Diapositiva 1

ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS
Los procedimientos electroforéticos se basan en la
migración de iones bajo la acción de un campo
eléctrico
La separación se logra por las distintas velocidades
de migración de las partículas cargadas
ELECTROFORESIS
Electroforesis clásica
Electroforesis capilar
ELECTROFORESIS CLÁSICA
TISELIUS 1937
libre de transportador
buffer
+
buffer
Muestra en
buffer
con transportador
diafragma
-
+
DV ~ 100 V
filtro de papel
buffer
ELECTROFORESIS CLÁSICA
Electroferograma de proteínas del suero
albúmina
a1
a2
b
g
albúmina
globulinas
b
a1
a2
g
ELECTROFORESIS CAPILAR
Comprende una familia de técnicas que
emplean como celda capilares que
contienen amortiguadores donde ocurre la
separación electroforética de los
componentes de la muestra
ELECTROFORESIS CAPILAR
CARACTERÍSTICAS GENERALES
 Incluida dentro de los métodos modernos de detección
 Emplea tubo capilar para la separación
 Utiliza campo eléctrico muy alto (~60 kV/m)
VENTAJAS
 Alta eficiencia
 Muy bajo volumen de muestra (útil para muestras valiosas)
 Poca cantidad de reactivos (económica)
 Aplicable a un amplio grupo de compuestos
ELECTROFORESIS CAPILAR
CONFIGURACIÓN INSTRUMENTAL BÁSICA
D
CÁTODO
(–)
ÁNODO
(+)
RESERVORIO
FUENTE
DE ALTO
VOLTAJE
ELECTROFORESIS CAPILAR
CONFIGURACIÓN INSTRUMENTAL BÁSICA
ELECTROFORESIS CAPILAR
PRINCIPIOS DE SEPARACIÓN
Migración electroforética
FENÓMENOS
ELECTROCINÉTICOS
Electroendoósmosis
(electroósmosis)
Electroendoósmosis
SÍLICA
FUNDIDA
LUZ DEL
CAPILAR,
20-200m
CUBIERTA DE
POLIIMIDA
Distribución de cargas en capilar de sílica y flujo
electroosmótico resultante
Si-OH
Si-O- + H+
CÁTODO (-)
Pared
del
capilar
F.E.O
capa de
Stern
capa
difusa
ÁNODO (+)
Velocidad electroosmótica
campo eléctrico
eo =
veo = eo E
veo
E
Ld/teo
Ld L
=
=
DV/L
DV teo
movilidad
electroosmótica
eo =
dq
√
e
eo =
4p
Unidades
v: longitud/tiempo (ej: cm/s)
eo : superficie/potencial.tiempo (ej: cm2/V.s)
E: potencial/longitud (ej: V/m)
: masa/longitud.tiempo (ej: kg/m.s)
La eo es igual para todas las especies dentro del capilar
Velocidad electroforética
campo eléctrico
vef = ef E
movilidad
electroforética
ef =
vef
E
q
ef =
f
Ld/tef
Ld L
=
=
DV tef
DV/L
q
=
6pr
coeficiente de fricción
La
ef depende de la carga y radio del analito
Velocidad neta
vneta = veo + vef
vneta = (eo+ ef) E
ap
vneta = ap E
Velocidades en presencia de F.E.O.
