guión de prácticas Biología Molecular (GBS)

Unidad Docente de
Bioquímica y Biología Molecular
Departamento de Biología de Sistemas
Prácticas de Biología Molecular
Inducción y detección de la expresión de una
proteína en bacterias
EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA p66 DEL VIH EN CÉLULAS DE E. coli TRANSFORMADAS CON Pet 24d>a p66
Y DETECCIÓN MEDIANTE INMUNOENSAYO WESTERN
Introducción
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH, o HIV en inglés) es un retrovirus que conduce a una pérdida de
función del sistema inmune, causando así infecciones oportunistas. El VIH infecta principalmente las células T
ayudadoras (específicamente CD4+), macrófagos y células dendríticas. Este virus causa una disminución de las
células CD4+ mediante tres mecanismos principales:
1. Muerte directa de las células infectadas.
2. Elevación de la tasa de apoptosis en las células infectadas.
3. Reconocimiento y muerte de las células infectadas por linfocitos CD8 citotóxicos.
Cuando el número de células CD4+ disminuye hasta llegar a un nivel crítico, la inmunidad mediada por células se
pierde y el cuerpo se vuelve de manera progresiva más susceptible a infecciones oportunistas.
El VIH está clasificado dentro el género Lentivirus de la familia Retroviridae. Los lentivirus tienen características
morfológicas y biológicas comunes entre sí e infectan diversas especies, causando enfermedades de larga
duración con prolongados tiempos de incubación. Los lentivirus se transmiten como RNA monocatenario positivo
que, al entrar en la célula diana, se usa para sintetizar DNA bicatenario por una transcriptasa inversa codificada en
el gen pol del virus. La transcriptasa inversa es un heterodímero compuesto por dos subunidades (p66 y p51).
En esta práctica se expresará la subunidad p66 de la transcriptasa inversa de VIH-1 unida a un epítopo T7, que
contiene 11 aminoácidos (MASMTGGQQMG) de la proteína mayor de la cápside del bacteriófago T7 y permite su
identificación con un anticuerpo específico. Posteriormente se realizará un inmunoensayo de tipo western
(inmunoblot) para detectar de manera específica la proteína expresada.
La expresión se realiza en bacterias de la especie
Escherichia coli cepa BL21 (DE3) Rosetta,
transformadas con el plásmido pET24d>a p66. Este
plásmido recombinante tiene insertado el gen de la
subunidad p66 con las etiquetas T7 y FLAG (fig. 1)
Por otra parte, la cepa bacteriana usada tiene
integrado en su cromosoma el gen de la RNA
polimerasa de T7, bajo control de un promotor Lac.
La inducción de la expresión se iniciará por
adición de IPTG al medio de cultivo; esto activa el
promotor Lac, que induce la expresión de la RNA
polimerasa de T7, que a su vez transcribirá el
inserto p66 a partir del promotor T7 presente en el
plásmido.
Prácticas de Biología Molecular (3º de Biología Sanitaria)
Figura 1
v. nov.2015
1
Etapas de la práctica:
1. Inducción de la expresión de T7-p66
2. Separación de proteínas mediante electroforesis
3. Inmunoensayo western
CRONOGRAMA
Primer día
• Inducción con IPTG de la proteína recombinante T7-p66 en un cultivo de bacterias.
• Preparación de las muestras para la electroforesis y conservación en el congelador.
Segundo día
• Separación electroforética de las proteínas, incluida la recombinante T7-p66.
• Transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa.
• Verificación de las proteínas en la membrana mediante tinción con rojo Ponceau.
• Bloqueo de la membrana.
Tercer día
• Incubación con el anticuerpo anti-T7 conjugado con HRP para la detección de la proteína recombinante
T7-p66.
• Lavados.
• Revelado mediante quimioluminiscencia.
• Análisis de resultados y discusión.
1.- INDUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE T7-p66
1. Inocular 10 ml de medio de cultivo con una colonia de E. coli transformada con Pet 24d>a p66. Incubar a
37oC toda la noche
2. Inocular medio de cultivo fresco con las bacterias crecidas durante la noche a una dilución final 1/10.
Incubar a 37oC durante aproximadamente 2h hasta que el cultivo alcance una densidad óptica de 0.5 a
600 nm.
