UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
GENERAL Y ESTOMATOLÓGICA
GUIA DE PRÁCTICA 2012
AUTOR: Mg CD ELOY GAMBOA ALVARADO
DOCENTES COLABORADORES:
Mg Blgo. Nelson O. Rivera Fernández (Coordinador del Curso).
Mg Blgo. Marco Antonio Mesia Guevara
Mg Blga. Carmen Lesly Castillo Pampas
RECOMENDACIONES GENERALES
1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas correctamente uniformado de blanco y
llevando consigo mandil blanco, gorro, mascarilla y guantes descartables. Además plumón
indeleble para escritura en vidrio y lápices de colores.
2. El alumno que incumpla el ítem anterior no podrá ingresar a sala de prácticas.
3. Está prohibido comer, beber y fumar en sala de prácticas.
4. Sobre la mesa de trabajo sólo colocará materiales, guía práctica y libreta de apuntes.
5. Antes y después de cada práctica el estudiante desinfectará la mesa de trabajo, para lo
cual deberá contar siempre con un frasco de alcohol yodado, algodón y gasa.
6. Finalizada la práctica el estudiante eliminará los materiales de desecho al depósito
correspondiente.
7. Las láminas preparadas deberán ser colocadas en una caja para su archivo.
8. Todas las placas y tubos con medios de cultivo ya usados serán colocadas en las canastillas
para su autoclavado y desecho.
9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en recipientes con boca ancha
conteniendo desinfectante.
10. Los cultivos a incubarse deberán rotularse con los siguientes datos:
a. Nombre o iniciales del estudiante.
b. Nombre del microrganismo, número de mesa, sección y fecha.
c. Las placas se colocarán en forma invertida, salvo indicación contraria del docente.
d. Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas.
e. Los alumnos son responsables de colocar los cultivos en las estufas a temperatura
y tiempo adecuados.
f. Los alumnos son responsables de la observación macroscópica tras la incubación.
11. Al finalizar la práctica, el estudiante se responsabiliza de:
a. Limpiar los objetivos y platina del microscopio con algodón y alcohol isopropílico.
b. Ubicar el objetivo de menor aumento frente al condensador y verificar que no
queden láminas sobre la platina.
c. Desinfectar la mesa de trabajo.
d. Cerrar la válvula de gas.
e. Lavarse las manos con jabón carbólico.
12. El protocolo será controlado por el docente al final de cada práctica.
PRÁCTICA N° 01
EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y MATERIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
OBJETIVOS:
 Identificar y reconocer los principales equipos, instrumentos y materiales
utilizados en el Laboratorio de Microbiología.
 Familiarizar al estudiante con el manejo y uso adecuado de los equipos,
instrumentos y materiales usados en las diversas prácticas de microbiología.
I.
EQUIPOS:
MICROSCOPIO
Aparato óptico formado por un juego de lentes que permiten la observación de la imagen
de un objeto amplificado. Existen varios tipos, siendo los más usados el óptico de campo
claro (hasta 2000x) y el electrónico (hasta 100000x), además existen otros con fines
específicos como los microscopios ópticos de inmunofluorescencia, el de campo oscuro y
el de contraste de fases. Es usado para reconocer características morfológicas, tintoriales y
detectar las diferentes estructuras que poseen los microrganismos.
Partes.



Mecánica.
Óptica.
Sistema de Iluminación.
A. Mecánica:
a) Pie.
b) Platina (Circular o rectangular fija o móvil, el vernier y el sistema de movimiento o tren)
c) Tubo óptico, Revólver.
d) Sistema de Enfoque: Tornillos Micrométricos y Macrométricos (Cremallera)
B. Sistema Óptico:
a) Oculares: 05 – 10 – 20x
b) Objetivos: 05 – 10 – 40 – 100x
Objetivos de observación en seco y en inmersión.
C. Sistema de Iluminación:
a) Espejo: Plano y Cóncavo
b) Condensador.
c) Diafragma filtros.
d) Fuentes de iluminación natural y artificial.
Para determinar el aumento del microscopio se multiplica la cifra del ocular con la del
objetivo; ambas representan el aumento proporcionado por cada lente.
Para la observación microscópica proceda según el siguiente orden:





La elección de la iluminación depende de la fuente de luz, aumentos empleados y
otros factores.
Enfoque de preferencia con el objetivo de menor aumento, que por lo común
tiene un tope inferior que impide la ruptura de las láminas a observar.
Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revólver y utilice el objetivo deseado. Al
usar el de inmersión, coloque previamente una gota de aceite de cedro sobre la
preparación. Al colocarse el objetivo en posición debe existir una continuidad
entre ellas. Para el enfoque preciso, use tornillo micrométrico.
Mantener los ojos abiertos, aunque el microscopio sea monocular.
Al terminar la observación limpie le objetivo con papel especial para lente,
algodón o un lienzo fino, embebido con alcohol isopropílico o xilol en pequeña
cantidad y secar. Las láminas ya observadas, se depositarán en un recipiente de
boca ancha con solución sulfocrómica.
AUTOCLAVE
Destinado para la esterilización con calor húmedo y presión (121°C x 15’ a 15 Lbs/pulg2 ).
Permite la esterilización demateriales de desecho, medios de cultivo, ropa quirúrgica, agua
destilada, etc.
HORNO (Horno Pasteur o Poupinel)
Destinado para la esterilización a calor seco. La temperatura usual es 160 – 180°C por 1 – 2
horas. Se esteriliza material de vidrio, de laboratorio e instrumentos metálicos.
ESTUFA O INCUBADORA
Permite obtener temperaturas fijas permanentes gracias a un termostato. La temperatura
se elige según el requerimiento del microrganismo a cultivar. Generalmente es de 37°C.
REFRIGERADOR O NEVERA
Permite obtener temperaturas bajas y se utiliza con fines de conservación de
microorganismos, medios de cultivo, muestras, reactivos, etc. Por lo general se usa a
temperatura de 0 a 4°C.
CENTRIFUGA
Equipo de diversas capacidades y que permite separar una sustancia sólida en suspensión
del líquido respectivo. Se puede centrifugar orina o sangre para obtener el “sedimento
urinario” o “suero” respectivamente.
BALANZA
Se usa en bacteriología para pesar colorantes, medios de cultivo, reactivos, etc. Existen de
diferentes tipos según su aplicación y sensibilidad.
BAÑO MARIA
Permite la transmisión indirecta y atenuada de calor, de un líquido sobre una sustancia a
través de un recipiente contenedor. Evita el calor directo. Se usa entre otras cosas para
licuar medios de cultivo y para inactivar sueros. Existen diversos modelos según aplicación.
AGITADOR MECÁNICO
Equipo de diseño diverso y con frecuencia variable por el número de veces que oscilan por
minuto. Se utilizan para agitar tubos, frascos, pipetas y láminas excavadas.
POTENCIOMETRO
Equipo destinado a determinar la concentración de iones H (pH en una solución).
BOMBA DE VACIO
Produce presión negativa y se utiliza de preferencia para filtrar muestras de agua potable,
a través de una membrana filtrante donde se retienen las bacterias contaminantes.
CONTADOR DE COLONIAS
Utilizado para el recuento de colonias en una placa de cultivo, de manera más exacta y con
mayor facilidad.
II.
MATERIALES DE VIDRIO
Materiales que deben ser de buena calidad, resistir acciones mecánicas y cambios bruscos
de temperatura, tener bajo coeficiente de dilatación y una mínima cantidad de álcali libre.
PLACA PETRI
Formado por dos cristalizadores, haciendo de tapa el más grande y de base el más
pequeño. Existen en medidas de 10x60 y 15x100, encontrándose en el mercado incluso
con divisiones internas.
PLACAS BREWER
Son más gruesas y pesadas que las anteriores. La tapa encaja perfectamente sobre la base,
dejando espacio sólo el necesario para colocar el medio de cultivo. Es usado generalmente
para el aislamiento y cultivo de microrganismos anaerobios.
TUBOS DE PRUEBA (Tubos de ensayo).
Presentes en tamaños variados y cuyas medidas se dan en mm del diámetro de la boca y el
largo del tubo. Los más frecuentes son de 13x100 mm, 16x150 mm y 18x150 mm. Una
variante de ellos posee tapa de bakelita y se emplea para realizar pruebas bioquímicas,
cepario, estudios de fermentación, reacciones diversas, etc. Los tubos para centrífuga son
de paredes gruesas y de fondo cónico, pueden tener graduación y sirve para reunir el
sedimento de los líquidos.
MATRACES Y BALONES
Recipientes de base esférica con fondo plano y forma cónica o de globo, con cuello de
boca ancha que termina en reborde. Existen con medidas volumétricas desde 50 ml hasta
5000ml, y son empleados para la preparación de medios de cultivo, colorantes, soluciones,
reactivos diversos, etc.
PIPETAS
De forma tubular y abierta en ambos extremos, graduado en su extremo proximal y son
usados para medir soluciones en cantidades pequeñas y exactas. Son de diversas clases:
Pipetas con bulbo, llamadas así por el abultamiento que presentan en su parte intermedia;
Pipetas de sangre, que poseen un pequeño bulbo y graduaciones que permiten relaizar
diluciones en citometría hemática; también están las Pipetas Pasteur que no poseen
marcas ni graduaciones y son utilizadas para medir volúmenes pequeños.
Las pipetas poseen las siguientes abreviaturas: TC (Tocontainer), las que contiene un
determinado volumen , pero al vaciar no suministra la totalidad del líquido; y TD
(Todeliver), al vaciar la pipeta suministrará la totalidad del volumen especificado.
PROBETA
De paredes gruesas y graduadas, con base para estabilidad. Existen de diferentes
capacidades, de 10 a 1000ml, y son usadas para medir soluciones o sustancias líquidas.
FIOLAS
Matraces volumétricos con cuello largo y base globosa, poseen una línea de aforo y son
usados para la preparación de reactivos valorados.
MATRAZ DE PRECIPITADO
Recipientes cilíndricos de boca ancha y con pico en el borde. Generalmente se usa para
preparar soluciones diversas.
LAMINAS PORTA Y CUBREOBJETOS
Láminas de vidrio rectangulares o cuadrangulares con diferentes dimensiones, las más
comunes son de 65x35 mm y 22x22mm. Son usadas para hacer extensiones y coloraciones
de muestras biológicas y observaciones en fresco.
En otros materiales de vidrio pueden considerarse embudos, jeringas hipodérmicas,
frascos, goteros, baguetas, perlas de vidrio, etc.
III.
OTROS MATERIALES
MANGOS DE KOLLE
Vástagos de metal con cubierta de ebonita (aislante de calor), en cuyo extremo distal
presenta una tuerca para insertar el alambre de platino o micrón que formará el asa de
siembra. Usado en la toma de muestras de microrganismos y en la siembra de los mismos.
ESPÁTULAS DE METAL
Usado para pesar medios de cultivo y reactivos. Los de níquel no se oxidan.
TRIPODE
Soporte de tres pies generalmente de metal, empleados para soportar recipientes durante
el calentamiento.
Entre otros materiales también se consideran: soportes universales, agujas hipodérmicas,
gradillas para tubos de ensayo, rejillas de asbesto, tapones de jebe, mangueras de jebe,
papel indicador de pH, etc.
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
Dibuje los diferentes equipos y materiales de laboratorio estudiados.
Describa y esquematice el modo de usar una pipeta y una placa Petri.
Qué material de laboratorio utilizaría para medir volúmenes pequeños y exactos?.
Qué equipo de laboratorio utilizaría para esterilizar medios de cultivo?.
PRÁCTICA N°02
COLORANTES Y COLORACIONES BACTERIANAS
OBJETIVOS


Identificar y reconocer los colorantes y las principales técnicas de coloración utilizadas en
Bacteriología.
Identificar y reconocer la estructura y morfología bacterianas.
INTRODUCCION
COLORANTE: Sustancia química de origen natural o sintético que otorga color.
Por su naturaleza, se clasifican en colorantes naturales y artificiales.


