luis eduardo pastenes opazo

UNIVERSIDAD DE CHILE
Campus Sur
Instituto de
Nutrición y
Tecnología de
los Alimentos
Facultad de
Ciencias
Agronómicas
Facultad de
Ciencias
Forestales
Facultad de
Ciencias
Veterinarias y
Pecuarias
PROGRAMA DE DOCTORADO
EN CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS Y VETERINARIAS
“ADAPTACIÓN LOCAL A LA TEMPERATURA: DIVERGENCIA
TRANSCRIPTÓMICA EN TRES POBLACIONES ANDINAS DE
Rhinella spinulosa (ANURA, BUFONIDAE)”
LUIS EDUARDO PASTENES OPAZO
Tesis para optar al Grado Académico de
Doctor en Ciencias Silvoagropecuarias y
Veterinarias
PROFESOR GUÍA: Dr. MARCO ANTONIO MÉNDEZ TORRES
SANTIAGO, CHILE
Septiembre 2013
PROGRAMA DE DOCTORADO
EN CIENCIAS SILVOAGROPECUARIAS Y VETERINARIAS
“ADAPTACIÓN LOCAL A LA TEMPERATURA: DIVERGENCIA
TRANSCRIPTÓMICA EN TRES POBLACIONES ANDINAS DE
Rhinella spinulosa (ANURA, BUFONIDAE)”
LUIS EDUARDO PASTENES OPAZO
Tesis para optar al Grado Académico de
Doctor en Ciencias Silvoagropecuarias y
Veterinarias
COMITÉ DE TESIS
Calificación
Firma
Dr. Marco Méndez Torres (Director de Tesis)
______________
_____________
Dr. Roberto Neira Roa (Consejero)
______________
_____________
Dr. Ángel Spotorno Oyarzún (Consejero)
______________
_____________
Dr. Rigoberto Solis Muñoz (Consejero)
______________
_____________
Dr. Cristián Estades Marfán (Presidente Comisión
Examen de Grado)
______________
_____________
SANTIAGO, CHILE
Septiembre 2013
AGRADECIMIENTOS
Al culminar este viaje de largo aliento, quisiera agradecer el apoyo de las siguientes
personas e instituciones:
A mi tutor y guía de tesis, Dr. Marco Méndez, por reclutarme en su laboratorio (Genética y
Evolución, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile). Gracias por mostrarme lo hermoso que
es estudiar Evolución y realizar trabajo de campo.
A los Centros: i) FONDAP de Regulación del Genoma (Dr. Miguel Allende; Universidad de
Chile); y ii) de Modelamiento Matemático (Dr. Alejandro Maass; Facultad de Ciencias Físicas y
Matemáticas, Universidad de Chile).
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Genética y Evolución. Quiero agradecer,
particularmente, a Pablo Fibla, Hugo Salinas y Moisés Valladares, por los esfuerzos y
compromisos adquiridos con los experimentos de jardín común; y también a Camilo Valdivieso,
por su invaluable apoyo intelectual y técnico en el análisis y discusión de los datos.
A los Drs. Alfredo Gonzalo Benavides y Michel Sallaberry, por su gran ayuda en las
expediciones a los Géiseres de El Tatio y Valle Incásico de Catarpe (Región de Antofagasta,
Chile).
A Rodrigo Pavez (INTA, Universidad de Chile), por su preciada ayuda en las expediciones al
poblado de Farellones (Región Metropolitana, Chile).
A Alex Di Genova y Dante Travisany (Centro de Modelamiento Matemático), por su invaluable
apoyo y experiencia en el análisis bioinformático.
A mi buen amigo Leonardo Pavez, por su ayuda y consejos en la elaboración de futuros
experimentos.
Finalmente, a mi gran amiga y compañera de vida, Alejandra. Gracias por tu cobijo y apoyo. Tu
enorme sabiduría permitió en gran medida dar término a este proceso.
FINANCIAMIENTO: Beca CONICYT (folio 21090559).
ÍNDICE
RESUMEN ...................................................................................................................................... 3
ABSTRACT .................................................................................................................................... 4
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 5
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................... 6
I. El papel de los factores ambientales en la adaptación local ................................................... 6
II. Anfibios como modelos de estudio en adaptación local ........................................................ 8
III. Aproximaciones genómicas para evaluar adaptación local ................................................. 13
IV. Fenotipos de Rhinella spinulosa para la heterogeneidad térmica ....................................... 17
HIPÓTESIS ................................................................................................................................... 20
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................ 20
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................ 20
METODOLOGÍA.......................................................................................................................... 21
1. Recolección de huevos de Rhinella spinulosa....................................................................... 21
2. Experimento de jardín común................................................................................................ 21
3. Obtención de RNA para análisis de secuenciación transcriptómica ..................................... 26
4. Construcción de las bibliotecas de cDNA y secuenciación Illumina .................................... 27
5. Filtración de datos, ensamble de novo, cuantificación de transcritos y anotación génica ..... 28
6. Clustering y clasificación de ontologías génicas ................................................................... 30
7. Genes diferencialmente expresados y genes candidatos de adaptación local a la
temperatura en Rhinella spinulosa ............................................................................................ 31
RESULTADOS ............................................................................................................................. 33
Rasgos de historia de vida ......................................................................................................... 33
Experimento RNA-Seq y ensamble de novo ............................................................................. 34
Genes diferencialmente expresados........................................................................................... 35
Genes candidatos de la adaptación local a la temperatura ........................................................ 41
DISCUSIÓN .................................................................................................................................. 45
Expresión de rasgos de historia de vida .................................................................................... 45
RNA-Seq y genes diferencialmente expresados ........................................................................ 47
Enriquecimiento génico y genes candidatos de la adaptación local a la temperatura ............... 50
CONCLUSIONES Y PROYECCIONES .................................................................................... 55
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................... 58
ANEXO: Material Suplementario ................................................................................................. 67
2
RESUMEN
En vertebrados ectotermos, la temperatura ha sido descrita como un factor determinante
asociado con adaptación local. Si bien, en anfibios existe evidencia de variación geográfica en
caracteres morfológicos, conductuales y de historia de vida, los estudios que han indagado en los
genes involucrados en adaptación local son escasos. El objetivo de esta tesis fue examinar, en el
anfibio Rhinella spinulosa, los genes diferencialmente expresados (DE) asociados a la adaptación
local a la temperatura. Para detectar y proponer genes candidatos de la adaptación local a la
temperatura, se diseñó un experimento de jardín común con larvas de tres hábitats diferentes (de
agua termal: géiseres de El Tatio; y de temperatura variable: Catarpe y Farellones), que fueron
expuestas a dos temperaturas experimentales (20 y 25 ºC). Para obtener transcriptomas de novo,
se realizó un ensayo de RNA-Seq con 12 muestras del experimento de jardín común,
correspondientes a distintas condiciones de temperatura, localidades y estadios de desarrollo (36
y 42 de Gosner). La comparación de estos perfiles transcriptómicos develó 7.451 genes DE y
mostró diferencias en la cantidad de genes DE para El Tatio (779), Catarpe (278) y Farellones
(337). Los genes DE fueron agrupados según perfiles de expresión similar (12 clusters) y se
realizó un enriquecimiento génico por clasificación de ontologías génicas. Se identificaron siete
genes candidatos: tres hormonas (pro-opiomelanocortina, prolactina y somatotropina), dos
factores transcripcionales (creb3 y klf9), una proteína de estrés térmico (hsp90α) y un receptor
sensorial (trpv3). Para estos siete genes candidatos, se evidenció un patrón de expresión menor en
El Tatio (estadios 36 y 42 de Gosner mantenidos a 20 ºC), en comparación al resto de las
condiciones evaluadas. En conclusión, el patrón de expresión génica observado en los individuos
de El Tatio, permite explorar a nivel transcriptómico la adaptación local a la temperatura de los
individuos de esta población.
Palabras claves: adaptación local, anfibios, expresión génica, genes candidatos, RNA-Seq,
temperatura.
3
ABSTRACT
In ectothermal vertebrates, temperature has been described as a determinant factor
associated with local adaptation. Although there is evidence in amphibians of geographic
variation in morphological, behavioral and life history characters, few studies have examined the
genes involved in local adaptation. The aim of this thesis was to examine the differentially
expressed (DE) genes associated with local adaptation to temperature in the amphibian Rhinella
spinulosa. To detect candidate genes of local adaptation to temperature, a common garden
experiment was designed using larvae from three different habitats; one from hot springs,
Géiseres de El Tatio, and two from habitats with variable temperature, Catarpe and Farellones,
which were exposed to two experimental temperatures (20 and 25 ºC). To obtain de novo
transcriptomes, an RNA-Seq trial was performed with 12 samples from the common garden
experiment, corresponding to different temperatures, localities and development stages (Gosner
stages 36 and 42). Comparison of the transcriptomic profiles revealed 7,451 DE genes and
showed differences in the number of DE genes for El Tatio (779), Catarpe (278) and Farellones
(337). DE genes were grouped by similar expression profiles (12 clusters) and genetic enrichment
was performed by Gene Ontology classification. Seven candidate genes were identified; three
hormones (pro-opiomelanocortin, prolactin and somatotropin), two transcription factors (creb3
and klf9), a thermal stress protein (hsp90α) and a sensorial receptor (trpv3). These seven
candidate genes showed lower expression in El Tatio (Gosner stages 36 and 42 at 20 ºC)
compared to the rest of the conditions evaluated. In conclusion, the pattern of gene expression
observed in the individuals from El Tatio allows exploration at the transcriptomic level of local
adaptation to temperature of the individuals of this population.
Key words: amphibians, candidate genes, gene expression, local adaptation, RNA-Seq,
temperature.
4
INTRODUCCIÓN
La adaptación local es el cambio genético que ocurre en una población en respuesta a una
presión selectiva localizada geográficamente, por lo que suele ser estudiada en organismos que
exhiben diferencias fenotípicas asociadas a ambientes específicos. En la actualidad, existe un
importante cúmulo de evidencia de adaptación local en diversos taxa, sin embargo, las bases
genéticas asociadas a los rasgos que incrementan la habilidad de un organismo para sobrevivir y
reproducirse en ambientes naturales aún no se han dilucidado. El acceso reciente a nuevos
recursos para la exploración de genomas y transcriptomas (e.g., Secuenciación de Próxima
Generación y Bases de Datos Públicas) permitirá identificar a aquellos genes que contribuyen a
los mecanismos de adaptación local en poblaciones naturales.
La temperatura ha sido descrita como un factor determinante asociado con adaptación local. Por
otra parte, los anfibios han sido utilizados para evaluar la variación morfológica y de los rasgos
de historia de vida en condiciones ambientales térmicas particulares. Es así que en este grupo, se
ha acumulado importante evidencia sobre variación geográfica en caracteres morfológicos,
conductuales y de historia de vida. Pocos estudios han examinado las bases genéticas de esta
variación, siendo los que han indagado sobre la expresión de genes involucrados en adaptación
local a la temperatura particularmente escasos. En Chile, el anuro Rhinella spinulosa presenta
variación geográfica a lo largo de su rango de distribución, lo que genera amplias oportunidades
para la adaptación local en hábitats específicos. Méndez & Correa-Solis (2009) reportaron para
esta especie la existencia de variación en los atributos morfológicos y de historia de vida de dos
poblaciones que habitan ambientes térmicamente contrastantes (El Tatio, una localidad de
arroyos termales permanentes; y Farellones, una localidad con cuerpos de agua temporales y
térmicamente fluctuantes). Si bien, en esta especie se ha caracterizado ampliamente la variación
fenotípica en cuanto a plasticidad fenotípica y adaptación local (Benavides 2003, MárquezGarcía et al 2009, Méndez & Correa-Solis 2009, Márquez-García et al 2010), a la fecha no
existen datos sobre cuáles son los genes involucrados en estas respuestas adaptativas. Por lo tanto,
esta tesis tiene como objetivo principal identificar genes involucrados en la respuesta a la
adaptación local a la temperatura en Rhinella spinulosa.
5
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I. El papel de los factores ambientales en la adaptación local
La adaptación local es el cambio genético que ocurre en una población en respuesta a una
presión selectiva localizada geográficamente. De acuerdo a lo anterior, “individuos de una
población local exhiben un fitness mayor en su ambiente local, comparado con individuos de una
población y ambiente diferentes” (Kawecki & Ebert 2004). De este modo, los individuos de cada
población local modificarán sus rasgos de manera que se expresen ventajas asociadas a las
condiciones locales (hábitat), independientemente de las consecuencias de estos caracteres en
otros hábitats. Por otra parte, un problema interesante de evaluar en biología evolutiva es la
relevancia de la variación geográfica sobre los factores genéticos que determinan la adaptación
local de los individuos a ambientes específicos. En la mayoría de los caracteres fenotípicos, el
estado observado está influenciado por fuerzas genéticas y ambientales, de tal modo que, bajo
condiciones ambientales contrastantes, un genotipo puede expresarse como un rango de fenotipos
(Schlichting & Pigliucci 1998). Esto es lo que se ha definido como variación geográfica, donde
las poblaciones, al estar separadas espacial o temporalmente entre sí, pueden mostrar variación
tanto en sus atributos genéticos y morfológicos, como en sus rasgos de historia de vida.
La influencia que ejercen los factores ambientales sobre el proceso de adaptación local ha sido
examinada en reiteradas ocasiones (e.g., ver revisiones de Adkison 1995, Shine 2005, Fraser et al
2011). Así por ejemplo, se ha documentado que la temperatura es un factor determinante que se
asocia con adaptación local. Estos estudios han reportado variación en las características
morfológicas y de historia de vida entre poblaciones que habitan ambientes con temperaturas
contrastantes. En peces, distintos estudios han mostrado que la relación entre los rasgos de
historia de vida tempranos y la supervivencia se ve afectada por la variación térmica del agua
(e.g., Bergenius et al 2002, Grorud-Colvert & Sponaugle 2011). Por otra parte, en anfibios y
reptiles se ha observado que individuos mantenidos a temperaturas bajas retardan su
diferenciación temprana, incrementando su tamaño estado-específico y presentando períodos
prolongados de desarrollo, en comparación con individuos que crecen a temperaturas más altas
(e.g., Smith-Gill & Berven 1979, Laugen et al 2003a, Angilletta et al 2004, Terribile et al 2009).
En el caso de algunos reptiles, tal efecto de variabilidad dependiente de la temperatura se observa
incluso en la determinación sexual de los individuos (e.g., Rhen et al 2011). De esta manera, se
6
hace evidente que las condiciones ambientales particulares están asociadas a las respuestas
adaptativas, y como en los casos recién mencionados, el efecto de un factor ambiental (la
temperatura), es suficiente para modelar las características fenotípicas de los individuos en las
poblaciones.
La heterogeneidad ambiental actúa como un factor importante que regula la evolución de la
plasticidad fenotípica (Moran 1992, Sultan & Spencer 2002), pero también provee de un
escenario para la adaptación (Schlichting & Pigliucci 1998). Por lo tanto, en ambientes que son
espacial o temporalmente variables, la selección natural favorecerá a: i) cualquiera de un
conjunto de genotipos especializados con fenotipos fijos, cada uno adaptado a un ambiente
particular; o ii) genotipos flexibles que expresan fenotipos diferentes en ambientes distintos,
obteniendo así un fitness mayor sobre un rango de ambientes; (Futuyma & Moreno 1988,
Whitlock 1996). Es por ello que, ambientes marcadamente heterogéneos son escenarios ideales
para investigar los mecanismos y procesos de la adaptación local.
