instituto tecnolgico de sonora

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
METODO HPLC PARA LA CUANTIFICACIÓN DE GLUCOSAMINA EN
QUITINA DE RESIDUOS DE CAMARÓN
TESIS
PARA OBTENER EL TITULO DE
INGENIERO BIOTECNOLOGO
PRESENTA
KARINA EDITH DELGADO ROSAS
CD. OBREGÓN, SONORA
OCTUBRE
Octubre 2005
DEDICATORIAS
A dios por darme la vida y otorgarme la fuerza para seguir adelante.
A mi mama por apoyarme siempre y confiar en mi, le doy las gracias por que siempre ha
luchado para sacarnos adelante sin ella no hubiera logrado esta meta importante en mi
vida te quiero.
A mi hermanita por que siempre he contado con su amistad y apoyo para hacer las cosas y
te agradezco la paciencia que me has tenido.
A mi tía Silvia por el cariño que siempre me ha brindado y porque ha sido como mi segunda
mama.
A mis padrinos por la confianza y cariño que siempre me han demostrado.
A Santiago por brindarme su cariño y amor durante estos años y apoyarme en todo
momento gracias flaco.
i
AGRADECIMIENTOS
A mis asesores: Dr. Jaime López y Dra. Dalia Sánchez por el apoyo y confianza que me
brindaron para realizar este trabajo.
A mis revisores: M.C Roberto García y M.C Jorge Cabrera.
A mis amigos con los que siempre conté en todo momento, Raúl mi hermanito te agradezco
el apoyo q siempre me has brindado, Lilian por hacerme reír en los momentos tristes, al
pollo por ser un muy buen amigo, Bedoy por que siempre he contado con su apoyo, Mario
te aprecio monito, Shagy, Fernando, Henry, Pancho, Helga, Marcia, Arely, Mario, Jesús,
Daniel, Carlita a todos ellos por ser parte importante de mi vida.
A mis compañeros de tesis Raúl, Lilian, Oliviert, Alfredo, Patricia, Berenice y Teresa por
que siempre me brindaron su apoyo y motivación par a seguir adelante.
ii
INDICE
LISTA DE TABLAS …………………………………………………………………... v
LISTA DE FIGURAS …………………………………………………………………
vi
RESUMEN…………………………………………………………………………...... vii
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………..
1
OBJETIVOS…………………………………………………………………………… 3
JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………
5
HIPÓTESIS……………………………………………………………………………. 7
I.- REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
1.1 Obtención de quitina a partir de fermentación láctica...……………………...
8
1.1.1 Características fisicoquímicas de la cabeza de camarón……........
8
1.1.2 Fermentación láctica………………………………………………........
10
1.2 Quitina como fuente de glucosamina…………………………………………
13
1.2.1 Quitina…………………………………………………………………….
13
1.2.1.1 Propiedades fisicoquímicas………………………………...
13
1.2.1.2 Fuentes y usos…… ………………………………………….
14
1.2.1.3 Procesos de purificación de quitina…………………...........
15
1.2.2 Glucosamina……………………………………………………………..
18
1.2.2.1 Propiedades fisicoquímicas………………………….……...
18
1.2.2.2
Fuentes y usos……………………………………………….
19
1.3 Cromatografía……………………………..……………………………….........
20
1.3.1 Conceptos sobre cromatografía……………………………….……….
20
1.3.2 Instrumentación…………………………………………………………..
21
1.3.2.1 Detectores……………………...………………………………..
21
1.3.2.2 Columnas………………………..………………………………
21
1.3.3 Validación del método…………………………………………………...
22
1.3.4 Reactivos de derivatización………………………………………..……
24
1.4 Antecedentes bibliográficos de los métodos para la determinación de
glucosamina…………………………………………………………………………… 26
1.4.1 Tratamientos de preparación de la muestra…………………………
26
iii
1.4.2 Derivatización…………………………………………………………..
27
II. MATERIALES Y METODOS
2.1 Patrones y reactivos químicos………………………………………………….
30
2.2 Obtención de quitina……………………………………………………………..
31
2.2.1 Condiciones de la fermentación………………………………………..
31
2.2.2 Purificación de quitina……………………………………………………
32
2.3 Preparación de la muestra……………………………………………………..
33
2.3.1 Hidrólisis de la muestra…………………………………………………
33
2.3.2 Derivatización……………………………………………………………
33
2.4 Equipo y condiciones HPLC…………………………………………………….
34
lll. RESULTADOS Y DISCUSION
3.1 Ensayos preliminares…………………………………………………………….
36
3.2 Preparación de la muestra………………………………………………………
37
3.3 Condiciones cromatográficas…………………………………………………..
37
3.4 Identificación de glucosamina………………………………………………….
39
3.5 Validación del método…………………………………………………………..
40
3.5.1 Linealidad…………………………………………………………………
40
3.5.2 Precisión………………………………………………………………….
44
3.5.3 Recuperación…………………………………………………………….
44
3.6 Análisis de la muestra……………………………………………………………
45
3.6.1 Humedad y cenizas……………………………………………………..
45
3.6.2 Contenido de glucosamina………………………………………………
46
CONCLUSIÓN………………………………………………………………………..
47
BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………….
48
iv
LISTA DE TABLAS
Tabla
Título
Pagina
1
Composición química del camarón............................................
10
2
Tratamiento de preparación de la muestra……………….…......
28
3
Condiciones cromatográficas para el análisis de glucosamina
propuesta por diferentes autores………………………………….
29
4
Programa de la bomba……………………………………………..
35
5
Condiciones cromatográficas establecida para el análisis……..
39
6
Datos de calibración de glucosamina……..……………………...
43
7
Valores de precisión del método………………………………….
44
8
Valores de recuperación del método……………………………..
45
9
Contenido de humedad y cenizas de quitina…………………….
45
v
LISTA DE FIGURAS
Figura
Título
Pagina
1
Partes del camarón....................................................................
2
2
Estructura de la quitina..............................................................
7
3
Estructura de la glucosamina....................................................
12
4
HPLC cromatogramas de glucosamina en hidrolizados de
quitina. (A) Detector UV (264 nm); (B) Detector de
fluorescencia (λex 270 nm, λem 316 nm)…………………………
5
Cromatograma de la muestra con el espectro de absorción
de la glucosamina………………………………...………………..
6
7
38
41
Comparación entre cromatogramas (A) Blanco, (B) Patrón,
(C) Muestra ………………………………………………………...
42
Recta patrón de glucosamina…………………………………….
43
vi
RESUMEN
El presente trabajo describe el desarrollo de un método HPLC para el análisis de
glucosamina en quitina obtenida a partir de la fermentación de desechos de
camarón. La quitina se hidroliza con ácido clorhídrico; y la glucosamina obtenida
es derivatizada con 9-fluorenil metil cloroformato (FMOC). La separación se llevo a
cabo en una columna SGE Hypersil ODS C18
250
mm x 4.6 mm, 5 μm y
detección de ultravioleta a 264 nm; la fase móvil es un gradiente de tres
soluciones: fase A (30mM fosfato de amonio pH 6.5 en 15:85 metanol-agua), fase
B (15:85 metanol-agua) y fase C (90:10 acetonitrilo-agua) a una velocidad de flujo
de1.20 ml/min, con una temperatura de la columna de 38 ºC.