Naturales: Son de origen animal y vegetal. Ejemplo: El Carmín es obtenido de la cochinilla,
la hematoxilina y el tornasol que son obtenidas de las plantas.
Artificiales o Sintéticos: Obtenidos como derivados del carbón de piedra o hulla. Son
conocidos como anilinas. Ejemplo: azul de etileno, safranina, violeta de genciana, atc.
Por su afinidad tintorial, es decir de acuerdo al comportamiento químico del colorante, se clasifica
en:
a) Colorantes Ácidos
b) Colorantes Básicos.
c) Colorantes Neutros.
a) Colorantes Ácidos: Se dice que un colorante es ácido o aniónico, cuando la parte básica o
catiónica es incolora y la parte ácida o aniónica es coloreada, teniendo afinidad poe le
citoplasma. Ejemplo: Ácido pícrico, Eosina, Fucsina ácida, etc.
b) Colorantes Básicos: Son los colorantes que tienen la parte básica o catiónica coloreada y la
parte ácida o aniónica incolora. Tienen afinidad por el núcleo. Ejemplo: Violeta de
genciana, Fucsina básica, Tionina, etc.
c) Colorantes Neutros: Son los colorantes que tienen la parte ácido y básica coloreada y
tiñen al núcleo de un color y al citoplasma de otro. Ejemplo: Leishman, Giemsa, Wright,
Eosinato azul de metileno, etc.
COLORACIÓN O TINCIÓN
Proceso en el que se produce un intercambio de iones entre los colorantes y los sitios activos de la
superficie o del interior de la célula.
Las coloraciones según el número de colorantes pueden ser:
A) Simples
B) Diferenciales
C) Especiales
A) COLORACIONES SIMPLES.
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para la observación de la
morfología de los microrganismos. Ejemplos: Coloración de azul de metileno, Tinta china y
la de azul de lactofenol.
B) COLORACIONES DIFERENCIALES.
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante. Generalmente al primer
colorante se le denomina Colorante Primario, mientras que al segundo se le denomina
Colorante Secundario o de Contraste. Permiten observar diferencias entre células
bacterianas o partes de la estructura bacterianas. Ejemplos: Coloración Gram y Coloración
de ZiehlNeelsen (también llamada ácido alcohol resistente).
C) COLORACIONES ESPECIALES.
Cuando se utilizan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares.
Ejemplo: Giemsa, Wrigth, Leishman, Vago, etc.
PASOS GENERALES DE UNA COLORACIÓN:
a) Extensión: Consiste en colocar la muestra sobre una lámina portaobjetos, extendiéndola
uniformemente.
b) Fijación: Fijar la muestra sobre la lámina portaobjeto utilizando alcohol, éter o flameado
suavemente sobre el mechero o simplemente dejarlo al medio ambiente.
c) Tinción: Se utiliza el colorante requerido cubriendo la muestra en su totalidad por un
tiempo determinado.
d) Lavado: Enjuagar usando un chorro suave de agua.
e) Secado: Dejar secar la lámina al calor del mechero.
f) Observación: Observar con el objetivo de inmersión usando el aceite de cedro.
COLORACION DE AZUL DE METILENO
1.
2.
3.
4.
Prepara un frotis con la muestra bacteriana y fijar al calor.
Cubrir el frotis con 3 gotas del colorante azul de metileno y dejar actuar por 3 – 5 minutos.
Lavar con chorro tenue de agua y dejar secar.
Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro.
RESULTADO: Los microrganismos se observan de color azul intenso.
PROTOCOLO
COLORACION SIMPLE
MORFOLOGÍA DEL
MICROORGANISMO
ESQUEMA DE LA
OBSERVACIÓN
AZUL DE METILENO
COLORACIÓN GRAM
1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular y 2/3 para la preparación del frotis.
2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en
el centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para
obtener una preparación en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado completo del frotis por flameado con la ayuda del
mechero.
4. Colocar la lámina sobre la varilla o puente de coloración.
5. Cubrir el frotis con 03 gotas de Cristal Violeta (colorante primario), dejar actuar por 2
minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la caída directa del chorro sobre el frotis).
7. Cubrir con Lugol durante 1 – 2 minutos.
8. Lavar con agua.
9. Decolorar el frotis con la solución de Alcohol Acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta
que no arrastre colorante), máximo por 30 segundos.
10. Lavar con agua.
11. Cubrir con 03 gotas del colorante de contraste Safranina durante 2 minutos.
12. Lavar con agua.
13. Secar a temperatura ambiente o con la ayuda de la llama del mechero.
14. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
RESULTADO: Las Bacterias Grampositivas se colorean de violeta y las Bacterias Gramnegativas
de color rojo grosella o rosado.
PROTOCOLO
CATEGORÍA BACTERIANA
GRAMPOSITIVAS
GRAMNEGATIVAS
MORFOLOGÍA BACTERIANA
ESQUEMA DE LA
OBSERVACIÓN
COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN
1. Cubrir el frotis con 05 gotas de Fucsina Fenicada y calentar la preparación con el mechero
de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por
03 veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con Alcohol Ácido hasta que se aprecie una coloración rosada, máximo hasta 01
minuto.
4. Lavar con agua corriente.
5. Cubrir con el colorante de contraste, Azul de Metileno, 03 gotas, durante 01 minuto.
6. Lavar con agua corriente.
7. Secar y observar con objetivo de inmersión.
RESULTADO: Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido
alcohol resistente se tiñen de color azul.
PROTOCOLO
LÁMINA
MORFOLOGÍA DEL
MICROORGANISMO
ESQUEMA DE LA
OBSERVACIÓN
COLORACIÓN DE ZIEHL
NEELSEN
CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol?
2. ¿Cuáles son los componentes del azul de metileno?
3. ¿Qué estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?
4. ¿A qué se debe que las bacterias Gramnegativas no retengan el complejo cristal violetayodo?
5. ¿A qué se debe que los colorantes básicos tiñan el núcleo de la célula?
6. ¿Con qué clase de colorante teñiría el protoplasma de la célula?
7. ¿Para qué clase de microrganismos es recomendable la coloración ácido alcohol
resistente?
8. ¿Cuál es la función de la fucsina fenicada?
9. ¿A qué se denomina colorante primario y colorante de contraste?
PRÁCTICA N° 03
MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS



Identificar y reconocer los medios de cultivo de uso frecuente en microbiología.
Conocer y describir los requerimientos nutricios necesarios para el crecimiento
microrganismos.
Preparar y autoclavar medios de cultivo.
de
INTRODUCCIÓN
MEDIOS DE CULTIVO
El término Cultivo hace referencia al crecimiento de microrganismos, por lo que los medios de
cultivo son sustancias nutritivas líquidas o solidas, que sirven en laboratorio para proporcionar
sustrato nutritivo para el crecimiento y multiplicación de los microorgansimos. Sus componentes
básicos deben satisfacer las exigencias nutricionales para el crecimiento microbiano y varian según
el tipo de bacteria.
Las condiciones que deben tomarse en cuenta para el crecimiento en medio de cultivo son:




Temperatura.
Grado de humedad.
Presión de oxígeno.
pH.
Los medios de cultivo permiten:






Crecimiento y desarrollo de microrganismos.
Aislamiento e identificación de los microrganismos.
Clasificación de los microrganismos.
Obtención de productos microbianos.
Obtención de cepas microbianas para la fabricación de vacunas.
Obtención de toxinas para la síntesis de antitoxinas
Para su crecimiento los microrganismos deben tomar del ambiente que lo rodea, todas las
sustancias que requiere para la síntesis de sus materiales celulares y energía. A estas sustancias se
les denomina nutrientes y un medio de cultivo debe tener la concentración adecuada de los
mismos acorde a los requerimientos específicos de los microrganismospara los que han sido
preparados. Y siendo los microrganismos extraordinariamente diversos, los medios de cultivo son
también muy diversos en cuanto a número y características nutricias.
AGUA
Para la preparación de medios de cultivo y reactivos diversos, sólo debe utilizarse agua destilada o
agua desmineralizada, libres de metales disueltos y compuestos bactericidas o bacteriostáticos.
EXTRACTO DE CARNE
Se puede usar cualquier marca de extracto de carne siempre y cuando produzca resultados
positivos, lo que no se debe usar es la infusión de carne.
PEPTONA
Es una proteína degradada para su fácil asimilación por los microrganismos. Se puede utilizar
cualquier peptona que previas pruebas conduzcan a resultados satisfactorios en el crecimiento de
microrganismos.
AZUCARES
Todos los azúcares usados para la preparación de medios de cultivo deben ser químicamente
puros y adecuados para propósitos bacteriológicos.
AGAR
Agente gelatinoso obtenido de algas marinas y que se emplea de forma granular o fragmentado
para la preparación de medios de cultivo.
REACTIVOS GENERALES
Todos los reactivos generales utilizados como ingredientes en los medios de cultivo deben ser de
grado ACS o de calidad analítica.
COLORANTES
Para la preparación de los medios de cultivo sólo deben emplearse colorantes certificados.
A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio de cultivo capaz de permitir el
crecimiento y desarrollo de diversos microrganismos heterótrofos.
TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO
A los medios de cultivo se les puede clasificar de las siguientes maneras:
I.
SEGÚN SU ESTADO FÍSICO
1. MEDIOS LIQUIDOS: Son los que se presentan en este estado. Se les denomina
Caldos.
2. MEDIO SÓLIDOS: Se preparan a partir de los medios líquidos , a los cuales se les
adiciona un agente gelificante, el Agar agar. Se les denomina Agares.
3. MEDIOS SEMISÓLIDOS: Se les prepara a partir de los medios líquidos y a los que
se les adiciona un agente gelificante pero en menor proporción que para los
sólidos.
II.
SEGÚN LA FUNCIÓN QUE CUMPLEN:
1. MEDIOS COMUNES: Son aquellos que poseen los componentes esenciales
mínimos para permitir el crecimiento de bacterias que no necesiten
requerimientos especiales. Ejemplos: Agua peptonada, Agar Nutritivo, Agar TSA
(Agar Tripticasa Soja), Agar Gelatina, Caldo Nutritivo, etc.
2. MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que se formar a partir de un medio común al
cual se le adiciona diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada. Pueden
ser:
2.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS: Cuando se les adiciona sustancias de mayor poder
nutritivo como huevos, extracto de levadura, sangre, vitaminas, etc. Sirven
para cultivar microrganismos exigentes en sus necesidades nutricionales. de
Ejemplos:

Agar Sangre: Cuando a un medio común se le adiciona entre 5 y 10%
de sangre. Permite el cultivp de bacterias patógenas.

Agar Ogawa o Lowenstein – Jensen: Medio enriquecido que permite el
cultivo de Mycobacterium tuberculosis(Bacilo de Koch).

Agar Chocolate: Se sintetiza al calentar el agar sangre a temperatura
entre 60 – 80°C, tomando el color chocolate característico. Sirve para
el
crecimiento
de
Neisseria
meningitis
(meningococo)
y
Neisseriagonorrhoeae (gonococo).

Caldo Cerebro – Corazón (Brain, Heart Infusión. BHI): Sirve para
microrganismos exigentes.

