 1,2 M, DMSO 7,5 M, fosfat o de sodio 10 m M pH 7. Luego,
las m uest ras fueron t rat adas con el buffer de siem bra y sem bradas en gel de agarosa
1% en buffer fosfat o 10 m M. La corrida elect roforét ica se llevó a cabo durant e 2- 3
horas a 100 m V en buffer fosfat o de sodio 10 m M.
Buffer de Siem bra: glicerol 50% , fosfat o de sodio 10 m M pH 7, azul de brom ofenol
0,25% y xilene cianol FF 0,25% .
Tr a n sfe r e ncia de RN A a m e m br a na . Una vez finalizada la elect roforesis, el gel
fue som et ido a t ransferencia pasiva a una m em brana de nylon ( Hybond- N+
Am ersham ) según lo descript o por Sam brook y col ( 1989) . Dicha m em brana fue
hum edecida previam ent e durant e 45 m inut os en SSC 20X. La t ransferencia se realizó
por capilaridad ascendent e en una solución de SSC 20X durant e 16 horas. Luego el
filt ro de nylon se secó ent re papeles What m an 3MM durant e 30 m inut os a
t em perat ura am bient e y se colocó en est ufa a 80 º C durant e 1 hora para que el ARN
se fij e irreversiblem ent e al nylon.
SSC 20X: NaCl 3 M, cit rat o de sodio 0,3 M pH 7
M a r ca ción de son da s
p1 9 . Con la finalidad de det ect ar el ARNm de p19I NK4d se sint et izó un
oligonucleót ido de 24 bases com plem ent ario a las bases + 3 a + 26 del ARNm de
p19I NK4d hum ano ( Newt on Bishop et al., 1999) cuya secuencia es: 5'- GGC GCG AAC
CTC CTC CAG CAG CAT - 3'.
134
MATERI ALES Y MÉTODOS
El oligonucleót ido fue m arcado radiact ivam ent e en su ext rem o 5' con la enzim a T4
polinucleót ido quinasa. Se preparó la m ezcla de reacción cont eniendo 5 pm oles de
oligonucleót ido, el buffer de reacción, 5 U de T4 polinucleót ido quinasa ( I nvit rogen) ,
100 μCi de [ γ- 32 P] ATP ( 6.000 Ci/ m m ol) , en un volum en t ot al de 30 μl. Est a
preparación se incubó 1 hora a 37 º C. La sonda m arcada fue purificada, para elim inar
el nucleót ido radioact ivo no incorporado, m ediant e dos precipit aciones sucesivas con
1/ 10 del volum en de acet at o de am onio 7,5 M pH 5,5 y 2 volúm enes de et anol
absolut o durant e 30 m inut os a - 20 º C. Se cent rifugó a 10.000 rpm durant e 20
m inut os. El precipit ado fue lavado con et anol 70% y resuspendido en 100 μl de buffer
TE ( Tris- HCl 10 m M y EDTA 1 m M) . Una alícuot a de la sonda se colocó en un vial con
líquido cent ellant e a base de t olueno y se cont ó la radioact ividad en un cont ador de
cent elleo líquido. Las sondas poseían una act ividad específica aproxim ada de 4- 6 x 10 3
cpm / fm ol.
Buffer TE: 10 m M Tris- HCl pH 8 y EDTA 1 m M.
β- t u bu lina . Los result ados de los ensayos de Nort hern blot fueron norm alizados
con los valores de los niveles de ARNm de β- t ubulina det ect ados en paralelo. Se eligió
el gen de la β- t ubulina por ser un gen de expresión const it ut iva, no afect ado por las
fases del ciclo celular. Para det ect ar el ARNm de β- t ubulina se em pleó com o m olde el
ADNc de β- t ubulina de pollo escindido del plásm ido pBR322β- t ubulina ( cedido por el
Dr. J. Messina; Universidad de Sout h Florida, Florida, EEUU) por digest ión con la
enzim a Hind ΙΙΙ. El cADN se m arcó radiact ivam ent e por la t écnica de hibridización con
hexaoligonucleót idos de secuencia al azar ( “ random prim ers” ) . Se m ezclaron 40 ng del
ADN m olde, previam ent e desnat uralizado 5 m inut os a 95 º C, buffer de reacción
correspondient e, 2 U del fragm ent o Klenow de la ADN polim erasa Ι de E.coli, 0,25 DO
de la m ezcla de hexaoligonucleót idos de secuencia al azar, dATP, dTTP, dGTP a una
concent ración 500 μM cada uno y [ α- 32 P] dCTP 10 μCi/ μl, ( 3.000 Ci/ m m ol) . La m ezcla
de reacción fue incubada a 25 º C det eniéndose luego de 1 hora con “ st op buffer” ( Tris
50 m M pH 8, EDTA 5 m M, NaCl 50 m M y SDS 0,5% ) . La sonda fue precipit ada con
1/ 10 del volum en de acet at o de am onio 7,5 M pH 5,5 y 2 volúm enes de et anol
absolut o durant e 1 hora a - 20 º C. Se cent rifugó a 10.000 rpm durant e 20 m inut os, se
lavó el precipit ado con et anol 70% y se resuspendió en 100 μl de buffer TE ( Tris 10
m M y EDTA 1 m M) . Una alícuot a de la sonda se colocó en un vial con líquido
cent ellant e a base de t olueno y se cont ó la radioact ividad en un cont ador de cent elleo
líquido. Las sondas así obt enidas poseían una act ividad específica aproxim ada de 5- 7 x
10 3 cpm / fm ol.
135
MATERI ALES Y MÉTODOS
Para det ect ar el ARNm de p16I NK4a, p15I NK4b, p18I NK4c, se ut ilizaron com o
sondas, los ADNc correspondient es m arcados con [ α- 32 P] dCTP con el m ét odo de
“ random prim ers” de m anera sim ilar a la descript a para
- t ubulina.
H ibr idiza ción . Las m em branas de nylon cont eniendo el ARN fij ado por calor
fueron prehibridizadas en una solución bloqueant e. Para det ect ar el ARNm de p19 la
prehibridización se llevó a cabo en una solución cont eniendo SSC 6X, SDS 0,1% ,
Denhardt 2X ( polivinilpirrolidona 0,04% , Ficoll 0,04% , seroalbúm ina bovina 0,04% ) y
ADN de esperm a de salm ón 100 μg/ m l durant e 2 horas a 68 º C en horno de
hibridización con rot ación. Post eriorm ent e, la sonda para p19 fue agregada a la
solución y la hibridización se com plet ó a 68 º C por 16 horas m ás. Finalizado est e
procedim ient o, las m em branas fueron lavadas 3 veces a t em perat ura am bient e con
SSC 1X y SDS 1% durant e 2 m inut os y t res veces a 68 º C con SSC 0,2X y SDS 0,1%
durant e 2 m inut os.
Para det ect ar los ARNm de β- t ubulina, p16I NK4a, p15I NK4b, p18I NK4c, la
prehibridización se llevó a cabo en una solución bloqueant e ( SSC 6X, SDS 1% ,
Denhardt 2X, y ADN de esperm a de salm ón 100 μg/ m l) durant e 2 horas a 68 º C en
horno de hibridización
con
rot ación.
Post eriorm ent e se agregaron
las sondas
correspondient es y se com plet ó la hibridización a 68 º C por 16 horas m ás. Finalizado
est e procedim ient o, las m em branas fueron som et idas a dos lavados a t em perat ura
am bient e con SSC 2X y SDS 0,1% durant e 15 m inut os y dos lavados a 68 º C con SSC
0,2X y SDS 0,1% durant e 15 m inut os.
Au t or r a diogr a fía y cu a n t ifica ción . Las m em branas lavadas se secaron ent re
papel What m m an 3MM por 30 m inut os, se envolvieron con nylon im perm eable y se
expusieron en un caset t e con pant alla radiográfica int ensificadora ( FUJI FI LM) a
t em perat ura am bient e ent re 24 y 72 horas. Luego de escanear las pant allas en un
analizador de im ágenes Bio- I m aging Analyzer Fuj ifilm BAS- 1800I I , las im ágenes
result ant es se cuant ificaron con el program a I m ageQuant , Am ersham Biosciences.
An á lisis de pr ot e ín a s por W e st e r n blot
Pr e pa r a ción de l lisa do ce lu la r t ot a l. Aproxim adam ent e 2,0 x 10 6 células
cult ivadas en placas de 60 m m , se lavaron dos veces con PBS frío, se pasaron a un
eppendorf con 1 m l de PBS, se cent rifugaron a 5000 rpm durant e 5 m inut os para
precipit ar las células y se descart ó el sobrenadant e. El lisado celular t ot al fue
preparado con 60 μl de buffer RI PA cont eniendo inhibidores de prot easas frescos
( PMSF 100 μg/ m l, aprot inina 60 μg/ m l y ort ovanadat o de sodio 1 m M) . Luego de
136
MATERI ALES Y MÉTODOS
hom ogeneizar las células, se dej aron en hielo durant e 30 m inut os. Se cent rifugaron a
10.000 rpm por 10 m inut os para rem over los rest os celulares y se guardó una alícuot a
del sobrenadant e para cuant ificar prot eínas por el m ét odo de Bradford.