Con las condiciones cromatográficas establecidas se ha validado el método a
través de parámetros como precisión (2.58), linealidad (0.9995) y recuperación
(89.05).
vii
INTRODUCCIÒN
La quitina es el polisacárido más abundante en la naturaleza que contiene
aminoazúcares, y está asociado con proteínas y minerales. En la actualidad este
biopolímero se obtiene industrialmente aislándolo de desperdicios generados en el
procesamiento de crustáceos, tales como caparazones de camarón y jaiba (Pinelli
et al., 1998).
Los aminoazúcares contribuyen una cantidad significativa de entre 5 y 12% de N
orgánico al suelo, siendo los más importantes glucosamina, galactosamina, ácido
murámico, y manosamina, aunque existe una variedad de otros aminoazúcares.
Las células fúngicas contienen en sus paredes grandes cantidades de
glucosamina y son la fuente principal de este componente en el suelo, aunque el
exoesqueleto de los invertebrados y las paredes de células bacterianas también
están constituidos de glucosamina.
Introducción
Existe una gran variedad de métodos para la determinación de los amino azúcares
después de la hidrólisis de la materia orgánica, como lo son cromatografía de
gases la cual es muy sensible y tiene una alta especificidad, pero el procedimiento
de la derivatización de los productos de la hidrólisis implica la producción de
componentes volátiles; con la cromatografía de líquidos (HPLC) también necesita
pasos de derivatización para determinar los amino azúcares, sin embargo, esto se
puede realizar hoy automáticamente por el sistema de HPLC como derivatización
de la pre-columna (Joergensen, 2004).
Los reactivos utilizados en la derivatización pre-columna incluyen fenilisotiocianato
(PITC), Orto-ftalaldehido (OPA), 1-dimethylaminophthalene-5-sulphonyl (dansyl) y
9- fluorenil- metil cloroformato (Fmoc-Cl) (Haynes, 1991).
Recientemente, químicos orgánicos han establecido formas de utilizar la quitina.
Una de las aplicaciones más importantes es el uso de la quitina para inmovilizar
enzimas. Además, estos polímeros pueden servir como acarreadores no
absorbibles de ingredientes altamente concentrados (colorantes, saborizantes y
nutrientes), cuya descarga puede ser controlada por la lisozima (Luvian et al.,
1993).
2
OBJETIVO
Analizar la pureza de la quitina de residuos de camarón a partir de la
cuantificación de glucosamina, mediante cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC)
OBJETIVO ESPECIFICO
Determinar el grado de pureza de quitina extraída, mediante cenizas,
glucosamina y humedad.
Evaluar la calidad de quitina obtenida, comparándola con
comercial.
una quitina
Objetivo
Estandarización de la metodología HPLC utilizando derivatización con
FMOC-Cl (9-Fluorenylmethyl cloroformato) y detección por ultravioleta.
Determinar la calidad de la quitina en relación al contenido de glucosamina
cuantificada
4
JUSTIFICACIÓN
En toda industria moderna rentable destinada a la producción de alimentos se
producen cantidades de residuos orgánicos, que de no ser utilizados en la
generación de otros productos para el consumo humano o animal, representan un
problema operacional y en ocasiones legal para la industria y una fuente de
contaminación ambiental.
Este problema es uno de los más críticos para la industria de la pesca a nivel
mundial, debido a las grandes cantidades de residuos orgánicos que se generan y
se descartan en el mar o en tierra (vertederos). Actualmente, estos residuos
orgánicos representan un 60% de la materia total resultante del procesado de
pescadería para el consumo humano.
Justificación
Debido a la preocupación que genera la disposición de estos residuos como
posibles contaminantes del medio ambiente (agua, suelos y aire) y la incapacidad
de costear un sistema de manejo de desperdicios efectivo, se crea el interés en
evaluar
nuevas
tecnologías
alternas
para
su
disposición
que
sean
económicamente factibles.
El procesar el residuo de camarón no solo resuelve un problema ambiental, sino
que también ayuda a obtener productos tales como lo la quitina la cual tiene un
alto valor comercial esto dependiendo de su grado de pureza y de sus
propiedades. El grado de pureza que se obtenga en la quitina va a depender de el
tratamiento que se le de a la misma. Por ello, en este trabajo se propone un
método HPLC para cuantificar la glucosamina presente en la quitina obtenida y así
determinar su calidad.
Por lo anterior, en esta investigación se pretende desarrollar una alternativa
para conocer la pureza de la quitina obtenida del fermentado de la cabeza de
camarón; de esta manera se aprovecharán los desechos de la industria
camaronícola.
6
HIPOTESIS
La calidad de la quitina puede ser evaluada en función del contenido de
glucosamina.
I.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 Obtención de quitina a partir de fermentación láctica.
1.1.1
Características fisicoquímicas de la cabeza del camarón
El camarón es un crustáceo decápodo, macruro de tamaño y color variable. Su
cuerpo es algo encorvado y esta dividido en 2 partes cefalotórax y abdomen. El
cefalotórax, es una combinación de cabeza y tronco en una sola unidad, el cual
esta cubierto por un caparazón que contiene a la cabeza, los órganos vitales del
animal, tres pares de patas prensoras y dos caminadoras. El abdomen se divide
en seis segmentos. El último de ellos termina en una punta fina llamada telsón y
por debajo esta la cola que le sirve para nadar (Capiña, 1995).
La figura 1 representa al camarón con cada una de sus partes, se observa que
alrededor del 50% del camarón esta constituido por el cefalotórax y corresponde a
Revisión Bibliográfica
la fracción no comestible y el cual es considerado como un desecho en la industria
de la camaronicultura (Desrosier,1992).
Esto da idea de los volúmenes de desechos de camarón que se producen en
México (Cañipa, 1995).
Fuente: Soluap, 1998
Figura 1. Partes del camarón
El camarón es excepcionalmente nutritivo. Es un alimento con alto contenido de
proteínas y bajo en grasas, en la tabla 1 se presenta la composición química de la
porción comestible del camarón.
9
Revisión Bibliográfica
Tabla 1. Composición química del camarón
Composición
Parte comestible
Agua (g)
78.2
Proteína (g)
18.1
Grasa (g)
0.8
Carbohidratos (g)
1.5
Niacina (mg)
3.20
Calcio (mg)
63.00
Fósforo (mg)
166.00
Hierro (mg)
1.60
Tiamina (mg)
0.02
Calorías cal
91.00
Fuente: Charley, 1995
La riqueza del cefalotórax de camarón en lo que respecta a sus componentes;
quitina, proteína y pigmentos, lo convierten en una fuente susceptible de ser
procesada para obtener subproductos útiles en la industria alimentaría, cosmética
y farmacéutica (Cañipa, 1995).
La basura o residuo de camarón contiene 26.5 % de materia seca de la cual el
74 % es material orgánico (principalmente proteínas y quitina del tejido fino), y el
resto, 26 % corresponde a los minerales (Gildberg, 2001).
1.1.2
Fermentación láctica
La fermentación inhibe el deterioro dentro del pescado mediante el incremento d el
nivel de acidez. Durante la fermentación, el uso de sal inhibe la acción del
deterioro bacteriano y permite que las enzimas del pescado o las bacterias
beneficiosas productoras de ácido descompongan la carne. La fermentación
puede definirse como la acción controlada de microorganismos benéficos sobre
10
Revisión Bibliográfica
los alimentos para alterar su sabor o textura y para prolongar su vida de anaquel
(Rao et. al., 2000)
Las fermentaciones lácticas son aquellas en donde el ácido es producido in situ
por bacterias lácticas a partir de una fuente de carbohidratos, y los
microorganismos responsables pueden pertenecer a la microflora natural o ser
cultivos iniciadores (Frazier, 1993).
