UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA Guía a través de

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE
VALÈNCIA
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA
Guía a través de sustratos inhibitorios de
células de la glía envolvente del bulbo
olfatorio por funcionalización de
nanofibras de PLA con SDF1α
TRABAJO FIN DE MÁSTER EN BIOTECNOLOGÍA BIOMÉDICA
ANA LÓPEZ MENGUAL
TUTOR/A: JOSÉ ANTONIO DEL RÍO
Curso Académico: 2015-2016
VALENCIA, 6 DE JULIO DEL 2016
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, dar las gracias por el cariño recibido por mis compañeros de grupo en
estos días de estrés y emociones fuertes, puesto que han supuesto un apoyo en mi
integración en el grupo y en la vida laboral.
Me gustaría agradecer a mi jefe de grupo, Toni, la guía en este trabajo, y su paciencia
en enseñarme. Y agradecer especialmente a Andreu su paciencia desde los primeros
días hasta los últimos, en los que me ha enseñado a trabajar y en los que me ha dejado
volar libremente después. Agradecer también a Oscar Castaño su colaboración en la
realización de este trabajo, tanto aconsejándome, como pasándome el material
necesario para los experimentos.
Muchas gracias a todos: Laura, Miriam, Ina, Ágata, Andreu, Toni, Vane, Arnau, Laia y
Anna, por esas tardes de “colegueo” y relax después de una jornada dura de trabajo.
Gracias a mi familia por apoyarme en la decisión de salir de casa para buscar un TFM
que me llenara, aunque ello implicara viajar hasta Barcelona y no verme en mucho
tiempo.
Y muchas gracias a mis compañeros de máster por toda la información que han
compartido desinteresadamente para que todos tuviésemos el trabajo de fin de
máster bien hecho y entregado conforme a la normativa y los plazos.
Sin todos vosotros hubiese sido más duro y menos divertido. Muchas gracias.
~2~
ÍNDICE
ABSTRACT
INTRODUCCIÓN
1. Migración celular
2. La lesión medular
La cicatriz meningo-glial
Los inhibidores
Estrategias regenerativas valoradas en otros estudios
3. OECs y primeros resultados
4. Las OECs cómo terapia celular
Obtención de las OECs
Variabilidad en los estudios
Estrategias de mejora
5. Electrospinning y obtención de nanofibras
Funcionalización
Eje CXCR4/CXCL12
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
ANEXO
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ABSTRACT
La lesión de la médula espinal produce muerte celular y disrupción de los vasos
sanguíneos de la región afectada. La desorganización de la barrera hematoencefálica
recluta neutrófilos, macrófagos y leucocitos para eliminar los restos celulares y reducir
daños secundarios en el tejido dañado. Unos días después, se produce la cicatriz glial
en la zona de la lesión, formada mayoritariamente por astrocitos reactivos. Estos
secretan muchas moléculas, como el proteoglicano condroitin sulfato (CSPG) o
inhibidores asociados derivados de la mielina (MAIs), que inhiben el crecimiento
axonal aberrante. Esta inhibición molecular y física de la cicatriz glial es uno de los
problemas más importantes en el tratamiento en la lesión medular.
En este contexto, una de las últimas áreas de estudio en el tratamiento de la lesión
medular (Spinal Cord Injury, SCI) es la terapia celular, como la basada en las células de
la glía envolvente del bulbo olfatorio (Olfactory Ensheating Cells, OECs). Estas células
ayudan a los axones de la vía olfativa a entrar en el bulbo. Debido a estas propiedades
se han propuesto para trasplantes en modelos de SCI para ayudar a los axones
dañados en la regeneración. Uno de los principales problemas en este tipo de terapia
es aumentar la migración a través de los sustratos inhibitorios típicos de la SCI como el
CSPG o los MAIs.
En el presente estudio analizamos el potencial de nanofibras de ácido poliláctico (PLA)
funcionalizadas con SDF1α como una ruta migratoria in vitro para las OECs a través de
sustratos inhibitorios. Las nanofibras de 80L/20D se funcionalizan con la quimioquina
SDF1α, el ligando de CXCR4. Las TEG3, la línea estable de las OECS, expresan el
receptor CXCR4 y son capaces de responder a SDF1α vía pERK ½. Cuando
cuantificamos la migración de TEG3 sobre nanofibras funcionalizadas o no
funcionalizadas a través de un sustrato inhibitorio observamos mayor migración en las
nanofibras funcionalizadas. Por tanto, la funcionalización de las nanofibras de PLA
aporta una ruta migratoria más eficaz para las OECs en la terapia de la lesión medular
en un modelo in vitro. El siguiente paso será testar la capacidad migratoria de las OECs
sobre las nanofibras funcionalizadas en un modelo de lesión medular ex vivo.
PALABRAS CLAVE: lesión medular, OECs, CSPG, nanofibras de PLA, CXCR4/SDF1α
~4~
INTRODUCCIÓN
1. La migración celular
La migración celular es un fenómeno físico-químico muy importante a nivel celular que
permite a las células una mayor interacción con el medio externo tanto en condiciones
fisiológicas como en patología. Por ejemplo, encontramos fenómenos de migración en
la metástasis, en el desarrollo embrionario, en la inflamación o en la regeneración de
tejidos. Este proceso implica la coordinación de los diferentes componentes celulares
en respuesta a las señales recibidas del medio (Harunaga and Yamada, 2011).
Las células deben de tener la suficiente plasticidad como para moverse a través de la
matriz extracelular (ECM) pero la suficiente rigidez como para no desestabilizar su
citoesqueleto y perder la forma celular. Este compromiso viene determinado tanto por
los componentes del citoesqueleto celular como por la composición de la ECM. En este
último caso, hay ECM que favorece la migración y otras inhibitorias, como las que
ocurren en las lesiones neurales. Además, se sabe que los gradientes juegan un papel
clave en la modulación de la migración celular aportando direccionalidad al
movimiento. En conjunto, las características del sustrato sobre el que la célula va a
migrar van a determinar su dirección, su plasticidad y, en definitiva, su velocidad
(Rodríguez et al., 2003).
2. La lesión medular
En la lesión del sistema nervioso central (SNC), la lesión medular juega un papel muy
relevante en la actualidad debido a su elevada morbilidad derivada de los problemas
de déficit neurológicos. Actualmente no existen intervenciones terapéuticas adecuadas
ni exitosas para su regeneración, debido a la complejidad de esta patología. Por ello,
comprender la fisiopatología de las lesiones medulares es fundamental para
desarrollar estrategias terapéuticas mejores y establecer modelos más simples de
estudio que nos permitan seguir investigando y desarrollando estrategias.
