Guía de TP Primera Parte

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS (1° Parte)
FISIOLOGÍA ANIMAL COMPARADA
AÑO 2016
CONTENIDOS

Normas de Higiene y Seguridad en Laboratorios.

Uso y Cuidado del Microscopio.

Programa de la Materia.

Características Generales de la Materia.

Cronograma.

Viernes 12 de agosto: Seminario Actividad Bioeléctrica I (a cargo de
los docentes).

Trabajo Práctico Nº1: Sistema Nervioso (19/8).

Trabajo Práctico N°2: Sistema Sensorial (02/9).

Trabajo Práctico N°3: Sistema Endocrino I (09/9) – Primera Parte.

Trabajo Práctico N°3: Sistema Endocrino II (16/9) – Segunda Parte.

Trabajo Práctico N°4: Sistema Reproductor (23/9).
(LOS TRABAJOS PRACTICOS SE DESARROLLARÁN EN EL
LABORATORIOS K y L – 2º PISO, SALVO EL PRIMER TP QUE SE
REALIZARÁ EN EL AULA DE INFORMÁTICA “A” DEL 1º PISO)
Miércoles 10/8: PRESENTACIÓN DE LA MATERIA Y
DISTRIBUCIÓN DE PAPERS
INTRODUCCIÓN. CÓMO ES FISIOLOGÍA ANIMAL COMPARADA

CLASES TEÓRICAS.

CLASES DE SEMINARIOS. MODALIDADES Y EVALUACIÓN.

CLASES DE TRABAJOS PRÁCTICOS. MODALIDAD. INFORMES Y
EVALUACIÓN.

PROYECTO DE INVESTIGACION (PI). MODALIDAD. EXPOSICIÓN Y
EVALUACIÓN.