Buffer RI PA: Tris- HCl 50 m M pH 7,5, NaCl 150 m M, Nonidet P- 40 1% , deoxicolat o de
sodio 0.5% , SDS 0.1% .
Ele ct r ofor e sis e n ge l de polia cr ila m ida . En t odos los casos las m uest ras
fueron analizadas en un gel de poliacrilam ida en condiciones desnat uralizant es
( Laem m li, 1970) . Ut ilizam os el sist em a vert ical de Bio- Rad. El gel separador ( inferior)
se preparó al 12% ( 1,5 m l de agua dest ilada est éril, 1,6 m l de solución de acrilam ida/
bisacrilam ida al 30% , 0,8 m l de Tris 1,5 M pH 8,8, 40 μl de SDS 10% , 40 μl de
persulfat o de am onio 10% y 2,5 μl de TEMED) en algunos casos el porcent aj e de
poliacrilam ida ut ilizado fue del 15% , y el gel concent rador ( superior) se preparó al 5%
( 2,04 m l de agua dest ilada est éril, 0,51 m l de solución de acrilam ida/ bisacrilam ida al
30% , 0,37 m l de Tris 1 M pH 6,8, 30 μl de SDS 10% , 30 μl de persulfat o de am onio
10% y 3 μl de TEMED) . Las m uest ras, con el buffer de siem bra se hirvieron durant e 3
m inut os. En un pocillo se sem braron 5 μl del m arcador de peso m olecular ( Full- Range
Rainbow Molecular Weight Marker, Am ersham Life Science) . Luego se realizó la
elect roforesis, a 100 V, en buffer Tris- Glicina- SDS 1X hast a que el azul de brom ofenol
alcanzó el final del gel separador.
Tr a n sfe r e n cia
a
m e m br a n a .
Una
vez
concluida
la
separación
elect roforét ica, las prot eínas fueron t ransferidas a un soport e sólido, en est e caso un
filt ro de nit rocelulosa ( Burnet t e, 1981) . Una de las caras del gel fue apoyada sobre un
t rozo de nit rocelulosa del m ism o t am año y am bos fueron colocados ent re papeles
What m an 3MM previam ent e hum edecidos en buffer de t ransferencia 1X y est os a su
vez colocados ent re dos esponj as de poro grande y dent ro de un soport e plást ico.
Toda la const rucción fue sum ergida en el t anque elect roforét ico, con buffer de
t ransferencia 1X, con el filt ro de nit rocelulosa del lado anódico. La t ransferencia se
llevó a cabo a 200 m A, durant e 60 m inut os.
Buffer Tris- Glicina- SDS 1X: Tris base 25 m M, glicina 250 m M pH 8,3, SDS 0,1% .
Buffer de Transferencia 1X: Tris- glicina 1X, SDS 0,01% , m et anol 20% .
Buffer de Siem bra: Tris- HCl 50m M pH 6,8,
- m ercapt oet anol 100 m M, SDS 2% , azul
de brom ofenol 0,1% , glicerol 10% .
137
MATERI ALES Y MÉTODOS
D e t e cción de pr ot e ín a s. Luego de la t ransferencia, se colocó la m em brana
de nit rocelulosa en una solución de bloqueo ( leche descrem ada en polvo 5% en TBS
1X) y se dej ó en agit ación O.N. a 4 º C para reducir los sit ios pot enciales de unión de
prot eínas irrelevant es. Luego se incubó la m em brana con el ant icuerpo prim ario
diluido en TBS 1X durant e 3 horas a t em perat ura am bient e con agit ación suave. La
m em brana se lavó 3 veces con Tween 20 0,05% en TBS 1X, durant e 5 m inut os. Luego
se incubó con el ant icuerpo secundario correspondient e conj ugado con la enzim a
peroxidasa de rabanit o ( HRP) diluido en solución de bloqueo durant e 90 m inut os a
t em perat ura am bient e. La m em brana se lavó 3 veces nuevam ent e con Tween 20
0,05% en TBS 1X, durant e 5 m inut os y una vez con TBS 1X, t am bién durant e 5
m inut os. Para visualizar las prot eínas de int erés se ut ilizó el kit de det ección ECL
( Am ersham Pharm acia Biot ech) , basado en la producción de quim iolum iniscencia
com o consecuencia de la digest ión de un sust rat o de la enzim a HRP. La señal fue
det ect ada en un analizador de im ágenes Bio- I m aging Analyser Fuj ifilm LAS- 1000.
Com o cont rol de carga del gel se ut ilizó la t écnica de t inción de un gel de prot eínas
corrido en paralelo con el colorant e Coom assie Blue.
Ant icuerpos prim arios:
- Ant icuerpo ant i- p19I NK4d hum ana de rat ón, P1000- 38, USBiological.
- Ant icuerpo ant i- V5, m onoclonal de rat ón. R960- 25, I nvit rogen.
- Ant icuerpo ant i- PKAc hum ana, policlonal de conej o. C- 20, Sant a Cruz Biot echnology.
- Ant icuerpo ant i- GAPDH, m onoclonal de rat ón. AB8245 clon 6c5, ABCAM.
- Ant icuerpo ant i- hist ona H3, policlonal de conej o. C- 16 sc- 8654–R, Sant a Cruz
Biot echnology.
Ant icuerpos secundarios:
- Goat ant i- m ouse conj ugado con HRP, sc- 2005 ( Sant a Cruz) .
- Goat ant i- rabbit conj ugado con HRP, sc- 2004 ( Sant a Cruz) .
Age n t e s ge n ot óx icos
I r r a dia ción
u lt r a viole t a .
Células
en
crecim ient o
exponencial
fueron
t ripsinizadas y sem bradas a 60% de confluencia. Veint icuat ro horas m ás t arde, se
rem ovió el m edio y las células fueron irradiadas en placas abiert as a diferent es
energías de luz UVC, de 254 nm ( rango 240- 280) según lo indicado, con una lám para
Philips TUV15WG15T8
calibrada
para
ot orgar
0,25
m J/ cm 2.seg.
Luego
de
la
138
MATERI ALES Y MÉTODOS
exposición, el m edio fue readicionado y las células incubadas en est ufa a 37 °C con
5% CO2 durant e los t iem pos indicados en cada caso.
Cis- pla t in o y pé pt ido β- a m iloide . Células en crecim ient o exponencial fueron
t ripsinizadas y sem bradas a 60% de confluencia en m edio com plet o con 10% SFB.
Veint icuat ro horas m ás t arde el m edio fue reem plazado por m edio fresco cont eniendo
cisplat ino 20 μM ó pépt ido
- am iloide 20 μM y las células fueron incubadas en est ufa a
37 °C con 5% CO 2 durant e los t iem pos indicados en cada caso ant es de realizar las
dist int as det erm inaciones. Células cont rol fueron t rat adas idént icam ent e sin agregar al
m edio fresco los dañadores.
I n h ibidor e s de qu in a sa s
La incubación de las células con los diferent es inhibidores fue iniciada una hora
ant es de la aplicación del daño. Los inhibidores ut ilizados fueron los siguient es:
inhibidor de PKA: H- 89 ( 1 µM final) e inhibidor de CDKs: roscovit ina ( 10 µM final) . Las
células fueron t rat adas o no con los dist int os agent es genot óxicos com o se indicó
ant eriorm ent e, pero en est e caso el m edio que cont enía a los inhibidores no fue
reem plazado. Post eriorm ent e las células fueron incubadas en est ufa a 37 º C con 5%
CO2 durant e los t iem pos indicados en cada ensayo.
Pr e pa r a ción de plá sm idos
Obt e n ción
de
ba ct e r ia s com pe t e nt e s.
Las bact erias com pet ent es se
prepararon según una variant e del m ét odo de Cohen ( Cohen et al., 1972) , descript a
por Sam brook y Russell ( Sam brook et al., 2001) . Brevem ent e, se inocularon 2 m l de
m edio LB líquido ( ext ract o de levadura 5 g, pept ona 10 g, NaCl 5 g, agua c.s.p 1 lit ro)
con bact erias Escherichia coli, cepa DH5α e incubaron con agit ación const ant e a 37 °C,
durant e t oda la noche. Luego se diluyó el cult ivo a 50 m l con m edio LB y se incubó a
37 °C con agit ación, hast a que alcanzó la fase expo nencial de crecim ient o ( DO600 =
0,35- 0,4) . Se enfrió el cult ivo en hielo y se cent rifugó a 5.000 x g durant e 5 m inut os.
El pellet de bact erias fue resuspendido en 10 m l de CaCl 2 60 m M frío y se m ant uvo en
hielo durant e 30 m inut os. Se cent rifugó a 5.000 x g y el pellet celular se resuspendió
en una solución de CaCl 2 60 m M, glicerol 15% . Las bact erias com pet ent es se
alicuot aron y alm acenaron a - 70 °C.