~5~
A partir del momento en el que se produce la lesión medular, ocurren una serie de
cambios a corto y largo plazo que revierten en la comorbilidad y la imposibilidad
fisiológica de regeneración. Destacamos tres fases o etapas principales (Hyun and Kim,
2010; James et al., 2011):
A) Fase aguda
En la fase aguda se produce una lesión primaria en la cual se produce una sección total
o parcial, más o menos limpia, del cordón medular y del resto de sus componentes. La
destrucción de la barrera hematoencefálica y de sus vasos sanguíneos locales produce
isquemia, anoxia e hipoglicemia, lo cual aumenta la gravedad de la lesión más allá de la
sección. En estas condiciones en un periodo de entre 8 a 24 horas, se produce la
muerte neuronal y la degeneración de la mielina de los axones dañados, que los
fagocitos empezarán a eliminar 48 horas después. Todo esto conlleva en primer lugar
un ambiente anaerobio y en segundo lugar la formación de un edema en el lugar de la
lesión medular (Dusart and Schwab, 1994; Tator and Fehlings, 1991). En el nivel
bioquímico se observan variaciones en los niveles de iones extracelulares que alterna
la transmisión sináptica y la excitabilidad de las neuronas. Ello conlleva una subida de
Ca2+ intracelular, que activa rutas de muerte celular y libera neurotransmisores
excitatorios como glutamato y aspartato. Esta liberación de neurotransmisores daña
las neuronas sanas, con lo que se extiende el campo de lesión (Balentine and Spector,
1977; Lotan et al., 1994). Además, debido a la respuesta inflamatoria se liberan otros
factores proinflamatorios como IL-1, IL-6, TNFα y MIP que promueven el edema
(infiltración de células inflamatorias y cambios en la permeabilidad vascular), liberan
radicales libres y promueven la pérdida progresiva de la mielina en los axones
lesionados (Alexander and Popovich, 2009; Caballero, 2005). En suma, se produce
muerte neuronal de las dañadas y de las sanas por varios factores y fallo general del
SNC durante varias semanas.
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B) Fase Subaguda
Después de la lesión primaria sobreviene una lesión secundaria derivada del proceso
de activación glial. La necrosis, la isquemia y la hemorragia provocan un aumento de la
actividad glial en la zona más inmediata a la lesión, denominada zona de penumbra,
donde tendrá lugar la muerte neuronal secundaria o retrasada, mucho más importante
que la lesión primaria (Reier et al., 1983). La activación glial se inicia en microglía y
astrocitos a los pocos días de la lesión. Como respuesta al daño se produce una
hipertrofia del cuerpo nuclear, una sobreexpresión de GAFP y vimentina,
hiperproliferación y acaban formando una malla extensa y densa denominada cicatriz
meningo-glial (Cregg et al., 2014). En esta fase es importante la infiltración de células
inflamatorias que darán paso a procesos de fagocitosis de las células dañadas y
muertas (Moreno-Flores et al., 1993). Esta fagocitosis inicia el proceso de
degeneración walleriana, a través de la cual los axones dañados degeneran
completamente, produciendo cambios morfológico en el segmento axonal distal
(Bruck et al., 1995). Estas células inflamatorias además liberan citoquinas como el
TNF-α que tiene tanto propiedades neurodegenerativas como neuroprotectoras (Yan
et al., 2001). Además de las citoquinas, la degeneración de la mielina libera inhibidores
que impiden la regeneración axonal en el tiempo que tarda en formarse la cicatriz glial,
y los oligodendrocitos expresan proteoglicanos inhibitorios y moléculas de guía axonal
que forman parte del proceso inhibitorio (Sandvig et al., 2004).
C) Fase crónica
Es el estado más estable, a partir del cual no se producen más cambios histológicos ni
funcionales. También suele ser el más predominante en la población, ya que todas las
lesiones llegan a esta fase. Aunque no hay un tempo determinado, ya que depende del
tipo de lesión, se sabe que en animales de experimentación esta fase llega a partir del
tercer mes (Hill et al., 2001). Se producen una serie de cambios endógenos que llevan
a la pérdida gradual de la regeneración neuronal, como la disminución en la expresión
de moléculas promotoras del crecimiento (GAP), la expresión de inhibidores del
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crecimiento axonal y cambios en los niveles de nucleótidos cíclicos intracelulares (Mar
et al. 2014; Selzer, 2003).
En su totalidad, el proceso de lesión medular conlleva una serie de cambios en el
tiempo que se traducen en un impedimento en la regeneración de la zona lesionada. El
conocimiento de dichas fases y sus principales características nos ayuda a elaborar
estrategias terapéuticas basándose en el papel de cada componente y su peso en la
inhibición del proceso regenerativo.
La cicatriz meningo-glial
Dentro del proceso de lesión medular, la cicatriz meningo-glial es una de los
acontecimientos que mayor peso tiene dentro del impedimento de la regeneración
medular. Formada debido a los astrocitos hiperproliferativos, se trata de una malla
extensa y gruesa que cubre la lesión. A nivel molecular está formada por una compleja
mezcla de factores inhibitorios (CSPG, semaforinas secretables, efrinas y tenascinas)
que reprimen el crecimiento axonal (Fig1) (Fitch and silver, 2008). A nivel celular
destaca la presencia de microglía, oligodendrocitos, células meníngeas y pericitos, que
conforman una barrera física obstruyendo en crecimiento axonal (Goritz et al., 2011;
Silver and miller, 2004). Aunque lo ideal sería eliminar esta barrera física, diversos
estudios apuntan a un empeoramiento de la lesión y desmielinización severa en el caso
de eliminar la cicatriz, con lo que se establece un compromiso entre la inhibición del
crecimiento axonal y la protección frente a la degeneración y la extensión del daño
neuronal (Bush et al., 1999; Pekny et al., 2014).
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Figura 1: Esquema simplificado de los inhibidores del crecimiento axonal presentes en la
cicatriz meningo-glial. La Rho-quinasa (ROCK) se activa a través de moléculas inhibidoras como
CSPG, OMgp, MAIs, Efrinas y semaforina que interactuan con sus receptores, dando lugar al
colapso del cono de crecimiento, retracción de las neuritas y la apoptosis. Adaptado de
Abeysinghe et al., 2016.
Los inhibidores
En la lesión secundaria de la medula espinal, aparecen una serie de inhibidores
asociados que frenan el crecimiento axonal. Estas moléculas se agrupan en inhibidores
asociados a mielina, proteoglicanos y moléculas de guía axonal.
Los proteoglicanos son glicoproteínas de la matriz extracelular altamente glicosiladas
que constan de una estructura central proteica unida covalentemente a cadenas
repetidas de glicosaminoglicanos (GAGs) (Silver and Miller, 2004; Mikami and
Kitagawa, 2013). Según como se organicen dentro de la proteína, y de los glucósidos
que contenga, así como de los sulfatos, se determina su actividad biológica (Volpi and
Tarugi, 1999). Estructuralmente existen cuatro tipos de disacáridos: Heparán sulfato
(HS), condroitin sulfato (CS), dermatán sulfato (DS) y queratán sulfato (QS). En
especial, los CS proteoglicanos (CSPG) participan en migración, diferenciación,
proliferación, crecimiento axonal, sinaptogénesis y polaridad neuronal (Galtrey and
Fawcett, 2007). Todo ello depende de la etapa de desarrollo, del tipo neuronal, de la
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concentración y de la presencia de otras moléculas. Los CSPGs se expresan como
moléculas secretables, moléculas ancladas a membrana y moléculas transmembrana
(Sandvig et al., 2004). Son importantes en las primeras 24 horas desde el daño
neuronal hasta varios meses después (Carulli et al., 2005). Son secretados por
astrocitos reactivos, oligodendrocitos y células meníngeas produciendo inhibición del
crecimiento axonal por el efecto repulsivo (Shearer et al., 2003).
