Resumen in extenso 2006 - Universidad Autónoma del Estado de

CINÉTICA DE BIODEGRADACIÓN DE FENOL POR GRÁNULOS AEROBIOS
Claudia CALVARIO1, Violeta VALERA1, Julio WAISSMAN2 y Gabriela VÁZQUEZ1
1
Centro de Investigaciones Químicas. 2Centro de Investigación en Tecnologías de
Información y Sistemas Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo Carr.
Pachuca-Tulancingo km. 4.5, C.P. 42076 Pachuca, Hgo., México; Tel: (771)
7172000 ext. 6501; Fax ext. 6502; e-mail: [email protected]
Palabras clave: Tratamiento del agua, granulación aerobia, molécula tóxica
RESUMEN
Como estrategia de sobrevivencia, la inmovilización confiere a los
microorganismos la capacidad de soportar concentraciones relativamente altas de
sustratos que podrían ser inhibitorios, tales como el fenol. Se llevó a cabo un
estudio de la cinética de degradación de fenol en un amplio rango de
concentraciones iniciales (40 - 1013 mg/L) por parte de gránulos aerobios
aclimatados a 100 mg/L, y se encontró que cuanto mayor era la concentración
inicial de fenol empleada, la velocidad específica de degradación se veía afectada
por la producción y acumulación de metabolitos intermediarios.
1. INTRODUCCIÓN
Las biopelículas son comunidades complejas de microorganismos que se
encuentran adheridas entre sí o a una superficie gracias a polímeros
extracelulares tales como el glicocálix (75%) (Betancourth et al., 2004). Dicho
exopolímero es producido por los mismos microorganismos, y forma una matriz
adherente en donde éstos quedan atrapados y pueden organizarse en colonias
con diferentes requerimientos metabólicos. Una biopelícula puede estar formada
por una especie o bien por consorcios bacterianos muy diversos (Costerton et al.,
1995). Las conformaciones microbianas presentan características como:
heterogeneidad (lo que las hace organizaciones únicas que pueden estar
conformadas por bacterias, hongos y protozoos), diversidad de microambientes
(pH, tensión O2, concentración de iones, carbono, nitrógeno), resistencia a
antimicrobianos (ya que éstos no tienen acceso a los microorganismos situados a
mayor profundidad), y capacidad de comunicación intercelular (quorum sensing)
que las convierten en complejos difíciles de erradicar de los ambientes donde se
establecen (Betancourth et al., 2004).
1.1 Formación de las biopelículas
La biopelícula bacteriana comienza a formarse cuando una célula individual se
une a una superficie. Después de la unión inicial, la célula comienza a crecer y a
esparcirse sobre la superficie en una monocapa, al mismo tiempo que forma
microcolonias.
1
En general, cuando hay flujo de agua sobre una superficie sólida, las bacterias
presentes en el agua se adhieren a la superficie y comienzan a crecer hasta que
eventualmente la biopelícula se estabiliza. En las biopelículas, las bacterias viven
de la energía que adquieren de las transformaciones del sustrato, la fuente de
carbono disponible y las sustancias traza necesarias que se encuentran en el
agua (Wik, 1999). Los sustratos involucrados en las reacciones son transportados
principalmente por difusión dentro y fuera de la biopelícula, donde las reacciones
tienen lugar (Fig. 1). En los procesos aerobios, la mayor parte del oxígeno
requerido para las reacciones es introducido en la interfase aire-agua, a partir de
la cual también se difunden productos gaseosos, tales como el dióxido de
carbono. El espesor de la biopelícula es gobernado por el crecimiento y
decaimiento de las bacterias, así como por la erosión de la biopelícula y la
adsorción de material presente en el agua (Arvin y Harremoës, 1990).
Figura 1. Ilustración de los fenómenos básicos en las biopelículas.
Adaptado de: Wik (1999).
Las biopelículas pueden crecer ya sea en forma espontáneamente grande o en
gránulos densos (Lettinga et al., 1980), adheridas a una superficie sólida estática
(biopelículas estáticas) o sobre soportes suspendidos (biopelículas de partículas
soportadas), o bien adheridas entre sí.
La morfología de la biopelícula es influenciada por una alta carga del sustrato y las
fuerzas de separación aplicadas durante su formación (Tijhuis et al., 1995; Kwok et
al., 1998). Una carga del sustrato moderada y una elevada fuerza de separación
favorecen la formación de biopelículas lisas y fuertes, mientras que la combinación
de una alta carga de sustrato y una baja fuerza de separación lleva a biopelículas
ásperas. La fuerza de las biopelículas también se relaciona con las fuerzas de
separación aplicadas durante la formación de la biopelícula, en combinación con la
carga del sustrato.