139
MATERI ALES Y MÉTODOS
Tr a n sfor m a ción de ba ct e r ia s com pe t e n t e s. Una pequeña cant idad de ADN
plasm ídico ( 50- 100 ng) se incubó con 50- 100 μl de bact erias en hielo durant e 45
m inut os. A cont inuación las bact erias fueron som et idas a un shock t érm ico a 42 °C
durant e 60 segundos, seguido de un enfriam ient o rápido en baño de agua con hielo.
Luego se agregó LB hast a com plet ar un volum en de 1 m l y se incubó durant e 45
m inut os a 37 °C. Las bact erias se cent ri fugaron y se resuspendieron en 50 μl de
sobrenadant e. Se sem braron en placas de Pet ri con LB agar 1,5% con am picilina ( 100
μg/ m l) . Se incubaron 16 horas en est ufa a 37 °C.
Pr e pa r a ción de plá sm idos e n ba j a e sca la ( m in ipr e p) . Los plásm idos
fueron preparados ut ilizando el kit
de m inipreparación plasm ídica Wizard Plus
( Prom ega) . Las bact erias t ransform adas con el plásm ido a aislar fueron inoculadas en
3 m l de m edio LB con am picilina ( 100 μg/ m l) e incubadas durant e 16 horas. Una vez
obt enido el pellet bact eriano, se prosiguió con la ext racción plasm ídica según las
inst rucciones del fabricant e.
Pr e pa r a ción de plá sm idos e n gr a n e sca la ( m a x ipr e p) . Los plásm idos fueron
preparados ut ilizando el kit de m axipreparación plasm ídica Wizard Plus ( Prom ega) . Las
bact erias t ransform adas con el plásm ido a aislar fueron inoculadas en 500 m l de
m edio LB con am picilina ( 100 μg/ m l) e incubadas durant e 16 horas. Una vez obt enido
el pellet bact eriano, se prosiguió con la ext racción plasm ídica según las inst rucciones
del fabricant e.
An á lisis de la s pr e pa r a cion e s pla sm ídica s.
Con el obj et o de det erm inar la concent ración y calidad de las preparaciones las
m ism as fueron som et idas a elect roforesis en gel de agarosa 0,8- 1% en buffer TAE
cont eniendo 0,5 μg/ m l de brom uro de et idio. Las m uest ras fueron sem bradas con
buffer de siem bra 6X ( azul de brom ofenol 0,25% , glicerol 30% ) , som et idas a
elect roforesis a volt aj e const ant e ( 5 V/ cm ) y visualizadas por t ransilum inación con luz
UV.
Paralelam ent e,
las
preparaciones
plasm ídicas
fueron
cuant ificadas
espect rofot om ét ricam ent e:
DO260 = 1 equivale 50 μg/ m l de ADN.
DO260/ 280 > 1,5 indica pureza acept able ( Sam brook et al., 1989) .
Buffer TAE: Tris- acét ico 0,4 M, EDTA 1 m M.
140
MATERI ALES Y MÉTODOS
Su bclon a dos y M u t a gé n e sis D ir igida
Su bclon a do de l cAD N de p1 9 I N K4 d
La secuencia codificant e com plet a de p19 hum ana fue am plificada por PCR a part ir
del ADNc copia previam ent e clonado desde una bibliot eca de cADN de cerebro
hum ana. Est e fragm ent o fue clonado en el vect or de expresión pcAD N 4 / V5 - H is C
( I nvit rogen) ut ilizando los siguient es oligonucléot idos ( prim ers) diseñados con sit ios
de cort e para las enzim as Bam HI y EcoRI respect ivam ent e:
prim er forward: 5´ CGGGATCCCGATGCTGCTGGAGGAGGTTCGC 3´
prim er reverse: 5´ GGAATTCCTCCCAGCGGGGCCACCATGTG 3´
Con st r u cción de m u t a n t e s p1 9 S6 6 A, P1 9 S7 6 A, p1 9 T1 4 1 A, p1 9 S7 6 E
En la generación de las m ut ant es de p19 que se describen a cont inuación se
ut ilizó la est rat egia ¨ Mism at ched Prim er Mut agénesis¨ , la cual pert enece a las
est rat egias basadas en PCR de m ut agénesis dirigida in vit ro. ( Higuchi R ( 1990)
Recom binant PCR. I n: PCR Prot ocols. A Guide t o Met hods and Applicat ions ( MA I nnis,
DH Gelfand, JJ Sninsky, TJ Whit e, eds) , pp. 177–183. Academ ic Press, San Diego,
CA.) .
Brevem ent e,
com plem ent ario
al
est a
sit io
est rat egia
t arget
pero
ut iliza
de
un
unión
prim er
que
específica.
es
Dos
parcialm ent e
reacciones
de
141
MATERI ALES Y MÉTODOS
m ut agénesis son diseñadas en las cuales los dos product os de PCR generados
present an una pequeña región cont eniendo la m ut ación que se solapa. Est os dos
product os son com binados en una t ercera reacción de PCR para generar el product o
com plet o con la m ut ación en una localización m ás cent ral ( Figura) .
Prim ers ut ilizados en los clonados de las m ut ant es p19S66A, p19S76A y p19T141A:
p1 9 S6 6 A, r e e m pla zo de se r in a 6 6 ( AGC) por a la n ina ( GCC) :
prim er reverse ( 1) : 5´ GTCCTGGACATTGGG GGC GGCACCTTGCTCAG 3´
prim er forward ( 2) : 5´ CTGAAGCAAGGTGCC GCC CCCAATGTCCAGGAC 3´
p1 9 S7 6 A, r e e m pla zo de se r in a 7 6 ( AGT) por a la n ina ( GCT) :
Prim er reverse ( 1) : 5´ CTGCGTCATGGACTGG AGC GGTACCCGGAGG 3´
prim er forward ( 2) : 5´ GACACCTCCGGTACC GCT CCAGTCCATGACGCAG 3´
p1 9 T8 9 A, r e e m pla zo de t r e on ina 8 9 ( ACC) por a la n ina ( GCC) :
Prim er reverse ( 1) :
5´ CACTAGGACCTTCAG GGC GTCCAGGAATCCAGT 3´
prim er forward ( 2) : 5´ ACTGGATTCCTGGAC GCC CTGAAGGTCCTAGTG 3´
p1 9 S7 6 E, r e e m pla zo de se r in a 7 6 ( AGT) por á cido glu t á m ico ( GAA) :
142
MATERI ALES Y MÉTODOS
Prim er reverse ( 1) : 5´ CTGCGTCATGGACTGG TTC GGTACCGGAGGTGTC 3´
prim er forward ( 2) : 5´ GACACCTCCGGTACC GAA CCAGTCCATGACGCAG 3´
En t odos los casos los prim ers cont eniendo los sit ios de rest ricción fueron los
siguient es:
prim er forward ( Bam HI ) : 5´ CGGGATCCCGATGCTGCTGGAGGAGGTTCGC 3´
prim er reverse ( EcoRI ) :
Con st r u cción
de
5´ GGAATTCCTCCCAGCGGGGCCACCATGTG 3´
m utantes
p1 9 AN Kle ss,
p1 9 S1 3 A,
p1 9 T1 4 1 A,
p1 9 S7 6 T1 4 1 A, p1 9 S7 6 T1 4 1 E
Las siguient es m ut ant es se subclonaron en el vect or pcAD N 4 / V5 - H is C en los sit ios
de rest ricción Bam HI – EcoRI ut ilizando los siguient es prim ers:
p1 9 AN Kle ss, de le ción de l ú lt im o dom in io a n k ir ina , a m inoá cidos 1 3 8 - 1 6 6
prim er forward ( Bam HI ) : 5´ CGGGATCCCGATGCTGCTGGAGGAGGTTCGC 3´
prim er reverse ( EcoRI ) :
5´ GGAATTCCCCTGGCGTCCCTGCGATGGAGA 3´
p1 9 S1 3 A, r e e m pla zo de se r in a 1 3 ( AGT) por a la n ina ( GCC)
prim er forward ( BAMHI ) : 5´ CGGGATCCCGATGCTGCTGGAGGAGGTTCGCG
CCGGCGACCCGGCTG GCC GGGGCG 3´
prim er reverse ( EcoRI ) : 5´ GGAATTCCTCCCAGCGGGGCCACCATGTG 3´
p1 9 T1 4 1 A, r e e m pla zo de t r e onina 1 4 1 ( ACA) por a la n ina ( GCC)
prim er forward ( Bam HI ) : 5´ CGGGATCCCGATGCTGCTGGAGGAGGTTCGC 3´
prim er reverse ( EcoRI ) :
5´ GGAATTCCTCCCAGCGGGGCCACCATGTGGCCC
TGCAGGATGTCCACGAGGTCCTGAGCCCCTCTCT
GCA GTGCCAGCTCCAAGGG GGC GAGACC 3´
143
MATERI ALES Y MÉTODOS
p1 9 S7 6 T1 4 1 A, r e e m pla zo de se r in a 7 6 ( AGT) y t r e on ina 1 4 1 ( ACA) por
a la n ina ( GCT - GCC)
Com o t em plado de est a reacción de PCR se em pleó la m ut ant e p19S76A descript a
ant eriorm ent e.
prim er forward ( Bam HI ) : 5´ CGGGATCCCGATGCTGCTGGAGGAGGTTCGC 3´
prim er reverse ( EcoRI ) :
5´ GGAATTCCTCCCAGCGGGGCCACCATGTGGCCCT
GCAGGATGTCCACGAGGTCCTGAGCCCCTCTCTGCA
GTGCCAGCTCCAAGGG GGC GAGACC 3´
p1 9 S7 6 T1 4 1 E, r e e m pla zo de se r in a 7 6 ( AGT) y t r e on ina 1 4 1 ( ACA) por
á cido glu t á m ico ( GAA)
Com o t em plado de est a reacción de PCR se em pleó la m ut ant e p19S76E descript a
ant eriorm ent e.
prim er forward ( Bam HI ) : 5´ CGGGATCCCGATGCTGCTGGAGGAGGTTCGC 3´
prim er reverse ( EcoRI ) : 5´ GGAATTCCTCCCAGCGGGGCCACCATGTGGCCC
TGCAGGATGTCCACGAGGTCCTGAGCCCCTCTCTGC
AGTGCC AGCTCCAAGGGTTCGAGACC 3´
La fidelidad de t odos plásm idos generados fue analizada por secuenciación del ADN.