Las moléculas de guía axonal comprenden semaforinas, efrinas, slits y netrinas como
las mejor estudiadas. Las semaforinas son una gran familia de proteínas
transmembrana y secretables que participan en migración celular, crecimiento
vascular, sinaptogénesis, progresión tumoral y regulación del sistema inmune (Kruger
et al., 2005). Cuando son secretadas inhiben el crecimiento del axón en zonas
específicas, lo que ayuda a dirigir el crecimiento específicamente en una dirección. En
el daño medular la Sema3A es secretada en la zona de lesión por meninges y
fibroblastos de la cicatriz glial y contribuye al ambiente inhibitorio de la zona
lesionada. Otras semaforinas participan en el proceso inhibitorio (sema4D, sema7D,
sema5A y sema6B) de manera transitoria o en lesiones determinadas (Sandvig et al.,
2004). El otro gran grupo está compuesto por proteínas secretables relacionadas con la
guía axonal durante el desarrollo. Las netrinas actúan como ligandos bifuncionales, en
el proceso de atracción axonal se unen al receptor DDC, en cambio, en los procesos
inhibitorios se unen al receptor UNC5 (Low et al., 2008; Lai Wing Sun et al., 2011). Los
slits son la tercera gran familia de proteínas difusibles que participan en el desarrollo
neuronal, en la guía axonal y en migración a través de los receptores roundabout
(Robo). Aunque muchas moléculas se expresan en lesiones de médula, Slit2 muestra
una expresión más intensa en astrocitos reactivos que rodean al tejido necrótico de la
lesión, lo que sugiere que podrían formar parte del ambiente inhibitorio de la zona
lesionada (Hagino et al., 2003). El último gran grupo lo constituyen las efrinas
transmembranas (EfrinasB) o unidas a membrana mediante GPI (EfrinasA), y sus
respectivos receptores EphB y EphA (Martínez and Soriano, 2005). Se conoce su papel
en migración y guía axonal en desarrollo y se sobreexpresan en la zona de lesión, ya
sea en astrocitos reactivos (Efrina-2) o en oligodendrocitos (Efrina-B3) (Sandvig et al.,
2004; Beanson et al., 2005).
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El último gran grupo de inhibidores del crecimiento axonal que participan en la lesión
medular son los inhibidores derivados de mielina (MAIs) y sus respectivos receptores.
Aunque el papel de la mielina como inhibidora del crecimiento axonal se conoce desde
hace tiempo (Carbonetto et al., 1987), actualmente está mejor descrita su acción
inhibitoria y las moléculas que participan en ello. De hecho, se han encontrado tres
proteínas que participan en la acción inhibitoria de la mielina: Nogo-A, MAG
(Glucoproteína glial asociada a la mielina) y OMgp (Glucoproteína mielínica
oligodendrocítica) (Schwab et al., 2005). Las tres proteínas son capaces de interactuar
con un mismo receptor (NgR1) y desencadenar el efecto inhibitorio. El complejo NgR1
por si sólo puede interaccionar con los MAIs, pero carece de un dominio transductor
de señales por lo que su asociación con otro correceptores es fundamental. SE
identificaron tres proteínas correceptoras: p75, Lingo-1 y TROY. Aun así, otros
receptores son capaces de interactuar con los MAIs: gangliósidos, diversas integrinas y
PirB (Filbin et al., 2003). Además, se han encontrado lípidos inhibitorios asociados a la
mielina, de hecho, aunque no se conoce exactamente que lípidos son, se sabe que
eliminando la expresión de las tres proteínas inhibitorias de mielina, aún sigue
habiendo un efecto inhibitorio de la mielina (Cafferty et al., 2010; Lee et al., 2010).
Estrategias regenerativas valoradas en otros estudios
Existe una gran variedad de estrategias terapéuticas probadas en las lesiones de
médula espinal, pero ninguna ha logrado una regeneración completa. Aun así, algunas
de ellas están cerca de los ensayos clínicos puesto que aportan una pequeña mejora,
que en su combinación podrían aportar mejoras funcionales significativas. Una de las
estrategias es la de administrar factores neuroprotectores y promotores de la
regeneración neural. Otra estrategia contempla la potenciación de la capacidad
regenerativa intrínseca neuronal intentando que no respondan a los estímulos
inhibitorios del entorno y puedan regenerar (Thuret et al., 2006).
Cómo hemos visto, el ambiente inhibitorio perjudica la regeneración, por ello, muchas
estrategias se han centrado en eliminar dicho ambiente a través del bloqueo de
moléculas inhibitorias. Se puede centrar en el bloqueo de las MAIs: KO de MAIs,
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anticuerpos neutralizantes contra Nogo-A, péptidos agonistas como NEP1-40,
fragmentos solubles del receptor NgR1, enzima neuraminidasa (NANasa), etc. Ninguno
de ellos a establecerse como una opción terapéutica (Thuret et al., 2006). Estas
estrategias se pueden focalizar en el bloqueo de la inhibición del CSPG mediante la
enzima bacteriana condroitinasa ABC (ChABC), que corta las cadenas de carbohidratos
asociadas al proteoglicano, y permite una recuperación parcial de la función motora
después de su aplicación en ratas (Bradbury et al., 2002).
Otras estrategias se basan en el trasplante celular, desde trasplante de nervios
periféricos, células de Schwan, OECs de la mucosa olfativa, de células embrionarias de
SNC, de trasplante de células madre adultas o embrionarias modificadas o sin
modificar y de trasplante de macrófagos activados (Thuret et al., 2006).
Por último, muchos son los estudios que se centran en el avance de la regeneración de
los axones mediante el uso de biomateriales, ya sea ellos solos, o bien combinándolos
con otras estrategias ya descritas cómo liberación de factores neurotróficos o guía de
las terapias celulares mencionadas (Shoichet et al., 2008).
3. OECS y primeros resultados
Unas de las estrategias usadas para la regeneración medular es la terapia celular con
células de la glía envolvente del bulbo olfatorio (OECs). Hace más de diez años que
estas células tienen una atención especial debido a que participan en la regeneración
del Sistema Nervioso Central (SNC) in vivo. Durante la vida de los mamíferos las OECs
acompañan los nuevos axones de las neuronas sensoriales olfativas desde el Sistema
Nervioso Periférico (SNP) hasta el bulbo olfatorio, dentro del SNC del mamífero adulto
(Fig2). Debido a esta capacidad única las OECs se han usado en modelos de
regeneración de lesiones del SNC con resultados prometedores (Li et al. 1997; RamónCueto et al. 1998).
Las OECs tienen unas características fenotípicas que las diferencian del resto de glía.
Estas células expresan varios antígenos, sin embargo su expresión no es constante ni
regular, por lo que no se pueden usar como marcadores (Franssen et al., 2007). Estos
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marcadores son tanto centrales (GAFP) como periféricos (S-100 y p75) (Ramón-Cueto
et al. 1998). Se han descrito dos subpoblaciones: las schwan-like OECs (sOECs) y las
astrocyte-like OECs (aOECs); que varían tanto en morfología como en propiedades
migratorias. Las sOECs tienen morfología fusiforme y migran 3 veces más que las
aOECs, con morfología estrellada plana (Kumar et al., 2005). Esta variación puede
significar que la morfología refleja un estado funcional diferente. Además, estas células
presentan una elevada plasticidad, pudiendo varia su morfología dependiendo del
ambiente (Huang et al., 2008). Además de la morfología, se ha observado la alta
dinámica de los lamelipodios laterales, los cuales actuarían como un sensor de
contacto célula-célula durante el proceso migratorio, con lo que se postula que el
proceso migratorio puede ser inducido por contacto (Windus et al., 2007).