3. Transferir con una pipeta 3,5 mL del cultivo de bacterias a un tubo estéril de 10 mL.
4. Recoger 500 μl y pasarlos a un tubo eppendorf de 1,5 ml. Centrifugarlo a 14000 rpm durante 1 minuto,
descartar el sobrenadante y añadir 50 µl de tampón Laemmli 1X. Resuspender con cuidado aspirando y
expulsando con la micropipeta. (Con el fin de evitar la formación de burbujas, reducir el volumen de
aspiración de la pipeta a 30 µl). Conservar la muestra a -20 oC.
5. Agregar al resto del cultivo IPTG a una concentración final de 1mM y poner el tubo en la estufa a 37 oC con
agitación.
6. Recoger una alícuota de 500 μL cada 15 minutos hasta completar 1 hora (tiempos de inducción 15, 30 y 60
min). Con cada alícuota recogida proceder como en el paso 4.
2.- SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE p66 MEDIANTE ELECTROFORESIS
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas mediante su migración en un campo eléctrico; es
decir, las moléculas deben estar cargadas para poder migrar. Las moléculas se mueven hacia el electrodo de
carga contraria impulsadas por una fuerza que es proporcional a la carga de la molécula.
Prácticas de Biología Molecular (3º de Biología Sanitaria)
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Cada una de estas moléculas estará sometida a una aceleración igual al cociente entre la fuerza ejercida por el
campo eléctrico y la masa de la molécula. Si conseguimos que todas las moléculas, en este caso proteínas,
alcancen la misma relación carga/masa, lograremos que todas ellas sean sometidas a la misma aceleración. Es
decir, en circunstancias ideales en las que no existieran fuerzas de rozamiento que se opusieran al movimiento,
todas las proteínas migrarían a la misma velocidad. En nuestro caso buscamos precisamente separar las
moléculas en función del rozamiento que encuentran durante su movimiento y por ello utilizamos soportes con
capacidad absorbente (como los geles de poliacrilamida, de almidón o de agarosa). De esta manera las proteínas
se separan en función de la mayor o menor resistencia que el soporte hace a su avance. En el caso de que todas
las proteínas tengan una forma similar, el único parámetro que determina la fuerza de rozamiento es su tamaño
molecular (masa).
Es muy importante tener en cuenta por tanto que el requisito esencial para que las proteínas puedan separarse
en función de su masa es que todas ellas tengan una misma forma (extendida) y una misma relación carga/masa.
Ello se consigue mediante calentamiento de las muestras a 100oC en presencia del detergente SDS y de
β-mercaptoetanol (agente reductor que rompe los posibles puentes disulfuro presentes en las proteínas,
permitiendo así que queden con una forma completamente extendida). Como consecuencia de este tratamiento
de la muestra y de la presencia posterior de SDS durante toda la separación (tanto en el tampón de separación
como en la composición del gel), las proteínas se mantienen desnaturalizadas. El SDS tiene la propiedad de unirse
a las cadenas polipeptídicas en una proporción masa:masa constante (1,4 g SDS / g proteína), de modo que en el
complejo SDS-proteína la carga de la proteína queda enmascarada por la de las múltiples moléculas de SDS y ésta
es proporcional al tamaño (nº de aminoácidos) de la proteína. En conclusión, en la electroforesis con SDS la
separación de proteínas se hace en función de la masa molecular. Tanto es así, que la representación del
logaritmo de la masa molecular frente a la distancia migrada se ajusta a una línea recta para gran número de
proteínas.
En el caso de la electroforesis SDS-PAGE (electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS – dodecil sulfato
sódico), la polimerización de los monómeros de acrilamida produce cadenas lineales que se ramifican al
interaccionar con la bisacrilamida, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de
poliacrilamida. El tamaño de los huecos o poros que forma la retícula del polímero depende de la concentración
de acrilamida y del grado de entrecruzamiento. Como polimerizador se utiliza el persulfato amónico (S2O82-), que
al disolverse en agua genera radicales libres (•SO42-) que transforman la acrilamida en radical libre y se inicia la
polimerización. El TEMED se añade como catalizador porque puede existir en forma de radical libre.
Para aplicar la muestra al gel, se le suele añadir un agente que la haga más densa, generalmente glicerina o
sacarosa. Además, para seguir el avance de la separación se añade un colorante, como azul de bromofenol, que
sirve como referencia (tracking dye). Éste tiene una movilidad mayor que la de cualquier macromolécula y, por
tanto, si la electroforesis se detiene cuando el colorante esté a poca distancia del extremo inferior del gel se tiene
la seguridad de que ninguna macromolécula se ha salido del gel por excesivo avance.