Caldo de Carne, Hemina y Vitamina K: Permite el crecimiento de
microrganismos anaerobios exigentes.
2.2. MEDIOS SELECTIVOS: Son medios de cultivo que tienen la finalidad de
favorecer el crecimiento y desarrollo de una bacteria y al mismo tiempo
inhibir el desarrollo de otras. Para este fin se le adicionan sustancias con
efectos INHIBIDORES tales como sal, colorantes, antibióticos o sales biliares. A
estos medios también se les denomina Medios de Aislamiento. Ejemplos:

Agar Mac Conkey, para E.coli y otras enterobacterias.

Agar Cetrimide, para Pseudomonas.

Agar Manitol Salado, para estafilococos.

Agar MitisSalivarius, para estreptococos orales.

Agar Clindamicina, para Eikenellacorrodens.

Agar GMC (Gelatina, Metronidazol y Cadmio), para el asilamiento de
Actynomicesviscosus,
Actynomicesnaeslundi
y
Actynomicesodontolyticus.

Agar TCBS, para Vibriumcholerae.

Agar Sabouraud, para hongos.
2.3. MEDIOS DIFERENCIALES: Son los medios que permiten evidenciar las
actividades bioquímicas de un microrganismo frente a sustrato determinado,
cambiando sus características observables y permitiendo su identificación.
Ejemplos:

Medio Ox – Ferm, para procesos de Oxidación y Fermentación.

Citrato de Simmons, para determinar el uso del citrato como fuente
decarbono.

TSI (Triple Azúcar Hierro), para determinar el uso de Lactosa, Glucosa
y producción de H2S.

LIA (Lisina Agar), para determinar el metabolismo de la Lisina.

Agar Manitol Salado, para determinar la reacción con el Manitol.

Agar Urea.

Agar SIM.
2.4. MEDIOS DE TRANSPORTE: Medios especiales que mantienen viables a los
microrganismos y permiten su transporte desde el lugar de muestra hasta el
laboratorio. Ejemplos:

Medio Cary Blair.

Medio Stuart.

Medio Amies.

Caldo Hajna.

Caldo de Tioglicolato.
A veces se combina las características de cada un de estos medios y por lo tanto el medio
resultante será Enriquecido, Selectivo y Diferencial. Esta clasificación es flexible y se plantea con
fines didácticos.
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
MATERIALES:

Agar común deshidratado.

Placas Petri.

Tubos de ensayo.

Mechero.

Algodón.

Gasa.

Papel kraft.

Hilo pavilo.

Matraces o balones.

Cocina eléctrica.

Plumón marcador.
PROCEDIMIENTO

Pesar los medios respectivos en relación con los volúmenes requeridos.

Disolver los medios en agua destilada y hervir en un matraz.

Esterilizar en autoclave a 121°C/15PSI por 15’.

Repartir en placas y tubos dentro del área de seguridad que brinda el mechero.

Se comprueba la esterilidad de los medios colocándolos en la estufa a 37°C por 24 horas.
CUESTIONARIO
1. Investigue y señale la composición del Agar Nutritivo y Agar Sangre.
2. Indique 05 medios de cultivo selectivos y su importancia.
3. esquematice las precauciones que se debe tener en la preparación de los medios de
cultivo: pesado, preparado y autoclavado.
4. Esquematice y dibuje lo realizado.
PRÁCTICA N°04
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS – LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS
OBJETIVOS:


Conocer e identificar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento de muestras
microbianas en medios de cultivo.
Conocer e identificar los tipos y características de crecimiento bacteriano en medios de
cultivo para su identificación final.
INTRODUCCIÓN
I.
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un
incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a
las 24 horas y otras necesitan un periodo prolongado para alcanzar su máximo desarrollo. Por esta
razón la siembra es uno de los pasos principales e iniciales del estudio completo de un
microrganismo y es indispensable ejecutarlo cumpliendo con las máximas condiciones de
esterilidad, desde la toma de muestra hasta la siembra, que debe ser efectuada a la brevedad
posible.
Es necesario precisar algunos términos:
SIEMBRA: Es el procedimiento por el cual se pone en contacto un microrganismo con el medio de
cultivo. Si el medio es sólido se formarán colonias y si el medio es líquido se observará turbidez,
sedimento, película, etc.
RESIEMBRA O AISLAMIENTO: Consiste en extraer, con un asa o aguja de kölle, una fracción de
colonia y sembrarla en un medio líquido o sólido, logrando así la pureza del cultivo.
TRANSPLANTE O REPICAJE: Consiste en la separación primaria de la cepa a un medio de cultivo
adecuado contenido en un tubo. Conservándose la cepa pura y por seguidos transplantes en
medios especiales, se conocerá las propiedades culturales y bioquímicas, lográndose su
identificación específica de aquella. Los transplantes se pueden realizar:
a)
b)
c)
d)
De líquido a sólido.
De líquido a líquido.
De sólido a líquido.
De sólido a sólido.
COLONIA: Es el conjunto de microrganismos resultantes del crecimiento y multiplicación en un
medio de cultivo sólido, y que está constituido por un mismo tipo de microrganismos.
CULTIVO PURO: Cultivo que consta de una sola especie bacteriana a partir de la cual se estudia sus
características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas.
CEPA: Es un cultivo puro plenamente identificado y ubicado en su taxonomía correspondiente.
MUESTRA BIOLÓGICA: Es cualquier material biológico de origen humano susceptible de
conservación y que alberga microrganismos. Pueden ser: sangre, orina, esputo, heces, LCR, uñas,
pelos, fluido gingival, paca dental, saliva, abscesos, etc.
TÉCNICAS DE SIEMBRA
La técnica de siembra a utilizar varía según el medio de cultivo a usar, ya sea líquidos o sólidos. Si
es líquido la Siembra por Inoculación será la indicada; si el medio es sólido las técnicas a usar
pueden ser Estría Simple, Por Puntura, Por Incorporación o Por Dispersión o Agotamiento.
SIEMBRA POR INOCULACIÓN
Con el asa de siembra previamente esterilizada, tomar una cantidad
suficiente de inóculo y ponerla en contacto con el medio líquido.
SIEMBRA POR ESTRÍA SIMPLE
Útil para estudio bioquímico y desarrollo bacteriano. Consiste en deslizar suavemente, en zigzag,
el asa de siembrasobre el medio de cultivo sólido contenido en una placa Petri o tubo.
SIEMBRA POR PUNTURA O PICADURA
Sirve para estudio bioquímico bacteriano. Con la aguja de kolle, tomar una pequeña cantidad de
muestra y sembrar introduciendo la aguja hasta cerca del fondo del tubo que contiene medio
sólido(a); después al momento de retirar la aguja de abajo hacia arriba hacer una estría simple(b).
a)
b)
SIEMBRA POR INCORPORACIÓN
Técnica que sirve para el recuento de bacterias y determinar si son anaeróbicas facultativas o
microaerófilas. Consiste en diluir la muestra y añadir el medio de cultivo licuado y enfriado a 45°C,
luego repartir la mezcla en placas Petri, dejar enfriar e incubar.
SIEMBRA POR DISPERSION O AGOTAMIENTO
Técnica utilizada para obtener colonias aisladas y consiste en repartir el inóculo sobre la superficie
del medio sólido en zigzag en 4 o 5 campos de la placa o también por estría simple en toda la
placa.
Giro de placa
45°
45°
45°
45°
MATERIALES