El ensilaje de residuos de pescadería, puede designarse como “pescado líquido” o
“concentrado de proteínas”, y se produce mediante fermentación anaeróbica o
acidificación directa. Por ensilaje de acidificación directa, se entiende el producto
resultante de la mezcla de residuos pesqueros con ácidos orgánicos e inorgánicos
que reducen el pH lo suficiente como para prevenir el deterioro del residuo (León,
2003)
El ensilaje biológico implica el uso de microorganismos para generar ácido in situ,
mientras que, el ensilaje químico usa
ensilaje
mineral químico
o ácido orgánico. El
de pescado para la bioconversión del desecho se ha estudiado
extensamente para aumentar la productividad de la industria de mariscos (Cira e.t
al., 2002).
™ Condiciones para la fermentación láctica
La eficiencia de la fermentación que utiliza bacterias ácido lácticas depende de
factores tales como la cantidad de inóculo, la glucosa, pH inicial y el pH durante la
fermentación, la cantidad y el tipo del ácido utilizado y del tiempo de fermentación
(Rao, et. al., 2000).
11
Revisión Bibliográfica
La mayor influencia en el crecimiento de bacterias lácticas y la velocidad con la
cual decrece el pH de la fermentación son debido a:
o Fuente de carbohidratos. En pescados y crustáceos frescos es muy baja la
cantidad de carbohidratos libres, por lo tanto es necesario agregar alguna
otra fuente de carbono para la buena producción de ácido en la
fermentación.
o Factores orgánicos de crecimiento. Las vitaminas, aminoácidos y otros
factores orgánicos de crecimiento son requeridos para el crecimiento de las
bacterias lácticas, estos factores son disponibles en cantidades adecuadas
a partir de los músculos del pescado y crustáceos.
o Condiciones anaerobias. La pronta exclusión del oxígeno durante las
etapas iniciales de la fermentación es un factor importante en la reducción
del crecimiento de las bacterias Gram negativas, las cuales son
contaminantes antes de que se establezcan las condiciones acidificantes
(Armenta, 1998)
o Temperatura. La temperatura puede ser considerada como un factor que
influye en la composición de la población microbiana y del sabor final de las
fermentaciones naturales. Las temperaturas altas promueven el rápido
crecimiento de microorganismos indeseables.
o Concentración de sal. La sal tiene una doble función en la fermentación,
disminuyendo el agua libre, y ayudando a las bacterias lácticas en la
competencia con bacterias contaminantes y peligrosas.
o Concentración de ácidos orgánicos y valor de pH. El crecimiento de las
bacterias lácticas es necesariamente acompañado por la producción de
12
Revisión Bibliográfica
ácido láctico y, en algunas circunstancias, de ácido acético, en
consecuencia se disminuye el valor de pH en el medio.
™ Bacterias lácticas
En el proceso de ensilado biológico, es común utilizar inóculos de bacterias
productoras de ácido láctico tipo homofermentativos de los géneros Lactobacillus,
Pediococcus o Streptoccoccus y fuentes de carbohidratos como la melaza de caña
para acelerar el proceso fermentativo. Además, una fermentación apropiada se
genera a una temperatura óptima a la cuál los microorganismos proliferan y
alcanzan poblaciones de 108 u.f.c. /g después de 4 a 8 días. Durante este proceso
ocurre un cambio rápido en la composición bacteriológica, generando una
dominancia de bacterias productoras de ácido láctico y la inhibición de
microorganismos indeseables causantes de efectos negativos de deterioro en el
ensilaje. El crecimiento y densidad de la población bacteriana del ensilaje varía
según el tipo de materia prima presente (León, 2003).
1.2 Quitina como fuente de glucosamina
1.2.1 Quitina
1.2.1.1 Propiedades fisicoquímicas
La quitina es un polisacárido formado por unidades de 2-acetamido-2desoxiglucosa, con uniones beta 1-4, su nombre químico es poli (1,4)-N-acetil-Dglucosamina, ver figura 2. Pertenece a una familia de productos derivados de los
complejos naturales de quitina-proteína.
13
Revisión Bibliográfica
La quitina puede ser biodegradada por efecto de las glicosidasas, especialmente
de la lisozima. Además presenta muy baja capacidad antigénica, por lo que se ha
propuesto su uso en aplicaciones biomédicas y farmacéuticas (Romero et. al.,
1995).
Fuente: www.fao.org/docrep/ field/003/ab492s/AB492S02.htm
Figura 2. Estructura de la quitina
La quitina es un sólido de color blanco translúcido prácticamente insoluble en
agua, ácidos diluidos, álcalis concentrados o diluidos, y solventes orgánicos;
además, los ácidos inorgánicos concentrados la degradan. La quitina sufre
degradación a altas temperaturas, no puede resistir temperaturas mayores de 100120 ° C (Fernández, 2002; Cañipa, 1995).
1.2.1.2 Fuentes y usos
La quitina es sintetizada por algunos organismos unicelulares como las diatomeas
y los protozoarios. La proporción de quitina con respecto al peso seco total del
14
Revisión Bibliográfica
cuerpo, es más alta en los crustáceos que en otros animales, lo cual hace que sea
la principal fuente para la obtención del polímero (Romero et. al., 1998).
Estos polímeros han encontrado variada aplicación en industrias como la textil, la
alimentaría y fundamentalmente la farmacéutica (Fernández, 2002).
La quitina es un polímero de origen natural que posee actividad como acelerador
de la cicatrización y reconstructor. Su efecto farmacológico, unido a su carácter
biocompatible y atóxico, han propiciado su introducción con éxito en diferentes
formas farmacéuticas (Suárez et. al., 1999)
La quitina como sus derivados tiene una serie de propiedades que los hacen muy
atractivos por su gran variedad de aplicaciones, en alimentos, nutrición, cosmética,
hasta
la
biomedicina,
agricultura
y
medio
ambiente.
Sus
propiedades
antibacteriales y antivirales están muy indicadas para las aplicaciones de la
medicina biológica, en la cura de heridas, suturas y como ayuda en las
operaciones de cataratas y tratamiento de las enfermedades periódicas. La quitina
es totalmente biodegradable y por sus aplicaciones antihongos está muy
recomendado
para
la
agricultura
y
el
medio
ambiente.
http://evven.5u.com/text/sobre_chitin_y_quitosan.htm.
1.2.1.3 Procesos de purificación de quitina
™ Despigmentación
Los pigmentos carotenoides que se encuentran en el cefalotórax de camarón
presentan estructuras muy parecidas entre sí, y globalmente se conocen como
astaxantinas.
Para extraer el pigmento, el principal obstáculo lo constituye la unión con las
proteínas. En estado natural, hay una mutua interacción entre proteínas y
15
Revisión Bibliográfica
carotenos que aumenta la estabilidad de los últimos. Si esta unión se debilita o se
rompe, entonces la estabilidad de los carotenos decrece (Cañipa, 1995)
Varios autores han probado diferentes sistemas de extracción, tales como
acetona, éter de petróleo, aceite se soya, mezclas de éter de petróleo-acetonaagua y acetona ciclohexano (Cañipa, 1995). Cira et. al., (2001) ha utilizado una
mezcla de solventes constituido por cloroformo, metanol y agua (1:2:4) a 25 ºC,
para la extracción de pigmentos de los desechos del camarón.