APROBACIÓN Y PROMOCIÓN DE LA MATERIA.
DISTRIBUCIÓN DE LOS PAPERS DE LA PRIMERA Y DE
LA SEGUNDA PARTE ENTRE LOS GRUPOS DE
ALUMNOS QUE SE FORMARÁN EN ESE MOMENTO.
CLASE ESPECIAL (Viernes 26/8 de 10 a 13 y 14 a 17 hs.)
EPISTEMOLOGÍA: El Problema del Método Científico
DOCENTE INVITADO: Dr. Leonardo González Galli (CEFIEC)
La Epistemología y el método científico
La epistemología es una metaciencia (otras metaciencias
son la historia de la ciencia, la sociología de la ciencia, etc).
Temas a Desarrollar:
 El inductivismo.
 El falsacionismo.
 Limitaciones de las principales concepciones del Método
Científico.
 La relación entre la teoría y la observación.
 ¿Existe el “Método Científico”?
TRABAJO PRÁCTICO N1
SISTEMA NERVIOSO
SIMULACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOELÉCTRICA
INTRODUCCIÓN
Propiedades de la membrana plasmática
La membrana celular, compuesta por lípidos y proteínas en un arreglo de
mosaico fluido, delimita el espacio celular. Desde un punto de vista eléctrico
ésta puede ser representada por un componente capacitivo (el aislamiento
lipídico) y otro resistivo asociado con los canales iónicos que regulan el pasaje
de iones específicos, confiriéndole una propiedad conductiva que puede variar
en el tiempo. La asimetría en la distribución de cargas, la permeabilidad de
membrana especifica a distintos iones y el funcionamiento de la bomba Na +/K+
son los factores principales que proveen una diferencia de potencial medible
entre el interior y el exterior de la célula (Vm). Esa diferencia es variable entre
los distintos tipos celulares y en los tejidos excitables gira entorno a los -90mV.
Estos tejidos tienen la capacidad de responder a un estimulo eléctrico con una
despolarización transitoria de la membrana, lo que llamamos potencial de
acción (PA). Este proceso fisiológico inicia diversos procesos tales como la
trasmisión nerviosa y la contracción muscular, entre otros.
OBJETIVO DEL TRABAJO PRÁCTICO
Discutir los conceptos de voltaje, corriente y conductancia en relación a los
cambios de permeabilidad (excitabilidad) de la membrana plasmática en
neuronas, utilizando como modelo el planteado por A. Hodgkin y A. Huxley (1,
2).
PROCEDIMIENTO
Para llevar a cabo el trabajo práctico utilizaremos un programa de simulación
denominado AXOVACS (Axon Instrument Inc.). El programa está basado en el
modelo de Hodgkin y Huxley, para la producción de potenciales de acción en
los axones gigantes de calamar (no confundir con el calamar gigante).
El programa AXOVACS nos presenta una pantalla con 10 opciones:
(1) Channels
VOLTAGE CLAMP
(2) Conductances
(3) Currents
(4) Advanced Version
CURRENT CLAMP
(5) Action Potencial
(6) Expanded Scales
(7) Pharmacology
(8) Ion Substitution
(9) Advanced Version
OR: (0) Quit
Para visualizar un gráfico, presione la tecla ¨r¨ (run). Para alterar los valores de
una simulación, presione la tecla ¨e¨ (edit). Aparecerá una ventana donde se
podrán modificar los valores de la simulación. Una vez introducidos los nuevos
valores, basta con apretar nuevamente la tecla ¨r¨(run). Si quiere borrar lo que
fue simulado anteriormente, presione la tecla ¨c¨ (clear). En algunos casos
puede llegar a ser interesante superponer las diferentes simulaciones para
poder comparar los cambios.
RECOMENDACIÓN: No limitarse al esquema del trabajo práctico. Hacer todas
las pruebas que se les ocurran.
BIBLIOGRAFÍA
1 Hodgkin AL, Huxley AF: The components of membrane conductance in the
giant axon of Loligo. J Physiol 1952, 116(4):473-496.
2 Hodgkin AL, Huxley AF: Currents carried by sodium and potassium ions
through the membrane of the giant axon of Loligo. J Physiol 1952, 116(4):449-472.
Fecha:
Integrantes:
INFORME T.P. N° 1 SISTEMA NERVIOSO
Objetivo del trabajo:
1ra Parte.
a) Variar el pulso del estímulo inicial externo (60, 70, 100 y 200 µA/cm2). Observe qué
ocurre con la velocidad de despolarización, repolarización y el pico del potencial. La
intensidad del estímulo modifica las conductancias de K+ y de Na+ ¿Por qué? ¿A qué
se deben las diferencias observadas a distintos estímulos?
b) Investigar la relación entre el PA y los cambios en las conductancias iónicas de los
iones K+ y Na+. Indicar, con un gráfico del PA realizado a mano, dónde intervienen las
corrientes de estos dos iones. Rotular debidamente los ejes y generar una leyenda
que describa el gráfico (Figura 1).
Figura 1:
c) Explicar los cambios observados a un Vm = -30 y -80 con respecto al inicial de -60
mV:
d) ¿Qué ocurre al aumentar la duración del estímulo externo al triple (Vm = -80)? ¿Se
ve una respuesta más rápida en los cambios de conductancias? (
Al finalizar el punto d), retornar al menú principal (presione < esc > e < y >),
eligir la opción 9 del menú principal (advanced version). Una vez dentro,
presionando la tecla <e> se entra al menú de edición que tiene varias ventanas
de opciones las cuales se suceden presionando <Av Pág>, <Re Pág>. En una de
esas ventanas buscar la opción “time scale” para ampliar la escala de tiempo a