Para las prácticas se usarán geles previamente polimerizados por la casa comercial Bio-Rad® TGX™ (Tris Glycine
eXtended). Estos geles cuentan con una modificación que permite una mejor separación de las muestras, una vida
media superior y una separación de las distintas proteínas a mayor velocidad. Se van a usar geles con una
concentración de acrilamida del 10%, que tienen un intervalo de separación efectiva de 30 a 150 kDa. Para la
separación se utilizará el sistema Mini-PROTEAN de BioRad®. Para su utilización seguir las siguientes instrucciones
para realizar el ensamblaje, si tiene alguna duda de cómo montar el sistema pida asistencia al personal del
laboratorio.
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Procedimiento experimental
A) Preparación de las muestras.
1. Calentar las muestras ya resuspendidas en tampón Laemmli 1X (día anterior) a 100oC durante 5 minutos.
2. Una vez esté el gel montado y la cubeta de electroforesis llena (véase más adelante) se aplicarán en sendos
pocillos del gel 40 μL de cada una de las muestras (preinducción e inducciones a distintos tiempos) y 5 µl de
marcadores de masa molecular (M).
B) Sistema de electroforesis.
Los componentes del sistema Mini-PROTEAN Cell ™ se muestran en la fig. 2, y el gel TGX™ pre-montado y
polimerizado en la fig. 3.
Figura 2
Figura 3
1. Sacar el casete que contiene el gel del envoltorio y retirar el peine y la tira adhesiva verde que se encuentra
en la parte inferior, tal y como se muestra en la figura 3.
2. Colocar el sistema de ensamblaje con los electrodos hacia arriba en una superficie plana y abrir los laterales
verdes como se indica en la figura 4.
Figura 4
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Figura 5
4
3. Colocar 2 geles (o 1 gel y una lámina plástica de cierre) en el sistema de ensamblaje del electrodo como se
muestra en la figura 5, situando la placa o cristal pequeño hacia el interior del sistema de forma que
contacte con la junta de goma.
4. Mientras se presionan los casetes contra las juntas de goma, deslizar los brazos verdes hacia arriba de uno en
uno, hasta asegurar ambos casetes al sistema de ensamblaje (fig. 6).
Figura 6
Figura 7
5. Colocar el módulo de electroforesis (sistema de ensamblaje y geles) en el tanque de electroforesis (fig. 7).
Llenar las cámaras interior (200 ml) y exterior (550 ml-800ml) con tampón de electroforesis 1x.
6. Cargar los volúmenes previamente indicados de las muestras. Como sugerencia para el orden de carga de las
muestras, véase la fig. 8.
M
PRE
15’
30’
60’
M
PRE
15’
30’
60’
Figura 8
7. Colocar la tapa del tanque de electroforesis con los electrodos en la orientación correcta y conectar a una
fuente eléctrica para iniciar la separación.
8. Correr la electroforesis a 300 V durante aprox. 20 minutos (vigilando el avance del frente para evitar que
puedan salirse las proteínas). Al finalizar la electroforesis realizar la transferencia de las proteínas separadas a
una membrana de nitrocelulosa (siguiente apartado).
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3.- WESTERN BLOT
El western blot o immunoblot es un método de detección de moléculas específicas inmovilizadas en un soporte
sólido, generalmente una membrana de nitrocelulosa o de PVDF (fluoruro de polivinilideno). La detección se basa
en que las proteínas son moléculas antigénicas susceptibles de ser reconocidas por anticuerpos concretos. Este
reconocimiento es específico, de manera que los anticuerpos permiten detectar de manera selectiva las proteínas
contra las que se han producido.
Todo procedimiento de western blot consta de 4 ó 5 etapas:
1. Inmovilización de las proteínas sobre una membrana
2. Saturación de los lugares de unión inespecíficos
3. Incubación con un anticuerpo primario contra la proteína de interés
4. Incubación con un anticuerpo secundario (sólo necesario si el anticuerpo primario no está marcado)
5. Detección de la proteína de interés
Una vez separadas las proteínas, se transfieren a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa), de manera que
se reproduce la separación obtenida en el gel. Trabajar con las proteínas fijadas sobre una membrana tiene
muchas ventajas respecto de emplearlas dentro del propio gel:
• son más rápidas de teñir y desteñir
• se detectan cantidades menores de proteínas pues se concentran en la superficie de la membrana y no se
diluyen en todo el espesor del gel
• son mucho más fáciles de manipular
A) Inmovilización de las proteínas sobre una membrana
Hay varios métodos para transferir las proteínas a la membrana, pero la transferencia electroforética es el más
utilizado. Dentro de esta técnica existen dos métodos: transferencia en húmedo y transferencia en semi-seco.