Figura 2: Esquema de una sección sagital que muestra el sistema nervioso olfativo (derecha) y
con una sección del sistema nervioso olfativo (izquierda). Las células madre del epitelio
olfativo generan nuevas neuronas receptoras olfativas durante toda la vida, que extienden
axones de novo al bulbo olfatorio. Estos axones están rodeados por la glía envolvente olfativa a
medida que pasan a través de la lámina propia de la mucosa olfativa y en el SNC a través de la
lámina cribosa. Extraído de Thuret et al., 2006.
~ 13 ~
4. Las OECs cómo terapia celular
En 2001 Raisman describió la necesidad de subcultivar durante varios pasos estas
células para poder obtener mejores resultados en la regeneración del SNC. Es por ello
que los cultivos primarios de OECs extraídas directamente desde el bulbo olfatorio no
son efectivas in vitro para estudios de regeneración del axón neuronal. Por ello, en
2003, Moreno-Flores et al describieron la generación de una línea de OECs estables
inmortal que resuelve la ardua tarea de extraer estas células, seleccionarlas y
subcultivarlas para que adquieran las propiedades necesarias para la regeneración,
paso limitante en humanos.
Las OECs se han probado a inmortalizar de muchas maneras con el antígeno T grande
del virus oncogénico SV40, pero la que mejor se adapta al co-cultivo con neuronas es la
del antígeno wilt-type, ya que la transformación se produce a una temperatura
fisiológica de 37ºC. Con este antígeno las células adquieren el carácter inmortal que
buscamos y se ha demostrado en experimentos de trasplante que no son oncogénicas
in vivo. También se han analizado los patrones de expresión molecular de la línea
inmortal y tienen pattern similares a las OECs de cultivo primario (Moreno-Flores et al.,
2003).
La línea celular inmortal de OECs, llamada TEG3, se ha establecido infectando cultivos
primarios de OECs de ratas adultas con el plásmido pEF321-T, que expresa el antígeno
T grande del virus oncogénico SV40, bajo el control del promotor constitutivo EF1α.
Esta línea celular se caracterizó para su expresión de tres marcadores bioquímicos:
beta-III tubulina, MAP2C axonal y sinaptofisina, cuyos valores fueron muy similares a
los cultivos primarios de OECs. Además, del resto de clones obtenidos, sólo las TEG3
consiguieron ayudar a regenerar neuritas más largas en el modelo de regeneración
axonal de neuronas ganglionares de la retina (RGN, de Retinal Ganglion Neuron)
(Moreno-Flores et al., 2003).
Goodman et al describieron en 1993 que líneas celulares de OECs inmortalizadas con
este antígeno T SV40 tenían la efectos neuritogénicos en RGN de embriones de pollo.
Por todo ello, la línea inmortal TEG3 establecida por Moreno-Flores et al será la elegida
para nuestros experimentos in vitro.
~ 14 ~
Hoy en día no está claro cuál es el mecanismo exacto por el cual las OECs ayudan a
regenerar los axones en una SCI. Diversas teorías se han postulado al respecto, que se
centran en dos posibles mecanismos. El primero será que la elevada expresión de
factores solubles (factores neurotróficos y factores de crecimiento) ayudarían a la
supervivencia neuronal (Lipson et al., 2003). El segundo implica la formación de una
estructura aislante entre el ambiente inhibitorio y el axón que acompaña, generando
un tubo envolvente (Li et al., 2005). Además, se sabe que las OECs secretan toda una
serie de factores propicios para el crecimiento axonal (laminina, heparan sulfato
proteoglicano, fibronectinas, moléculas de adhesión, etc.) (Tisay and Key, 1999).
Las OECs tienen ventajas respecto a otros tipos celulares, ya que logran integrarse y
migrar en la cicatriz meningo-glial, además, secretan factores neuroprotectores y
neurotróficos, promueven la angiogénesis, forman un tubo que aísla los axones del
ambiente inhibitorio y pueden obtenerse del propio individuo adulto (Rhoet and
Verhaagen, 2014). Así pues, se promueve la regeneración axonal, se disminuyen los
problemas éticos asociados al uso de células embrionarias y al ser autólogas no
producen rechazo.
Obtención de las OECs
Las células de la glía envolvente olfativa se pueden obtener del individuo adulto, tanto
del epitelio nasal (OEC-OE) como de las capas superficiales del bulbo olfativo (OEC-OB),
aunque algunos estudios indican la fuente bulbar como la más óptima en estudios de
regeneración medular (Rubio et al., 2008; López-Vales et al., 2006).
Variabilidad en los estudios
Muchos son los estudios realizados sobre las OECs y su papel en la regeneración de la
lesión medular, y no todos afirmar un papel beneficioso de las OECs. Esto puede
deberse a la variabilidad en la fuente de extracción, las diferencias de edad de los
animales, los métodos de cultivos y a la estrategia de trasplante (Harvey and Plant,
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2006). Por todo ello se hace tan complicado
interpretar los resultados de los
trasplantes de OECs en SCI.
Estrategias de mejora
En el campo de la terapia celular, muchas veces se tiende a modificar las propias
células para añadir o quitar características y mejorar la terapéutica. En las OECs se han
probado diversas técnicas a fin de mejorar su migración y potenciar su capacidad
regenerativa. Por ejemplo, en 2015 se obtuvo una línea celular estable de OECs que
secretaban el ectodominio de NgR1, obteniendo un efecto antagonista de los factores
inhibitorios en estas células y mejorado su migración en modelos in vitro y en modelos
animales de SCI (Reginensi et al., 2015). En combinación con las modificaciones se
aplican otras estrategias para mejorar los tratamientos: terapia génica para liberar
factores que mejoren el crecimiento axonal; factores neutralizantes de las moléculas
inhibitorias o de sus señales; y biomateriales que guíen y aporten direccionalidad y
soporte estructural a las células migratorias. En este último campo es en el que se
centrará nuestro estudio, ya que usaremos nanofibras de PLA modificadas para guía
las OECs.
5. Electrospinning y obtención de nanofibras
El proceso de electrospinning permite obtener fibras a partir de la aplicación de altos
voltajes eléctricos (10-20KV) en soluciones poliméricas. Esto permite crear un fino flujo
expulsado desde la punta de la jeringa que contiene la solución acoplada a una bomba
de infusión hasta el plato colector conectado a tierra. Durante el proceso se evapora el
solvente y las nanofibras se depositan en el colector (Teo and Ramakrishna, 2006).
Dependiendo de la viscosidad y el voltaje obtendremos un grosor determinado y según
el tipo de colector que usemos una disposición específica de las nanofibras. Por
ejemplo, si usamos un colector fijo plano obtendremos una disposición entrecruzada,
pero si usamos un colector rotatorio a alta velocidad (>500 rpm), iremos recogiendo
las fibras de manera ordenada conforme se depositan (Fig3). En este último caso
~ 16 ~
obtendremos nanofibras alineadas entre sí. Además, dependiendo del material del
colector y del tiempo de electrospinning obtendremos una compactación de las fibras
determinada (Baji et al., 2010).
Figura 3: Para obtener nanofibras alineadas deberemos de usar un colector rotatorio, porque
al usar un colector plano obtenemos una malla de nanofibras entrecruzadas.
Dependiendo del ensayo nos interesa tener un diámetro determinado de nanofibras.
Los principales factores que controlan este diámetro son: (I) la concentración de
polímero en la solución, y por tanto su viscosidad, (II) el tipo de solvente utilizado, (III)
la conductividad de la solución, y (IV) el flujo de salida de la solución (Baji et al., 2010).