Un concepto importante en biología evolutiva es que los rasgos de historia de vida 1 son los
componentes principales del fitness (Stearns & Hoekstra 2005). Dado que la diferenciación en los
rasgos de historia de vida de los individuos puede estar facilitada por el ambiente que habitan, es
necesario considerar las diferencias geográficas entre las poblaciones para comprender la
variación en estos atributos. Desde esta perspectiva, un enfoque típico para examinar variación en
los atributos de historia de vida es comparar dos o más poblaciones y evaluar las diferencias de
estos rasgos entre ellas con respecto a sus ambientes. A modo de ejemplo, cito tres estudios en los
cuales se ha evaluado variación geográfica, tanto en rasgos de historia de vida como en atributos
morfológicos y genéticos, en distintos taxa animales:
i) Baker & Foster (2002), utilizando al pez Gasterosteus aculeatus, examinaron el tamaño a la
reproducción, los tamaños de las puestas y de los huevos, y la masa relativa de las puestas, en
busca de evidencia de plasticidad dentro de un conjunto de seis muestreos anuales en la región
centro-sur de Alaska, USA. Ellos encontraron diferencias significativas entre peces de río y de
1
Según Stearns & Hoekstra (2005), los rasgos de historia de vida son aquellos atributos que están directamente
asociados con la reproducción y la supervivencia, incluyendo el tamaño de la cría (o el tamaño a la metamorfosis,
en el caso de artrópodos y anfibios), la tasa de crecimiento, la edad y el tamaño a la madurez, el número de
descendencia, la frecuencia de reproducción, y el período de vida.
7
estanque, para los cuatro rasgos estudiados. Además, las hembras de estanque mostraron mayor
variación intra e interanual que aquellas de río.
ii) Laugen et al (2002) utilizaron cruces recíprocos entre dos poblaciones divergentes de Rana
temporaria para evaluar los efectos genéticos y maternos en la supervivencia y en tres atributos
de historia de vida (tasa de crecimiento, y edad y tamaño a la metamorfosis). Los efectos
genéticos fueron importantes en los tres rasgos estudiados, pero también hubo contribuciones
genéticas no-aditivas en el tamaño a la metamorfosis y en la tasa de crecimiento. La
contribución de los efectos maternos a la divergencia poblacional, vistos a través del tamaño
del huevo, fue alta en dos de los tres rasgos evaluados (edad a la metamorfosis y tasa de
crecimiento). Estos autores sugieren que los efectos maternos y genéticos son determinantes en
la variación geográfica en las historias de vida de los anfibios, y que mucha de la diferenciación
resultante de los efectos maternos es mediada a través de la variación en el tamaño del huevo.
iii) Wapstra & Swain (2001) investigaron en el lagarto Niveoscincus acellatus la variación
geográfica e interanual de los rasgos de historia de vida de dos poblaciones de Tasmania que
habitan en los extremos climáticos de la distribución. Dentro de cada población no hubo
diferencias interanuales o intersexuales en el tamaño corporal adulto. Sin embargo, individuos
maduros de un sitio montañoso frío fueron significativamente más grandes en la madurez y
tuvieron un tamaño corporal máximo mayor que individuos maduros de un sitio costero cálido.
Además, la descendencia fue mayor en el sitio frío, siendo consistente con la variación en los
tamaños de descendencia de otras especies con amplia distribución.
En conclusión, estos ejemplos sugieren que la heterogeneidad ambiental es un factor que induce
cambios en los atributos de historia de vida y en los rasgos morfológicos y genéticos de los
organismos, generando así variación geográfica en las poblaciones.
II. Anfibios como modelos de estudio en adaptación local
Los anfibios, en general, exhiben una escasa vagilidad y una alta filopatría2 (Seppä &
Laurila 1999). Estos atributos permiten la acumulación de diferencias, tanto genéticas y
morfológicas (Blouin & Brown 2000, Miaud & Merilä 2001), como en los rasgos de historia de
2
La filopatría se refiere a los animales que retornan a una ubicación específica, generalmente para reproducirse o
alimentarse (Vitt & Caldwell 2009).
8
vida (Berven & Gill 1983, Laurila et al 2002). Por estas razones, los anfibios han sido utilizados
frecuentemente para evaluar la variación en los rasgos de historia de vida y las condiciones en
que se expresa la plasticidad fenotípica (Newman 1992, Merilä et al 2000, Laurila et al 2002,
Laugen et al 2003a, b). Por otra parte, se ha documentado que los ciclos reproductivos de los
anfibios, aunque están fuertemente controlados por variaciones hormonales y presentan
restricciones a nivel genético, pueden exhibir un fuerte componente ambiental en su regulación
(Duellman & Trueb 1994). Además, y como en otros ectotermos, los anfibios no poseen un
mecanismo eficiente para la termorregulación fisiológica (Duellmann & Trueb 1994),
determinando así la fuerte dependencia de los procesos de crecimiento y diferenciación a la
temperatura (Atkinson 1994, Alvarez & Nicieza 2002).
En Chile, la mayoría de los anfibios presentan estrategias reproductivas asociadas a ambientes
acuáticos (Soto et al 2008). En Rhinella spinulosa, por ejemplo, los eventos reproductivos están
asociados a la temporalidad de las pozas donde se desarrollan sus larvas. Para esta especie, los
sitios con pozas o cursos de agua permanentes en la zona norte de Chile promueven una mayor
continuidad de su ciclo reproductivo en comparación con la zona central, donde se observa
reproducción sólo en la época estival debido a la marcada estacionalidad de esta zona (Soto et al
2008). Pero, además, tanto en la zona norte como centro de Chile, la temperatura del agua es el
factor que más influye en el crecimiento y tamaño que alcanzan a la metamorfosis las larvas de
esta especie (ver Benavides 2003).
Adaptación local a la temperatura en anfibios
En ectotermos, la temperatura ha sido descrita como un factor determinante asociado con
adaptación local (Smith-Gill & Berven 1979). La evidencia de los estudios sugiere que larvas
mantenidas a temperaturas bajas retardan su diferenciación e incrementan su tamaño estadoespecífico, resultando en períodos prolongados de desarrollo larval comparado con congéneres
que crecen a temperaturas mayores. De esta manera, se espera que haya diferencias en los rasgos
fisiológicos, morfológicos y de historia de vida entre poblaciones que viven en ambientes
térmicamente contrastantes. Al respecto, Chen et al (2001) describieron diferencias en la
fenología3 y fisiología del anuro Buergeria japonica. Estos autores compararon poblaciones de
3
La fenología es la secuencia temporal de eventos, a menudo referida a los cambios estacionales en la vocalización
y reproducción de adultos y la presencia de larvas (McDiarmid & Altig 1999).
9
ambientes geotérmicos (35 ºC) y arroyos (23 ºC), reportando diferencias en la fenología y en la
fisiología térmica larval, donde la población del ambiente termal evidencia reproducción continua
y una mayor tolerancia de las larvas a temperaturas altas (40 ºC). Asimismo, Olsson & Uller
(2003) reportaron una alta mortalidad de larvas de Rana temporaria de una región cálida
sometidas a temperaturas bajas, comparado con individuos procedentes de una región más fría.
Por último, Castañeda et al (2006) evaluaron el efecto de la temperatura y la dieta sobre la
plasticidad intestinal en larvas de Calyptocephalella gayi, donde se evidenció que la temperatura
tiene un efecto significativo sobre la longitud del tracto intestinal. En conclusión, los resultados
aquí plasmados son evidencia de que la adaptación local a la temperatura es un fenómeno ubicuo,
que puede ser estudiado en distintas especies de anfibios.
Si bien existe un importante cúmulo de evidencia de variación geográfica en caracteres
morfológicos, conductuales y de historia de vida, pocos estudios han examinado las bases
genéticas de esta variación (Merilä et al 2000, Morrison & Hero 2003, Crispo 2008); mientras
que aquellos que han evaluado comparativamente la existencia de atributos genéticos,
morfológicos y de historia de vida en la misma especie son aún más escasos (Laurila et al 2002,
Laugen et al 2002, 2003a, b). Estos estudios se han llevado a cabo fundamentalmente en Rana
temporaria, un anuro con amplia distribución en Europa y el noroeste de Asia, y cuyas
poblaciones presentan variación geográfica altitudinal y latitudinal. Un patrón similar se puede
observar en Rhinella spinulosa, un anuro con amplia distribución en Chile, el cual también
presenta variación geográfica en sus poblaciones.
Rhinella spinulosa como modelo experimental
Rhinella spinulosa Wiegmann, 1834 (Anura: Bufonidae) es un anfibio con una amplia
distribución geográfica, que va desde el altiplano peruano-boliviano hasta las laderas orientales y
occidentales de la Cordillera de los Andes en Chile y Argentina (Cei 1962). En Chile, esta
especie se distribuye entre los 17º30’ y 41º30’ latitud sur, con poblaciones que van desde el nivel
del mar (e.g., localidad de Azapa; Arica) hasta los 4.500 metros de altitud (Angulo et al 2010).
Esta distribución nos permite encontrar adultos y larvas de esta especie viviendo en ambientes
heterogéneos, con temperaturas del agua que oscilan, por ejemplo, entre los 25 ± 1 ºC (géiseres
de El Tatio, 4.450 msnm; Antofagasta), a 5-30 ºC (poblado de Farellones, 2.233 msnm; Santiago).
Estos antecedentes han permitido realizar estudios poblacionales en R. spinulosa, pudiéndose
10
evidenciar variación geográfica, tanto en caracteres morfológicos y de historia de vida
(Benavides 2003, Méndez & Correa-Solis 2009, Márquez-García et al 2009 y 2010), como en los
patrones de diferenciación genética (Méndez et al 2004, Correa et al 2010).
Los análisis filogeográficos de las poblaciones de R. spinulosa evidencian estructuración genética
a lo largo de su distribución. Méndez et al (2004), utilizando marcadores nucleares RAPDs,
encontraron altos niveles de diferenciación morfológica y genética en 10 poblaciones distribuidas
en el norte (e.g., El Tatio) y centro (e.g., Farellones) de Chile. Además, estos autores propusieron
que las condiciones abióticas locales, especialmente la temperatura del agua, podrían explicar la
divergencia morfológica de los adultos observada en individuos de la población de El Tatio, que
representa un extremo en la variación morfológica observada para esta especie. Por su parte,
Correa et al (2010) investigaron la variación genética de 38 poblaciones que representan a la
distribución del extremo norte de Chile. El análisis de la región control mitocondrial permitió
diferenciar tres haplogrupos. De los dos haplogrupos meridionales (II Región), el más norteño (al
igual que el haplogrupo septentrional; XV y I Región) mostró una baja estructura filogeográfica,
con haplotipos ampliamente distribuidos (e.g., El Tatio, Catarpe, Vilama, entre otras). Estos
resultados muestran que existe un patrón filogeográfico característico para esta especie.
Respecto a estudios de variación en los atributos de historia de vida en R. spinulosa, e igual que
en la mayoría de los anfibios, la temperatura del agua es considerada uno de los principales
factores que inciden en estos rasgos, incluidos la morfología y la fisiología larvaria (Soto et al
2008). Así, por ejemplo, Benavides (2003) evaluó el efecto de la procedencia geográfica y la
variación de la temperatura sobre el tamaño a la metamorfosis en cuatro localidades chilenas de
este anuro (tres poblaciones del extremo norte de la distribución, incluida El Tatio, más la
población de Farellones en Chile central). Este autor no encontró diferencias en las temperaturas
máximas a las que están expuestas naturalmente las larvas en las distintas localidades evaluadas,
siendo la excepción la localidad de El Tatio, que no presenta oscilación térmica diaria ni
estacional. Para Benavides, los resultados de los experimentos de jardín común sugieren que la
temperatura es la variable más influyente en el crecimiento y tamaño que alcanzan las larvas a la
metamorfosis, ejerciendo su influencia a través de la modificación de la tasa de desarrollo (e.g.,
Benavides postula: “bajo el efecto global de la temperatura, se ejercerían los efectos de otros
factores como la densidad y la dieta”). Además, estos experimentos muestran que en las larvas no
existe compensación al aumento de la temperatura, siendo la tasa metabólica de éstas
11
permanentemente alta durante esta etapa de desarrollo, y que la temperatura ejerce un efecto
positivo sobre la capacidad de asimilar los alimentos. Benavides también encontró que los
tamaños a la metamorfosis que alcanzan las larvas de diferentes orígenes geográficos resultan
distintos, siendo las larvas de El Tatio las que alcanzan los mayores tamaños. Este resultado fue
valido tanto para un régimen constante de temperatura (El Tatio, 25 ºC), como para uno variable
que presenta oscilación térmica (situación que simula el régimen térmico para todas las otras
localidades estudiadas, 15-25 ºC). Por consiguiente, estos resultados sugieren que entre las
poblaciones de R. spinulosa pueden haber diferencias en atributos fisiológicos, y estas diferencias
posiblemente determinarán el desarrollo y crecimiento de las larvas y el tamaño de los adultos.
Más recientemente, Méndez & Correa-Solis (2009), en un experimento de jardín común,
documentaron la existencia de variación en los caracteres de historia de vida de dos poblaciones
térmicamente contrastantes de R. spinulosa (El Tatio y Farellones). A estos autores les interesaba
evaluar si la temperatura alta y constante, a la que larvas de El Tatio están expuestas naturalmente,
produce diferencias en los rasgos de historia de vida, y si esto implica ocurrencia de variación
morfométrica (medida en individuos postmetamórficos), comparada con larvas de Farellones, que
viven en un hábitat con diferentes regimenes térmicos. En ambas poblaciones, la supervivencia y
la tasa de crecimiento fueron mayores a temperaturas más altas, mientras que hubo una
divergencia en la tasa de crecimiento y la edad a la metamorfosis en función del origen
geográfico y la temperatura. Este estudio sugiere que larvas de El Tatio, provenientes de un
ambiente termal (25 ºC), mantenidas en laboratorio a 20 ºC, retardan su diferenciación corporal
temprana, incrementan su tamaño estado-específico y despliegan períodos prolongados de
desarrollo, e incluso presentan una mayor tasa de mortalidad, comparados con hermanos
completos que crecen a una temperatura de 25 ºC. Así, estos resultados dan cuenta de la
adaptación local a la temperatura por parte de la población de El Tatio.
Por su parte, Márquez-García et al (2009 y 2010), en un experimento natural y de campo,
respectivamente, evaluaron los efectos de la desecación de pozas sobre los rasgos morfológicos y
de historia de vida de R. spinulosa en la población de Farellones. En el “Experimento Natural”,
Márquez-García et al (2009) no observaron diferencias significativas en la temperatura promedio
o en las fluctuaciones de temperatura diaria entre los niveles de desecación de las pozas, por lo
que estos autores descartan el efecto de la temperatura como un factor relevante para los atributos
estudiados. Sin embargo, en el “Experimento de Campo”, Márquez-García et al (2010)
12
reportaron que pozas con nivel de desecación alto registraron una temperatura promedio mayor
que pozas con nivel de desecación bajo. En este estudio se documentó una correlación
significativa entre la oscilación térmica y la edad a la metamorfosis, pero que para el tamaño a la
metamorfosis no resultó ser así. Esto evidencia que las larvas de Farellones provenientes del
tratamiento de desecación alto, aceleraron el desarrollo y alcanzaron la metamorfosis a una
menor edad respecto a las larvas provenientes del tratamiento de desecación bajo, por lo que la
temperatura se muestra como un factor que acelera la metamorfosis.
En conclusión, Rhinella spinulosa es un anuro que exhibe variación geográfica a lo largo de su
distribución geográfica en Chile, generando así múltiples oportunidades para estudiar adaptación
local. Por lo tanto, esta especie resulta ser un modelo experimental apropiado para explorar la
variación morfológica y genética entre poblaciones que habitan ambientes térmicamente
contrastantes. Si bien, los estudios aquí reportados (i.e., Benavides 2003, Márquez-García et al
2009 y 2010, Méndez & Correa-Solis 2009) han evaluado esta variación, todos ellos han dejado
preguntas abiertas respecto a cuáles son los agentes causales del proceso de adaptación, como por
ejemplo ¿cuántos y cuáles son los genes involucrados en la adaptación a la temperatura? Además,
experimentos de jardín común y herramientas moleculares de última generación parecen ser
metodologías apropiadas para avanzar en la búsqueda de los genes involucrados en estas
respuestas adaptativas, más aún cuando no se han generado datos, tanto en condiciones naturales
como de laboratorio, acerca de los genes candidatos de la adaptación local a la temperatura.