25 ms (utilice las flechas).
e) Establecer el umbral de disparo del potencial de acción a un Vm de -60 mV y -80mV
¿A qué se debe la diferencia?
f) Investigar lo que ocurre entre 2 estímulos sucesivos. Estos deben tener 100 µA/cm2
de amplitud y 0,1 milisegundos de duración. Varíe el intervalo entre los estímulos (20,
15, 10, 5 ms). Comentar y determinar a que se pueden deber las diferencias
observadas a distintos tiempos, después del segundo estímulo.
g) Este fenómeno es debido a:
h) Establecer el periodo refractario absoluto y relativo a -60mV (NOTA: Tenga en
cuenta el estímulo umbral calculado en e).
Retorne al menú principal (presione < esc > e < y >)
2da Parte. Opción (7) Pharmacology
i) STX bloquea completamente canales de
j) TEA bloquea completamente canales de
k) Observar y comentar el efecto sobre el PA al utilizar bloqueantes específicos de
canales, Saxitoxina (STX) y Tetraetilamonio (TEA), a diferentes concentraciones.
l) Modificar las concentraciones iónicas de sodio y potasio. Comentar lo que sucede
sobre el potencial de acción.
m) Comentarios finales
TRABAJO PRÁCTICO N2
SISTEMA SENSORIAL (GUSTO)
INTRODUCCIÓN
Los mamíferos pueden degustar muchos compuestos utilizando una paleta
sensorial que consiste en sólo cinco modalidades básicas del gusto: dulce,
amargo, ácido, salado y umami (el sabor del glutamato monosódico). A pesar
de este repertorio que puede parecer limitado, proporciona la información
crítica acerca de la naturaleza y la calidad de los alimentos. A diferencia del
tacto, la visión, la audición y el olfato, que funcionan en diversos contextos de
comportamiento, el sentido del gusto ha evolucionado para servir como un
regulador dominante y controlador de la conducta alimentaria. Sistemas de
detección de compuestos nutricionalmente relevantes y nocivos provocan
comportamientos innatos a la aceptación o el rechazo de las fuentes de
alimento, respectivamente ¿Cómo se transforma la información sensorial en un
comportamiento alimenticio particular? Un primer paso para contestar esta
pregunta consiste en definir la ubicación de las células que responden a cada
modalidad del gusto.
OBJETIVOS DEL TRABAJO PRÁCTICO
 Determinar si existe especialización regional en la lengua para los distintos
gustos básicos.
 Evidenciar la contribución del olfato en la discriminación de los sabores.
MATERIALES A UTILIZAR
Vasos descartables. Agua potable. Café (Gusto amargo). Sal de mesa (Gusto
salado). Azúcar (Gusto dulce). Vinagre (Gusto ácido). Ajinomoto (Gusto
Umami). Cotonetes o hisopos. Pañuelos de papel. Guantes de látex. Algodón.
DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍA
Experimento 1
1.- Vendarle los ojos a un compañero que participará en este experimento.
Debe mantener los ojos vendados todo el tiempo. A continuación, con un
pedazo de algodón debe taparse las fosas nasales.
2.- Mojar el extremo de un cotonete (hisopo) en la solución número 1 y tocar
con él la punta, la base y las partes laterales de la lengua de tu compañero, sin
permitirle que la meta a su boca; pedirle que te conteste que sabor percibió
y en qué porción de su lengua pudo percibir con mayor intensidad esa
sustancia. Debe enjuagarse entre pruebas de diferentes sustancias.
3.- Realizar el mismo procedimiento, pero empapando otro cotonete en las
soluciones restantes. Vuelve a preguntarle en que zonas de la lengua percibe
los respectivos sabores. Es importante que no utilices el mismo aplicador
(hisopo) para cada una de las sustancias.
4.-Completar la Tabla 1.
Experimento 2
Realizar exactamente el experimento anterior, pero sin los tapones de la nariz.
Experimento 3
Determinar el umbral de detección para la sal, la sacarosa y la cafeína de cada
integrante del grupo. Repetir el procedimiento anterior, pero esta vez se
probarán diferentes diluciones hasta que el compañero detecte cada una de
las modalidades gustativas. En el caso de la sacarosa y de la sal se utilizarán
las siguientes concentraciones: 0,05; 0,1 y 0,5 M; en el caso de la cafeína
0,005; 0,01 y 0,05 M. Aplicar el hisopo en la zona de la lengua correspondiente,
teniendo en cuenta los resultados de los experimentos 1 y 2.
Experimento 4
Determinar si es posible diferenciar entre distintas sustancias dulces tales
como sacarosa, edulcorante, glucosa (todas a la misma concentración, 2 M).
Recordar que el compañero no debe meter la lengua en su boca. Estimular
siempre la misma región, y enjuagar la boca con agua entre pruebas.
Experimento 5
Realizar un experimento de adaptación cruzada, donde se moja el hisopo con
la solución azucarada (2 M), hasta que el compañero no perciba más el gusto
dulce. El hisopo solo debe tocar durante aproximadamente 2 minutos una sola
región de la lengua (no mover el hisopo, no salivar). En el momento en que el
compañero deje de detectar el sabor dulce, tocar inmediatamente la misma
región de su lengua con un hisopo embebido en la solución salada (2 M).
Preguntarle al compañero si es capaz de detectar el gusto salado.