™ Desproteinización
ƒ
Química
La extracción química de proteínas del cefalotórax de camarón implica un
tratamiento con NaOH y calor. Las proteínas se pueden recuperar del filtrado
proveniente de dicho proceso, si son centrifugadas, ajustadas a pH de 4.5 con
HCl, centrifugadas por segunda vez, y secadas en un horno con vacío a 50 °C
durante 8 horas. La recuperación de proteínas de los desechos de camarón
requieren sólo que se neutralice el medio, lo cual a la vez facilita la formación de
sales en la proteína recuperada (Cañipa, 1995).
En el proceso químico, los esqueletos de crustáceo se tratan generalmente con la
solución (1-10%) de NaOH a temperaturas elevadas (65-100 °C) en donde se
disuelve la proteína presente. Algunos autores mencionan también el uso de una
gran variedad de agentes para este paso tales como NaOH, el Na2CO3, NaHCO3,
KOH, K2CO3, Na2SO3, NaHSO3, CaHSO3, Na3PO4 y Na2S
(Goycoolea et. al.,
2000).
16
Revisión Bibliográfica
Los tratamientos alcalinos más utilizado por diferentes autores son realizados con
Na2CO3 a concentraciones arriba a 0.1 M, a 100 °C durante 4 horas (Goycoolea et
al, 2000).
ƒ
Lizardi
Enzimática
(1998),
utilizó un extracto enzimático de páncreas de porcino para
desproteinizar la cáscara de camarón logrando remover el 82 % de la proteína
presente.
El uso de enzimas proteolíticas es sencilla y económica, además es una
alternativa a métodos químicos empleados actualmente en la preparación de
quitina. Podría ser especialmente útil para la conservación del estado natural de
este polímero. También es importante
el hecho de que el líquido de
desprotenización puede ser utilizado para la recuperación de la proteína para su
uso en alimentación o suplemento animal, y con bajo nivel de minerales (Gagne
et. al., 1993).
Gagne et. al., (1993), utilizaron 2 tipos de enzimas proteolíticas para la obtención
de quitina a partir del desecho del camarón, estas fueron papaina y quimotripsina,
encontrando que ambas enzimas son eficientes para separación de la proteína
presente.
™ Desmineralización
Las sales minerales, principalmente fosfatos y carbonatos de calcio son el
segundo componente más abundante del cefalotórax, estas sustancias se
encuentran asociadas a la quitina y a las proteínas, dándole al animal la rigidez
que lo caracteriza.
17
Revisión Bibliográfica
La materia mineral puede ser removida con solventes tales como ácido acético y
el ácido clorhídrico especialmente al carbonato de calcio y otras sales presentes
(Pinelli, 1998).
La desmineralización con ácido sulfuroso es económicamente atractiva sólo en
operaciones comerciales muy grandes, pues su principal ventaja la constituye un
sistema de recirculación muy costoso. Para operaciones comerciales de pequeña
y mediana escala se utiliza HCl (Pinelli, 1998).
™ Decoloración
El color es una propiedad de la materia que tiene una gran importancia en cuanto
a la aceptación o rechazo de un producto por parte de los consumidores, esto se
debe a que el color es el primer contacto que tiene el consumidor con los
productos y posteriormente los juzga por sus otras características (Badui, 1990).
El hipoclorito de sodio es una sustancia blanqueadora que decolora o blanquea un
sustrato por acción química. Esta acción puede ser por procesos de oxidación o
reducción, que hacen que las sustancias de color en el sustrato sean más solubles
y se eliminen más fácilmente durante su proceso (Kirk y Othmer, 1998).
1.2.2 Glucosamina
1.2.2.1
Propiedades fisicoquímicas
La D-glucosamina (2-amino-2-desoxi-D-glucosa) es una molécula de glucosa
modificada por reemplazo de un grupo OH por un grupo NH3 que se encuentra en
el segunda átomo de carbono, es un aminoazúcar ampliamente difundido (figura
3).
18
Revisión Bibliográfica
Fuente: Wilcox, 2003.
Figura 3. Estructura de la glucosamina
Es una molécula pequeña, su peso molecular es de 215.63 y es muy hidrosoluble,
por lo que es absorbida con facilidad por las células intestinales por medio de
transporte activo. Su solubilidad es de 0.1 g/ml en agua y tiene un color claro.
1.2.2.2 Fuentes y usos
La D-glucosamina se encuentra en muchos polisacáridos de los tejidos de los
vertebrados y es también componente principal de la quitina, polisacárido
estructural presente en el exoesqueleto de los insectos y de los crustáceos
(Lehninger, 1995).
La glucosamina, es un componente natural de las glicoproteínas encontradas en
tejidos finos conectivos y membranas de la mucosa gastrointestinales. Además
tiene potencial terapéutico para el tratamiento de una variedad de enfermedad,
incluyendo artritis,
enfermedades
inflamatorias del intestino, y de daño
inflamatorio general (Zhu et. al., 2005).
19
Revisión Bibliográfica
Es uno de los mayores bloqueadores de la síntesis natural del cuerpo, de los
lubricantes críticos y de los amortiguadores necesarios para restaurar y mantener
saludables las coyunturas o articulaciones (http://www.riovel.com/glucosam.htm).
1.3 Cromatografía
1.3.1 Conceptos sobre cromatografía
La cromatografía es una técnica de separación de los constituyentes de una
mezcla. Se ha convertido en un método analítico de primer orden para identificar y
cuantificar los compuestos de una fase líquida o gaseosa homogénea. El principio
básico se fundamenta en los equilibrios de distribución de los compuestos
presentes entre dos fases no miscibles de la que una, llamada estacionaria, está
inmovilizada en una columna o fijada sobre un soporte y la otra, llamada móvil,
se desplaza al contacto de la primera. La elusión (proceso en el cual, se separan
los solutos a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil)
a velocidades diferentes de los compuestos presentes por la fase móvil conduce a
su separación. De todos los métodos analíticos e instrumentales, la cromatografía
es el que tiene el mayor campo de aplicabilidad y por ello, ocupa una posición
dominante (Rouessac y Rouessac, 2003).
El HPLC es una técnica cromatográfica de reparto o posición en la que la muestra
se fracciona entre una fase móvil que es líquida y una fase estacionaria y es la
técnica más utilizada de todos los tipos de cromatografía de elusión, conociéndose
como tal al desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente
(Bermejo, 1991).
20
Revisión Bibliográfica
1.3.2 Instrumentación
1.3.2.1
Detectores
El papel del detector es indicar los momentos de aparición de los componentes, y
proporcionar indicación cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector
utilizado depende de la naturaleza de la muestra y deberá reunir una serie de
características como son, tener una sensibilidad elevada, buena estabilidad y
reproducibilidad, amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la
presión y la temperatura (Hernández, 2002).
Características de los detectores:
-
Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la
muestra en una señal eléctrica medible.
-
Linealidad. Rango de masa o concentración de muestra sobre el cual el
detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviación arbitraria.
-
Rango dinámico lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es
constante.
- Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal.