III. Aproximaciones genómicas para evaluar adaptación local
En los párrafos precedentes se ha documentado la existencia de los estudios que han
evaluado adaptación local en ambientes particulares, no obstante, los fundamentos genéticos que
subyacen a tales respuestas adaptativas aún no se han dilucidado. Por ende, se hace necesario
identificar aquellos genes que determinan este tipo de respuesta y así comenzar a develar una
serie de interrogantes evolutivas. Para responder a estas preguntas, un requisito previo es poder
identificar los genes que influyen en los rasgos de importancia evolutiva, pero también, éstas
deben ser analizadas en un número de organismos que incluya y se extienda más allá de los
organismos modelos tradicionales, representando así a diversos grupos taxonómicos y distintas
historias de vida evolutiva. Como lo advierte Gracey & Cossins (2003), el grueso de estas
13
investigaciones debería centrarse en organismos no-modelo, ya que muchas de las preguntas
esenciales en biología evolutiva no pueden abordarse únicamente usando organismos modelo4.
Aun cuando los organismos modelo han sido instrumentos que han permitido generar
conocimientos elementales en los mecanismos genéticos y evolutivos, ellos solo representan una
pequeña fracción de la biodiversidad total (Lee & Mitchell-Olds 2006).
Los estudios en los cuáles se intenta aplicar técnicas genómicas a especies silvestres, como
aquellos que abordan preguntas asociadas a dilucidar los mecanismos de adaptación local, tienen
como fin último identificar blancos genéticos (genes candidatos) de selección. En la búsqueda de
genes candidatos, los esfuerzos se centran en el estudio de un conjunto de genes que se sabe están
involucrados en una vía que afectan el fenotipo. Posteriormente, la secuenciación del gen (o los
genes) en individuos con fenotipos divergentes permitiría identificar, por ejemplo, mutaciones
asociadas con variación adaptativa, o bien, proponer genes candidatos de selección en un
subconjunto de genes que muestren cambios en su expresión génica (Stapley et al 2010).
Aunque la identificación de genes candidatos de selección es inherentemente dificultosa, ya que
rasgos específicos son controlados por regiones relativamente pequeñas dentro de vastos
genomas (Lee & Mitchell-Olds 2006), cambios en los patrones de expresión génica podrían ser
usados para explorar genes candidatos involucrados en adaptación local. Por ejemplo, en un
experimento con dos poblaciones de la planta Boechera holboellii, Knight et al (2006)
documentaron las bases genéticas de la adaptación local a la tolerancia a la sequía. Estos autores
encontraron diferenciación genética a la perdida hídrica por transpiración, reportando una mayor
eficiencia del uso de agua en genotipos adaptados a la sequía. Además, ellos examinaron los
perfiles de expresión génica en respuesta al estrés hídrico mediante la técnica de cDNA-AFLP,
pudiendo identificar genes candidatos de expresión diferencial (e.g., genes involucrados en
procesos de transducción de señales, de regulación transcripcional, de regulación redox, y de
estrés oxidativo). Sin embargo, también existen otras herramientas para analizar los genomas o
transcriptomas de los individuos en búsqueda de genes candidatos a adaptación, como lo es la
novedosa tecnología de “Secuenciación High-Throughput”.
4
Los organismos modelo tienden a poseer tiempos cortos de generación, distribución geográfica cosmopolita y
estrategias de vida generalistas bajo diversas condiciones ambientales. Como tal, los estudios que utilizan sistemas
modelo tienden a excluir a las especies adaptadas localmente y endémicas raras, a los parásitos y simbiontes, y a las
especies con historias de vida complejas o largos tiempos de generación (Lee & Mitchell-Olds 2006).
14
Herramientas de secuenciación masiva en estudios evolutivos
La Secuenciación de Próxima Generación (NGS, del inglés “Next Generation
Sequencing”), también conocida como Secuenciación Masiva o de Alto Rendimiento (“HighThroughput”), posee un gran potencial para generar recursos genómicos en cualquier organismo,
en orden a investigar las bases genéticas de la adaptación (Stapley et al 2010). Varias tecnologías
muy diferentes constituyen la NGS, cada una con su propio conjunto de características (e.g.,
Roche 454, Illumina/Solexa, ABI SOLiD, Helicos tSMS [para detalles técnico-metodológicos y
aplicaciones de estas plataformas revisar Metzker 2010 y Ekblom & Galindo 2011]). Todas ellas
producirán enormes cantidades de datos de secuencia o reads5, que para propósitos de ensamblaje
y anotación funcional (Wheat 2010), deberán ser alineados contra un genoma de referencia
conocido, o bien, ser ensamblados de novo (ver Pop & Salzberg 2008, Trapnell & Salzberg 2009,
Chaisson et al 2009), por lo que contar con una especie de “referencia genómica y/o
transcriptómica” ya no es una limitante tecnológica (e.g., Li et al 2010, Elmer et al 2010).
En estudios de especiación ecológica, por ejemplo, se han utilizado escaneos genómicos para
encontrar regiones genómicas que evidencien flujo génico reducido entre poblaciones o especies
divergentes (i.e., detección de loci outliers). Al respecto, Galindo et al (2010) llevaron a cabo un
escaneo genómico basado en ESTs empleando secuenciación 454 en dos ecotipos divergentes del
gastrópodo marino Littorina saxatilis. Con esta aproximación lograron detectar 40 loci outliers de
2.454 SNPs dentro de 572 contigs 6 analizados. La anotación funcional de los contigs que
contienen a los SNP outliers mostraron que estos incluyen proteínas musculares y de matriz de la
concha, proteínas involucradas en el metabolismo energético y transcriptasas reversas. Por otra
parte, Turner et al (2010) proponen que una manera adecuada de mapear la variación genómica
funcional y revelar las bases genéticas de la adaptación local es asociar la frecuencia alélica del
genoma con condiciones ambientales particulares. Ellos investigaron la adaptación local de
Arabidopsis lyrata a suelos serpentinos (i.e., suelos caracterizados por un alto contenido de
metales pesados y bajas razones de calcio/magnesio) y mapearon los polimorfismos responsables
de tal adaptación. Para tal efecto, emplearon DNA grupal de individuos de suelos serpentinos y
5
read: pieza corta e individual de secuencia resultante de una plataforma NGS (Ekblom & Galindo 2011).
6
contig: conjunto de lecturas o reads NGS que están superpuestas y que conforman un tramo mayor de una
secuencia génica (Ekblom & Galindo 2011).
15
no-serpentinos, y los secuenciaron en un analizador genómico Illumina. Los polimorfismos que
se asocian más fuertemente al tipo de suelo están enriquecidos en loci de detoxificación de
metales pesados y de transporte de calcio y magnesio.
Como se puede apreciar en estos estudios, la tecnología NGS es una herramienta útil en la
búsqueda e identificación de genes candidatos de selección, por lo que se visualiza como una
aproximación eficaz en estudios genómicos (o transcriptómicos) de la adaptación local.
Aproximaciones genómicas en estudios de adaptación local en anfibios
Una búsqueda bibliográfica en el sitio ISI Web of KnowledgeSM (Thomson Reuters, agosto
de 2013) sobre “genes candidatos de adaptación local en anfibios” dio como resultado sólo
dos reportes relacionados. En el primero de ellos, Bonin et al (2006) realizaron un barrido
genómico exploratorio en Rana temporaria, basado en 392 marcadores AFLP, para detectar loci
candidatos para adaptación en un gradiente altitudinal. En total, ocho loci outliers fueron
identificados como potenciales candidatos involucrados en adaptación a la altitud. En el segundo,
Richter-Boix et al (2011) realizaron un análisis genético de diferenciación entre sitios de
reproducción de Rana arvalis (estudios previos habían mostrado el valor adaptativo de la
diferenciación genética a escala local en rasgos de historia como el período larval o la tasa de
crecimiento). Estos autores emplearon marcadores Microsatélites para medir la diferenciación
genética entre 17 poblaciones de R. arvalis, encontrando que un locus genético (RC08604) se
desvió de las expectativas neutrales. Tal hallazgo sugiere que éste locus es un buen candidato
para selección direccional (i.e., gen candidato para adaptación local). Interesantemente, el locus
RC08604 está localizado parcialmente dentro de un gen para el receptor de la hormona tiroidea
(TRβ), y está sobre-regulado, coordinando la expresión de otros genes durante la metamorfosis.
Respecto a estudios de expresión génica diferencial, la mayoría de ellos corresponden a reportes
de diferencias encontradas en “genes individuales” y en “especies de laboratorio”, como en el
caso de la regulación de la expresión de proteínas de estrés térmico (“heat-shock proteins”) en
embriones de Xenopus laevis expuestos a temperaturas elevadas (hsp30, Heikkila 2004), o en
fibroblastos de Rana catesbeiana bajo estrés térmico inducido (hsp30, Mulligan-Tuttle &
Heikkila 2007), o en la expresión inducible tejido-específico en embriones de Rana lessonae
(hsp70, Simoncelli et al 2010). Sin embargo, en poblaciones silvestres de anfibios, los estudios a
16
nivel transcripcional de genes involucrados en la respuesta a heterogeneidad ambiental térmica
son reducidos. Por ejemplo, en Rana temporaria se evaluó la existencia de variación geográfica
en la tolerancia al calor y en los niveles de expresión de la proteína Hsp70 para tres poblaciones,
a lo largo de 1.500 km de gradiente latitudinal en Suecia (Sørensen et al 2009). Este estudio
muestra que la tolerancia a la temperatura de las larvas recién eclosionadas no difirió entre
poblaciones, pero sí toleraron las altas temperaturas de estrés mejor que las larvas de dos semanas
de edad. Entre las larvas de dos semanas de edad, la población del sur (Skåne) toleró mejor una
temperatura de 32 ºC que las larvas de las otras dos poblaciones. Paralelamente, se encontró una
diferencia en la expresión de Hsp70, en la cual la población de Skåne evidenció el nivel de
expresión más alto para esta proteína. Sin embargo, a una temperatura muy estresante (36 ºC), la
población del norte (Lappland) mostró mayor tolerancia térmica. En este estudio, el posible papel
adaptativo de Hsp70 para la tolerancia térmica y la adaptación climática en larvas de R.
temporaria no fue concluyente, pero evidenció que las diferencias interpoblacionales en los
niveles de expresión de Hsp70 sí existen. Además, estos autores proponen que las condiciones
locales, la adaptación local y la ontogenia, podrían jugar un papel importante en la tolerancia
térmica y en la expresión de las proteínas HSP en las larvas de R. temporaria.
En conclusión, en anfibios existen pocos estudios en los que se ha examinado el papel de genes
candidatos en la adaptación local. Los estudios realizados ilustran el potencial que tiene la
inspección de todo el genoma para revelar señales de selección a través de gradientes de
selección, donde, por ejemplo, la asociación entre ambientes variables y rasgos relacionados al
fitness y a mecanismos de adaptación local puede ser compleja.
IV. Fenotipos de Rhinella spinulosa para la heterogeneidad térmica
Los antecedentes sobre variación poblacional en el anuro Rhinella spinulosa aquí
entregados se pueden resumir en los siguientes puntos:
1) A nivel genético-poblacional, se evidencia una extraordinaria variación morfológica a lo largo
de un gradiente latitudinal, donde algunas poblaciones no muestran divergencia genética (e.g., El
Tatio y Catarpe; norte de Chile), mientras que otras si la presentan (e.g., Farellones; centro de
Chile) (Méndez et al 2004, Correa et al 2010). Estos estudios sólo han caracterizado
genotípicamente a las distintas poblaciones de esta especie, no registrándose a la fecha datos
17
genéticos que asocien estos genotipos con los diferentes fenotipos observados (e.g., genes que
exhiban cambios en sus niveles de expresión).
2) A nivel de rasgos morfológicos y de historia de vida, experimentos de jardín común han
permitido caracterizar la variación existente en los atributos de historia de vida (e.g.,
supervivencia, edad, tamaño y tasa de crecimiento) y en las características morfológicas (e.g.,
tamaño corporal) de individuos postmetamórficos de diferente procedencia geográfica, que han
sido expuestos a temperaturas diferenciales (Benavides 2003, Méndez & Correa-Solis 2009,
Márquez-García et al 2009 y 2010). Esta información muestra que los individuos
postmetamórficos de R. spinulosa, de las poblaciones evaluadas, presentan tasas de crecimiento
más altas a 25 ºC que a 20 ºC. Además, los postmetamórficos de la localidad de El Tatio exhiben
un tamaño mayor a la metamorfosis, tanto a 20 ºC como a 25 ºC, pero también registran un
tiempo a la metamorfosis mayor y una mortalidad alta cuando son evaluados a 20 ºC. Esto indica
que las larvas de El Tatio, al crecer y desarrollarse fuera de su hábitat natural (25 ºC), tienen
dificultades para adaptarse a un nuevo ambiente térmico.
3) Respecto a la heterogeneidad ambiental de las poblaciones caracterizadas, la población de El
Tatio, un extremo en la variación morfológica de R. spinulosa (son los adultos más pequeños de
toda la distribución), presenta eventos reproductivos anuales en un ambiente térmico estable (25
± 1 ºC), respecto a otras poblaciones geográficamente cercanas, como por ejemplo la población
de Catarpe (a aproximadamente 100 km de distancia), la que evidencia reproducción temporal en
un gradiente térmico anual (10-20 ºC). Además, estas dos poblaciones (El Tatio y Catarpe)
divergen genotípica y fenotípicamente de la población de Farellones (separada por más de 1.700
km de distancia), la que evidencia eventos reproductivos marcadamente estacionales en cuerpos
de agua que presentan desecación estival y un amplio gradiente térmico diario (5-30 ºC).
Si bien las poblaciones de R. spinulosa se encuentran caracterizadas, tanto a nivel genotípico
como a nivel de rasgos morfológicos y de historia de vida (como el caso de El Tatio y Farellones),
aún no se propone una explicación a nivel molecular para explicar las diferencias detectadas en el
tamaño y la edad a la metamorfosis entre estas poblaciones. Al respecto, Benavides (2003)
postula que podría ser una consecuencia de los efectos diferenciales de la temperatura sobre el
metabolismo y crecimiento de las larvas de las diferentes localidades geográficas. Por su parte,
Méndez & Correa-Solis (2009) sugieren que la variación entre las poblaciones no sólo responden
18
a los gradientes latitudinales, sino también puede reflejar las condiciones ambientales locales que
cada población experimenta. De todas maneras, estas hipótesis siguen siendo preguntas abiertas
que aun deben ser resueltas.
Para avanzar en la comprensión de la respuesta genética que existe en la adaptación local, hoy
contamos con novedosos recursos genéticos (e.g., bases de datos públicas para genomas y
transcriptomas) y tecnologías moleculares de alto rendimiento (i.e., NGS), que nos permitirían
explorar e identificar a los posibles genes candidatos involucrados en este proceso, y así no tener
que consumir esfuerzos en la búsqueda individual de éstos (i.e., “explorar gen por gen”). Por esta
razón, el presente proyecto de tesis doctoral se centra en abordar un estudio transcriptómico
(RNA-Seq) en individuos de tres poblaciones de R. spinulosa, incluida la población de los
géiseres de El Tatio, para identificar a los genes diferencialmente expresados en la adaptación
local a la temperatura.
19
HIPÓTESIS
El proceso de adaptación local a la temperatura en individuos de Rhinella spinulosa, de
poblaciones que habitan ambientes térmicamente contrastantes, está regulado por la expresión
diferencial de genes que ocurre durante el crecimiento y desarrollo larval.
Predicción 1: En larvas provenientes de El Tatio, Catarpe y Farellones, existirá una diferencia en
sus perfiles transcriptómicos, y
Predicción 2: Esta diferencia de los perfiles transcriptómicos será mayor en la población de los
géiseres de El Tatio.