electrodo +
eo
ef
electrodo –
neta = eo+ef
Migración diferencial de los analitos según su
relación carga/radio
+
N
N
N
+
+
+
+
+
+
+
+
+
N
Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos
Perfiles de flujo para líquidos
Flujo hidrodinámico: inducido por presión
P
Flujo electroosmótico
+
–
Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos
Perfiles de flujo para líquidos
F.E.O
perfil plano
EC
Flujo laminar
perfil parabólico
HPLC
Flujo electroosmótico
Flujo laminar
Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos
Causas de ensanchamiento de las bandas
x
x
H = A + B/ + C
B = 2 Dt
tiempo migración
coeficiente de difusión
Otras causas:
Longitud finita de la muestra sembrada
Calentamiento por efecto Joule
Dispersión por asimetría
Efecto “stacking” (apilamiento)
Dispersión debida a la detección
Dispersión total
s2 = s2D + s2I + s2T + s2A + s2stac + s2D
Si consideramos a la difusión longitudinal como la principal
causa de ensanchamiento:
s2 = 2 Dt = 2 DL/vneta
vneta = ap E = ap DV/L
s2 = 2 DL2/ ap DV
Número de platos teóricos: N = L2/s2
Sustituyendo:
N = ap DV/2D
RESOLUCIÓN
ap(a) ap(b)
R=
[ap(a)+ ap(b)]/ 2
N =
Dap
ap
recordando que: N = ap DV/2D
R=
Dap
ap
ap DV/2D
0.707 Dap
R=
ap
ap
D
DV
N
Equipo de electroforesis capilar
Sílice fundida/poliimida, vidrio Pirex, teflón
50 cm longitud y 50 m d.i.
ánodo
cátodo
Pt
D
Pt
Fuente de potencial
Columnas
Recipientes de electrolito
Termostatización
Detectores
FAV
10 – 30 kV
i = 500 – 1000 A
dH/dt = k E2/L2
Detector Z
Inyección de la muestra
Hidrodinámica (gradiente de presión entre extremos del capilar)
cantidad de muestra inyectada
Flujo
gravitatorio
(sifón)
h
diferencia de altura
w = dgr4 hCti /8L
densidad aceleración radio del
gravedad
capilar
presión
ley de Poiesuille
vacío
w = r4 PCti /8L
diferencia de presión
Inyección de la muestra
Electrocinética (diferencia de potencial entre extremos del capilar)
Cantidad de soluto inyectada
voltaje inyección
radio
capilar
movilidad analito
w=
 r2 V t C
L
longitud capilar
tiempo inyección
concentración
Técnicas de detección en EC
UV-visible
 Universal
 Disponible comercialmente
 Amplia información espectral con detector de
diodos en línea
Fluorescencia
 Disponible
en
algunos
instrumentos
comerciales
 Muy sensible
 Se requiere fluoróforo o derivatización pre o
post columna
Fluorescencia
inducida por
láser
 Muy sensible
 Longitudes de onda disponibles limitadas
 Precio elevado
Técnicas de detección en EC
Potenciometría
 Se requiere electrodo selectivo de iones
 Se debe aislar el detector de la FAV
 Sensible siempre que no hayan iones
interferentes
Conductividad
 Universal
 Bajo costo pero poco sensible
 Se debe aislar el detector de la FAV
Amperometría
 Muy sensible pero solo utilizable con analitos
electroactivos
 Altamente específico
 Se debe aislar el detector de la FAV
Técnicas de detección en EC
Espectrometría
de masas
 Precio muy elevado
 Interfaz EC-EM complicada
 Sensible y con información estructural
Otras técnicas
Índice de refracción,
dicroismo circular, Raman
absorbancia
termoóptica,
Modos de aplicación
 Electroforesis capilar de zona
 Cromatografía electrocinética micelar
 Electroforesis capilar en gel
 Electrocromatografía capilar
 Enfoque isoelectrónico capilar
 Isotacoforesis capilar
MODOS DE APLICACIÓN
USO EN
QUÍMICA
ANALÍTICA
MODOS DE APLICACIÓN
Electroforesis capilar de zona (CZE)
Capilar lleno de electrolito de fondo y aplicación de campo eléctrico
Mecanismo: separación de analitos según su movilidad en solución
MODOS DE APLICACIÓN
El pH del buffer de fondo es la clave de la separación ya que determina
el grado de ionización y por lo tanto la movilidad relativa de los
diferentes analitos. Debe tener también baja absortividad a la longitud
de onda de detección y baja movilidad electroforética para minimizar el
paso de corriente.
MODOS DE APLICACIÓN
Cromatografía electrocinética micelar (MEKC)
Capilar lleno de electrolito de fondo que contiene tensioactivo.
