aspectos generales de la bioquimica de la antioxidación

ASPECTOS GENERALES DE LA
BIOQUIMICA DE LA ANTIOXIDACIÓN
LUIS F. GONZÁLEZ
En los átomos que conforman la materia, los
electrones giran en órbitas alrededor de núcleos
En los orbitales, los electrones giran de a
pares con un spin particular (MÁXIMA
ESTABILIDAD NATURAL)
Por tanto, si hay electrones desapareados en
un orbital, se generan especies atómicas
altamente reactivas que tienden a robar un
electrón de cualquier otro átomo para
compensar su deficiencia electrónica
RADICAL LIBRE
EL PRINCIPAL RADICAL LIBRE
DEL PLANETA ES EL OXÍGENO
EL PROCESO DE FOTOSÍNTESIS
VEGETAL LO INTRODUJO EN LA
ATMOSFERA QUE RESPIRAMOS (21 %)
HACE MÁS DE 2500 MILLONES DE
AÑOS
EL O2 ES UN ELEMENTO ESENCIAL PARA NUESTRA VIDA….
POR QUÉ?........
DONDE LO UTILIZAMOS
ALIMENTOS
PARA EXTRAER LA
ENERGÍA ALMACENADA
EN LOS ALIMENTOS
GLUCOSA
O2
ATP
ENERGÍA (ELECTRONES)
PIRUVATO
H2O
O2
ENERGÍA (ELECTRONES)
H2O
ATP
….Pero también es un tóxico celular
El oxígeno tiene dos electrones desapareados
: :
: :
. O:O .
DAÑO CELULAR RADICALARIO
• Los electrones desapareados en el O2,
presentan un spin paralelo (di-radical)
• Por tanto, el O2 presenta una reactividad
limitada debido a su restricción de spin
Sin embargo; a partir del O2 atmosférico, se
genera una gran variedad de especies
reactivas de oxígeno (robadores de electrones)
FORMACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO
(ERO)
.NO
NO2 .–
ONOO–
(radical nitrito) (peroxinitrito)
No es un radical.
Pro-oxidante
O2
e–
–
e
.–
O2
Radical
Superóxido
H2O2
e–
Fe, Cu
(Reacción Haber-Weiss)
–
e
HO.
Radical
Hidroxilo
H2O
FORMACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO
(ERO)
-Detoxificación xenobióticos (P450)
-Catabolismo de nucleótidos
(síntesis de ácido úrico)
-Síntesis de NO
-Síntesis de prostaglandinas
(lipoxigenasas)
-Metales
de transición (Fe, Cu)
Leucocitos
macrofagos
DAÑO CELULAR
HOCL, O2.–
Insecticidas,
nitróxidos,
fenoles,etc
REACTIVIDAD CELULAR DE ERO
Lípidos
Proteínas
ADN
Oxidación de tioles
Alteración Conformación
Peroxidación
de lípidos
Daño del ADN
Expresión génica alterada
Pérdida permeabilidad
selectiva de membrana
Daño de membrana
Alteración de gradientes
iónicos transmembrana
Activación/desactivación
de varios sistemas enzimáticos
Adaptado de Kehrer JP, 1993
Disminución ATP
y NAD(P)H
Daño Celular
A menos que ocurra……
1. Prevención en la formación de ERO
2. Intercepción de las ERO
3. Ruptura de la cadena de propagación oxidativa
4. Reparación del daño oxidativo celular
ANTIOXIDANTE: una substancia que relativamente a
bajas concentraciones es capaz de competir con otros
sustratos oxidables, de tal modo de retardar o inhibir la
oxidación de otros sustratos.
INDUCTORES DE LA
DETOXIFICACIÓN DE ERO
(SEÑALES OXIDATIVAS O
EL MISMO AOX QUE
INDUCE EXPRESIÓN DE
GENES AOX)
Antioxidantes
ATRAPADORES
DIRECTOS DE
ERO
(REDUCCIÓN)
R•, RO•,
ROO•, 3O2
1
Pro-oxidantes
R•, RO•,
ROO•,
O2, 1O2,
3
Cu ion
Fe ion
INTERFIEREN O
INHIBEN CON LA
REACCIÓN QUE
GENERA ERO
(QUELANTES,
DESCOMPONEDORES DE
PERÓXIDOS)
O2, Cu, Fe
TODOS LOS ORGANISMOS QUE USAMOS OXÍGENO
METABOLICAMENTE (AERÓBICOS) POSEEMOS UNA PROTECCIÓN
ANTIOXIDANTE
No Enzimática
„ Vitamin E
Enzimática
„ Vitamin C
„ Superóxido dismutasa
„ Coenzyme Q
„ Catalasa
„ Uric Acid
„ Glutatión Peroxidasa
„ Melatonina
„ Glutatión Transferasa
„ Bilirrubina
„ Taurina
„ Glutatión
„ Cisteína
„ Se, Zn, Mn (cofactores
de enzimas AOX)
CARACTERÍSTICAS DE UN COMPUESTO O SISTEMA
ANTIOXIDANTE
1. Previene o detiene una cadena de propagación oxidativa, mediante
la estabilización del radical generado (Estabilización resonante)
OH
C (C H 3 )3
O C H3
RH , ROH , ROOH
R• , RO • , ROO •
O
.