En cuanto a la transferencia en húmedo, el procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja
plana papel de filtro empapado en tampón de transferencia, el gel, la membrana en contacto directo con el gel,
más papel de filtro y finalmente una esponja plana. Este conjunto se recoge entre dos capas de plástico perforado
(emparedado de transferencia) y se introduce verticalmente en un tanque en el que se encuentra una disolución
salina (tampón de transferencia) y dos electrodos planos, diseñados para conseguir un campo eléctrico uniforme
en toda la superficie del gel. Se dispone de forma que el gel quede hacia el cátodo (-) y la membrana hacía el
ánodo (+). Cuando se aplica corriente eléctrica las proteínas (con carga (-) debido al SDS) migran
electroforéticamente desde el gel hasta la membrana.
En la transferencia electroforética semi-seca, el gel y la membrana se colocan entre dos apilamientos de papeles
de filtro que están en contacto directo con los electrodos. El término semi-seco hace referencia a la limitada
cantidad de tampón que se necesita, ya que éste se encuentra confinado únicamente en los papeles de filtro. En
los sistemas semi-secos, la distancia entre los electrodos está limitada únicamente por el grosor del gel y de los
papeles de filtro. Como resultado se consiguen campos eléctricos de alta intensidad, lo que permite reducir
considerablemente los tiempos de transferencia. Sin embargo, existe el inconveniente de que bajo estas
condiciones de transferencia algunas proteínas de baja masa molecular pueden migrar muy rápidamente e
incluso pasar a través de la membrana debido a la alta intensidad del campo eléctrico. Así mismo, la baja
capacidad de los tampones (al ser tan pequeño su volumen) limita el tiempo de transferencia, lo que puede
suponer algún problema a la hora de transferir proteínas de alta masa molecular.
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Habitualmente se emplean técnicas de tinción de proteínas sobre la membrana para confirmar la transferencia.
Los colorantes que tiñen las proteínas en los geles de acrilamida no se pueden utilizar en las membranas pues se
unen de forma inespecífica e irreversible a éstas. En el caso de las membranas se suele utilizar el colorante rojo
Ponceau S en disolución acuosa. Esta tinción es rápida y no permanente, de manera que no interfiere en el
procesamiento posterior.
B) Saturación de los lugares de unión inespecíficos
Después de transferir las proteínas del gel, se incuba la membrana en una disolución de leche desnatada o de
albúmina de suero bovino. De esta forma se bloquean los poros libres de la membrana y se evita la unión no
específica de los anticuerpos y reactivos de detección en los pasos siguientes.
C) Incubación con anticuerpos contra la proteína de interés
A continuación la membrana se incuba en una disolución que lleva el anticuerpo contra la proteína que se
pretende detectar. Esto permite que el anticuerpo localice sus antígenos específicos (proteína de interés) sobre la
membrana. Tras la incubación, el anticuerpo no unido se retira mediante lavados sucesivos. Cuando se emplean
anticuerpos primarios no marcados (muy frecuentemente), para saber dónde se ha producido la unión antígenoanticuerpo es necesario incubar con un segundo anticuerpo capaz de reconocer al primero y que lleva unido un
marcador. Los marcadores más utilizados son: enzimas (fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano), fluorocromos,
productos radioquímicos u oro coloidal. De nuevo, los anticuerpos secundarios libres son eliminados por lavados
sucesivos. Por último, se detecta la proteína de interés mediante detección de la fluorescencia emitida (marcaje
con fluorocromos), exposición de una película fotográfica (marcaje radioquímico), precipitación del oro coloidal o
por incubación con sustratos adecuados (marcaje enzimático) para formar productos fácilmente detectables, bien
como consecuencia de su precipitación en el lugar donde se han producido las reacciones antígeno-anticuerpo o
bien por su capacidad de emitir luz.
En esta práctica se usará un anticuerpo primario (α-T7) ya marcado con peroxidasa de rábano (horseradish
peroxidase, HRP). De esta forma se evita el uso de un segundo anticuerpo marcado y se agiliza el procedimiento.
