PRÁCTICA 1

PRÁCTICA 1
Separación de aminoácidos por técnicas de cromatografía de capa fina. Reacciones coloreadas de
aminoácidos: prueba de ninhidrina.
Introducción.
Con la siguiente práctica conseguimos conocer los aminoácidos de una muestra problema y su identificación
gracias a la reacción coloreada con ninhidrina.
Tenemos una serie de muestras patrón con diferentes aminoácidos.
La cromatografía es una técnica que permite la separación y purificación de mezclas complejas en las
biomoléculas que la componen.
Reactivas.
−Glutamato, glicina, lisina, prolina y leucina al 1% en n−propanol al 10% en agua destilada.
−Solución problema de aminoácidos.
−Eluyente: etanol: hidróxido amónico al 34% en una proporción 7:3.
Resultados y discusión.
1. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice.
Una vez revelada la placa hay que medir la distancia que separa el frente de avance de la línea de aplicación
de los patrones y de la muestra problema, a lo que denominamos Df (12,7).
Después calculamos la Rf de cada uno de los aminoácidos de la siguiente forma: Rf=D/Df siendo D la
distancia recorrida por cada muestra y Df la distancia del frente de avance.
MUESTRA
D(cm)
Rf
Lisina
0.5
0.03
Glicina
Glutamato
03.5
12
0.27
0.94
Prolina
4
0.31
Leucina
9
0.70
Al variar Rf según los distintos aminoácidos, nos permite distinguir más fácilmente los aminoácidos que
constituyen el problema. Esta variación se produce debido a que las fuerzas de avance ejercidas por la fase
móvil en su desplazamiento sobre la estacionaria son diferentes. Hay que tener en cuenta la absorción del
material utilizado.
1
Los compuestos más solubles seguirán el camino del eluyente con más velocidad lo que nos permite de
terminar las distintas alturas alcanzadas por las manchas de los diferentes patrones.
2. Identificación de los aminoácidos que componen la molécula.
Ya revelada la muestra observamos que tiene dos manchas, debido a que la muestra se compone de dos
aminoácidos. Observando la similitud que guarda la muestra problema con los patrones, determinamos los
aminoácidos que componen la muestra (glutamato y leucina)
PRACTICA 2
Reacciones coloreadas para la determinación cualitativa de azúcares. Prueba de la antrona y fehling.
Introducción.
La prueba de la antrona se basa en determinar la naturaleza de un azúcar problema mediante esta sustancia.
Llegaremos a una conclusión contrastando el problema con los patrones.
La prueba del fehling se basa en determinar si el azúcar posee poder reductor ya que los azúcares reductores
tienen una coloración rojiza debido al oxido cuproso que es forma por oxidación del azúcar por medio del
catión Cu 2+.
Los azúcares utilizados son la glucosa, fructosa, xilosa y sacarosa.
Resultados.
1. Prueba de fehling.
Ponemos en tubos de ensayo 2 ml de solución de azúcares y solución problema. El blanco se obtiene con 2 ml
de agua destilada. Después se añaden 5 gotas de fehling a los tubos. Una vez agitados se sitúan al baño maría
observando los cambios de color de cada compuesto. Si hay cambio de color el azúcar es reductor (maltesa), y
si no, no es reductor (sacarosa).
5 min.
BLANCO
SACAROSA
GLUCOSA
XILOSA FRUCTOSA
PROBLEMA
azul
azul
Azul
Azul
amari.
azul
azul claro
azul claro
Naranja claro
Naranja
oscuro
naranja claro
azul claro
"
"
"
"
"
"
1 min.
100*C
5 min.
De esta tabla se deduce que los azúcares reductores son la glucosa, la xilosa y la fructosa, dado que cambian
de color.
2. Prueba de la antrona.
2
Preparamos el blanco con dos gotas de agua destilada y 2 ml de antrona, 4 tubos con las muestras patrón con
una gota de cada azúcar y 2 ml de antrona, y otro tubo con una gota de la muestra problema y 2 ml de antrona,
poniéndolos a continuación al baño maría.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
5 min.
BLANCO
SACAROSA
GLUCOSA
XILOSA
FRUCTOSA
PROBLEMA
Amarillo
Verde oscuro
Verde−azul
Verde−azul verde oscuro
verde oscuro
Amarillo−verde negro
Negro
Negro
negro
negro
"
"
"
"
"
1 min.