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles fueron las zonas de la lengua y las sustancias que te contestó la
persona que se sometió al tratamiento? Organiza tus datos en la tabla 1.
2.- ¿Hay alguna diferencia entre los resultados del experimento con o sin la
nariz tapada?
3.- Según sus datos ¿qué opinan sobre el mapa de la lengua que aparece en la
mayoría de los libros de texto de nivel secundario?
4.- ¿Existen diferencias entre los umbrales de detección de distintas personas?
¿Los umbrales para los distintos gustos son similares?
5.- ¿Las diferentes sustancias dulces se perciben como un mismo sabor o
diferente?
6.- ¿Que nos indica el experimento de adaptación cruzada?
7.- ¿Existe concordancia entre sus resultados y los comentados en el Review
de Chandrashekar et al. 2006? (texto completo al final del TP)
8.- ¿A partir de los resultados obtenidos en el paper de Xiaoke Chen et al. 2011
(texto completo al final del TP), realice una analogía entre el sistema
somatosensorial y el sistema del gusto.
Tabla 1
NARIZ TAPADA
GUSTO\Sección
en la lengua
Punta
Costados
Atrás
Gusto percibido
Observaciones
Punta
Costados
Atrás
Gusto percibido
Observaciones
1
2
3
4
5
6
NARIZ DESTAPADA
GUSTO\Sección
en la lengua
1
2
3
4
5
6
Nivel de sensación
(----)
(+)
(+++)
NADA
POCO
MUCHO
INFORME
Objetivos. Mencionar brevemente.
Resultados: Presentar completa la Tabla 1 con los datos observados por cada
alumno. Describir las observaciones realizadas.
Discusión y Conclusiones: Se deben discutir los resultados obtenidos
(contestando las preguntas que se plantean) y realizar conclusiones generales.
BIBLIOGRAFÍA
Chandrashekar, J., Hoon, M.A., Ryba, N.J. y Zuker, C.S. The receptors
and cells for mammalian taste. Nature 444, 288-294 (2006). (para discutir el
clase)
Xiaoke Chen, Mariano Gabitto, Yueqing Peng, Nicholas J. P. Ryba,
Charles S. Zuker. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain.
Science 333, 1262-1266 (2011). (para discutir en clase)
Yarmolinsky, D.A., Zuker, C.S. y Ryba, N.J. Common sense about taste:
from mammals to insects. Cell 139, 234-244 (2009).
TRABAJO PRÁCTICO N3 - PRIMERA PARTE
SISTEMA ENDOCRINO (Cromatóforos)
Regulación neurohormonal del movimiento pigmentario
en el cangrejo Neohelice granulata
INTRODUCCIÓN
El sistema neurosecretor de los crustáceos está formado por un grupo de neuronas
especializadas en la síntesis, almacenamiento y secreción de agentes químicos que actúan
como neurohormonas (Welsh, 1961). Un ejemplo de esto es el sistema neuroendocrino
conocido como complejo órgano X - glándula del seno, ubicado en los pedúnculos oculares
(PO) de los crustáceos superiores. En el órgano X se encuentran los somas neuronales que
proyectan sus axones hacia la glándula del seno, tejido neurohemal desde donde se secretarán
varias neurohormonas capaces de controlar la muda, la regeneración de apéndices, la
regulación iónica y osmótica, la actividad neuronal, el metabolismo de carbohidratos y la
dinámica pigmentaria, entre otros procesos (ver Figura).
En estudios previos, Fingerman (1987) observó cambios de coloración causados por la
movilidad de pigmentos que, al dispersarse, protegen a los tejidos internos de la radiación
deletérea, particularmente UV, en presencia de una alta luminosidad.
Estas células pigmentarias conocidas como cromatóforos, presentan distintos tipos de
sustancias que le confieren propiedades específicas; en los cangrejos (decápodos braquiuros),
por ejemplo, son especialmente importantes los melanóforos, células epiteliales que contienen
el pigmento melanina. Los pigmentos pueden dispersarse dentro de las células (movilizándose
por el citoplasma), aumentando el grado de oscurecimiento de la superficie corporal
(Felgenhauser, 1992).
De acuerdo a la especie en estudio, se han descrito diversos factores hormonales que
regulan esa dispersión, y eventualmente, la concentración de pigmentos en los cromatóforos.
La mayoría de estos factores son neurohormonas sintetizadas en los pedúnculos oculares,
identificándose además una serie de neuroreguladores involucrados en el cambio de coloración.
Estos son de bajo peso molecular y funcionarían como neurotransmisores; entre ellos se
encuentran la acetilcolina, el glutamato, el ácido gama aminobutílico (GABA), la serotonina y la
dopamina (Fingerman y Nagabhushanam, 1992). Los neurotransmisores no actuarían de
manera directa, sino estimulando o inhibiendo la liberación de los factores hormonales
producidos en los pedúnculos oculares.
Figura. Sistema neuroendocrino en los pedúnculos oculares: complejo órgano X - glándula del seno y
morfología de las neuronas sintetizadoras y secretoras. El axón se origina desde el cuerpo del órgano X
(Xo), cruzando la médula terminalis (MT) y alcanzando la glándula del seno (SG). Pueden observarse
también algunos de los tejidos que regulan las neurohormonas liberadas por el complejo, así cómo la
conexión de los PO con cerebro y el ganglio ventral (Andrew et al., 1978; Cooke y Sullivan., 1982).
OBJETIVO DEL TRABAJO PRÁCTICO