Agar TSA en placas y tubos.
Caldo nutritivo.
Mechero.
Asas de siembra.
Aguja de kölle.
Hisopos.
Solución salina fisiológica.
Tubos de ensayo
Láminas portaobjetos.
PROCEDIMIENTO



Identificar la técnica adecuada para la siembra y proceder a realizarla ya sea en un medio
líquido o sólido. Siempre con el asa o aguja de siembra esterilizada antes y después de su
uso.
La boca de los tubos se flamean al destaparlos y antes de volver a tapar.
Las manipulaciones de siembra se deben realizar en el área de seguridad que brinda el
mechero.

Una vez realizada la siembra y rotuladas las placas y tubos, proceder a incubar en la estufa
a 37°C por 24 horas, al cabo de las cuales se hace la lectura correspondiente.
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS
Si se han seguido correctamente las técnicas de siembra y cultivo, sobre algunos planos del medio,
se podrá visualizar masas microbianas definidas y separadas entre si, llamadas colonias en medio
sólido; y turbidez, sedimento, película o flóculos en medio líquido.
Cada colonia es el resultado de la multiplicación logarítmica de una bacteria depositada en un
punto del medio sólido, que en condiciones óptimas de crecimiento forman una progenie con sus
características de especie o de grupo, las cuales nos permitirán su identificación.
Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:
FORMA: Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.
ELEVACIÓN: Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE: Entera, ondulado, dentado, filamentoso.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, granulada.
TAMAÑO: Diámetro en milímetros.
CONSISTENCIA: Cremosa, membranosa, mucosa.
CROMOGENENESIS: Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.
GRADO DE TRANSPARENCIA: Transparente, translúcido, opaco.
MATERIALES







Cultivos en placa Petri, sembradas por técnicas diversas.
Cultivos en medio diferenciales de diferentes microrganismos.
Set de coloración Gram.
Lápices.
Gradilla.
Microscopio.
Aceite de cedro.
PROTOCOLO
TÉCNICA DE SIEMBRA
DESCRIPCIÓN DE LA SIEMBRA
MEDIO DE CULTIVO USADO
OBSERVACIÓN DE COLONIAS
MEDIO DE CULTIVO USADO
ESTRÍA SIMPLE
DISPERSIÓN AGOTAMIENTO
PUNTURA
INOCULACIÓN
CARACTERISTICAS DE LA COLONIA
FORMA
ELEVACIÓN
BORDES
SUPERFICIE
TAMAÑO
CONSISTENCIA
CROMOGÉNESIS
GRADO DE TRANSPARENCIA
RESULTADO DE SIEMBRAS REALIZADAS:
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
Cuál es el fin de usar una siembra por estría simple?
Cuál es el objetivo de la siembra por estría por dispersión o agotamiento?
Para qué sirve la siembra por puntura?
De sus placas y tubos sembrados, describa las características morfológicas de las colonias
encontradas.
5. Esquematice las observaciones de la práctica.
PRÁCTICA N°05
PRIMERA PRÁCTICA CALIFICADA
PRÁCTICA N°06
METABOLISMO BACTERIANO
OBJETIVOS:


Reconocer e identificar los diferentes sistemas enzimáticos usados en el metabolismo
bacteriano.
Utilizar las características metabólicas para el aislamiento e identificación bacteriana.
INTRODUCCIÓN
La identificación bacteriana en forma inicial pude realizarse mediante la determinación de las
características de las colonias y a través de las diferentes tinciones; sin embargo para identificar
una bacteria desconocida a nivel de género y especie, no basta con un aislamiento, sino que deben
llevarse a cabo ciertos estudios de los sistemas enzimáticos que son únicos para cada género y
especie y sirvan como marcadores de identificación.
A nivel de laboratorio, estos sistemas enzimáticos se van a identificar sembrando una porción de
colonia bacteriana aislada en los diferentes medios de cultivos que contienen sustrato e
indicadores químicos específicos que nos permiten detectar cambios de pH o la presencia de
subproductos específicos, características que nos permitirán la identificación bacteriana.
I.
REACCIONES DE OXIDACION – FERMENTACION DE AZUCARES
MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)
Este medio de cultivo fue diseñado para la diferenciación de bacilos gramnegativos,
basándose en la capacidad de estas bacterias para fermentar azúcares, producir sulfuro
de hidrogeno (H2S) y producir Gas.
El medio contiene tres carbohidratos: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de
1:10:10 respectivamente, y para detectar los productos ácidos generados, se emplea u
indicador de pH, el rojo fenol, cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8
(amarillo). Los patrones de fermentación de los bacilos gramnegativos ante los azúcares
presentes en el medio, pueden ser fundamentalmente tre:
a) Fermentación de glucosa únicamente.
b) Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos
carbohidratos.
c) No fermentación de carbohidratos.
Como producto de fermentación de los azucares, se puede formar Gas, que se detecta por
la presencia de burbujas, grietas o desplazamientos del medio de cultivo en el tubo.
De igual manera al medio se le ha adicionado Tiosulfato de Sodio como fuente de azufre
para generar H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado de
color negro insoluble denominado Sulfuro ferroso (FeS).
MATERIAL