100*C
5 min.
"
Discusión.
En la prueba de antrona todas las muestras dieron positivo porque utilizamos azúcares en forma de hexosa o
pentosa, sin embargo, en la prueba de fehling la sacarosa no dio positivo porque tiene carácter no reductor
debido al enlace glucosídico (1−2) donde están situados los hidroxilos de los carbonos anoméricos de la
glucosa y de la fructosa.
PRÁCTICA 3
Determinación cuantitativa de p−nitrofenol por espectrofotometría visible
Introducción.
La espectrofotometría visible consiste en una Técnica analítica basada en la capacidad de absorción de
determinadas moléculas para determinadas radiaciones.
Obtención del espectro de absorción del p−nitrofenol.
Preparamos una disolución con 2,5 ml de solución de p−nitrofenol 0,2 mM con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de
agua destilada, y otra disolución (blanco) con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de agua destilada.
Llevamos las disoluciones al espectrofotómetro y medimos la absorbancia de la primera disolución con
distintas longitudes de onda, sirviéndonos el blanco para calibrar la máquina.
ð
360
380
390
395
400
405
415
440
460
Llevando los datos a una gráfica.
Observando la curva vemos que la máxima absorbancia se da a una longitud de onda de aproximadamente
400 nm.
3
Curva de calibrado de p−nitrofenol.
Preparamos seis disoluciones a partir de la de p−nitrofenol 0,2 mM indicadas en la tabla, y de cada una
tomamos 2,5 ml, añadiéndole 1 ml de NaOH 0,5N y 1,5 ml de agua destilada.
A continuación determinamos la absorbancia de las muestras fijando la longitud de onda máxima (400 nm),
utilizando el blanco para calibrar el espectrofotómetro.
MUESTRA
0
1
2
3
4
5
6
[P−NITROFENOL] (mM)
0
10
20
40
50
100
200
ABSORBANCIA
0.054
0.156
0.247
0.448
0.526
0.562
1.180
Llevando los datos a una gráfica obtenemos:
Cálculo del coeficiente de extinción molar del p−nitrofenol en su longitud de onda máxima y la ecuación de
Lambert−Beer.
La ecuación de dicha ley es: A=EmdC
siendo:
Em= coeficiente de extinción molar
d= longitud del medio (cubeta de d=1 cm)
C= concentración
A, cuando d=1 cm, se denomina densidad óptica y se representa como DO .
Esta ley dice que cuando una radiación pasa a través de una sustancia que absorbe luz, parte de esa radiación
es absorbida,
y parte sale con menor intensidad de la que llega, con base a esta ley conociendo la absorbancia de la
disolución podremos hallar su concentración, pero cuando una disolución demasiado concentrada se produce
un apantallamiento de la luz que llega.
Utilizando los datos del tubo 2:
Em=A/dxC=0,25/1x20mM=12500 1/cmxM
Determinación de la concentración de una solución problema de p−nitrofenol.
4
La solución problema de p−nitrofenol se obtiene mezclando en un tubo de ensayo 2,5 ml de solución
problema con 1 ml de NaOH 0,5N y 1,5 ml de agua destilada. Medimos la absorbancia a 400nm y fue 0,315.
Llevando este dato a la curva obtenemos que tenemos una concentración de 24 mM.
Despejando la concentración de la fórmula de Lambert−Beer obtenemos: C=A/12500=0,315/12500=25,2mM
El NaOH es muy necesario porque neutraliza la acidez a la que queda la disolución de p−nitrofenol que es un
ácido débil, y es una molécula polar que aumenta, la salida de iones H+, y por lo tanto, la acidez.
PRÁCTICA 4
Extracción y ensayo de actividades glicosidasas de girasol. Efecto de la concentración de enzimas, pH,
temperatura y concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.
Introducción.
Estudiaremos la reacción:
p−nitrofenol− −D−manopiranósido −−−> p−nitrofenol + manosa
catalizada por la −o−manosidasa.
Resultado y discusión.
1. Determinación de las velocidades iniciales.
TIEMPO (min.)