El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor
determinante en la evaluación de la cantidad mínima detectable y el límite
inferior del rango lineal.
-
Límite de detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia
que puede producir una señal que sea el triple del nivel de ruido.
La separación efectuada se conserva en un registro individual llamado
cromatograma. Un cromatograma es una imagen que se traduce visualmente en
una pantalla o en un papel, en función del tiempo, y de un parámetro que depende
de la concentración instantánea del soluto a la salida de la columna. Este gráfico
se obtiene gracias a un detector situado a la salida de la columna (Rouessac y
Rouessac, 2003).
21
Revisión Bibliográfica
1.3.2.2 Columnas
En las columnas cromatográficas es donde se produce la velocidad diferencial de
los solutos que permiten su separación (Loro, 2001). El material de las columnas
cromatográficas suele ser de acero inoxidable cuya longitud varía de 5 a 30 cm, y
un diámetro de 1 a 5 mm. La eficacia de las columnas aumenta al disminuir el
tamaño de las partículas de la fase estacionaria (Harris, 2001).
Skoog, et. al., (2001), reportan los típicos rellenos de las partículas porosas para
cromatografía de líquidos los cuales están formados por micropartículas porosas
con diámetros entre 3 y 10 μm, con la menor dispersión posible con respecto a un
tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina, de una resina sintética
de poliestireno-divinilbenceno o resinas de intercambio iónico, aunque, sílice es el
material de relleno más común en cromatografía de líquidos.
Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la
entrada de la columna con otra más corta, la precolumna, que retiene por
adsorción las impurezas (Harris, 2001).
1.3.3 Validación del método
Validar el método significa el establecimiento de la evidencia documental de que
un procedimiento analítico conducirá, con un alto grado de seguridad, a la
obtención de resultados precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los
atributos de calidad previamente establecidos.
Para iniciar la validación es necesario previamente:
ƒ
Tener perfectamente caracterizado el analito.
22
Revisión Bibliográfica
ƒ
Trabajar con una composición definida, puesto que cambios en la
composición incluso a niveles de excipientes afectarán probablemente al
procedimiento analítico.
ƒ
Trabajar suficientemente con el método de análisis como para que nuestro
conocimiento acerca de éste, nos ofrezca garantías de que la validación
puede ser satisfactoria.
Las características de fiabilidad son las que demuestran la capacidad de un
método analítico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales
de validación y comprenden varios criterios.
Selectividad: Capacidad de un método analítico para medir y/o identificar
simultáneamente o separadamente los analitos de interés, de forma inequívoca,
en presencia de otras sustancias químicas que puedan estar presentes en la
muestra.
Linealidad: Se define como la capacidad del método para proporcionar resultados
que son directamente (o por medio de transformaciones matemáticas)
proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un rango
establecido.
Rango: Se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior para
las cuales se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del
método.
Precisión: es la capacidad de un método para proporcionar resultados próximos
entre sí. Se puede a tres niveles: repetibilidad: evalúa la precisión del método
(precisión intraensayo); precisión intermedio: evalúa la precisión frente a
variaciones de analista, equipo y día; reproducibilidad: evalúa la precisión entre
laboratorio.
23
Revisión Bibliográfica
Repetibilidad del sistema instrumental: Este parámetro estudia la variabilidad
debida únicamente al instrumento, y se determina analizando repetidamente una
misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces.
Repetibilidad del método: Se efectúa con una serie de alícuotas de una muestra
homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparación de
la muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el
mismo analista. Puede realizarse con un mínimo de 6 muestras a la concentración
nominal o un mínimo de 3 muestras a tres niveles de concentración cubriendo el
intervalo especificado (un total de 9 muestras).
Exactitud:
expresa
la
proximidad
entre
el
valor
que
es
aceptado
convencionalmente como valor verdadero o valor de referencia y el valor
experimental encontrado.
Límite de cuantificación: Se define como la cantidad mínima de analito que
puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y precisión.
Límite de detección: Se define como la mínima cantidad de un analito en una
muestra que puede ser detectado aunque no necesariamente cuantificado con
precisión y exactitud.
1.3.4 Reactivos de derivatización para compuestos amino
La derivatización puede ser llevada a cabo antes de la separación. Debería ocurrir
cuantitativamente para generar productos sencillos para cada aminoácido, y el
reactivo no debería interferir. Es probable que la derivatización genere productos
que son más parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la alta selectividad de
separación de los sistemas cromatográficos implica que raramente haya
problemas.
24
Revisión Bibliográfica
La derivatización tras la separación requiere, en general, una complejidad
instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser
optimizados para alcanzar sensibilidad de detección más alta (Burriel, 2003).
™ Orto–ftalaldehído (OPA)
El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina
en la postcolumna de derivatización y suministró un significante incremento en la
sensibilidad. Los aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor
fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11), dando un compuesto fluorescente. La
separación en fase reversa seguida de detección fluorescente constituye un
método de detección rápido, sensible y selectivo para todos los aminoácidos con
grupos amino primario.
™ Fenilisotiocianato (PITC)
El PITC, también conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado
para la secuenciación de polipéptidos y proteínas y fue introducido para el análisis
de aminoácidos al principio de los años ochenta. Es actualmente, el agente más
usado para precolumnas de derivatización, seguido de cromatografía en fase
reversa, en análisis de aminoácidos, siendo empleado para mezclas de
aminoácidos de una gran variedad de fuentes.
™ Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl)
El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados
altamente fluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente
y todavía usado como grupo amino protector en síntesis de péptidos, fue
primeramente aplicado como un agente derivatizante en precolumna para análisis
de aminoácidos.
25
Revisión Bibliográfica
El FMOC-Cl reacciona con todos los aminoácidos a pH alcalino y temperatura
ambiente para producir derivados aminoacídicos altamente estables que tienen
una fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- y
bis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas de estos
derivados varían en función del pH y de la proporción de reactivo y aminoácido.
1.4 Antecedentes bibliográficos de los métodos para la determinación de
glucosamina
Existen diferentes métodos para la determinación de glucosamina, pero cada uno
posee dificultades. El problema más común es la sensibilidad, debido a que la
glucosamina no es cromofóra (Thrall, 2004). Algunos de los métodos utilizados
para la determinación de este compuesto, son cromatografía de gases el cual
tiene una alta especificidad y es muy sensible (Joergensen, 2004), otro método
utilizado para este tipo de análisis es el de colorimetría.
El método más extensamente usado para la determinación de glucosamina es
principalmente HPLC fase reversa, con una precolumna de derivatización, la cual
tiene la ventaja de tiempos cortos de análisis, instrucciones de uso relativamente
sencillas y un bajo costo (Sánchez – Machado et. al., 2003).
1.4.1 Tratamientos de preparación de la muestra
La determinación de glucosamina se basa en varias etapas una de ellas es la de
la preparación de la muestra, otra etapa involucra el análisis cromatográfico. En la
tabla 2 se presenta el manejo sugerido de las muestras por diferentes autores en
investigaciones previas.
26
Revisión Bibliográfica
1.4.2 Derivatización
La derivatización de la glucosamina es una de las alternativas para realizar su
análisis. Dependiendo de las características de la muestra y los reactivos de
derivatizacion utilizados, las condiciones cromatográficas serán distintas, por lo
que en la tabla 3 se hace referencia a otros trabajos para determinar las
condiciones ideales para el análisis.