Por último, la variedad de materiales que se pueden usar en esta técnica es muy
amplia: polímeros naturales (colágeno, almidón, quitina y quitosano) y polímeros
sintéticos biodegradables (ácido poliláctico (PLA), policaprolactona (PCL), ácido poli
(láctico–co–glicólico) (PLGA), etc). Además, los diferentes polímeros se pueden mezclar
para obtener nuevas características que junto a la gran diversidad de variables que
implican la técnica del electrospinning aportan un amplio abanico de posibilidades.
~ 17 ~
La aplicación de estas fibras es tan grande como sus posibilidades en cuanto a
características, aunque las que nos interesan son aquellas que tienen relación con la
biomedicina y la ingeniería de tejidos. Las nanofibras de polímeros biodegradables se
pueden usar en la ingeniería de tejidos debido a su elevada área, su volumen y su alta
porosidad, por otra parte su flexibilidad las hacen ideales para el sostén de células.
Estas fibras además se pueden modificar químicamente su superficie para mejorar sus
características en base a las aplicaciones o a las características de las células usadas
(funcionalización). Usando las fibras orientadas de manera aleatoria podemos obtener
estructuras similares a la matriz extracelular con alta resistencia que se pueden usar
en estrategias regenerativas o como sustitutas de tejido, promoviendo su regeneración
natural en una lesión (por ejemplo) de piel (Baji et al., 2010). Si en cambio usamos
estructuras alineadas se pueden reproducir características de otros tejidos como
nervios o tejido musculoesquelético (músculo, tejido cardíaco, tendones y ligamentos).
Funcionalización
Aunque la técnica del electrospinning permite gran variedad de características, a veces
podemos mejorar estas fibras y añadir nuevas características mediante la
funcionalización con moléculas bioactivas. La funcionalización de la superficie de
nanofibras en gradiente es un concepto relativamente nuevo que está empezando a
ser explorado. Shi et al. presentaron un método para hacer gradientes en nanofibras
mediante el control de la velocidad de sumergido en una solución con la proteína de
interés y fisadsorción. Por otra parte, aunque la generación de fibras con gradiente
puede ser una solución, no se puede usar con todas las moléculas, por eso se puede
recurrir a la funcionalización por quimioadsorción de moléculas en nanofibras ya
formadas. En el caso de la funcionalización mediante química EDC/NHS primero se
deben preparar químicamente las nanofibras mediante la inducción de grupos
carboxilos y seguidamente se añaden los intermedio de acoplamiento (EDC/NHS) para
finalmente unir la biomolécula a través de una amina primaria resultando en un enlace
amida. (Mateos-Timoneda et al., 2014).
~ 18 ~
Eje CXCR4/CXCL12
Las quimioquinas son una familia citoquinas proinflamatorias de bajo peso molecular
(8-10 KDa) y son las principales responsables de la quimiotaxis, que induce dirección
migracional. Están implicadas en respuesta del sistema inmune, en angiogénesis,
desarrollo embrionario, metástasis, hematopoyesis, etc. Los receptores de
quimioquinas son proteínas transmembrana con siete dominios, que pertenecen al
grupo de las proteínas G que activan e inhiben diferentes enzimas enviando señales
intracelulares (Kucia et al., 2004).
El factor derivado de células de estroma-1 (SDF-1/CXCL12) es una quimioquina que
regula la quimiotaxis de leucocitos, la diferenciación de linfocitos T, reclutamiento de
precursores osteoclásticos y participa en angiogénesis. Los receptores de SDF1α son
CXCR4 y CXCR7 y presentan un amplio patrón de expresión en los tejidos. Ambos
receptores contribuyen de forma diferente a las respuestas mediadas por CXCL12, no
obstante cada vez está más aceptado el papel de CXCR7 como modulador de la
señalización vía CXCR4 (Levoye et al., 2009). Dependiendo de la activación de la
proteína Gαi, CXCL12 promueve la activación de PI3K, Erk1/2, y la fosforilación de
tirosinas en las proteínas de la adhesión focal (Fig4).
Figura 4: La activación del CXCR4 mediante la unión de CXCL12 desencadena una amplia
variedad de respuestas fisiológicas como la quimiotaxis, la supervivencia y la proliferación
celular. Adaptado de Teicher and Fricker, 2010.
~ 19 ~
OBJETIVOS
En el presente estudio intentamos determinar la capacidad de las nanofibras
funcionalizadas con quimioatrayentes cómo rutas migratorias para las OECs en un
modelo in vitro preliminar de lesión medular. Para ello primeros intentaremos
determinar si las OECs responden a SDF1α cómo molécula clave. Además, probaremos
la correcta funcionalización de las nanofibras que usaremos a continuación. Por último,
intentaremos determinar la preferencia de las OECs en nanofibras funcionalizadas y
determinaremos si la funcionalización ayuda a conseguir mayores distancias y
direccionar la migración de las OECs.
~ 20 ~
MATERIALES Y MÉTODOS
Anticuerpos y reactivos
Los
anticuerpos
primarios
usados
en
los
ensayos
de
Western
blot
e
inmunocitoquímicas son: Akt-Phospho (Ser473) Rabbit (Cell Signalling), AKT1 Goat
(Santa Cruz), SDF1 alpha antibody (Abcam; AB25117), CXCR4/CD184 (Thermo Fisher
Scientific;
PA3-305),
Actin
(pan-Actin):
rabbit
(Cell
Signaling;
4968),
Erk
phospho(p44/42 MAP Kinasa ) rabbit (Cell Signaling; 9101S) y ERK (panERK) mouse (BD
Transduction Laboratories; 610123).
Los anticuerpos secundarios usados para detector los primarios son: anti-mouse IgG,
HRP-linked antibody (Cell Signalling; 7076), Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody (Cell
Signalling; 7074) y Polyclonal goat anti-mouse immunoglobulins/HRP (Dako; P0447).
Otros reactivos usados tanto para los tratamientos de los cubres como para sus
coatings: BSA Alexa Fluor 594 (Invitrogen), extracellular chondroitin sulfate
proteoglycan mixture (millipore), Poly-L-Lysine (Sigma; P4707), Laminin (Sigma; L2020),
Recombinant murine SDF-1 (CXCL12) (Peprotech; 250-20A), Boric acid (Sigma; B1934),
Líneas celulares
Para todos los experimentos usaremos una línea celular estable de OECs denominada
TEG3. Para mantener estas células en cultivo necesitan D-MEM/F-12 (1:1) (1X), liquid
(Invitrogen; 31330-038) con un 10% de BCS (Bovine Calf Serum, SAFC Biosciences,
12133C-500ML), Fungizona 1% (Invitrogen; 15290-026), extracto de pituitaria
(Invitrogen) y forskolina (Sigma; F6886). En ocasiones usamos una línea TEG3-GFP para
determinar la posición de las células sin necesidad de teñirlas previamente para
reducir los lavados en las inmunocitoquímicas que pueden perturbar la muestra.
~ 21 ~
Electrospinning y funcionalización nanofibras
Para el electrospinning recurrimos a un grupo del IBEC especializado en biomateriales
y regeneración, en concreto al grupo de Elisabeth Engel. Para los diferentes
experimentos usaremos una mezcla de ácido poli-láctico (PLA) que polimeriza por la
técnica del electrospinning. Estas nanofibras se depositan en una ventana de parafina
que luego usaremos para funcionalizar con una solución de SDF1α sumergiéndola
durante unos minutos en un extremo (Mateos-Timoneda et al., 2014). Estas ventanas
son la que usaremos en los experimentos con TEG3 sobre cubres tratados (ver
protocolo).