Las biopelículas son de gran interés en el tratamiento de aguas residuales, ya que
ofrecen diversas ventajas con respecto a células individuales suspendidas, debido
a que facilitan la separación célula-líquido. Así mismo, toman un papel muy
importante en la biorremediación del suelo o de aguas subterráneas, en donde
2
transforman agentes contaminantes a formas menos dañinas (Nicolella et al.,
2000).
1.2 Formación de gránulos aerobios
El crecimiento de los gránulos aerobios es un caso especial de desarrollo de
biopelícula. Los gránulos microbianos pueden ser considerados como agregados
microbianos más densos que los lodos activados y con forma externa esferoidal.
Casi todos los gránulos aerobios han sido cultivados en reactores SBR
(Sequencing Batch Reactor, reactores discontinuos de alimentación secuenciada).
El sistema SBR es un diseño modificado del proceso convencional de lodos
activados y ha sido extensamente usado en el tratamiento de aguas residuales
municipales e industriales.
Beun et al. (1999) utilizaron la tecnología granular aerobia en reactores SBR. El
sistema empleado consistía de una columna de burbujeo, en la cual el agua
residual es tratada en aerobiosis con biomasa granular. Al comienzo de todos los
ciclos se agrega agua residual al reactor, dando inicio a la aireación y a la
conversión de la materia orgánica. Al final del ciclo, la aireación se apaga y los
gránulos sedimentan en pocos minutos, mientras que el efluente clarificado es
removido por la parte superior del reactor. Así, estos autores obtuvieron una alta
concentración de biomasa y elevados porcentajes de remoción de materia
orgánica en un solo reactor, utilizando un agua residual sintética. Morgenroth et al.
(1997) utilizaron un sistema semejante pero a mayor escala para el tratamiento de
melazas, obteniendo también buenos resultados. También se ha reportado el uso
de la tecnología de granulación aerobia en el tratamiento de aguas residuales con
altas cargas de contenido orgánico, nitrógeno y fósforo (Liu y Tay, 2004).
1.3 El fenol como contaminante del agua
El fenol es un contaminante comúnmente encontrado en numerosas aguas
residuales industriales. El fenol puede ser tóxico para algunas especies acuáticas
a concentraciones por debajo de 1 mg/L (Tay et al., 2004) y causa problemas de
sabor y olor en el agua potable a concentraciones más bajas. Por consiguiente su
remoción de las aguas residuales es de obvio interés. Aunque la degradación del
fenol por vía biológica es generalmente preferible, el contenido de fenol en las
aguas residuales dificulta que sea tratada por medio biológico ya que resulta ser
un sustrato inhibidor.
Poco se sabe acerca de la capacidad de los gránulos aerobios para degradar
químicos tóxicos tales como el fenol. Por lo tanto, el principal objetivo de este
estudio fue evaluar la utilidad de los gránulos aerobios para la biodegradación de
fenol, así como el efecto que puede causar la formación de metabolitos
intermediarios en la degradación del mismo a diferentes concentraciones de fenol.
Este trabajo podría contribuir a mejorar el entendimiento sobre la capacidad de los
gránulos aerobios para tratar aguas residuales industriales que contengan
químicos inhibitorios para el crecimiento microbiano y la biodegradación.
3
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Cultivo y aclimatación de gránulos aerobios.
En la Figura 2 se muestra una representación esquemática de la instalación del
reactor empleado, basada en el proceso de Beun et al. (1999). El reactor tiene la
configuración empleada por Valera et al. (2005), así como las mismas condiciones
de operación.
Biociclo
D Diá m et r o de la colu m n a
h Alt u r a de la colu m n a
h b Alt u r a de la boqu illa
de sa lida del eflu en t e
In flu en t e
Difu sor
Bom ba
Depósit o del
in flu en t e
Depósit o del
eflu en t e
Alt u r a de sedim en t a ción
P C + pr ogr a ma
DOS
E flu en t e
Air e
Figura 2. Representación esquemática del SBR granular.
El inóculo consistió en el sobrenadante de lodos activados muestreados en el
tanque de aireación de una planta de tratamiento de aguas residuales domésticas.
La relación volumétrica de inoculación fue de 200 mL por 1.1 L de medio.
En la primera etapa del estudio, se empleó agua residual sintética para validar el
método de granulación propuesto por Beun et al. (1999). Una vez obtenidos los
gránulos, se repitió la operación añadiendo gradualmente fenol al sustrato original.
Para los ensayos de adaptación de los gránulos a esta molécula tóxica, se
adicionó fenol al medio a una concentración final de 100 mg/L.
2.2 Estudio cinético de la biodegradación de fenol en matraces agitados.
El estudio cinético de biodegradación de fenol se llevó a cabo en matraces
agitados en un baño de agua a 120 rpm y a una temperatura de 25ºC. Se colocó
en cada uno de los matraces 400 mL de agua residual sintética desprovista de
4
etanol, además de un inóculo de biomasa granular (alrededor de 2 g). Las
concentraciones de fenol estudiadas variaron entre 40 y 1013 mg/L.