27
Revisión Bibliográfica
Tabla 2. Tratamientos de preparación de la muestra
AUTOR
PROCEDIMIENTO
La muestra fue tratada con NaOH 0.2N por 6 horas a 20 °C y a 100 °C por
Ekblad y Nasholm otras 17.5 horas y lavadas 4 veces con agua destilada, después fueron
(1996)
hidrolizadas con HCl 6N a 100 °C por 7 horas.
500 mg de muestra fueron colocados en tubos de 20 ml y mezclados con
Joergensen, et.al.,
10 ml de HCl 6 M transferidos a un evaporador y calentados por 6 horas a
(2004)
105 °C. El hidrolizado es filtrado y se toman alícuotas de 0.5 ml y son
evaporados a 40 °C, Después es redisuelta con 0.5 ml de agua y
evaporado nuevamente. Finalmente el residuo es nuevamente redisuelto
con 1 ml de agua y centrifugado a 5000 g. El sobrenadante es transferido a
viales para el analisis HPLC.
Wu, et.al .,
La muestra fue hidrolizada con HCl 6N a 110 °C. El hidrolizado fue
(2004)
neutralizado con acetato de sodio.
Cheng, et.al .,
La muestra fue hidrolizada por 12 horas a 100 °C con HCl pH 1.0. Después
(2003)
de la hidrólisis la muestra fue evaporada para remover el ácido clorhídrico.
Du y Anumula
La muestra fue hidrolizada con 0.5 ml de ácido trifluoroacético al 20% y 1.6
(1999)
ml de polipropileno en viales a 100 °C por 6-7 horas
Zhu, et. al .,
La muestra fue hidrolizada con ácido clorhídrico 8 M a una temperatura de
(2005)
110 ºC por 4 horas.
28
C18 de 250 x 5 mm (I.D)
Columna
Phenomenex Luna C18, 4.6 Isocratico ACN/H2O/H3PO4
x 150 mm
(10/90/0.1)
http://www.nsf.org
/business/ina/
glucosamine.asp?
program=INA
Fase móvil pH ( 5.3):
Citrato de sodio0.05M
Acetato de Sodio 0.05M
metanol y tetrahidrofuran
(90:8.5:0.75:0.75)
C18 de 125mm x 4 mm
C18 ODC de 4 mm x 2 mm.
Fase Movil:
acetonitrilo-agua-acido
acetico-trietilamina
(4.5:95.5:0.1:0.05)
Consiste en:
metanol-buffer
40-50%
50-68%
68-90%
Flujo 1 ml / min.
Fase Móvil
Joergensen, et.al
(2004)
Ali Aghazadeh-Habashi, Saeed C18 de 10 cm × 4.6 mm (I.D)
Sattari, Franco Pasutto nad
Fakhreddin Jamali
Ekblad y Nasholm
(1996)
Referencia
del
OPA
Fenilisotiocianato (PITC)
UV a 240 nm
1-naphthyl
isothiocyanato
FMOC-Cl
derivatización
Reactivo
Longitud de onda 445 nm
Excitación 340 nm
Excitación 260nm
Emisión 330nm
método
Validación
Tabla 3. Condiciones cromatográficas para el análisis de glucosamina propuestas por diversos autores
Revisión Bibliográfica
29
II. MATERIAL Y METODOS
2.1 Patrones y reactivos químicos
Todas las soluciones fueron preparadas con agua ultra pura purificada con un
sistema Nano pure Diamon (Barnstead Internacional, Bodoque Iowa). FMOC (9fluorenil metil cloroformato) (Sigma, St. Louis, MO, USA) se disolvió en acetonitrilo
(EMD Chemicals Inc. Darmstadt, Germany, Grado HPLC); el buffer de boratos fue
preparado con ácido bórico y agua ajustando el pH a 8.5 con hidróxido de sodio 1
M (Productos Químicos Monterrey, Nuevo León, México).
El reactivo para eliminar el FMOC sin reaccionar (Cleavage) se preparó utilizando
hidróxido de sodio 0.85 M con hidroxilamina 0.5 M y 2 – metiltioetanol (SigmaAldrich, St. Louis, USA); también la solución para ajustar el pH de la reacción
(Quench) se preparó con ácido acético glacial y acetonitrilo (Productos Químicos
Monterrey, NL, México).
Material y Métodos
Los reactivos fosfato de amonio, metanol y acetonitrilo utilizados para la
composición de la fase móvil fueron proporcionados por EMD Chemicals Inc.
2.2 Obtención de quitina
2.2.1 Condiciones de la fermentación
Como inóculo se utilizó un producto probiótico de células inmovilizadas
(Lactobacillus sp.). Éste fue activado al colocarlo en un recipiente con azúcar
3.75% (p/v) y agua 5% (v/v) durante 5 días a 37 °C
A los residuos de camarón descongelado (500 g) y previamente molidos se les
adicionó de 6.6% de azúcar (p/p), y posteriormente se inoculó con el probiótico
previamente activado 50% (v/p), el pH fue ajustado por debajo de 6.5 con ácido
cítrico al 10% esto para evitar la descomposición de la muestra.
Las muestras fueron incubadas durante 24 horas a una temperatura de 30 °C; el
pH y la acidez total titulable (ATT) se monitorearon cada 3 horas hasta obtener un
pH por debajo de 4.5 y una acidez titulable de 3.5%.
™ Centrifugación
Después de realizar la fermentación, el ensilaje obtenido fue centrifugado a 5000
rpm a 8 °C durante 15 minutos, esto para separar las fases: sobrenadantepigmento, licor y residuo, los dos primeros fueron separados por decantación y se
guardaron para las investigaciones de extracción de pigmentos y extracción de
proteínas.
El residuo sólido fue recolectado y secado a 60 ºC por 6 horas para
posteriormente realizar su purificación.
31
Material y Métodos
2.2.2 Purificación de quitina
ƒ Despigmentación
La extracción de los pigmentos, se realiza mediante la siguiente mezcla de
solventes
éter
de
petróleo:acetona:agua,
en
una
relación
15:75:10,
respectivamente. Esta mezcla de solventes se añade a la muestra, en relación
1:10 p/v, en un vaso de precipitados de 500 ml cubiertos con papel aluminio, se
homogeniza por medio de un multiagitador magnético y se mantiene en agitación
por 3 horas, transcurrido el tiempo la mezcla se filtra en un tamiz No. 100, y se
lava con acetona. El residuo despigmentado fue secado a vació a 60 ºC por 6
horas y almacenado.
ƒ Desproteinización
Inicialmente se toman 10 g de muestra previamente despigmentada y se mezclan
con 160 ml de buffer de carbonatos pH 9.5, por otro lado en un matraz se agregan
1.5 g de enzima proteasa TAKABATE y 20 ml de buffer pH 9.5. Ambos matraces
se ponen a baño María con agitación a 60 °C, y cuando ambas soluciones
alcancen la temperatura se le añade la solución enzimática a cada muestra. El
tiempo de reacción es de 3 horas, manteniendo constante la temperatura y la
agitación.
ƒ Desmineralización
Consistió en tratar la muestra previamente desproteinizada con HCl 1N en relación
(1:20, muestra/ácido)
por 3 horas a temperatura ambiente con agitación
constante, después de transcurridas las 3 horas la muestra se vierte en un tamiz
No. 100 y se lava con agua, posteriormente se secó por 6 horas a 60 ºC.