Tr a n sfe cción t r a n sit or ia de cé lu la s y se le cción .
Las t ransfecciones en células MA- 10 se llevaron a cabo de acuerdo con el
prot ocolo st andard de precipit ación por fosfat o de calcio ( Chen and Okayam a, 1988) .
En general, las células fueron plaqueadas en placas de 35 m m a una densidad de 5 x
10 6 células/ placa en 2,5 m l de m edio. Luego de 24 horas, cada pocillo fue t ransfect ado
con una m ezcla cont eniendo 4 μg de pCMVCAT y 6,5 μg de pCMVβgal j unt o con los
plásm idos indicados en cada experim ent o. Por cada pocillo a t ransfect ar se preparó un
t ubo cont eniendo 150 μl de HeBS 2X y 3 μl de Buffer Fosfat o. Por ot ro lado, se
prepararon las dist int as soluciones de plásm idos en 20 μl de CaCl 2 2 M y H2 O c.s.p.
147 μl. Cuando se indica, 4 μg de vect or de expresión para CDK4wt o CDK4R24C
fueron em pleados. La cant idad final de ADN fue aj ust ada en t odos los casos a 20 μg
por pocillo, la que fue com plet ada con cant idad necesaria de ADN “ carrier” ( ADN
genóm ico de esperm a de salm ón) . Las dist int as preparaciones plasm ídicas se
144
MATERI ALES Y MÉTODOS
agregaron lent am ent e a la solución de fosfat o de sodio, m ient ras ést a se agit aba en
form a cont inua con vórt ex. Se dej ó reposar 20 m inut os a t em perat ura am bient e para
perm it ir la form ación del precipit ado y se agregaron a cada pocillo 250 μl de la
correspondient e preparación de ADN. Se dej ó recuperar a las células en m edio
com plet o aproxim adam ent e por 20 horas. Al cabo de est e período, las células fueron
lavadas con PBS y cult ivadas con 2,5 m l de m edio com plet o por los t iem pos indicados.
Luego se realizaron las dist int as det erm inaciones.
Las
células
WI - 38
y
BHK- 21
fueron
t ransfect adas
ut ilizando
el
react ivo
Lipofect am ine 2000 reagent ( I nvit rogen) siguiendo las indicaciones del fabricant e. En
general, 1 x 10 6 células sem bradas en pocillos de 35 m m fueron con 2,5 μg de
plásm ido t ot al. En los ensayos de UDS, ciclo celular y caspasa- 3, 2 μg de pcADN4cp19
o de las m ut ant es de p19 fueron t ransfect ados j unt o con 0,5 μg de plásm ido pBABE
que confiere resist encia al ant ibiót ico purom icina. Veint icuat ro horas luego de la
t ransfección se agregó al m edio el ant ibiót ico purom icina ( Sigm a) 2,5 μg/ m l y luego
de 60 horas de selección, las células resist ent es ( t ransfect adas) fueron ut ilizadas en
los dist int os ensayos.
En los ensayos de fosforilación in vivo, las células fueron plaqueadas a 60% de
confluencia en placas de 60 m m . Luego de 24 horas, las células fueron t ransfect adas
con 5 μg de plásm ido t ot al y, 24 horas m ás t arde, fueron ut ilizadas en los diferent es
ensayos.
En los ensayos de fosforilación in vivo, en dónde se realizó fraccionam ient o
subcelular, las células fueron plaqueadas en caj as de 100 m m , t ransfect adas con 14
μg de plásm ido t ot al y, 24 horas m ás t arde, fueron ut ilizadas en los diferent es
ensayos.
HeBS 2X: Hepes 1% pH 7, NaCl 1,6% .
Buffer Fosfat o: NaHPO4 0,06 M, NaH2 PO4 0,07 M.
Act ivida d de la e n zim a ca spa sa - 3
Para det erm inar el nivel de apopt osis en las células luego del t rat am ient o con
daño se m idió la act ividad de la enzim a caspasa- 3. El ensayo fue realizado com o fue
descript o previam ent e, con algunas m odificaciones ( Chen et al., 2005) . Las células
fueron cult ivadas en pocillos de 35 m m a razón de 1 x 10 6 células/ pocillo y fueron
t rat adas con dist int os agent es genot óxicos por 24 h. Luego, fueron cosechadas y
lavadas 1 vez con PBS y resuspendidas en 325 μl de buffer de lisis en los t iem pos
indicados, incubadas 30 m inut os a 37 º C y cent rifugadas a 12.000 rpm por 20
m inut os. La act ividad de caspasa- 3 fue det erm inada con 150 μl del lisado celular
145
MATERI ALES Y MÉTODOS
ut ilizando 100 μM del sust rat o sint ét ico Ac- DEVD- pNA ( Sigm a) en buffer de reacción
en un volum en final de 300 μl incubando la m ezcla a 37 º C por 4 horas. La aparición
de color am arillo, indicat ivo de la act ividad de caspasa- 3 fue cuant ificada en
espect rofot óm et ro a 405 nm . La act ividad de caspasa- 3 fue est im ada com o A405nm / μg
prot eína x hora.
Buffer de Lisis: 50 m M Tris- HCl, pH 7,4, 1 m M EDTA, 10 m M EGTA, 10 μM
digit onina, 500 μM PMSF, 10 μg/ m l bisbenzam ida, 10 μg/ m l
pepst at ina, y 10 μg/ m l aprot inina.
Buffer de Reacción: 100 m M HEPES pH 7,5, 0.5 m M EDTA, 5 m M dit iot reit ol y 20%
v/ v glicerol.
Ge n e r a ción de lín e a s ce lu la r e s e st a ble s pa r a p1 9 I N K4 d
Las t ransfecciones se llevaron a cabo con el react ivo Lipofect am ine 2000
reagent ( I nvit rogen) siguiendo las indicaciones del fabricant e y com o est á descript o en
el punt o 12. Células de Leydig MA- 10, plaqueadas en pocillos de 35 m m para llegar a
90% de confluencia en el m om ent o de la t ransfección, fueron t ransfect adas con 3 μg
de plásm ido de expresión pMTCB ( vacío) , ó pMTCBp19 ó pMTCBp19AS que expresan
la prot eína p19I NK4d salvaj e y la secuencia ant isent ido respect ivam ent e, río abaj o del
prom ot or del gen de la m et alot ioneína, inducible con Zn 2+ . Adem ás, el vect or pMTCB
confiere a las células resist encia al ant ibiót ico genet icina ( G418) . Cuarent a y ocho
horas luego de la t ransfección, las células fueron t ripsinizadas, diluidas y sem bradas
en placas de 60 m m con m edio fresco cont eniendo 300 μg/ m l de genet icina ( Sigm a) .
La presión de selección se m ant uvo durant e 2 sem anas cam biando el m edio cada 4
días. Los clones de células resist ent es fueron aislados y crecidos hast a t ener una
cant idad de células suficient e para analizar la expresión ( increm ent o o inhibición,
según el caso) del gen de p19 m ediant e Nort hern blot , en ausencia o en presencia de
Zn 2+ .
Sín t e sis de AD N n o pr ogr a m a da ( UD S, Un sch e du le d AD N Syn t h e sis) .
Las células, t ransfect adas en pocillos de 35 m m con los vect ores indicados,
fueron lavadas dos veces con PBS y el m edio fue reem plazado por m edio con 1%
suero y libre de arginina ( m edio UDS) . Luego de 24 horas el m edio fue reem plazado
por m edio UDS fresco por ot ras 36 h. Baj o est as condiciones, det erm inam os que la
sínt esis de ADN sem iconservat iva es inhibida com plet am ent e. Las células fueron
146
MATERI ALES Y MÉTODOS
lavadas con PBS, dañadas o no e incubadas nuevam ent e con m edio UDS fresco y 10
μCi/ m l
3
H- t im idina. En los t iem pos indicados, se det erm inó la incorporación de
3
H-
t im idina. Las células fueron lavadas 3 veces con PBS frío, cosechadas y cent rifugadas
a 3000 rpm por 5 m inut os. Luego fueron lisadas con 500 μl de 5% TCA por 30
m inut os y cent rifugadas a 10.000 rpm por 10 m inut os. El pellet fue lavado dos veces
con agua fría y resuspendido en 50 μl de 1 M NaOH. La radioact ividad incorporada fue
cuant ificada en un cont ador de cent elleo. La reparación del ADN fue est im ada com o
dpm / μg de prot eína.