OBJETIVO GENERAL
Comparar la respuesta transcriptómica, y proponer genes candidatos, del proceso de
adaptación local a la temperatura, en larvas y metamórficos de Rhinella spinulosa de las
poblaciones de El Tatio, Catarpe y Farellones.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Analizar el efecto de la temperatura (20 y 25 ºC) sobre postmetamórficos de Rhinella
spinulosa, respecto a la expresión de cuatro rasgos de historia de vida: supervivencia, edad y
tamaño a la metamorfosis, y tasa de crecimiento.
2. Analizar la respuesta transcriptómica de la exposición térmica diferencial (20 y 25 ºC) en
larvas y metamórficos de Rhinella spinulosa.
3. Proponer genes candidatos implicados en la adaptación local a la temperatura en Rhinella
spinulosa.
20
METODOLOGÍA
1. Recolección de huevos de Rhinella spinulosa
El período reproductivo de Rhinella spinulosa varía con la altitud y la latitud, y se
correlaciona con la temperatura y las precipitaciones (Veloso et al 1982). En los géiseres de El
Tatio (localizados 97 km al nororiente de San Pedro de Atacama, II Región), la reproducción
ocurre durante todo el año, en arroyos termales cuya temperatura media diaria se mantiene
constante (25 ± 1 ºC). En la localidad de Catarpe (8 km al norponiente de San Pedro de Atacama),
los eventos reproductivos suceden entre los meses de Mayo y Septiembre, en pozas permanentes
sujetas a variación térmica (20 ºC al medio día y 10 ºC en la noche). En contraste, en la localidad
de Farellones (32 km al nororiente de Santiago), la reproducción toma lugar solo en primavera
(Septiembre-Octubre), en pozas temporales en que la temperatura del agua varía de 30 ºC al
mediodía, a 5 ºC en la noche.
Para implementar un experimento de jardín común, se efectuaron visitas a las localidades
establecidas como sitios de muestreo (previamente georeferenciados; ver Figura 1): El Tatio
(22º20’10’’S, 68º00’59’’O, 4.264 msnm), Catarpe (22º50’02’’S, 68º11’55’’O, 2.460 msnm) y
Farellones (33º21’02’’S, 70º18’59’’O, 2.331 msnm). En estos sitios, entre Octubre de 2010 y
Agosto de 2011, se recolectaron diez puestas por localidad (aprox. 500 huevos por puesta). Los
huevos se transportaron hasta las dependencias del laboratorio de Genética y Evolución (Facultad
de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago). El transporte fue hecho en neveras, donde las
puestas fueron colocadas en agua, previamente oxigenada por aireación por 5 horas, y a baja
temperatura para asegurar la viabilidad de los embriones.
2. Experimento de jardín común
El experimento de jardín común se llevó a cabo en una cámara climatizada de ambiente
controlado (i.e., temperatura, fotoperíodo, bombas para la aireación del agua, extractores de
humedad; ver Figura 2), localizada en la Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. En esta
cámara, los huevos eclosionados de Rhinella spinulosa se cultivaron hasta que alcanzaron el
estadio de desarrollo larval 25 de Gosner (Gosner 1960), que fue el estadio inicial para montar el
experimento de jardín común. Durante todo el experimento, las larvas fueron alimentadas con
lechuga cocida ad libitum y el agua de las cajas fue cambiada dos veces por semana. Dado que la
21
reproducción sucede diferencialmente en las tres localidades, los experimentos fueron realizados
continuamente entre los años 2010 y 2011.
Figura 1. Fotografías y sitios de muestreo georeferenciados de Chile, donde se realizaron las
recolecciones de las puestas de Rhinella spinulosa (cordones de huevos, tipo “rosario”). Región de
Antofagasta: Géiseres de El Tatio (arroyos de aguas termales permanentes, de 25 ± 1 ºC) y Valle de
Catarpe (arroyos permanentes, a un costado del lecho del Río San Pedro, con gradiente térmico anual de
10-20 ºC). Región Metropolitana: Farellones (arroyos y pozas temporales, producto de los deshielos
primaverales, que presentan desecación estival y un amplio gradiente térmico diario de 5-30 ºC).
El experimento consistió en un diseño factorial para dos temperaturas (20 y 25 ºC) y tres
localidades (El Tatio, Catarpe y Farellones) (ver Figura 3). Se utilizaron estos dos factores,
considerando que los individuos de El Tatio habitan un ambiente térmico estable (25 ± 1 ºC) y
evidencian adaptación local a la temperatura. Estos individuos, al ser expuestos de manera
continua a otra temperatura (e.g., 20 ºC), han evidenciado diferencias significativas en sus
22
atributos morfológicos y de historia de vida (Benavides 2003, Méndez & Correa-Solis 2009). Por
otra parte, la población de Catarpe, aunque exhibe variación fenotípica respecto a la de El Tatio,
no presenta diferenciación genotípica en relación a El Tatio. Finalmente, la población de
Farellones si evidencia diferenciación genotípica y fenotípica respecto a El Tatio y Catarpe
(Méndez et al 2004, Correa et al 2010). Otro aspecto a considerar es que las poblaciones de
Catarpe y Farellones habitan ambientes térmicos variables, con una clara variación diaria en las
temperaturas del agua. Por lo tanto, estas dos poblaciones corresponderían a localidades “control”
en el experimento de jardín común y en la evaluación de la respuesta diferencial de la expresión
génica en la adaptación local a la temperatura.
Figura 2. La fotografías muestran: a) Una puesta (= una familia) de R. spinulosa; b) Larvas eclosionadas
y cultivadas hasta el estadio de desarrollo 25 de Gosner; c) Detalle de un conjunto de cajas de agua, cada
una con sólo una larva de R. spinulosa; y d) Sistema de aireación de una sección de la cámara climatizada,
donde se observan bombas de aireación, distribuidores de aire y cajas con larvas siendo aireadas. También
se observa un esquema (e) en el que se muestran las condiciones de cultivo de cada larva por caja.
23
Dado que la cámara climatizada mantiene una temperatura constante de 20 ºC, la condición
térmica de 25 ºC se generó empleando piscinas de agua, ubicadas dentro de la cámara, que
contenían calefactores eléctricos sumergibles con termostato. Con el fin de obtener muestras para
análisis de rasgos de historia de vida y para secuenciación transcriptómica y expresión génica,
para cada temperatura y localidad, se utilizaron familias de hermanos completos. El experimento
de jardín común se inició con larvas en estadio Gosner 25, las que se mantuvieron bajo las
condiciones térmicas señaladas hasta el estadio de desarrollo requerido para muestreo:
a) Rasgos de historia de vida: Para diez familias en total, en cada condición térmica, se
utilizaron diez réplicas. Esto implicó un total de 600 individuos (Figura 3A). Una vez que las
larvas alcanzaron el estadio de desarrollo 46 de Gosner, estas fueron sacrificadas mediante
inmersión en solución de metansulfonato de tricaína al 0,2% (p/v) (“MS-222”, Veterquímica
Ltda., Chile). Las muestras (individuos postmetamórficos) se preservaron en etanol 70%
(v/v) y se almacenaron en la Colección Herpetológica DBGUCH. Los rasgos de historia de
vida (RHV) evaluados en este experimento fueron: la supervivencia (expresado como
porcentaje), el tamaño a la metamorfosis (SVL: longitud hocico-cloaca en mm), la edad a la
metamorfosis (días) y la tasa de crecimiento (mm/día).
La supervivencia se registró para aquellos individuos que completaron la metamorfosis
(estadio 46 de Gosner). Estos datos se analizaron mediante un modelo lineal generalizado,
utilizando la prueba estadística likelihood-ratio tipo 1 (estadígrafo χ2), bajo una distribución
binomial y una función de enlace logit. La edad a la metamorfosis se estimó por exámenes
diarios de los individuos hasta que la metamorfosis fue completada. El tamaño a la
metamorfosis se determinó utilizando un estéreomicroscopio Motic® SMZ168-TP (Motic,
British Columbia, Canadá), con micrométrico ocular. Finalmente, la tasa de crecimiento se
calculó dividiendo la edad a la metamorfosis por el tamaño a la metamorfosis. Estos últimos
tres RHV fueron analizados mediante un ANOVA de dos-vías, en que los factores evaluados
fueron temperatura y localidad (dos niveles). Dado que hay datos perdidos, se utilizó el error
tipo III. Producto del interés en comparar explícitamente las respuestas de las tres
poblaciones a la temperatura (20 y 25 ºC), tanto la localidad como la temperatura se
consideraron como efectos fijos. Los valores numéricos de los RHV fueron transformados a
log10, cuando estos no cumplieron con los requisitos de homocedasticidad y normalidad.
24
Todos los análisis estadísticos fueron realizados en el programa STATISTICA v10.0
(StatSoft, Inc. 2011).
Figura 3: Esquema de un ensayo de jardín común (diseño factorial) que recrea dos condiciones de
temperatura experimental (20 y 25 ºC). Notar la presencia de una larva de R. spinulosa en estadio 25 de
Gosner por cada caja. Cada larva, en la condición de temperatura respectiva, llevará a cabo su proceso de
metamorfosis. Se muestrearon individuos completos, para cada condición térmica, familia y localidad, en
los estados de desarrollo: (A) Rasgos de historia de vida: 46 de Gosner; y (B) RNA-Seq y expresión
génica: 36 y 42 de Gosner. Para más detalles, ver texto (Metodología, sección 2, a y b).
b) RNA-Seq y expresión génica: Para tres familias en total, en cada condición térmica, se
utilizaron 25 réplicas. Esto implicó un total de 450 individuos (Figura 3B). Los muestreos
correspondieron a individuos completos de cada tratamiento, en los siguientes estadios de
desarrollo Gosner: 36 (premetamórfico) y 42 (metamórfico). Para cada estadio de desarrollo,
familia, condición térmica y localidad, se muestrearon como mínimo cinco individuos, que
25
se sacrificaron por inmersión en solución MS-222 al 0,2% (p/v). Las muestras se preservaron
en solución RNAlater (Ambion Inc., Austin, TX), y se almacenaron a -20 ºC hasta la
posterior extracción de RNA.
3. Obtención de RNA para análisis de secuenciación transcriptómica
El aislamiento de RNA se realizó a partir de individuos completos de Rhinella spinulosa
provenientes del experimento de jardín común, de los estadios 36 y 42 de Gosner. Para proceder
con la secuenciación transcriptómica (RNA-Seq), el RNA aislado debe tener una alta calidad y
estar libre de contaminación con DNA genómico (gDNA), requisito que se abordó mediante un
kit comercial ad-hoc. Se utilizaron 36 muestras en total, correspondientes a 18 larvas por estadio
de desarrollo (36 y 42 de Gosner), para las dos condiciones térmicas (20 y 25 ºC), y
pertenecientes a las tres localidades empleadas (tres réplicas por condición experimental, de un
total de 12 condiciones experimentales) (Figura 4).
Se extrajo RNA total mediante el RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA), de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Se utilizaron 40-70 mg de tejido larval total previamente estabilizado
en solución RNAlater (Ambion). A este tejido se le agregó 350 μl de una mezcla de búfer de lisis
y β-mercaptoetanol. La disrupción y homogeneización del tejido se llevó a cabo mediante un
sistema de rotor Tissue Master 125 (OMNI International, Kennesaw, GA), en ciclos de 15 a 20
segundos. Posteriormente, el lisado se centrifugó a 18.000 rpm por 3 min a 23 ºC, y se descartó el
sedimento. El sobrenadante se recuperó y se le adicionó 350 μl de etanol 70% (v/v). Luego se
tomaron 700 μl de esta mezcla y se cargaron en una minicolumna. Se centrifugó a 10.000 rpm
por 15 s a 23 ºC, y se descartó el flujo. Para eliminar contaminación por gDNA, se realizó una
digestión con DNasa I (QIAGEN) en la minicolumna: primero se lavó la minicolumna agregando
350 μl de búfer RW1, se centrifugó a 10.000 rpm por 15s a 23 ºC, y se descartó el flujo; luego se
adicionó 80 μl de una mezcla de incubación de DNasa I y se incubó a 25 ºC por 15 min; se lavó
agregando 350 μl de búfer RW1 y se centrifugó a 10.000 rpm por 15s a 23 ºC; posteriormente se
agregó 500 μl de búfer RPE y se centrifugará a 10.000 rpm por 15s a 23 ºC, y se descartó el flujo;
luego se agregó 500 μl de búfer RPE y se centrifugó a 10.000 rpm por 3 min a 23 ºC. Para secar
la minicolumna se realizó una centrifugación a 10.000 rpm por 15 s a 23 ºC. Una vez seca, la
minicolumna se colocó en un tubo de 1,5 ml, se adicionó 50 μl de agua libre de RNasas y se
centrifugó a 10.000 rpm por 1 min a 23 ºC para eluir el RNA. Finalmente, el eluido se cargó
26
nuevamente en la minicolumna y se centrifugó para aumentar la concentración final de RNA. La
calidad y cantidad de RNA total fue examinada en un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000
(NanoDrop products, Wilmington, DE), mientras que su integridad se evaluó mediante
electroforesis denaturante en geles de agarosa-formaldehído al 1% (p/v). Las muestras de RNA se
almacenaron a -80 ºC para ser utilizadas en análisis posteriores.
Figura 4. Número de muestras totales de individuos de R. spinulosa (dos estadios de desarrollo, tres
localidades y dos temperaturas experimentales) para extracciones de RNA, que derivaron a los
experimentos de secuenciación transcriptómica (RNA-Seq). Notar que la condición experimental
‘TAT20G36’ significa ‘individuo de El Tatio, expuesto a 20 ºC, y en estadio de desarrollo 36 de Gosner’
(ídem para el resto de las 11 condiciones experimentales).
4. Construcción de las bibliotecas de cDNA y secuenciación Illumina
Para realizar el experimento RNA-Seq, todas las muestras de RNA se estandarizaron a
100 ng/μl. Luego, se tomaron volúmenes iguales de estas muestras y se combinaron para producir
12 pools (mezclas equimolares), cada uno representando por dos individuos (un individuo por
familia, dos familias en total) de un único estadio de desarrollo (36 o 42 de Gosner), condición
térmica (20 o 25 ºC) y localidad (El Tatio o Catarpe o Farellones).
Aproximadamente diez μg totales de RNA de cada pool fueron precipitados en 0,1 volúmenes de
acetato de sodio 3M (pH 5,2) y 2,2 volúmenes de etanol 100% frío, para ser enviados a la
División NGS de Macrogen Inc. (Seoul, Korea), con el objeto de secuenciar los transcriptomas
(12 reacciones de secuenciación). En este servicio NGS, los pools de RNA total fueron
examinados en un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). Esta
27
tecnología permite determinar la concentración de RNA y realizar un análisis de integridad del
RNA total, extrayendo información desde los RNA ribosomales (subunidades 18S y 28S), el
electroferograma y la imagen tipo-gel. Esto entrega datos sobre la calidad de la muestra de RNA
total, con valores óptimos: RIN > 8 (del inglés ‘RNA Integrity Number’) y razones de rRNA
28S/18S ≥ 2/1. Para construir las bibliotecas de cDNA, se utilizaron sólo muestras de RNA con
valores de RIN ≥ 8 y razones de rRNA 28S/18S ≥ 1,8.