Tubo con TSI en plano inclinado.
Cepas de control: Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella typhi.
PROCEDIMIENTO


Con el asa de kolle, haga una siembra por puntura en el tubo con TSI.
Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.
INTERPRETACION
1. FERMENTACIÓN DE AZUCARES

Alcalina/alcalina: Lactosa y Sacarosa (-), Glucosa (-) (K/K): Rojo/rojo o anaranjado
Ejemplo: Pseudomonas

Acida/Acida: Lactosa y Sacarosa (+) y Glucosa (+) (A/A): Amarillo/ amarillo
Ejemplo: E. coli, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, etc

Alcalina/Acida: Lactosa y Sacarosa (-) y Glucosa (+) (K/A): Rojo/amarillo
Ejemplo: Salmonella (H2S+), Shigella (H2S -), Yersinia.
2. PRODUCCION DE H2S
 Producción de pigmento negro en fondo de tubo:
 No pigmento negro en fondo de tubo:
H2S (+)
H2S (-)
3. PRODUCCION DE GAS
 Presencia de burbujas, grietas o desplazamiento en medio :
 No burbujas, no grietas, no desplazamientos:
II.
Gas (+)
Gas (-)
PRUEBA DE LA CATALASA
La Catalasa es una enzima que posee la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas y que va a convertir el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxigeno, de
acuerdo a la siguiente reacción:
2H2O2
2 H2O + O2
El peróxido de hidrogeno es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los
carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo.
Esta prueba es vital para la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativa) y los
estafilococos (catalasa positiva)
MATERIALES





Cepas control: S. aureus y Streptococcus o Enterococcus.
Solución de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 3%.
Láminas portaobjeto.
Asa de siembra.
Gotero.
PROCEDIMIENTO





Con el asa de siembra estéril, transferir parte el inóculo a una lámina portaobjeto.
Añadir 1 o 2 gotas de H2O2 al 3%.
Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después de añadir las gotas
de H2O2 al 3%.
Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.
Precauciones: La prueba debe realizarse en cultivos hasta de 24 horas, cultivos
más viejos pueden perder su actividad catalasa dando un falso negativo. Además
evitar el contacto de peróxido de hidrogeno con la piel.
INTERPRETACION


Formación de burbujas o efervescencia
No formación de burbujas y efervescencia
: Catalasa Positiva.
: Catalasa Negativa.
Nota: Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el
H2O2 dando pocas burbujas diminutas durante 20 – 30´, estas no son Catalasa positiva.
III.
PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA
Los Citocromos son hemoproteínas que actúan como último eslabón de la cadena
respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxigeno con formación de agua. Este
sistema de citocromos se encuentran en los microrganismos aerobios y anaerobios
facultativos, permitiéndonos identificar a los microrganismos que carecen de la enzima y
los anaerobios anaerobios estrictos.
En laboratorio se ahce reaccionar a la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o
tetrametil - p – fenilendiamina (Reactivo de Kovacs), y que se presenta en solución, discos
o tiras llamados comúnmente oxidasa.
MATERIAL



Cepa control: sembrada previamente en agar nutritivo.
Reactivo oxidasa.
Goteros.
PROCEDIMIENTO

Método Directo: Se añade directamente a las placas sobre las colonias bacterianas
02 o 03 gotas del reactivo oxidasa.
INTERPRETACION


IV.
Colonias bacterianas con actividad citocromo oxidasa viran a color lavanda :
Oxidasa Positivo
Colonias bacterianas sin actividad citocromo oxidasa no viran de color :
Oxidasa Negativo
PRUEBA DEL MANITOL
Para esta prueba se utiliza el agar manitol salado, medio de cultivo selectivo y diferencial
que permite el crecimiento de estafilococos, y que en su composición cuenta con el
sustrato Manitol, el cual tras su fermentación se libera ácidos que serán detectados por el
indicador rojo fenol el cual hará viraje a color amarillo.
Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus del Staphylococcus epidermidis y
otras especies perteneciente a este género bacteriano.
MATERIAL



Cepas de S.aureus y S. epidermidis.
Placas Petri con agar manitol salado.
Asas de siembra.
PROCEDIMIENTO


Realizar siembra por estría simple de ambas cepas bacterianas.
Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.
INTERPRETACION : A la observación macroscópica de las colonias bacterianas en agar
manitol salado:


Presencia de colonias amarillas y medio con halos de color amarillo :
Manitol Positivo
Presencia de colonias blancas o cremas con medio sin cambio de color:
Manitol Negativo
V.
PRUEBA DE LAS HEMOLOSINAS
Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir enzimas y toxinas que pueden
ser detectadas al sembrar los microorganismos en placas con Agar Sangre, produciendo la
lisis de los eritrocitos. Esta capacidad de los microorganismos se relaciona directamente
con su virulencia y patogenicidad. Ahora según el tipo de lisis que producen se pueden
clasificar en Hemolisinas Alfa, que producen una lisis parcial o incompleta de eritrocitos; y
Hemolisinas Beta, productoras de una lisis total o completa.
MATERIAL


Cepa bacteriana.
Placas con Agar Sangre.
PROCEDIMIENTO


Con el asa de kölle realizar una siembra por estria simple en una placa con agar
sangre.
Incubar a 37°C por 24 horas.
INTERPRETACION