En sa yo de r e a ct iva ción e n la cé lu la h u é spe d ( H CR: h ost ce ll
r e a ct iva t ion a ssa y)
La capacidad de una célula para reparar el ADN dañado puede ser evaluada a
t ravés del m ét odo denom inado Host Cell React ivat ion. Est a t écnica consist e en
t ransfect ar en una célula un plásm ido que cont iene el ADNc de un gen report ero baj o
la regulación de un prom ot or fuert e, y que ha sido dañado con luz UV o con agent es
quím icos. La capacidad de la célula para reparar est e ADN plasm ídico se cuant ifica
m ediant e la expresión del gen report ero. De est e m odo, est e ensayo perm it e m edir la
react ivación de la expresión del plásm ido y relacionarla direct am ent e con la capacidad
de reparación de la célula huésped del ADN dañado. En nuest ro t rabaj o se ut ilizó el
plásm ido pCMVCAT que cont iene el prom ot or fuert e del cit om egalovirus y el gen de la
enzim a cloram fenicol- acet ilt ransferasa ( CAT) com o report ero. pCMVβgal fue ut ilizado
com o plásm ido de referencia co- t ransfect ado con pCMVCAT.
I r r a dia ción de plá sm ido. A efect os de evaluar la capacidad de reparación de las
células de Leydig MA- 10 en condiciones basales, se realizó un experim ent o de
t ransfección de plásm idos irradiados con UV, en un rango de energía ent re 0 y 640
m J/ cm 2. Se colocó el plásm ido a irradiar en placas de Pet ri de 6 cm sobre hielo, a una
concent ración de 100 μg/ m l.
Tr a n sfe cción de cé lu la s. El prot ocolo de t ransfeccción ut ilizado el m ét odo de
precipit ación con fosfat o de calcio ( Chen and Okayam a, 1988) descript o previam ent e
en t écnicas de t ransfección.
Pr e pa r a ción de e x t r a ct os ce lu la r e s. Las células fueron lavadas 3 veces con 2 m l
de PBS frío. Se agregó luego 1 m l de TEN frío para favorecer el despegado de las
células. La m onocapa celular fue levant ada m ediant e el em pleo de un “ rast rillo de
células” y cosechada en t ubos eppendorf. Las células fueron cent rifugadas a 1.000 x g
durant e 15 m inut os a 4 °C. El sobrenadant e fue elim inado por aspiración y el pellet
147
MATERI ALES Y MÉTODOS
celular resuspendido en 200 μl de buffer Tris 250 m M pH 7,5 cont eniendo glicerol
15% . Las células fueron lisadas som et iéndolas a 3 ciclos consecut ivos, de 5 m inut os
cada uno, de congelam ient o y descongelam ient o en baño de et anol/ hielo seco y baño
de agua a 37 °C respect ivam ent e, agit ando vigorosam ent e cada vez. Finalm ent e, los
t ubos se cent rifugaron a 1.000 x g 10 m inut os a 4 °C para elim inar los rest os
celulares. El sobrenadant e prot eico se dividió en dos alícuot as para la post erior
det erm inación de las act ividades de β- galact osidasa y cloram fenicol acet ilt ransferasa.
TEN: Tris 20 m M, NaCl 100 m M y EDTA 1 m M.
D e t e r m in a ción de la a ct ivida d β- ga la ct osida sa . La act ividad de la enzim a βgalact osidasa se det erm inó m ediant e un ensayo colorim ét rico cuant ificando el sust rat o
crom ogénico liberado por hidrólisis enzim át ica. La reacción se llevó a cabo en una
m ezcla cont eniendo 50- 65 μl del ext ract o, 1 m l de buffer PM2, 0,25 m l de una
solución del sust rat o ort onit rofenil- β- galact opiranósido ( ONPG) 4 m g/ m l en PM2 y 0,7
μl de β- m ercapt oet anol que se incubó a 37 °C hast a la aparición de color am arillo,
aproxim adam ent e luego de 3- 4 horas. Se regist ró el t iem po de reacción y se m idió la
absorbancia a 420 nm . La act ividad específica de la enzim a β- galact osidasa fue
calculada según:
( A420nm m uest ra – A420nm cont rol) / ul ext ract o x hora.
Buffer PM2: Na 2 HPO4 60 m M, NaH2 PO4 40 m M, KCl 10 m M y MgSO4 1 m M.
D e t e r m in a ción
de
la
a ct ivida d
de
clor a m fe n icol
a ce t ilt r a n sfe r a sa
( CAT) . La act ividad de la enzim a CAT fue det erm inada según el m ét odo descript o por
Seed y Sheen ( Seed and Sheen, 1988) . El ext ract o celular fue previam ent e calent ado
a 65 °C durant e 5 m inut os, con el propósit o de inact ivar las acet ilasas endógenas. Se
enfrió inm ediat am ent e en hielo y se cent rifugó 15 m inut os a 1.500 x g a 4 °C para
elim inar las prot eínas desnat uralizadas. El ensayo fue realizado con 50 μl de
sobrenadant e en una m ezcla de reacción, descript a m as adelant e, e incubando a 37
°C ent re 90- 120 m inut os. A co nt inuación se agregaron 200 μl de xileno y luego de
agit ar vigorosam ent e, los incubados fueron cent rifugados a 10.000 x g durant e 15
m inut os. Se separó la fase orgánica, la que fue som et ida a una ext racción reversa
m ediant e el agregado de 200 μl de H2O. Luego de agit ar y cent rifugar baj o las
m ism as condiciones, la fase orgánica result ant e, cont eniendo los derivados but irilados
de 3H- cloram fenicol, fue colocada en viales con líquido cent elleant e a base de t olueno
( PPO 0,4% , dim et il POPOP 0,05% en t olueno) y se cuant ificó la radioact ividad en un
cont ador de cent elleo líquido. La act ividad específica de CAT se det erm inó com o ( dpm
pCMV- CAT –
dpm
cont rol
pBLCAT6) / ul
x
m inut o) .
Las unidades CAT fueron
148
MATERI ALES Y MÉTODOS
norm alizadas cont ra las unidades β- galact osidasa, para aj ust ar los result ados de
acuerdo con la eficiencia de t ransfección en cada caso.
Buffer de reacción: cont eniendo Tris 100 m M pH 8, but iril- CoA 0,25 m g/ m l y 200 nCi
de 3 H- cloram fenicol ( 60 Ci/ m m ol, 0,01 m Ci/ m l) .
I n cor por a ción de 3 H - t im idin a .
Las células se sem braron en pocillos de 35 m m a razón de 2 x 10 5 células
pocillo
con
m edio
com plet o,
suplem ent ado
con
10%
de
suero
fet al
bovino.
I nm ediat am ent e luego del t rat am ient o correspondient e, las células fueron incubadas
con 1 μCi/ m l 3 H- t im idina ( 81 Ci/ m m ol; Am ersham Biosciences) durant e 6 horas a 37
°C, lavadas 3 veces con PBS frío, cose chadas y cent rifugadas a 3000 rpm por 5
m inut os. Luego fueron lisadas con 500 μl de 5% TCA por 30 m inut os y cent rifugadas a
10.000 rpm por 10 m inut os. El pellet fue lavado dos veces con agua fría y
resuspendido en 50 μl de 1 M NaOH durant e 1 hora. La radioact ividad incorporada fue
cuant ificada en un cont ador de cent elleo. La proliferación celular fue est im ada com o
dpm / μg de prot eína.
En sa yo de M TT: e st im a ción de via bilida d ce lu la r
La viabilidad celular fue est im ada con el ensayo de brom uro de 3- [ 4,5
dim et ilt iazol- 2- yl] - 2,5- difenilt et razolio ( MTT) . Los clones de células de Leydig MA- 10
est ables para p19 sent ido o p19 ant isent ido se sem braron en pocillos de 35 m m a
razón de 2 x 10 5 células/ pocillo con m edio com plet o, suplem ent ado con 10% de suero
fet al bovino y se incubaron 24 horas. Las células fueron t rat adas con las dosis
indicadas de luz UV y la supervivencia celular fue evaluada en los diferent es t iem pos
reem plazando el m edio de cult ivo con 1 m l de m edio fresco cont eniendo MTT ( Sigm a)
1 m g/ m l, e incubando las células ot ras 4- 6 horas. El m edio y el MTT fueron rem ovidos
y se agregaron 500 μl de isopropanol para disolver el precipit ado de MTT reducido. Las
placas fueron agit adas 15 m inut os y la absorbancia en el solvent e fue det erm inada a
570 nm . El blanco fue calculado ut ilizando m ediciones a dos longit udes de onda a 570
y 650 nm . Se incluyeron cont roles de células no t rat adas y de m edio solo. En paralelo,
se det erm inó el núm ero de células viables por cont eo en cám ara de Neubauer con el
colorant e azul de t ripán descript o previam ent e.