Tratamiento de los cubres
Todos los cubres redondos usados en estos experimentos han sido previamente
lavados con etanol 70% durante 10 minutos en agitación suave y con H20 mili-Q
durante 10 minutos en agitación suave. Después de dejarlos secar se incuban toda la
noche (ON) a 4ºC con una solución de tampón borato. Al día siguiente se realiza un
lavado con H2O mili-Q y se incuba durante 1 hora a 37ºC con poly-l-lisina. Después se
realiza un lavado con H2O mili-Q y se deja secar para poder enganchar los diferentes
chips de PDMS que usaremos tanto para los coatings inhibitorios como para el ensayo
de bandas (stripes assay).
Stripes assay
Para el ensayo de bandas usaremos cubres tratados con el protocolo nombrado
anteriormente. Encima del cubre seco depositaremos ejerciendo una ligera presión un
chip de microfluídica que dispone de una serie de bandas de silicona que separan los
diferentes canales que tienen un lugar de entrada por donde introduciremos el coating
y uno de salida. El primer coating lo dejaremos durante 1 hora a 37ºC (ya sea CSPG,
SDF1α o laminina), pasado este tiempo se hace un lavado con H2O mili-Q sin levantar
el chip y se incuba durante 30 minutos con BSA-Alexa 594 a 37ºC. Su vuelve a hacer un
lavado con H2O mili-Q y se saca el chip. El cubre entero se incuba con el segundo
~ 22 ~
coating según cada condición durante 1 hora a 37ºC y se realiza un lavado con H2O
mili-Q pasado este tiempo. Sobre este cubre ya se pueden sembrar las TEG3 (100.000
células por cubre) y esperar durante 24 horas a que se enganchen antes de fijarlas.
Para cada condición se fotografían 3 campos a 10x que se cuantifican contando las
células en cada banda y haciendo la relación sobre el total de células. Luego hacemos
el promedio y calculamos el error de cada condición.
Western Blot
En el contexto de determinación bioquímica de la activación de CXCR4 vía estimulación
con SDF1α usamos la separación mediante geles de acrilamida de los extractos
celulares proteicos. Para ello se prepara la muestra separando el medio de las células y
lisando estas con Ripa buffer más inhibidores de proteasas y separando las proteínas
de los orgánulos y lípidos. El extracto proteico se desnaturaliza en el gel de acrilamida y
se separa por peso molecular y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa, luego
se incuba la membrana con las proteínas con el anticuerpo primario apropiado durante
toda la noche a 4ºC. Al día siguiente se incuba con un anticuerpo secundario unido a
HRP (horseradish peroxidase), que lo revelaremos con el sustrato ECL (Amersham ECL
Western Blotting Detection Reagents), dando lugar a una señal quimioluminiscente
que, en una sala oscura, se transmite a un film de autorradiografía y se revela. Los
anticuerpos secundarios usados son Rabbit HRP secondary antibody (dilución 1:2000),
Mouse HRP secondary antibody (dilución 1:4000) y Goat HRP secondary antibody
(dilución 1:2000) (Invitrogen).
Inmunocitoquímica
La detección de ciertos componentes y su revelado en una muestra se realiza a través
de una serie de pasos que empiezan fijando la muestra en el momento deseado y
permeabilizándola. A partir de este punto incorporamos los anticuerpos primarios y los
secundarios. En nuestro caso procederemos con el mismo método variando los
anticuerpos usados según el tipo de muestra.
~ 23 ~
El primer paso es fijar la muestra con paraformaldehído al 2% en hielo durante 5
minutos, y luego con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos. Después de lavar
con PBS 1x (2 veces, 10 minutos), procedemos a permeabilizar la muestra con PBS 1x +
tritón 0.05% (3 veces, 10 minutos). A partir de este punto empezaremos con el
bloqueo con PBS gelatina, FBS 5% y tritón 0.05% durante 30 minutos. Después de lavar
con PBS 1x + tritón 0,05% (2 veces, 5 minutos) se incuba durante 90 minutos el
anticuerpo primario con PBS gelatina, FBS 5% y tritón 0.05%. Para revelar la muestra
una vez lavada con PBS 1x + tritón 0.05% (2 veces, 5 minutos) se usa un anticuerpo
secundario que normalmente usaremos unido a un fluorocromo como los Alexa en sus
diferentes variedades (488nm, 594nm, etc.). Este anticuerpo fluorescente se incuba en
una solución de PBS gelatina, FBS 5% y tritón 0.05% durante 1 hora a temperatura
ambiente. Pasado este tiempo se realizan dos lavados de 5 minutos con PBS 1x + tritón
0.05% y dos lavados con PBS 1x de 10 minutos.
En este punto podemos guardar la muestra en frío con PBS 1x + azida 0.02%, o hacer
una tinción de núcleo en el caso de tener células. Para marcar núcleo se suele realizar
una tinción Hoescht (1:200, stock a 200ug/ml) durante 7 minutos protegido de la luz.
Pasado este tiempo se realizan lavados con PBS y se conserva la muestra a 4 ºC con
PBS-Azida 0.02%.
Montaje experimentos in vitro con nanofibras
Con los cubres de vidrio tratados según el experimento se deben de dejar secar y se
montan las ventanas de parafina con las nanofibras de PLA alineadas. Para ello se usan
adhesivos no citotóxicos y placas individuales de 35mm de diámetro. Se orientan las
nanofibras según convenga con los coatings inhibitorios y se fijan a la placa y al cubre
de vidrio. Esta construcción se esteriliza mediante rayos UV durante 15 minutos. En
condiciones de esterilidad situamos una pieza de PDMS rectangular con un agujero
donde situaremos las células. Estas se dejan 3 horas en el incubador a 37ºC y 5% CO2 y
pasado este tiempo se añade a toda la placa 2 ml de medio completo OECs. A las 12
horas comprobamos que las células estén adheridas y retiramos la pieza de PDMS. Así
~ 24 ~
conseguimos localizar las células en un lugar determinado y valorar la migración de
estas sobre las nanofibras de PLA.
Microscopia y software
Para las fotografías de fluorescencia y de contraste de fase de cada experimento se usa
tanto un microscopio invertido (IX71 Olympus, Japan) cómo un microscopio Olympus
BX61. En cada caso se usa el programa Cell Sense o el programa Cell^P para capturar
las imágenes y ajustar las diversas características. Para cuantificar y procesar estas
imágenes usamos el software ImageJ (NIH).
~ 25 ~
RESULTADOS
El condroitin sulfato proteoglicano es un sustrato inhibitorio para las OECs
Las OECs prefieren sustratos permisivos como laminina o SDF1α a sustratos
inhibitorios como el condroitin sulfato proteoglicano (CSPG). En un ensayo de bandas
(stripes assay), incubamos CSPG (12μM) en una zonas y en la otra sustratos permisivos
como SDF1α (100ng/mL) o Laminina (2um/mL). Uno de los sustratos siempre se marca
con Alexa 594 0.1% BSA para delimitar la zona del coating con fluorescencia. Después
de lavar los coatings la línea celular estable TEG3 se siembra en todo el cubreobjetos y
a las 24 horas vemos que sólo se adhieren a los sustratos permisivos como el SDF1α
(Fig5a). Al hacer la cuantificación del número de células en cada combinación de
sustratos seguimos viendo esta tendencia, en los sustratos inhibitorios se adhieren
muchas menos células. El 11% de las células se sitúan en el sustrato CSPG mientras que
el 89% las encontramos en el sustrato permisivo SDF1α. En cambio, en las bandas con
dos sustratos permisivos no vemos diferencias entre bandas (Fig5b; Figura
suplementaria 1), sugiriendo que no es efecto del coating fluorescente y validando la
repulsión de las OECs en estos sustratos inhibitorios.