Hemólisis Parcial ------- Presencia de halos verduzcos grisáceos -------- Hemólisis Alfa
Hemólisis Total ------- Presencia de halos transparentes
-------- Hemólisis Beta
No hemólisis
------- No presencia de halos
-------- Hemólisis Gamma
En la hemolisis alfa, el enverdecimiento del medio se debe a la salida de un derivado del
tipo de la metahemoglobina, que al ser oxidado ser convierte en un compuesto del tipo de
la biliverdina.
VI.
PRUEBA DE LA COAGULASA
La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la
conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre
diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la
muestra contiene S. aureus.
La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama
staphylothrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina.
Esto hace que se coagule la sangre.
La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y
puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que
está cubierta de fibrina del Staphylococcus es capaz de resistir la fagocitosis haciendo que
esta bacteria tenga un factor de virulencia mayor.
MATERIALES



Cepa de S.aureus y S. epidermidis.
Tubos con plasma sanguíneo.
Asas de siembra.
PROCEDIMIENTO

Con el asa de kölle, realizar una siembra por inoculación en los tubos de plasma
sanguíneo.
Incubar a 37°C por 4 horas.

INTERPRETACION


VII.
Si hay coagulación de plasma ------No hay coagulación de plasma -------
Coagulasa Positivo
Coagulasa Negativo
PROTOCOLO
PRUEBA BIOQUIMICA
MEDIO DE CULTIVO
REACTIVO O
INDICADOR
LECTURA
TSI:
a)
b)
c)
d)
Glucosa:
Lactosa:
H2S
Gas
CATALASA
CITOCROMO OXIDASA
MANITOL
HEMOLISINAS
COAGULASA
CUESTIONARIO:
Esquematice y grafique los resultados obtenidos en la lectura de las pruebas bioquímicas
anteriormente realizadas.
PRÁCTICA N°07
ACCIÓN DE AGENTES FISICOQUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO
ANTIBIOGRAMA
OBJETIVOS:


Reconocer e identificar los factores físicos químicos que influyen sobre el crecimiento
bacteriano.
Conocer e identificar el uso del antibiograma para determinar sensibilidad bacteriana a
fármacos antibióticos.
INTRODUCCIÓN
Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en función de su fondo
genético, en relación con los nutrientes, y en unas hipotéticas condiciones ideales (óptimas). Sin
embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores
ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos que:
1. Modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores
de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;
2. Condicionan la distribución de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitats
naturales.
3. Permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de
parámetros para: a) La mutagénesis. b) La esterilización y desinfección. c) La
quimioterapia.
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así,
unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser
neutras o beneficiosas para otra. Además conviene distinguir entre los efectos que un
determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar
al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de reproducción. Los principales
tipos de factores a considerar son:
Agentes Físicos
Agentes Químicos
Temperatura
Desinfectantes y antisépticos
Desecación
Quimioterápicos de síntesis
Radiaciones
Antibióticos
Ondas sonoras
Presión hidrostática
Presión osmótica
El Antibiograma es una prueba en laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad
antibacteriana de los antibióticos y quimioterápicos empleados, permite por lo tanto seleccionar
el antibiótico o quimioterápico mas adecuado para la terapia de enfermedades infecciosas.
Consiste en sembrar la muestra de estudio sobre la superficie de una placa de Agar Müeller
Hinton o TSA, y luego colocar discos de sensibilidad que contienen antibióticos y después de una
incubación de 24 horas se observan las zonas de inhibición alrededor del disco.
En la presente práctica, el método utilizado es le Difusión en Agar, según Kirby – Bauer y col.
MATERIALES

















Placas con Agar TSA.
Placas con Agar Müellen Hinton
Tubos con caldo nutritivo
Tubos y placas con cultivo bacterianos
Asas de siembra.
Hisopos estériles.
Discos de papel filtro.
Discos de sensibilidad antibiótica para grampositivos.
Discos de sensibilidad antibiótica para gramnegativos
Pinza porta algodón.
Mechero.
Vasos dapen
Agua oxigenada
Eugenol
Savlon
Alcohol medicinal
Alcohol yodado
PROCEDIMIENTO 01: DISCOS IMPREGNADOS CON DESINFECTANTES Y ANTISEPTICOS .





Hacer siembra por difusión en una placa con agar TSA.
Con la pinza porta algodón, coger los discos y sumergirlos en los vasos dapen conteniendo
los desinfectantes y antisépticos.
Colocar los discos impregnados con los diferentes desinfectantes y antisépticos sobre la
superficie del agar, en forma equidistante.
Incubar a 37°C durante 24 horas
Lectura y medición en mm de las zonas de inhibición.
PROCEDIMEINTO 02: TUBOS INOCULADOS VS TEMPERATURA


Inocular los tubos con caldo nutritivo.
Colocar el Tubo 1 en baño maria a 37°C durante 15 minutos.



Colocar el Tubo 2 en baño maria a 70°C duarnte 15 minutos.
Incubar ambos tubos a 37°C durante 24 horas.
Lectura de crecimiento bacteriano.
PROCEDIMEINTO 03: ANTIBIOGRAMA





Sumergir los hisopos estériles en los cultivos bacterianos, escurrirlos en las paredes del
tubo y sembrar uniformemente sobre la superficie del Agar Müellen Hinton.
Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente.
Con la pinza estéril, colocar los discos impregnados con antibióticos sobre la superficie del
agar. La distancia entre los discos debe ser de 20 mm.
Incubar a 37°C durante 24 horas.
Lectura:
o Medir en mm el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano
alrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco.
o Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y
determinar la sensibilidad del microorganismo: Resistente (R), Intermediio (I) o
Susceptible (Sensible) (S), a los diferentes antimicrobianos utilizados.
o Anotar e interpretar los resultados.
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados obtenidos en la práctica.
Mediante dibujos o fotografías, fundamentar los resultados del cuadro anterior.
Cual es la importancia de la aplicación del antibiograma?
Qué indica la Resistencia o Susceptibilidad de un microrganismo en un antibiograma?
Qué indica un resultado Intermedio en esta prueba?