En sa yo clon ogé n ico.
149
MATERI ALES Y MÉTODOS
Luego de irradiar con UV células MA- 10 est ables para p19 sent ido o p19
ant isent ido se det erm inó la supervivencia celular m ediant e un ensayo clonogénico. Las
células fueron sem bradas diluidas de m odo de que queden aisladas ( aprox. 1000
células / placa de 10 cm ) y fueron irradiadas con 8 m J/ cm 2 de UV luego de inducir el
prom ot or de MT durant e 6 horas con 75 μM ZnCl 2 . Veint icuat ro horas m ás t arde el
m edio fue reem plazado por m edio fresco libre de ZnCl 2 . Las células fueron incubadas
7 días y luego fij adas con form aldehído al 10% y t inción con el colorant e crist al violet a
( 5 m g/ m l en et anol) y cuant ificación de los clones supervivient es. Las colonias que
cont enían m ás de 50 células fueron consideradas com o derivadas de células
clonogénicam ent e act ivas.
En sa yo de l com e t a
Las líneas MA- 10 generadas ( MA- 10p19S, MA- 10p19AS, MA- 10p19em pt y) fueron
sem bradas en placas de 35 m m ( 3 x 10 5 células/ placa) . Las células fueron irradiadas
con 8 m J/ cm 2 , en la ausencia de m edio de cult ivo. I nm ediat am ent e luego de la
exposición, el m edio de cult ivo fue agregado nuevam ent e y las células fueron
incubadas en oscuridad a 37 °C por diferent es t iem pos.
Aproxim adam ent e 10 5 células fueron suspendidas en 140 μl de agarosa de baj o
punt o de fusión pre- calent ada ( 0,5% ) , preparada en PBS libre de calcio y m agnesio.
Sesent a y cinco μl de la suspensión fue rápidam ent e dispersada en port aobj et os
enfriados a - 20 °C precubiert os con 80 μl de agarosa de alt o punt o de fusión ( 0,8% ) y
cubiert as con cubreobj et os. La gelificación procedió por 10 m inut os a 0 °C. Los
cubreobj et os fueron rem ovidos suavem ent e y los port aobj et os sum ergidos en la
solución de lisis por una hora a t em perat ura am bient e. Los port aobj et os fueron
rem ovidos de la solución de lisis e incubados en buffer de elect roforesis nuevo por 40
m inut os a t em perat ura am bient e para perm it ir el desenrollado del ADN. Luego de la
elect roforesis, los port aobj et os fueron lavados dos veces con buffer de neut ralización.
Los m inigeles sobre los port aobj et os fueron dej ados secar a t em perat ura am bient e.
Luego fueron t eñidos con 50 μl de una solución de brom uro de et idio ( 20 μg/ m l) y
observados a t ravés de m icroscopía de fluorescencia ( m icroscopio Nikon t ype 120) .
Los com et as fueron analizados y el m om ent o de la cola de olive ( olive t ail m om ent o)
calculado usando el soft ware CASP.
Solución de lisis: 2,5 m M NaCl, 10 m M Tris- HCl pH 10, 10 m M EDTA, 10% Me2 SO
Trit on X- 100 am bos agregados al m om ent o de ut ilizar.
Buffer de elect roforesis: 300 m M NaOH; 1 m M EDTA pH >13.
150
MATERI ALES Y MÉTODOS
Solución de neut ralización: 400 m M Tris- ClH pH 7,5.
An á lisis de a be r r a cion e s cr om osóm ica s
Las líneas MA- 10 generadas ( MA- 10p19S, MA- 10p19AS, MA- 10p19em pt y) fueron
sem bradas en placas de 35 m m ( 3 x 10 5 células/ placa) . Las células fueron irradiadas
con 8 m J/ cm 2 , en la ausencia de m edio de cult ivo. I nm ediat am ent e luego de la
exposición, el m edio de cult ivo fue agregado nuevam ent e y las células fueron
incubadas en est ufa a 37 °C por 48 horas.
Para la evaluación de aberraciones crom osóm icas est ruct urales, el arrest o
m it ót ico fue iniciado 2 horas ant es de cosechar las células por adición de colchicina
( 0.2 μg/ m l) y las células fueron t ripsinizadas. Luego de la cent rifugación, fueron
resuspendidas en solución hipot ónica calent ada previam ent e ( 75 m M de KCl) por 30
m inut os y la fij ación fue llevada a cabo en m et anol/ ácido acét ico ( 3: 1) .
Los port aobj et os fueron t eñidos con Giem sa 10% por 4 m inut os. Para cada
t rat am ient o 300 m et afases fueron exam inadas para la presencia de diferent es t ipos de
aberraciones est ruct urales. I nt ercam bio de crom át idas, crom osom as dicént ricos y
crom osom as en form a de anillos fueron evaluados com o dos rot uras. Met afases
cont eniendo m ás de 5 aberraciones fueron consideradas com o células con m últ iplas
aberraciones.
En sa yo de fosfor ila ción
M a r ca ción m e t a bólica con
32
P. Las células, cult ivadas en placas de 60 m m y
t rat adas o no con los diferent es agent es genot óxicos y/ o inhibidores de quinasas,
fueron incubadas durant e t res horas ant es de la preparación de los ext ract os
celulares, con 0,5 m Ci de
32
P- ort ofosfat o de sodio. A diferent es t iem pos, según lo
indicado en los ensayos, las células fueron lavadas dos veces con 5 m l de PBS frío y
recolect adas en 1 m l de PBS frío. Las m uest ras celulares fueron cent rifugadas a 1500
x g, los lisados preparados por el agregado de 60 μl de buffer RI PA en el pellet celular
y conservadas en hielo por 20 m inut os. Los lisados fueron cent rifugados por 10
m inut os a 10.000 x g. Los sobrenadant es fueron t ransvasados a t ubos lim pios y las
prot eínas cuant ificadas m ediant e la t écnica de Bradford.
I n m u nopr e cipit a ción de p1 9 . A 100 μg de prot eínas del lisado se las som et ió
a inm unoprecipit ación con 1 μg de un ant icuerpo, ant i- p19 o ant i- V5 según se indique,
incubando la m ezcla durant e 2 horas a 4 º C con rot ación. Luego se agregaron 20 μl de
151
MATERI ALES Y MÉTODOS
una solución de bolit as de agarosa acopladas a prot eína A/ G ( Sant a Cruz sc- 2003)
incubándose durant e t oda la noche a 4 º C con rot ación. Los com plej os inm unes se
recuperaron por cent rifugación a 1.000 rpm por 5 m inut os a 4 º C y se descart ó el
sobrenadant e. El precipit ado se lavó 3 veces con PBS y luego se resuspendió en 20 µl
de PBS y en 20 µl de buffer de siem bra 1X ( Tris- HCl 50 m M pH 6,8,
- m ercapt oet anol
100 m M, SDS 2% , azul de brom ofenol 0,1% , glicerol 10% ) .
Ele ct r ofor e sis e n ge l de polia cr ila m ida . En t odos los casos las m uest ras
fueron analizadas en un gel de poliacrilam ida en condiciones desnat uralizant es
( Laem m li, 1970) . Se ut ilizó la cuba vert ical de Life Technologies ( GI BCO BRL Vert ical
Gel Elect rophoresis Apparat us, Model V15.17) . El gel separador ( inferior) se preparó al
12%
( 13,2
ml
de
agua
dest ilada
est éril,
15,9
ml
de
solución
de
acrilam ida/ bisacrilam ida al 30% , 10 m l de Tris 1,5 M pH 8,8, 0,4 m l de SDS 10% , 0,4
m l de persulfat o de am onio 10% y 16 μl de TEMED) , y el gel concent rador ( superior)
se preparó al 5%
( 6,8 m l de agua dest ilada est éril, 1,7 m l de solución de
acrilam ida/ bisacrilam ida al 30% , 1,25 m l de Tris 1 M pH 6,8, 0,1 m l de SDS 10% , 0,1
m l de persulfat o de am onio 10% y 10 μl de TEMED) . Las m uest ras, con el buffer de
siem bra, se hirvieron durant e 5 m inut os ant es de sem brarlas en el gel. En uno de los
pocillos se sem braron 5 μl del m arcador de peso m olecular ( Bench Mark Prest ainded
Prot ein Ladder, I nvit rogen) . Luego se realizó la elect roforesis, a 120 V, en buffer TrisGlicina- SDS 1X ( Tris base 25m M, glicina 250 m M pH 8,3, SDS 0,1% ) hast a que el azul
de brom ofenol alcanzó el final del gel separador, aproxim adam ent e 4 horas.
Se ca do de l ge l y e x posición . Una vez concluida la separación elect roforét ica, el
gel fue colocado sobre un papel What m an 3MM y secado al vacío y calor en un secador
de geles ( Slab Gel Dryer Model SE 1160, Pharm acia Biot ech) . Luego, el papel
What m an fue envuelt o con nylon im perm eable y expuest o en un caset t e con pant alla
radiográfica int ensificadora ( FUJI FI LM) a t em perat ura am bient e ent re 24 y 72 horas.