~ 26 ~
Figura 5: Ensayo de bandas con CSPG (12μM + Alexa 594 0.1% BSA) en rojo y SDF1α en
las regiones negras. Los núcleos de las células se han teñido con DAPI, y vemos un
pequeño porcentaje de ellas GFP positivas debido a la línea celular (a). Cuantificación
del número de células que se sitúa en cada banda según los coating de las moléculas
testadas. En rojo las bandas incubadas con el coating y Alexa 594 0.1% BSA, y en negro
el resto del coating. Se calcula el porcentaje respecto del total de células (b) en un total
de 3 imágenes diferentes para cada condición a 10X (200 micras) en microscopio
Olympus bx61.
Las OECs responden a la estimulación con SDF1α a través del receptor CXCR4
El eje CXCR4/CXCL12 (SDF1) está implicado en migración celular a través de las vías de
pAKT y pERK. Mediante la estimulación de TEG3 a varios tiempos con SDF1 intentamos
ver si las TEG3 se activan en su presencia a través de las rutas implicadas en migración.
Para ello tratamos con SDF1 (100 ng/mL) a varios tiempos (0, 1, 5, 10, 15 y 30 minutos)
en la línea celular TEG3. La fosforilación de AKT ocurre sobre el minuto 5 desde la
estimulación con SDF1, es una activación rápida (Fig6a y fig6b). En cambio, pERK
aparece fosforilada un poco más tarde, sobre el minuto 10 (Fig6a y fig6c) siguiendo un
patrón claro de activación. Por otra parte, aunque el receptor natural de CXCR4 es
SDF1, comprobamos mediante inmunocitoquímica que estas células disponen del
receptor. Para ello incubamos TEG3 fijadas con paraformaldehído con el anticuerpo
primario de CXCR4 y lo revelamos con un secundario fluorescente Alexa 488. Las
células tienen marcada parte de la membrana, que es dónde se sitúa el receptor
(Fig6d) sólo en aquellas muestras que se añade el anticuerpo primario. En las muestras
con sólo anticuerpo secundario no encontramos marca alguna (Fig6e), por lo que
podemos determinar la existencia de CXCR4 en la membrana plasmática de las TEG3.
~ 27 ~
Figura 6: Estudio del eje CXCR4/CXCL12 en TEG3 mediante activación de la vía y
expresión y detección del receptor. Para determinar la activación de la vía se lisan las
células estimuladas y se analizan pAKT y pERK por Western Blot (a). Mediante un
control de carga se hace la ratio y observamos activación a los pocos minutos de pAKT
(b) y a los 10 y 60 minutos se observan dos picos de pERK (c). La existencia de CXCR4
en la membrana de las TEG3 se detecta mediante inmunocitoquímica con el receptor
primario de CXCR4 y un secundario fluorescente Alexa 488 (d), que no marca en
ausencia de primario (e). Magnificación 10x (200 μm) en Olympus bx61.
~ 28 ~
Las nanofibras de PLA se pueden funcionalizar con SDF1α
Las nanofibras de PLA D80/L20 se obtienen mediante electrospinning en colaboración
con el grupo de Engel E. (Institute for Bioengineering of Catalonia, Barcelona), quienes
además funcionalizan las nanofibras de PLA según sus protocolos. Para conseguir
alinear las fibras se usa un colector rotatorio (Fig7b) sobre el cual se coloca una
ventana de parafina, consiguiendo un soporte y las nanofibras se alinean en este
espacio vacío y conseguir sólo funcionalizar las fibras. Las nanofibras que se obtienen
tienen un calibre aproximado de 700 nm (Fig7b). La funcionalización se consigue
sumergiendo la ventana con las nanofibras en una serie de soluciones activadoras, y
por último en una solución con SDF1α durante un tiempo determinado (dip-coating),
consiguiendo así la conjugación de la molécula al PLA (c). Primero comprobamos que
las fibras están correctamente funcionalizadas para así validar el protocolo. Para ello
se incuban con un anticuerpo primario específico para SDF1α y se revelan con un
secundario fluorescente Alexa 488. Para testar que realmente no es un artefacto y la
nanofibra contiene SDF1α, se prueban nanofibras funcionalizadas y sin funcionalizar, y
el anticuerpo secundario Alexa 488 sólo. Como vemos en la figura 7d, sólo aquellas
nanofibras funcionalizadas se marcan con color verde, con lo que podemos confirmar
que las nanofibras se funcionalizan con SDFΑα siguiendo este protocolo.
~ 29 ~
Figura 7: Las nanofibras de 700 nm se obtienen mediante electrospinning (a) y se
colectan en un colector rotatorio para conseguir que estén alineadas (b). Para
funcionalizarlas con SDF1α se sumerge la ventana de parafina con las nanofibras en
una solución con SDF1α durante un tiempo determinado (c). Mediante una
inmunotinción
específica
de
SDF1α
comprobamos
~ 30 ~
que
realmente
estén
funcionalizadas y no se deba a un artefacto (autofluorescencia, unión inespecífica del
anticuerpo secundario, etc.) (d). Magnificación de 10x (200 μm) en Olympus inverted.
En otras investigaciones realizadas por el grupo se obtuvo que los diámetros
adecuados para la migración de las OECs eran entre 900 y 1000 nm (no se muestra).
Estas investigaciones fueron realizadas por Diego Reginensis y Òscar Castaño.
Las nanofibras de PLA funcionalizadas con SDF1α ayudan en la migración de las OECs
Una vez sabemos que las nanofibras se funcionalizan correctamente y que las TEG3 se
activan ante el estímulo con SDF1α, comprobaremos si la funcionalización ayuda a la
migración de las OECs. Para ello se hizo un ensayo preliminar en el que se
enganchaban nanofibras sobre cubres de vidrio previamente tratados. Sobre estos
cubres con las nanofibras se hacia la funcionalización por dip-coating en gradiente,
sumergiendo un poco cada un tiempo determinado. En otros cubres control no se
hacia la funcionalización. Después de esterilizar las nanofibras y el cubre mediante UV
se sembraban 200.000 células y se dejaban enganchar durante 48 horas y se
determinaba la preferencia de las mismas. En la Figura 8a se ve cómo a medida que
aumenta la cantidad de SDF1α en el gradiente hay más células enganchadas, mientras
que en el cubre con PLA sin funcionalizar no se observa esta distribución siguiendo el
gradiente (Fig8b).
Para tener la seguridad de que la funcionalización de sólo las nanofibras ayuda en la
migración se crearon las ventanas de parafina con nanofibras funcionalizadas hasta el
mitad y el resto no se funcionaliza, con lo que tenemos control negativo en la misma
muestra. Situamos una pieza de PDMS para localizar las células en esta mitad y una vez
unidas se dejan migrar durante 4 y 6 días. Pasados estos días se fijan las células y se
tiñen para comprobar que están encima de las nanofibras (rodamina al 0.01%). Cómo
se aprecia en la imagen (Fig8c) migran desde el frente de avance por encima de las
nanofibras, que además de constituir un soporte físico, actúan como una guía
migratoria. Además, en la parte funcionalizadas las TEG3 llegan más lejos que las que
no están funcionalizadas (Fig8c). Para basarse en unos resultados más sólidos
cuantificamos muestras a los 4 y 6 días y analizamos la distancia de migración de cada
condición respecto al frente de avance. Las nanofibras por si solas ya consiguen buenas
~ 31 ~
tasas de migración a los 6 días (2077,55 μm ± 89,5), pero las funcionalizadas
promueven la migración de las OECs de manera significativa a partir del día 6
(3022,889 μm ± 121,74), mientras que en el día 4 no se observan cambios significativos
(Fig8d).