2.3 Métodos de análisis
Los métodos analíticos principales del estudio se refieren a la concentración de
DQO (Demanda Química de Oxígeno), sólidos suspendidos totales (SST) para la
cuantificación de la biomasa, la concentración de fenol y la determinación del
metabolito intermediario. Las dos primeras técnicas se llevan a cabo según los
métodos estándar de la APHA (1989; 5220.D y 2540.D, respectivamente). En
cuanto a la concentración de fenol, esta se determinó según el método establecido
por Woolard e Irvine (1995), mientras que el análisis del intermediario se realizó
colorimétricamente de acuerdo al protocolo establecido por Mörsen y Rehm,
(1989).
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Cultivo y aclimatación de gránulos aerobios
Una vez arrancado el reactor, se procedió a esperar la formación de los primeros
gránulos; sin embargo, debido a que el flujo de aire suministrado no era el
adecuado (2.8 L/min), no se logró la obtención de éstos, por lo que se procedió a
aumentar dicho flujo (4.8-5 L/min). Una vez hecho ésto y luego de 7 días de
operación, se observaron los primeros gránulos en el reactor, los cuales tenían un
diámetro aproximado de 1 mm, una coloración amarillenta y se desintegraban
fácilmente al tacto. Cuando los gránulos maduraron, después de 40 días de cultivo
a las mismas condiciones, la cantidad de biomasa se incrementó gradualmente en
el reactor hasta alcanzar un estado estable, con un diámetro promedio de los
gránulos mayor a 3 mm. Además, hubo un incremento notable en cuanto a su
resistencia y su densidad. En la Figura 3 se observa una fotografía obtenida por
microscopia electrónica de barrido de un gránulo aerobio después de 10 meses de
operación.
Figura 3. Gránulo aerobio después de 10 meses de operación.
5
Se probaron dos cargas másicas distintas (1.59 y 2.45 KgDQO/m3·d),
obteniéndose remociones del 77 y del 88%, respectivamente. Al aumentar la carga
másica aumentó también la velocidad específica de consumo de materia orgánica
(qs) de 24.7 a 53.5 mgDQO/gSST·h.
Al adicionar el fenol (100 mg/L) al medio de cultivo, se observó una adaptación
casi inmediata de los gránulos, ya que la qs se mantuvo (53.7 mgDQO/gSST·h) y
se registraron remociones de fenol del 100%.
3.2 Cinética de degradación de fenol y de producción del metabolito
intermediario
Una vez aclimatados los gránulos aerobios, se llevó a cabo un estudio cinético de
biodegradación de fenol a diferentes concentraciones iniciales. Dicho estudio
mostró que los gránulos aerobios degradan el fenol siguiendo una cinética de
Haldane-Andrews.
Wang y Loh (1999), reportaron que la ruptura del anillo aromático del fenol por la
vía meta es acompañada de la acumulación de un metabolito intermediario, el
semialdehído ácido 2-hidroximucónico (2-HMAS), cuya producción está en función
de la concentración inicial de fenol. Dicho intermediario se ha relacionado con un
color amarillento en el medio de cultivo. Estos autores propusieron también un
modelo matemático basado en la ecuación de Haldane-Andrews donde se
consideró el efecto inhibitorio causado por la producción y acumulación de
metabolitos intermediarios tales como el 2-HMAS. El modelo propuesto se ajustó
de manera adecuada a la biodegradación de fenol por parte de Pseudomonas
putida en un cultivo discontinuo para concentraciones de fenol en el rango de 25 a
800 mg/L.
En la Figura 4 se muestran algunas de las cinéticas obtenidas. Se observa que la
degradación del fenol por parte del consorcio microbiano empleado está
acompañada de la formación del intermediario (probablemente 2-HMAS), cuya
concentración alcanza un máximo cuando el fenol se agota. Además, la velocidad
de consumo de fenol disminuye cuando el metabolito intermediario comienza a
presentarse, lo cual es función de la concentración inicial de fenol utilizada. Así
mismo, se pudo corroborar la aparición del color amarillento en el medio de cultivo
cuando la concentración de fenol era mínima.
6
0.8
60
0.6
40
0.4
20
0.2
0
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
250
1.0
200
0.8
150
0.6
100
0.4
50
0.2
0
Concentración de 2-hmas [mg/L]
80
Concentración de fenol [mg/L]
1.0
Concentración de 2-hmas [mg/L]
Concentración de fenol [mg/L]
100
0.0
0
1
Tiempo [h]
2
3
4
5
6
7
Tiempo [h]
A
B
Figura 4. Degradación de fenol y evolución del metabolito intermediario a distintas
concentraciones iniciales de fenol: (A) 84; (B) 209 mg/L
4. CONCLUSIONES
La capacidad para tolerar y degradar altas concentraciones de fenol es deseable
en sistemas de tratamiento biológico de aguas residuales, tal que pueda facilitar el
tratamiento de altas cargas de aguas residuales industriales. La agregación
microbiana como estrategia de autoinmovilización, confiere a las bacterias la
capacidad de resistir altas concentraciones de sustratos inhibitorios, los cuales
podrían ser tóxicos para cultivos de células individuales en suspensión.