Sólo el mRNA presente en cada pool fue utilizado para elaborar una biblioteca de moléculas
templado adecuadas para la generación de un posterior clúster, usando los reactivos provistos en
el Illumina® TruSeq™ RNA Sample Preparation Kit (Illumina Inc., San Diego, CA). En este
flujo de trabajo, el primer paso involucró la purificación de moléculas de mRNA, que contienen
poli-A, empleando perlas magnéticas unidas a un oligo poli-T. Luego de la purificación, el
mRNA fue fragmentado en pequeñas piezas empleando cationes divalentes bajo temperatura
elevada. Los fragmentos de mRNA clivados fueron copiados en una primera hebra de cDNA
utilizando transcriptasa reversa y random primers. A continuación, se realizó la síntesis de una
segunda hebra de cDNA usando DNA polimerasa I y RNasa H. Estos fragmentos de cDNA
pasaron a un proceso de reparación de sus extremos (la adición de una única base “A”), para
luego realizar la ligación de los adaptadores. Finalmente, los productos se purificaron y
enriquecieron mediante una PCR para crear las bibliotecas finales de cDNA, que produjeron un
tamaño de inserto de 300-500 pb. Estas bibliotecas de cDNA fueron secuenciadas paired-end,
empleando la plataforma de secuenciación Illumina HiSeq™ 2000 (Illumina Inc.). Se decidió
utilizar el sistema de secuenciación Illumina HiSeq™ 2000, pues permite correr simultáneamente
seis muestras por lane y generar altos outputs y números de reads para el procesamiento de
múltiples muestras en una sola corrida (outputs de 200 Gb y reads de longitud máxima de 2x100
pb, con niveles de calidad > 80%). Los resultados de la secuenciación (reads crudos de tamaño
de información 4-5 Gigabytes por muestra) se almacenaron en formato Fastq.
5. Filtración de datos, ensamble de novo, cuantificación de transcritos y anotación génica
Un diagrama de flujo de los procesos post-secuenciación transcriptómica se puede
observar en la Figura 5. Los procesos de trimming (limpieza de los adaptadores y de los reads
respecto a calidad y longitud) sobre el conjunto de datos completo, se realizaron mediante la
herramienta FastX (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/), manteniendo a aquellos reads de
28
longitud mayor a 50 y calidad de base mayor a 20 (>Q20). Después del proceso de trimming, el
conjunto de datos completo se ensambló de novo mediante el ensamblador Trinity (Grabherr et al
2011). El ensamblador Trinity usa la estrategia gráfica Bruijn (de Bruijn 1946) y, corre bien y
entrega muy buenos resultados con datos Illumina (ver Haas et al 2013). Estos procesos se
computaron en el cluster IBM iDataPlex (528-cores Intel® Xeon®, de 2,27 GHz, con capacidad
de 5 TeraFlops) del Centro de Modelamiento Matemático, Facultad de Ciencias Físicas y
Matemáticas, Universidad de Chile.
Figura 5. Diagrama de flujo de los procesos post-secuenciación transcriptómica. En esta secuencia, los
archivos outputs de la plataforma Illumina HiSeq™ 2000 (archivos Fastq) son los archivos inputs para el
ensamblador Trinity, previo proceso de filtración de datos (reads) por calidad y longitud (trimming).
29
Después de ensamblar un transcriptoma consenso para Rhinella spinulosa, cada biblioteca RNASeq se alineó separadamente al transcriptoma de referencia utilizando el programa TopHat
(Trapnell et al 2009), con parámetros por defecto. La prueba de expresión diferencial y el análisis
de datos se realizó empleando los programas CuffDiff (Roberts et al 2011) y cummeRbund
v.2.0.0 (Goff et al 2012), respectivamente. cummeRbund es un programa de visualización y
exploración de datos para resultados RNA-Seq CuffDiff, que permite la navegación rápida e
inferencia de información de una manera fácil.
La anotación funcional del transcriptoma consenso (predicción y anotación funcional de los
CDS) se realizó utilizando búsquedas Blast (e-value ≤ 1e-10) (Camacho et al 2009) contra las
bases de datos proteicas Uniprot, Swissprot, NR, TCDB, KEGG y PRIAM. También se hizo una
asignación de dominios usando el programa InterPro (Hunter et al 2011) y bases de datos de
dominios. Finalmente, la información se almacenó en un sitio web, construido a semejanza de la
base de datos pública de Xenopus laevis y X. tropicalis “Xenbase” (Di Genova et al 2011,
Travisany et al 2012). Los datos transcriptómicos estarán disponibles en el NCBI Sequence Read
Archive (SRA). El transcriptoma de referencia y la anotación génica estarán disponible
públicamente en el sitio web http://rhinelladb.cmm.uchile.cl/download/.
6. Clustering y clasificación de ontologías génicas
Los genes DE resultantes fueron agrupados mediante el algoritmo K-means (MacQueen
1967), y la distancia métrica, en términos de expresión (índice FPKM), fue calculada utilizando
la divergencia de Jensen-Shannon, ambos implementados en el programa cummeRbund (Goff et
al 2012). Para determinar el número correcto de clusters se utilizó el índice de Dunn (Dunn
1973). La idea fue identificar un grupo compacto de clusters, en donde exista una baja varianza
entre los miembros del cluster y, además, que éstos estén bien separados.
Con los genes DE agrupados, y utilizando el programa clusterProfiler (Yu et al 2012), se
identificaron las categorías Gene Ontology (GO) de nivel 2 sobre-representadas para los genes
DE de cada cluster. clusterProfiler utiliza una prueba hipergeométrica para identificar a las
categorías GO sobre-representadas. Para considerar una categoría GO como sobre-representada,
se utilizó un valor de FDR menor a 0,05. Los enriquecimientos GO se realizaron de manera
30
independiente, en las categorías de Componente Celular, Función Molecular y Proceso
Biológico.
7. Genes diferencialmente expresados y genes candidatos de adaptación local a la
temperatura en Rhinella spinulosa
Una búsqueda bibliográfica en el sitio ISI Web of KnowledgeSM (Thomson Reuters,
agosto de 2013) sobre “métodos para detectar genes candidatos por RNA-Seq” entregó un
total de ocho resultados relacionados. De estos reportes, sólo tres corresponden a mapeos y/o
cuantificaciones de transcriptomas (Mortazavi et al 2008 y Bonfert et al 2012) y descubrimientos
de SNPs (Cánovas et al 2010). Considerando lo anterior, en esta tesis se utilizó el método
implementado por Mortazavi et al (2008), donde la sensibilidad de la técnica RNA-Seq será una
función de la concentración molar y longitud de los transcritos.
Para la cuantificación de los transcritos se utilizó el índice FPKM (del inglés ‘Fragments per
Kilobase of exon model per Million mapped fragments’), descrito por Mortazavi et al (2008). El
FPKM es una medida de la abundancia de los transcritos, como se ve en la ecuación 1:
donde, C es el número de reads mapeados en los exones del gen, N es el número total de reads en
el experimento, y L es la suma de los exones en pares de bases (longitud). El índice FPKM refleja
la concentración molar de un transcrito en la muestra de partida normalizado por la longitud del
RNA y por el total de números de reads en la medición, facilitando así una comparación
transparente de los niveles de transcritos dentro y entre muestras.
Los genes diferencialmente expresados se obtuvieron mediante el programa CuffDiff (Roberts et
al 2011), empleando un punto de corte de 1,5 veces y un valor de FDR menor a 0,05, para las 24
comparaciones experimentales de a pares (temperatura, estadio de desarrollo y localidad). La
base de datos resultante se almacenó como un archivo cuffData.db. Dentro de los genes DE, se
buscaron perfiles de expresión similares para detectar genes candidatos, utilizando el programa
cummeRbund (Goff et al 2012) y el archivo cuffData.db. El criterio para seleccionar a los genes
candidatos se basó en encontrar una diferencia de expresión significativa entre dos condiciones
experimentales de la población de El Tatio (i.e., larvas en estadio 36, y/o 42, expuestas a 20 y 25
31
ºC). Luego, estas diferencias se compararon con las demás condiciones experimentales de a pares
de las otras dos localidades (ver Figura 6). Finalmente, se seleccionaron los genes que
presentaron esta diferencia, y aquellos que siguieron este patrón de co-expresión evidente.
Figura 6. Esquema del análisis realizado para seleccionar posibles genes candidatos de la adaptación local
a la temperatura en R. spinulosa. En este flujo metodológico, que se centró en el cambio de temperatura en
el mismo estadio de desarrollo, se realizaron inspecciones visuales de los datos (7.451 genes DE) y se
utilizó el programa cummeRbund, para detectar genes candidatos.
32
RESULTADOS
Rasgos de historia de vida
Respecto a la supervivencia (Figura 7A), el análisis por localidad evidenció que el mayor
porcentaje de supervivientes se observó en Catarpe, seguido de Farellones y El Tatio. Estas
diferencias fueron estadísticamente significativas (p = 0,000001; g.l. = 2; χ2 = 54,27291). En el
análisis por temperatura experimental, la supervivencia fue mayor a 25 ºC (para las tres
localidades evaluadas), y en el caso particular de El Tatio, un alto porcentaje de los individuos
(92%) no lograron completar la metamorfosis. Estas diferencias también fueron estadísticamente
significativas (p = 0,000542; g.l. = 1; χ2 = 11,96519). Además, la interacción temperaturalocalidad fue significativa (p = 0,000021; g.l. = 2; χ2 = 21,56544).
Figura 7. Efecto de la temperatura y la localidad geográfica en cuatro rasgos de historia de vida de
postmetamórficos de R. spinulosa, en un experimento de jardín común con tres poblaciones térmicamente
contrastantes. (A) porcentaje de supervivencia al estadio 46 de Gosner; (B) edad a la metamorfosis (días);
(C) tamaño a la metamorfosis (mm); y (D) tasa de crecimiento promedio (mm/día). Los datos representan
el promedio ± el error estándar (excepto A); los tratamientos etiquetados con letras minúsculas distintas
fueron significativamente diferentes entre sí (p < 0,05; prueba de Bonferroni).
33
Respecto a los otros tres atributos de historia de vida, la edad a la metamorfosis a 20 ºC fue
mayor para los postmetamórficos de El Tatio, mientras que a 25 ºC fue mayor para los
postmetamórficos de Catarpe (Figura 7B). Hubo un efecto de la temperatura y la localidad; la
interacción temperatura-localidad fue significativa (Tabla 1). El tamaño (SVL) a la metamorfosis
fue mayor para los postmetamórficos de El Tatio (Figura 7C), a ambas temperaturas evaluadas,
aunque esto se debió sólo a la localidad; no hubo efecto de la temperatura o interacción entre
temperatura-localidad (Tabla 1). Finalmente, la tasa de crecimiento a 25 ºC fue mayor para los
postmetamórficos de Farellones (Figura 7D), también debido a la temperatura y la localidad, con
interacción significativa (Tabla1).
Tabla 1. ANOVA de dos vías (localidad y temperatura) para el análisis del tamaño a la metamorfosis, la
edad a la metamorfosis y la tasa de crecimiento, en postmetamórficos de R. spinulosa del experimento de
jardín común.
Edad a la metamorfosis
g.l.
CM
F
Tamaño (SVL) a la metamorfosis
p
g.l.
CM
F
p
Tasa se crecimiento
g.l.
CM
F
p
Intercepto
1 548,634 26.374,04 0,000001
1 163,3351 150.547,7 0,000001
1 0,630477 1.919,112 0,000001
Localidad
2
0,9607
46,18 0,000001
2
0,0231
21,3 0,000001
2 0,014797
45,04 0,000001
Temperatura
1
2,3474
112,85 0,000001
1
0
0 0,869939
1 0,042953
130,743 0,000001
Loc. x Temp.
2
0,4868
23,4 0,000001
2
0,0022
2 0,011852
36,076 0,000001
374
0,0208
372
0,0011
Error
2,1
0,12925
372 0,000329
Nota: Se utilizó error tipo III. La localidad y la temperatura fueron tratadas como efectos fijos.
Experimento RNA-Seq y ensamble de novo
El experimento RNA-Seq, realizado en una plataforma Illumina HiSeq™ 2000, generó un
total de 815.178.730 reads pareados de 101 pb de longitud, correspondientes a 82.333.051.730
bases, con un contenido GC promedio de 46,7%. Los detalles de los resultados de la
secuenciación, para las 12 condiciones experimentales, se muestran en la Tabla 2. Luego de
realizar el proceso de trimming, el total de reads se redujo a 799.145.632 (un 2% fue eliminado).
El conjunto total de reads filtrados se mapeó contra los transcriptomas de referencia de los
anfibios Xenopus laevis y X. tropicalis. Sólo un 5% del volumen total de reads produjo un match
contra estas referencias. Este bajo porcentaje de reads mapeados contra las referencias da cuenta
de la diferencia existente entre los transcriptomas de estas especies de anfibios, que evidencian un
34
tiempo de divergencia de aproximadamente 230 millones de años (Triásico, Roelants et al 2007).
Debido a la baja similitud nucleotídica de los transcritos de estos anfibios, se decidió realizar un
ensamblaje de novo utilizando la totalidad de los reads filtrados, con lo cual se generó un
transcriptoma consenso. Luego, las 12 bibliotecas RNA-Seq de R. spinulosa fueron mapeadas de
vuelta contra los 87.844 transcritos ensamblados y, en promedio, el 88,5% de los reads mapeó
contra este transcriptoma consenso (resultado soportado por la buena calidad de los reads).
Finalmente, el transcriptoma consenso ensamblado generó un total de 87.844 transcritos, con una
longitud promedio de 1.036 bases y un pico de tamaño de insertos entre 300 y 400 bases.
Aproximadamente un 20% de unigenes (17.569 transcritos) mostró match a nivel nucleotídico
con genes conocidos. De estos 17.569 transcritos, un 49% lo hizo contra Xenopus tropicalis y un
17% contra X. laevis, y sólo un 2% contra Rana catesbeiana.
Tabla 2. Cuadro resumen de la información generada en el experimento RNA-Seq, para las 12 muestras
experimentales de R. spinulosa. Q20 y Q30 son índices de calidad para los reads totales generados por
condición experimental. GC (%) es el contenido de los nucleótidos Guanina + Citosina.
Muestra
N° Reads
N° Bases
GC (%)
Q20 (%) Q30 (%)
N° Transcritos
TAT25G36
70.152.478
7.085.400.278
47,92
95,45
90,75
36.009
TAT20G36
69.294.400
6.998.734.400
46,81
95,42
91,03
46.562
TAT25G42
63.545.536
6.418.099.136
46,3
95,99
91,73
43.009
TAT20G42
60.279.656
6.088.245.256
47,57
95,91
91,59
35.447
CAT25G36
84.741.760
8.558.917.760
47,57
95,63
91,16
39.443
CAT20G36
57.950.618
5.853.012.418
46,38
95,79
91,22
35.540
CAT25G42
67.024.168
6.769.440.968
46,09
95,56
90,36
37.108
CAT20G42
74.177.532
7.491.930.732
45,47
95,16
89,71
38.020
FAR25G36
72.784.792
7.351.263.992
46,98
95,27
89,75
36.253
FAR20G36
56.197.196
5.675.916.796
47,04
94,68
88,79
36.087
FAR25G42
69.575.726
7.027.148.326
46,31
95,79
90,68
40.294
FAR20G42
69.454.868
7.014.941.668
46,15
95,98
91,04
43.478
Total
815.178.730
82.333.051.730
Promedio
67.931.561
6.861.087.644
46,72
95,55
90,65
467.250
38.938
Genes diferencialmente expresados
La cuantificación digital de los transcritos para las 12 bibliotecas RNA-Seq se realizó
mediante la metodología FPKM (Mortazavi et al 2008) y el programa CuffDiff (Roberts et al
2011). Con los puntajes FPKM totales y utilizando el programa cummeRbund (Goff et al 2012),
35
se construyó un dendrograma que agrupó a las distintas condiciones experimentales según su
genotipo (Figura 8).
Figura 8. Dendrograma para los puntajes FPKM del conjunto total de genes (38.938 transcritos promedio
por condición experimental) correspondientes a las 12 bibliotecas RNA-Seq de R. spinulosa.