~ 32 ~
Figura 8: La funcionalización de las nanofibras aumenta la migración de las TEG3 tanto
cuando se funcionaliza en gradiente estando sobre un cubre (a, b) como cuando se
funcionalizan sólo las nanofibras en una ventana (c, d). En este último caso la
migración aumento a partir del sexto día (3022,889 μm ± 121,74) con respecto al
control interno sin funcionalizar (2077,55 μm ± 89,5). Magnificación 4x (500 μm).
~ 33 ~
DISCUSIÓN
En las lesiones de médulas espinal se sigue un patrón más o menos establecido, en el
que los inhibidores secretados en la cicatriz meningo-glial inhiben el crecimiento de
nuevos axones. Estos inhibidores, están bien establecidos, y actualmente hay varios
modelos in vitro para estudiar sus efectos en el crecimiento de las neuritas. El papel
que juegan las células envolventes del bulbo olfatorio (OECs) está bien estudiado
dentro de estos modelos, si bien es verdad, falta muchos estudios sobre estas células.
En el presente trabajo valoraremos una nueva estrategia para la implantación de estas
células en la lesión de médula espinal. En primer paso es definir el comportamiento de
dichas células respecto a los sustratos inhibitorios y la molécula que hemos
considerado como idónea en nuestra estrategia. Para ello, hacemos un ensayo de
bandas, dónde confrontamos los diferentes sustratos inhibitorios (CSPG) o no (SDF1α y
laminina). Las OECs tienden eludir los sustratos inhibitorios y no tienen preferencia
entre el sustrato preferencial por excelencia (laminina) o el sustrato escogido para la
estrategia (SDF1α). Esto podría ser una de las causas de la baja eficiencia de los
trasplantes de OECS en lesiones medulares, por ello, necesitamos establecer una guía
migratoria para que las OECs puedan travesar estos sustratos inhibitorios en una
dirección concreta y buscada, acompañando así a los axones y estableciendo estos
conductos que los ayudan a regenerar.
Muchas son las estrategias en materia de scaffolds e hidrogeles que se están
estudiando en las lesiones de médula, aunque ninguna de ellas supone un soporte guía
mejor que las nanofibras de materiales biodegradables para las OECs. De hecho, las
OECs prefieren estar sobre nanofibras de PLA que sobre un sustrato plano. Aunque
sabemos que las OECs migran bien sobre nanofibras, debemos de tener en cuenta que
siguen siendo polímeros biodegradables no naturales, y que no son del todo propicios
para la migración celular. Es por ello, que la biofuncionalización en superficie de las
nanofibras con moléculas bioactivas puede suponer una mejora significativa.
En nuestra estrategia usamos el SDF1α para la funcionalización, ya que se conoce por
estudios previos que señaliza en células de la glía y en las OECs. Teniendo esto en
cuenta, comprobamos que la línea células TEG3 expresaba el receptor CXCR4 y que
~ 34 ~
estas eran capaces de responder a la quimioquina a través de la fosforilación de
ERK1/2 y de AKT al cabo de un tiempo. La biofuncionalización de las nanofibras de
hace siguiendo el protocolo establecido por Mateos-Timoneda et al para unir proteínas
a la superficie de nanofibras de PLA. Aunque este protocolo se estableció inicialmente
para otras proteínas, el SDF1α se engancha correctamente a las nanofibras, por lo que
este protocolo es válido en la biofuncionalización con SDF1α.
Teniendo esta herramienta, el siguiente paso es determinar la longitud de las OECs
sobre nanofibras funcionalizadas o sin funcionalizar. En un primer momento se hacia el
electrospinning directamente sobre cubreobjetos, y la funcionalización afectaba a las
nanofibras y al vidrio. Aun así ya se pudo determinar la preferencia de las OECs a los
sitios donde había mayor SDF1α en el PLA. Pero en una lesión real, implantaríamos las
nanofibras funcionalizadas sin el vidrio, así que usando unas ventanas se hizo el mismo
experimento y obtuvimos mayores tasas de migración en las nanofibras
funcionalizadas a partir del día 6, con unas distancias de hasta 3mm. Aunque los
resultados son prometedores, hay la necesidad tanto de hacer más réplicas de estos
experimentos, como de dejar más tiempo las OECs sobre nanofibras, para determinar
si migran mayores distancias, ya que en lesiones reales la distancia a regenerar puede
ser mayor. Por otra parte, este experimento también debería de probarse en un
ambiente inhibitorio para ver si realmente migran más sobre estos ambientes
inhibitorios y no tienen afectación de las OECs sobre las nanofibras.
Aunque los resultados que varios investigadores obtienen son positivos, sigue
haciéndose necesaria más investigación hasta lograr alcanzar la recuperación funcional
de una lesión de médula espinal. Para ello un buen planteamiento es usar las
estrategias ya conocidas e implementándolas. En nuestro trabajo hemos mencionado
la existencia de una línea que expresa el ectodominio de NgR, que hace de antagonista
de los inhibidores regeneración neural en SCI, propiciando un ambiente menos
inhibitorio. Si combinamos la funcionalización de nanofibras como guía para estas
células modificadas, podríamos obtener mejores resultados. Otras variables
implicarían el uso de factores neurotróficos o enzimas que mejoren estos ambientes
inhibitorios. Por todo ello se hace necesario seguir investigando y combinando
terapias, para estar un paso más cerca de la recuperación funcional en SCI.
~ 35 ~
CONCLUSIONES
En un modelo in vitro simple de cicatriz glial, donde el entorno es muy inhibitorio
debido a las diferentes moléculas que lo componen como el CSPG o los derivados de
mielina inhibitorios, el ensayo de stripes reproduce la repulsión del CSPG en la línea
celular estable TEG3. Como molécula candidata a la quimioatracción de TEG3
probamos SDF1α en varios tiempos y en TEG3 se activa la vía por pAKT y pERK, además
comprobamos mediante inmunocitoquímica que las TEG3 expresan el receptor CXCR4.
Con SDF1α en solución se pueden funcionalizar las nanofibras de PLA de manera
satisfactoria. Las nanofibras funcionalizadas con SDF1α mejoran la migración de las
TEG3 comparado con nanofibras sin funcionalizar, y constituyen una ruta migratoria
para TEG3. Las nanofibras de PLA funcionalizadas con moléculas quimioatrayentes
pueden ser una ruta migratoria a través de sustratos inhibitorios para OECs en un
modelo preliminar in vitro de SCI.
~ 36 ~
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~ 43 ~
ANEXO
Figura suplementaria 1: stripes assay
Figura suplementaria 1: Ensayo de bandas con la línea celular TEG3. Coatings en rojo
con Alexa 594 0.1% BSA más la molécula correspondiente. En ay b se prueban dos
coating permisivos, y en c se prueba un coating permisivo contra uno inhibitorio.
~ 44 ~