32
Material y Métodos
ƒ Decoloración
La quitina purificada es decolorada utilizando una solución de hipoclorito de sodio,
con 0.5% de cloro en una relación (1:20, muestra/solución); la mezcla se mantiene
en agitación por 20 minutos, transcurrido el tiempo la quitina se lava en un tamiz
N.100 con agua destilada y se seca a 60 ºC por 6 horas.
2.3 Preparación de la muestra
2.3.1 Hidrólisis de la muestra
En esta etapa se incluye principalmente la hidrólisis química de la quitina para
obtener glucosamina libre de acuerdo al método propuesto por Ekblad y Nasholm
(1996) con algunas modificaciones. Posteriormente la glucosamina es derivatizada
siguiendo el procedimiento de López-Cervantes et al (2005).
Se depositan 100 mg de quitina seca en tubos con rosca y se tratan con 5 ml de
HCl 6 N por 7 horas a una temperatura de 100 °C. La muestra hidrolizada es
filtrada a vacío (papel Wathman No. 41) y se diluye a 100 ml en un matraz
volumétrico. Previamente a la derivatización, 300 μl de la solución patrón o de
muestra se pasan a un vial, y se llevan a sequedad en condiciones de vacío por 6
horas a 60 ºC.
2.3.2
Derivatización
Para llevar a cabo la derivatización el residuo seco se redisuelve en 300 μl de
buffer de boratos a pH 8.5, posteriormente a la solución resultante se le agregan
300 μl del reactivo FMOC- Cl, y se agitan 90 segundos en el vortex, después de
trascurrido el tiempo se añaden 180 μl del reactivo Cleavage, la solución se
mezcla en el vortex y se deja reposar por 3.5 minutos, posteriormente se agregan
420 μl del reactivo Quench, se agita y se filtra utilizando una membrana millipore
de 0.45 μm; después de esto la muestra esta lista para ser analizada por HPLC.
33
Material y Métodos
2.4 Equipo y condiciones HPLC
Para el análisis se utilizó un cromatógrafo de líquidos equipado con un auto
muestreador y un detector de fluorescencia controlado con un software
(WinCrom), la temperatura de la columna se controla a 38 ºC con un calentador de
columna, todo el equipo utilizado es proporcionado por GBC Instrumental,
Australia. La separación se lleva a cabo con una columna de fase reversa 4.6 mm
SGE Hypersil ODS C18, para el análisis cromatográfico se inyectan 5 μL de la
muestra derivatizada.
La fase móvil esta compuesta por una mezcla de 3 soluciones de distinta
composición: Fase A: 30 mM fosfato de amonio (pH 6.5) disuelto en una mezcla
de metanol–agua (15:85); fase B: metanol – Agua (15:85) y la fase C: acetonitriloagua (90:10).
La glucosamina es separada con un gradiente de elusión el cual se muestra en la
tabla 4.
34
Material y Métodos
Tabla 4. Programa de la bomba (flujo en gradiente)
La velocidad de flujo utilizada fue de 1.20 mL/min. La longitud de onda del detector
de fluorescencia es de 264 nm excitación y 316 nm emisión.
35
III. RESULTADOS Y DISCUSION
La quitina es un polímero de la N-acetil-glucosamina. Por lo tanto, actualmente se
dispone de diversos métodos para la cuantificación indirecta de quitina en
bacterias, hongos, insectos y raíces. La hidrólisis de quitina puede ser enzimática
o química, ácida o alcalina, y la subsiguiente medición de la glucosamina
producida, se puede realizar por colorimetría, cromatografía de gas-líquidos o con
HPLC. En este trabajo se presenta el desarrollo de un método HPLC para la
cuantificación de glucosamina, el cual fue aplicado a muestras de quitina
obtenidas por fermentación láctica de residuos de camarón.
3.1 Ensayos preliminares
En los ensayos previos, tanto la glucosamina pura como la glucosamina obtenida
de la hidrólisis de las muestras fueron convertidas en FMOC-derivados para
producir un producto fluorescente. Los FMOC-derivados fueron detectados por
ultravioleta y por fluorescencia. En fluorescencia las longitudes de onda
seleccionadas
para
excitación
y
emisión
fueron
270
nm
y
316
nm,
respectivamente; mientras que para absorción UV la longitud correspondió a 264
Resultados y Discusión
nm. En la figura 4 se muestran los cromatogramas para ambos tipos de detección.
En el cromatograma del patrón la glucosamina se observa como tres picos con
tiempos de retención de 18.240, 19.721 y 20.445 minutos. Este mismo perfil fue
encontrado en los hidrolizados de quitina comercial y de quitina obtenida de la
fermentación láctica de residuos de camarón. Además, la relación entre los tres
picos no varía entre los diferentes tipos de muestras, manifestándose mayor
interacción entre el segundo y triple picos. La cuantificación de la glucosamina en
los hidrolizados de quitina se realizo por detección ultravioleta.
3.2 Preparación de la muestra
Para determinar la cantidad óptima del hidrolizado de la muestra a utilizar en el
análisis, se llevaron a cabo ensayos preparando hidrolizados con 100, 200 y 300
mg de muestra en 5 y 10 ml de HCl 6 N. Posteriormente los hidrolizados fueron
filtrados al vacío con papel Whatmann No. 41, y diluidos a 100 ml con buffer de
boratos (pH 8.5). Con estos ensayos se determinó que la cantidad óptima de
muestra a utilizar correspondía a los hidrolizados preparados a partir de 100 mg
de muestra en 5 ml de HCl 6 N y diluidas a 100 ml de buffer de boratos sonificados
por 1 min. a temperatura ambiente.
3.3 Condiciones cromatográficas
Diferentes columnas cromatográficas han sido utilizadas para el análisis de
aminoazúcares como la glucosamina, en este estudio se seleccionó una columna
25 cm x 4.6 mm SGE Hypersil ODS C18 5μm. De acuerdo a las recomendaciones
de López-Cervantes et al 2005, para la separación de FMOC-derivados fueron
seleccionados como componentes de la fase móvil fase A: 30 mM fosfato de
amonio, fase B: metanol – Agua (15:85) y fase C: acetonitrilo – Agua (90:10); y se
llevaron ensayos variando la relación de los componentes en el gradiente de la
bomba, velocidades de flujo de la fase móvil y temperaturas de la columna
(resultados no mostrados). Estos ensayos permitieron optimizar las condiciones
37
Resultados y Discusión
cromatográficas del método, lo cual permitió separar los tres picos que identifican
a la glucosamina. En la tabla 5 se muestran las condiciones seleccionadas.
A
B
Figura 4. HPLC cromatogramas de glucosamina en hidrolizados de quitina. (A) Detector
UV (264 nm); (B) Detector de fluorescencia (λex 270 nm, λem 316 nm)
38
Resultados y Discusión
Tabla 5. Condiciones cromatográficas propuestas para la
cuantificación de glucosamina
Parámetro
Condiciones
Columna
25 cm x 4.6 mm SGE Hypersil ODS C18 5μm
Eluyente
Velocidad de flujo
Detección
Temperatura
Fase A: 30 mM fosfato de amonio pH 6.5
Fase B: metanol – Agua (15:85)
Fase C: acetonitrilo – Agua (90:10)
1.2 mL/min
Ultravioleta
Excitación: 264 nm
Emisión: 316 nm
38ºC
3.4 Identificación de glucosamina
En esta investigación la identificación de la glucosamina en la columna
cromatográfica por sus tiempos de retención y por espectros de absorción UV.