En este dendrograma se puede observar que las cuatro condiciones experimentales de Farellones
permanecen en un mismo grupo (cuadro verde), a diferencia de las localidades de Catarpe y El
Tatio, que no se diferencian entre ellas, aunque sí presentan una tendencia a agruparse por la
temperatura experimental. En este caso, vemos dos grupos: i) el primero agrupa a los
tratamientos de 20 ºC de El Tatio y Catarpe (cuadro azul), donde encontramos a las condiciones
experimentales TAT20G36 y TAT20G42 (flechas negras); ii) el segundo grupo reúne a los
tratamientos de 25 ºC de El Tatio y Catarpe (cuadro rojo), en el cual encontramos a las
condiciones TAT25G36 y TAT25G42 (flechas rojas). La excepción en este último grupo es la
condición de Catarpe ‘KAT20G42’, que presenta un tratamiento de 20 ºC. Estos resultados
apoyan la hipótesis filogenética de que las poblaciones de El Tatio y Farellones son
genotípicamente distintas, y que la cercanía geográfica entre las poblaciones de El Tatio y
Catarpe se refleja en la similitud genotípica observada.
36
Tras la anotación génica, y utilizando las bases de datos públicas disponibles, se procedió a
identificar a aquellos genes que variaron sus niveles de expresión significativamente en las
distintas condiciones experimentales (dadas por la localidad, la temperatura y el estadio de
desarrollo). La identificación de estos genes permitió conocer cuál de ellos varía producto del
cambio de temperatura, así como también, cuáles son las respuestas de cada población frente a
una temperatura y estadio de desarrollo determinado. También permitió realizar comparaciones
(24 en total) de las respuestas transcriptómicas dentro de una misma población y entre distintas
poblaciones. Para tal efecto, se utilizó la cuantificación digital de todos los transcritos (puntajes
FPKM) y el programa CuffDiff (Roberts et al 2011). Se obtuvo un total de 7.451 genes
diferencialmente expresados (DE), para las 24 comparaciones entre las 12 condiciones
experimentales. De este total, 1.531 genes DE corresponden a la población de El Tatio (794 son
genes up-regulados y 737 son genes down-regulados), 1.489 genes DE a la población de Catarpe
(650 up-regulados y 839 down-regulados), y 1.743 a la población de Farellones (735 upregulados y 1.008 down-regulados). Este análisis incluye a genes DE de función desconocida. El
detalle de la obtención de genes DE para cada comparación se muestra en la Tabla 3.
El análisis entre temperaturas experimentales (20 vs 25 ºC) y dentro del mismo estadio de
desarrollo y localidad (valores en negrita en Tabla 3), muestra diferencias en la cantidad de genes
DE para las tres localidades: El Tatio = 779 genes DE; Catarpe = 278; y Farellones = 337. De
estos 1.394 genes DE, un 36,5% corresponden a genes DE de función desconocida (GFD) (Tabla
4). Además, en este análisis observamos dos hechos interesantes en la localidad de El Tatio: i) el
menor número de genes DE (82) se encuentra en la comparación TAT20G36_TAT25G36, pero
también se encuentra el porcentaje más alto de GFD (58,5%); y ii) el mayor número de genes DE
(697) se encuentra en la comparación TAT20G42_TAT25G42, pero también se presenta uno de
los porcentajes más bajo de GFD (35,6%). Estos GFD son genes que, tras el proceso de anotación
funcional, no se les encontró una identificación en las bases de datos consultadas. Para más
detalles de los GFD por cambio de temperatura, estadio de desarrollo y localidad, ver Tabla 4.
37
Tabla 3. Cuadro resumen de la cantidad de genes DE, genes up-regulados y genes down-regulados, de
cada una de las 24 comparaciones biológicas de los 12 transcriptomas de R. spinulosa. El análisis contiene
genes DE de función desconocida.
Comparación
Genes DE
Genes upregulados
Genes downregulados
82
586
166
697
54
188
42
510
28
398
124
187
141
135
58
546
539
143
665
281
73
86
160
217
81
555
180
177
731
276
201
675
7.451
75
117
32
195
237
92
246
188
37
35
87
89
29
222
59
31
251
229
140
366
3.551
66
18
26
351
302
51
419
93
36
51
73
128
52
333
121
146
480
47
61
309
3.900
TAT20G36_TAT25G36
TAT25G36_TAT25G42
TAT20G42_TAT20G36
TAT25G42_TAT20G42
CAT20G36_TAT20G36
CAT20G36_CAT25G36
CAT25G36_TAT25G36
CAT20G42_CAT20G36
CAT20G42_TAT20G42
CAT20G42_CAT25G42
CAT25G42_CAT25G36
CAT25G42_TAT25G42
FAR20G36_TAT20G36
FAR20G36_CAT20G36
FAR20G36_FAR25G36
FAR25G36_TAT25G36
FAR25G36_CAT25G36
FAR20G42_TAT20G42
FAR20G42_CAT20G42
FAR20G42_FAR25G42
FAR20G42_FAR20G36
FAR25G42_TAT25G42
FAR25G42_CAT25G42
FAR25G42_FAR25G36
Total
Tabla 4. Número de genes DE totales y número y porcentaje de genes DE de función desconocida (GFD),
por cambio de temperatura y por localidad.
Genes DE
Totales
GFD
Totales
%
82
48
58,5
697
248
35,6
135
62
45,9
CAT20G42_CAT25G42
143
34
23,8
FAR20G36_FAR25G36
160
57
35,6
177
60
33,9
1.394
509
TAT20G36_TAT25G36
TAT20G42_TAT25G42
CAT20G36_CAT25G36
FAR20G42_FAR25G42
Total
38
Posteriormente, los 7.451 genes DE fueron agrupados en clusters utilizando el algoritmo de kmeans y la distancia métrica de Jensen-Shannon, implementados en el programa cummeRbund
(Goff et al 2012). Este análisis permitió obtener grupos de genes (o clusters génicos) con perfiles
similares de expresión, y se basó en el índice de Dunn para determinar el mejor número de
clusters. Un comportamiento transcriptómico similar puede asociarse, por ejemplo, a una función
determinada común o a una posible pertenencia a la misma cascada de regulación génica. Para
ello se realizaron 16 corridas iterativas de k-means, desde k = 4 hasta k = 20. Para cada número
de cluster se calculó el índice de Dunn. A medida que se incrementó el número de clusters, el
índice de Dunn fue aumentando hasta llegar a un máximo, para luego descender abruptamente y
mantenerse oscilando en valores bajos. El número de clusters óptimo se registró para un k = 12,
donde se obtuvo un valor máximo para el índice de Dunn (0,0484), y donde se reflejó la menor
varianza entre los miembros del cluster (Figura 9).
Figura 9. Determinación del número de clusters óptimos a través del índice de Dunn, previo análisis de kmeans y divergencia de Jensen-Shannon mediante programa cummeRbund. En el gráfico, el valor máximo
del índice de Dunn (0,0484) se corresponde a un k = 12 clusters.
39
El análisis entregó un total de 2.325 genes DE, con diferentes cantidades de genes por cluster
(Tabla 5). Cabe destacar que los genes candidatos de la adaptación local a la temperatura en
Rhinella spinulosa, como veremos más adelante, forman parte de este enriquecimiento génico
(clusters 3, 6 y 7).
Tabla 5. Número del cluster y cantidad de genes DE por cada cluster, resultantes del análisis de
agrupamiento y enriquecimiento génico. En negrita, los clusters que contienen a los posibles genes
candidatos identificados en este estudio (ver Tabla 7).
Cluster Genes DE
1
180
2
255
3
352
4
160
5
221
6
319
7
146
8
178
9
178
10
105
11
160
12
71
Finalmente, para cada cluster de genes DE, de los 12 agrupamientos propuestos, se realizó un
enriquecimiento génico basado en las categorías GO de nivel 2, utilizando el programa
clusterProfiler (Yu et al 2012). Este análisis permitió asociar términos GO a los genes DE, de
manera independiente para las tres principales categorías funcionales GO: Componente Celular,
Función Molecular y Proceso Biológico. Dentro de la función Componente Celular, que contiene
a 281 genes DE, se encontraron 14 categorías de nivel 2 y los términos “filamento” (82 genes
DE), “complejo” (70), y “organelo” (48), fueron los componentes principales (>70%). Dentro de
la categoría Función Molecular, que contiene a 305 genes DE, se encontraron 17 categorías de
nivel 2, y el término “actividad” (229), fue la función dominante (>75%). Finalmente, dentro de
Proceso Biológico, que contiene 78 genes DE, se encontraron 17 categorías de nivel 2, y los
términos “actividad” (16), “desensamble” (16), “percepción” (14) y “diferenciación” (13), fueron
las categorías funcionales principales (>75%).
40
La cantidad de clusters y el numero de cada cluster representados en el enriquecimiento génico,
son los siguientes: i) para Componente Celular, fueron asignados seis clusters (C3, C4, C6, C7,
C10 y C11); ii) para Función Molecular, se asignaron cinco clusters (C3, C6, C7, C10 y C11); y
iii) para Proceso Biológico, se asignaron cuatro clusters (C2, C3, C10 y C11). Un ejemplo gráfico
de clasificación GO, para la categoría Componente Celular, se puede observar en la Figura 10.
Los grafos de las categorías GO ‘Función Molecular’ y ‘Proceso Biológico’ se pueden revisar en
el material suplementario, sección Anexo (Figuras S1 y S2; páginas 67 y 68, respectivamente).
Figura 10. Comparación de enriquecimiento GO por cluster de genes (categoría Componente Celular).
Genes candidatos de la adaptación local a la temperatura
Para el conjunto total de genes DE, y en el estadio de desarrollo 36 de Gosner, el cambio
de temperatura para los individuos de El Tatio generó un total de 82 genes DE (ver Tabla 3), una
de las comparaciones con menor cantidad de genes DE. Por el contrario, en el estadio 42 de
41
Gosner, de esta misma localidad, se obtuvo un total de 697 genes DE, formando parte del grupo
de comparaciones con la mayor cantidad de genes DE (ver Tabla 3). Este mismo patrón se obtuvo
al cuantificar el número de genes únicos DE para El Tatio, en que las comparaciones
TAT20G36_TAT25G36
y TAT20G42_TAT25G42
mostraron
26
y 550
genes
DE,
respectivamente (Tabla 6).
No obstante, el resultado más interesante de este análisis emerge de la cuantificación de
transcritos únicos y diferencialmente expresados, por localidad y cambio de temperatura, donde
El Tatio mostró 576 genes únicos DE. Esta cantidad de genes es 3,6 y 3 veces más alta que los
genes únicos DE en Catarpe (159) y Farellones (192), respectivamente (Tabla 6). El análisis de
genes únicos DE por cambio de temperatura también contiene genes de función desconocida.
A continuación, se inspeccionó visualmente la expresión diferencial (o veces de cambio de la
expresión) de cada uno de los genes DE (listados en archivo Excel) para las 24 comparaciones
experimentales que son biológicamente relevantes (entre temperatura, estadio de desarrollo y
localidad, ver Tabla 3). La inspección se centró en el cambio de temperatura por estadio de
desarrollo
en
la
localidad
de
El
Tatio
(comparaciones
TAT20G36_TAT25G36
y
TAT20G342_TAT25G42), ya que es esta población la que presenta adaptación local a la
temperatura. Luego, utilizando el programa cummeRbund (Goff et al 2012), se realizó una
búsqueda de aquellos genes que presentaron un perfil de expresión similar, como se muestra en la
Figura 11 (e.g., gen pro-opiomelanocortina). De esta manera, se logró encontrar genes que
presentaron un comportamiento similar y que se vincularon con respuestas transcripcionales
diferenciales en la exposición a temperaturas contrastantes (esto se realizó mediante una revisión
bibliográfica). Los perfiles transcripcionales del resto de los genes candidatos se pueden revisar
en el material suplementario, sección Anexo (Figura S3; página 69).
Tabla 6. Número de genes únicos DE por cambio de temperatura y por localidad (incluyen a genes de
función desconocida). Notar que T20 es tratamiento a 20 ºC.
Cambio de Temperatura
T20G36_T25G36
T20G42_T25G42
Total
El Tatio
Catarpe
Farellones
26
550
576
99
60
159
106
86
192
42
El resultado del screening de los genes DE permitió encontrar siete posibles genes candidatos
para la adaptación local a la temperatura en Rhinella spinulosa. Estos genes corresponden a tres
hormonas (pro-opiomelanocortina, prolactina y somatotropina), dos factores de transcripción
(CREB3 y KLF9), una proteína de estrés térmico (HSP90α) y un receptor de membrana (TRPV3).
Estos siete genes han sido vinculados con respuestas a estrés o como parte de una respuesta a la
exposición térmica (Krone & Sass 1994, Arends et al 1998, Hadley & Haskell-Luevano 1999,
Ohguchi et al 2008, Vargas-Chacoff et al 2009, Wetsel 2011). Además, respecto al agrupamiento
de clusters, para los siete genes candidatos, seis se encuentran en los clusters C3 (POMC, CREB3
y KLF9), C6 (PRL1 y GH1), y C7 (HSP90α). Un resumen de los genes candidatos, su código
asignado en la base de datos de R. spinulosa y las categorías GO para Proceso Biológico, se
muestran en la Tabla 7.
Figura 11. Perfil de expresión diferencial (puntajes FPKM) del gen pro-opiomelanocortina en las 12
condiciones experimentales. Se observa un bajo valor de FPKM para la condición de El Tatio
‘TAT20G36’ (0,3; en rojo), en contraste con lo que sucede en las mismas condiciones de Catarpe (23,3) y
Farellones (118,8).
43
Tabla 7. Listado con los siete genes candidatos involucrados en la adaptación local a la temperatura en R.
spinulosa. Se indica el código de acceso (ID) para estos genes en la base de datos transcriptómica de R.
spinulosa, la identificación de la proteína homóloga en NCBI, y la clasificación en Gene Ontology
(términos GO) de nivel 2 para categoría Proceso Biológico y su número de acceso a las bases de datos GO
de NCBI. La búsqueda de homología génica fue hecha contra las bases de datos de Xenopus laevis, X.
tropicalis y Homo sapiens.
Secuencia ID
Proteína homóloga
Categoría GO
comp304250_c1_seq1
Pro-opiomelanocortin (POMC)
Peptide hormone processing
GO:0016486*
Signal transduction
GO:0007165*
Cell proliferation
GO:0008283*
Cell surface receptor signaling pathway
GO:0007166*
Glucose transport
GO:0015758*
JAK-STAT cascade
GO:0007259*
Heat Shock Protein 90 alpha
(HSP90α)
Protein folding
GO:0006457
Signal transduction
GO:0007165*
cAMP responsive element
binding protein 3 (CREB3)
Regulation of transcription, DNAdependent
Regulation of cell proliferation
GO:0006355
GO:0042127*
Transcription, DNA-dependent
GO:0006351*
Cellular response to Thyroid hormone
stimulus
GO:0097067*
Response to temperature stimulus
GO:0009266*
comp369824_c0_seq1
comp378451_c0_seq1
comp404752_c3_seq1
comp417391_c3_seq1
comp415176_c6_seq1
comp420197_c1_seq1
Prolactin (PRL)
Somatotropin (GH)
Krueppel like factor 9 (KLF9)
Transient receptor potential
cation channel, subfamily V,
member 3 (TRPV3)
* Términos encontrados en la base de datos de Homo sapiens.