Determinar la participación de factores neuroendocrinos en la regulación de
los cambios de pigmentación corporal en los crustáceos decápodos.
MATERIALES A UTILIZAR







Cangrejos machos adultos de la especie Neohelice granulata
Los animales estarán ubicados en peceras plásticas con agua salina
artificial al 12‰ (g/L)
Jeringas de 1 ml provistas de agujas 27G
Recipientes (cápsulas de petri) y frascos de vidrio
Lupas binoculares y lámparas
Tubos con solución salina para crustáceos y extractos de pedúnculo ocular
Recipientes de telgopor y guantes de látex
DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍA
Observación de la migración pigmentaria:
1) Puesta a punto de la técnica: Se entregará a cada grupo de alumnos,
previamente formados, (2) dos cangrejos intactos y (2) dos cangrejos
ablacionados de sus pedúnculos oculares para que identifiquen los
melanóforos, observen los pigmentos y comparen entre melanóforos con
pigmentos agregados y dispersos. Con el fin de normalizar las observaciones,
éstas se realizarán en la cara externa del meropodito de la quinta pata
derecha de cada animal (completar Tabla 1).
2) Efecto del fondo sobre la dinámica pigmentaria: Sobre un total de
aproximadamente 40 cangrejos de la especie Neohelice granulata se analizará
el grado de dispersión de los cromatóforos (melanóforos) en función de
distintos sustratos (i.e. fondos) y bajo condiciones de fotoperíodo constante
(14hs luz : 10hs oscuridad):