Para confirmar la identificación de glucosamina a través de los tres picos
observados en el cromatograma, se determinó el espectro de absorción de cada
uno de los picos detectados en las muestras del hidrolizado de quitina, y se
compararon con los observados en la solución estándar de glucosamina.
Encontrándose que la serie de picos corresponden a la glucosamina. La figura 5
muestra el cromatograma de una muestra con los espectros de absorción de cada
pico, lo cual indica que corresponden al mismo compuesto.
Otro método para la identificación de la glucosamina es la comparación de los
cromatogramas de un blanco y del patrón con la muestra analizada, como se
muestra en la figura 6.
39
Resultados y Discusión
3.5 Validación del método
3.5.1 Linealidad
La curva de calibración fue determinada con 4 diferentes concentraciones de la
muestra patrón de glucosamina que van desde 338 μg/ml hasta1354 μg/ml, las
cuales fueron inyectadas por duplicado. La recta patrón para glucosamina se
obtuvo graficando concentración contra el área del pico lo cual fue satisfactoria ya
que
presentó un valor de r2 = 0.9995
y según la Asociación Española de
Farmacéuticos de la Industria, (2001), el valor recomendable para el coeficiente de
correlación es ≥ 0.999 aunque en caso de impurezas se admite ≥ 0.990
40
1
2
3
2
Figura 5. Cromatograma de la muestra con el espectro de absorción
de la glucosamina
1
3
Resultados y Discusión
41
Resultados y Discusión
A
B
C
Figura 6. Comparación entre cromatogramas
(A) Blanco, (B) Patrón, (C) Muestra
42
Resultados y Discusión
La representación gráfica de la recta de regresión en un sistema de coordenadas
junto con los valores experimentales, permite visualizar la bondad del ajuste. La
recta patrón es expresada matemáticamente como y = ax + b. Si la recta no pasa
cerca del origen de coordenadas significa que el método a evaluar esta afectado
por un error sistemático por defecto o por exceso en el intervalo estudiado. Si
existen diferencias apreciables significa que la linealidad no es buena (figura 7).
Tabla 6. Datos de calibración de glucosamina
Tiempo de
retención
(min)
Cantidad
(μg/ml)
Área
338.56
894342
677.12
1881307
1015.68
2786166
1354.24
3683757
18.240
19.721
20.445
Y = 2739x – 6883
R2 = 0.9995
4000000
3500000
3000000
Àrea
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
0
500
1000
1500
Concentracion (μg/ml)
Figura 7. Recta patrón de glucosamina
43
Resultados y Discusión
3.5.2
Precisión
La precisión es conocer la variabilidad o el más-menos del método de ensayo.
Esta variabilidad se puede deber a errores aleatorios. Este se llevó a cabo
analizando una misma muestra cuatro veces, los valores se muestran en la tabla
7, en donde se observa la desviación estándar relativa RSD % la cual es de 2.58
Tabla 7. Valores de precisión del método
Ensayos
Glucosamina
mg/g materia seca
1
688,2
2
706,4
3
719,6
4
731,1
Promedio
Desviación estándar
RSD, %
711,32
18.42
2.58
3.5.3 Recuperación
Para llevar a cabo la recuperación del método, se añaden sobre una o varias
muestras cantidades conocidas de un analito patrón. Lo anterior se realizó
adicionando glucosamina (605 mg/g matera seca), antes de la hidrólisis de la
quitina y después se cuantifico el contenido total por HPLC. Los datos se muestran
en la tabla 8 (4 ensayos de la misma muestra), donde se
observa que la
recuperación es de 89.05% la cual se considera aceptable debido al afecto que
podría tener las condiciones de la hidrólisis y la derivatización sobre la
glucosamina.
44
Resultados y Discusión
Tabla 8. Valores de recuperación del método
Ensayos
Glucosamina
mg/g materia seca
1
86.3
2
87.0
3
90.6
4
92.3
Promedio
Desviación estándar
RSD, %
89.05
2.87
3.22
3.6 Análisis de la muestra
3.6.1 Humedad y cenizas
El muestreo se llevó acabo utilizando 11 muestras obtenidas de diferentes
fermentaciones, realizando análisis por duplicado bajo las condiciones ya
establecidas del método. En la tabla 9 se muestran los valores obtenidos de
humedad y de cenizas tanto de la muestra proveniente del residuo de camarón y
la de la quitina comercial.
El contenido de cenizas y humedad son parámetros de calidad importantes para
determinar la pureza de la quitina estos fueron comparados con los resultados de
investigaciones previas, el contenido de humedad obtenido de la quitina del
residuo de camarón es de 2.3 % el cual es similar al reportado por Shahidi et al,
(1999), mientras que Cremades et al, (2001) reporta valores de cenizas de 1.09 %
lo cual indica que el método para remover los minerales es eficaz encontrándose
que tanto la quitina comercial como la obtenida de residuo de camarón son muy
similares a las reportadas.
45
Resultados y Discusión
Tabla 9. Contenido de humedad y cenizas en quitina
Muestra
Quitina
residuo de
camarón
Quitina
Comercial
Humedad (%)
Cenizas (g) 100g
materia
1
2.33
1.07
2
2.35
1.01
3
2.39
1.07
1
3.41
1.02
2
3.44
1.17
3
3.12
1.04
3.6.2 Contenido de glucosamina en la quitina
La quitina obtenida de residuo de camarón y la quitina comercial presentan
resultados muy similares en cuanto al contenido de glucosamina los cuales son de
89.91 % y 89.82 % respectivamente (Tabla 10).
El contenido de glucosamina representa la calidad de la quitina así como otros
parámetros ya mencionados. La pureza de la quitina obtenida a partir de los
residuos de camarón es de 93.71%.(89.91% glucosamina, 1.5% cenizas, 2.3%
humedad) esto se puede deber según Wu et al (2004) a diferentes factores tales
como el tipo y concentración de ácido, la temperatura y el tiempo de hidrolizado de
la quitina los cuales no hallan sido los óptimos para la recuperación de la
glucosamina.
Tabla 10. Contenido de glucosamina en quitina
Quitina residuo de
camarón
914.6
863.8
919.1
899.1
Quitina Comercial
Desviación estándar
30.7
78.7
RSD, %
3.41
8.76
Ensayos
1
2
3
Promedio
972.8
815.8
906.1
898.2
46
CONCLUSIÓN
En este trabajo se presentó un método HPLC sensible y reproducible para el
análisis y cuantificación de glucosamina en quitina de la cabeza de camarón
utilizando una derivatización con FMOC.
La validación del método se considera satisfactoria debido a que se obtuvieron
niveles de recuperación de un 89 % y una buena precisión del método con valores
de coeficiente de correlación mayores de 0.999, lo cual implica un gran potencial
para la investigación y análisis de rutina.
De tal manera que al llevar a cabo el análisis del contenido de glucosamina en la
quitina, se puede confirmar la pureza de la misma así como también
las
condiciones óptimas de la hidrólisis por lo tanto, el método debe ser aplicable para
la determinación rutinaria de glucosamina y la pureza de la quitina en residuos de
camarón
47
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