O
C (CH 3 )3
O C H3
O
.
C (C H 3 )3
O C H3
O
.
C (C H 3 )3
C (C H 3 ) 3
.
O C H3
O CH 3
2. Regeneración del antioxidante radicalario
LOS ANTIOXIDANTES PODRÍAN FUNCIONAR
COMO PRO-OXIDANTES (CICLAJE REDOX)
Cuando el AOX es incorporado al sistema
(biológico) en altas cantidades, el radical formado
en la antioxidación se acumula en grandes
cantidades.
Cuando el sistema de regeneración del radical del
antioxidante es deficiente, el radical estabilizado
se acumula.
EXISTE UN DELICADO EQUILIBRIO ENTRE…
Se, Vit E-C, GSH, SOD, GSH-Px
Capacidad Antioxidante
_
.
O2
H2O2
ONOO
_
Acumulación ERO
ESTRÉS OXIDATIVO
El concepto de Estrés Oxidativo es introducido por Sies en
1986 y es un componente importante de variadas
patologías al incrementar el potencial degenerativo de
éstas (diabetes, nefropatías, cardiopatías, alzheimer,
cancer, parkinson, pancreatitis, etc.)
Más aún, ya en 1956 D. Harman propuso su teoría hoy
ampliamente difundida del envejecimiento como
consecuencia de la acumulación del daño celular radicalario
De este modo es que la popularidad de los
antioxidantes, búsqueda de nuevas moléculas, su
extracción y evaluación es cada vez más importante
(....justifica varios seminarios)
PERO QUE HAY DE LAS PLANTAS?.......
……ELLAS NOS MANTIENEN EN ESTE PROBLEMA
EVOLUTIVO DE LA PARADOJA DEL OXÍGENO
SIN EMBARGO, ELLAS TAMBIÉN SON SENSIBLES A
LA TOXICIDAD DEL OXÍGENO Y DEBEN SER MUY
EFICIENTES EN SU DEFENSA ANTIOXIDANTE……
….. PUES HAN EVOLUCIONADO COMO ORGANISMOS
SÉSILES
La cantidad y diversidad de
compuestos únicos con propiedades
antioxidantes en plantas es enorme :
Carotenos, flavonas, antocianos,
terpenos, polifenoles, etc
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE
LAS PROPIEDADES
ANTIOXIDANTES DEL AROMA
DE LAS PLANTAS
Aroma en las plantas
ATRAYENTE, DEFENSA A LA HERBIVORÍA Y ESTRÉS ABIÓTICO (UV,
CALOR, OZONO) : DETERRENTE E INDUCTOR DE GENES DE DEFENSA.
COMUNICACIÓN INTER-INTRAESPECÍFICA.
VOLÁTILES AROMÁTICOS DE PLANTAS
Glándulas epidérmicas
(Tricomas oleaginosos)
VARIEDAD DE COMPUESTOS VOLATILES EN PLANTAS
ARENOS
(ANILLOS AROMÁTICOS)
VARIEDAD DE COMPUESTOS VOLATILES EN PLANTAS
TERPENOS
VARIEDAD DE COMPUESTOS VOLATILES EN PLANTAS
ESTERES
VOLÁTILES DE PLANTAS COMO POTENCIALES
ANTIOXIDANTES
VOLÁTILES DE PLANTAS
RICOS EN ELECTRONES,
PUEDEN NEUTRALIZAR
ESPECIES RADICALARIAS
LOS RADICALES LIBRES
ROBAN ELECTRONES DE
MOLÉCULAS EN LA
CÉLULA
EVALUACIÓN DE ANTIOXIDACIÓN
REDUCCIÓN DEL RADICAL DPPH
(medio semi-hidrofóbico)
DISMINUCIÓN A515 nm
2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH)
Reducción del radical DPPH por el aroma
de hojas de cedrón
0,1
DPPH radical
(A505 nm)
0,08
0,06
0,04
0,02
0
DPPH abierto DPPH abierto
(frasco vacío) (frasco hojas)
DPPH cerrado
(frasco hojas)
Extracción de hidrosol y aceite esencial de
plantas por hidrodestilación
Trampa de Clevenger
Rendimiento: 0,13 -0,15 % vol/pf tejido
(100-150 ul / 80 – 100 g tf)
Extracción de volátiles
Hidrosol (volátiles polares en solución acuosa no
saturada, estandarizada en relación al contenido del
componente principal o de terpenos totales)
Aceite esencial (volátiles apolares principalmente
terpenos en solución saturada junto a ceras no volátiles.