Un grupo de cangrejos (n = 20) será mantenido durante una semana en un
fondo oscuro (negro)
Un grupo de cangrejos (n = 20) será mantenido durante una semana en un
fondo claro (blanco)
Luego del período de exposición se medirá el grado de dispersión del pigmento
melanina en los melanóforos de cada animal, observando bajo lupa binocular y
determinando si se encuentran dispersos (D) o agrupados (A). Cada grupo de
alumnos deberá observar dos (2) cangrejos en fondo oscuro y dos (2) en fondo
claro (completar las Tablas 2a, b).
3) Efecto de la luminosidad sobre la dinámica pigmentaria: Sobre un total de
aproximadamente 40 cangrejos de la especie Neohelice granulata se analizará
el grado de dispersión de los cromatóforos (melanóforos) bajo distintas
condiciones de iluminación y sobre un fondo homogéneo (gris).


(a) Un grupo de cangrejos (n = 20) será mantenido durante una semana en
iluminación constante
(b) Un grupo de cangrejos (n = 20) será mantenido durante una semana en
oscuridad constante
Luego del período de exposición se medirá el grado de dispersión del pigmento
melanina en los melanóforos de cada animal. Cada grupo de alumnos
observará dos (2) cangrejos provenientes de cada tratamiento (completar las
Tablas 3a, b).
4) Efecto de la inyección de extracto de pedúnculo ocular (EPO): Se utilizarán
cangrejos mantenidos durante una semana en condiciones estándar de
iluminación ambiente (14hs luz: 10hs oscuridad). Unas 48hs antes del
desarrollo del trabajo práctico, a estos animales se les ablacionarán ambos
pedúnculos oculares (tarea docente). Con los pedúnculos oculares extraídos y
colocados en solución salina para crustáceos, se realizará un homogenato en
frío utilizando un homogeneizador de vidrio con émbolo de teflón. Obtenido el
homogenato, se centrifugará a 10.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos. A partir
del sobrenadante obtenido (extracto puro) se prepararán tres (3) diluciones de
extracto de pedúnculo ocular (25% - 50% - 75%).
Cada grupo de alumnos inyectará cuatro (4) cangrejos mantenidos una semana
en condiciones de oscuridad constante o mantenidos una semana en
condiciones de iluminación constante, con 100 ul de cada dilución del
extracto o con 100 ul de solución salina para crustáceos (Nota: si se
inyectaran 100 ul de extracto puro, eso representaría inyectar el contenido
hormonal de un pedúnculo ocular).
Grupos Experimentales:
Grupo control: inyectado con solución salina
Grupo 25: inyectado con extracto de PO al 25%
Grupo 50: inyectado con extracto de PO al 50%
Grupo 75: inyectado con extracto de PO al 75%
Se medirá el grado de dispersión de los melanóforos previo a la inyección
(t0) y a los 5 (t5), 15 (t15), 30 (t30), 45 (t45) y 60 (t60) minutos postinyección
(completar las Tablas 4a, b).
PLANILLAS Y TABLAS
I. Observación Inicial de los Cromatóforos. Puesta a punto de la técnica,
utilizando lupa binocular
Paso 1. Observar (2) cangrejos ablacionados de sus PO
Paso 2. Observar (2) cangrejos intactos de sus PO
TABLA 1. (Observación Inicial)
ENSAYO
Cangrejo
Observaciones
A/D
OBS INICIAL
Ablacionados
OBS INICIAL
Intactos
II. Efecto del Sustrato (Fondo). Observación de los cromatóforos bajo lupa
binocular
Paso 1. Observar (2) cangrejos en fondo claro
Paso 2. Observar (2) cangrejos en fondo oscuro
TABLA 2a. (Efecto Fondo-Datos del Grupo)
ENSAYO
Observaciones
A/D
FB
FB
FN
FN
TABLA 2b. (Efecto Fondo-Datos del Turno)
ENSAYO
A
D
Totales
observados
FB
FN
A: agregado ; D: disperso
Gráfico de barras ID vs Fondo (Claro/Oscuro)
Efecto Fondo
1
0.8
ID
0.6
0.4
0.2
0
FB
FN
III. Efecto de la Luminosidad. Exposición a luz cte / oscuridad cte.
Observación de los cromatóforos bajo lupa binocular
Paso 1. Observar (2) cangrejos en iluminación constante (fondo gris)
Paso 2. Observar (2) cangrejos en oscuridad constante (fondo gris)
TABLA 3a. (Efecto Luminosidad-Datos del Grupo)
ENSAYO
Observaciones
A/D
LUZ CTE
LUZ CTE
OSC CTE
OSC CTE
TABLA 3b. (Efecto Luminosidad-Datos del Turno)
ENSAYO
A
D
Totales observados
LUZ CTE
OSC CTE
A: agregado ; D: disperso
Gráfico de barras ID vs Luminosidad ambiente (Luz/Oscuridad)
Efecto Luminosidad
1
0,8
ID
0,6
0,4
0,2
0
LUZ CTE
OSC CTE
IV. Efecto del Extracto de Pedúnculos Oculares (PO) sobre la dinámica
pigmentaria
La mitad de los grupos del turno realizan estas inyecciones:
Paso 1. Inyectar (4) cangrejos en condiciones de oscuridad constante con
100 ul de:
 solución salina para crustáceos (control)
 extracto de PO al 25 %
 extracto de PO al 50 %
 extracto de PO al 75 %
Paso 2. Observar el estado de los melanóforos ((A) agregado / (D) disperso)
antes de la inyección (t0) y a los 5, 15, 30, 45 y 60 minutos postinyección.
La otra mitad de los grupos del turno realizan estas inyecciones:
Paso 1. Inyectar (4) cangrejos en condiciones de iluminación constante con
100 ul de:
 solución salina para crustáceos (control)
 extracto de PO al 25 %
 extracto de PO al 50 %
 extracto de PO al 75 %
Paso 2. Observar el estado de los melanóforos ((A) agregado / (D) disperso)
antes de la inyección (t0) y a los 5, 15, 30, 45 y 60 minutos postinyección.
TABLA 4a. (Efecto Inyección Extracto - Datos del Grupo)
Tratamiento
Hora de
Inyección
Tiempo de Observación
0
5
15
30
45
OBS
60
CT
25%
50%
75%
Indicar si el animal se encuentra agregado (A) o disperso (D)
TABLA 4b. (Efecto Inyección Extracto - Datos del Turno)
OSCURIDAD CONSTANTE
Tiempo
(min)
t0
t5
t15
t30
t45
t60
Totales
Obs.
Control
A
D
Tiempo
(min)
t0
t5
t15
t30
t45
t60
Totales
Obs.
Control
A
D
25%
A
50%
D
A
75%
D
A
D
ILUMINACION CONSTANTE
25%
A
50%
D
A
A: agregado ; D: disperso
75%
D
A
D
Gráfico ID vs Tiempo de observación, para los diferentes grupos
experimentales (Osc. Cte.)
CT
25%
Efecto EPO (OSC CTE)