5
10
20
30
ABSORB. 400nm
0,8
1,54
2,86
3,4
68,3
131,62
244,4
290,6
[P−NITROF]
(mM)
5
Pte de la gráfica (K)=(yi−yo)/(xi−xo)=(244,4−131,62)/(20−10)= 11,28 t.
v=−d[p−nitrofenol− ð−D−manopiranósido]/dt=Kt=11,28
siendo esta la ecuación aproximada de la gráfica, ya que hay imperfecciones en la medición, observándose
que la concentración aumenta con el tiempo.
2. Efecto de la concentración de enzimas sobre la actividad enzimática.
DILUCIÓN
[P−NITROFENOL]
ML DE ESTRACTO
ABSORBANCIA
1/1
136,75
0,25
1,6
1/10
42,73
0,025
0,5
1/50
8,54
0,005
0,1
1/100
4,27
0,0025
0,05
La actividad enzimática son los moles de producto por segundo que se forman de sustrato. Vo=[p]/t nKat
DILUCIÓN
1/1
1/10
1/50
1/100
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
75,97
23,73
4,74
2,37
La recta responde a la ecuación siguiente: V=Kcat[E]
Kcat=Pte=tg =(23,73x10 −4,74x10 )Kat/(0,025−0,005)ml= 9,5x10 Kat/ml
entonces: V=9,5x10 Kat/ml [volumen enzima]
[ −D−manosidasa]
La ecuación responde a la primera parte de la gráfica, cuando hay una cantidad de enzimas.
3. Efecto del pH sobre la actividad enzimática.
pH
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
6,0
ABSORBANCIA
400 nm
0,4
0,6
0,8
1,4
0,7
0,3
[P−NITROFENOL]
34,2 mM
51,3
68,4
119,6
52,8
25,6
ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
19 nKat
28,5
38
66,4
33,2
14,2
6
7,0
0,1
8,5
4,7
El pH óptimo de la reacción está alrededor de 4,5.
4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
TEMPERATURA
ABSORBANCIA
[P/NITROFENOL]
ACT.ENZIMÁTICA
20ºC
0,4
34,2
19 nKat
30
1,3
111,1
61,7
40
1,6
136,7
75,9
50
2,0
170,9
94,9
60
2,5
213,6
118,6
70
0,4
34,2
19
La temperatura óptima está alrededor de los 50ºC. A partir de esta temperatura se observa una caída muy
brusca de la velocidad debido a que a temperaturas altas los enzimas se desnaturalizan.
Qio es el aumento de la velocidad con un incremento de 10ºC.
Qio entre 30 y 40ºC=14,2 nKat |
Qio entre 40 y 50ºC=19 |> Qio=18,97 nKat
Qio entre 50 y 60ºC=23,7 |
Representación de Arrhenius
1/T (K )
log[Vo/(Vmax−Vo)]
3,09x10
0,6
3,19x10
0,249
3,3x10
0,035
3,41x10
−0,72
Pte recta=tg =−Ea/R=−(0,6−0,249)/[(3,19−3,09)x x10 ]=−3510 K Ea=6,97 Kcal/mol
log [Vo/(Vmax−Vo)]=log K−(Ea/R)(1/T)
7
5.Efecto de concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.
SUSTRATO
10 mM
20
40
60
80
100
200
400
600
ABSORBANCIA
0,25
0,46
0,71
0,87
1,00
1,10
1,30
1,42
1,43
[P−NITROFENOL]
21
39,3
60,7
74,3
85,4
94,0
111,1
121,4
121,9
ACT.ENZIMÁTICA
11,6 nKat
21,8
33,7
41,2
47,4
52,2
61,7
67,4
67,6
V=Vmax[S]/(Km+[S]) siendo Km la cte. de Michaelis que nos da la afinidad del enzima por el sustrato.
Observando la gráfica vemos primero un aumento de velocidad rápido para después ir aumentando más
lentamente.
Ecuación de Linewearer−Burk (cálculo Vmax)
1/[S]
1/Vo
0,0116
0,024
0,0125
0,021
0,0100
0,019
0,005
0,016
0,0025
0,014
Representación de Eadie−Hafstee.
Vo
11,6
21,8
33,7
41,2
47,4
52,2
61,7
67,4
[S]
10
20
40
60
80
100
200
400
Vo/[S]
1,16
1,099
0,8425
0,680
0,5925
0,522
0,3085
1,168
8
9