La peroxidasa cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrogeno. Inmediatamente después
de la oxidación el luminol se encuentra en un estado excitado, del que pasa al estado fundamental más estable
con emisión de luz (quimioluminiscencia). La luz emitida tiene una longitud de onda de 428 nm. Si esta reacción
se produce sobre una membrana en contacto con una película sensible a la emisión azul, ésta queda
impresionada.
Figura 9
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Figura 10
Procedimiento experimental
A) Transferencia
En la práctica se realizará una transferencia de tipo semi-seco, usando el sistema Trans-Blot® Turbo™ de BioRad®
(figuras 11 y 12).
Componentes del sistema Trans-Blot ® Turbo™
Figura 11
Figura 12
Figura 13
1. Después de realizar la electroforesis, apagar la fuente de alimentación y desconectar la tapa. Abrir la tapa de la
cubeta y retirar el módulo de electroforesis. Bajar las pestañas laterales verdes y retirar los casetes. Para abrir
los casetes, utilizar la palanca tal y como se indica en la fig. 13, alineando las flechas del casete con las de la
palanca en los 4 puntos indicados.
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2. Abrir un Mini Transfer Pack. Éste contiene dos reservorios de tampón con sus respectivos apilamientos de
papel de filtro (fig. 14). El apilamiento de la derecha está compuesto de papel de filtro con una membrana de
nitrocelulosa en la parte superior. Sobre el filtro debe colocarse el gel y todo el conjunto se coloca sobre la
base del casete (fig. 15). El apilamiento de la izquierda está compuesto exclusivamente por papel de filtro y se
coloca sobre el gel, una vez situado éste sobre el apilamiento anterior.
Figura 14
Figura 15
3. Después de colocar el apilamiento superior, aplanar con el rodillo y cerrar el casete presionando levemente la
tapa y girando en dirección de las manecillas del reloj el sistema de cierre.
4. Introducir el casete en uno de los compartimentos del instrumento.
5. Dependiendo del número y del tipo de geles que se introduzcan por casete se puede hacer la transferencia en
3 o 7 minutos.
Condiciones de transferencia para geles TGX
Un gel
Dos geles
2,5 A · 25 V · 3 min
2,5 A · 25 V · 7 min
B) Inmunoblot
NOTA: Toda la incubación deberá hacerse con agitación constante.
1. Después de realizar la transferencia, abrir el casete y retirar el apilado superior y el gel. Sacar la membrana
de nitrocelulosa y hacer una marca en la esquina inferior izquierda.
2. Pasar con unas pinzas a una caja de plástico.
3. Teñir la membrana añadiendo 10 ml de una disolución de rojo Ponceau durante unos 5 minutos.
Transcurrido este tiempo, retirar el rojo Ponceau recuperándolo en un frasco y lavar la membrana con
agua del grifo hasta que se vean las bandas rojas de proteínas. Tomar una fotografía. Continuar lavando
para desteñir la membrana todo lo posible.
4. Bloquear con 10 ml de TBST + 0.05% Tween-20 + 5% leche desnatada durante toda la noche a 4oC con
agitación (de forma alternativa, es posible incubar durante una hora a temperatura ambiente).
5. Preparar 4 ml de anticuerpo anti-T7 HRP a una dilución 1:5000 en TBS+Tween + 5% leche.
6. Retirar la disolución de bloqueo y añadir la disolución de anticuerpo a la caja donde se encuentra la
membrana. Incubar durante 30 minutos con agitación suave.
7. Recuperar los 4 ml de anticuerpo diluido. (Será posible reutilizarlo si se guarda a 4oC)
8. Lavar la membrana con 5 ml de TBS+Tween:
• 1 lavado rápido (añadir la disolución hasta cubrir la membrana, agitar manualmente y eliminar el
líquido).
• 5 lavados de 5 minutos.
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3) Revelado
1. Mezclar 2 mL de reactivo A + 2 mL de reactivo B del sistema de detección mediante oxidación del luminol.
2. Incubar la membrana durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación.
3. Coger con unas pinzas la membrana por una esquina y escurrirla poniendo en contacto la esquina opuesta
sobre un papel de filtro.
4. Envolver en plástico, colocar en el casete de revelado y llevar al cuarto oscuro.
5. Poner en contacto una película de radiografía, cerrar el casete durante 3 segundos, abrir el casete y revelar
la película.