ID
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
T0
T5
T15
T30
T45
Tiempo
T60
Gráfico ID vs Tiempo de observación, para los diferentes grupos
experimentales (Luz Cte.)
CT
25%
50%
ID
Efecto EPO (LUZ CTE)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
T0
T5
T15
T30
T45
Tiempo
T60
75%
INFORME TP Sistema Endocrino – Primera Parte
- Hipótesis y Objetivos. Mencionar brevemente.
- Resultados: Completar las tablas del grupo y las tablas generales del turno.
Obtener un índice de dispersión (ID) como: número de animales dispersos
en función del número de animales observados. A partir de estos datos
graficar ID versus Tratamientos (fondo claro y fondo oscuro, luz constante y
oscuridad constante) para las variables ambientales, así como también ID en
función del tiempo de medición para el tratamiento con los extractos de
pedúnculo ocular. Interpretar los resultados obtenidos en cada sección.
- Discusión y Conclusiones: Para cada sección, comparar los resultados del
grupo con los resultados generales del turno. En caso de no coincidir, discutir,
proponer hipótesis alternativas o informar los posibles errores cometidos en la
aplicación de la metodología. Además, comparar con los resultados generales
obtenidos en los otros turnos de TP para analizar el efecto del ciclo circadiano.
BIBLIOGRAFÍA
Andrew, RD, Orchard, I y Saleuddin, ASM (1978). Structural reevaluation of the neurosecretory system in the crayfish eyestalk. Cell Tiss.
Res.190: 235-246.
Cooke, IM y Sullivan, RE (1982). Hormones and neurosecretion. En: The
Biology of Crustacea. Volumen 3, pp. 205-290.
Felgenhauser, BE (1992). External anatomy and integumentary
structures En: Microscopic anatomy of invertebrates, vol. 10: Decapod
Crustacea, editado por FW Harrison y AG Humes, Wiley-Liss, pp. 7-43.
Fingerman, M (1987). The endocrine mechanisms of crustaceans.
Journal of Crustacean Biology. 50: 37-45.
Fingerman, M y Nagabhushanam, R (1992). Control of the release of
crustacean hormones by neuroregulators. Comp. Biochem. Physiol. 102C(3):
343-352.
Welsh, JH (1961). Neurohumors and Neurosecretion. En: The physiology
of Crustacea, editado por TH Waterman. Academic Press, NY. Volumen II: 281311.
TRABAJO PRÁCTICO N3 - SEGUNDA PARTE
SISTEMA ENDOCRINO (Cromatóforos)
Durante el transcurso de este práctico, los diferentes grupos deberán realizar
los experimentos que consideren necesarios para poder responder las
preguntas o hipótesis que deberán elaborar previamente (luego de analizar
los resultados del TP anterior).
Ejemplos de preguntas que podrían hacerse:
¿Existe algún factor hormonal, presente en la hemolinfa (la sangre de los
cangrejos), que pueda producir cambios en la coloración de la superficie
corporal?
¿El factor hormonal tiene un efecto directo o indirecto sobre los cromatóforos?
¿Además del sustrato y de la luminosidad ambiente, existe alguna otra variable
ambiental que pueda incidir sobre la coloración de la superficie corporal?
INFORME TP Sistema Endocrino – Segunda Parte
Cada grupo deberá entregar un informe donde figure: a) la pregunta que se
plantearon, b) el diseño experimental y la metodología que aplicaron para
responder esa pregunta, c) los resultados obtenidos y d) una breve discusión
de los resultados.
TRABAJO PRÁCTICO N4
SISTEMA REPRODUCTOR
INTRODUCCIÓN
Las hormonas sexuales en los vertebrados (esteroides derivados del colesterol)
incluyen los estrógenos (predominantes en las hembras), los andrógenos
(predominantes en los machos) y la progesterona. La producción y secreción
de estos esteroides, gonadales, esta bajo control de la hormona folículo
estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH), liberadas por la
adenohipófisis en respuesta a Gn-RH (hormona hipotalámica liberadora de
gonadotrofinas). A su vez, la secreción de las gonadotrofinas hipofisarias está
modulada por la retroalimentación de las hormonas gonadales. Los
mecanismos neuroendocrinos desempeñan un papel importante en la
regulación del ciclo sexual y reproductivo. Las interacciones entre las
gonadotrofinas y los esteroides proporcionan la base de la periodicidad o
ritmicidad sexual que es muy acentuada en la hembra de los mamíferos.
En el caso de la hembra de la mayoría de los mamíferos, el ciclo reproductivo
(estral) a nivel del ovario y del útero, consiste en 3 fases fundamentales: 1.
fase folicular (ovario) o fase proliferativa (útero), 2. Ovulación (ovario), 3. fase
lútea (ovario) o fase secretora (útero). La duración de estas fases del ciclo varía
en los distintos grupos de mamíferos. Este ciclo estral está basado en las
relaciones endocrinas y niveles de concentración de gonadotrofinas y
hormonas ováricas. El ciclo estral en la rata-ratón de laboratorio se estudia
mediante un frotis vaginal, que se caracteriza por cantidades relativas y
específicas de distintos tipos celulares del epitelio vaginal. El ciclo en estos
roedores se repite cada 4 o 5 días y consiste en los siguientes estados: diestro
(fase luteolítica y de crecimiento folicular), proestro (fase de maduración
folicular y preovulatoria), estro (ovulación) y metaestro (fase luteogénica). En el
diestro de la rata-ratón los niveles hormonales permanecen bajos durante la
mayor parte de dicho estado, solo ocurre un gradual incremento de estrógenos,
liberados por el folículo ovárico en desarrollo. En el proestro se produce un pico
de FSH y LH debido al aumento significativo de estrógenos. En el estro se
desencadena la ovulación y los niveles de LH y estrógenos bajan a sus niveles
mínimos basales. En el metaestro (fase lútea temprana) comienza a detectarse
un aumento en los niveles de progesterona (producida por el cuerpo lúteo).
OBJETIVOS DEL TRABAJO PRÁCTICO