Estandarizada en masa o volumen)
Barrido de absorción UV en los hidrosoles
analizados
1,2
0,8
0,4
0
20
0
21
8
23
6
25
4
27
2
29
0
30
6
32
4
34
2
36
0
37
8
39
6
Absorbancia
Flor de la pluma
oregano
cedron
Longitud de onda (nm)
Reducción del radical DPPH por hidrosoles
de plantas
DPPH radical
(A505 nm)
0,25
0,2
Co
0,15
C FP
0,1
0,05
O
0
0
200
400
600
volumen hidrosol (µL)
Tiempo de incubación 1 h
Reducción del radical DPPH por aceite
esencial de plantas
0,2
DPPH radical
(A505 nm)
0,16
0,12
0,08
0,04
0
rol
t
n
co
an
lav
da
ron
d
e
c
E
vit
Volumen ensayado 5 uL (10 mg Vit E) por 1 h
Reducción del radical DPPH por aceite
esencial de plantas
0,15
control
DPPH radical
(A505 nm)
Ac. Lavanda
Ac. cedrón
0,1
0,05
0
0
1000
2000
3000
Tiempo (seg)
Volumen ensayado 5 uL
4000
EVALUACIÓN DE ANTIOXIDACIÓN
Cel HL-60
Pre-tratamiento células HL-60 con aroma
aceite esencial…………………………..3 h
Carga de células HL-60 con DCFH-DA (10
µM)……………………………………15 min
Tratamiento células HL-60 con ABAP (2,2azo-bis-amidino propano, 1 mM)…0-90 min
Análisis Emisión de Fluorescencia en
extracto de células HL-60
1,2 x 106 cél/ml
Disminución de la oxidación de DCFH-DA por aceites esenciales de
plantas en células HL-60 sometidas a estrés oxidativo
Fluorescencia relativa To
(Em 520 nm / mg prot.)
2,5
control
cedron
2
lavanda
1,5
1
0,5
0
0
20
40
60
Tiempo (min)
80
100
CONCLUSIONES
LAS PLANTAS POSEEN UNA GRAN DIVERSIDAD DE COMPUESTOS
COMPLEJOS RICOS EN ELECTRONES Y POTENCIALMENTE
ANTIOXIDANTES ÚTILES PARA COMPENSAR LA TOXICIDAD DEL
OXÍGENO Y SUS DERIVADOS.
LA EVALUACIÓN BIOLÓGICA COMPLEMENTARIA A LOS ENSAYOS
QUÍMICOS TRADICIONALES DE EVALUACIÓN ANTIOXIDANTE,
PERMITIRÁN EVALUAR EL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE UN
COMPUESTO CONSIDERANDO LAS POTENCIALES CONSECUENCIAS
DEL CICLAJE REDOX DE TALES COMPUESTOS.
LA BÚSQUEDA, EXTRACCIÓN Y EVALUACIÓN DE ESTOS
COMPUESTOS PODRÍA PERMITIR LA SUPLEMENTACIÓN DE
NUESTRA LIMITADA DEFENSA ANTIOXIDANTE.
LOS COMPUESTOS VOLÁTILES CONTENIDOS EN EL AROMA DE LAS
PLANTAS ES UNA POTENCIAL FUENTE DE ESTOS COMPUESTOS
ANTIOXIDANTES.
Prooxidant Mechanisms of Metals
Acceleration of hydroperoxide decomposition to form peroxy radical and alkoxy
radical.
Fe3+
+
ROOH
Fe2+
+ ROO• + H+
Fe2+
+
ROOH
Fe3+
+ RO • + OH-
Formations of alkyl free radical by direct reaction with fats and oils.
Fe3+
+
RH
Fe2+
+ R•
+ H+
Activation of molecular oxygen for singlet oxygen formation.
Fe2+
+
O2
Fe3+ + O-2
1O
2
Ascorbic Acid
• Hydrogen donation to radicals
• Quenching of singlet oxygen
• Removal of molecular oxygen
• Regenerate tocopherol from tocopherol radicals
• Prooxidant
Reduce ferric iron to ferrous iron
NO• signaling in physiology
Nitric Oxide Synthase
O2-•
NO•
ONOO-
Binds to heme moiety of
guanylate cyclase
Conformational change of
the enzyme
Increased activity
(production of cGMP)
Modulation of activity of
other proteins (protein
kinases, phosphodiesterases, ion channels)
Physiological response
(relaxation of smooth
muscles, inhibition of
platelet aggregation, etc.)