Las pant allas fueron escaneadas en un analizador de im ágenes Bio- I m aging Analyzer
Fuj ifilm BAS- 1800I I , y la radioact ividad result ant e se cuant ificó ut ilizando el program a
I m ageQuant , Am ersham Biosciences.
En sa yos de fosfor ila ción in vivo con Fr a ccion a m in e t o Su bce lu la r
Células WI - 38 ó BHK- 21 fueron sem bradas en placas de 100 m m . En el caso de
t ransfecciones en células BHK- 21 est as fueron realizadas al alcanzar un 90% de
confluencia ( en general 24 horas luego de la siem bra) . Las t ransfecciones fueron
realizadas con Lipofect am ina 2000 reagent siguiendo el prot ocolo indicado por el
fabricant e ut ilizando 14 μg de vect or t ot al indicado en cada caso.
152
MATERI ALES Y MÉTODOS
En el caso de las células t ransfect adas, la m arcación m et abólica con
32
P se realizó
24 horas luego de la t ransfección y com o fue indicado ant eriorm ent e. Las células WI 38
fueron
m arcadas m et abólicam ent e cuando alcanzaron
un 90%
o m ás de
confluencia. Una vez aplicados los dist int os daños, las células fueron cosechadas en
los t iem pos indicados. Las células fueron lavadas dos veces con 10 m l de PBS frío y
recolect adas en 1m l de PBS frío. Las m uest ras fueron cent rifugadas a 1.500 x g por 5
m inut os. Luego, el PBS es rem ovido y el pellet resuspendido en 400 μl de buffer A
aspirando suavem ent e con un t ip am arillo. Las células fueron m ant enidas en est e
m edio hipot ónico durant e 15 m inut os en hielo, después de los cuales 25 μl de una
solución
10%
de
Nonidet
P- 40
fueron
agregados
y
los
t ubos
vort exeados
vigorosam ent e por 10 segundos. El hom ogenat o fue cent rifugado por 30 segundos en
una m icrocent rífuga. El sobrenadant e, cont eniendo la fracción cit oplasm át ica, fue
t ransferido a un t ubo lim pio. El pellet resuspendido en 55 μl de Buffer C y los t ubos
agit ados vigorosam ent e a 4 °C por 15 m i nut os. Luego fueron cent rifugados por 5
m inut os a m áxim a velocidad y los sobrenadant es de la fracción nuclear congelados a
- 70°C. Las prot eínas fueron cu ant ificadas por el ensayo de BCA para la cuant ificación
de prot eínas.
Una cant idad de 250 μg de prot eínas provenient es de las diferent es fracciones
subcelulares fueron inm unoprecipit adas y analizadas por elect roforesis en gel según
fue descript o previam ent e.
Buffer A: 10 m M HEPES pH 7,9, 10 m M KCl, 0,1 m M EDTA, 0,1 m M EGTA, 1 m M
DTT, 0,5 m M PMSF.
Buffer C: 20 m M HEPES pH 7,9, 0,4 M NaCl, 1 m M EDTA, 1 m EGTA, 1m M DTT,
1 m M PMSF.
Fosfor ila ción in vit r o
En sa yo de fosfor ila ción de l pé pt ido de p1 9 por PKA
La fosforilación direct a de p19 por PKA fue evaluada ut ilizando un pépt ido
cont eniendo la secuencia de la t reonina 141 de p19. El ensayo fue realizado a t ravés
de la incubación del pépt ido de p19 ( p- T141, 200 μM) y la subunidad cat alít ica de PKA
( PKAc) de corazón bovino ( 5 unidades por reacción) en el buffer de reacción a 30 °C
153
MATERI ALES Y MÉTODOS
en los t iem pos indicados. Luego, los incubados fueron absorbidos en papel de
fosfocelulosa y lavados 3 veces con agit ación en 1 lit ro de H3 PO4 . Los papeles
cont eniendo las m uest ras fueron secados, sum ergidos en 1 m l de líquido cent elleant e
Hisafe cada uno y la m arca radiact iva en cada m uest ra det erm inada en un cont ador
de cent elleo. Cóm o cont rol de act ividad de la enzim a se ut ilizó un pépt ido sint ét ico,
sust rat o de PKA, denom inado Kém pt ido ( 200 μM) , el cuál es derivado del sit io de
fosforilación de la piruvat o quinasa de hígado. Com o cont rol negat ivo se ut ilizó la
m ezcla cont eniendo la enzim a sin agregado de subst rat o.
La act ividad de la enzim a est á expresada en unidades: una unidad est á definida
com o la cant idad de enzim a que cat aliza la incorporación de 1 pm ol de fosfat o a un
subst rat o prot eico por m inut o a pH 7,4 y a 30 °C. PKAc liofilizada fue reconst it uída en
50 m M de dit hiot reit ol.
Secuencia del Kém pt ido: LRRASLG
Secuencia del pépt ido de t reonina 141 ( p- T141) : RDARGLTPLELA
Buffer de reacción: 50 m M Tris- Hcl pH 7,4, 0,1 m M EGTA, 0,1 m M EDTA, 15 m M
Cl 2 Mg, 10 m M β- m ercapt oet anol, 0,1 m M[ - 32 P] ATP ( 700
dpm / pm ol) , 0,1 m M ATP.
En sa yo de fosfor ila ción de GST- p1 9 por PKA
En est e ensayo se procedió com o en el prot ocolo descript o previam ent e para el
pépt ido p- T141 con algunas m odificaciones. Las reacciones fueron llevadas a cabo en
el m ism o buffer descript o ant eriorm ent e con el agregado de inhibidores de prot easas.
En est e caso se evaluó la fosforilación de 2 μg GST- 19 ó de GST ut ilizando 5 unidades
de PKAc. Com o cont rol posit ivo de la act ividad de PKA fue ut ilizada la prot eína CREB
recom binant e expresada previam ent e en el laborat orio a part ir de bact erias E.coli cepa
BL21 ( DE3) pLysS t ransform adas con el plásm ido pET- CREB e inducidas por I PTG. La
especificidad de la fosforilación por PKA se est udió m ediant e la adición al buffer de
reacción del inhibidor de PKA, H- 89 ( 100 μM) . Com o cont rol negat ivo se evaluó la
reacción de fosforilación sin el agregado de enzim a. Las reacciones de fosforilación
fueron evaluadas por elect roforesis en gel de poliacrilam ida com o fue descript o
previam ent e.
Buffer de reacción: 50 m M Tris- Hcl pH 7,4, 0,1 m M EGTA, 0,1 m M EDTA, 15 m M
Cl 2 Mg, 10 m M 2- m ercapt oet anol, 0,1 m M[ - 32 P] ATP ( 700
154
MATERI ALES Y MÉTODOS
dpm / pm ol) , 0,1 m M ATP, PMSF 100 μg/ m l, aprot inina 60
μg/ m l y ort ovanadat o de sodio 1 m M.
En sa yo de fosfor ila ción de l pé pt ido de p1 9 por CD K2 y CD K5
La fosforilación direct a de p19 por CDK2 y CDK5 fue evaluada ut ilizando un
pépt ido cont eniendo la secuencia de la serina 76 de p19. El ensayo fue realizado a
t ravés de la incubación del pépt ido de p19 ( p- S76, 200 μM) y CDK2 ó CDK5
inm unoprecipit adas de células HEK293 ó SH- SY5Y com o se describe m ás adelant e. La
reacción de fosforilación fue llevada a cabo en buffer HB incubando p- S76 ó pépt ido de
hist ona H1 a 37 °C en los t iem pos indicados. Los sust rat os fueron preparados en
Buffer HB 2X y luego diluido por el agregado de un volum en igual de la enzim a en
buffer HB. Com o cont rol de act ividad de la enzim a se ut ilizó un pépt ido de la Hist ona
H1 ( 200 μM) . Com o cont rol negat ivo se ut ilizó la m ezcla cont eniendo la enzim a sin
agregado de subst rat o.
Luego, los incubados fueron absorbidos en papel de fosfocelulosa y lavados 3
veces con agit ación en 1 lit ro de H 3 PO4 . Los papeles cont eniendo las m uest ras fueron
secados, sum ergidos en 1 m l de líquido cent elleant e Hisafe cada uno y la m arca
radiact iva en cada m uest ra det erm inada en un cont ador de cent elleo.
Secuencia del pépt ido de hist ona H1: PKTPKKAKKL
Secuencia del pépt ido de serina 76 ( p- S76) : RGTSPVHDAART
Buffer de reacción HB: 25 m M MOPS pH 7,2, 15 m M EGTA, 15 m M Cl 2 Mg, 1 m M
de DTT, 1% de Trit ón- X100, 0,1 m M de vanadat o de
sodio, 1 m M de PMSF, 40 μg/ m l aprot inina y 20 μg/ m l
leupept ina.