Conocer el ciclo estral de mamíferos.
Observar e interpretar las diferentes fases del ciclo estral.
Correlacionar la fase del ciclo estral de cada hembra con las características
morfológicas del útero y del ovario.
MATERIALES A UTILIZAR
Instrumental de cirugía, portaobjetos con cubre, pipetas Pasteur de plástico,
tips amarillos, solución fisiológica, alcohol, algodón, papel metálico, azul de
metileno, pinzas, guantes descartables, batería de tinción, balanzas. Ratonas
adultas (60 días de edad).
DISEÑO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍAS
Se utilizarán ratonas de la línea CF1 criadas en diferentes jaulas con el fin de
obtener animales en las distintas fases del ciclo estral. Cada turno recibirá 4
jaulas con 4 animales en cada una. Cada grupo de alumnos utilizará dos
ratonas de jaulas diferentes. Se sacrificarán los animales en cámara de CO 2 o
por dislocación cervical.
CICLO ESTRAL
Se determinará el ciclo estral del ratón utilizando la técnica de citología vaginal
exfoliativa con posterior coloración por la Técnica de Papanicolaou (modificada
por Iodice y col., 1988) y por tinción directa con Azul de metileno (AzM). El
procedimiento a seguir será:






Sujeción del ratón
Toma de la muestra mediante lavado vaginal
Extendido del material obtenido sobre portaobjeto limpio y desengrasado
(preparar 2 portaobjetos x ratón)
A un portaobjeto colocarle una gota de AzM y dejar secar (tinción
alternativa).
Al segundo portaobjeto colocarlo durante 1 minuto en Metanol (fijación de
las células).
Luego, se procederá a colorear las células fijadas mediante la técnica
descripta a continuación:
Técnica de tinción para frotis vaginal:
1. Pasaje por alcohol 50% (1 min.)
2. Lavado con agua destilada (1 min.)
3. Coloración con hematoxilina (de Mayer, Carazzi -10 min) o (de Gill – 5 min.)
4. Lavado con agua corriente (enjuague)
5. Pasaje por agua destilada (1 min.)
6. Pasaje por alcohol 70% (1 min.)
7. Coloración con Orange G (6 min.)
8. Pasaje por alcohol 70% (enjuague)
9. Coloración con Eosina (EA 36- EA 50) (30 seg.)
10. Pasaje por alcohol 70% (enjuague)
11. Observación al microscopio de todos los preparados (4 portaobjetos en total,
2 por cada ratón)
- Lectura, interpretación y cuantificación de las observaciones.
-Observar los extendidos bajo microscopio con aumento 40X.
Análisis cualitativo
Identificar los siguientes tipos celulares según sus características morfológicas
y su tinción:
Células parabasales
Células intermedias
Células superficiales
Células superficiales queratinizadas
Leucocitos (neutrófilos, linfocitos, etc.)
Caracterización del estado o fase del ciclo estral
Para establecer en qué fase del ciclo está la hembra de ratón, se estimará la
fase del ciclo estral del animal tomando en cuenta las proporciones relativas
aproximadas de los tipos celulares hallados. Para ello, se contarán los
diferentes tipos celulares y se establecerán sus proporciones relativas,
contando alrededor de 30 células en diferentes campos del frotis vaginal. En el
frotis es común encontrar leucocitos; de ser así, en las tablas indicar presencia
o ausencia, anotando la cantidad relativa como muchos o pocos, pero no
contarlos.
Tabla del grupo
Expresar el recuento del número de cada tipo de células como % sobre un total
de células contadas (30) y determinar, en base a esos porcentajes, la fase del
ciclo estral.
Número de
jaula
Parabasales Intermedias Superficiales Queratinizadas
Leucocitos
%
%
%
%
(muchos/pocos)
Fase del
ciclo (*)
1a4
(*) Pueden ser estados intermedios, como metaestro-diestro.
Tabla general de datos de las fases del ciclo por jaula
Una vez determinada la fase del ciclo de cada animal, se anotará el número
total de ratones (de cada jaula) que se encuentra en cada fase, en la siguiente
tabla. Expresar los resultados como % de ratones que se encuentran en cada
fase del ciclo x jaula.
Número de jaula
Proestro
Estro
Metaestro
Diestro
1a4
(*) Pueden ser estados intermedios, como metaestro-diestro.
Otros (*)
CARACTERÍSTICAS DEL ÚTERO



Colocar el animal en decúbito dorsal.
Realizar diéresis de la piel por la línea media ventral con tijera.
Realizar diéresis de la pared muscular subyacente por la línea alba (media)
con tijera.
 Reconocer el tracto reproductivo dentro de la cavidad abdominal e
identificar los distintos órganos que lo componen (ovario, oviducto, útero,
cérvix).
 Disectar todo el tracto genital en cápsula de Petri (con solución fisiológica
SF) y separar el útero en su totalidad, extrayendo oviductos, ovarios, cérvix
y tejido graso.
 Colocar los cuernos uterinos sobre papel metálico y pesar (expresar en mg).
 Colocar los cuernos uterinos en la cápsula de Petri (con SF) para
observarlos macroscópicamente y bajo lupa.
Análisis cualitativo: describir el aspecto, en cuanto a coloración, volumen o
cualquier característica externa observada.
Análisis cuantitativo: completar la siguiente Tabla
Número de jaula
Peso útero Peso corporal
IUS (*) Fase del ciclo
(mg)
(mg)
(*): Calcular el índice útero-somático (IUS) como mg peso útero / mg peso
corporal.
Se recogerán los datos de todos lo animales y se agruparán en una tabla
general, clasificándolos por fase del ciclo.
CARACTERÍSTICAS DEL OVARIO
Colocar el ovario en una cápsula de Petri con solución fisiológica, observar y
distinguir bajo lupa:
- folículos
- cuerpos lúteos (si hay, contarlos)
INFORME
Hipótesis y Objetivo/s: mencionar brevemente
Metodologías y Procedimientos: Explicación breve de los procedimientos
realizados.
Resultados
Análisis del ciclo estral: Realizar esquemas de los distintos tipos celulares
observados. Expresar los resultados en forma de gráficos de barras, en función
del número de la jaula. Analizar si existe alguna relación entre el número de
jaula y la fase del ciclo.
Análisis uterino: Describir las características de los úteros observados. Analizar
los datos agrupados en la tabla general (Fase del ciclo vs. IUS).
Discusión y Conclusiones
Interpretar los resultados y discutirlos en forma interrelacionada, analizando el
estado del ciclo con lo observado en útero y ovarios.
Según el estado del ciclo, relacionar con el estado hormonal o endocrino que
tendría cada grupo de animales.
Enunciar brevemente las conclusiones obtenidas.