44
Nº de acceso GO
DISCUSIÓN
En esta tesis, se estudiaron las diferencias transcriptómicas en dos estadios de desarrollo
específicos (estadios 36 y 42 de Gosner) de individuos de tres poblaciones de R. spinulosa que
habitan en ambientes con temperaturas del agua que son contrastantes. El criterio de elección de
estas dos etapas de desarrollo radica en que, el individuo 36 de Gosner es el estadio larval en el
que se inicia el proceso de metamorfosis, mientras que el individuo 42 de Gosner es el estadio
que se encuentra en el clímax del proceso de metamorfosis. Los cambios de enorme amplitud que
ocurren durante la metamorfosis, tanto en el ámbito morfológico, bioquímico y celular, son
iniciados y sostenidos por la hormona tiroidea (Tata 2006), y resultan ser cruciales para generar
un individuo postmetamórfico. Al respecto, observaciones previas hechas en nuestro laboratorio,
muestran que los huevos alcanzan el estadio 25 de Gosner, y estos avanzan hasta el estadio 36 de
Gosner, independientemente de si la temperatura del agua es 15, 20 o 25 ºC (el autor de esta tesis
ha mantenido individuos en estadio 25 de Gosner a temperaturas de 30 ºC, y estas larvas han
logrado alcanzar el estadio 36 de Gosner). No obstante, a partir del estadio 36 de Gosner, y hasta
que se completa la metamorfosis (estadio 46 de Gosner), los estadios de desarrollo larval son
afectados fuertemente por la temperatura. Por lo tanto, la variación térmica a la que son expuestos
individuos que están adaptados localmente a una temperatura de hábitat específica (como es el
caso de los individuos de El Tatio), genera tiempos prolongados de metamorfosis y tasas de
supervivencia menores que los individuos que habitan en un ambiente donde el agua experimenta
oscilaciones térmicas amplias y constantes (como es el caso del resto de las poblaciones de R.
spinulosa).
Una limitación del presente estudio tiene que ver con que la heterogeneidad ambiental recreada
en los experimentos de jardín común, es una simplificación de las condiciones a las que deben
hacer frente los individuos de R. spinulosa en sus hábitats específicos, ya sea para un ambiente
homogéneo (como en el caso de El Tatio) o para ambientes heterogéneos (en el resto de las
poblaciones de esta especie). Por lo tanto, se debe ser cauto al momento de concluir sobre estos
resultados, ya que éstos sólo representan una condición experimental en la cual se ha intervenido
la temperatura de exposición y se ha anulado cualquier otra variable ambiental (e.g., altitud,
radiación solar, características físico-químicas del agua, entre otras). No obstante lo anterior, un
experimento de jardín común es un primer paso para comenzar a entender las causas y los
45
mecanismos de la adaptación local a la temperatura, lo cual, a mi juicio, debe ser complementado
con determinaciones y/o experimentaciones de campo, con la idea de obtener datos que se ajusten
más a las condiciones naturales.
Expresión de rasgos de historia de vida
El presente estudio evidencia que: i) La supervivencia de postmetamórficos, en las tres
localidades evaluadas, fue mayor en Catarpe a 25 ºC (Figura 7A). Los efectos dados por la
interacción temperatura-localidad, fueron significativos; ii) La edad a la metamorfosis fue mayor
para los postmetamórficos de El Tatio evaluados a 20 ºC. Hubo un efecto significativo de la
temperatura y la localidad (Figura 7B, Tabla 2); iii) El tamaño corporal fue mayor para los
postmetamórficos de El Tatio, efecto debido sólo a la localidad (Figura 7C, Tabla 2); y iv) La
tasa de crecimiento fue mayor en los individuos de Farellones, con efecto significativo de la
temperatura y la localidad (Figura 7D, Tabla 2).
Los resultados mostraron que las tasas de supervivencia y crecimiento, para los individuos
experimentales evaluados, fueron mayores a la temperatura más alta (25 ºC). Esto es esperado,
pues se sabe que en ectotermos, el incremento de la temperatura afecta la tasa metabólica y el
desarrollo larval positivamente (Atkinson 1994, Álvarez & Nicieza 2002). En otra arista, los
resultados evidenciaron una alta mortalidad de individuos de El Tatio a 20 ºC, comparada con los
individuos mantenidos a 25 ºC; mientras que en Catarpe y Farellones la mortalidad fue similar a
ambas temperaturas. Esto también es esperado, ya que en El Tatio la temperatura promedio del
agua (25 ± 1 ºC) es constante durante todo el año; mientras que en las otras dos localidades,
durante el período reproductivo, el rango térmico del agua fluctúa diariamente. Según lo anterior,
la amplitud térmica experimentada por los individuos de Catarpe y Farellones en sus ambientes
naturales, podría explicar la supervivencia similar observada a las dos temperaturas evaluadas. Lo
anterior, es coincidente con lo reportado para esta misma especie por Benavides (2003) y Méndez
& Correa-Solis (2009). Asimismo, Chen et al (2001) reportaron que las larvas de Buergeria
japonica de un ambiente termal, sobrevivieron a una temperatura alta (40º C) por más tiempo,
que aquellas provenientes de un ambiente temperado. En concordancia con los anterior, Olsson &
Uller (2003) también registraron una alta mortalidad de larvas de Rana temporaria de una región
cálida expuestas a temperaturas bajas, comparada con individuos de una región más fría.
46
Los resultados también mostraron que los individuos postmetamórficos de El Tatio mostraron un
tamaño corporal mayor que aquellos de Catarpe y Farellones, aunque estas diferencias fueron
sólo determinadas por la localidad (Tabla 2). Este resultado es coincidente con aquellos
reportados por Benavides (2003) y Méndez & Correa-Solis (2009), quienes examinaron las
localidades de El Tatio y Farellones. Al igual que en Méndez & Correa-Solis (2009), la ausencia
de efectos dados por la temperatura y la interacción temperatura-localidad, lleva a sugerir que el
tamaño a la metamorfosis es un rasgo fijado genéticamente. Adicionalmente, se observaron
diferencias en la edad a la metamorfosis, ya que los postmetamórficos de Farellones mostraron
una menor edad, a ambas temperaturas evaluadas, que aquellos de Catarpe y El Tatio. Las larvas
de Farellones mantenidas a 25 ºC, fueron las primeras en completar la metamorfosis (promedio
de 37 días). Por el contrario, las larvas de El Tatio mantenidas a 20 ºC mostraron el lapso más
largo en la edad (promedio de 143 días). Al respecto, respuestas similares se han observado en
experimentos de jardín común con Rana sylvatica (Berven & Gill 1983) y R. temporaria (Merilä
et al 2000). Estos estudios y nuestros datos sugieren que los individuos que habitan en ambientes
con temperaturas más cálidas tienden a retardar su desarrollo en comparación con sus congéneres
que viven en ambientes más fríos, y apoyan la aseveración de Méndez & Correa-Solis (2009),
respecto a que la edad a la metamorfosis es el rasgo que muestra plasticidad.
RNA-Seq y genes diferencialmente expresados
En la última década, los estudios biológicos a nivel de genomas y transcriptomas se han
incrementado sustancialmente, por lo que se han generado nuevas y variadas tecnologías de
secuenciación masiva (NGS) para dar soporte a este tipo de investigaciones. Desde esta
perspectiva, las herramientas NGS aparecen como una estrategia atractiva para explorar en las
bases genéticas de la adaptación local. Los estudios que emplean metodologías NGS para abordar
preguntas asociadas a dilucidar los mecanismos genéticos de la adaptación local tienen, como
objetivo final, identificar genes candidatos de selección. Como lo discuten Lee & Mitchell-Olds
(2006) y Stapley et al (2010), en la búsqueda de genes candidatos, los esfuerzos se deben centrar
en el estudio de un conjunto de genes que se sabe están involucrados en una vía que afectan el
fenotipo. Luego, la comparación entre individuos de fenotipos divergentes permitirá proponer
genes candidatos de adaptación local en un subconjunto de genes que muestren cambios en su
expresión génica.
47
En esta tesis doctoral, se generaron datos transcriptómicos (Tabla 3) producto de haber realizado
un ensayo RNA-Seq de 12 pools de muestras de RNA de Rhinella spinulosa, provenientes de un
experimento de jardín común. Se optó por este procedimiento para disminuir la variabilidad que
podría entregar cada muestra individual en el análisis transcriptómico, así como también, para
disminuir errores técnicos asociados a la manipulación de los RNAs (en la extracción, en la
purificación y, especialmente, en la cuantificación). Esta estrategia de preparación de muestras
para secuenciación NGS ha sido ampliamente reportada en organismos modelo (especies de
laboratorio), tanto para pools de individuos como para pools de tejidos, pero también se ha
descrito para estudios evolutivos con especies silvestres (e.g., Galindo et al 2010 con Littorina
saxatilis, Turner et al 2010 con Arabidopsis lyrata).
Tomando en cuenta que para Rhinella spinulosa no existen anotaciones transcriptómicas, ni
menos genómicas, en las bases de datos de dominio público, la ventaja de utilizar la plataforma
Illumina HiSeq™ 2000 es que permite obtener decenas de millones de secuencias para el posterior
ensamblaje del transcriptoma (ver Metzker 2010 y Ekblom & Galindo 2011). Las características
de esta NGS son importantes al momento de realizar un ensamblaje adecuado y una posterior
anotación funcional exitosa (ver Li et al 2010, Elmer et al 2010), sobre todo si este ensamble se
realiza de novo (ver Pop & Salzberg 2008, Trapnell & Salzberg 2009, Chaisson et al 2009). Los
datos resultantes de este experimento RNA-Seq (liberados en agosto del 2012), generaron reads
de alta calidad, lo que significó que tan sólo un 2% de los reads se eliminaron antes de continuar
con los demás análisis. Dada la robustez del ensayo RNA-Seq, no resultó relevante que sólo un
5% del volumen total de reads haya producido match contra los transcriptomas de referencia de
los anfibios Xenopus laevis y X. tropicalis. Algo interesante a destacar de este bajo porcentaje
mapeado contra los transcriptomas de referencia, es que este resultado da cuenta de la
divergencia existente entre los transcriptomas de estas dos especies de anfibios (Rhinella y
Xenopus, ~230 millones de años, Triásico, Roelants et al 2007). Por ende, la decisión final fue
ensamblar de novo un transcriptoma consenso.
Para cada transcriptoma de R. spinulosa, en promedio, se obtuvieron 38.938 transcritos de
longitud 1.036 bases y, aproximadamente, un 20% de unigenes (17.569 transcritos) mostró match
a nivel nucleotídico con genes conocidos. Estos resultados (sus cifras) son similares a lo
evidenciado por Yang et al (2012) para dos anuros de la familia Ranidae (Rana chensinensis y R.
kukunoris), y a cuales se les realizó una RNA-Seq (en plataforma Illumina) y un ensamblaje de
48
novo (ensambladores Velvet y Oases). Los ensambles transcriptómicos de R. chensinensis y R.
kukunoris produjeron 41.858 transcritos de longitud promedio 909pb y 39.293 transcritos de
longitud promedio 956pb, respectivamente. Además, para cada conjunto de transcritos, estos
autores lograron anotar un total de 16.738 genes (40,0%) para R. chensinensis y 16.549 genes
(42,1%) para R. kukunoris. Tomando en cuenta que la divergencia genética existente entre las
familias Bufonidae y Ranidae es de ~160 millones de años (Jurásico, Roelants et al 2007), y que
los resultados de nuestro ensayo RNA-Seq son de aceptable calidad, el camino a seguir es
trabajar en el “curado” de los transcritos de R. spinulosa para convertir este primer transcriptoma
de bufónido en un transcriptoma de referencia.
La cuantificación digital de los transcritos de los 12 transcriptomas de R. spinulosa, permitió
obtener genes diferencialmente expresados (DE). La identificación de estos genes DE posibilitó
conocer cuáles son las respuestas de cada población frente a una temperatura y estadio de
desarrollo determinado, centrándose en la población que evidencia adaptación local a la
temperatura (El Tatio). El análisis de los 7.451 genes DE, por cambio de temperatura (20 vs 25
ºC) y dentro del mismo estadio de desarrollo y localidad, mostró diferencias notorias en la
cantidad de genes DE para cada población (779 para El Tatio, 278 para Catarpe, y 337 para
Farellones; Tabla 4). Además, en El Tatio se encuentra el menor número de genes DE (82 genes,
comparación ‘TAT20G36_TAT25G36’), pero también el mayor número de genes DE (697 genes,
comparación ‘TAT20G42_TAT25G42’). Este mismo patrón se obtuvo al cuantificar, esta vez, el
número de genes únicos DE para El Tatio. El análisis evidenció 26 genes únicos (31,7%) para la
comparación
‘TAT20G36_TAT25G36’,
y
550
genes
únicos
(78,9%)
para
‘TAT20G42_TAT25G42’ (Tabla 6). Este resultado es lo más interesante de esta cuantificación,
ya que los transcritos únicos y diferencialmente expresados, por localidad y cambio de
temperatura, resultaron ser de 576 genes únicos DE para El Tatio, esto es 3,6 veces más que en
Catarpe (159) y 3 veces más que en Farellones (192). Este resultado sustenta las predicciones de
la hipótesis de esta tesis: 1) Larvas provenientes de tres localidades térmicamente contrastantes
(El Tatio, Catarpe y Farellones) exhibirán diferencias en sus perfiles de expresión génica; y 2)
Esta diferencia será mayor en la población de los géiseres de El Tatio.
49
Enriquecimiento génico y genes candidatos de la adaptación local a la temperatura
La estrategia de categorías Gene Ontology (GO) es ampliamente usada para clasificar
funciones génicas (Ashburner et al 2000). Inicialmente, los 7.451 genes DE fueron agrupados
(según índice de Dunn) en 12 cluster, cada uno de estos con un perfil de expresión similar
característico. Este método de agrupamiento se basa en la idea de que un comportamiento
transcriptómico similar puede asociarse, por ejemplo, a una función determinada común o a una
posible pertenencia a la misma cascada de regulación génica. El análisis de enriquecimiento
génico para los 12 clusters permitió asociar términos GO a los 2.325 genes DE, para las tres
categorías funcionales GO: Componente Celular (6 clusters), Función Molecular (5 clusters) y
Proceso Biológico (4 clusters). Al comparar las tres principales categorías GO, se observó que los
clusters que se repiten son C3, C10 y C11. Al comparar categorías de a pares, vemos que para
Componente Celular y Función Molecular se repiten C3, C6, C7, C10 y C11; y para Componente
Celular y Proceso Biológico, como para Función Molecular y Proceso Biológico, sólo se repiten
C3, C10 y C11. Estas relaciones las retomaré en el siguiente párrafo, luego de discutir acerca del
método de detección de genes candidatos de adaptación local a la temperatura.
Como se discutió en párrafos anteriores, el análisis por cambio de temperatura, dentro del mismo
estadio de desarrollo y localidad, mostró diferencias notorias en la cantidad de genes DE. Con el
objetivo de poder detectar genes candidatos de la adaptación local a la temperatura, se realizó una
búsqueda de perfiles de expresión similares en la base de datos de genes DE. El criterio de
búsqueda de posibles genes candidatos se basó en encontrar una diferencia de expresión mediante
inspección visual, entre las dos condiciones experimentales de El Tatio (TAT20G36_TAT25G36
y TAT20G42_TAT25G42). Cuando se encontró un gen con esta diferencia, se busco su perfil de
expresión en el resto de las condiciones experimentales (ver Figura 11). Luego, con este perfil
transcripcional se buscaron otros genes que mostraran este patrón de co-expresión específico.
Finalmente, para cada gen seleccionado, sus cambios de expresión dados por el cambio de
temperatura se asociaron, mediante búsqueda de bibliografía, con estudios que hayan evaluado la
respuesta a la temperatura. Este protocolo de búsqueda permitió usar los 7.451 genes DE
resultantes de las 24 comparaciones (las diferencias en los puntajes FPKM por pareja de
comparación) y el programa cummeRbund (Goff et al 2012) para manejar de manera rápida y
fácil la información, una estrategia deseada cuando se requiere inspeccionar y analizar grandes
volúmenes de datos. De esta manera, el screening de la base de datos de genes DE sumado a la
50
búsqueda bibliográfica para los genes resultantes, permitió detectar a siete posibles genes
candidatos para la adaptación local a la temperatura en Rhinella spinulosa. Estos genes
candidatos se agrupan en tres hormonas (pro-opiomelanocortina, prolactina y somatotropina), dos
factores de transcripción (CREB3 y KLF9), una proteína de estrés térmico (HSP90α) y un
receptor de membrana (TRPV3).