Mecanismo: interacciones hidrofóbicas/iónicas de analitos con micelas
S
S
S
S
S
S
S
S
S S
S
MODOS DE APLICACIÓN
Electrocromatografía capilar
Capilar funcionalizado con fase estacionaria
Mecanismo: interacciones diferenciales de un analito en dos fases
Electroforesis capilar en gel
Capilar relleno con gel que actúa como tamiz molecular
Mecanismo: diferencia de tamaños y carga
MODOS DE APLICACIÓN
Enfoque isoeléctrico capilar (isoelectroenfoque)
Capilar lleno de distintos buffers. Un extremo del capilar sumergido en solución
ácida y el otro en solución alcalina. Se genera gradiente de pH a lo largo del
capilar. Mecanismo: los analitos migran hasta alcanzar el pH donde son neutros
(punto isoeléctrico). Una vez completada la focalización se alcanza un estado
estacionario (no fluye corriente en el capilar). Para la detección, las zonas son
movilizadas hacia el detector por aplicación de presión al capilar o adición de sal
a uno de los reservorios
MODOS DE APLICACIÓN
Isotacoforesis capilar
Mecanismo: separación en el interior de la zona delimitada por dos buffers
Se usan dos buffers con distinta movilidad. Se separan aniones o cationes,
no ambos. Ej: para separar aniones se elige un “electrolito lider o frontal”
cuya forma aniónica posee la mayor movilidad, mientras que el anión del
“electrolito terminal” es el más lento. Al aplicar el E los aniones comienzan a
migrar al ánodo. El anión lider es el que se mueve más rápidamente, con los
demás aniones siguiéndolo detrás. Los analitos se separan en zonas
determinadas por sus movilidades, con el anión más rápido del analito
moviéndose detrás del electrolito lider.
Isotacoforesis capilar
Significa electroforésis a velocidad uniforme. Esto quiere decir que el tiempo de
recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforética es independiente de la
velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento.
Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder en un
extremo, de gran movilidad, y debe ser mayor que la de los componentes a
separar. Luego se introduce la muestra seguido del electrolito terminal o cola,
cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la
muestra. La selección de los electrolitos guías y terminales depende del
conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todos los
componentes de la muestra.
En ITP las bandas están siempre en contacto con la zona adyacente. Esta
característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del
sistema, dado que no hay un electrolito de soporte.
ITP puede ser usada para determinar cationes y aniones. Se requiere
usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica.
Los Isotacoferogramas pueden mostrar diferencias en el orden de migración en
presencia o no de EOF.
La detección en ITP es usualmente con detectores de "bulk property" de la
solución electrolítica. Se ha utilizado detección de conductividad . También se
han utilizado detectores térmicos (medida del calor de Joule producido dentro de
cada zona) o detectores que miden la caída de voltaje de cada zona.
Equipos de electroforesis capilar
Ejemplos de electroferogramas
Detección de aminas halucinogénicas (hidromorfona, morfina y codeína) en sangre
total por EC (nalorfina= estándar interno). Condiciones de separación: capilar 70 cm
(60 cm del detector) × 75 um de sílice fundida conteniendo 0.4% de β-CD en
100 nM de fosfato pH = 2.38 a 21 kV; 25 °C, inyección a 10 kV durante 16 s;
detección a 200 nm. La recta muestra la respuesta lineal para hidromorfona.
.
Controles de calidad para
drogas básicas en sangre total.
Condiciones de separación:
capilar de 60 cm (50 cm del
detector) × 75 mm de sílica
fundida conteniendo 100 nM
fosfato pH= 2.38, a 18 kV, 25 °C,
inyección a 10 kV por 8–16 s,
detección a 200 nm. a) control
de calidad de muestra en agua
pura; b) control de calidad del
extracto, 10 ng de cada droga
en sangre porcina; c) control de
calida del blanco con 50 ng/mL
de estandar interno adicionado