Buffer de reacción HB 2X: 25 m M MOPS pH 7,2, 15 m M EGTA, 15 m M Cl 2 Mg,
1,m M de
DTT, 1% de Trit ón- X100, 0,1m M de
vanadat o de sodio, 1 m M de PMSF, 40 μg/ m l
aprot inina y 20 μg/ m l leupept ina, 200 μM ATP, 10
μCi/ μl [ - 32 P] ATP ( 6000Ci/ m m ol, 10 Ci/ μl) .
En sa yo de fosfor ila ción de GST- p1 9 por CD K2 y CD K5
155
MATERI ALES Y MÉTODOS
En est e ensayo se procedió com o en el prot ocolo descript o previam ent e para el
pépt ido p- S76 con algunas m odificaciones. Las reacciones se llevaron a cabo
em pleando los m ism os buffers descript os previam ent e. En est e caso se evaluó la
fosforilación de 8 μg GST- 19 ó de GST ut ilizando CDK2 ó CDK5 inm unoprecipit adas de
células HEK293 ó SH- SY5Y com o se describe m ás adelant e. La reacción de
fosforilación fue llevada a cabo en buffer HB incubando GST- p19 ó GST con la fuent e
de prot eína indicada a 37 °C en los t iem pos indicados. Los sust rat os fueron
preparados en Buffer HB 2X y luego diluido por el agregado de un volum en igual de la
enzim a en buffer HB. Com o cont rol de act ividad de la enzim a se ut ilizó hist ona H1 ( 1,5
μg por reacción; 382150
Hist one H1, Calf Thym us, Calbiochem ) . Com o cont rol
negat ivo se ut ilizó la m ezcla cont eniendo el sust rat o y el product o del proceso de
inm unoprecipit ado
sin
ut ilizar
ant icuerpo
( sin
enzim a
inm unoprecipit ada) .
Las
reacciones de fosforilación fueron evaluadas por elect roforesis en gel de poliacrilam ida
com o fue descript o en previam ent e.
I n m u n opr e cipit a ción de CD K2 ó CD K5
Células HEK- 293T ó SH- SY5Y fueron sem bradas en caj as de 100 m m , irradiadas
con UV ( 4 m J/ cm 2 ) y cosechadas en 1 m l de PBS. Luego de ser cent rifugadas a 1.500
x g, fueron resuspendidas en 500 μl de Buffer HB y m ant enidas en hielo por 10
m inut os. Luego, de una cent rifugación a 10.000 x g los sobrenadant es fueron
t ransvasados a un m ism o t ubo y las prot eínas cuant ificadas.
Para la inm unoprecipit ación, por cada reacción de fosforilación se ut ilizó 1 m g de
prot eínas t ot ales,
1
μg de ant icuerpo y
25 μl de bolit as A/ - G agarosa.
La
inm unoprecipit ación procedió por 3 horas a 4 º C después de las cuales, los t ubos
fueron cent rifugados, las bolit as de agarosa lavadas 3 veces con buffer HB y
resuspendidas en 15 μl de Buffer HB. A est e volum en se agregaron 15 μl del buffer de
reacción HB 2X cont eniendo los sust rat os com o fue descript o previam ent e.
Ant icuerpos: CDC2 p34( C- 19) sc- 954, Sant a Cruz. CDK2 ( M2) sc- 163, Sant a Cruz.
D ism in u ción de los n ive le s de la s qu in a sa s CD K1 y CD K2
La dism inución en los niveles de las prot eínas CDK1 y CDK2 fue llevado a cabo
m ediant e la est rat egia de oligonucleót idos ant isent ido. Se em plearon oligonucleót idos
de aproxim adam ent e 27 bases ( 46 a 73, ó 129 a 155 para CDK2 y CDK1
respect ivam ent e) . Las células fueron sem bradas un día ant es de la t ransfección. Se
156
MATERI ALES Y MÉTODOS
ut ilizó Lipofect am ina 200 reagent para int roducir los oligonucleót idos en las células. La
concent ración final ut ilizada para cada uno fue 1 μM. Doce horas luego de la
t ransfección el m edio fue reem plazado por m edio cont eniendo una concent ración de 1
μM del oligonucleót ido correspondient e. Doce horas después, las células fueron
dañadas o no con luz UV ( 4 m J/ cm 2 ) y cosechadas en los t iem pos indicados. Para el
análisis de Nort hern blot el procesam ient o de las m uest ras se realizó según lo indicado
en el prot ocolo descript o previam ent e al igual que en el caso de análisis de
fosforilación
de
p19.
En
el
caso
del
análisis
de
Nort hen
blot ,
los
m ism os
oligonucleót idos m encionados fueron ut ilizados en la det ección por est a t écnica. La
dism inución en los niveles de prot eínas CDK1 y CDK2 fue analizada por West ern blot
con los ant icuerpos señalados previam ent e.
Oligonucleót ido AS CDK1: 5´ TAT TTT GGT ATT ATC TTC CAT AGT TAG 3´
Oligonucleót ido AS CDK2: 5´ CCA ACT TGA AAC AAT CTT GCC GCC TCC C 3´
I n t e r a cción de p1 9 y PKA in vivo
Células BHK- 21 fueron sem bradas en placas de 100 m m un día ant es de la
t ransfección. Se ut ilizó el prot ocolo de Lipofect am ina 2000 reagent t ransfect ando 9 μg
de los vect ores de expresión pcADN4C- p19wt y/ ó 9 μg del vect or pCMV- HA- PKACA
( cedido gent ilm ent e por Laura Pasqualucci M.D. del I rving Cancer Research Cent er )
según es indicado. Luego de 24 horas, las células fueron dañadas con luz UV ( 4
m J/ cm 2 ) y cosechadas en los t iem pos indicados. La lisis celular fue realizada con 650
μl del buffer descript o m ás adelant e, durant e 20 m inut os en hielo. Luego de la
cent rifugación, 600 μg de prot eínas fueron inm unoprecipit adas con 1,5 μg del
ant icuerpo ant i- V5 y 30 μl de bolit as de A/ G- agarosa. La inm unoprecipit ación procedió
durant e t oda la noche a 4 º C, luego de lo cual, los com plej os inm unoprecipit ados
fueron lavados t res veces con el buffer de lisis y resupendidos en el m ism o buffer. Los
com plej os fueron analizados por elect roforesis y West ern blot .
Buffer de Lisis: 1 M de Tris- HCL pH 7,5, 1 M sacarosa, 100 m M ort ovanadat o de
sodio, 1 m M EDTA, 1 m M EGTA, 50 m M de NaF, 10% Trit ón X100,
10
mM
β- m ercapt oet anol,
cockt ail
de
inhibidores
de
prot easas ( Roche Applied Science, # cat álogo 11836170001) .
I n du cción y pu r ifica ción de GST- p1 9
157
MATERI ALES Y MÉTODOS
p19 hum ana fue expresada y
purificada a part ir
de la cepa de E. coli
BL21( DE3) pLys ( Novagen) com o una prot eína de fusión con GST ( Glut at hione STransferase) , a part ir del vect or pGEX 2T ( Pharm acia Biot ech) . Para la expresión, un
cult ivo en LB de 16 horas, fue diluido 10 veces y crecido en agit ación a 37 º C hast a
una O.D. de 0,6. La inducción de la expresión de GST- p19 se realizó por el agregado
de I PTG en una concent ración final de 0,4 m M y post erior incubación por 4 horas en
agit ación a 37 º C. Luego de est e t iem po, el cult ivo fue cent rifugado a 3000 x g. El
pellet fue resuspendido en PBS frío, sonicado y purificado ut ilizando una resina de
glut at ión - agarosa ( SI GMA cat # G4510) siguiendo el prot ocolo descript o por el
fabricant e. Fracciones del proceso de expresión y de purificación fueron analizadas por
SDS- PAGE y por t inción con Coom assie Blue.
Té cn ica de D oble H íbr ido e n le va du r a s
El est udio de int eract ores de p19 por la t écnica de doble híbrido en levaduras fue
realizada ut ilizando el sist em a Cyt oTrap® t wo- hybrid syst em ( St rat agene, núm ero de
cat álogo 217438) , siguiendo el prot ocolo descript o por el fabricant e.
La prot eína p19 hum ana fue subclonada ent re los sit ios Bam HI y SalI el vect or
pSos am plificando el ADNc con los siguient es prim ers:
prim er forward: 5´ CGGGATCCTCATGCTGCTGGAGGAGGTTCG
3´
prim er reverse: 5´ AGCGTCGACTCACAGCGGGGCCACCATGTG 3´
Se resalt an los sit ios de cort e para las enzim as de rest ricción.
An á lisis de e st r u ct u r a y sim u la ción de fosfor ila ción de p1 9
El análisis de la est ruct ura de p19 que est a fue realizado ut ilizando el program a
VMD ( Visual Molecular Dynam ics, ht t p: / / www.ks.uiuc.edu/ Research/ vm d/ ) .
Los cálculos o sim ulaciones de la prot eína en cada est ado fueron obt enidos con el
158
MATERI ALES Y MÉTODOS
program a AMBER. Los graficos XY fueron realizados con el program a XMGRACE.
159
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