Asimismo, cabe señalar que en el agrupamiento de clusters y enriquecimiento génico, seis de los
siete genes candidatos postulados se encuentran formando parte de los clusters C3 (POMC,
CREB3 y KLF9), C6 (PRL1 y GH1), y C7 (HSP90α). Tomando en cuenta esto, y para la
clasificación GO propuesta, dentro de la categoría Proceso Biológico se observa que sólo aparece
el cluster C3, a diferencia de las otras dos categorías funcionales, que contienen a los tres clusters
antes mencionados (C3, C6 y C7). Además, el cluster C3 siempre se recupera en las tres
categorías funcionales. No obstante, para la categoría Componente Celular se observa que el
cluster C3 (POMC, CREB3 y KLF9) se asocia con el término “región extracelular”; en este
sentido vale mencionar que POMC es una hormona proteica que una vez sintetizada y procesada
cumple su función a distancia.
Finalmente, el resultado del análisis clusterProfiler no resultó útil para clasificar a estos siete
genes candidatos propuestos, ya que de este tipo de análisis se espera encontrar a grupos de genes
que compartan un patrón similar de expresión y que se asocien a alguna función determinada
común. Por lo tanto, hasta este momento, la única evidencia que respalda a estos siete genes
como candidatos de adaptación local a la temperatura es la bibliografía revisada que los vincula
con respuestas a exposición térmica diferencial y/o estrés térmico:
a) El sistema pro-opiomelanocortina, como se le conoce, consiste de una pre-pro-hormona
(POMC), sus numerosos productos hormonales (α-MSH, ACTH y β-endorfina), y los
igualmente numerosos receptores-ligandos (MCRs, receptores de melanocortinas). Los
mensajeros químicos derivados de POMC actúan regulando diversas funciones fisiológicas
(Hadley & Haskell-Luevano 1999). Arends et al (1998), utilizando cepas isogénicas del pez
Ciprinius carpio, evidenciaron expresión diferencial de dos mRNAs POMC (I y II) durante
experimentos de estrés inducido por temperatura. Estos autores concluyeron que ambos genes
POMC se expresan en la carpa común y su razón de expresión (POMC-I/POMC-II) es cepadependiente y cambia en respuesta a la temperatura ambiental.
51
b) Prolactina (PRL) y somatotropina (u hormona del crecimiento, GH), son dos hormonas
proteicas que siguen el mismo patrón de expresión diferencial de POMC para las 12
condiciones experimentales de R. spinulosa. Vargas-Chacoff et al (2009), utilizaron al pez
Sparus aurata como modelo para estudiar la expresión diferencial de estos genes expuestos a
condiciones naturales de fotoperíodo, salinidad y temperatura diferentes. Ellos encontraron
que los niveles de mRNAs de PRL y GH son dependientes de la variación estacional de la
temperatura. La mayor expresión fue observada durante primavera y otoño para PRL, y para
GH en verano e invierno. Estos autores sugieren que estas hormonas jugarían un papel en la
transducción de señal molecular de factores ambientales (especialmente de fotoperíodo y
temperatura).
c) La proteína CREB3 (cAMP response element-binding protein 3) es un factor transcripcional
asociado estrechamente al “sistema pro-opiomelanocortina” antes comentado (Hadley &
Haskell-Luevano 1999). La transducción celular de la señal de melanocortina involucra un
incremento en los niveles de cAMP intracelular. Este aumento de cAMP es responsable de
varias respuestas celulares (también fisiológicas). Una de estas respuestas celulares es la
interacción de cAMP con una proteína quinasa (PKA) que luego fosforila a CREB. Esta
fosforilación permite que este factor de transcripción interactúe con CRE (una secuencia de
DNA regulatoria) para activar la transcripción de mRNAs célula-específicos para la síntesis
proteica. En esta secuencia de eventos, la transcripción de más mRNA CREB tiene feed-back
positivo a la presencia de POMC.
d) KLF9 (kruppel-like factor 9) es un factor de transcripción, que sigue el mismo patrón de
expresión diferencial de CREB3 para las 12 condiciones experimentales de R. spinulosa.
Este gen candidato, sin embargo, no es inducido por la temperatura, sino más bien, su
presencia se relaciona con los niveles de hormona tiroidea. Ohguchi et al (2008) utilizaron
hepatocitos de ratón como modelo, para evidenciar la expresión diferencial de las distintas
isoformas de KLF9 presentes. Ellos reportaron que los niveles de mRNA de KLF9 se
incrementan más de cuatro veces en células tratadas con hormona tiroidea (T3), respecto a las
células control (sin presencia de T3). Dado que T3 es la hormona que regula la metamorfosis
en los anfibios, el gen KLF9 aparece como un buen candidato de la adaptación local a la
temperatura, pues cumple funciones de sensibilizar a los tejidos que responden a la hormona
tiroidea.
52
e) TRPV3 (transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 3) es un canal
proteico de membrana que se asocia a percepción de temperatura, que pertenece a una familia
multigénica de canales de este tipo (Wetsel 2011). Estos canales TRP tienen importantes
implicancias en la investigación de la hipertermia y pueden ayudar a identificar mecanismos
inexplorados previamente en diferentes tejidos que responden a estrés térmico. Este gen sigue
el mismo patrón de expresión diferencial de KLF9 para las 12 condiciones experimentales de
R. spinulosa.
f) HSP90α (heat-shock protein 90 alpha) es una proteína chaperona de alto peso molecular,
cuyas principales funciones son asistir a otras proteínas en su correcto plegamiento,
estabilizar proteínas ante estrés térmico y, además, ayudar a evitar la degradación proteica. En
un experimento de estrés térmico que utilizó embriones de pez cebra, Krone & Sass (1994)
evaluaron la presencia y la expresión diferencial de dos isoformas de HSP90 (HSP90α y
HSP90β). Ellos evidenciaron que, durante la embriogénesis de este pez, ambos transcritos
están presentes, pero sólo los niveles de mRNA de HSP90α aumentaron en un gradiente de
temperatura experimental.
Existen estudios moleculares de la metamorfosis en anfibios que apoyarían los resultados de los
patrones de expresión génica observados y los genes candidatos propuestos en esta tesis doctoral.
En la revisión hecha por Rose (2005), se discute sobre algunos de los mecanismos reguladores
que controlarían cómo las larvas que ingresan al proceso metamórfico (estadio 36 de Gosner)
responden a la variación ambiental. Este autor revisa tres áreas clave para entender los factores
individuales que provocan plasticidad de la metamorfosis: i) los ejes centrales que controlan la
producción de hormona tiroidea (T3) y somatotropina (GH); ii) los procesos periféricos que
afectan ya sea el crecimiento o el desarrollo larval (e.g., producción de factor de crecimiento tipoinsulina o conversión de T4 a T3), y iii) las propiedades globales afectadas por las dos anteriores
(e.g., tasa de absorción de nutrientes, y las cinéticas de expresión génica, síntesis de proteínas y
división celular). El desarrollo larval ocurre mayoritariamente en las fases tardías de la vida larval
(en la premetamorfosis, estadio 36 de Gosner; y en el clímax metamórfico, estadio 42 de Gosner),
e involucra sucesos tejido-específicos de proliferación celular, muerte celular y cambios en la
diferenciación celular (Rose 2005). Estos eventos son regulados primariamente por el eje
hipotálamo-pituitaria-tiroideo a través de la producción de T3. En etapas tempranas de la
53
metamorfosis (estadio 36 de Gosner), la hormona prolactina (PRL) es importante para mantener
el crecimiento ya que actúa como un promotor de este proceso. Nuestros resultados muestran que
el efecto de la temperatura (20 ºC), sobre los individuos en estadio 36 de Gosner de El Tatio
(TAT20G36), es disminuir los niveles de expresión de PRL. Por otra parte, GH también es un
regulador del crecimiento en anfibios, y su sobre-expresión resulta en incrementos sustanciales de
la tasa de crecimiento y del tamaño a la metamorfosis. Además, los niveles de GH se incrementan
a partir del estadio premetamórfico (Rose 2005). Nuestros resultados muestran que el efecto de la
temperatura (20 ºC) sobre los individuos TAT20G36 es disminuir los niveles de expresión de GH.
Asimismo, también cabe destacar lo observado para la hormona pro-opiomelanocortina (POMC),
que presenta una baja expresión génica en la condición TAT20G36, y que además, se relaciona
con la expresión del factor de transcripción CREB3 (Hadley & Haskell-Luevano 1999), con bajos
niveles de expresión en TAT20G42. De acuerdo a lo anterior, señalar también que KLF9, un
factor de transcripción que actúa sensibilizando a los tejidos a la acción de T3 (Ohguchi et al
2008), y que presenta un patrón de expresión similar a CREB3, también mantiene niveles bajos
de expresión en TAT20G42.
De este modo, nuestros hallazgos, apoyados por la literatura, sugieren que los bajos niveles de
expresión de estas hormonas y factores de transcripción en las condiciones TAT20G36 y
TAT20G42, respectivamente, entregarían una posible explicación sobre que el tiempo de
metamorfosis se alargue, no pudiendo estos individuos alcanzar el clímax metamórfico, y
generando así una alta mortalidad de individuos de El Tatio mantenidos a 20 ºC.
54
CONCLUSIONES Y PROYECCIONES
Los rasgos de historia de vida evaluados mostraron que las tasas de supervivencia, edad a
la metamorfosis y crecimiento de los individuos de El Tatio, mantenidos a 20 ºC, son más bajas
que lo observado para Catarpe y Farellones, a la misma temperatura. Estos resultados son
esperados ya que, en condiciones naturales, los individuos de El Tatio experimentan un ambiente
térmico anual homogéneo (25 ± 1 ºC), a diferencia de lo que sucede en Catarpe y Farellones,
donde las larvas experimentan oscilaciones térmicas diarias en sus ambientes. Las condiciones
térmicas naturales contrastantes experimentadas por los individuos de El Tatio, Catarpe y
Farellones, explicarían las diferencias observadas a las dos temperaturas evaluadas. De acuerdo a
lo anterior, si los individuos de la población de El Tatio presentan adaptación local, estos
individuos deberían exhibir diferencias en la expresión génica, al ser comparados con los
individuos de Catarpe y Farellones.
El resultado del análisis de los datos transcriptómicos, centrado en el cambio de temperatura (de
25 a 20 ºC), por estadio de desarrollo y localidad, mostró que el mayor número de genes DE se
encontraba en El Tatio (779 genes), siendo este valor 2,8 y 2,3 veces más alto que en Catarpe y
Farellones, respectivamente. Más aún, cuando se realiza el mismo análisis para los genes únicos
DE (aquellos que no se repiten entre localidades), el mayor número de genes también se encontró
en El Tatio (576 genes), siendo este valor 3,6 y 3 veces más alto que en Catarpe y Farellones,
respectivamente.
El mayor número de genes DE registrados en El Tatio, orientó la búsqueda de genes candidatos,
la que se basó en evidenciar un perfil transcripcional diferencial a 20 ºC para esta localidad,
respecto a la temperatura de 25 ºC y a lo observado en las larvas de Catarpe y Farellones. El
resultado de este screening permitió proponer siete genes DE como candidatos de la adaptación
local a la temperatura (POMC, PRL1, GH1, CREB3, KLF9, TRPV3 y HSP90α). De este
conjunto de genes, dos grupos comparten independientemente un patrón similar de expresión
para las 12 condiciones experimentales ([POMC, PRL1 y GH1] y [CREB3, KLF9 y TRPV3]).
Además, en los siete genes candidatos se evidenció un patrón de expresión bajo en El Tatio para
la condición térmica de 20 ºC, para los estadios de desarrollo 36 (POMC, PRL1, GH1 y HSP90α)
y 42 de Gosner (CREB3, KLF9 y TRPV3), a diferencia de lo observado en el resto de las
condiciones. En conclusión, el patrón de expresión de estos genes DE candidatos en los
55
individuos de El Tatio, dan cuenta de una relación entre el efecto de la temperatura contrastante y
su consecuencia en los rasgos de historia de vida evaluados.
Los resultados de este estudio, proponen por primera vez cambios de expresión génica diferencial
asociados a poblaciones de R. spinulosa que habitan en ambientes térmicos distintos. En esta tesis,
se ha evidenciado que el mayor número de genes DE para la localidad de El Tatio forma parte del
acervo genético que le permite a los individuos de esta localidad utilizar este ambiente como
hábitat. Esto se evidencia en que, cuando larvas de esta población son expuestas a una
temperatura distinta a la encontrada en su hábitat, la expresión génica de los genes propuestos
como candidatos disminuye. Esta disminución en la expresión de estos genes tendría
consecuencias en el crecimiento y desarrollo larval de estos individuos, afectando el proceso de
metamorfosis, ya sea ralentizándolo o impidiendo su continuidad, y llevando a la muerte de
ciertos individuos. Lo anterior, podría explicar tanto la extensión del desarrollo larval,
produciendo una disminución de la diferenciación larval, como la alta mortalidad observada en
esta población evaluada a 20º C.
Finalmente, y como aporte de esta tesis doctoral, los datos transcriptómicos generados se
publicarán en la base de datos Sequence Read Archive (SRA) de NCBI. Esta divulgación
corresponderá al primer transcriptoma público de un anfibio bufónido, un grupo taxonómico que
reúne a más de 570 especies en 50 géneros, los que están distribuidos en todo el mundo, a
excepción del continente antártico (Frost 2013). A comienzos de este siglo, solo se habían
reportado los genomas de los anfibios modelo Xenopus laevis y X. tropicalis, dos especies de
amplio uso en investigaciones biológicas. No obstante, existe una divergencia genética entre los
géneros Xenopus y Rhinella de más de 230 millones de años (Roelants et al 2007), y que se
puede apreciar en el bajo porcentaje de identidad entre estos transcriptomas. Recientemente, se
han reportado los transcriptomas de dos anuros de la familia Ranidae (Rana chensinensis y R.
kukunoris), especies que se han utilizado para comenzar a entender las bases genéticas de la
adaptación local a la altitud (Yang et al 2012). Por lo tanto, y al igual como lo planteado por
Yang et al (2012), R. spinulosa aparece como un excelente modelo, dentro de la familia
Bufonidae, para estudios de adaptación local a la temperatura.
56
Como proyección a los resultados generados en esta tesis doctoral, en el futuro sería conveniente
el considerar el estudio de estos genes propuestos como candidatos de adaptación local a la
temperatura, en larvas de R. spinulosa muestreados en terreno, en distintos estadios de desarrollo
(tempranos y tardíos) y de ambientes con diferentes regimenes térmicos (incluida la población de
El Tatio). Una propuesta interesante sería evaluar la expresión génica de estos siete genes
candidatos a través de métodos cuantitativos (e.g., QPCR en tiempo real). Asimismo, y dado que
los individuos muestreados presentan distintas historias evolutivas producto de vivir en ambientes
diferentes, se debería realizar un análisis de variación genética (e.g., a través de la detección de
variantes SNPs) de los mismos genes propuestos como candidatos de la adaptación local a la
temperatura, y en las mismas poblaciones utilizadas para evaluar en los muestreos de terreno.
Estos ambientes locales contrastantes, sumado a las distancias geográficas entre localidades,
proveen de una excelente oportunidad para estudiar la variación geográfica a una escala amplia y
evaluar los procesos adaptativos locales asociados con la expresión génica diferencial, y la
detección de variantes genéticas, en función del ambiente térmico de cada población.
57
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ANEXO: Material Suplementario
Figura S1. Comparación de enriquecimiento GO por cluster de genes (categoría Función Molecular).
67
Figura S2. Comparación de enriquecimiento GO por cluster de genes (categoría Proceso Biológico).
68
Figura S3. Perfiles de expresión diferencial (puntajes FPKM), en las 12 condiciones experimentales, para
los restantes seis genes DE propuestos como candidatos de la adaptación local de la temperatura en
Rhinella spinulosa.
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