Anexos
1. Muestras y reactivos
•
Bacterias Escherichia coli, cepa BL21 (DE3) Rosetta
transformadas con el plásmido pET24d>a p66
Suspensión en medio de cultivo LB con kanamicina
•
Medio LB: 10 g/L triptona, 5 g/L extracto de levadura, 5 g/L NaCl
•
IPTG (β-isopropiltiogalactósido) 1 M
•
Tampón de Laemmli (para cargar las muestras en la electroforesis):
o 8% SDS
o 40% glicerol
o 20% β-mercaptoetanol
o 0.008% azul de bromofenol
o 250 mM Tris - HCl, pH = 6,8
•
Tampón de electroforesis:
o Tris base 3.03 g/L
o glicina 14.42 g/L
o SDS 1 g/L
•
Gel de poliacrilamida al 10% (Bio-Rad® TGX™)
•
Proteínas patrón, marcadores de masa molecular (fig. 16)
•
Membrana de nitrocelulosa, papel de filtro, tampón para la transferencia.
•
Rojo Ponceau S, 1% en acético 5%
•
Tampón TBS: 20 mM Tris - HCl, 137 mM NaCl, pH = 7.6
•
Tampón para lavados: TBS con 0.05% Tween20
•
Tampón de bloqueo: TBS + Tween20 + 5% de leche desnatada en polvo
•
Anticuerpo anti-(etiqueta T7) conjugado con peroxidasa
(ab21477 de Abcam, policlonal de conejo)
Se usa diluido 1:5000 en tampón de bloqueo
•
Reactivo de quimioluminiscencia:
(sistema ECL Western Blotting de GE Healthcare Life Sciences)
Contiene luminol, H2O2 y potenciadores.
Se prepara en el momento mezclando 1:1 los reactivos "A" y "B"
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Figura 16
10
2. Secuencias de p66
T7-FLAG-p66 (DNA)
ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGCTTCCCATTAGCCCTA
TTGAGACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGC
ATTAGTAGAAATTTGTACAGAGATGGAAAAGGAAGGGAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTT
GCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTCAAGACTTCTGGGAAG
TTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAACAGTACTGGATGTGGGTGATGCATATTTTTCAGT
TCCCTTAGATGAAGACTTCAGGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTAC
AATGTGCTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAAAGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAACAAA
ATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAACAAAAATAGA
GGAGCTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGACTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTTGGATGGGT
TATGAACTCCATCCTGATAAATGGACAGTACAGCCTATAGTGCTGCCAGAAAAAGACAGCTGGACTGTCAATGACATACAGAAGT
TAGTGGGGAAATTGAATTGGGCAAGTCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGCAATTATGTAAACTCCTTAGAGGAACCAAAGC
ACTAACAGAAGTAATACCACTAACAGAAGAAGCAGAGCTAGAACTGGCAGAAAACAGAGAGATTCTAAAAGAACCAGTACATGGA
GTGTATTATGACCCATCAAAAGACTTAATAGCAGAAATACAGAAGCAGGGGCAAGGCCAATGGACATATCAAATTTATCAAGAGC
CATTTAAAAATCTGAAAACAGGAAAATATGCAAGAATGAGGGGTGCCCACACTAATGATGTAAAACAATTAACAGAGGCAGTGCA
AAAAATAACCACAGAAAGCATAGTAATATGGGGAAAGACTCCTAAATTTAAACTGCCCATACAAAAGGAAACATGGGAAACATGG
TGGACAGAGTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAGTTTGTTAATACCCCTCCCTTAGTGAAATTATGGTACCAGTTAG
AGAAAGAACCCATAGTAGGAGCAGAAACCTTCTATGTAGATGGGGCAGCTAACAGGGAGACTAAATTAGGAAAAGCAGGATATGT
TACTAATAGAGGAAGACAAAAAGTTGTCACCCTAACTGACACAACAAATCAGAAGACTGAGTTACAAGCAATTTATCTAGCTTTG
CAGGATTCGGGATTAGAAGTAAACATAGTAACAGACTCACAATATGCATTAGGAATCATTCAAGCACAACCAGATCAAAGTGAAT
CAGAGTTAGTCAATCAAATAATAGAGCAGTTAATAAAAAAGGAAAAGGTCTATCTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGAATTGG
AGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGTCAGTGCTGGAATCAGGAAAGTACTA
T7-FLAG-p66 (proteína)
MASMTGGQQMGRGSMDYKDDDDKLPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVF
AIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQY
NVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMG
YELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHG
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QDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSESELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKVL
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