Se observó que los gránulos conservaron la capacidad para degradar fenol aún a
concentraciones del orden de 1013 mg/L. No obstante, la velocidad específica de
degradación de fenol (qs) por parte de gránulos aerobios se relaciona con la
concentración inicial de fenol, ya que cuanto mayor es dicha concentración, la
producción y acumulación de metabolitos intermediarios también se incrementa.
Así, la producción y acumulación de metabolitos intermediarios parece controlar la
cinética de biodegradación de fenol, lo que deberá confirmarse en estudios
posteriores.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el financiamiento otorgado para este proyecto por parte de
CONACYT (SEP-2003-C02-45394) y PROMEP.
REFERENCIAS
APHA (1989). American Public Health Association. Standard methods for the examination
of water, 17th Edition, Baltimore.
Arvin E. y Harremoës P. (1990). Concepts and models for biofilm reactor performance.
Water Sci. Technol. 22(1/2), 171-192.
7
Betancourth M., Botero J. E. y Rivera S. P. (2004). Biopelículas: una comunidad
microscópica en desarrollo. Colomb. Med. 35 (Supl 1), 34-39.
Beun J.J., Hendricks A., van Loosdrecht M.C.M., Morgenroth E., Wilderer P.A. y Heijnen
J.J. (1999). Aerobic Granulation in a Sequencing Batch Reactor. Water Res. 33(10), 22832290.
Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R. y Lappin-Scott H.M. (1995).
Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745.
INE (2000). Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud Ambiental. Agua para
uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe
someterse el agua para su potabilización.
Kwok W.K., Picioreanu C., Ong S.L., van Loosdrecht M.C.M., Ng W.J. y Heijnen J.J.
(1998). Influence of biomass production and detachment forces on biofilm structures in a
biofilm airlift suspension reactor. Biotechnol. Bioeng. 58, 400–407.
Lettinga G., van Velsen A.F.M., Homba S.W., de Zeeuw W. y Klapwijk A. (1980). Use of
the upflow sludge blanket reactor concept for biological wastewater treatment especially
for anaerobic treatment. Biotechnol. Bioeng. 22, 699-734.
Liu Y. y Tay J.H., (2004). State of the art of biogranulation technology for wastewater
treatment. Biotechnol. Adv. 22, 533-563.
Morgenroth E., Sherden T., Van Loosdrecht M.C.M., Heijnen J.J. y Wilderer P. A. (1997).
Aerobic granular sludge in a sequencing batch reactor. Water Res. 31(12), 3191-3194.
Mörsen A. y Rehm H. (1989). Degradation of phenol by a defined mixed culture
immobilized by adsorption on activated carbon and sintered glass. Appl Microbiol
Biotechnol 33, 206-212.
Nicolella C., van Losdrecht M.C.M. y Heijnen J.J. (2000). Wastewater treatment with
particulate biofilms reactors. Biotechnol Bioeng. 80: 1-33
Tay J.H., Jiang H.L. y Tay S.T.-L. (2004) Aerobically grown microbial granules for phenol
biodegradation. Civil Eng. Res. 54-55.
Tijhuis L., van Loosdrecht M.C.M. y Heijnen J.J. (1995). Dynamics of biofilm detachment in
biofilm airlift suspension reactors. Biotechnol. Bioeng. 45, 481-487.
Valera D.V., Calvario R.C.I., Martínez H.H.E., Waissman V.J y Vázquez R.G.A. (2005).
Desarrollo de un proceso biológico para el tratamiento de fenol utilizando biomasa
granular. Rev. Int. Contam. Amb. 21, Supl. 1, 1131-1136.
Wang S.J. y Loh K. C. (1999). Modeling the role of metabolic intermediates in kinetics of
phenol biodegradation. Enzyme Microb. Technol. 25, 177-184
Wik T. (1999). On Modeling the Dynamics of Fixed Biofilm Reactors with focus on nitrifying
trickling filters. Tesis de Doctorado. Chalmers University of Technology. Göteborg, Suecia.
(fecha
de
último
acceso
11
de
febrero
de
2006).
Disponible
en:
http://db.s2.chalmers.se/download/theses/phd_365.pdf
Woolard C.R. e Irvine R.L. (1995). Treatment of hypersaline wastewater in the sequencing
batch reactor. Water Res. 29(4), 1159-1168.
8